CN110106152B

CN110106152B - 杂交瘤细胞株ytt-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体

Info

Publication number: CN110106152B
Application number: CN201910361592.2A
Authority: CN
Inventors: 张奇; 李培武; 唐晓倩; 李慧; 张文
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110106152A

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株YTT‑2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体。本发明提供的杂交瘤细胞株YTT‑2，保藏编号CCTCC NO:C201871，可用于制备高效价抗环匹阿尼酸单克隆抗体，抗环匹阿尼酸腹水抗体间接非竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)测得效价可达1.2×10⁵。本发明提供的抗环匹阿尼酸单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对环匹阿尼酸的50％抑制浓度IC₅₀为0.84ng/mL，对黄曲霉毒素和杂色曲霉毒素的交叉反应率均小于0.1％，可应用于环匹阿尼酸的残留检测。

Description

杂交瘤细胞株YTT-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株YTT-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体。

背景技术

环匹阿尼酸(CPA)是青霉菌属和曲霉菌属真菌产生次级代谢产物，稳定性好，一般的储存条件和加工程序不能破坏环匹阿尼酸，其毒性主要表现为胃肠溃疡、脾脏萎缩、肾病、肝脏和心肌坏死。同时，环匹阿尼酸是肌质网中钙依赖性ATP酶的特异性抑制剂，导致Ca²⁺浓度升高，致使肌肉收缩增加，造成细胞膜通透性增加，神经元骨架破坏，神经细丝分解，神经微观解聚，导致神经元坏死。环匹阿尼酸可污染花生、玉米、棉籽、饲料等农产品，并能通过饲料转移到牛奶和鸡蛋中。环匹阿尼酸可与黄曲霉毒素同时产生，通常适合黄曲霉毒素产生的条件，也适合环匹阿尼酸产生，因此，环匹阿尼酸造成的农产品、食品安全问题会被同时产生的黄曲霉毒素掩盖，目前研究认为“火鸡X病”、“Kodua中毒”是由环匹阿尼酸与黄曲霉毒素共同引起。一些黄曲霉毒素未检出的农产品中可能含有高浓度的环匹阿尼酸，引起人畜的健康危害。因此，需要建立农产品中CPA的快速、可靠的免疫学检测技术。因此探究及农产品、食品中环匹阿尼酸的分析方法具有重要的意义。

目前环匹阿尼酸分析检测方法主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用等。薄层色谱法由于前处理操作过程中有机溶剂以及毒素会对操作人员产生毒害作用，且测定结果灵敏度和准确度不高。高效液相色谱法、液质联用等仪器分析法是常用的定性定量分析法，这些方法虽然灵敏度高、稳定性强，但需要大量时间进行复杂的前处理，而且需要严格的实验室环境，昂贵的仪器设备以及专业的操作人员，不能满足现场污染检测。免疫分析是基于抗原与抗体的特异性结合反应，通过免疫标记技术，将酶、放射性元素、胶体金等标记物与抗原或抗体结合，用于定性定量检测待检物质，其中抗体是核心试剂，其质量很大程度上决定了免疫分析的灵敏度与特异性，而只有高质量的抗体才能满足免疫分析。目前，国内外有关CPA的检测方法主要为仪器检测，鲜有针环匹阿尼酸免疫学检测技术的报道。因此，抗环匹阿尼酸单克隆抗体的研究获得可为环匹阿尼酸的快速检测开辟新思路，对实现环匹阿尼酸免疫定量检测具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株YTT-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体。

本发明提供了杂交瘤细胞株YTT-2，该细胞株已于2018年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201871。其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的抗环匹阿尼酸单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO:2所示的抗环匹阿尼酸单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

抗环匹阿尼酸单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该抗环匹阿尼酸单克隆抗体可以特异性识别环匹阿尼酸，对环匹阿尼酸的50％抑制浓度IC50为0.84ng/mL。

抗环匹阿尼酸单克隆抗体在环匹阿尼酸含量测定中的应用。

本发明所提供的杂交瘤细胞株YTT-2是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将环匹阿尼酸(CPA)和血蓝蛋白(KLH)通过曼尼希反应，合成了完全抗原CPA-KLH，将其乳化后免疫雌性BALB/c小鼠4-5次后，用相同免疫剂量的未乳化的CPA-KLH加强免疫，3天后进行细胞融合。采用两步梯度法筛选杂交瘤细胞：第一步利用间接非竞争ELISA法筛选出抗环匹阿尼酸而不抗载体蛋白KLH的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用CPA为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的阳性孔。采用有限稀释法稀释细胞后，用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落转移至液体培养基中培养采用同样的两步筛选法进行筛选。如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YTT-2。

本发明提供的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株YTT-2腹腔注射至预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠体内，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗环匹阿尼酸单克隆抗体。

按上述方案，所述的纯化处理方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗环匹阿尼酸单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用。

按上述方案，所述的醋酸盐缓冲液为：0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸，用超纯水定容至100mL。

按上述方案，所述的0.1mol/L磷酸盐缓冲液为：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，用超纯水定容至100mL。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的的杂交瘤细胞株YTT-2可用于制备高效价抗环匹阿尼酸单克隆抗体，抗环匹阿尼酸腹水抗体间接非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得效价可达1.2×10⁵。

(2)本发明提供的抗环匹阿尼酸单克隆抗体特灵敏度高、特异性好，对环匹阿尼酸的50％抑制浓度IC₅₀为0.84ng/mL，对黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂，M₁，P₁和杂色曲霉毒素的交叉反应率均小于0.1％。

(3)本发明提供的抗环匹阿尼酸单克隆抗体可应用于环匹阿尼酸含量测定。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株YTT-2的筛选

1.抗原合成及动物免疫

购买市售环匹阿尼酸标准品进行完全抗原合成，具体的合成步骤如下：将1mg CPA溶于1mL 0.05M NaHCO₃的50％甲醇水溶液中；取2mg血蓝蛋白(KLH)加入0.4ml 3M醋酸钠，在室温搅拌条件下，1min内逐滴加入0.2mL甲醛，持续搅拌10min；将CPA逐滴缓慢加入到KLH中，室温条件下持续搅拌16h以上。将最终反应产物CPA-KLH置于合适大小透析袋内，于PBS中4℃揽拌透析三天。同样方法合成检测原CPA-OVA。

购买6周龄雌性BaLb/c小鼠6只，免疫自行合成的环匹阿尼酸完全抗原CPA-KLH，免疫剂量为100μg/只。第一次免疫将完全抗原CPA-KLH与弗氏完全佐剂混合乳化，进行背部皮下多点注射免疫。初免间隔3周，之后每次间隔2周进行免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化进行免疫。从第三次免疫一周后，进行尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，用间接竞争ELISA 法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次冲刺免疫，融合前3天取100μg免疫原溶于200μL PBS直接注射腹腔。弗氏佐剂购于Sigma-Aldrich公司。

2.细胞融合

最后一次冲刺免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤如下：

颈椎脱臼法处死免疫小鼠，在无菌条件下摘取脾脏，研磨分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0按5:1个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20％(体积百分数)胎牛血清，2％(重量百分数)生长因子和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2面积大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA 方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接非竞争ELISA法筛选出抗环匹阿尼酸而不抗载体蛋白KLH的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，以环匹阿尼酸作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株YTT-2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201871。

实施例2：抗环匹阿尼酸单克隆抗体杂交瘤细胞株系YTT-2抗体可变区序列测定

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株YTT-2的总RNA。

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃50s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至苏州泓迅生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’(22mer)和5’-TGA GGA GACGGTGAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3’(24mer)和5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长360bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由120个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长322bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由107个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。

实施例3：抗环匹阿尼酸单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定

将实施例2获得的环匹阿尼酸单克隆抗体杂交瘤细胞株YTT-2腹腔注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠体内，收集小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗环匹阿尼酸单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.9g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株YTT-2分泌的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的亚型为IgG2a型。

用常规间接非接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YTT-2的鼠腹水抗体的效价可达1.2×10⁵，即鼠腹水抗体稀释1.2×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。常规间接竞争ELISA法鉴定其对环匹阿尼酸的灵敏度(IC₅₀)为0.84ng/mL，对黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1和杂色曲霉毒素的交叉反应率均小于0.1％。

实施例4：抗体应用

将杂交瘤细胞株YTT-2分泌的抗环匹阿尼酸单克隆抗体用于环匹阿尼酸的添加回收试验，具体包括以下步骤：

(1)以2μg/mL人工抗原CPA-OVA包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜，0.01mol/L pH7.4 PBST洗涤扣干；

(2)4％脱脂奶粉配成封闭液封闭，每孔200μL，37℃1h，洗涤扣干；

(3)配制0，0.050805，0.15242，0.45725，1.3717，4.1152，12.3457，37.037，111.11，333.33，1000ng/mL的环匹阿尼酸标准溶液(含10％甲醇的磷酸盐缓冲液)，第一排每孔依次加入待测CPA标准溶液50μL，其它孔作为检测孔，每个样品三个重复，每孔抗环匹阿尼酸单克隆抗体(稀释9000倍)50μL，37℃孵育1h，洗涤扣干；

(4)每孔加1：5000羊抗鼠IgG-HRP 100μL，37℃孵育1h，洗涤扣干；

(5)底物显色反应：每孔加底物显色液100μL(所述底物显色液的配制：1mg/mL四甲基联苯胺0.5mL，底物缓冲液9.5mL，1％H₂O₂ 37μL，现配现用)，37℃避光反应15min，每孔50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应，450nm测吸光值；

(6)绘制标准曲线，并计算环匹阿尼酸对抗原抗体结合反应的抑制率在50％时的浓度(IC₅₀)。

(7)添加回收试验：分别称取5g粉末样品于50mL离心管中，加入20ml甲醇/2％NaHCO₃水溶液，振荡提取1h，离心取上清。分次加入50mL正己烷，振荡混合萃取，分层后收集下层水相。加入5ml 10％氯化钾溶液，并用HCl调节至pH 2-3。分次加入30mL氯仿振荡混合多次提取，收集下层氯仿。旋转蒸发除去氯仿，然后准确加入2mL甲醇充分溶解，用0.45μm有机滤膜过滤。向滤液中分别加入准确添加50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的环匹阿尼酸，采用间接竞争ELISA方法进行添加回收试验，测定大米、玉米、花生样品的添加回收率在83.6％-97.7％之间，且具有较好的重复性和准确性。

ELISA所需溶液配制：

磷酸盐缓冲液(pH7.4PBS):Na₂HPO₄·12H₂O 8.7g，NaCl 24g，KCl 0.6g，KH₂PO₄0.6g，用超纯水定容至3000mL。

包被用包被缓冲液(PH9.6碳酸盐缓冲液)：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，用超纯水定容至1000mL。

0.5％吐温20的PBS溶液(PBST溶液)：Na₂HPO₄.12H₂O 8.7g，NaCl 24g，KCl 0.6g，KH₂PO₄ 0.6g，Tween-20 1.5mL，用超纯水定容至3000mL。

封闭液：4g脱脂奶粉溶于100mL PBST。

底物缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 1.843g，柠檬酸0.933g，用超纯水定容至100mL。

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 杂交瘤细胞株YTT-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体

<160> 4

<210> 1

<211> 360bp

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 1

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgac ctgatgaagc ctggggcttc 50

agtgaagata tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact acctactaca 100

tgcactgggt gaagcagagc catggaaaga gccttgagtg gattggatat 150

attgatcctt tcaatggtga tactaggtac aacccgaaat tcaaggccaa 200

ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac atgcagctca 250

gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagtttat 300

tactacggta gtagctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac 350

tgtctctgca 360

<210> 2

<211> 322bp

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga 50

cacagtcacc atcacttgcc atgcaagtca gggcattagc agtaatatag 100

ggtggttgca gcagaaacca gggaaatcat ttaagggcct gatctatcaa 150

ggaagcaact tggaagatgg agttccatca aggttcagtg gcagtggatc 200

tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat gaagattttg 250

cagactatta ctgtgtacag tttgctcagt ttcctcccac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Met Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

Thr Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Asp Thr Arg Tyr

50 55 60

Asn Pro Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser

95 100 105

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

110 115 120

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser

20 25 30

Ser Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys

35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln

80 85 90

Phe Ala Gln Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105

Leu Lys

107

Claims

1.杂交瘤细胞株YTT-2，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:C201871。

2.抗环匹阿尼酸单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述的保藏编号为CCTCCNO:C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。

3.权利要求2所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的杂交瘤细胞株YTT-2注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗环匹阿尼酸单克隆抗体。

4.权利要求2所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体在环匹阿尼酸含量测定中的应用。