BG62685B1 - Състави и методи за стимулиране растежа и диференциацията на мегакариоцитите - Google Patents

Abstract

Изобретението включва нови белтъци, отнасящи се към мегакариоцитите - факторите за растеж и развитие на MGDFs, наречени обобщено MpL лиганди. Тяхнатабиологична активност стимулира растежа и развитието или узряването на мегакариоцитите, при което сеполучават тромбоцити. Изобретението се отнася също до производни на MGDF, включващи MGDF молекули, свързани с водородразтворими полимери като полиетиленгликол, до методите за тяхното получаване и процесите за получаване на MGDFs в хомогенна форма отестествени източници и продуцирането им чрез рекомбинантни генноинженерни техники от бозайници, включително от хора. </P>

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

ИЗОБРЕТЕНИЕТО СЕ ОТНАСЯ ДО НОВИ БЕЛТЪЦИ, НАРИЧАНИ СИНОНИМНО Мр1 ЛИГАНДИ ИЛИ MGDFs. КОИТО СТИМУЛИРАТ РАСТЕЖА НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ , УСКОРЯВАТ ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА ИЛИ УЗРЯВАНЕТО ИМ И КАТО КРАЕН ЕФЕКТ УВЕЛИЧАВАТ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ, ПРЕДСТАВЕНИ СА ПРОЦЕСИТЕ, ПРИ КОИТО ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СЕ ПОЛУЧАВАТ В ХОМОГЕНЕН ВИД ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ, И ПОЛУЧАВАНЕТО ИМ ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ГЕННОИНЖЕНЕРНИ ТЕХНИКИ.

ИЗОБРЕТЕНИЕТО СЕ ОТНАСЯ И ДО НОВ КЛАС ПРОИЗВОДНИ MGDF, ПРИ КОИТО MGDF МОЛЕКУЛАТА Е СВЪРЗАНА С ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР, А СЪЩО И ДО МЕТОДИТЕ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТАКИВА МОЛЕКУЛИ.

ОТ ТРЕТА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА ПРОИЗВОДНИ MGDF, ПРИ КОИТО MGDF МОЛЕКУЛАТА Е СВЪРЗАНА С ЕДНА И ПОВЕЧЕ ГРУПИ ПОЛИЕТИЛЕН ТЛИКОЛ /PEG/ И МЕТОДИТЕ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТЕЗИ МОЛЕКУЛИ.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ЗАСЕГНАТИ НАЙ-МАЛКО ДВЕ РАЗЛИЧНИ НАУЧНИ ОБЛАСТИ. ПЪРВАТА Е СВЪРЗАНА С РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ПОСЛЕДВАЩОТО ПРОИЗВОДСТВО НА ТРОМБОЦИТИ, А ВТОРАТА КАСАЕ ПОЛИПЕПТИДНАТА ЧАСТ ОТ РЕЦЕПТОР ЗА РАСТЕЖЕН ФАКТОР, НАРИЧАН ТУК Мр1 РЕЦЕПТОР И НЕГОВИТЕ ЛИГАНДИ. ВСЯКА ОТ ТЕЗИ ОБЛАСТИ НА ИЗСЛЕДВАНЕ ЩЕ БЪДЕ РАЗГЛЕДАНА ПО-ДОЛУ.

А.ПРОДУЦИРАНЕ НА ТРОМБОЦИТИ ОТ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ

ТРОМБОЦИТЕ СА ЦИРКУЛИРАЩИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, КОИТО ИМАТ РЕШАВАЩА РОЛЯ ЗА ПРЕДОТВРАТЯВАНЕТО НА КРЪВОИЗЛИВИ И СЪЩЕСТВЕНО ЗНАЧЕНИЕ ЗА КОАГУЛАЦИЯТА НА КРЪВТА. МЕГАКАРИОЦИТИТЕ СА КЛЕТЪЧНИЯТ ИЗТОЧНИК ЗА ТРОМБОЦИТИТЕ И ПРОИЗХОЖДАТ ОТ ОБЩА КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК В КОСТНИЯ МОЗЪК, КОЯТО ДАВА НАЧАЛОТО НА ЦЯЛОТО ХЕМОПОЕТИЧНО КЛЕТЪЧНО РОДОСЛОВИЕ. ТАЗИ КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК Е ПОЗНАТА КАТО ПЛУРИПОТЕНТНА СТВОЛОВА КЛЕТКА ИЛИ PPSC.

РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТНАТА КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК Е БИЛО ПРОСЛЕДЕНО ПО ВРЕМЕТО НА ПОЯВАТА И ФОРМАТА НА МЕГАКАРИОЦИТНИТЕ /МК/ КОЛОНИИ В IN VITRO КЛЕТЪЧНИ СИСТЕМИ В ОТГОВОР НА ПОДХОДЯЩИ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ. ВЗРИВООБРАЗНО КОЛОНИЯ-ОБРАЗУВАЩАТА ЕДИНИЦА /BFU-МК/ Е НАЙ-ПРИМИТИВНАТА МЕГАКАРИОЦИТНА КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК. СЧИТА СЕ, ЧЕ BFU-МК ДАВА НАЧАЛО НА МНОГОБРОЙНИ КОЛОНИЯОБРАЗУВАЩИ ЕДИНИЦИ НА МЕГАКАРИЦИТИТЕ /CFU-МК/, КОИТО СА ПОДИФЕРЕНЦИРАНИ МЕГАКАРИОЦИТНИ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ.

-2СЛЕД КАТО МК КЛЕТКИТЕ ПРЕТЪРПЯТ СЛЕДВАЩА ДИФЕРЕНЦИАЦИЯ ТЕ ЗАГУБВАТ СПОСОБНОСТТА СИ ДА СЕ ДЕЛЯТ ЧРЕЗ МИТОЗА, НО ПРИДОБИВАТ СПОСОБНОСТ ДА СЕ ЕНДОРЕДУППИЦИРАТ. ЕНДОРЕДУПЛИКАЦИЯ ИЛИ ЕНДОМИТОЗА Е ЯВЛЕНИЕ, ПРИ КОЕТО В КЛЕТКАТА Е НАЛИЦЕ ДЕЛЕНИЕ НА ЯДРОТО БЕЗ ДА ИМА КЛЕТЪЧНО ДЕЛЕНИЕ. КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ ОТ ЕНДОРЕДУПЛИКАЦИЯТА Е МК , КОЙТО Е ПОЛИПЛОИД. ПРИ ПО-НАТАТЪШНОТО УЗРЯВАНЕ НА МК СЕ ПОЯВЯВАТ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ОРГАНЕЛИ И МЕМБРАННИ СЪДЪРЖИМИ, КОИТО СА ХАРАКТЕРНИ ЗА ТРОМБОЦИТИТЕ.

ТРОМБОЦИТИТЕ СЕ ПОЛУЧАВАТ ОТ УЗРЕЛИ МК ЧРЕЗ ПРОЦЕС, КОЙТО НЕ Е ДОБРЕ ИЗУЧЕН И ЗА КОЙТО СЕ ПРЕДПОЛАГА, ЧЕ Е СЛЕДСТВИЕ ОТ ФИЗИЧЕСКА ФРАГМЕНТАЦИЯ ИЛИ ДРУГИ МЕХАНИЗМИ. ОБСТОЙНИТЕ НАБЛЮДЕНИЯ НА МЕМБРАННИТЕ СТРУКТУРИ В МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ДОВЕДОХА ДО МОДЕЛ ЗА ТРОМБОЦИТНОТО ОБРАЗУВАНЕ. ПРИ КОИТО ЗАРАЖДАЩИТЕ СЕ В КЛЕТЪЧНОТО ТЯЛО ТРОМБОЦИТИ СА ОТДЕЛЕНИ С РАЗГРАНИЧИТЕЛНА МЕМБРАНА.

ДРУГ МОДЕЛ ЗА ОБРАЗУВАНЕТО НА ТРОМБОЦИТИТЕ Е ПОЛУЧЕН ПРИ НАБЛЮДЕНИЕ, ЧЕ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ФОРМИРАТ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ГРАНУЛИ, ПРИЩЪПНАТИ НА ИНТЕРВАЛИ С ГОЛЕМИНАТА НА ТОРМБОЦИТ, ОТ КОИТО ТРОМБОЦИТИТЕ ВЕРОЯТНО СЕ ОТКЪСВАТ ПОД ДЕЙСТВИЕ НА НАЛЯГАНЕТО НА КРЪВНИЯ ПОТОК В КОСТНИЯ МОЗЪК И/ИЛИ БЕЛИЯ ДРОБ. ЗА ДА ОТБЕЛЕЖАТ ПРЕДПОЛАГАЕМАТА РОЛЯ НА ТЕЗИ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ГРАНУЛИ КАТО ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ ВЪВ ФОРМИРАНЕТО НА ТРОМБОЦИТИТЕ BECKER И DEBRUYN ГИ НАРИЧАТ ПРО-ТРОМБОЦИТИ. /ВИЖ. BECKER AND DEBRUYN, AMER. J. ANAT. 145: 183. (1976) /.

ФИГ. 1. ПРЕДСТАВЛЯВА ПРЕГЛЕД HA РАЗЛИЧНИТЕ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ, УЧАСТВАЩИ В РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ТРОМБОЦИТИТЕ. КЛЕТКАТА В КРАЙНАТА ЛЯВА ЧАСТ НА ФИГУРАТА ПРЕДСТАВЛЯВА PPSC,

-3СЛЕДВАЩАТА КЛЕТКА ВДЯСНО ПРЕДСТАВЛЯВА BFU - МК, СЛЕДВАНА ОТ CFUМК. КЛЕТКАТА, НАМИРАЩА СЕ В ЕНДОРЕДУПЛИКАЦИЯ, КОЯТО Е РАЗПОЛОЖЕНА НЕПОСРЕДСТВЕНО ВДЯСНО ОТ PPSC НА ФИГУРАТА Е ЗРЯЛА МЕГАКАРИОЦИТНА КЛЕТКА. В РЕЗУЛТАТ НА ЕНДОМИТОЗАТА ТАЗИ КЛЕТКА Е СТАНАЛА ПОЛИПЛОИД. СЛЕДВАЩАТА ФИГУРА ВДЯСНО ПОКАЗВА ДЪЛГИТЕ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ГРАНУЛИ, ПОЯВЯВАЩИ СЕ ОТ ПОЛИПЛОИДНИТЕ ЯДРА НА ЗРЯЛАТА МЕГАКАРИОЦИТНА КЛЕТКА. В НАЙ-ДЯСНАТА СТРАНА НА ФИГУРАТА СА ПОКАЗАНИ НЯКОЛКО ТРОМБОЦИТА, ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗ ФРАГМЕНТАЦИЯ НА ЦИТОПЛАЗМЕНИТЕ ГРАНУЛИ.

СЛЕДВА СПИСЪК НА НЯКОИ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С ТУК ОПИСАНОТО ЗРЕЕНЕ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ:

1. WILLIAMS, N. AND LEVINE, R.F., BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY 52: 173-180 (1982).

2. LEVIN, J., MOLECULAR BIOLOGY AND DIFFERENTIATION OF MEGAKARYOCYTES, PUB. WILEY-LISS, INC.: 1-10 (1990).

3. GEWIRTZ, A.M., THE BIOLOGY OF HEMATOPOIESIS, PUB. WILEY-LISS, INC. :123-132 (1990).

4. HAN, Z.C., ET AL., INT. J. HEMATOL. 54: 3-14 (1991).

5. NIEUWENHUIS, H.K. AND SIXMA, J., NEW ENG. J. OF MED. 327 : 1812-1813 (1992).

6. LONG, M„ STEM CELLS 11 : 33-40 (1993).

Б. РЕГУЛАЦИЯ НА ОБРАЗУВАНЕТО НА ТРОМБОЦИТИ,

ГОЛЯМО КОЛИЧЕСТВО ДАННИ, СЪБРАНИ В РЕДИЦА ЛАБОРАТОРИИ, ПОКАЗВАТ, ЧЕ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ СЕ РЕГУЛИРА ОТ ХУМОРАЛНИ ФАКТОРИ. СЛОЖНОСТТА НА ТОЗИ БИОЛОГИЧЕН ПРОЦЕС ПЪРВОНАЧАЛНО НЕ БЕ ОЦЕНЕНА И ВПОСЛЕДСТВИЕ СЕ ОКАЗА, ЧЕ ТАКАВА СПОСОБНОСТ ПРИТЕЖАВАТ ГРУПА ЧОВЕШКИ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ.

МЕГАКАРИОЦИТНАТА РЕГУЛАЦИЯ СЕ ОСЪЩЕСТВЯВА НА МНОГО КЛЕТЪЧНИ НИВА. ГРУПА ЦИТОКИНИ УВЕЛИЧАВА ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ ЧРЕЗ РАЗШИРЯВАНЕ НА КЛЕТЪЧНИЯ ПУЛ НА КЛЕТКИТЕ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. ВТОРА ГРУПА РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ДЕЙСТВАТ КАТО ФАКТОРИ НА ЗРЕЕНЕТО ВЪРХУ ПО-ДИФЕРЕНЦИРАНИ КЛЕТКИ ИЛИ СПОМАГАТ ЕДНДОРЕДУПЛИКАЦИЯТА. В ДОПЪЛНЕНИЕ СЕ ОКАЗА, ЧЕ ИМА ДВА НЕЗАВИСИМИ БИОЛОГИЧНИ ЦИКЪЛА С ОБРАТНА ВРЪЗКА₅РЕГУЛИРАЩИ ТЕЗИ ПРОЦЕСИ.

НЯКОЛКО ЛИНИИ НЕСПЕЦИФИЧНИ ХЕМАТОПОЕТИЧНИ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ОКАЗВАТ ВАЖНИ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ЗРЕЕНЕТО НА МК. СТИМУЛИРАЩИЯТ ФАКТОР НА ГРАНУЛОЦИТО-МАКРОФАГОВАТА КОЛОНИЯ /GM-CSF/, ИНТЕРЛЕВКИН - 3 /IL-З/, IL-6, IL-11, ЛЕВКЕМИЯ ИНХИБИРАЩИЯТ ФАКТОР /LIF/ И ЕРИТРОПОЕТИНА /ЕРО/, ВСЕКИ ПООТДЕЛНО СПОСОБСТВА ЗРЕЕНЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МК, КАКТО Е ПОКАЗАНО ПО ТЕХНИТЕ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ГОЛЕМИНАТА, БРОЯ ИЛИ ПЛОИДНОСТТА НА МК. ЕФЕКТИТЕ ВЪРХУ МК ЗРЕЕНЕТО НА LIF, IL-6 И IL-11 СА ИЛИ ЧАСТИЧНО /LIF И IL-б/, ИЛИ НАПЪЛНО /IL-11/ДОПЪЛНИТЕЛНИ КЪМ ТЕЗИ НА IL-З. ИЗПОЛЗВАЙКИ ДАННИ ОТ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ МОЖЕ ДА СЕ ПРЕДПОЛОЖИ, ЧЕ КОМБИНАЦИИ ОТ ЦИТОКИНИ МОЖЕ ДА СЕ ОКАЖЕ НЕОБХОДИМА ЗА СПОМАГАНЕ НА МК ЗРЕЕНЕТО IN VITRO.

СЛЕДВА СПИСЪК НА НЯКОИ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С РЕГУЛАЦИЯТА НА ПРОИЗВОДСТВОТО НА МЕГАКАРИОЦИТИ И ТРОМБОЦИТИ:

7. HOFFMAN, R. ЕТ AL., BLOOD CELLS 13: 75-86 (1987).

8. MURPHY, M.J., HEMATOLOGY/ONCOLOGY CLINICS OF NORTH AMERICA 3 (3): 465-478 (1988).

9. HOFFMAN, R„ BLOOD 74 (4): 1196-1212 (1989).

10. MAZUR, E.M. AMD COHEN, J. L, CLIN. PHARMACOL. THER., 46 (3) : 250 - 256 (1989).

11. GEWIRTZ, A.M. AND CALABRETTA, B., INT. J. CELL CLONING 8: 267- 276 (1990).

12. WILLIAMS, N., PROGRESS IN GROWTH FACTOR RESEARCH 2: 81-95 (1990).

13. GORDON, M.S. AND HOFFMAN, R„ BLOOD 80 (2): 302-307 (1992).

14. HUNT, P. ET. AL., EXP. HEMATOL. 21: 372-281 (1993).

15. HUNT, P. ET AL., EXP. HEMATOL. 21: 1295-1304 (1993)

ДОКЛАДВАНО Е СЪЩО ТАКА /ВИЖ ТОЧКА 16/, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ АПЛАСТИЧЕН СЕРУМ ПРИТЕЖАВА СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТНАТА КОЛОНИЯ, РАЗЛИЧНА ОТ ТАЗИ НА IL-3, СТИМУЛИРАЩИЯ ФАКТОР НА ГРАНУЛОЦИТНАТА КОЛОНИЯ И ФАКТОРИТЕ, ПРИСЪСТВАЩИ В ЛИМФАТА. МОЛЕКУЛАТА ^ОТГОВОРНА ЗА ТАЗИ АКТИВНОСТ,ОБАЧЕ НЕ Е БИЛА ИЗОЛИРАНА, НИТО ХАРАКТЕРИЗИРАНА В ПРЕДИШЕН ТРУД.

16. MAZUR, Е.М., ЕТ AL., BLOOD 76: 290-297/1990/

В, Mpl РЕЦЕПТОР

МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНИЯТ ЛЕВКЕМИЧЕН ВИРУС /MPLV/ Е МИШИ РЕПЛИКАЦИОННО ДЕФЕКТЕН РЕТРОВИРУС, КОЙТО ПРИЧИНЯВА АКУТНА ЛЕВКЕМИЯ В ЗАРАЗЕНИТЕ БОЗАЙНИЦИ. УСТАНОВЕНО Е, ЧЕ ГЕН ЕКСПРЕСИРАН

-6ОТ MPLV СЕ СЪСТОИ ОТ ЧАСТ ОТ ГЕН. КОДИРАЩ СИНТЕЗАТА НА ВИРУСНАТА ОБВИВКА, СВЪРЗАН СЪС СЕГМЕНТ, ОТНАСЯЩ СЕ ДО СЕМЕЙСТВОТО НА ЦИТОКИНОВИТЕ РЕЦЕПТОРИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО РЕЦЕПТОРИТЕ ЗА GM-CSF, G-CSF И ЕРО.

ЕКСПРЕСИЯТА НА MPLV ГЕНА, ОПИСАН ПО-ГОРЕ, ПРИТЕЖАВА ИНТЕРЕСНАТА БИОЛОГИЧНА СПОСОБНОСТ ДА ПРЕДИЗВИКВА НЕЗАБАВНО ПРИДОБИВАНЕ НА РАСТЕЖНО-ФАКТОРНА НЕЗАВИСИМОСТ КАКТО ЗА ПРОЛИфЕРАЦИЯТА, ТАКА И ЗА УЗРЯВАНЕТО НА МИШИ КЛЕТКИ ОТ РАЗЛИЧНИ ВИДОВЕ. НЕЩО ПОВЕЧЕ НЯКОИ КЛЕТЪЧНИ КУЛТУРИ ОТ КОСТЕН МОЗЪК АКУТНО ТРАНСФОРМИРАНИ ОТ MPLV СЪДЪРЖАТ МЕГАКАРИОЦИТИ, КОЕТО ПРЕДПОЛАГА, ЧЕ СЪЩЕСТВУВА ВРЪЗКА МЕЖДУ MPLV ГЕНА И РАСТЕЖА И ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ.

ВЕЧЕ Е УСТАНОВЕНО, ЧЕ ВИРУСНИЯТ ГЕН НА MPLV /НАРИЧАН ТУК V-Mpl/ ИМА ХОМОЛОГ В КЛЕТКИТЕ НА БОЗАЙНИЦИТЕ, НАРИЧАН КЛЕТЪЧЕН MPL ГЕН /ИЛИ СMpl/. С ПОМОЩТА НА ПРОБИ С V-Mpl ПРОИЗХОД Е КЛОНИРАНА кДНК, СЪОТВЕТСТВАЩА НА ЧОВЕШКИЯ С-MPL ГЕН. ВИЖ РСТ ПУБЛИКУВАНА ЗАЯВКА WO 92/07074 /ПУБЛИКУВАНА НА 30 АПРИЛ 1992; РАЗГЛЕДАНА ПО-ДОЛУ/. РЕДИЦА АНАЛИЗИ ПОКАЗАХА, ЧЕ БЕЛТЪКА, КОДИРАН ОТ С-Mpl ГЕНА ПРИНАДЛЕЖИ КЪМ СЕМЕЙСТВОТО НА СИЛНО КОНСЕРВАТИВНИЯ ЦИТОКИНОВ РЕЦЕПТОР, СЪЩО КАТО СЪОТВЕТНИЯ V-Mpl ГЕНЕН ПРОДУКТ.

СМЯТА СЕ, ЧЕ ТОЗИ КЛЕТЪЧЕН C-Mpl ГЕН ИГРАЕ ФУНКЦИОНАЛНА РОЛЯ В ХЕМОПОЕЗАТА. ТОВА СТАНОВИЩЕ СЕ БАЗИРА НА НАБЛЮДЕНИЕ ^НАПРАВЕНО С ПОМОЩТА НА РНК-ЗАЩИТЕНА ПРОБА И RT-PCR ЕКСПЕРИМЕНТИ, ПОКАЗВАЩИ, ЧЕ Е НАЛИЦЕ ЕКСПРЕСИЯ НА ТОЗИ ГЕН В КОСТЕН МОЗЪК, ДАЛАК И БЯЛ ДРОБ ОТ МЪРТВИ МИШКИ, НО НЕ И В ДРУГИ ОРГАНИ. ПО-СПЕЦИАЛНО С-Mpl ГЕНА Е ЕКСПРЕСИРАН ВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТИ. СЪЩО ТАКА Е ПОКАЗАНО, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ С-Mpl КЛЕТЪЧЕН ГЕН Е ЕКСПРЕСИРАН В CD - ПОЗИТИВНИ КЛЕТКИ,

-7ВКЛЮЧИТЕЛНО ПРЕЧИСТЕНИ МЕГАКАРИОЦИТИ И ТРОМБОЦИТИ. CD Е АНТИГЕН, ПРИСЪЩ НА РАННИ ХЕМАТОПОЕТИЧНИ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. ОЩЕ ПОВЕЧЕ ПРИ СМЕСВАНЕТО НА СИНТЕТИЧНИ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕТИДИ, КОИТО СА БЕЗСМИСЛЕНИ ЗА МАТРИЧНАТА РНК НА С-Мр1 ЧУВСТВИТЕЛНО СЕ ИНХИБИРА КОЛОНИЯ ФОРМИРАЩАТА СПОСОБНОСТ НА ПРЕДШЕСТВЕНИЦИТЕ НА CFU-M, НО НЕ СЕ ПОВЛИЯВАТ ЕРИТРОЦИТНИТЕ И ГРАНУЛОМАКРОфАГОВИТЕ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ.

ВЪЗ ОСНОВА НА ГОРЕСПОМЕНАТИТЕ НАБЛЮДЕНИЯ МОЖЕ ДА СЕ ПРЕДПОЛОЖИ, ЧЕ С-Mpl КОДИРА МОЛЕКУЛА ОТ КЛЕТЪЧНАТА ПОВЪРХНОСТ, НАРИЧАНА ТУК Мр1 РЕЦЕПТОР, КОЯТО СЕ СВЪРЗВА С ЛИГАНД, АКТИВИРАЩ РЕЦЕПТОРА И ВЕРОЯТНО ТОВА ВОДИ ДО ПРОИЗВОДСТВО И/ИЛИ РАЗВИТИЕ НА МЕГАКАРИОЦИТИ.

РСТ ПАТЕНТНАТА ПУБЛИКАЦИЯ НА ЗАЯВКА WP 92/07074 РАЗГЛЕЖДА БЕЛТЪЧНИЯ СЕГМЕНТ, ПРОИЗВЕДЕН ОТ С-Mpl ГЕНА ОТ ЧОВЕШКИ И МИШИ ПРОИЗХОД. СМЯТА СЕ, ЧЕ ТОЗИ ГЕНЕН ПРОДУКТ Е РЕЦЕПТОР, КАКТО БЕШЕ СПОМЕНАТО ПО-ГОРЕ И ЧЕ ТОЙ Е ИЗГРАДЕН ОТ ТРИ ГЛАВНИ УЧАСТЪКА ИЛИ ДОМЕНА: ИЗВЪНКЛЕТЪЧЕН ДОМЕН, ТРАНСМЕМБРАНЕН ДОМЕН И ВЪТРЕКЛЕТЪЧЕН ИЛИ ЦИТОПЛАЗМЕН ДОМЕН. СВЪРЗАНИ ЗАЕДНО ТЕЗИ ДОМЕНИ ОБРАЗУВАТ ИНТАКТНИЯ Мр1 РЕЦЕПТОР. ТАЗИ РСТ ПУБЛИКАЦИЯ РАЗГЛЕЖДА СЪЩО ТАКА РАЗТВОРИМАТА ФОРМА НА РЕЦЕПТОРА, КОЯТО ВСЪЩНОСТ СЪОТВЕТСТВА НА ИЗВЪНКЛЕТЪЧНИЯ ДОМЕН НА С-Mpl ПРОТЕИНА. ВЪТРЕКЛЕТЪЧНИЯТ ДОМЕН СЪДЪРЖА ХИДРОФОБЕН УЧАСТЪК, КОЙТО ПРИ СВЪРЗВАНЕ С ИЗВЪНКЛЕТЪЧНИЯ ДОМЕН ЧРЕЗ ТРАНСМЕМБРАННИЯ УЧАСТЪК НА БЕЛТЪКА ПРИДАВА НА ЦЕЛИЯ БЕЛТЪК НЕРАЗТВОРИМОСТ И СПОСОБНОСТ ЗА АГРЕГАЦИЯ. ОТ ДРУГА СТРАНА? КОГАТО ИЗВЪНКЛЕТЪЧНИЯТ УЧАСТЪК НА С-Mpl ГЕННИЯ ПРОДУКТ Е ОТДЕЛЕН ОТ ТРАНСМЕМБРАННИЯ ДОМЕН И ВЪТРЕКЛЕТЪЧНИЯ ДОМЕН ТОЙ СТАВА РАЗТВОРИМ, ПОРАДИ КОЕТО ИЗВЪНКЛЕТЪЧНАТА ЧАСТ НА БЕЛТЪКА Е НАРИЧАНА ТУК „РАЗТВОРИМА“ ФОРМА НА РЕЦЕПТОРА.

-8СЛЕДВА СПИСЪК НА НЯКОИ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С ГОРЕОПИСАНИТЕ V-Mpl И С-Мр1 РЕЦЕПТОРИ И ГЕНИ:

17. WENDLING, Е, ЕТ AL, LEUKEMIA 3 (7) : 475 - 480 /1989/.

18. WENDLING, F. ЕТ AL., BLOOD 73 (5) : 1161 -1167 /1989/.

19. SOUYRI, M., ET AL., CELL 63 : 1137 -1147 /1990/.

20. VIGON, I., ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 5640 - 5644 /1992/.

21. SKODA, R.C., ET AL, THE EMBO JOURNAL 12 (7): 2645 - 2653 /1993/.

22. OGAWA, M., BLOOD 81 (11) : 2844 - 2853 /1993/.

23. METHIA, N.. ET AL., BLOOD 82 (5) : 1395 -1401 /1993/.

24. WENDLING, F. ET AL., BLOOD 80 : 246 a /1993/.

Г. НУЖДАТА ОТ АГЕНТ, СПОСОБЕН ДА СТИМУЛИРА ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ

НАСКОРО БЕ ПУБЛИКУВАНО, ЧЕ ТРАНСфУЗИИ НА ТРОМБОЦИТИ СЕ ПРИЛАГАТ ВСЕ ПО-ЧЕСТО В МЕДИЦИНСКИ ЦЕНТРОВЕ В СЕВЕРНА АМЕРИКА, ЗАПАДНА ЕВРОПА И ЯПОНИЯ. /ВИЖ GORDON, M.S. И HOFFMAN, R., BLOOD 80 (2) : 302 - 307 /1992/. ИЗГЛЕЖДА^ТОВА СЕ ДЪЛЖИ ДО ГОЛЯМА СТЕПЕН НА НАПРЕДЪКА НА МЕДИЦИНСКАТА ТЕХНОЛОГИЯ И, НАЙ-ВЕЧЕ НА ТАКИВА ТЕХНОЛОГИИ КАТО СЪРДЕЧНАТА ХИРУРГИЯ И ТРАСПЛАНТАЦИИТЕ НА КОСТЕН МОЗЪК, СЪРЦЕ И ЧЕРЕН ДРОБ. УВЕЛИЧАВАНЕТО НА ДОЗИТЕ, КАТО СРЕДСТВО ЗА ОБЕЗПЕЧАВАНЕ НА ТЕРАПИЯТА НА БОЛНИ ОТ РАК И HIV - 1 ВИРУСОНОСИТЕЛИ СЪЩО ДОВЕЖДА ДО УВЕЛИЧАВАНЕ НА НУЖДАТА ОТ СНАБДЯВАНЕ С ТРОМБОЦИТИ.

-9ПРИ УПОТРЕБАТА НА ТРОМБОЦИТИ СЪЩЕСТВУВА ВЕРОЯТНОСТ ОТ ПРЕДАВАНЕ НА МНОГО КРЪВНИ ИНФЕКЦИОЗНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ, А СЪЩО ТАКА И ОТ АЛОИМУНИЗАЦИЯ. ОЩЕ ПОВЕЧЕ, ПРОИЗВОДСТВОТО НА ПРЕЧИСТЕНИ ТРОМБОЦИТИ Е СКЪПО И ПОРАДИ ТОВА С ПОВИШАВАНЕ НА УПОТРЕБАТА НА ТАКИВА ТРОМБОЦИТИ СЕ УВЕЛИЧАВАТ ВСИЧКИ МЕДИЦИНСКИ РАЗХОДИ. КАТО РЕЗУЛТАТ ОТ ТОВА СЪЩЕСТВУВА ОСТРА НУЖДА ОТ НОВИ, ПОДОБРЕНИ МЕТОДИ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ТРОМБОЦИТИ ЗА ЧОВЕШКА УПОТРЕБА.

СЛЕДВА ОПИСАНИЕ НА ПРЕДИШНИ ПОДХОДИ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ТРОМБОЦИТИ:

АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 5,032,396 СЪОБЩАВА, ЧЕ ИНТЕРЛЕВКИН-7 /11_-7/ ПРИТЕЖАВА СПОСОБНОСТ ДА СТИМУЛИРА ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ. ИНТЕРЛЕВКИН-7 Е ПОЗНАТ СЪЩО КАТО КАТО ЛИМфОПОЕТИН-1 И Е ЛИМфОПОЕТИЧЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР, ПРИТЕЖАВАЩ СПОСОБНОСТ ДА СТИМУЛИРА РАСТЕЖА НА ПРЕДШЕСТВЕНИЦИТЕ НА В- И Т - КЛЕТКИТЕ В КОСТНИЯ МОЗЪК. ПУБЛИКУВАНАТА РСТ ЗАЯВКА No 88/03747, ПОДАДЕНА НА 19 ОКТОМВРИ 1988 Г., И ЗАЯВКАТА ЗА ЕВРОПЕЙСКИ ПАТЕНТ No 88309977, ПОДАДЕНА НА 24 ОКТОМВРИ 1988 РАЗГЛЕЖДАТ ДНК-ОВИ, ВЕКТОРНИ И ДРУГИ ПОДОБНИ ПРОЦЕСИ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА IL-7 БЕЛТЪЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ С ПОМОЩТА НА РЕКОМБИНАНТНИ ДНК ТЕХНОЛОГИИ. ДАННИТЕ ПРЕДСТАВЕНИ В АМЕРИКАНСКИЯ ПАТЕНТ ПОКАЗВАТ, ЧЕ IL-7 МОЖЕ ДА УВЕЛИЧИ ЦИРКУЛИРАЩИТЕ ТРОМБОЦИТИ В НОРМАЛНИ И СУБЛЕТАЛНО ОБЛЪЧЕНИ МИШКИ.

АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 5,087,448 ПОКАЗВА, ЧЕ ПРОЛИфЕРАЦИЯТА НА МЕГАКАРИОЦИТИ И ТРОМБОЦИТИ В БОЗАЙНИЦИ МОЖЕ ДА БЪДЕ СТИМУЛИРАНА ОТ ИНТЕРЛЕВКИН-6. РЕКОМБИНАНТНИЯТ ЧОВЕШКИ ИНТЕРЛЕВКИН Е ГЛИКОПОРТЕИН-6 С МОЛЕКУЛНА МАСА 26,000 И ПРИТЕЖАВА РАЗНООБРАЗНИ БИОЛОГИЧНИ АКТИВНОСТИ. ДАННИТЕ ПРЕДСТАВЕНИ В ТОЗИ ПАТЕНТ ПОКАЗВАТ, ЧЕ IL-6 ПРИТЕЖАВА СПОСОБНОСТ ДА УВЕЛИЧАВА КОЛОНИИТЕ НА

-10МЕГАКАРИОЦИТИ IV VITRO.

И В ДВАТА ГОРЕСПОМЕНАТИ ПАТЕНТА НЕ СЕ СЪДЪРЖА ИНФОРМАЦИЯ ЗА Мр1 ЛИГАНДИТЕ, КОИТО СА РАЗГЛЕДАНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ.

НЕЗАВИСИМО ОТ СПОМЕНАТОТО ВСЕ ОЩЕ СЪЩЕСТВУВА ОСТРА НУЖДА ОТ НОВИ СТИМУЛАТОРИ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И/ИЛИ ТОРМБОЦИТИТЕ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ.

Д. ПРЕДИСТОРИЯ НА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИТЕ MGDF

В ДНЕШНО ВРЕМЕ БЕЛТЪЦИТЕ ЗА ТЕРАПЕВТИЧНИ НУЖДИ СА ДОСПЪПНИ В ПОДХОДЯЩИТЕ ФОРМИ И НЕОБХОДИМИТЕ КОЛИЧЕСТВА БЛАГОДАРЕНИЕ НА НАПРЕДЪКА НА РЕКОМБИНАНТНИТЕ ДНК ТЕХНОЛОГИИ. ХИМИЧНИ ПРОИЗВОДНИ НА ТАКИВА БЕЛТЪЦИ ЕФЕКТИВНО МОГАТ ДА БЛОКИРАТ ФИЗИЧЕСКИЯ КОНТАКТ МЕЖДУ ПРОТЕОЛЕТИЧЕН ЕНЗИМ И БЕЛТЪЧНАТА МОЛЕКУЛА И ПО ТОЗИ НАЧИН ДА ПРЕДОТВРАТЯТ РАЗГРАЖДАНЕТО Й. ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИ УСЛОВИЯ МОГАТ ДА СЕ ПОЛУЧАТ ДОПЪЛНИТЕЛНИ ПОДОБРЕНИЯ. УВЕЛИЧАВАЩИ СТАБИЛНОСТТА И ЦИРКУЛАЦИОННОТО ВРЕМЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ БЕЛТЪЦИ И НАМАЛЯВАЩИ ТЯХНАТА ИМУНОГЕННОСТ. ВЪПРЕКИ ТОВА ТРЯБВА ДА СЕ ОТБЕЛЕЖИ, ЧЕ МОДИФИКАЦИЯТА НА ОПРЕДЕЛЕН БЕЛТЪК НЕ МОЖЕ ДА БЪДЕ ТОЧНО ПРЕДСКАЗАНА. /FRANCIS, FOCUS ON GROWTH FACTORS 3 : 4 - 10 /MAY 1992/, /ПУБЛИКУВАН ОТ MEDISCRIPT, MOUNTVIEW COURT, FRIERN BARNET LANE, LONDON N20, OLD, UK/, ПРЕДСТВЛЯВА ОБЗОРЕН ТРУД ВЪРХУ МОДИФИКАЦИЯТА НА БЕЛТЪЦИ И ПРОИЗВОДНИ БЕЛТЪЦИ.

ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА /PEG/ Е ТАКЪВ ХИМИЧЕН МОДИфИКАТОР, КОЙТО СЕ ИЗПОЛЗВА ЗА ПРИГОТВЯНЕТО НА ТЕРАПЕВТИЧНИ БЕЛТЪЧНИ ПРОДУКТИ. НАПРИМЕР ADASEN ® ПРЕДСТАВЛЯВА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОДИФИЦИРАНА АДЕНОЗИН ДЕЗАМИНАЗА, КОЯТО Е ОДОБРЕНА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ТЕЖКИ

-11КОМБИНИРАНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ НА ИМУНОНЕДОСТАТЪЧНОСТ; СУПЕРОКСИД ДИЗМУТАЗА_;МОДИфИЦИРАНА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е КЛИНИЧНО ИЗПИТАНА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА НАРАНЯВАНИЯ В ГЛАВАТА; АЛфА-ИНТЕРфЕРОН^МОДИфИЦИРАН С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е БИЛ ТЕСТВАН ВЪВ ФАЗА I НА КЛИНИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ХЕПАТИТ; ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОДИФИЦИРАНАТА ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗА И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОДИФИЦИРАНИЯ ХЕМОГЛОБИН Е СЪОБЩЕНО, ЧЕ СА ПРЕДКЛИНИЧНО ТЕСТВАНИ. ПОКАЗАНО Е, ЧЕ СВЪРЗВАНЕТО НА НЯКОИ БЕЛТЪЦИ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ГИ ПРЕДПАЗВА ОТ ПРОТЕОЛИЗА, /SADA, ЕТ AL., J. FERMENTATION BIOENGINEERING 71:137-139 /1991/, И СА ДАДЕНИ МЕТОДИТЕ ЗА СВЪРЗВАНЕ НА НЯКОИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ. ВИЖ АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,179,337, DAVIS ЕТ AL., „NON - IMMUNOGENIC POLYPEPTIDES“, ИЗДАДЕН HA 18 ДЕКЕМВРИ 1979, И АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,002,531, ROYER, „MODIFYING ENZIMES WITH POLYETHILENE GLYCOL AND PRODUCTS PRODUCED THEREBY“, ИЗДАДЕН HA 11 ЯНУАРИ 1977 . ВИЖ СЪЩО ABUCHOWSKI ET AL., IN ENZYMES AND DRUGS. /J.S. HOLCERBERG AND J. ROBERTS, EDS. PP. 367-383 /1981//.

ДРУГИ ВОДОРАЗТВОРИМИ ПОЛИМЕРИ КАТО КО-ПОЛИМЕРИТЕ НА ЕТИЛЕН ГЛИКОЛА /ПРОПИЛЕН ГЛИКОЛ, КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛУЛОЗА, ДЕКСТРАН ПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛ, ПОЛИВИНИЛ ПИРОЛИДОН, ПОЛИ- 1, 3-ДИОКСАЛАН, ПОЛИ-1,3,6-ТРИОКСАН, КО-ПОЛИМЕР НА ЕТИЛЕН С МАЛЕИНОВ АНХИДРИД И ПРОИЗВОЛНИ КО-ПОЛИМЕРИ СА БИЛИ ИЗПОЛЗВАНИ ЗА МОДИФИЦИРАНЕ НА БЕЛТЪЦИ.

ПРИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА СА БИЛИ ИЗПОЛЗВАНИ РЕДИЦА РАЗЛИЧНИ МЕТОДИ ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА МОЛЕКУЛА С БЕЛТЪКА. НАЙОБЩО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ МОЛЕКУЛИ СА БИЛИ СВЪРЗВАНИ С БЕЛТЪКА ЧРЕЗ РЕАКТИВОСПОСОБНИ ГРУПИ ОТ ПОВЪРХНОСТТА НА БЕЛТЪКА. УДОБНИ ЗА ТАКОВА СВЪРЗВАНЕ СА АМИНО ГРУПИ КАТО ТЕЗИ НА ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ ИЛИ НА N-КРАЯ. НАПРИМЕР ROYER /АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,002,0531 ЦИТИРАН ПО-ГОРЕ/ ПОКАЗВА, ЧЕ ЗА СВЪРЗВАНЕТО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ С

-12ЕНЗИМ Е БИЛО ИЗПОЛЗВАНО РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ. ЕР No 0 539 167, ПУБЛИКУВАН НА 28 АПРИЛ 1993 Г. WRIGHT, „PEG IMIDATES AND PROTEIN DERIVATES THEREOF“ ПОКАЗВА, ЧЕ БЕЛТЪЦИ ИЛИ СЪЕДИНЕНИЯ СЪС СВОБОДНА АМИНО ГРУПА /И/ СА МОДИФИЦИРАНИ С ИМИДНО ПРОИЗВОДНО НА PEG ИЛИ ПОДОБНИ ВОДОРАЗТВОРИМИ ОРГАНИЧНИ ПОЛИМЕРИ. АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,904,584, SHAW, ИЗДАДЕН НА 27 ФЕВРУАРИ 1990, РАЗГЛЕЖДА МОДИФИКАЦИЯТА НА ГРУПА ЛИЗИНОВИ ОСТАТЪЦИ В БЕЛТЪЦИТЕ ЗА ПРИКРЕПВАНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ МОЛЕКУЛИ ЧРЕЗ РЕАКТИВОСПОСОБНИ АМИНО ГРУПИ.

ЕДИН ОТ СПЕЦИФИЧНИТЕ ТЕРАПЕВТИЧНИ ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ БЕЛТЪЦИ Е СТИМУЛИРАЩИЯТ ФАКТОР НА ГРАНУЛОЦИТНАТА КОЛОНИЯ „G-CSF“. ВИЖ ЕВРОПЕЙСКИ ПАТЕНТНИ ПУБЛИКАЦИИ ЕР No 0 401 384, ЕР No 0 473,268 И ЕР No 0 335 423.

ДРУГ ПРИМЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН IL-6, ЕР No 0442 724, ОЗГЛАВЕН „MODIFIED HIL-б“, /ВИЖ ОЧАКВАЩ РЕШЕНИЕ U.S.S.N. 07/632,070/, КОЙТО РАЗГЛЕЖДА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ МОЛЕКУЛИ ПРИБАВЕНИ КЪМ IL-6. ЕР No 0154 316, ПУБЛИКУВАН НА 11 СЕПТЕМВРИ, 1985 СЪОБЩАВА ЗА РЕАКЦИЯТА НА ЛИМфОКИН С АЛДЕХИД И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.

ДОСЕГА В НАУКАТА НЕ Е ИЗВЕСТНА ВЪЗМОЖНОСТТА ЗА МОДИФИЦИРАНЕ НА MGDF, ПОРАДИ ТОВА, ЧЕ ПОДАТЛИВОСТТА НА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН БЕЛТЪК КЪМ МОДИФИЦИРАНЕ Е ОПРЕДЕЛЕНА ОТ СПЕЦИФИЧНИТЕ СТРУКТУРНИ ПАРАМЕТРИ НА ТОЗИ БЕЛТЪК. ОЩЕ ПОВЕЧЕ, ЧЕ ЕФЕКТЪТ НА ЕДНА ТАКАВА МОДИФИКАЦИЯ ВЪРХУ БИЛОГИЧНИТЕ СВОЙСТВА НА БЕЛТЪКА Е НЕПРЕДСКАЗУЕМА. ПОРАДИ МНОГОБРОЙНИТЕ КЛИНИЧНИ ПРИЛОЖЕНИЯ НА MGDF, КОИТО БЯХА ПОСОЧЕНИ ТУК, ПРОИЗВОДЕН MGDF ПРОДУКТ С ПРОМЕНЕНИ КАЧЕСТВА Е НЕОБХОДИМ. ТАКИВА МОКЕКУЛИ МОГАТ ДА ИМАТ УВЕЛИЧЕН ПОЛУЖИВОТ И/ИЛИ АКТИВНОСТ IN VIVO, А СЪЩО ТАКА И ДРУГИ КАЧЕСТВА.

-13В РЕЗУЛТАТ НА ОБРАБОТКАТА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ НАЙ-ОБЩО ЩЕ СЕ ПОЛУЧИ СМЕС ОТ ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ БЕЛТЪЧНИ МОЛЕКУЛИ. АКО ВЗЕМЕМ ЗА ИЛЮСТРАЦИЯ БЕЛТЪЧНА МОЛЕКУЛА С 5 ЛИЗИНОВИ ОСТАТЪКА И 3 АМИНО ГРУПИ НА N-КРАЯ, ТО РЕЗУЛТАТЪТ ОТ РЕАКЦИЯТА ПО . . ОПИСАНИТЕ

МЕТОДИ ЩЕ БЪДЕ ХЕТЕРОГЕННА СМЕС, В КОЯТО НЯКОИ МОЛЕКУЛИ ЩЕ ИМАТ 6 ПОЛИЕТИЛЕН ГКЛИКОЛОВИ ГРУПИ, НЯКОИ 5, НЯКОИ 4, НЯКОИ 3, НЯКОИ 2, НЯКОИ 1 И НЯКОИ 0. ПРИ МОЛЕКУЛИТЕ С НЯКОЛКО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ОСТАТЪКА, ТЕЗИ ОСТАТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ СВЪРЗАНИ НА РАЗЛИЧНИ МЕСТА В РАЗЛИЧНИТЕ МОЛЕКУЛИ. ЧЕСТО Е НУЖНО ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕН ХОМОГЕНЕН ПРОДУКТ, КОЙТО ДА СЪДЪРЖА ПРАКТИЧЕСКИ ЕДНАКВИ ПО БРОЙ И/ИЛИ ПО РАЗПОЛОЖЕНИЕ НА ХИМИЧНИТЕ МОДИфИКАТОРИ /КАТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ/ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРАНИ БЕЛТЪЦИ ИЛИ БРОЯ НА ОТЛИЧАВАЩИТЕ СЕ ДА БЪДЕ МАЛЪК /2 - 3/. ВЪПРЕКИ ТОВА СМЕС ОТ МОНО-, ДИ - И/ИЛИ ТРИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОДИФИЦИРАНИ РАЗНОВИДНОСТИ МОЖЕ ДА БЪДЕ НЕОБХОДИМ ИЛИ ПРИЛОЖИМ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИ ТЕРАПЕВТИЧНИ ПОКАЗАНИЯ.

ПРИ РАЗРАБОТВАНЕТО НА ТЕРАПЕВТИЧЕН БЕЛТЪЧЕН ПРОДУКТ, МОДИФИЦИРАН С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е НЕБЛАГОПРИЯТНО ДА ИМА РАЗЛИЧИЯ В СЪСТАВА НА СМЕСТТА ПРИ ОТДЕЛНО ПРИГОТВЕНИТЕ КОЛИЧЕСТВА. ПРИ ТАКИВА РАЗРАБОТКИ Е ВАЖНА ПРЕДСКАЗУЕМОСТТА НА БИОЛОГИЧНАТА АКТИВНОСТ. ПОКАЗАНО Е НАПРИМЕР, ЧЕ ПРИ НЕСЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА СУПЕРОКСИД ДИЗМУТАЗА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ НЯКОЛКО ОТ ПОЛУЧЕНИТЕ ФРАКЦИИ НА ЕНЗИМА СА БИЛИ НАПЪЛНО НЕАКТИВНИ /Р. McGOFF ЕТ AL.,CHEM PHARM. BULL. 36 : 3079-3091 /1988//. ВИЖ СЪЩО ROSE ЕТ AL., BIOCONJUGATE CHEMISTRY 2 : 154 159 /1991/, КЪДЕТО СЕ СЪОБЩАВА ЗА СЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА ЛИНКЕРНА ГРУПА КАРБОХИДРАЗИД КЪМ С-КРАЙНАТА КАРБОКСИЛНА ГРУПА НА БЕЛТЪЧНИЯ СУБСТРАТ /ИНСУЛИН/. НЕ МОЖЕ ДА ИМА ТАКАВА ПРЕДСКАЗУЕМ OCT, АКО ОТДЕЛНО ПРИГОТВЕНИТЕ КОЛИЧЕСТВА ОТ ТЕРАПЕВТИЧНИЯ БЕЛТЪК СЕ РАЗЛИЧАВАТ ПО СЪСТАВ ЕДНО ОТ ДРУГО. ВЪЗМОЖНО Е НЯКОИ ОТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ ДА БЪДАТ СВЪРЗАНИ НЕ ТОЛКОВА ЗДРАВО С БЕЛТЪЧНАТА МОЛЕКУЛА, КОЛКОТО ДРУГИ И ПОРАДИ ТОВА ДА СЕ ОТДЕЛЯТ ОТ

-14НЕЯ. ОЧЕВИДНО Е, ЧЕ АКО ТАКИВА ГРУПИ СА СЛАБО СВЪРЗАНИ И ПОРАДИ ТОВА ЛЕСНО СЕ ОТДЕЛЯТ, ТО ФАР МО КИН ЕТ И КАТА НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ БЕЛТЪК НЕ МОЖЕ ДА БЪДЕ ПРЕДСКАЗАНА ТОЧНО.

ДОБРЕ Е СЪЩО ТАКА ДА СЕ ПОЛУЧИ ПРОИЗВОДЕН MGDF ПРОДУКТ, ПРИ КОЙТО НЯМА СВЪРЗВАЩА ГРУПА МЕЖДУ ПОЛИМЕРА И MGDF. ЕДИН ОТ ПРОБЛЕМИТЕ ПРИ ОПИСАНИТЕ МЕТОДИ Е, ЧЕ ПРИ ТЯХ ОБИКНОВЕНО Е НУЖНА СВЪРЗВАЩА ГРУПА МЕЖДУ БЕЛТЪКА И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА МОКЕКУЛА. ТАЗИ СВЪРЗВАЩА ГРУПА МОЖЕ ДА СЕ ОКАЖЕ АНТИГЕН НА, КОЕТО СЪЩО Е НЕБЛАГОПРИЯТНО ПРИ РАЗРАБОТКАТА НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ БЕЛТЪК.

МЕТОД, НЕВКЛЮЧВАЩ СВЪРЗВАЩА Е ГРУПА Е ОПИСАН В FRANCIS ЕТ AL., В: STABILITY OF PROTEIN PHARMACEUTICALS: IN VIVO PATHWAYS OF DEGRADATION AND STRATEGIES FOR PROTEIN STABILIZATION“ /EDS. AHERN., T. AND MANNING, M.S./ PLEUM, NEW YORK, 1991/. СЪЩО B DELGADO ET AL. „COUPLING OF PEG TO PROTEIN BY ACTIVATION WITH TREZYL CHLORADE, APPLICATIONS IN IMMUNOAFFINITY CELL PREPARATION“. B : FISHER ET AL, ED., SEPARATIONS USING AQUEOUS PHASE SYSTEMS, APPLICATIONS IN CELL BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, PLENUM PRESS, N.Y., N.Y. 1989 PP. 211-213 _? ВКЛЮЧВАЩ УПОТРЕБАТА HA ТРЕЗИЛ ХЛОРИД, КОЕТО ВОДИ ДО ОТСЪСТВИЕ НА СВЪРЗВАЩА ГРУПА МЕЖДУ ПОЛИТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ЧАСТ И БЕЛТЪЧНАТА ЧАСТ. МОЖЕ ДА СЕ ОКАЖЕ ТРУДНО ДА СЕ ИЗПОЛЗВА ТОЗИ МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ТЕРАПЕВТИЧНИ ПРОДУКТИ, ТЪЙ КАТО ПРИ УПОТРЕБАТА НА ТРЕЗИЛ ХЛОРИД Е ВЪЗМОЖНО ПОЛУЧАВАНЕТО НА ТОКСИЧНИ СТРАНИЧНИ ПРОДУКТИ.

CHAMOW ЕТ AL., BIOCONJUGATE СНЕМ. 5 :133-140 /1994/ СЪОБЩАВА ЗА МОДИФИКАЦИЯТА НА CD4 ИМУНОАДХЕЗИН С АЛДЕХИД НА МОНО-МЕТОКСИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ /“MEPEG GLYCOL“/ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ. АВТОРИТЕ СЪОБЩАВАТ, ЧЕ 50 % ОТ CD4 -lg Е БИЛ MEPEG- МОДИФИЦИРАН ЧРЕЗ СЕЛЕКТИВНА РЕАКЦИЯ НА 0С-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ. /ПАК ТАМ СТР. 137/.

-15АВТОРИТЕ СЪОБЩАВАТ СЪЩО ТАКА, ЧЕ СВЪРЗВАЩАТА СПОСОБНОСТ НА МОДИФИЦИРАНИЯ CD4-IG /С БЕЛТЪКА др120/ IN VITRO НАМАЛЯВА ДО НИВО, СЪПОСТАВИМО СЪС СТЕПЕНТА НА MEPEG - МОфИфИКАЦИЯТА. /ПАК ТАМ /.

ПОРАДИ ТОВА СЪЩЕСТВУВА НУЖДА ОТ ПРОИЗВОДНИ MGDF И ПО-СПЕЦИАЛНО ОТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF. СЪЩО ТАКА СА НЕОБХОДИМИ МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТАКИВА ПРОИЗВОДНИ.

РЕЗЮМЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ОТ ЕДНА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ДАВА НОВИ ПОЛИПЕПТИДИ, КОИТО СПЕЦИФИЧНО УСИЛВАТ РАСТЕЖА И/ИЛИ РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ /“MPL LIGANDS“ ИЛИ „MGDFS“/, КАТО ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СА ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ /Т.Е. В СЛУЧАЯ С MPL ЛИГАНДА БЕЛТЪЦИТЕ ОТ БОЗАЙНИЦИТЕ СА ПОЛУЧЕНИ ОТ ИЗТОЧНИЦИ ОТ БОЗАЙНИЦ I. ТАКИВА БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗОЛИРАНИ ОТ КЛЕТЪЧНИ ИЗТОЧНИЦИ, КОИТО ПРОИЗВЕЖДАТ ФАКТОРИТЕ ИЛИ ПО ЕСТЕСТВЕН ПЪТ, ИЛИ ЧРЕЗ ИНДУКЦИЯ С ДРУГИ ФАКТОРИ. СЪЩО ТАКА ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИ ЧРЕЗ ГЕННО ИНЖЕНЕРНИ ТЕХНИКИ. Mpl ЛИГАНДИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ СИНТЕЗИРАНИ ЧРЕЗ ХИМИЧНИ ТЕХНИКИ ИЛИ ЧРЕЗ КОМБИНАЦИЯ ОТ СПОМЕНАТИТЕ ТЕХНИКИ.

В ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ Mpl ЛИГАНДИТЕ СА ПОЛУЧЕНИ В ТЯХНАТА НАТИВНА ФОРМА ОТ ИЗТОЧНИЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ. В ПРИВЕДЕНИТЕ ТУК ПРИМЕРИ СА ОПИСАНИ ДВА Mpl ЛИГАНДА, ИЗОЛИРАНИ ОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА. В ДРУГИ ПРИМЕРИ С ДЕМОНСТРИРАНО, ОБАЧЕ, ЧЕ МНОГО СХОДНИ Mpl ЛИГАНДИ ПРИСЪСТВАТ В АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА ОТ ЧОВЕШКИ И СВИНСКИ ИЗТОЧНИЦИ. ОСОБЕНОТО ТУК Е, ЧЕ АКТИВНОСТТА НА ВСЕКИ ОТ ТЕЗИ ВИДОВЕ: ЧОВЕШКИ, СВИНСКИ И КУЧЕШКИ Mpl ЛИГАНДИ МОЖЕ ДА БЪДЕ ИНХИБИРАНА СПЕЦИФИЧНО ОТ РАЗТВОРИМАТА ФОРМА НА МИШИЯ Mpl РЕЦЕПТОР, КОЕТО ПОКАЗВА, ЧЕ ВСИЧКИ ТЕЗИ Mpl ЛИГАНДИ, А СЪЩО ТАКА И ТЕЗИ ОТ ДРУГИ

-16БОЗАЙНИЦИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО И ОТ МИШКИ, СА ТЯСНО СВЪРЗАНИ КАКТО В СТРУКТУРНО ОТНОШЕНИЕ, ТАКА И ПО ОТНОШЕНИЕ НА АКТИВНОСТТА.

ПРЕДПОЛГА СЕ, ЧЕ ЧОВЕШКИТЕ, СВИНСКИТЕ Мр1 ЛИГАНДИ И ТЕЗИ ОТ ДРУГИ БОЗАЙНИЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗОЛИРАНИ ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ ЧРЕЗ ПРОЦЕДУРИТЕ, ОПИСАНИ ТУК. ВИЖ ПРИМЕР 10. СЪОТВЕНО ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ ОСНОВНО РАЗГЛЕЖДА Мр1 ЛИГАНДИ ОТ БОЗАЙНИЦИ КАТО КУЧЕТА, ПРАСЕТА, МИШКИ, КОНЕ, ОВЦЕ И ЗАЙЦИ. ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИ СА Мр1 ЛИГАНДИТЕ ОТ КУЧЕТА, ПРАСЕТА И ХОРА.

В ДОПЪЛНЕНИЕ ГЕНИТЕ, КОДИРАЩИ ЧОВЕШКИТЕ Мр1 ЛИГАНДИ СА БИЛИ КЛОНИРАНИ ОТ ГЕННИ БИБЛИОТЕКИ ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН БЪБРЕК И ЧЕРЕН ДРОБ И СА БИЛИ СЕКВЕНИРАНИ, КАКТО Е ПОКАЗАНО В ПРИМЕРИТЕ ПОДОЛУ. ПРИ КЛЕТЪЧНО БАЗИРАНИ АНАЛИЗИ Е ОПРЕДЕЛЕНО, ЧЕ ЧОВЕШКИТЕ ПОЛИПЕПТИДНИ СЕКВЕНЦИИ ПРИТЕЖАВАТ АКТИВНОСТ. /ВИЖ ПРИМЕР 4/. ТЕЗИ СЕКВЕНЦИИ СА РАЗЛИЧНИ ПО ДЪЛЖИНА, НО ИМАТ СХОДСТВО В ГОЛЯМ УЧАСТЪК ОТ ПОЛИП ЕПТИДНАТА СИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ. В ЕДИНИЧНИ УЧАСТЪЦИ СЪЩЕСТВУВА ХОМОЛОГИЯ С ЕРИТРОПОЕТИН. СЪЩО ТАКА Мр1 ЛИГАНДИТЕ СА ОПРЕДЕЛЕНИ ТУК КАТО ФАКТОРИ НА РАСТЕЖА И РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ /MGDFS/, НАВСЯКЪДЕ, КЪДЕТО СТАВА ДУМА ЗА Mpi ЛИГАНДИ ТУК ЩЕ СЕ ПРИЛАГА НАЗВАНИЕТО MGDFS И ОБРАТНО. ПОД „MGDF ПОЛИПЕПТИД“ ЩЕ СЕ РАЗБИРА ПОЛИПЕПТИД, ПРИТЕЖАВАЩ АКТИВНОСТ СПЕЦИФИЧНО ДА СТИМУЛИРА ИЛИ ИНХИБИРА РАСТЕЖА И/ИЛИ РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ. ТУК СА РАЗГЛЕДАНИ ПРИМЕРНИ ТАКИВА БЕЛТЪЦИ.

УСТАНОВЕНО Е, Мр1 ЛИГАНДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПРИТЕЖАВАТ СПЕЦИФИЧНА АКТИВНОСТ СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТНОТО РОДОСЛОВИЕ, КАТО УСИЛВАТ УЗРЯВАНЕТО И/ИЛИ ПРОЛИфЕРАЦИЯТА НА МЕГАКАРИОЦИТА, КАКТО Е ПОКАЗАНО В ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ ОТ ПРИМЕРИ 2 И 4 ПО-ДОЛУ. ПОД „СПЕЦИФИЧНО“ СЕ РАЗБИРА, ЧЕ ПОЛИПЕПТИДИТЕ ПОКАЗАВАТ БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ В СРАВНИТЕЛНО ПО-ГОЛЯМА СТЕПЕН КЪМ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, В СРАВНЕНИЕ С МНОГО ДРУГИ КЛЕТЪЧНИ ТИПОВЕ. ПРЕДПОЛАГА СЕ, ЧЕ ТЕЗИ -17БЕЛТЪЦИ, КОИТО ОКАЗВАТ СТИМУЛИРАЩО ВЪЗДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ

МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, ЩЕ ИМАТ IN VIVO СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ И СПРЯМО ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ. ЧРЕЗ СТИМУЛИРАНЕ УЗРЯВАНЕТО И ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ.

ДВА ОТ ПРЕДПОЧИТАНИТЕ Мр1 ЛИГАНДА ОТ КУЧЕШКИ ПРОИЗХОД ИМАТ МОЛЕКУЛНА МАСА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 25 kd И 31 kd, КАКТО Е ОПРЕДЕЛЕНО ЧРЕЗ ЕКЕКТРОФОРЕЗА В НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛСУЛфАТ ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ /SDSPAGA/ ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ. ДВАТА БЕЛТЪКА СА ПРЕЧИСТЕНИ ЧРЕЗ ПРОЦЕДУРИТЕ, РАЗГЛЕДАНИ ПОДРОБНО В ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИЯ РАЗДЕЛ ПОДОЛУ.

ДВАТА ПРЕДПОЧИТАНИ ЧОВЕШКИ ЛИГАНДА MGDF-1 И MGDF -2 СА С ДЪЛЖИНА СЪОТВЕТНО 332 И 173 АМИНО КИСЕЛИНИ, БЕЗ ДА СЕ ВКЛЮЧВАТ 21 АМИ, 0 КИСЕЛИНИ ОТ ПРЕДПОЛАГАЕМИЯ СИГНАЛЕН ПЕПТИД. ТЕЗИ МОЛЕКУЛИ, А СЪЩО ТАКА И ТРЕТА ПОДОБНА МОЛЕКУЛА MGDF-З СА ПОКАЗАНИ НА ФИГУРИ 11 И 12. СЛЕДВАЩ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ПРОЦЕСИТЕ ЗА ИЗОЛИРАНЕ И ПРЕЧИСТВАНЕ НА Mpl ЛИГАНДИТЕ, ОБЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ИЛИ ТЕХНИ ФРАГМЕНТИ, ИЗОЛИРАНИ ОТ ИЗТОЧНИЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ, ГЛАВНО КРЪВ, СЕРУМ И ПЛАЗМА. АПЛАСТИЧНАТА КРЪВ, СЕРУМ И ПЛАЗМА СА ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИ ИЗХОДНИ МАТЕРИАЛИ. АПЛАСТИЧНА КРЪВ, СЕРУМ И ПЛАЗМА МОЖЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ ЧРЕЗ ПРОЦЕС, ВКЛЮЧВАЩ ОБЛЪЧВАНЕ НА БОЗАЙНИК С РАДИАЦИОНЕН ИЗТОЧНИК, КАТО КОБАЛТ - 60, ПРИ РАДИАЦИОННО НИВО ОТ ОКОЛО 400 - 800 RAD, ТАКА ЧЕ ДА СТАНАТ АПЛАСТИЧНИ. ТАЗИ ПРОЦЕДУРА Е ПОЗНАТА В НАУКАТА, КАКТО Е ИЛЮСТРИРАНО В ПУБЛИКАЦИИТЕ, ЦИТИРАНИ В ПРИМЕР 1 ПО-ДОЛУ. ПРИ ХОРА ОБЛЪЧЕНА КРЪВ, СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА МОЖЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ ОТ ПАЦИЕНТИ, ПОДЛОЖЕНИ НА РАДИАЦИОННА ТЕРАПИЯ, Т.Е. ПРИ ЛЕЧЕНИЕ НА РАК.

-18СЛЕД ТОВА АПЛАСТИЧНАТА КРЪВ, СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА СЕ ПОДЛАГА НА ПРЕЧИСТВАЩА ОБРАБОТКА. ПРЕЧИСТВАЩАТА ОБРАБОТКА ПРЕДЛОЖЕНА В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ВКЛЮЧВА СЛЕДНИТЕ ПРОЦЕДУРИ: ЛЕКТИН АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ И Mpl РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ. КАТО РЕЗУЛТАТ ОТ ВСЯКА ЕДНА ОТ ТЕЗИ ПРОЦЕДУРИ СЕ ПОЛУЧАВА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 300 - 500 ПРЕЧИСТВАНЕ НА 25 kd И 31 kd БЕЛТЪЦИ ОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА. ЗА ПО-НАТАТЪЧНО ПРЕЧИСТВАНЕ НА Mpl ЛИГАНДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ВКЛЮЧАТ И ДРУГИ СТАНДАРТНИ ПРОЦЕДУРИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА БЕЛТЪЦИ, КОИТО СА ОПИСАНИ ПО-ДОЛУ.

ДРУГ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ПОЛИНУКЛЕОТИДИТЕ, КОИТО КОДИРАТ ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИЯ БЕЛТЪК ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ. ТАКАВА ДНК СЕКВЕНЦИЯ МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА ИЗОЛИРАНА ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ КАКТО Е ОПИСАНО ТУК. ДНК СЕКВЕНЦИЯТА МОЖЕ СЪЩО ТАКА ДА ВКЛЮЧВА 5’ И 3’ НЕКОДИРАЩА СЕКВЕНЦИЯ, В ДВАТА КРАЯ НА КОДИРАЩАТА Mpl ЛИГАНДНА СЕКВЕНЦИЯ. ДНК СЕКВЕНЦИЯТА МОЖЕ СЪЩО ТАКА ДА КОДИРА АМИНО КРАЕН СИГНАЛЕН ПЕПТИД. ТАКАВА СЕКВЕНЦИЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ ПРИГОТВЕНА ЧРЕЗ ВСЕКИ ПОЗНАТ МЕТОД, ВКЛЮЧИТЕЛНО ЧРЕЗ ПЪЛЕН ИЛИ ЧАСТИЧЕН ХИМИЧЕН СИНТЕЗ. КОДОНИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ОПТИМИЗИРАНИ ЗА ЕКСПРЕСИЯ В КЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК, ИЗБРАНА ЗА ЕКСПРЕСИЯ /Е. coli ИЛИ СНО КЛЕТКИ/.

В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ДАДЕНИ СЪЩО ТАКА РЕКОМБИНАНТНИ ДНК МОЛЕКУЛИ, ВСЯКА ОТ КОИТО Е СЪСТАВЕНА ОТ ВЕКТОРНА ДНК И ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНД ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ. ДНК МОЛЕКУЛИТЕ ОБЕЗПЕЧАВАТ СВЪРЗВАНЕТО НА Mpl ЛИГАНДНАТА ДНК С РЕГУЛАТОРНА СЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО ПРИТЕЖАВА СПОСОБНОСТ ДА НАСОЧВА РЕПЛИКАЦИЯТА И ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДА В КЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК. КЛЕТКИТЕ ГОСТОПРИЕМНИЦИ /БАКТЕРИАЛНИ КЛЕТКИ, КЛЕТКИ ОТ НАСЕКОМИ ПО БОЗАЙНИЦИТЕ, ДРОЖДИ, ИЛИ РАСТИТЕЛНИ КЛЕТКИ/,ТРАНСфОРМИРАНИ С

-19ТАКИВА ДНК МОЛЕКУЛИ, ЗА ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА РЕКОМБИНАНТЕН Мр1 ЛИГАНД СА СЪЩО РАЗГЛЕДАНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ.

В ДРУГ АСПЕКТ, ДНК МОЛЕКУЛИТЕ И ТРАНСФОРМИРАНИТЕ КЛЕТКИ, РАЗГЛЕДАНИ В ИЗОБРЕТЕНИЕТО, СА АНГАЖИРАНИ В НОВ ПРОЦЕС НА ПРОИЗВОДСТВО НА РЕКОМБИНАНТНИ Мр1 ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ ИЛИ ТЕХНИ ПЕПТИДНИ ФРАГМЕНТИ. ПРИ ТОЗИ ПРОЦЕС Е КУЛТИВИРАНА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ, ТРАНСФОРМИРАНА С ДНК СЕКВЕНЦИЯ КОДИРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА НА Мр1 ЛИГАНДНИЯ БЕЛТЪК ИЛИ НЕГОВ ФРАГМЕНТ /ИЛИ РЕКОМБИНАНТНА ДНК МОЛЕКУЛА, КАКТО Е ОПИСАНО ПО - ГОРЕ/, СВЪРЗАНА С ПОДХОДЯЩА РЕГУЛАТОРНА ИЛИ КОНТРОЛОРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА СЕКВЕНЦИЯ, СПОСОБНА ДА КОНТРОЛИРА ЕКСПРЕСИЯТА НА БЕЛТЪКА ПРИ ПОДХОДЯЩИ УСЛОВИЯ, ПОЗВОЛВЯВАЩИ ЕКСПРЕСИЯТА НА РЕКОМБИНАНТНАТА ДНК. В ПОСОЧЕНИЯТ ПРОЦЕС КАТО КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ РЕДИЦА ПОЗНАТИ КЛЕТКИ. ПРЕДПОЧИТАНИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ЗА ПРОИЗВОДСТВОТО НА Мр1 ЛИГАНДИ ТУК СА КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ БОЗАЙНИЦИ /СНО КЛЕТКИ/ И БАКТЕРИАЛНИ КЛЕТКИ /Е СоН/.

ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА ПРОТЕИНА В Е. Coll СЕ ПРЕДПОЧИТА ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ МЕТИОНИНОВИТЕ И ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ НА N-КРАЯ, ТЪЙ КАТО КОЛИЧЕСТВОТО ЕКСПРЕСИРАН ПРОДУКТ ОБИКНОВЕНО Е ГОЛЯМО. ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН ПРОДУКТ Е ΜΕΤ-LYS ЧОВЕШКИ MGDFj СЪСТОЯЩ СЕ ВСИЧКО ОТ 165 АМИНО КИСЕЛИНИ / Т.Е. МЕТ-2 LYZ-2 [1 - 163]/ MGDF, АКО БРОИМ ОТ ПЪРВАТА АМИНО КИСЕЛИНА ДО КРАЯ НА ЗРЕЛИЯ ПРОТЕИН. СЛЕД ПРЕЧИСТВАНЕ НА ПРОДУКТА, ЕКСПРЕСИРАН В БАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА КАТО Е. coli КРАЙНИТЕ ΜΕΤ-LYZ ОСТАТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ОТДЕЛЕНИ ЧРЕЗ ОБРАБОТКА С ЕНЗИМ КАТО ДЕПЕПТИДАЗА /КАТЕПСИН С/.

СЛЕД ТОВА ЕКСПРЕСИРАНИЯТ Mpl ЛИГАНДЕН БЕЛТЪК СЕ ИЗВЛИЧА ОТ КЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК, КЛЕТЪЧНИЯТ ЛИЗАТ ИЛИ КУЛТУРАЛНАТА СРЕДА

-20ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИ СТАНДАРТНИ СРЕДСТВА. СЪОТВЕТНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ОБРАБОТЕНА ЧРЕЗ СЪЩИТЕ ЕТАПИ НА ПРЕЧИСТВАНЕ ИЛИ ТЕХНИ МОДИФИКАЦИИ КАКВИТО СА ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ИЗОЛИРАНЕТО НА Мр1 ЛИГАНДА ОТ АПЛАСТИЧНА ПЛАЗАМА /ВИЖ ПРИМЕР 7\

СЛЕДВАЩ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ЗАСЯГА РЕКОМБИНАНТНИ Мр1 ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СА ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ МАТЕРИАЛИ ХАРАКТЕРНИ ЗА БОЗАЙНИЦИТЕ И ПО-СПЕЦИАЛНО ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ. СЪЩО ТАКА Мр1 ЛИГАНДНИТЕ БЕЛТЪЦИ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО ТОВА ДАЛИ ПРИТЕЖАВАТ ЕДНА ИЛИ ПОВЕЧЕ ОТ ФИЗИЧНИТЕ, БИОХИМИЧНИТЕ, ФАРМАКОЛОГИЧНИТЕ И БИОЛОГИЧНИТЕ АКТИВНОСТИ ОПИСАНИ ТУК.

ОСВЕН ТОВА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ MGDF, КОИТО СЕ СЪСТОЯТ ОТ MGDF БЕЛТЪЧНА ЧАСТ, СВЪРЗАНА С НАЙ-МАЛКО ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР И МЕТОДИТЕ ЗА ПОЛУЧАВАНЕТО НА ТАКИВА СЪЕДИНЕНИЯ. ПО-СПЕЦИАЛНО НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ КАСАЕ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРАНИ MGDF, ПРИ КОИТО MGDF РЕАГИРАТ С РЕАКТИВОСПОСОБНИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ МОЛЕКУЛИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ ВРЪЗКА МЕЖДУ MGDF И PEG. ТАКОВА СВЪРЗВАНЕ МОЖЕ ДА БЪДЕ ОСЪЩЕСТВЕНО ЧРЕЗ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ СВЪРЗВАЩИТЕ РЕАКЦИИ, РАЗГЛЕДАНИ ТУК - ТАКИВА КАТО АЦИЛИРАНЕ И АЛКИЛИРАНЕ. АЦИЛИРАНЕ И АЛКИЛИРАНЕ С PEG МОЖЕ ДА СЕ ПРОВЕДЕ ПРИ УСЛОВИЯ, ПРИ КОИТО ОСНОВНИЯТ ПРОДУКТ ДА БЪДЕ МОНО - ИЛИ ПОЛИ - ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН. ПОЛИ - ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО СЕ СЪСТОИ ГЛАВНО В СВЪРЗВАНЕТО НА PEG КЪМ ε-АМИНО ГРУПИТЕ НА ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ, НО МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ НА N-КРАЯ НА ПОЛИПЕТИДА. МОНОПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО СЕ СЪСТОИ НАЙ-ЧЕСТО В СВЪРЗВАНЕ НА PEG С α-АМИНО ГРУПАТА НА N- КРАЯ НА БЕЛТЪКА. ДОБИВЪТ И ХОМОГЕНОСТТА ПРИ

-21ТАКАВА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАЩА РЕАКЦИЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОВИШЕНА ЧРЕЗ ВИД РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ, КОЕТО СПЕЦИФИЧНО МОДИФИЦИРА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК НА БЕЛТЪКА. ТОВА ОСИГУРЯВА ПРИГОТВЯНЕТО НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННА СМЕС ОТ ПОЛИМЕР- MGDF СВЪРЗАНИ БЕЛТЪЧНИ МОЛЕКУЛИ, А СЪЩО ТАКА, ПРИ УСЛОВИЕ, ЧЕ Е ИЗПОЛЗВАН ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, СЕ ПОЛУЧАВАТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF БЕЛТЪЧНИ МОЛЕКУЛИ, ПРИ КОЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТЛ ЧАСТ Е ДИРЕКТНО СВЪРЗАНА С БЕЛТЪЧНАТА ЧАСТ. В ДРУГ АСПЕКТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА ФАРМАЦЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ, СЪДЪРЖАЩИ ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ ИЗОЛИРАНИЯ ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ ИЛИ РЕКОМБИНАНТЕН Мр1 ЛИГАНД, КОЙТО МОЖЕ ДА БЪДЕ МОДИФИЦИРАН С ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КАТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ И ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ НОСИТЕЛ, РАЗТВОРИТЕЛ ИЛИ ИНЕРТЕН ПЪЛНИТЕЛ. ТЕЗИ ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ МОГАТ ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ В МЕТОД ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ ИЛИ НАРУШЕНИЯ, ХАРАКТЕРИЗИРАЩИ СЕ С ДЕФИЦИТ НА МЕГАКАРИОЦИТИ И/ИЛИ ТРОМБОЦИТИ, А СЪЩО ТАКА И ПРИ IN

-22VIVO ДЕФЕКТИ HA Mpl ЛИГАНДИ. СЪЩО ТАКА ТЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ПРОФИЛАКТИЧНО ЗА ОБЛЕКЧАВАНЕ НА ОЧАКВАНИ МЕГАКАРИОЦИТНИ ИЛИ ТРОМБОЦИТНИ ДЕФИЦИТИ ПРИ ОПЕРАЦИИ.

Mpl ЛИГАНДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ В ЛЕЧЕНИЕТО НА АПЛАСТИЧНИ АНЕМИИ Т.Е. ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ ПРИ ПАЦИЕНТИ С НАРУШЕНО ТАКОВА ПРОИЗВОДСТВО /ПАЦИЕНТИ СЪС СПИН ИЛИ ПОДЛОЖЕНИ НА ХИМИОТЕРАПИЯ ПРИ РАК/. Mpl ЛИГАНДИТЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА КРЪВНИ НАРУШЕНИЯ КАТО ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. Mpl ЛИГАНДИТЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ КАТО ДОПЪЛНИТЕЛНА ТЕРАПИЯ ПРИ ПАЦИЕНТИ С ТРАНСПЛАНТИРАН КОСТЕН МОЗЪК. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ОТ ЧОВЕК ИЛИ ОТ ДРУГ БОЗАЙНИК. ПРЕДПОЛГА СЕ, ЧЕ Mpl ЛИГАНДИ ОТ ЕДИН ВИД СА ГОДНИ ЗА ПРИЛОЖЕНИЕ ПРИ ДРУГ ВИД.

В ДРУГ АСПЕКТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА МЕТОД ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ЕДНИ ИЛИ ДРУГИ ПАТОЛОГИЧНИ СЪСТОЯНИЯ, ПРИЧИНЕНИ ОТ ТРОМБОЦИТЕН ДЕФИЦИТ, ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО НА ФАРМАКОЛОГИЧНИЯ СЪСТАВ, КАКТО Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ. ТЕЗИ ТЕРАПЕВТИЧНИ МЕТОДИ МОГАТ ДА ВКЛЮЧВАТ ЕДНОВРЕМЕННО ИЛИ ПООТДЕЛНО ПРИЛАГАНЕ НА: Mpl ЛИГАНД; ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ НАЙМАЛКО ЕДИН СТИМУЛИРАЩ ФАКТОР НА МЕГАКАРИОЦИТНАТА КОЛОНИЯ; ЦИТОКИН /ЕРО/; РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР; РАСТЕЖЕН ФАКТОР И АНТИТЯЛО.

В ДРУГ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ РАЗГЛЕЖДАТ АНТИТЕЛАТА /ПОЛИКЛОНАЛНИ, МОНОКЛОНАЛНИ, ХУМАНИЗИРАНИ И РЕКОМБИНАНТНИ/ И ТЕХНИ ФРАГМЕНТИ, КОИТО РЕАГИРАТ С Mpl ЛИГАНДА ИЛИ ЛИГАНДЕН ФРАГМЕНТ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ. КАТО ^иАСТ ОТ ТОЗИ АСПЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЕТО ВКЛЮЧВА КЛЕТКИТЕ СПОСОБНИ ДА СЕКРЕТИРАТ ТАКИВА АНТИТЕЛА /ХИБРИДОМИ, В СЛУЧАЙ НА МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА/ И МЕТОДИТЕ ЗА

-23ТЯХНОТО ПРОИЗВОДСТВО И ИЗПОЛЗВАНЕ ЗА ДИАГНОСТИЧНИ И ТЕРАПЕВТИЧНИ НУЖДИ.

ДРУГ АСПЕКТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Е АНАЛИЗ НА ТЪКАННА ТЕЧНОСТ ЗА НАЛИЧИЕ НА Мр1 ЛИГАНДИ. ТОЗИ АНАЛИЗ МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА АНТИТЕЛА, КОИТО СПЕЦИФИЧНО РАЗПОЗНАВАТ Мр1 ЛИГАНДА, КАТО ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ЕДИНИЧНИ ИЛИ ТИП „САНДВИЧ“. ТАКЪВ АНАЛИЗ МОЖЕ ДА СЕ ИЗПОЛЗВА ЗА ДА СЕ ОПРЕДЕЛИ ДАЛИ ПАЦИЕНТА СЕ НУЖДАЕ ОТ ДОПЪЛНИТЕЛНО ВНАСЯНЕ НА Мр1 ЛИГАНД ОТВЪН И/ИЛИ ДАЛИ Е ВЕРОЯТНО ТОЗИ ПАЦИЕНТ ДА ПОЛУЧИ ТРОМБОЦИТЕН ДЕФИЦИТ ИЛИ НАРУШЕНИЕ. ТОЗИ АНЛИЗ МОЖЕ ДА БЪДЕ НАПРАВЕН ПОД ФОРМАТА НА КИТ, СЪДЪРЖАЩ ПОЛОЖИТЕЛНИ И ОТРИЦАТЕЛНИ КОНТОРЛИ ЗА АНТИТЕЛА И ДРУГИ СТАНДАРТНИ КИТ КОМПОНЕНТИ.

ДРУГИ АСПЕКТИ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ И ПОЛЗАТА ОТ НЕГО ЩЕ БЪДАТ ОНАГЛЕДЕНИ В ХОДА НА СЛЕДВАЩОТО ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ.

IV, КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

МНОГО АСПЕКТИ И ПРЕДИМСТВА НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ЩЕ БЪДАТ РАЗБРАНИ ПРИ РАЗГЛЕЖДАНЕТО НА СЛЕДНИТЕ ФИГУРИ:

ФИГ. 1 ИЗОБРАЗЯВА ПРЕГЛЕД НА РАЗВИТИЕТО И ЗРЕЕНЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ТРОМБОЦИТИТЕ.

ФИГ. 2 ПОКАЗВА, ЧЕ РАЗТВОРИМ МИШИ Мр1 РЕЦЕПТОР ПРАКТИЧЕСКИ НАПЪЛНО ИНХИБИРА СПОСОБНОСТТА НА ПЛАЗАМА ОТ ОБЛЪЧЕНИ КУЧЕТА/ „APLASTIC CANINE“ ИЛИ „АРК 9“/ ДА ИНДУЦИРА МЕГАКАРИОЦИТНО РАЗВИТИЕ. АНАЛИЗЪТ НА МЕГАКАРИОЦИТНОТО РАЗВИТИЕ Е ОПИСАН В ПРИМЕР 2.

ФИГ.З ПОКАЗВА, ЧЕ ПОВИШЕНАТА АКТИВНОСТ НА АРК9 ЧРЕЗ ЛЕКТИН АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ И Мр1 РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНА

-24ХРОМАТОРГАфИЯ СТИМИЛИРА РАСТЕЖА НА 1 А6.1 КЛЕТКИ И ЧЕ РАЗТВОРИМИЯ МИШИ Mpl РЕЦЕПТОР БЛОКИРА ТОЗИ РАСТЕЖ.

ФИГ. 4 ПОКАЗВА СТАДИИТЕ НА ПРЕЧИСТВАНЕ, ИЗПОЛЗВАНИ ПРИ ПРЕЧИСТВАНЕТО НА 25 И 31 kd ФОРМИТЕ НА КУЧЕШКИЯ Mpl РЕЦЕПТОР ОТ АПЛАСТИЧНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА.

ФИГ. 5 ПОКАЗВА ПРЕЧИСТВАНЕТО НА Mpl ЛИГАНДА ЧРЕЗ R-P - HPLC. ФРАКЦИЯ 21 СЪДЪРЖА ВИСОКО ПРЕЧИСТЕН 31 kd Mpl ЛИГАНД, ФРАКЦИЯ 22 СЪДЪРЖА СМЕС ОТ 31 kd И 21 kd Mpl ЛИГАНДИ И ФРАКЦИЯ 23 СЪДЪРЖА ВИСОКО ПРЕЧИСТЕН 25 kd Mpl ЛИГАНД.

ФИГ. 6 ПОКАЗВА СРАВНЕНИЕ МЕЖДУ АКТИВНОСТИТЕ НА Mpl ЛИГАНДИ ВЪВ R-P HPLC /С4 КОЛОНА/ ФРАКЦИИ, КОИТО СЪДЪРЖАТ 25 И/ИЛИ 31 kd ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ.

ФИГ. 7 ПОКАЗВА БРОЯ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, ПРОИЗВЕДЕНИ В КУЛТУРИ ОТ CD34 ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, СТИМУЛИРАНИ С АРК9; Mpl ЛИГАНД И РАЗЛИЧНИ ДРУГИ ФАКТОРИ.

ФИГ. 8 ПОКАЗВА БРОЯ НА ВСИЧКИ ЛЕВКОЦИТИ, ПРОИЗВЕДЕНИ ОТ КУЛТУРИ ОТ CD-34 ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, СТИМУЛИРАНИ С АРК9; Mpl ЛИГАНД И РАЗЛИЧНИ ДРУГИ ФАКТОРИ.

ФИГ. 9 ПОКАЗВА ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, ПРОИЗВЕДЕНИ В КУЛТУРИ ОТ CD-34 ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, СТИМУЛИРАНИ С АРК9; Mpl ЛИГАНД И РАЗЛИЧНИ ДРУГИ ФАКТОРИ.

ФИГ. 10 ПОКАЗВА, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ IL-3 НЕ Е ВКЛЮЧЕН В Mpl ЛИГАНДИНДУЦИРАНОТО МЕГАКАРИОЦИТНО РАЗВИТИЕ.

-25ФИГ. 11. ПОКАЗВА С ДНК И СЪОТВЕТНИТЕ ФРАГМЕНТИ НА ЧОВЕШКИ MGDF -1 И MGDF -2.

ФИГ. 12. ПОКАЗВА СДНК И СЪОТВЕТНИТЕ ФРАГМЕНТИ НА ЧОВЕШКИ MGDF-3.

ФИГ. 13 ПОКАЗВА СРАВНЕНИЕ МЕЖДУ MGDF-1 И MGDF-2 /Мр1 ЛИГАНДИТЕ/ ОТ КУЧЕШКИ /А/ И ОТ МИШИ /В/ ПРОИЗХОД.

ФИГ. 14 ПОКАЗВА ПРИМЕР НА АЦЕАИРАНЕ НА MGDF ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА NХИДРОКСИСУКЦИНИМИДИЛ /NHS/ АКТИВНИ ЕСТЕРИ НА МОНО-МЕТОКСИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ, ОТ КОЕТО Е ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ.

ФИГ. 15 ПОКАЗВА ПРИМЕР НА НЕСПЕЦИФИЧНО РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК. ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ АЛДЕХИДИ, КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ ОТ КОЕТО Е МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ.

ФИГ. 16 ПОКАЗВА ПРИМЕР НА МЯСТО-СПЕЦИфИЧНО РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА а-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ АЛДЕХИДИ, КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ ОТ КОЕТО Е МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ.

ФИГ. 17 ПОКАЗВА РАЗМЕРНИ /SEC/ HPLC АНАЛИЗИ НА MEPEG - MGDF КОНЮГАТИ, ПРИГОТВЕНИ С ПОМОЩТА НА АКТИВИРАНИ MW 20 KDA MEPEG ПРОИЗВОДНИ.

А. ПОЛИ -MEPEG-MGDF СЪЕДИНЕНИЕ ПРИГОТВЕНО ЧРЕЗ АЦЕЛИРАНЕ НА MGDF С NHS ЕСТЕР НА MEPEG /PEG11/.

B. ПОЛИ-MEPEG-MGDF СЪЕДИНЕНИЕ ПРИГОТВЕНО ЧРЕЗ АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С MEPEG АЛДЕХИД/PEG 20/.

C. MOHO-MEPEG-MGDF СЪЕДИНЕНИЕ ПРИГОТВЕНО ЧРЕЗ АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С MEPEG АЛДЕХИД/PEG 16/.

ФИГ. 18 ПОКАЗВА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИ ОТ МИШКА, ТРЕТИРАНА С РЕКОМБИНАНТНИ ЧОВЕШКИ MGDF: ПРАЗНИ РОМБОИДИ = СНО - ПРОИЗВОДЕН 22-353 MGDF; ПРАЗНИ КРЪГОВЕ = 22-184 MGDF ОТ Е. coli, НЕОБРАБОТЕНИ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ 1 -163 MGDF; ПЛЪТНИ КРЪГОВЕ = 22-184 MGDF ОТ Е. coli, ОБРАБОТЕНИ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.

ФИГ. 19. ПОКАЗВА СХЕМА НА ПЪТЯ НА ПРЕЧИСТВАНЕ НА HuMGDF.

ФИГ. 20 ПОКАЗВА ЕФЕКТА ОТ г-HuMGDF /Е. coli 1-163/ ВЪРХУ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МИШИ КАРБОПЛАТИНОВ МОДЕЛ. МИШКИ BALB/c БЯХА ИНЖЕКТИРАНИ ИНТЕРПЕРИТОНАЛНО С ЕДИНИЧНА ДОЗА КАРБОПЛАТИНА /1,25 мд/МИШКА/ В ДЕН 0. НА ОТДЕЛНА ГРУПА НЕ Е ИНЖЕКТИРАНА КАРБОПЛАТИНА, А САМО ИНЕРТЕН НОСИТЕЛ. СЛЕД 24 ЧАСА ЖИВОТНИТЕ, ТРЕТИРАНИ С КАРБОПЛАТИНА СА ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ ИЛИ С 100 UG/КГ. г-HuMGDF ДНЕВНО ЗА ОСТАТЪКА ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО. /N = 10 ЗА ВСЯКА ГРУПА; ОТ 5 ЖИВОТНИ Е ВЗЕМАНА КРЪВ ВЪВ ВСЯКА ТОЧКА ОТ ВРЕМЕТО./

ФИГ. 21 ПОКАЗВА ЕФЕКТА ОТ r-HuMGDF /Е. coli 1-163/ ВЪРХУ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ПРИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ С РАДИАЦИЯ. МИШКИ BALB/c БЯХА ОБЛЪЧЕНИ С ЕДИНИЧНА ДОЗА ОТ 500 RAD ГАМА-ЛЪЧИ /ЦЕЛЗИЕВ ИЗТОЧНИК/ В ДЕН 0. ОТДЕЛНА ГРУПА ЖИВОТНИ НЕ Е ПОДЛАГАНА НА РАДИАЦИЯ, А Е ПОЛУЧИЛА ОТ ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ. СЛЕД 24 ЧАСА ОБЛЪЧЕНИТЕ ЖИВОТНИ, СА

-27ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ ИЛИ С 100 UG/КГ. гHuMGDF ДНЕВНО ЗА ОСТАТЪКА ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО. /N=8 ЗА ВСЯКА ГРУПА; ОТ 4 ЖИВОТНИ Е ВЗЕМАНА КРЪВ ВЪВ ВСЯКА ТОЧКА ОТ ВРЕМЕТО./

ФИГ. 22 ПОКАЗВА ЕФЕКТА ОТ r-HuMGDF /Е. coli 1-163/ ВЪРХУ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ПРИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ ЕДНОВРЕМЕННО С РАДИАЦИЯ И КАРБОПЛАТИНА. МИШКИ BALB/c БЯХА ОБЛЪЧЕНИ С ЕДИНИЧНА ДОЗА ОТ 500 RAD ГАМА-ЛЪЧИ /ЦЕЛЗИЕВ ИЗТОЧНИК/ И БЯХА ТРЕТИРАНИ С КАРБОПЛАТИНА /1.25 мд/МИШКА/ В ДЕН 0. СЛЕД 24 ЧАСА ОБЛЪЧЕНИТЕ ЖИВОТНИ, БЯХА ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ, ИЛИ С 100 UG/КГ. r-HuMGDF ДНЕВНО ЗА ОСТАТЪКА ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО. /N = 8 ЗА ВСЯКА ГРУПА; ОТ 4 ЖИВОТНИ Е ВЗЕМАНА КРЪВ ВЪВ ВСЯКА ТОЧКА ОТ ВРЕМЕТО./ ПРИ ОТСЪСТВИЕ НА r-HuMGDF ПОВЕЧЕТО ЖИВОТНИ НЕ ОЦЕЛЯВАТ. В КОНТРОЛНАТА ГРУПА 1 ОТ 8 ЖИВОТНИ ОЦЕЛЯВА. В ТРЕТИРАНАТА ГРУПА 8 ОТ 8 ЖИВОТНИ ОЦЕЛЯВАТ.

ФИГ. 23 ПОКАЗВА ЕфЕКТА НА r-HuMGDF /Е. coli 1-163/ ВЪРХУ РАДИАЦИОННО ПРЕДИЗВИКАНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ В МАЙМУНИ RHEZUZ. RHEZUZ МАЙМУНИ БЯХА ПОДЛОЖЕНИ НА РАДИАЦИЯ /700 с Gy Со-80/. 24 ЧАСА СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТО БЕШЕ ИНЖЕКТИРАН r-HuMGDF /п = 3/ ИЛИ ЧОВЕШКИ СЕРУМЕН АЛБУМИН /п = 5/./И ДВЕТЕ ПО 25 mg/KG/ ДЕН/, КАТО ПРИЛГАНЕТО ИМ ПРОДЪЛЖИ 18 ПОСЛЕДОВАТЕЛНИ ДНИ. КРЪВНИТЕ АНАЛИЗИ БЯХА ПРОВЕДЕНИ С ЕЛЕКТРОНЕН АНАЛИЗАТОР НА КРЪВНИ КЛЕТКИ. ВСЕКИ СИМВОЛ ИЗОБРАЗЯВА СРЕДНА СТОЙНОСТ (+/ - СРЕДНАТА ГРЕШКА НА МЕТОДА) .

ФИГ. 24 ПОКАЗВА ЕфЕКТА НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН И ГЛИКОЗИЛИРАН r-HuMGDF ВЪРХУ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МИШКИ, ТРЕТИРАНИ С КАРБОПЛАТИНА И РАДИАЦИЯ. МИШКИТЕ СА ПОДЛОЖЕНИ НА КОМБИНИРАНО ДЕЙСТВИЕ НА КАРБОПЛАТИНА И РАДИАЦИЯ, КАКТО Е ОПИСАНО В ОБЯСНЕНИЯТА НА ФИГ. 22. 24 ЧАСА СЛЕД ТОВА ТРЕТИРАНЕ ЗАПОЧВА

-28ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНЕ НА r-HuMGDF /50 mg/КГ/ДЕН/, ОБРАБОТЕН ПО ПОСОЧЕНИТЕ НАЧИНИ. БРОЯТ НА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ ЗА ВСЕКИ ОТ ПОСОЧЕНИТЕ ДНИ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН ЧРЕЗ ЕЛЕКТРОНЕН КЛЕТЪЧЕН БРОЯЧ SYSMEX /BAXTER/.

фиг. 25 ПОКАЗВА СИНТЕЗИРАНА ГЕННА СЕКВЕНЦИЯ НА РЕКОМБИНАНТЕН ЧОВЕШКИ MGDF, АМИНОКИСЕЛИНИ 1- 163. КОЯТО ИМА Е. coli ОПТИМИЗИРАНИ КОДОНИ.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В СЛЕДВАЩОТО ОПИСАНИЕ, КОЕТО ПОДРОБНО РАЗГЛЕЖДА ПРАКТИЧЕСКАТА ЧАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ЩЕ БЪДАТ ПОКАЗАНИ НЕГОВИТЕ ДОПЪЛНИТЕЛНИ АСПЕКТИ И ПРЕДИМСТВА.

НОВИТЕ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ МЕГАКАРИОЦИТНИЯ РАСТЕЖ И/ИЛИ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ, НАРЕЧЕНИ Мр1 ЛИГАНДИ, ПРЕДСТВЕНИ В НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХОМОГЕННИ БЕЛТЪЦИ, ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЧНИ МАТЕРИАЛИ. ЖЕЛАТЕЛНО Е ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ ДА СА 90 % ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ, ПО-ДОБРЕ Е ДА СА ОКОЛО 95 % ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ И НАЙ-ДОБРЕ Е ДА СА ОКОЛО 98 % ИЛИ ПОВЕЧЕ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИ ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ТЕХНИКИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПОЧУЧИ ГОЛЯМА ПО КОЛИЧЕСТВО ПРОДУКЦИЯ ЧИСТИ, АКТИВНИ Мр1 ЛИГАНДИ, КОИТО ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ТЕРАПЕВТИЧНИ НУЖДИ. АЛТЕРНАТИВНО ТАКИВА БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПОЛУЧЕНИ В ЧИСТ ВИД ОТ АПЛАСТИЧНА КРЪВ, ПЛАЗМА ИЛИ СЕРУМ ОТ БОЗАЙНИЦИ, ИЛИ ОТ КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ ОТ БОЗАЙНИЦИ, КОЯТО СЕКРЕТИРА ИЛИ ЕКСПРЕСИРА Mpl

-29ЛИГАНД. СЪЩО ТАКА Мр1 ЛИГАНД ИЛИ НЕГОВИ АКТИВНИ ФРАГМЕНТИ МОГАТ ДА БЪДАТ ХИМИЧНО СИНТЕЗИРАНИ.

НАЙ-ОБЩО ПОД НАЗВАНИЕТО „Мр1 ЛИГАНДИ“, ИЗПОЛЗВАНО В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ РАЗБИРАТ Мр1 ЛИГАНДИ ОПИСАНИ ТУК, А СЪЩО ТАКА ТЕХНИ АКТИВНИ ФРАГМЕНТИ И ВАРИАНТИ, КОИТО СА ПОДРОБНО ОПИСАНИ ПО-ДОЛУ.

ДВА ПРЕДПОЧИТАНИ Мр1 ЛИГАНДА ОТ КУЧЕШКИ ПРОИЗХОД ИМАТ СЪОТВЕТНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ПРИБЛИЗИТЕЛНО 25 kd И 31 kd, КОЕТО Е ОПРЕДЕЛЕНО ЧРЕЗ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА В НАТРИЕВДОДЕЦИЛ СУЛфАТ ПОЛИАКРИЛ АМИДЕН ГЕЛ /SDSPAGE/ ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ. ДВАТА БЕЛТЪКА СА ПРЕЧИСТЕНИ ЧРЕЗ МЕТОДИТЕ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ ПОДРОБНО ОПИСАНИ В ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ. ТАКА НАПРИМЕР, И ДВАТА БЕЛТЪКА СЕ СВЪРЗВАТ С ЛЕКТИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ И ИМОБИЛИЗИРАН Mpl РЕЦЕПТОР. 25 kd ФОРМАТА ВКЛЮЧВА АМИНО КИСЕЛНИННА СЕКВЕНЦИЯ КАКТО СЛЕДВА:

АЛА-ПРО-ПРО-АЛА-ХАА-АСП-ПРО-АРГ-ЛЕВ-ЛЕВ-АСН-ЛИЗ-МЕТ-ЛЕВ-АРГ-АСП-СЕРХИС-ВАЛ-ЛЕВ-ХИС-ХАА-АРГ-ЛЕВ-ХАА-ГЛН-ХАА-ПРО-АСП-ИЛЕ-ТИР /СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИфИКАЦИНЕН N0:1/ kd ФОРМАТА ВКЛЮЧВА АМИНО КИСЕЛНИННА СЕКВЕНЦИЯ КАКТО СЛЕДВА:

АЛА-ПРО-ПРО-АЛА-ХАА-АСП-ПРО-АРГ-ЛЕВ-ЛЕВ-АСН-ЛИЗ-МЕТ-ЛЕВ-АРГ-АСП-СЕРХИС-ВАЛ-ЛЕВ-ХИС /СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИфИКАЦИНЕН N0:2 „ХАА“ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ПОКАЗАНИ В СЕКВЕНЦИИ С ИНДЕНТИфИКАЦИОННИ No: 1 И 2 НЕ СА ИЗВЕСТНИ СЪС СИГУРНОСТ, НО СЕ ПРЕДПОЛГА _}ЧЕ СА ЦИСТЕИН, ТРЕОНИН, ИЛИ /НАЙ-МАЛКО ВЕРОЯТНО/ ТРИПТОфАН.

-30ОТ ГОРНИТЕ СЕКВЕНЦИИ Е ОЧЕВИДНО, ЧЕ 31 kd ЛИГАНДА СЪДЪРЖА ПОНЕ ЧАСТ ОТ 25 kd ФОРМАТА. ПО-СПЕЦИАЛНО ПЪРВИТЕ 21 АМИНО КИСЕЛИНИ НА 31 kd ФОРМАТА СА АБСОЛЮТНО СЪЩИТЕ КАТО ТЕЗИ НА 25 kd БЕЛТЪКА. ТОЗИ ОЧЕВИДЕН ФАКТ, И ОСОБЕНО ФАКТА, ЧЕ И ДВАТА БЕЛТЪКА ИМАТ АКТИВНОСТ ПРИ АНАЛИЗИТЕ ЗА Мр! ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ ПОКАЗАНИ ТУК, ВОДИ ДО ИЗВОДА, ЧЕ ДВАТА БЕЛТЪКА СА МНОГО ТЯСНО СВЪРЗАНИ ПО ОТНОШЕНИЕ НА СТРУКТУРА И АКТИВНОСТ. ВЕРОЯТНО 31 kd ФОРМАТА НА БЕЛТЪКА СЕ РАЗЛИЧАВА ОТ 25 kd ФОРМАТА ПО РАЗЛИЧНА С-КРАЙНАТА СЕКВЕНЦИЯ, РАЗЛИЧНО ГЛИКОЗИЛИРАНЕ И/ИЛИ РАЗЛИЧЕН СПЛАЙСИНГ НА ГЕНА КОДИРАЩ БЕЛТЪЦИТЕ.

В ДОПЪЛНЕНИЕ КЪМ ИНФОРМАЦИЯТА ЗА ГОРНАТА СЕКВЕНЦИЯ ПРИ СЕКВЕНИРАНЕТО НА 25 kd ПРЕДИ ПОСЛЕДНАТА СТЪПКА НА ПРЕЧИСТВАНЕ ЧРЕЗ ОБРАТНО ФАЗОВА HPLC Е БИЛА ОПРЕДЕЛЕНА И ДРУГА СЕКВЕНЦИЯ. ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ Е БИЛА СВЪРЗАНА С 21 kd ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ, НО НЕ РЕДУЦИРАЩИ УСЛОВИЯ, КОЕТО ЗНАЧИ, ЧЕ ТЯ Е РЕЗУЛТАТ ОТ РАЗДЕЛЯНЕТО НА 25 kd БЕЛТЪКА НА ДВЕ ЧАСТИ ЧРЕЗ ПРОТЕАЗА КАТО ТЕЗИ ДВЕ ЧАСТИ СА СВЪРЗАНИ С ДИСУЛфИДНА ВРЪЗКА. ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ Е :

ТРЕ-ГЛН-ЛИЗ-ГЛУ-ТРЕ-ЛИЗ-АЛА-ГЛН-АСП-ВАЛ-ЛЕВ-ГЛИ-АЛА-ВАЛ-АЛА-ЛЕВ /СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИфИКАЦИНЕН N0:3/

ВЪПРЕКИ ЧЕ ТОЧНОТО МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИфИКАЦИНЕН N0 3 В СЕКВЕНЦИЯТА НА 25 kd БЕЛТЪКА Е НЕЯСНО, АНАЛОГИЯТА С ДРУГИ ЦИТОКИНИ , КАТО ЕРИТРОПОЕТИН ПОДДЪРЖА ВЪЗМОЖНОСТТА ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ ДА СЕ НАМИРА ОКОЛО АМИНО КИСЕЛИНА 114 В 25 kd БЕЛТЪКА. ТРЯБВА ДА ОТБЕЛЕЖИ, ЧЕ Е ВЕРОЯНО, ВЪПРЕКИ, ЧЕ НЕ Е ДОКАЗАНО, СЕКВЕНЦИЯ N0 3 ДА СЕ СЪДЪРЖА И В 31 kd БЕЛТЪКА, ВЕРОЯТНО ОТНОВО ЗАПОЧВАЙКИ ОКОЛО АМИНО КИСЕЛИНА 114. ИНФОРМАЦИЯТА ЗА ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ Е РАЗГЛЕДАНА В ДОПЪЛНИТЕЛНИ ДЕТАЙЛИ В ПРИМЕР 7.

-31СЛЕД ПЪВОНАЧАЛНИТЕ ЕКСПЕРИМЕНТИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА КУЧЕШКИ ЛИГАНДИ, РАЗГЛЕДАНО НАКРАТКО ПО-ГОРЕ БЕШЕ КЛОНИРАН ГЕН^КОДИРАЩ КУЧЕКИ ЛИГАНД. КАТО РЕЗУЛТАТ ПЪЛНАТА ДЪЛЖИНА НА АМИНО КИСЕЛИННАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА ТОЗИ КУЧЕШКИ ЛИГАНД БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕНА И Е ПОКАЗАНА НА фИГ.13 А. ЧРЕЗ ИЗЧИСЛЕНИЯ БАЗИРАНИ НА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО Е ПРЕДСКАЗАНО, ЧЕ 25 kd И 31 kd СА С-КРАЙНИ ФОРМИ НА ЛИГАНДА, ПОКАЗАН В ПЪЛНАТА СИ ДЪЛЖИНА НА ФИГ. 13 А. В ДОПЪЛНЕНИЕ Е ПОЛУЧЕН МИШИ Мр1 ЛИГАНД, ЧИЯТА СЕКВЕНЦИЯ Е ПОКАЗАНА НА ФИГ. 13 В.

ТАКИВА ПРЕЧИСТЕНИ ЛИГАНДИ МОГАТ ДА БЪДАТ ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО СПЕЦИФИЧНА АКТИВНОСТ В АНАЛИЗИТЕ НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ В ПРИМЕР 2, ПРИ НАЙ-МАЛКО ОКОЛО 5.7 х 10 НА ДЕВЕТА СТЕПЕН МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/mg. ЕДНА МЕГАКАРИОЦИТНА ЕДИНИЦА Е ОПРЕДЕЛЕНА КАТО КОЛИЧЕСТВОТО МАТЕРИАЛ, КОЕТО ПРОИЗВЕЖДА ТОЛКОВА МЕГАКАРИОЦИТИ, КОЛКОТО 1 МИКРОЛИТЪР АРК9 СТАНДАРТНА КОНТРОЛА ЧРЕЗ АНАЛИЗИТЕ,ОПИСАНИ В ПРИМЕР 2.

СЪЩО ТАКА ТАКИВА ПРЕЧИСТЕНИ ЛИГАНДИ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО СПЕЦИФИЧНА АКТИВНОСТ ПРИ АНАЛИЗА НА Mpl - ЗАВИСИМ КЛЕТЪЧЕН РАСТЕЖ В ПРИМЕР 4, ПРИ НАЙ-МАЛКО ОКОЛО 6.9 х 10 НА ДЕВЕТА СТЕПЕН КЛЕТЪЧНА РАСТЕЖНА ЕДИНИЦА/mg. ЕДНА „КЛЕТЪЧНА РАСТЕЖНА ЕДИНИЦА“ Е ДЕФИНИРАНА КАТО КОЛИЧЕСТВОТО ЛИГАНД, НЕОБХОДИМО^ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИ РАСТЕЖ НА 200 1 А6.1 КЛЕТКИ В АНАЛИЗА НА ПРИМЕР 4.

СЛЕДВАЩАТА ТАБЛИЦА ПОКАЗВА ДОПЪЛНИТЕЛНИ СПЕЦИФИЧНИ ИЗЧИСЛЕНИЯ ЗА АКТИВНОСТТА НА ПРЕЧИСТЕНИИ КУЧЕШКИ Mpl ЛИГАНДИ, ПРИГОТВЕНИ СПОРЕД ИЗОБРЕТЕНИЕТО:

-32Mpl

1A6.1. АНАЛИЗ

АНАЛИЗ НА ЧОВЕШКИ

MEG

ЛИГАНД kd kd

девета

6.52 х 10 на девета

10.5 х 10 на девета

девета

В ОБОБЩЕНИЕ НА ГОРНАТА ИНФОРМАЦИЯ НЯКОИ ПРИМЕРНИ Mpl ЛИГАНДИ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО ЕДНО ИЛИ ПОВЕЧЕ ОТ СЛЕДНИТЕ БИОХИМИЧНИ И БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА:

а) ТАКИВА Mpl ЛИГАНДИ СА ИЗОЛИРАНИ ОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА;

б) ТАКИВА Mpl ЛИГАНДИ ИМАТ СЪОТВЕТНИ МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА ОТ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 25 kd ИЛИ 31 kd, КАКТО Е ОПРЕДЕЛЕНО ЧРЕЗ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА В 12-14 НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛфАТ ПОЛИАКРИЛ АМИДЕН ГЕЛ /SDS-PAGE/ ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ.

в) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЪДЪРЖАТ СЛЕДНАТА АМИНО КИСЕЛИННА СЕКВЕНЦИЯ: СЕКВЕНЦИЯ С ИНДЕНТИфИКАЦИОНЕН: No 1 В СЛУЧАЯ С 25 kd БЕЛТЪКА; ИЛИ СЕКВЕНЦИЯ С ИНДЕНТИфИКАЦИОНЕН: No 2 В СЛУЧАЯ С 31 kd БЕЛТЪКА;

г) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЪДЪРЖАТ АМИНО КИСЕЛИННАТА СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No 3 / ОСОБЕНО ВЕРОЯТНО В 25 kd БЕЛТЪКА/;

д) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЕ СВЪРЗВАТ С ЛЕКТИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ;

е) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЕ СВЪРЗВАТ С ИМОБИЛИЗИРАН РАЗТВОРИМ МИШИ Mpl РЕЦЕПТОР.

ж) Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ МОЖЕ ДА БЪДЕ ИНХИБИРАНА IN VITRO ОТ РАЗТВОРИМИЯ Mpl РЕЦЕПТОР; И

з) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЕ СВЪРЗВАТ КЪМ ЙОНООБМЕННА КОЛОНА ПРИ pH ОКОЛО 8-9.

-33БИОЛОГИЧНАТА АКТИВНОСТ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ Мр1 ЛИГАНДИ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ Е ПОКАЗАНА ЧРЕЗ ТЯХНАТА СПОСОБНОСТ СПЕЦИФИЧНО ДА СТИМУЛИРАТ РАСТЕЖА И РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИ В АНАЛИЗИТЕ ЗА УСИЛВАНЕ НА МЕГАКАРИОЦИТНИЯ РАСТЕЖ НА ПРИМЕР 2. ПРИ ТЕЗИ АНАЛИЗИ Мр1 ЛИГАНД СТИМУЛИРА ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НА ЧОВЕШКИ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ CD 34+/CD-34 КЛЕТКИ ИЗБРАНИ ЧРЕЗ ИМУНОАДСОРБЦИЯ/ КЛЕТКИ ПРЕЗ 8 ДНЕВЕН КУЛТУРАЛЕН ПЕРИОД. МЕГАКАРИОЦИТИТЕ СА РАЗПОЗНАТИ ЧРЕЗ СВЪРЗВАНЕ СЪС СПЕЦИФИЧНИ АНТИ-ТОРМБОЦИТ АНТИГЕН АНТИТЕЛА И СА ПРЕБРОЕНИ МИКРОСКОПСКИ. Мр1 ЛИГАНД СТИМУЛИРА СЪЩО РАСТЕЖА НА ФАКТОР-ЗАВИСИМАТА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ 1А6.1. ПРИ ОТСЪСТВИЕ НА Mpl ЛИГАНД КЛЕТКИТЕ ЩЕ ЗАГИНАТ. БРОЯТ НА 1А6.1 КЛЕТКИТЕ Е ОПРЕДЕЛЕН СЛЕД ДВА ДНИ В КУЛТУРА С Mpl ЛИГАНД.

Mpl ЛИГАНДИТЕ ОПИСАНИ ПО-ГОРЕ ИМАТ СПЕЦИФИЧНИ АКТИВНОСТИ, КАКТО Е ПОКАЗАНО В ТАБЛИЦА 1 ПО-ГОРЕ.

КАТО ИЗТОЧНИЦИ ЗА Mpl ЛИГАНДИТЕ СА ОПРЕДЕЛЕНИ АПЛАСТИЧНА КРЪВ, ПЛАЗМА ИЛИ СЕРУМ ОТ БОЗАЙНИЦИ. ОЧАКВА СЕ ОБАЧЕ, ЧЕ ИЗТОЧНИЦИТЕ ЗА ТАКИВА ЛИГАНДИ НЕ СА ОГРАНИЧЕНИ ДО ТЕЗИ ПОЗНАТИ ИЗТОЧНИЦИ И МОГАТ ДА ВКЛЮЧВАТ ДРУГИ ТЪКАННИ ТЕЧНОСТИ ОТ БОЗАЙНИЦИ, КЛЕТКИ ПОЛУЧЕНИ ОТ ТЯХ И ДР.

ПРЕЧИСТВАНЕТО НА НАТИВНИТЕ Mpl ЛИГАНДИ ОТ БОЗАЙНИЦИ СЕ БАЗИРА НА ДВА КЛЮЧОВИ ПРЕЧИСТВАЩИ ЕТАПА:

а) ЛЕКТИН АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ, НАЙ-ДОБРЕ ИЗПОЛЗВАЙКИ АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ; И

б) ИМОБИЛИЗИРАН Mpl РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ.

-34ЗА ПО-НАТАТЪШНОТО ПРЕЧИСТВАНЕ НА БЕЛТЪКА МОГАТ ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ ДОПЪЛНИТЕЛНИ ЕТАПИ, КАТО ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ И ОБРАТНОфАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ.

ТЕХНИКИТЕ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕТО НА Мр1 ЛИГАНД ОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА СЪДЪРЖАТ СЛЕДНИТЕ ЕТАПИ /ВИЖ ПРИМЕР 7/:

а) ЛЕКТИН АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ /ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНА Е ХРОМАТОГРАФИЯ С АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ/;

б) РАЗТВОРИМ Мр1 РЕЦЕПТОР /Мр1 - X/ АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ /ПРЕДПОЧИТАНА Е ТАЗИ С ИМОБИЛИЗИРАН МИШИ Мр1-Х/;

в) ЙОН /АНИОН ИЛИ КАТИОН/ ОБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ /ПРЕДПОЧИТАНА Е АНИ0.Н ОБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ОСОБЕНО ТАЗИ С MONO Q КОЛОНА/;

г) ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ ПРИ ДИСОЦИИРАЩИ УСЛОВИЯ /ПРЕДПОЧИТАНА Е ТАЗИ С ИЗПОЛЗВАНЕ НА SUPERDEX 200 ПЛЮС НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ/;

д) ОБРАТНО ФАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ /ПРЕАДПОЧИТА Е ТАЗИ С ИЗПОЗВАНЕ НА С-4 КОЛОНА/.

ХОМОГЕНЕН Мр1 ЛИГАНД ОТ БОЗАЙНИЦИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО ЧОВЕШКИ ЛИГАНД МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА ГОРНИТЕ ПРОЦЕДУРИ ОТ АПЛАСТИЧНА КРЪВ, СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА ИЛИ ДРУГИ ИЗТОЧНИЦИ НА Мр1 ЛИГАНДИ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ - КЛЕТЪЧНИ ИЛИ ТЪКАННИ ИЗТОЧНИЦИ. НЕ Е ЗАДЪЛЖИТЕЛНО ЕТАПИТЕ ДА БЪДАТ ТОЧНО В ТАЗИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, НО ИЗБРОЕНАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ Е ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ. ПРОЦЕДУРИТЕ ЗА КУЛТИВИРАНЕ НА КЛЕТЪЧЕН /ИЛИ ТЪКАНЕН/ ИЗТОЧНИК, КОЙТО ПРОИЗВЕЖДА Мр1 ЛИГАНД СА ПОЗНАТИ И МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ НАПРИМЕР ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ НА ИЗХОДНИЯ МАТЕРИАЛ.

-35Mpl ЛИГАНД ИЛИ ЕДИН ИЛИ ПОВЕЧЕ НЕГОВИ ПЕПТИДНИ ФРАГМЕНТИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИ СЪЩО ТАКА И ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ТЕХНИКИ. ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИ ДНК СЕКВЕНЦИЯ ЗА ОПРЕДЕЛЕН Mpl ЛИГАНД, ПРЕЧИСТЕНИЯТ Mpl ЛИГАНДЕН МАТЕРИАЛ Е РЕДУЦИРАН И Е ЖЕЛАТЕЛНО ДА Е НАРЯЗАН С ПРОТЕАЗА, КАТО ТРИПСИН НАПРИМЕР. ФРАГМЕНТИТЕ СЕ ИЗОЛИРАТ И СЕКВЕНИРАТ ЧРЕЗ ОБИЧАЙНИТЕ ТЕХНИКИ. АЛТЕРНАТИВНО, КАКТО Е ПОКАЗАНО В ПРИМЕРИТЕ ТУК, ИНТАКТНИЯ ПРЕЧИСТЕН БЕЛТЪК МОЖЕ ДА БЪДЕ СЕКВЕНИРАН ДИРЕКТНО ДО СТЕПЕН ОПРЕДЕЛЕНА ОТ НАЛИЧНИЯ БЕЛТЪК И СЛЕД ТОВА СЕКВЕНИРАНИЯ УЧАСТЪК МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗПОЛЗВАН АНАЛОГИЧНО НА СЕКВЕНИРАНИТЕ С ТРИПСИН ФРАГМЕНТИ В СЛЕДВАЩИТЕ ПРОЦЕДУРИ. ЧРЕЗ ГЕНЕН КОД СА СИНТЕЗИРАНИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНИ ПРОБИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПРЕДСКАЖАТ ВСИЧКИ ВЪЗМОЖНИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТО КОДИРАТ АМИНО КИСЕЛИННИТЕ СЕКВЕНЦИИ НА СЕКВЕНИРАНИЯ фРАГМЕНТ/И/. СЪЗДАДЕНИ СА НЯКОЛКО СЕКВЕНЦИИ, КОЙТО ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ КАТО ПРОБИ. ГЕНЪТ НА Mpl ЛИГАНДА Е ОПРЕДЕЛЕН КАТО ТЕЗИ ПРОБИ СА ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ПРЕТЪРСВАНЕ /СКРИНИНГ/ НА ГЕНОМНИ БИБЛИОТЕКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ ИЛИ ДРУГИ ИЗТОЧНИЦИ. АЛТЕРНАТИВНО мРНК НА Mpl ЛИГАНДА ОТ КЛЕТЪЧЕН ИЗТОЧНИК МОЖЕ ДА ИЗПОЛЗВА ДА СЕ НАПРАВИ сДНК БИБЛИОТЕКА, КОЯТО МОЖЕ ДА БЪДЕ ПРЕТЪРСЕНА С ПРОБИТЕ, ЗА ДА СЕ ОПРЕДЕЛИ ДНК, КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНДНИЯ ПОЛИПЕПТИД. СЛЕД ТОВА ДНК МОЖЕ ДА БЪДЕ УДЪЛЖЕНА С ПОМОЩТА НА ПОДХОДЯЩИ ЗАЧАТЪЦИ ЧРЕЗ PCR /ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ/ТЕХНИКА.

ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕТО НА ТЕЗИ ПРОБИ ЗА ПРЕТЪРСВАНЕ НА ГЕНОМНА БИБЛИОТЕКА Е ПОЛУЧЕН ДНК КЛОН. ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИ КЛОН С ПЪЛНА ДЪЛЖИНА ПРОБИТЕ^БАЗИРАНИ НА ПОЛУЧЕНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ПОВТОРНО ПРЕТЪРСВАНЕ НА БИБЛИОТЕКАТА И ДА СЕ ХИБРИДИЗИРАТ ПО ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА ДНК СЕКВЕНЦИЯТА НА Mpl ЛИГАНДА.

-36ЧОВЕШКАТА ДНК ЗА Mpl ЛИГАНДА СЪЩО МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕНА ЧРЕЗ СУБКЛОНИРАНЕ НА ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА ЧОВЕШКИЯ ГЕНЕТИЧЕН КЛОН В ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР, КОЙТО ДА СЕ ВЪВЕДЕ В COS КЛЕТКИ, ДА СЕ ПРИГОТВИ ДНК БИБЛИОТЕКА ОТ ТЕЗИ КЛЕТКИ И ДА СЕ ПРЕТЪРСИ ЧРЕЗ ДНК ХИБРИДИЗАЦИЯ ЗА Mpl ЛИГАНДНА ДНК. СЛЕД КАТО ЦЯЛАТА ДНК ВЕДНЪЖ Е ОПРЕДЕЛЕНА ТЯ ИЛИ ЧАСТ ОТ НЕЯ, КОЯТО КОДИРА АКТИВНИЯ ФРАГМЕНТ НА Mpl ЛИГАНДА, МОЖЕ ДА БЪДЕ ВКЛЮЧЕНА ВЪВ ВСЕКИ ЕДИН ОТ МНОГОТО ЕКСПРЕСИОННИ ВЕКТОРИ,ЗА ДА СЕ НАПРАВИ СИСТЕМА ЗА ЕКСПРЕСИЯ НА Mpl ЛИГАНД ИЛИ ЕДИН ИЛИ ПОВЕЧЕ НЕГОВИ ФРАГМЕНТИ.

ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА ТАКИВА РЕКОМБИНАНТНИ ТЕХНИКИ Е ПОЛУЧЕНА ПРЕДПОЧИТАНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНДНИЯ ПОЛИПЕТИД. НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ВКЛЮЧВА СЪЩО ДНК СЕКВЕНЦИИ, ЧИСТИ ОТ ДНК СЕКВЕНЦИИ, КОДИРАЩИ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ И КОДИРАЩИ ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ С Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ /МЕГАКАРИОЦИТЕН РАСТЕЖ И РАЗВИТИЕ/. ТЕЗИ ДНК СЕКВЕНЦИИ ВКЛЮЧВАТ СЕКВЕНЦИИТЕ^ КОДИРАЩИ ЦЕЛИЯ Mpl ЛИГАНД ИЛИ ЧАСТ ОТ НЕГО И ТЕЗИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТО ХИБРИДИЗИРАТ НАЙ-ВЕЧЕ ПРИ СТРОГИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ С СДНК СЕКВЕНЦИИТЕ [ВИЖ Т. MANIATIS ЕТ. AL., MOLECULAR CLONING (A LABRATORY MANUAL); COLD SPRING HARBOR LABORATORY (1982), CTP. 387 ДО 389].

ПРИМЕРНИ СТРОГИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ СА ХИБРИДИЗАЦИЯ В 4 X SSC ПРИ 62 - 67° С ЗА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 1 ЧАС. АЛТЕРНАТИВНИ ПРИМЕРНИ СТРОГИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ СА ХИБРИДИЗАЦИЯ В 45 - 55 % ФОРМАМИД, 4 X SSC ПРИ 40 - 45 ° С.

ДНК СЕКВЕНЦИИТЕ, КОИТО ХИБРИДИЗИРАТ СЪС СЕКВЕНЦИИТЕ ЗА Mpl ЛИГАНД ПРИ ОБЛЕКЧЕНИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ И КОИТО КОДИРАТ Mpl ЛИГАНДНИ ПЕПТИДИ, ИМАЩИ Mpl ЛИГАНДНИ БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА, СЪЩО

-37КОДИРАТ НОВИ Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ НА ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ. ПРИМЕРИ ЗА ТАКИВА ОБЛЕКЧЕНИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ СА 4 X SSC ПРИ 45-55°С ИЛИ ХИБРИДИЗАЦИЯ С 30 - 40 % фОРМАМИД ПРИ 40 - 45°С. НАПРИМЕР, ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО ИМА РАЙОНИ ЗНАЧИТЕЛНО ХОМОЛОЖНИ С Mpl ЛИГАНДНИТЕ СЕКВЕНЦИИ КАТО МЕСТАТА ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ И ДИСУЛфИДНИ ВРЪЗКИ И КОДИРА БЕЛТЪК ИМАЩ ЕДНА ИЛИ ПОВЕЧЕ Mpl ЛИГАНДНИ БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА, ОЧЕВИДНО КОДИРА Mpl ЛИГАНДЕН ПОЛИПЕПТИД ДОРИ, АКО ТАЗИ ДНК СЕКВЕНЦИЯ НЕ СЕ ХИБРИДИЗИРА СТРОГО С Mpl ЛИГАНДНАТА СЕКВЕНЦИЯ /И/.

АЛЕЛНИТЕ ВАРИАЦИИ, ЕСТЕСТВЕНО ВЪЗНИКНАЛИ ЗАМЕНИ НА БАЗИ ВЪВ ВИДОВАТА ПОПУЛАЦИЯ, КОИТО МОГАТ ДА ДОВЕДАТ ДО ЗАМЯНА НА АМИНО КИСЕЛИНИ, НО МОЖЕ И ДА НЕ ДОВЕДАТ, НА ДНК СЕКВЕНЦИИ, КОДИРАЩИ ПЕПТИДНАТА СЕКВЕНЦИЯ НА Mpl ЛИГАНДА, КАКТО И ТЕХНИТЕ АНАЛОЗИ И ПРОИЗВОДНИ СЪЩО СА ВКЛЮЧЕНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ. СЪЩО ТАКА, В ИЗОБРЕТЕНИЕТО СА ОБХВАНАТИ ДНК СЕКВЕНЦИИ, КОИТО КОДИРАТ Mpl ЛИГАНДНИ ПЕПТИДИ, НО СЕ РАЗЛИЧАВА ПО ИЗПОЛЗВАНЕТО НА КОДОНИТЕ ПОРАДИ ИЗРАЖДАНЕ НА ГЕНЕТИЧНИЯ КОД ИЛИ ВАРИАЦИИ В ДНК СЕКВЕНЦИЯТА НА Mpl ЛИГАНДА, КОИТО СА ПОЛУЧЕНИ ВСЛЕДСТВИЕ ТОЧКОВИ МУТАЦИИ ИЛИ МОДИФИКАЦИИ ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ НА АКТИВНОСТТА, ПОЛУЖИВОТА ИЛИ ПРОДУКЦИЯТА НА КОДИРАНИТЕ ОТ ТЯХ ПОЛИПЕПТИДИ.

ЧРЕЗ ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ПРОЦЕДУРИТЕ ЗА КЛОНИРАНЕ, ОПИСАНИ В ПРИМЕР 11 СА ПОЛУЧЕНИ АМИНО КИСЕЛИННИ И _СДНК СЕКВЕНЦИИ НА ЧОВЕШКИТЕ MGDF-1, MGDF-2 И MGDF-З БЕЛТЪЦИ ОПИСАНИ ТУК. MGDF-1 Е ПОКАЗАН КАТО АМИНО КИСЕЛИНИ 22- 353 НА фИГ. 11 И СЪДЪРЖА 332 АМИНО КИСЕЛИНИ. MGDF-2 Е СЪКРАТЕНА ЧАСТ ОТ MGDF-1H Е ПОКАЗАН КАТО АМИНО КИСЕЛИНИ 22-195 НА ФИГ. 11. MGDF-2 СЪДЪРЖА 174 АМИНО КИСЕЛИНИ. MGDF-З Е ПОКАЗАН КАТО АМИНО КИСЕЛИНИ 22-289 НА фИГ. 12 И СЪДЪРЖА 268 АМИНО КИСЕЛИНИ. ВЪВ ВСЕКИ MGDF}ОПИСАН ТУК МОЛЕКУЛАТА_;ВКЛЮЧВАЩА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД,

-38ПОКАЗАН КАТО АМИНО КИСЕЛИНИ 1-21 НА ДВЕТЕ ФИГУРИ 11 И 12 Е ЧАСТ ОТ ПОЛИПЕПТИДИТЕ, НО ТЯ Е ОТСТРАНЕНА ЗА ДА БЪДЕ ПОКАЗАНА АКТИВНОСТТА ЗА МЕГАКАРИОЦИТЕН РАСТЕЖ И РАЗВИТИЕ. НАКРАТКО MGDF 1 - 3 СА ДЕФИНИРАНИ КАКТО СЛЕДВА:

MGDF-1 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 - 353 ФИГ. 11 MGDF-2 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -195 ФИГ. 11 MGDF-З АМИНО КИСЕЛИНИ 22 - 289 ФИГ. 12

В ПРЕДСТАВЕНИТЕ ТУК АНАЛИЗИ MGDF -1 -И MGDF-2 СА БИЛИ АКТИВНИ, ДОКАТО MGDF-3 НЕ Е БИЛ.

ВЪЗ ОСНОВА НА ДАННИТЕ ЗА АКТИВНОСТТА; ПРЕДЛОЖЕНИ ТУК МОЖЕ ДА СЕ ПРЕДПОЛОЖИ, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ MGDF IN VIVO СЕ ЕКСПРЕСИРА КАТО НАПЪЛНО НЕАКТИВЕН ИЛИ С НАМАЛЕНА АКТИВНОСТ ПОЛИПЕПТИДЕН ПРЕДШЕСТВЕНИК, СЪДЪРЖАЩ РАЗЛИЧНИ С-КРАЙНИ АМИНО ГРУПИ. СЛЕД ПРЕМАХВАНЕ НА СКРАЙНИТЕ АМИНО ГРУПИ /КАКТО И НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД/ ОБРАБОТЕНАТА ФОРМА НА МОЛЕКУЛАТА ПРИДОБИВА АКТИВНОСТ ИЛИ СТАВА ПО-АКТИВНА. ВЪВ ВРЪЗКА С ТОВА ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ СЕ СМЯТА, ЧЕ Е НЕОХОДИМО MGDF-1 ДА ПРЕТЪРПИ ПРОЦЕСИНГ НАПР. СРЯЗВАНЕ С ПРОТЕАЗА, ЗА ДА ПОКАЖЕ СВОЯТА АКТИВНОСТ. ФАКТЪТ, ЧЕ СКЪСЕНАТА ФОРМА НА MGDF-1 /MGDF-2/ Е АКТИВНА ПОТВЪРЖДАВА ТОВА ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ.

ОБРАБОТЕНА СРЕДА ОТ КЛЕТКИ 293 ОТ ЧОВЕШКИ БЪБРЕК /INVITORGEN/ ТРАНСФЕКТИРАНИ С MGDF-1 ГЕН ПОКАЗВА АКТИВНОСТ В КЛЕТЪЧНИТЕ АНАЛИЗИ НА ПРИМЕР 4 ПО-ДОЛУ. ОТ ДРУГА СТРАНА_?В ДРУГИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ КАТО 32 D КЛЕТКИ НЕ Е ОТКРИТА АКТИВНОСТ НА ТЕЗИ МОЛЕКУЛИ. ПРЕДПОЛГА СЕ, ЧЕ ТОВА ОЗНАЧАВА, ЧЕ Е ВЪЗМОЖНО MGDF-1 ДА ПРЕТЪРПИ ПРОЦЕСИНГ В 293 КЛЕТКИТЕ, ВЕРОЯТНО ЧРЕЗ СКЪСЯВАНЕ, ТАКА ЧЕ МОЛЕКУЛАТА, ОСНОВНО

-39ОТГОВОРНА ЗА АКТИВНОСТТА Е СКЪСЕНА ФОРМА, ОТКЪДЕТО СЛЕДВА _?ЧЕ 32 D НЕ ПРИТЕЖАВАТ СПОСОБНОСТ ЗА ПРОЦЕСИНГ НА МОЛЕКУЛАТА.

СПОРЕД ГОРНОТО ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ В РЕЗУЛТАТ НА СКЪСЯВАНЕ НА СЕКВЕНЦИЯТА_;ОБОЗНАЧЕНА КАТО MGDF-1 МОГАТ ДА СЕ ПОЛУЧАТ РАЗЛИЧНИ АКТИВНИ МОЛЕКУЛИ /фИГ. 11/. СТРУКТУРНИТЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СЪХРАНЕНИ В ЦИТОКИНОВАТА ГРУПА, НАПРИМЕР В ЕРИТРОПОЕТИНА /ЕРО/, ВКЛЮЧВАТ 4 АЛфА-СПИРАЛНИ СТРУКТУРИ И ЧЕТИРИ ЦИСТЕИНА. ЩО СЕ ОТНАСЯ ДО MGDF-1 СЕКВЕЦИЯТА ЦИСТЕИН 172 Е НАЙ С-КРАЙНИЯТ ЕЛЕМЕНТ НА ТЕЗИ ЕВОЛЮЦИОННО СЪХРАНЕНИ И ФУНКЦИОНАЛНО ВАЖНИ СТРУКТУРИ. ПОРАДИ ТОВА ПРЕДПОЧИТАНИ СКЪСЕНИ ВАРИАНТИ НА MGDF-1 СА ТЕЗИ, ПРИ КОИТО ИМА С-КРАЙНИ СКЪСЯВАНИЯ ОТ АМИНО КИСЕЛИНА 173 ДО 353 /ЗАЕДНО С ОТДЕЛЯНЕ НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД/. ДОБРЕ Е ОТ MGDF-1 СЕКВЕНЦИЯТА ДА СА ОТДЕЛЕНИ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ 50 ДО 185 ОТ С-КРАЯ, А НАЙ-ДОБРЕ Е АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ 90 ДО 172 ОТ С - КРАЯ. КАКТО БЕШЕ КАЗАНО ТУК СМЯТА СЕ, ЧЕ СИГНАЛНИЯТ ПЕПТИД Е ДЪЛЪГ 21 АМИНО КИСЕЛИНИ. В MGDF-1 СЕКВЕНЦИЯТА ОБАЧЕ СИГНАЛНИЯТ ПЕПТИД МОЖЕ ДА СЪДЪРЖА 23 АМИНО КИСЕЛИНИ. ТАКА ЧЕ₍ТУК СА РАЗГЛЕДАНИ СЪЩО СЪОТВЕТНИТЕ ПОЛИПЕПТИДИ, КОИТО СА СХОДНИ С ПРЕДСТАВЕНИТЕ ПО-ГОРЕ, НО ЗАПОЧВАТ ОТ ПОЗИЦИЯ 24 НА ФИГ. 11 ИЛИ 12.

СЛЕДВАТ НЯКОИ СПЕЦИФИЧНИ ПРЕДПОЧИТАНИ ВАРИАНТИ НА MGDF-1, КОИТО МОГАТ ДА ПОКАЖАТ АКТИВНОСТ /Т.Е. СПОСОБНОСТ ЗА УСИЛВАТ РАСТЕЖА НА МЕГАКАРИОЦИТИ И/ИЛИ ТРОМБОЦИТИ; ИЛИ ИНХИБИРАЩА/СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ ПО ОТНОШЕНИЕ НА ЕСТЕСТВЕНИЯ РЕЦЕПТОР/:

MGDF-4 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -172 ФИГ. 11 MGDF-5 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -177 фИГ. 11 MGDF-6 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -191 ФИГ. 11

-40MGDF-7 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -198 ФИГ. 11

MGDF-8 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 - 265 ФИГ. 11 MGDF-11 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -184 ФИГ. 11

В НЯКОИ КЛОНОВЕ В MGDF СЕКВЕНЦИЯТА ЛИПСВАТ АМИНО КИСЕЛИНИ 133-136, ТАКА ЧЕ СЕКВЕНЦИИТЕ , КОИТО СЪОТВЕТСТВАТ НА ГОРЕПОСОЧЕНИТЕ, НО НЕ ПРИТЕЖАВАТ ТЕЗИ АМИНО КИСЕЛИНИ /И ПРИ КОИТО БРОЯ НА АМИНО КИСЕЛИНИТЕ НА С-КРАЯ Е НАМАЛЕН С 4/, СЪЩО МОГАТ ДА БЪДАТ АКТИВНИ.

В ЕДИН ОТ КЛОНОВЕТЕ, КОЙТО ИМА СТОП-КОДОН В ПОЗИЦИЯ 192 Е ОТКРИТ АЛА - ОСТАТЪК ВМЕСТО ТРЕ-ОСТАТЪК, КАКТО Е ПОКАЗАНО В ПОЗИЦИЯ 192 НА ФИГ. 11. ПОРАДИ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ВКЛЮЧВА ВАРИАНТИ НА MGDF МОЛЕКУЛИ, ПРИ КОИТО В ПОЗИЦИЯ 191 ИМА АЛА ВМЕСТО ТРЕ.

MGDF-З СЕ ПОЛУЧАВА В РЕЗУЛТАТ НА ОТСТРАНЯВАНЕ НА СЕКВЕНЦИЯ, НАРЕЧЕНА ТУК IVS-5 /INTERVERTING SEQUENCE’S/ И СНАЖДАНЕ В РАМКИТЕ НА ПЕТИЯ ЕКЗОН НА СЕКВЕНЦИЯТА. ПОРАДИ ТОВА, ЧЕ 5’ КРАЯТ НА IVS-5 УЧАСТВА В КОДОН ПРЕМАХВАНЕТО И ВОДИ ДО ИЗМЕСТВАНЕ НА РАМКАТА НА ЧЕТЕНЕ В ОСТАНАЛАТА MGDF СЕКВЕНЦИЯ, КАТО ТОВА ИЗМЕСТВАНЕ ЗАПОЧВА ОТ ПОЗИЦИЯ 160 И ПРОДЪЛЖАВА ДО КРАЯ НА МОЛЕКУЛАТА.

ВСЕ ОЩЕ НЕ Е ОТКРИТА АКТИВНОСТ НА САМАТА MGDF-З СЛЕД ТРАНСфЕКЦИЯ В 293 КЛЕТКИ И ТЕСТУВАНЕ ЗА АКТИВНОСТ НА ПОЛУЧЕНАТА ОБРАБОТЕНА СРЕДА В КЛЕТЪЧНО БАЗИРАНИТЕ АНАЛИЗИ НА ПРИМЕР 4. ОЧЕВИДНО/293 КЛЕТКИТЕ СА НЕСПОСОБНИ ДА ПРОИЗВЕЖДАТ В АКТИВНА ФОРМА MGDF-З, ЗА РАЗЛИКА ОТ MGDF-1. ВЪПРЕКИ ТОВА ОСНОВАВАЙКИ СЕ НА ХИПОТЕЗАТА ЗА СКЪСЯВАНЕ, РАЗГЛЕДАНА ПО-ГОРЕ ВЪВ ВРЪЗКА С MGDF-1, ОТДЕЛЯНЕТО НА С-КРАЙНИ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ MGDF-З МОЖЕ ДА ДОВЕДЕ ДО АКТИВНОСТ. НАПРИМЕР СКЪСЯВАНЕ НА С-КРАЯТ НА MGDF-З ОТ 40 ДО 102 АМИНО КИСЕЛИНИ МОЖЕ ДА

-41ДОВЕДЕ ДО АКТИВНОСТ. ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ Е ДА СЕ ОТДЕЛЯТ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ 50 ДО 90. ДВА ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИ ВАРИАНТА НА MGDF-2 СА:

MGDF-9 22-179 фИГ.12

MGDF-10 22-190 фИГ.12

ВЪВ ВСИЧКИ Mpl ЛИГАНДИ, РАЗГЛЕДАНИ ТУК, ВКЛЮЧИТЕЛНО В ПРИМЕРНИТЕ, ИЗЛОЖЕНИ ПО-ГОРЕ, МОЖЕ ДА ПРИСЪСТВА МЕТИОНИНОВ ОСТАТЪК НА N-КРАЯ, ОСОБЕНО АКО ТЕЗИ ПОЛИПЕПТИДИ СА ЕКСПРЕСИРАНИ В БАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК.

Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИ СЪЩО ТАКА ЧРЕЗ ПОЗНАТ СТАНДАРТЕН ХИМИЧЕН СИНТЕЗ. МЕТОДИТЕ ЗА ИЗГРАЖДАНЕ НА ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПО СИНТЕТИЧЕН ПЪТ СА ПОЗНАТИ НА РАБОТЕЩИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. БЛАГОДАРЕНИЕ НА ТОВА, ЧЕ СИНТЕТИЧНО ИЗГРАДЕНИТЕ Мр1 ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДНИ СЕКВЕНЦИИ ИМАТ СЪЩАТА ПЪРВИЧНА, ВТОРИЧНА И ТРЕТИЧНА СТРУКТУРА, А СЪЩО ТАКА И КОНФОРМАЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ _? КАТО ТЕЗИ НА Мр1 ЛИГАНДНИТЕ ПОЛИПЕПТИДИ, ТЕ МОГАТ ДА ПРИТЕЖАВАТ СЪЩИТЕ БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА КАТО Mpl ЛИГАНДНИТЕ БЕЛТЪЦИ, ОПИСАНИ ТУК. СЛЕДОВАТЕЛНОДЕ МОГАТ ЗА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ КАТО БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ ИЛИ КАТО ИМУНОЛОГИЧНИ ЗАМЕСТИТЕЛИ НА ЕСТЕСТВЕНИТЕ ПРЕЧИСТЕНИ Mpi ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ В ТЕРАПЕВТИЧНИ ИЛИ ИМУНОЛОГИЧНИ ПРОЦЕСИ.

МОДИФИКАЦИИ В ПЕПТИДИТЕ ИЛИ В ДНК СЕКВЕНЦИЯТА, КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНД МОГАТ ДА БЪДАТ НАПРАВЕНИ ОТ ВСЕКИ СПЕЦИАЛИСТ ЧРЕЗ ПОЗНАТИТЕ ТЕХНИКИ. МОДИФИКАЦИИТЕ, КОИТО ПРЕДСТАВЛЯВАТ ИНТЕРЕС ПРИ Mpl ЛИГАНДНИТЕ СЕКВЕНЦИИ ВКЛЮЧВАТ ЗАМЕСТВАНЕ, ДОБАВЯНЕ ИЛИ

-42ОТДЕЛЯНЕ НА ИЗБРАН АМИНО КИСЕЛИНЕН ОСТАТЪК В КОДИРАЩАТА СЕКВЕНЦИЯ. МУТАГЕНЕЗНИТЕ ТЕХНИКИ ЗА ТАКОВА ЗАМЕСТВАНЕ, ДОБАВЯНЕ ИЛИ ОТДЕЛЯНЕ СА ДОБРЕ ПОЗНАТИТЕ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. [ВИЖ АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,518,584]. ПРЕДПОЧИТАНИ СА КОНСЕРВАТИВНИТЕ ПРОМЕНИ В АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 1 ДО 20. ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ПЕПТИДИ МОГАТ ДА СЕ СЪЗДАДАТ ЧРЕЗ ПРОТЕОЛИТИЧНИ ЕНЗИМИ ИЛИ ЧРЕЗ ДИРЕКТЕН ХИМИЧЕН СИНТЕЗ. ТАКА СЪЗДАДЕНИТЕ ВАРИАНТИ СЪЩО СА ВКЛЮЧЕНИ В ЗНАЧЕНИЕТО НА НАЗВАНИЕТО Mpl ЛИГАНДНИ ПОПИПЕПТИДИ И ПОЛИНУКЛЕОТИДИ В ГОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ.

СПЕЦИФИЧНИТЕ МУТАЦИИ В СЕКВЕНЦИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИЯ БЕЛТЪК МОГАТ ДА ВКЛЮЧВАТ МОДИФИКАЦИИ В МЯСТОТО ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ /СЕРИН, ТРЕОНИН ИЛИ АСПАРАГИН/. ЛИПСА НА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ ИЛИ САМО ЧАСТИЧНО ГЛИКОЗИЛИРАНЕ СЕ ПОЛУЧАВА В РЕЗУЛТАТ НА ЗАМЕСТВАНЕ ИЛИ ОТСТРАНЯВАНЕ НА АМИНО КИСЕЛИНА ВЪВ ВСЯКО ОТ СВЪРЗАНИТЕ С АСПАРАГИН МЕСТА ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ ИЛИ НА ВСЯКО МЯСТО В МОЛЕКУЛАТА, КОЕТО Е МОДИФИЦИРАНО ЧРЕЗ ДОБАВЯНЕ НА О-СВЪРЗАН КАРБОХИДРАТ. АСПАРАГИН СВЪРЗАНАТО МЯСТО, РАЗПОЗНАВАНО ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ СЕ СЪСТОИ ОТ ТРИПЕПТИДНА СЕКВЕНЦИЯ. КОЯТО СПЕЦИФИЧНО СЕ РАЗПОЗНАВА ОТ СЪОТВЕТНИТЕ КЛЕТЪЧНИ ГЛИКОЗИЛИРАЩИ ЕНЗИМИ. ТЕЗИ ТРИПЕПТИДНИ СЕКВЕНЦИИ СА ИЛИ АСН - ХАА-СЕР ИЛИ АСН-ХАА-СЕР, КЪДЕТО ХАА МОЖЕ ДА БЪДЕ ВСЯКА АМИНО КИСЕЛИНА С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ПРОЛИН. РАЗНООБРАЗИЕТО В ЗАМЕСТВАНЕТО И ОТСТРАНЯВАНЕТО НА АМИНО КИСЕЛИНИ В ЕДНА ПОЗИЦИЯ ИЛИ ЕДНОВРЕМЕННО В ПЪРВА И ТРЕТА ПОЗИЦИЯ НА МЯСТОТО РАЗПОЗНАВАНО ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ И/ИЛИ ОТСТРАНЯВАНЕ НА АМИНО КИСЕЛИНА ВЪВ ВТОРА ПОЗИЦИЯ ВОДИ ДО ОТСЪСТВИЕ НА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ В МОДИФИЦИРАНАТА ТРИПЕПТИДНА СЕКВЕНЦИЯ. ПРИ ЕКСПРЕСИЯТА НА ТАКИВА ИЗМЕНЕНИ НУКЛЕОТИДНИ СЕКВЕНЦИИ СЕ ПОЛУЧАВАТ ВАРИАНТИ, КОИТО НЕ СА ГЛИКОЗИЛИРАНИ В ТОВА МЯСТО.

-43ВАРИАНТИ НА MGDF

ДРУГИ АНАЛОЗИ ИЛИ ПРОИЗВОДНИ НА MGDF /Мр1 ЛИГАНД/ СЕКВЕНЦИИТЕ, КОИТО МОГАТ ДА ПРИТЕЖАВАТ MGDF /Mpi ЛИГАНДНА/ АКТИВНОСТ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРИГОТВЕНИ ОТ ВСЕКИ ПРОФЕСИОНАЛИСТ, ЗАПОЗНАТ С ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ. ТЕЗИ МОДИФИКАЦИИ СА СЪЩО ОБХВАНАТИ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ.

ПО-СПЕЦИАЛНО, НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ОБСТОЙНО РАЗГЛЕЖДА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ MGDF СЪСТАВИ И МЕТОДИТЕ ЗА ПРИГОТВЯНЕТО И УПОТРЕБАТА ИМ. НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПОКАЗВА, ЧЕ МОДИФИКАЦИЯТА НА MGDF И ПОДОБРЯВАНЕТО НА ТЕХНИТЕ КАЧЕСТВА Е ВЪЗМОЖНО.

ОТ ЕДНА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ ОТНАСЯ ЗА MGDF ПРОДУКТ, СЪДЪРЖАЩ MGDF БЕЛТЪК, СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКО ЕДНА ГРУПА НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР. ОТ ДРУГА СТРАНА,НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ ОТНАСЯ ЗА MGDF МОЛЕКУЛИ СВЪРЗАНИ С НАЙ-МАЛКО ЕДНА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА МОЛЕКУЛА ЧРЕЗ АЦИЛНА ИЛИ АЛКИЛНА ВРЪЗКА.

ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА MGDF МОЖЕ ДА СЕ ИЗВЪРШИ ЧРЕЗ ЕДНА ОТ ПОЗНАТИТЕ РЕАКЦИИ ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ. ВИЖ НАПРИМЕР FOCUS ON GROWTH FACTORS 3 (2) : 4-10 /1992/; EP No 0154316; EP No 0401384 И ДРУГИТЕ ОТНАСЯЩИ СЕ ДО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ПУБЛИКАЦИИ ЦИТИРАНИ ТУК. ПРЕДПОЧИТА СЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ДА СЕ ИЗВЪРШИ ЧРЕЗ АЦИЛИРАЩА РЕАКЦИЯ И АЛКИЛИРАЩА РЕАКЦИЯ С РЕАКТИВОСПОСОБНА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА МОЛЕКУЛА /ИЛИ АНАЛОГИЧЕН РЕАКТИВОСПОСОБЕН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР. ТЕЗИ ПРЕДПОЧИТАНИ МЕТОДИ ЗА МОДИФИЦИРАНЕ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ЩЕ БЪДАТ РАЗГЛЕДАНИ ТУК В НАЙПОДРОБНИ ДЕТАЙЛИ.

-44АЦИЛИРАНЕ

ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ ВКЛЮЧВА НАЙ-ОБЩО РЕАКЦИЯ МЕЖДУ АКТИВЕН ЕСТЕР НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА /PEG/ И MGDF БЕЛТЪК. ВСЯКА ПОЗНАТА ИЛИ ОТКРИТА В ПОСЛЕДСТВИЕ РЕАКТИВОСПОСОБНА МОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗПОЛЗВАНА ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА MGDF. ПРЕДПОЧИТАН АКТИВИРАН ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВ ЕСТЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ЕСТЕРИфИЦИРАН С NХИДРОКСИСУКЦИНИМИД /“NHS“/. СМИСЪЛЪТ НА ТЕРМИНА „АЦИЛИРАНЕ¹) ИЗПОЛЗВАН ТУК, ВКЛЮЧВА БЕЗ ОГРАНИЧЕНИЯ СЛЕДНИТЕ ВИДОВЕ ВРЪЗКИ МЕЖДУ MGDF И ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КАТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ: АМИДНА, КАРБАМАТНА, ИРЕТАНОВА И ДР. ПОДОБНИ. ВИЖ BIOCONJUGATE CHEM. 5:133-140 /1994/. РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗБРАНИ ИЗМЕЖДУ ТЕЗИ, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ИЛИ ТАКИВА РАЗВИТИ ПО-КЪСНО, НО ТРЯБВА ДА СЕ ИЗБЯГВАТ УСЛОВИЯ , КАТО ТЕМПЕРАТУРА, РАЗТВАРЯНЕ И pH, КОИТО МОГАТ ДА ИНАКТИВИРАТ МОДИФИЦИРАНЕТО НА MGDF ГРУПИТЕ. РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ, КОИТО СЕ ИЗПОЛЗВАТ ОБИКНОВЕНО ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА MGDF ЩЕ БЪДАТ БЪДАТ РАЗГЛЕДАНИ ПО-ДОЛУ. КАТО ПРИМЕРНА РЕАКЦИЯ В ПРИМЕР 14 Е РАЗГЛЕДАНА ТАЗИ С NHS ЕСТЕР НА МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.

РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ НАЙ-ОБЩО КАЗАНО ЩЕ БЪДЕ ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF, В КОЙТО ЛИЗИНОВИТЕ £-АМИНО ГРУПИ СА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ЧРЕЗ АЦИЛНА СВЪРЗВАЩА ГРУПА. ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ Е СВЪРЗВАЩАТА ГРУПА ДА БЪДЕ АМИД. СЪЩО ТАКА ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ПОЛУЧЕНИЯТ ПРОДУКТ ДА БЪДЕ ОСНОВНО /Т.Е. > 95 %/ МОНО, ДИ- ИЛИ ТРИ- ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН. ВЪПРЕКИ ТОВА Е НОРМАЛНО ДА СЕ ОБРАЗУВАТ НЯКОИ ВИДОВЕ С ВИСОКО НИВО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ /ДА СЕ ОБХВАНАТ МАКСИМАЛНИЯ БРОЙ НА

-45ЛИЗИНОВИТЕ ε- АМИНО ГРУПИ НА MGDF ПЛЮС ЕДНА СС-АМИНО ГРУПА НА АМИНО КРАЯ НА MGDF/ В КОЛИЧЕСТВА, ЗАВИСЕЩИ ОТ ИЗПОЛЗВАНИТЕ СПЕЦИФИЧНИ РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ. АКО Е НЕОБХОДИМО;ОТ СМЕСТТА МОГАТ ДА СЕ ОТДЕЛЯТ ПО-ВИСОКО ПРЕЧИСТЕНИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ВИДОВЕ, ПО СПЕЦИАЛНО ТЕЗИ, КОИТО НЕ СА РЕАГИРАЛИ. ТОВА МОЖЕ ДА СТАНЕ ЧРЕЗ СТАНДАРТНИТЕ ТЕХНИКИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ, ВКЛЮЧИТЕЛНО ДИАЛИЗА, ИЗСОЛВАНЕ, УЛТРАфИЛТРАЦИЯ, ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ГЕЛ-фИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ И ЕЛЕКТОРфОРЕЗА.

ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЛКИЛИРАНЕ ВКЛЮЧВА РЕАКЦИЯ НА КРАЙНО АЛДЕХИДНО ПРОИЗВОДНО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА С БЕЛТЪК, КАКЪВТО Е MGDF В ПРИСЪСТВИЕТО НА РЕДУЦИРАЩ АГЕНТ. КАКТО ПРИ АЦИЛИРАНЕТО, ОПИСАНО ПО-ГОРЕ, РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ ЩЕ БЪДАТ РАЗГЛЕДАНИ ПО-ДОЛУ.

РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЛКИЛИРАНЕ МОЖЕ СЪЩО ДА БЪДЕ ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF. ПРИМЕРНА РЕАКЦИЯ НА РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF, ПРИ КОЯТО СЕ ПОЛУЧАВА ПОЛИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ Е ПОКАЗАНА НА фИГ. 15. В ДОПЪЛНЕНИЕ РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗМЕНЕНИ, КАКТО Е ОПИСАНО ТУК, ТАКА ЧЕ ДА СЕ БЛАГОПРИЯТСТВА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ОСНОВНО НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ НА MGDF ВИДОВЕТЕ /Т.Е. ДА СЕ ПОЛУЧАТ МОНОПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ВИДОВЕ/. ПРИМЕРНА РЕАКЦИЯ НА РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF, ПРИ КОЯТО СЕ ПОЛУЧАВА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ Е ПОКАЗАНА НА фИГ.12. В ДРУГ СЛУЧАЙ НА МОНОПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ ИЛИ ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ СА СВЪРЗАНИ С

-46БЕЛТЪКА ЧРЕЗ -СН₂ - NH - ГРУПА. ЩО СЕ ОТНАСЯ ДО СН₂ - ГРУПАТА, ТОЗИ ТИП ВРЪЗКА Е НАРЕЧЕ ТУК „АЛКИЛНА“ ВРЪЗКА.

РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ, КАТО НАЧИН ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОИЗВОДЕН ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ ИЗПОЛЗВА РАЗЛИЧНАТА РЕАКТИВНА СПОСОБНОСТ НА РАЗЛИЧНИТЕ ВИДОВЕ ПЪРВИЧНИ АМИНО ГРУПИ В MGDF /ЛИЗИНА НА N-КРАЯ/, ДОСТЪПНИ ЗА МОДИФИЦИРАНЕ. РЕАКЦИЯТА Е ПРОВЕДЕНА ПРИ pH /ВИЖ ПО-ДОЛУ/. КОЕТО ПОЗВОЛЯВА ДА СЕ ДАДЕ ПРЕДИМСТВО НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК НА БЕЛТЪКА,

ПОРАДИ РАЗЛИКИТЕ В рКа МЕЖДУ НЕЯ И S- АМИНО ГРУПИТЕ НА ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ. ПРИ ТАКОВА СЕЛЕКТИВНО МОДИФИЦИРАНЕ СВЪРЗВАНЕТО НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР, СЪДЪРЖАЩ РЕАКТИВОСПОСОБНА ГРУПА, ТАКАВА КАТО АЛДЕХИДНАТА, КЪМ БЕЛТЪКА Е ПОД КОНТРОЛ: СВЪРЗВАНЕТО СЕ ИЗВЪРШВА ПРЕДИМНО НА N-КРАЯ НА БЕЛТЪКА, БЕЗ ДА ИМА ЗНАЧИТЕЛНО МОДИФИЦИРАНЕ НА ОСТАНАЛИТЕ РЕАКТИВОСПОСОБНИ ГРУПИ, ТАКИВА КАТО АМИНО ГРУПИТЕ НА ЛИЗИНА. ЕДИН ВАЖЕН АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ Е, ЧЕ ДАВА ВЪЗМОЖНОСТ ЗА ПРИГОТВЯНЕ НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННА СМЕС ОТ ПОЛИМЕР-MGDF СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ /ИМА СЕ ПРЕДВИД MGDF БЕЛТЪК, КЪМ КОЙТО МОЛЕКУЛАТА НА ПОЛИМЕРА Е СВЪРЗАНА ПРЕДИМНО /> 95 % / В ЕДНО МЯСТО НА СВЪРЗВАНЕ. ПО-СПЕЦИАЛНО, АКО Е ИЗПОЛЗВАН ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПРЕДОСТАВЯ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF БЕЛТЪК, В КОЙТО ЛИПСВА ВЕРОЯТНО АНТИГЕННА ГРУПА, А ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА МОЛЕКУЛА Е ДИРЕКТНО СВЪРЗАНА С MGDF БЕЛТЪКА.

ТАКА^ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ Е СВЪРЗАНО НАЙ-ВЕЧЕ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОРАН MGDF, ПРИ КОЙТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА /И/ Е /СА/ СВЪРЗАНА ЧРЕЗ АЦИЛНИ ИЛИ АЛКИЛНИ ГРУПИ. КАКТО БЕШЕ КАЗАНО ПО-ГОРЕ, ТЕЗИ ПРОДУКТИ МОГАТ ДА СА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ИЛИ ПОЛИ-47ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ /Т.Е. ДА СЪДЪРЖАТ 2 - 6, ПО-ДОБРЕ 2 - 5 ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ/. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ СА СВЪРЗАНИ С БЕЛТЪКА ОБИКНОВЕНО В а- ИЛИ ε-АМИНО ГРУПИТЕ НА АМИНО КИСЕЛИНИТЕ, НО СЪЩО ТАКА СЕ ПРЕДПОЛАГА, ЧЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ МОГАТ ДА БЪДАТ СВЪРЗАНИ С ВСЯКА АМИНО ГРУПА, ОТ БЕЛТЪКА, АКО ТЯ Е ДОСТАТЪЧНО РЕАКТИВОСПОСОБНА, ЗА ДА СЕ СВЪРЖЕ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА ПРИ ПОДХОДЯЩИ РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ.

МОЛЕКУЛИТЕ НА ПОЛИМЕРИТЕ, ИЗПОЛЗВАНИ И В ДВАТА ПОДХОДА - НА АЛКИЛИРАНЕ АЦИЛИРАНЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗБРАНИ ИЗМЕЖДУ ПОЗНАТИТЕ ВОДОРАЗТВОРИМИ ПОЛИМЕРИ, А СЪЩО ТАКА МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ СМЕСИ ОТ ТЯХ. ИЗБРАНИЯТ ПОЛИМЕР ТРЯБВА ДА БЪДЕ ВОДОРАЗТВОРИМ, ТАКА ЧЕ БЕЛТЪКА, ЗА КОЙТО ТОЙ Е СВЪРЗАН ДА НЕ ПРЕЦИПИТИРА ВЪВ ВОДНА СРЕДА, КАКВАТО Е ФИЗИОЛОГИЧНАТА СРЕДА. ИЗБРАНИЯТ ПОЛИМЕР ТРЯБВА ДА БЪДЕ МОДИФИЦИРАН ТАКА, ЧЕ ДА ИМА ЕДИНИЧНА РЕАКТИВОСПОСОБНА ГРУПА КАТО: АКТИВНА ЕСТЕРНА ЗА АЦИЛИРАНЕТО И АКТИВНА АЛДЕХИДНА ЗА АЛКИЛИРАНЕТО, ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ТАКИВА, ЧЕ СТЕПЕНТА НА ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ДА МОЖЕ ДА БЪДЕ КОНТРОЛИРАНА, КАКТО БЕ ПОКАЗАНО В ТУК ПОСОЧЕНИТЕ МЕТОДИ. ПРЕДПОЧИТАН РЕАКТИВОСПОСОБЕН АЛДЕХИД Е ПОЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ПРОПИОНАЛДЕХИДА, КОЙТО КОЙТО Е ВОДОУСТОЙЧИВ, ИЛИ НЕГОВИТЕ МОНО С1 - С10 АЛКОКСИ ИЛИ АРИЛОКСИ ПРОИЗВОДНИ. /ВИЖ АМЕР. ПАТЕНТ No 5,252,714/. ПОЛИМЕРЪТ МОЖЕ ДА БЪДЕ РАЗКЛОНЕН ИЛИ НЕРАЗКЛОНЕН. ЗА ПРИГОТВЯНЕТО НА КРАЕН ПРОДУКТ ЗА ФАРМАЦЕВТИЧНА УПОТРЕБА ПОЛИМЕРА ТРЯБВА ДА Е ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ. ВОДОРАЗТВОРИМИЯТ ПОЛИМЕР МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗБРАН ОТ ГРУПА СЪСТОЯЩА СЕ НАПРИМЕР ОТ: ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ; МОНОМЕТОКСИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ; ДЕКСТРАН; ΠΟΛΗ-Ν-ВИНИЛ ПИРОЛИДОН/ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ; ХОМОПОЛИМЕРИ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА; КОПОЛИМЕР НА ПОЛИПРОПИЛЕНОВ ОКИС/ЕТИЛЕНОВ ОКИС; ПОЛИОКСИЕТИЛИРАНИ ПОЛИОЛИ

-48/НАПР. ГЛИЦЕРОЛ/ И ПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛ. ЗА РЕАКЦИИТЕ НА АЦИЛИРАНЕ ИЗБРАНИЯТ ПОЛИМЕР/И/ТРЯБВА ДА ИМА РЕАКТИВОСПОСОБНА ЕСТЕРНА ГРУПА. ЗА РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ ДАДЕНО ТУК ИЗБРАНИЯ ПОЛИМЕР/И/ ТРЯБВА ДА ИМА РЕАКТИВОСПОСОБНА АЛДЕХИДНА ГРУПА. НАЙ-ОБЩО КАЗАНО ВОДОРАЗТВОРИМИЯТ ПОЛИМЕР НЯМА ДА БЪДЕ ИЗБИРАН ОТ ЕСТЕСТВЕНО ПОЛУЧЕНИ ГЛИКОЗИДНИ ОСТАТЪЦИ, ТЪЙ КАТО ТЕ СЕ ПРИГОТВЯТ ПО-УДОБНО ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ЕКСПРЕСИОННИ СИСТЕМИ. ПОЛИМЕРЪТ МОЖЕ ДА БЪДЕ С ПРОИЗВОЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО И ДА БЪДЕ РАЗКЛОНЕН ИЛИ НЕРАЗКЛОНЕН.

ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИЗПОЛЗВАН ТУК Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛЪТ, СЪКРАТЕНО PEG. НАЗВАНИЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ТУК ОБХВАЩА ВСЯКА ФОРМА НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА, КОЯТО СЕ ИЗПОЛЗВА ЗА МОДИФИЦИРАНЕ НА БЕЛТЪЦИ, КАТО МОНО-(С1 - С10) АЛКОКСИ - ИЛИ АРИЛОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.

ПОД MGDF СЕ РАЗБИРА ВСЕКИ ОТ ВАРИАНТИТЕ НА MGDF, ОПИСАНИ ТУК: НАПРИМЕР ВСИЧКИ ФОРМИ НА MGDF С ПЪЛНА ДЪЛЖИНА ИЛИ СКЪСЕНИ, ГЛИКОЗИЛИРАНИ И НЕГЛИКОЗИЛИРАНИ. СЛЕДВАТ ПРЕДПОЧИТАНИТЕ MGDF ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОИЗВОДНИ MGDF МОЛЕКУЛИ /ЗА ВСЕКИ ОТ СЛУЧАИТЕ НОМЕРИРАНЕТО СЪОТВЕТСТВА НА НОМЕРИРАНЕТО НА АМИНОКИСЕЛИНИТЕ НА ФИГ. 11./:

MGDF-1	АМИНО КИСЕЛИНИ	22-353	ФИГ. 11
MGDF-2	АМИНО КИСЕЛИНИ	22-195	ФИГ. 11
MGDF-4	АМИНО КИСЕЛИНИ	22-172	ФИГ. 11
MGDF-11	АМИНО КИСЕЛИНИ	22-184	ФИГ. 11
MGDF-12	АМИНО КИСЕЛИНИ	27-353	ФИГ. 11
MGDF-13	АМИНО КИСЕЛИНИ	27-195	фиг. 11
MGDF -14	АМИНО КИСЕЛИНИ	27-172	ФИГ. 11
MGDF -15	АМИНО КИСЕЛИНИ	27-184	ФИГ. 11

-49ПОСОЧЕНИТЕ ВИДОВЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ГЛИКОЗИЛИРАНИ, НЕГЛИКОЗИЛИРАНИ ИЛИ ДЕГЛИКОЗИЛИРАНИ, ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ НЕГЛИКОЗИЛИРАНИ. ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРИГОТВЕНИ РЕКОМБИНАНТНО ИЛИ В БАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА /Е. coli/ ИЛИ В КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ /СНО/.

СЛЕДВАТ ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ПОДГРУПИ НА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИТЕ МОЛЕКУЛИ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ /ВЪВ ВСЕКИ ОТ СЛУЧАИТЕ ТЕ СА МОНО- ИЛИ ПОЛИ - ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ фГ.Е. 2-4 ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ СА СВЪРЗАНИ ЧРЕЗ АЦИЛНА ИЛИ АЛКИЛНА ГРУПА/:

ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF-11

ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF - 4 ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF -2

ХИМИЧНОТО МОДИФИЦИРАНЕ ТРЯБВА ДА БЪДЕ ИЗВЪРШЕНО ПРИ ПОДХОДЯЩИ УСЛОВИЯ, ЗА ДА МОЖЕ БИОЛОГИЧНО АКТИВНАТА СУБСТАНЦИЯ ДА РЕАГИРА С АКТИВИРАНА МОЛЕКУЛА ПОЛИМЕР. МЕТОДИТЕ ЗА ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF НАЙ-ОБЩО ВКЛЮЧВАТ ЕТАПИ НА: (а) РЕАКЦИЯ МЕЖДУ MGDF ПОЛИПЕПТИД И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ /РЕАКТИВОСПОСОБЕН ЕСТЕР ИЛИ АЛДЕХИДНО ПРОИЗВОДНО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА/ ПРИ УСЛОВИЯ, ПРИ КОИТО MGDF СЕ СВЪРЗВА С ЕДНА ИИЛИ ПОВЕЧЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ; И (б) ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОДУКТА/ИТЕ/ ОТ РЕАКЦИЯТА. ОПТИМАЛНИТЕ РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ ЗА ВСЯКА РЕАКЦИЯ НА АЦИЛИРАНЕ ЩЕ БЪДАТ ОПРЕДЕЛЕНИ ЗА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН СЛУЧАЙ, В ЗАВИСИМОСТ ОТ ПОЗНАТИТЕ ПАРАМЕТРИ И ЖЕЛАНИЯ РЕЗУЛТАТ. НАПРИМЕР, КОЛКОТО ПО-ГОЛЯМО Е СЪОТНОШЕНИЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ:БЕЛТЪК, ТОЛКОВА ПО-ГОЛЯМ ЩЕ БЪДЕ ПРОЦЕНТЪТ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯТ ПРОДУКТ.

-50РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ КАТО МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ХОМОГЕННА ПОПУЛАЦИЯ ОТ МОНО-ПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ НАЙОБЩО ОБХВАЩА ЕТАПИТЕ: (а) РЕАКЦИЯ МЕЖДУ MGDF БЕЛТЪК И РЕАКТИВОСПОСОБНА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА ГРУПА ПРИ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ, ПРИ ПОДХОДЯЩО pH, ТАКОВА ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВА СЕЛЕКТИВНОТО МОДИФИЦИРАНЕ НА СС-АМИНО ГРУПАТА НА АМИНО КРАЯ НА ПОСОЧЕНИЯ MGDF БЕЛТЪК; И (б) ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОДУКТА ОТ РЕАКЦИЯТА.

ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННИ ПОПУЛАЦИИ ОТ МОНОПОЛИМЕР/ MGDF БЕЛТЪК СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ НА РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ СА ТАКИВА, ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВАТ СЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА ГРУПАТА НА ВОДОРАЗТВОРИМИЯ ПОЛИМЕР КЪМ N- КРАЯ НА MGDF. ТАКИВА РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ НАЙ-ОБЩО СЕ ОБЕЗПЕЧАВАТ С рКа РАЗЛИКИ МЕЖДУ ЛИЗИНОВИТЕ АМИНО ГРУПИ И OC-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ /рКа Е ТОВА pH, ПРИ КОЕТО 50 % ОТ АМИНО ГРУПИТЕ СА ПРОТОНИРАНИ И 50 % НЕ СА/. pH СЪЩО ВЛИЯЕ ВЪРХУ ИЗПОЛЗВАНОТО СЪОТНОШЕНИЕ ПОЛИМЕР:БЕЛТЪК. НАЙ-ОБЩО, АКО pH Е НИСКО ЩЕ БЪДЕ НЕОБХОДИМ ГОЛЯМ ИЗЛИШЪК НА ПОЛИМЕРА СПРЯМО БЕЛТЪКА /КОЛКОТО ПО-МАЛКО РЕАКТИВОСПОСОБНА Е N-КРАЙНАТА АМИНО ГРУПА, ТОЛКОВА ПОВЕЧЕ ПОЛИМЕР ЩЕ БЪДЕ НЕОБХОДИМ, ЗА ДА СЕ ПОСТИГНАТ ОПТИМАЛНИТЕ УСЛОВИЯ/. АКО pH Е ВИСОКО, ТО НЕ Е НЕОБХОДИМО СЪОТНОШЕНИЕТО ПОЛИМЕР: БЕЛТЪК ДА Е ТОЛКОВА ГОЛЯМО /НАЛИЧНИ СА ПОВЕЧЕ РЕАКТИВОСПОСОБНИ ГРУПИ, ТАКА ЧЕ СА НЕОБХОДИМИ ПО-МАЛКО МОЛЕКУЛИ ПОЛИМЕР/. ЗА НУЖДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ pH СЕ ДВИЖИ В ГРАНИЦИ 3 - 9, НАЙ-ВЕЧЕ 3-6.

ДРУГ ВАЖЕН ФАКТОР Е МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ПОЛИМЕРА. НАЙ-ОБЩО КОЛКОТО ПО-ВИСОКО Е МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ПОЛИМЕРА, ТОЛКОВА ПОМАЛЪК БРОЙ ПОЛИМЕРНИ МОЛЕКУЛИ ЩЕ СЕ СВЪРЖАТ С БЕЛТЪКА. СЪЩО ТАКА

-51ПРИ ОПТИМИЗИРАНЕ НА ПАРАМЕТРИТЕ ТРЯБВА ДА СЕ ВЗЕМЕ ПОД ВНИМАНИЕ РАЗКЛОНЕНОСТТА НА ПОЛИМЕРА. НАЙ-ОБЩО КОЛКОТО ПО-ВИСОКО Е МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО /ИЛИ РАЗКЛОНЕНОСТТА/, ТОЛКОВА ПО-ГОЛЯМО ЩЕ Е СЪОТНОШЕНИЕТО ПОЛИМЕР.БЕЛТЪК. ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАЩИТЕ РЕАКЦИИ РАЗГЛЕДАНИ ТУК СРЕДНОТО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО Е ОТ ОКОЛО 2 KDa ДО 100 kDa „ОКОЛО“ ОЗНАЧАВА ± 1 kDa/. ПРЕДПОЧИТАНОТО СРЕДНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО Е ОТ ОКОЛО 5 kDa ДО ОКОЛО 50 kDa, НАЙПРЕДПОЧИТАНОТО Е ОТ ОКОЛО 12 kDa ДО ОКОЛО 25 kDa. СЪОТНОШЕНИЕТО ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР: MGDF БЕЛТЪК ОБИКНОВЕНО Е В ГРАНИЦИТЕ ОТ 1:1 ДО 100:1, ПРЕДПОЧИТАНО ЗА ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО Е ОТ 1:1 ДО 20:1 И ЗА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАНЕТО ОТ 1:1 ДО 5:1.

ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА УСЛОВИЯТА, ПОСОЧЕНИ ПО-ГОРЕ РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ ЩЕ ДОВЕДЕ ДО СЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА ПОЛИМЕРА КЪМ ВСЕКИ MGDF БЕЛТЪК ИМАЩ а-АМИНО ГРУПА НА АМИНО КРАЯ И ЩЕ ОБЕЗПЕЧИ ПРИГОТВЯНЕТО НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННИ МОНОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЯ. ПОНЯТИЕТО „МОНОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ“, ИЗПОЗВАНО ТУК, ОЗНАЧАВА СЪЕДИНЕНИЕ, СЪДЪРЖАЩО ЕДИНИЧНА ПОЛИМЕРНА МОЛЕКУЛА, СВЪРЗАНА С MGDF БЕЛТЪЧНА МОЛЕКУЛА. ПРЕДПОЧИТА СЕ НОМОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕТО ДА ИМА ПОЛИМЕРНА МОЛЕКУЛА СВЪРЗАНА НА N-КРАЯ, А НЕ КЪМ СТРАНИЧНИТЕ ЛИЗИНОВИ АМИНО ГРУПИ. ПРЕДПОЧИТА СЕ СЪЩО ТАКА ДА СЕ ПОЛУЧИ ПОВЕЧЕ ОТ 90 % МОНОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ, А ОЩЕ ПО-ДОБРЕ Е ДА СЕ ПОЛУЧИ ПОВЕЧЕ ОТ 95 % МОНОПОЛИМЕР/ MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ, С ОСТАТЪК ОТ НЕРЕАГИРАЛИ ГРУПИ /БЕЛТЪК_?НЯМАЩ ПОЛИМЕРНА ГРУПА/. ПРИ ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ СЕ ОБЕЗПЕЧАВА ПРИГОТВЯНЕТО НА НАЙ-МАЛКО 90 % МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ И ОКОЛО 10 % НЕРЕАГИРАЛ БЕЛТЪК. СЪЕДИНЕНИЕТО МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК ПРИТЕЖАВА БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ.

-52РЕДУЦИРАЩИЯТ АГЕНТ ЗА РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ, ИЗПОЛЗВАН ТУК, ТРЯБВА ДА БЪДЕ СТАБИЛЕН ВЪВ ВОДЕН РАЗТВОР И ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ДА БЪДЕ СПОСОБЕН ДА РЕДУЦИРА САМО ШИфОВАТА БАЗА, КОЯТО СЕ ОБРАЗУВА В НАЧАЛНИЯ СТАДИЙ НА РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ. ПРЕДПОЧИТАНИТЕ РЕДУЦИРАЩИ АГЕНТИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗБРАНИ ОТ ГРУПАТА, СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: НАТРИЕВ БОРОХИДРИД, НАТРИЕВ ЦИАНОБРОМИД, ДИМЕТИЛАМИН БОРАН, ТРИМЕТИЛАМИН БОРАН И ПИРИДИН БОРАН. ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН РЕДУЦИРАЩ АГЕНТ Е НАТРИЕВИЯТ ЦИАНОБОРОХИДРИД.

ДРУГИ РЕАКЦИОННИ ПАРАМЕТРИ КАТО РАЗТВОРИМОСТ, РЕАКЦИОННО ВРЕМЕ, ТЕМПЕРАТУРА И ДР, КАКТО И МЕТОДИТЕ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА ПРОДУКТИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ОПРЕДЕЛЕНИ ЗА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН СЛУЧАЙ ВЪЗ ОСНОВА НА ПУБЛИКУВАНАТА ИНФОРМАЦИЯ, КАСАЕЩА МОДИФИЦИРАНЕТО НА БЕЛТЪЦИ С ВОДОРАЗТВОРИМИ ПОЛИМЕРИ /ВИЖ ПУБЛИКАЦИИТЕ, ЦИТИРАНИ ТУК/. В РАЗДЕЛА С ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ СА ДАДЕНИ НЯКОИ ДЕТАЙЛИ.

ПРИ ПРИГОТВЯНЕТО НА СМЕС ОТ ПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ МОЖЕ ДА СЕ ИЗБЕРЕ ДАЛИ ТОВА ДА СТАНЕ ЧРЕЗ МЕТОДА НА АЦИЛИРАНЕ И/ИЛИ АЛКИЛИРАНЕ. ПРЕДИМСТВОТО, ПРЕДЛОЖЕНО ТУК Е, ЧЕ МОЖЕ ДА СЕ ИЗБЕРЕ СЪОТНОШЕНИЕТО НА МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЯТА, КОИТО ДА СЕ ВКЛЮЧАТ В СМЕСТА. ПО ТОЗИ НАЧИН, АКО Е НЕОБХОДИМО, МОЖЕ ДА СЕ ПРИГОТВИ СМЕС ОТ РАЗЛИЧНИ БЕЛТЪЦИ, ИМАЩИ РАЗЛИЧЕН БРОЙ СВЪРЗАНИ ПОЛИМЕРНИ МОЛЕКУЛИ /ДИ ТРИ-, ΤΕΤΡΑ- И Т.Н.Т./ И ДА СЕ СЪЧЕТАЕ С МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕТО, ПРИГОТВЕНО ПО ОПИСАНИТЕ МЕТОДИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ СМЕС С ПРЕДОПРЕДЕЛЕНО СЪОТНОШЕНИЕ НА МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕТО.

ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ ДЕМОНСТРИРАТ ПРИГОТВЯНЕТО НА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАН MGDF И ПРИГОТВЯНЕТО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ И АЛКИЛИРАНЕ. ТАКА ДРУГ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО

-53ИЗОБРЕТЕНИЕ Е ПРИГОТВЯНЕТО НА ТЕЗИ ПРОДУКТИ.

СЪСТОЯНИЯТА, КОИТО МОГАТ ДА БЪДАТ ОБЛЕКЧЕНИ ИЛИ МОДУЛИРАНИ ЧРЕЗ КОНТРОЛИРАНЕ НА ПОЛИМЕР/MGDF НАЙ-ОБЩО ВКЛЮЧВАТ ТЕЗИ ОПИСАНИ ПО-ГОРЕ ЗА MGDF МОЛЕКУЛИТЕ. ПОЛИМЕР/БЕЛТЪК МОЛЕКУЛИТЕ, ОПИСАНИ ТУК ОБАЧЕ МОГАТ ДА ИМАТ ДОПЪЛНИТЕЛНИ АКТИВНОСТИ, НАМАЛЕНИ ИЛИ ЗАСИЛЕНИ АКТИВНОСТИ, А СЪЩО ТАКА И ДРУГИ ХАРАКТЕРИСТИКИ В СРАВНЕНИЕ С НЕМОДИФИЦИРАНИТЕ МОЛЕКУЛИ.

В СЛЕДВАЩ АСПЕКТ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ДАДЕНИ ФАРМАЦЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ, ВКЛЮЧВАЩИ ПОСОЧЕНИТЕ ХИМИЧНО

МОДИФИЦИРАНИ MGDF МОЛЕКУЛИ. ТЕЗИ ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ МОГАТ ДА СЪДЪРЖАТ И ВСЯКА ОТ ТЕЗИ MGDF МОЛЕКУЛИ В НЕМОДИФИЦИРАН ВИД.

С ПРОВЕЖДАНЕ НА ПО-НАТАТЪШНИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ ЩЕ СЕ ПОЛУЧИ ИНФОРМАЦИЯ, ОТНАСЯЩА СЕ ДО ПОДХОДЯЩИТЕ НИВА НА ДОЗИРОВКА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА РАЗЛИЧНИ СЪСТОЯНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНИ ПАЦИЕНТИ И ВСЕКИ СПЕЦИАЛИСТ, ВЗЕМАЙКИ ПРЕДВИД ТЕРАПЕВТИЧНОТО ЗНАЧЕНИЕ НА ПРЕПАРАТИТЕ, ВЪЗРАСТТА И ОБЩОТО ЗДРАВОСЛОВНО СЪСТОЯНИЕ НА ПАЦИЕНТА ЩЕ МОЖЕ ДА ОПРЕДЕЛИ ПРАВИЛНАТА ДОЗА. НАЙ-ОБЩО КАЗАНО ДОЗАТА ЩЕ БЪДЕ МЕЖДУ 0.01 цд/КГ. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО И 300 цд/КГ. /ВЗЕМА СЕ МАСАТА НА САМИЯ БЕЛТЪК, БЕЗ ХИМИЧНИТЕ МОДИфИКАТОРИ/. ПРЕДПОЧИТАНА ДОЗА ОБИКНОВЕНО ЩЕ БЪДЕ ОТ 5 цд<С. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ДО 100 цд/цо. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО, А ОЩЕ ПО-ПРЕДПОЧИТАНА ОТ 10 pg/RQ. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ДО 75 цд/кд. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО.

НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ ОТНАСЯ И ДО МЕТОД ЗА

ПРОИЗВОДСТВОТО НА MGDF /Мр1 ЛИГАНДНИ/ ПОЛИПЕПТИДИ ИЛИ ТЕХНИ АКТИВНИ ФРАГМЕНТИ. ЕДИН ОТ МЕТОДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ

-54РАЗГЛЕЖДА ВКЛЮЧВАНЕТО НА сДНК, КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНДЕН ПОЛИПЕПТИД, ВЪВ ВЕКТОР, ПРИ КОЕТО СЕ ПОЛУЧАВА ЕКСПРЕСИОННА СИСТЕМА ЗА Mpl ЛИГАНД. ВЕКТОРЪТ СЕ ВЪВЕЖДА В ИЗБРАНЙ КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК И ТЯ СЕ КУЛТИВИРА. СЛЕДОВАТЕЛНО^ МЕТОДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ВКЛЮЧВАТ КУЛТИВИРАНЕТО НА ПОДХОДЯЩА КЛЕТКА ИЛИ КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ,В КОЯТО Е ВЪВЕДЕНА ДНК СЕКВЕНЦИЯ КОДИРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДЕН ПОЛИПЕПТИД, ПОД КОНТРОЛА НА ПОЗНАТИТЕ РЕГУЛАТОРНИ СЕКВЕНЦИИ. РЕГУЛАТОРНИТЕ СЕКВЕНЦИИ ВКЛЮЧВАТ ПРОМОТОРНИ ФРАГМЕНТИ, ТЕРМИНАТОРНИ ФРАГМЕНТИ И ДРУГИ ПОДХОДЯЩИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТО НАСОЧВАТ ИЛИ КОНТРОЛИРАТ ЕКСПРЕСИЯТА НА БЕЛТЪКА В СЪОТВЕТНАТА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК. СЛЕД ТОВА ЕКСПРЕСИРАНИЯТ ФАКТОР СЕ ИЗВЛИЧА, ИЗОЛИРА И ПРЕЧИСТВА ОТ КУЛТУРАЛНАТА СРЕДА /ИЛИ ОТ КЛЕТКАТА, АКО Е ЕКСПРЕСИРАН ВЪТРЕКЛЕТЪЧНО/ ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИТЕ СРЕДСТВА, ПОЗНАТИ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. В ДОПЪЛНЕНИЕ СЕ СМЯТА, ЧЕ МЕТОДИТЕ ОПИСАНИ В АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 5,272,071 СЪЩО СА ПРИЛОЖИМИ ЗА ПОЛИНУКЛЕОТИДИТЕ И ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ ИЗОБРЕТЕНИЕТО.

ПОДХОДЯЩИ КЛЕТКИ ИЛИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ СА КЛЕТКИТЕ ОТ БОЗАЙНИЦИ, ТАКИВА КАТО КЛЕТКИ ОТ ЯЙЧНИК НА КИТАЙСКИ ХАМСТЕР /CHINESE HAMSTER OVARY,“СНО“/ ИЛИ ЗТЗ. ПОДХОДЯЩИТЕ ЗА ГОСТОПРИЕМНИЦИ КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ, КАКТО И МЕТОДИТЕ ЗА ТРАНСФОРМАЦИЯ, КУЛТИВИРАНЕ, НАМНОЖАВАНЕ, ОТСЯВАНЕ И ПРОИЗВОДСТВО НА ПРОДУКТ И ПРЕЧИСТВАНЕТО МУ СА ПОЗНАТИ. ВИЖ GETHING AND SOMBROOK, NATURE 293:620-625 /1981/; ИЛИ KAUFMAN ЕТ. AL., MOL CELL BIOL.. 5(7): 1750 - 1759 /1985/. ИЛИ HOWLEY ET AL., АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,419,446. ДРУГИ ПОДХОДЯЩИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ БОЗАЙНИЦИ СА МАЙМУНСКИТЕ COS-1 И COS-7 КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ И КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ CV-1. ПО-НАТАТЪК ПРИМЕРНИТЕ КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ ВКЛЮЧВАТ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ПРИМАТИ И КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ГРИЗАЧИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО ТРАНСФОРМИРАНИТЕ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ. ПОДХОДЯЩИ СА СЪЩО НОРМАЛНИ ДИПЛОИДНИ КЛЕТКИ; КЛЕТЪЧНИ РОДОВЕ,

-55ПРОИЗЛИЗАЩИ ОТ КУЛТУРИ IN VITRO ИЛИ ПЪРВИЧНИ ТЪКАНИ, А СЪЩО ТАКА И ПЪРВИЧНИ ЕКСПЛАНТИ. КЛЕТКИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ С ГЕНОТИПНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ ПО ИЗБРАНИЯ ГЕН ИЛИ МОГАТ ДА ПРИТЕЖАВАТ ДОМИНАНТНО ДЕЙСТВАЩ ИЗБРАН ГЕН. ДРУГИ ПОДХОДЯЩИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ БОЗАЙНИЦИ ВКЛЮЧВАТ, НО НЕ СЕ ОГРАНИЧАВАТ ДО: HELA, МИШИ L929 КЛЕТКИ, ЗТЗ ЛИНИИ ПРОИЗХОЖДАЩИ ОТ SWISS; BALB-C ИЛИ NIH ОТ МИШКА, ВНК ИЛИ НАК КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ХАМСТЕР.

СЪЩО ТАКА КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ, ПОДХОДЯЩИ ЗА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА БАКТЕРИАЛНИТЕ КЛЕТКИ. НАПРИМЕР РАЗЛИЧНИТЕ ЩАМОВЕ НА E.coli /НВ101; DH9, DH10, МС1061/ СА ДОБРЕ ПОЗНАТИ КАТО КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНЦИ В ОБЛАСТТА НА БИОТЕХНОЛОГИЯТА. РАЗЛИЧНИ ЩАМОВЕ НА В. SUBTILIS; PSEUDOMONAS SPP; BACILUS SPP; STREPTOMYCES SPP И ДРУДИ ПОДОБНИ СА СЪЩО ВКЛЮЧЕНИ В ТОЗИ МЕТОД.

МНОГО РОДОВЕ ДРОЖДЕНИ КЛЕТКИ, ПОЗНАТИ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ, СЪЩО МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ ТОВА ИЗОБТРЕТЕНИЕ. В ДОПЪЛНЕНИЕ , АКО Е НЕОБХОДИМО КАТО КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ ЗА МЕТОДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЗВАТ КЛЕТКИ ОТ НАСЕКОМИ. ВИЖ MILLER ЕТ AL., GENETIC ENGINEERING 8: 277-298 /1986/ И ЦИТИРАНИТЕ ТАМ СПРАВКИ.

НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ДАВА СЪЩО ТАКА РЕКОМБИНАНТНИ МОЛЕКУЛИ ИЛИ ВЕКТОРИ, КОИТО ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ В МЕТОДА ЗА ЕКСПРЕСИЯ НА НОВИ Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ. ТЕЗИ ВЕКТОРИ СЪДЪРЖАТ Mpl ЛИГАНДНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО САМОСТОЯТЕЛНО ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ СЕКВЕНЦИИ КОДИРА Mpl ЛИГАНДНИТЕ ПОЛИПЕПТИДИ /С ИЛИ БЕЗ СИГНАЛНИ ПЕПТИДИ/ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ИЛИ ТЕХНИ АКТИВНИ ФРАГМЕНТИ. ВЕКТОРИТЕ, ВКЛЮЧВАЩИ МОДИФИЦИРАНИ СЕКВЕНЦИИ, КАКТО Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ СА

-56ВКЛЮЧЕНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ И СА ПРИЛОЖИМИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВОТО НА Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ. ВЕКТОРЪТ ИЗПОЛЗВАН В МЕТОДА СЪДЪРЖА СЪЩО ТАКА ИЗБРАНИ РЕГУЛАТОРНИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТО СА В ОПЕРАТИВНА ВРЪЗКА С ДНК КОДИРАЩИТЕ СЕКВЕНЦИИ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО И СА СПОСОБНИ ДА НАСОЧВАТ ТЯХНАТА РЕПЛИКАЦИ И ЕКСПРЕСИЯ В ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ.

ЕДИН ОТ ВЕКТОРИТЕ ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН ЗА ЕКСПРЕСИЯ В COS КЛЕТКИ Е РМХ [Y.C. YANG ЕТ AL., CELL:47:3 -10 /1986/]. ДРУГ ВЕКТОР, КОЙТО Е ПРЕДПОЧИТАН ЗА ЕКСПРЕСИЯ В КЛЕТКИ ОТ БАЗАЙНИЦИ, НАПРИМЕР В СНО КЛЕТКИ Е ЕРЕМС2В1. ВЕКТОРИТЕ, ЕКСПРЕСИРАНИ В КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ, ОПИСАНИ ТУК, СА ДОБРЕ ПОЗНАТИ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. КОМПОНЕНТИТЕ НА ВЕКТОРИТЕ, Т.Е. РЕПЛИКОНИТЕ; ИЗБРАНИТЕ ГЕНИ, УСИЛВАТЕЛИТЕ /ЕНХАНСЕРИ/, ПРОМОТОРИ И ДР. МОГАТ ДА БЪДАТ ПОЛУЧЕНИ ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ ИЛИ СИНТЕЗИРАНИ ЧРЕЗ ПОЗНАТИТЕ ПРОЦЕДУРИ. ВИЖ KAUFMAN ЕТ AL., J. MOL. BIOL. 159: 511-521 /1982/; И KAUFMAN, PROC. NATE. ACAD. SCI UUSA 82:689-693 /1985/. ОСВЕН ТОВА ВЕКТОРНАТА ДНК МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА ЦЕЛИЯ ГЕНОМ НА ГОВЕЖДИЯ ПАПИЛОМЕН ВИРУС ИЛИ ЧАСТ ОТ НЕГО [LUSKY ЕТ AL., CELL 36: 391-401 /1984/] И ТОЙ ДА БЪДЕ РЕПЛИЦИРАН КАТО СТАБИЛЕН ЕПИЗОМЕН ЕЛЕМЕНТ В КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ КАТО С127 МИШИ КЛЕТКИ. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ТРАНСфЕКЦИЯТА НА ПОДХОДЯЩИТЕ КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ С ТЕЗИ ВЕКТОРИ Е ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ. ЗА ТАЗИ ЦЕЛ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ И ДРУГИ ЕКСПРЕСИОННИ ВЕКТОРИ, ПОЗНАТИ В ТАЗИ ОБЛАСТ ЗА ЕКСПРЕСИЯ В КЛЕТКИ НА БОЗАЙНИЦИ, НАСЕКОМИ, ДРОЖДИ, ГЪБИ И БАКТЕРИИ.

СЪСТОЯНИЯТА, КОИТО МОГАТ ДА СЕ ЛЕКУВАТ С МЕТОДИТЕ И СЪСТАВИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ НАЙ-ОБЩО ВКЛЮЧВАТ СЪЩЕСТВУВАЩА МЕГАКАРИОЦИТНАЯРОМБОЦИТНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ ИЛИ ОЧАКВАНА МЕГАКАРИОЦИТНА/ТРОМБОЦИТНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ В БЪДЕЩЕ /ПРИ

-57ПЛАНИРАНИ ОПЕРАЦИИ НАПРИМЕР/. ТЕЗИ СЪСТОЯНИЯ ОБИКНОВЕНО СА РЕЗУЛТАТ ОТ НЕДОСТАТЪЧНОСТ /ВРЕМЕННА ИЛИ ПОСТОЯННА/ НА АКТИВЕН Mpl ЛИГАНД IV VIVO. ГЕНЕРИЧНОТО НАЗВАНИЕ НА ТРОМБОЦИТНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ Е ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И СЛЕДОВАТЕЛНО; МЕТОДИТЕ И СЪСТАВИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ПОДХОДЯЩИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ.

ТРОМБОЦИТОПЕНИЯТА МОЖЕ ДА Е РЕЗУЛТАТ ОТ РАЗЛИЧНИ ПРИЧИНИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО ХИМИОТЕРАПИЯ, ДРУГИ ТЕРАПИИ С ЛАКАРСТВА, РАДИАЦИОННА ТЕРАПИЯ, ХИРУРГИЧНИ ОПЕРАЦИИ, ЗАГУБА НА КРЪВ И ДРУГИ СПЕЦИФИЧНИ БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ. НАПРИМЕР СПЕЦИФИЧНИ БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ, КОИТО СЕ ИЗРАЗЯВАТ В ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И МОГАТ ДА СЕ ЛЕКУВАТ В СЪОТВЕТСТВИЕ С ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ СА: АПЛАСТИЧНА АНЕМИЯ; ИДИОПАТИЧНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ; МЕТАСТАЗНИ ТУМОРИ, КОИТО ПРЕДИЗВИКВАТ ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, СИСТЕМЕН ЛУПУС ЕРИТЕМАТОЗУС; СПЛЕНОМЕГАЛИЯ; СИНДРОМ НА FAUCONI; НЕДОСТАТЪЧНОСТ НА ВИТАМИН В12; НЕДОСТАТЪЧНОСТ НА фОЛИЕВА КИСЕЛИНА; АНОМАЛИЯ НА MAY-HEGGLIN; СИНДРОМ НА WISKOTT-ALDICH; PARATYSMAL NOCTURAL HEMOGLOBINURIA. ТРОМБОЦИТОПЕНИЯТА МОЖЕ ДА БЪДЕ РЕЗУЛТАТ ОТ НЯКОИ МЕТОДИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА СПИН /НАПР. AZT/. СЪЩО ТАКА , НЯКОИ НАРУШЕНИЯ ПРИ ЗАРАСТВАНЕТО НА РАНИ МОГАТ ДА СЕ ПОВЛИЯЯТ БЛАГОПРИЯТНО С УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ.

ВЪВ ВРЪЗКА С РАЗГЛЕДАНИТЕ СЪСТОЯНИЯ НА ТРОМБОЦИТНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ, НАПР. ПРИ БЪДЕЩА ОПЕРАЦИЯ Mpl ЛИГАНДА ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ТРЯБВА ДА СЕ ПРИЛОЖИ ОТ НЯКОЛКО ДНИ ДО НЯКОЛКО ЧАСА ПРЕДИ НУЖДАТА ОТ ТРОМБОЦИТИ. ПРИ ОСТРИТЕ СЪСТОЯНИЯ, НАПРИМЕР ПРИ ВНЕЗАПНА И МАСИВНА КРЪВОЗАГУБА Mpl ЛИГАНДА МОЖЕ ДА СЕ ПРИЛОЖИ ЗАЕДНО С КРЪВ ИЛИ ПРЕЧИСТЕНИ ТРОМБОЦИТИ.

-58Mpl ЛИГАНДИТЕ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ОКАЖАТ ПОЛЕЗНИ ЗА СТИМУЛИРАНЕ И НА НЯКОИ КЛЕТЪЧНИ ТИПОВЕ, РАЗЛИЧНИ ОТ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, АКО Е УСТАНОВЕНО ЧЕ ТЕЗИ КЛЕТКИ ЕКСПРЕСИРАТ Mpl РЕЦЕПТОР. СЪСТОЯНИЯТА, СВЪРЗАНИ С КЛЕТКИ, ЕКСПРЕСИРАЩИ Mpl РЕЦЕПТОР СА СЪЩО ОБХВАНАТИ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ.

MGDF МОЛЕКУЛИТЕ, КОИТО САМИ ПО СЕБЕ СИ НЕ ПОКАЗВАТ АКТИВНОСТ В ИЗСЛЕДВАНИЯТА > ПРЕДСТАВЕНИ ТУК МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ КАТО МОДУЛАТОРИ /ИНХИБИТОРИ ИЛИ СТИМУЛАТОРИ/ НА Mpl РЕЦЕПТОРИТЕ IN VITRO ИЛИ IN VIVO.

СЪЩО ТАКА ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЗВАТ САМОСТОЯТЕЛНО ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ ЦИТОКИНИ; РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР; ХЕМАТОПОЕТИЧНИ ФАКТОРИ; ИНТЕРЛЕВКИНИ; РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ИЛИ АНТИТЕЛА ПРИ ЛЕЧЕНИЕ НА СПОМЕНАТИТЕ СЪСТОЯНИЯ.

ПОРАДИ ТОВА ДРУГ АСПЕКТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО СА ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ПОСОЧЕНИТЕ ПО-ГОРЕ СЪСТОЯНИЯ. ТЕЗИ СЪСТАВИ СЪДЪРЖАТ ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ Mpl ЛИГАНДНИЯ ПОЛИПЕПТИД ИЛИ НЕГОВ ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВЕН ФРАГМЕНТ В СМЕС С ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ НОСИТЕЛ НОСИТЕЛЯТ МОЖЕ ДА БЪДЕ ВОДА ЗА ИНЖЕКТИРАНЕ, ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ДОПЪЛНЕНА С ДРУГИ МАТЕРИАЛИ, КОИТО СЕ ИЗПОЛЗВАТ В РАЗТВОРИТЕ ЗА ПРИЛАГАНЕ ПРИ БОЗАЙНИЦИ. ТИПИЧНОТО ПРИЛОЖЕНИЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ Mpl ЛИГАНД ЩЕ БЪДЕ ПОД ФОРМАТА НА СЪСТАВ, СЪДЪРЖАЩ ПРЕЧИСТЕН БЕЛТЪК И ЕДИН ИЛИ ПОВЕЧЕ ФИЗИОЛОГИЧНО ПРИЕМЛИВИ НОСИТЕЛИ ИЛИ РАЗТВОРИТЕЛИ. ПРИМЕРНИ ПОДХОДЯЩИ НОСИТЕЛИ СА СОЛЕВИ БУфЕР ИЛИ СОЛ СМЕСЕНА СЪС СЕРУМЕН АЛБУМИН. ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ Е ПРОДУКТЪТ ДА СЕ ПРИГОТВИ ПОД ФОРМАТА НА ЛИОФИЛИЗАТ ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИ ИНЕРТНИ НОСИТЕЛИ /НАПР. ЗАХАРОЗА/. ПРИ

-59НЕОБХОДИМОСТ МОГАТ ДА СЕ ВКЛЮЧАТ И ДРУГИ СТАНДАРТНИ НОСИТЕЛИ И РАЗТВОРИТЕЛИ. ДРУГИ ПРИМЕРНИ СЪСТАВИ ВКЛЮЧВАТ ТРИС БУфЕР, pH 8.0 И АЦЕТАТЕН БУФЕР, pH 5.0, КАТО ЗА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН СЛУЧАЙ В ТЯХ МОЖЕ ДА СЕ ВКЛЮЧИ ДОПЪЛНИТЕЛНО СОРБИТОЛ.

ТЕЗИ СЪСТАВИ МОГАТ ДА БЪДАТ СИСТЕМНО ПРИЛАГАНИ ПАРЕНТЕРАЛНО. ОСВЕН ТОВА. СЪСТАВИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРИЛАГАНИ ВЕНОЗНО ИЛИ ПОДКОЖНО. КОГАТО ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ НА ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ ПРИЛАГАТ СИСТЕМНО ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПОД ФОРМАТА НА НЕПИРОГЕНЕН ПАРЕНТЕРАЛНО ПРИЛОЖИМ ВОДЕН РАЗТВОР. ПРИГОТВЯНЕТО НА ТАКИВА ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВИ БЕЛТЪЧНИ РАЗТВОРИ С НЕОБХОДИМОТО pH, ИЗОТОНИЧНОСТ И СТАБИЛНОСТ Е ПОЗНАТО В НАУКАТА.

РЕЖИМА НА ДОЗИТЕ В МЕТОДА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА СПОМЕНАТИТЕ

СЪСТОЯНИЯ ЩЕ БЪДЕ ОПРЕДЕЛЕН ОТ ЛЕКУВАЩИЯТ ЛЕКАР, КАТО СЕ ВЗЕМАТ ПОД ВНИМАНИЕ РАЗЛИЧНИТЕ ФАКТОРИ , ОПРЕДЕЛЯЩИ ДЕЙСТВИЕТО НА ЛЕКАРСТВАТА: ВЪЗРАСТ, СЪСТОЯНИЕ, ТЕЛЕСНО ТЕГЛО, ПОЛ, ДИЕТА НА ПАЦИЕНТА, НАЛИЧИЕ НА ИНФЕКЦИЯ, ВРЕМЕ НА ПРИЕМИТЕ И ДРУГИ КЛИНИЧНИ ФАКТОРИ. НАЙ-ОБЩО ДНЕВНАТА ДОЗА ТРЯБВА ДА БЪДЕ В РАМКИТЕ ОТ 0.1 ДО 1000 МИКРОГРАМА Mpl ЛИГАНДЕН БЕЛТЪК НА КИЛОГРАМ ТЕЛЕСНО ТЕГЛО.

ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ МЕТОДИ, СЪСТАВИ И ПОЛИПЕПТИДИ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ СЪЩО ТАКА ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ САМОСТОЯТЕЛНО ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ ЦИТОКИНИ, РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР, ХЕМОПОЕТИЧНИ ФАКТОРИ, ИНТЕРЛЕВКИНИ, РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ИЛИ АНТИТЕЛА В ЛЕЧЕНИЕ НА БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ, ХАРАКТЕРИЗИРАЩИ СЕ С ДРУГИ СИМПТОМИ. УСТАНОВЕНО Е, ЧЕ Mpl ЛИГАНДНАТА МОЛЕКУЛА В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ СТИМУЛИРАЩИ ХЕМОПОЕЗАТА ФАКТОРИ КАТО IL ИЛИ GM CSF, СЕ ОКАЗВА ПОЛЕЗНА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА НЯКОИ ФОРМИ ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. ДРУГИ СТИМУЛИРАЩИ ФАКТОРИ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ

-60KATO Meg-CSF, ФАКТОРА НА СТВОЛОВИТЕ КЛЕТКИ /STEM CELL FACTOR ,„SCF“/; ЛЕВКЕМИЯ ИНфИБИРАЩИЯТ ФАКТОР /LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR, ,,LIF“/; ОНКОСТАИН M /ONKOSTATIN M, ,,OSM“/ ИЛИ ДРУГИ МОЛЕКУЛИ, ПРИТЕЖАВАЩИ СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТИТЕ СЪЩО МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ЗАЕДНО С Mpl ЛИГАНДА. ДРУГИ ЦИТОКИНИ ИЛИ ХЕМОПОЕТИЧНИ ФАКТОРИ ЗА ТАКОВА ЕДНОВРЕМЕННО ПРИЛАГАНЕ СА НАПРИМЕР: IL-1 АЛфА, IL-1 БЕТА, IL-2, IL-3, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, КОЛОНИЯ СТИМУЛИРАЩ ФАКТОР -1 /G-CSF/, ЕРО, ИНТЕРфЕРОН -АЛфА /IFN - АЛФА/, ИНТЕРфЕРОН -БЕТА, ИНТЕРфЕРОН -ГАМА. СЪЩО ТАКА МОЖЕ ДА СЕ ОКАЖЕ ПОЛЕЗНО ЕДНОВРЕМЕННОТО ИЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНО ПРИЛАГАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР ОТ БОЗАЙНИЦИ, КОЙТО ПРЕДИЗВИКВА ФРАГМЕНТАЦИЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, КОГАТО МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ДОСТИГНАТ ЗРЯЛА ФОРМА. ОЧАКВА СЕ ОСОБЕНО ЕФЕКТИВНО СРЕДСТВО ЗА СТИМУЛИРАНЕ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ ДА БЪДЕ ПРИЛАГАНЕТО НА Mpl ЛИГАНД /ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ЗРЕЛИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ/ ПОСЛЕДВАНО ОТ ПРИЛАГАНЕ НА РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР /ЗА ИНАКТИВИРАНЕ НА ЛИГАНДА И ЗА ДА ПОЛЗВОЛИ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ/. ДОЗАТА ЦИТИРАНА ПО-ГОРЕ ТРЯБВА ДА БЪДЕ КОРИГИРАНА, ЗА ДА СЕ КОМПЕНСИРАТ ТЕЗИ ДОПЪЛНИТЕЛНИ КОМПОНЕНТИ В ТЕРАПЕВТИЧНИЯ СЪСТАВ. ПОДОБРЕНИЕТО В СЪСТОЯНИЕТО НА ЛЕКУВАНИЯ ПАЦИЕНТ МОЖЕ ДА БЪДЕ УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ СТАНДАРТНИТЕ МЕТОДИ.

ДРУГО ПРИЛОЖЕНИЕ НА ТЕЗИ НОВИ ПОЛИПЕПТИДИ Е В РАЗРАБОТВАНЕТО НА АНТИТЕЛА, СЪЗДАДЕНИ ЧРЕЗ СТАНДАРТНИ МЕТОДИ. РАЗЛГЕДАНИ СА АНТИТЕЛА, КОИТО РЕАГИРАТ С Mpl ЛИГАНД ИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ, А СЪЩО И РЕАКТИВОСПОСОБНИ ФРАГМЕНТИ ОТ ТАКИВА АНТИТЕЛА. АНТИТЕЛАТА МОГАТ ДА БЪДАТ ПОЛИКЛОНАЛНИ, МОНОКЛОНАЛНИ, РЕКОМБИНАНТНИ, ХИМЕРНИ, ЕДНОВЕРИЖНИ И/ИЛИ БИСПЕЦИфИЧНИ И ДР. ФРАГМЕНТИТЕ ОТ АНТИТЕЛА МОГАТ ДА БЪДАТ ВСИЧКИ ФРАГМЕНТИ, КОИТО РЕАГИРАТ С Mpl ЛИГАНДА ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ КАТО Fab, И ДР. В

-61НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ДАДЕНИ СЪЩО ХИБРИДОМИТЕ, ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗ ПРЕДСТАВЯНЕ НА Мр1 ЛИГАНД ИЛИ НЕГОВ ФРАГМЕНТ КАТО АНТИГЕН В ИЗБРАН БОЗАЙНИК, ПОСЛЕДВАНО ОТ СЛИВАНЕТО НА КЛЕТКИТЕ ОТ ЖИВОТНОТО С ОПРЕДЕЛЕНИ РАКОВИ КЛЕТКИ С ПОМОЩТА НА ПОЗНАТИТЕ ТЕХНИКИ, ЗА ДА СЕ ПОЛУЧАТ БЕЗСМЪРТНИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ. В ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ СА РАЗГЛЕДАНИ СЪЩО МЕТОДИТЕ ЗА СЪЗДАВАНЕ НА КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ И АНТИТЕЛА, НАСОЧЕНИ СРЕЩУ ЦЕЛИЯ ЧОВЕШКИ Мр1 ЛИГАНДЕН ПОЛИПЕПТИД ИЛИ ЧАСТИ ОТ НЕГО.

АНТИТЕЛАТА МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ТЕРАПЕВТИЧНО ЗА ИНХИБИРАНЕ СВЪРЗАНЕТО МЕЖДУ Мр1 ЛИГАНДА И НЕГОВИЯ РЕЦЕПТОР. ОСВЕН ТОВА АНТИТЕЛАТА МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ДИАГНОСТИЧНИ ЦЕЛИ IN VIVO И IN VITRO, НА ПРИМЕР ЗА ПРИГОТВЯНЕ НА ТЕСТ ЗА УСТАНОВЯВАНЕ НАЛИЧИЕТО НА Мр1 ЛИГАНД В ТЪКАННИ ТЕЧНОСТИ.

★ * ★

ЗА ПО-ПЪЛНА ИЛЮСТРАЦИЯ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ВКЛЮЧЕНИ СЛЕДВАЩИТЕ ПРИМЕРИ. В ДОПЪЛНЕНИЕ ТЕЗИ ПРИМЕРИ ПОКАЗВАТ НАЙВАЖНИТЕ АСПЕКТИ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО, БЕЗ ДА ОГРАНИЧАВАТ ТЕХНИЯ ОБХВАТ, ОСВЕН АКО ТОВА НЕ Е ИЗРИЧНО ОТБЕЛЯЗАНО. СТАНДАРНИТЕ МЕТОДИ ЗА ВСЯКА ОТ ПРОЦЕДУРИТЕ, ОПИСАНИ В СЛЕДВАЩИТЕ ПРИМЕРИ ИЛИ ПОДХОДЯЩИТЕ АЛТЕРНАТИВНИ ПРОЦЕДУРИ СА ПРЕДСТАВЕНИ В ШИРОКО ИЗВЕСТНИТЕ РЪКОВОДСТВА ПО МОЛЕКУЛЯРНА БИОЛОГИЯ, КАТО: SAMBROOK ЕТ AL., MOLECULAR CLINING, SECOND EDITION; COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS /1987/; AUSHBEL ET AL., /EDS/, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, GREENE ASSOCIATES. WILEY INTERSCIENCE, NEW YORK/1990/.

-62ПРИМЕР 1

АПЛАСТИЧНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА

ХИПАРИНИЗИРАНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА “АРК9“/ ИЛИ НОРМАЛНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА БЕШЕ ПОЛУЧЕНА СПОРЕД МЕТОДИТЕ _} ОПИСАНИ В СЛЕДВАЩИТЕ ПУБЛИКАЦИИ, КАТО Е ПРОМЕНЕНО ТОВА ЧЕ РЕЦИПИЕНТИТЕ СА ПОЛУЧИЛИ 450 rad РАДИАЦИЯ НА ЦЯЛОТО ТЯЛО:

1. MAZUR, Е. AND SOUTH, К. EXP. HEMATOL. 13: 1164-1172/1985/.

2. ARRIAGE, M„ SOUTH K„ CONEN, J.L. AND MAZUR, E.M. BLOOD 69: 486-492/1987/.

ПРИМЕР 2

ИЗСЛЕДВАНЕ HA ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ

APK9 И ФРАКЦИОНИРАНА АРК9 . БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ЗА

СПОСОБНОСТТА ИМ ДА СТИМУЛИРАТ РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ ОТ CD34+ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. СО34-ИЗБРАНИ КЛЕТКИ БЯХА ПОЛУЧЕНИ ОТ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ^КАКТО Е ОПИСАНО /НОКОМ, Т., AND HUNT, Р. MOLECULAR BIOGOLY OF HAEMOTOPOESIS 3:31 /1994/ И БЯХА ИНКУБИРАНИ В СЛЕДНАТА КУЛТУРАЛНА СРЕДА:1 SCOVE МОДИФИЦИРАНА DULBECCO СРЕДА /IMDM; G ВСО, GRAND ISLAND, N.Y./jKBM КОЯТО СА ДОБАВЕНИ: 1% ГЛУТАМИН PEN-STREP /IRVINE SCIENTIFIC, SOUTH ANA, СА/ И 10 % ХИПАРИЗИРАНА, БЕДНА НА ТРОМБОЦИТИ ЧОВЕШКА АБ ПЛАЗМА. СЪЩО ТАКА СА ДОБАВЕНИ: 2-МЕРКАПТОЕТАНОЛ /10 М/; PYRUVIC

КИСЕЛИНА /110 gg/ml/; ХОЛЕСТЕРОЛ 7.8 gg/ml/; АДЕНИН; ГУАНИН; ЦИТИДИН; УРИДИН; ТИМИДИН; 2 ДЕЗОКСИ ЦИТОЗИН; 2 ДЕЗОКСИ АДЕНОЗИН; 2 ДЕСОКСИ ГУАНОЗИН /ПО 10 gg/ml ОТ ВСЯКА, SIGMA/; ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ИНСУЛИН /10 цд/т!/; ЧОВЕШКИ ТРИСфЕРИН /300 цд ml/; СОЕВИ ЛИПИДИ /1%, BOEHRINGER

-63MANUHEIM; FUDIANA POLIS, IN/; ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ОСНОВЕН ФИБРОБЛАСТЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР /2 ng/ml, GEUZYME; CAMBRIDGE; МА/; ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ЕПИДЕРМАЛЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР /5 ng/ml/, ТРОМБОЦИТЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР /10 ng/ml, AMGEN INC, THOUSAND OAKS, СА/. CD-34 -ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА ПОСТАВЕНИ В 2 х 10 ml КУЛТУРАЛНА СРЕДА, 15 ul КРАЕН ОБЕМ, В МИКРОТИТЪРНИ СЪДОВЕ ВИД TERASAKI /VAUDUARD, INC., NEPTUNE, NJ/. КЛЕТКИТЕ БЯХА ИНКУБИРАНИ ПРИ 37 ⁰ С ЗА 8 ДНИ В ОВЛАЖНИТЕЛНИ БОКСОВЕ, ПРИ 5 % СО₂ ВЪВ ВЪЗДУХА, ФИКСИРАНИ ДИРЕКТНО ВЪРХУ СЪДОВЕТЕ С 1 % ГЛУТАРАЛДЕХИД И ИНКУБИРАНИ СЪС СМЕС ОТ МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА [АНТИ- GPIb, АНТИ -GPIIb, /BIODESIGN/ И АНТИGPIb /DAKO; CARPINTERIA, СА/. ИМУННАТА РЕАКЦИЯ Е РАЗВИТА В СТРЕПТАВИДИН-БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА ДЕТЕКТОРНА СИСТЕМА /HUSTOMARK, KIKEGAARD AND PERRY/. МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, СИНИ НА ЦВЯТ СА ПРЕБРОЕНИ С ОБРАТНО ФАЗОВ МИКРОСКОП ПРИ 100 X УВЕЛИЧЕНИЕ. РЕЗУЛТАТИТЕ БЯХА ПРЕДСТАВЕНИ КАТО СРЕДНИЯ БРОЙ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ЗА СЪД ± СТАНДАРТНАТА ГРЕШКА НА МЕТОДА. В НЯКОИ СЛУЧАИ ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИ КАТО МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml, КЪДЕТО НИВОТО, ДО КОЕТО ДАДЕНА ПРОБА УВЕЛИЧАВА МЕГАКАРИОЦИТНОТО РАЗВИТИЕ БЕШЕ С АНДАРТИЗИРАНО С ПОЛОЖИТЕЛНИЯ АРК9 КОНТРОЛ ЗА ТОЗИ ЕКСПЕРИМЕНТ. ЕДНА ЕДИНИЦА Е ДЕФИНИРАНА KOTO КОЛИЧЕСТВОТО МАТЕРИАЛ, КОЕТО ДАВА СЪЩОТО КОЛИЧЕСВО МЕГАКАРИОЦИТНИ КЛЕТКИ КАТО 1 ul ОТ АРК9 СТАНДАРТА. АКТИВНОСТТА БЕ ПРИЕТА КАТО ТАЗИ НА Mpl ЛИГАНДА, АКО ТОЙ МОЖЕ ДА БЪДЕ БЛОКИРАН С 5 - 10 pg/ml Mpl-X /РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР/.

В ТАЗИ СИСТЕМА Е ПОКАЗАНО, ЧЕ АРК9 СЪДЪРЖА ФАКТОР/И, КОЙТО СТИМУЛИРА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ. CD 34- ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ, ИНКУБИРАНИ С 10 NK ЗА 8 ДНИ ДАВАТ НЕЗНАЧИТЕЛЕН БРОЙ СИНЬО ОЦВЕТЕНИ МЕГАКАРИОЦИТИ.

-64ФИГ. 2 ПОКАЗВА, ЧЕ НАРАСТВАЩИ КОНЦЕНТРАЦИИ Mpl-X, ПРИБАВЕНИ КЪМ КУЛТУРАЛНАТА СИСТЕМА ОТ ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ НАРАСТВАЩО БЛОКИРАТ РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ. ПРИ КОНЦЕНТРАЦИИ НА Мр1-Х НАД 5 gg/ml ИНХИБИРАНЕТО Е ПЪЛНО.

В ТОЗИ ЕКСПЕРИМЕНТ CD-34-ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА СТИМУЛИРАНИ С 5 % АРК9. ТОВА ПОКАЗВА, ЧЕ ЗА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ Е НЕОБХОДИМА АКТИВНОСТ, КОЯТО ВЗАИМОДЕЙСТВА С Mpl - X / ПРЕДПОЛАГАЕМ Mpl ЛИГАНД/ И ПОКАЗВА, ЧЕ Mpl ЛИГАНДА ПРИСЪСТВА В САМАТА АРК9.

ПО-НАТ?АТЪК БЕШЕ ПОКАЗАНО, ЧЕ Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ, НЕОБХОДИМА ЗА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ ПРИСЪСТВА В АРК9. АРК9 /135 ml/ БЕШЕ РАЗРЕДЕНА 6 ПЪТИ СЪС СРЕДА ISCOVE И ПУСНАТА ПРЕЗ Мр1-Х АФИНИТЕТНА КОЛОНА. НЕСВЪРЗАНИЯТ МАТЕРИАЛ БЕШЕ СЪБРАН И КОНЦЕНТРИРАН ДО ОРИГИНАЛНИЯ ОБЕМ ОТ НАЧАЛОТО НА ИЗСЛЕДВАНЕТО. СВЪРЗАНИЯТ МАТЕРИАЛ БЕШЕ ОТМИТ/ЕЛЮИРАН/ С 10 ml 1М NaCI И 20 % ОТ ТОВА КОЛИЧЕСТВО БЕШЕ ДИАфИЛТРИРАНО И КОНЦЕНТРИРАНО 4 ПЪТИ. CD-34 ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ, ИНКУБИРАНИ САМО В КУЛТУРАЛНА СРЕДА НЕ СЕ РАЗВИВАТ ДО МЕГАКАРИОЦИТИ. КЛЕТКИТЕ ИНКУБИРАНИ В 5 % АРК9 /СЪЩАТА КАТО ТАЗИ ПУСНАТА ПРЕЗ КОЛОНАТА/ СЕ РАЗВИВАТ ДО 48 ± 8 МЕГАКАРИОЦИТА НА СЪД. КЛЕТКИТЕ, ИНКУБИРАНИ В 10 % ОТ НЕСВЪРЗАНИЯТ МАТЕРИАЛ НЕ СЕ РАЗВИВАТ ДО МЕГАКАРИОЦИТИ. КЛЕТКИТЕ, ИНКУБИРАНИ В 10 % ОТ ОТМИТИЯ МАТЕРИАЛ /ЕЛУАТА/ СЕ РАЗВИВАТ ДО 120 ± 44 МЕГАКАРИОЦИТА НА СЪД. И ДВЕТЕ АКТИВНОСТИ - ТАЗИ НА ПЪРВОНАЧАЛНАТА АРК9, КОЯТО Е ПУСНАТА ПРЕЗ КОЛОНАТА И ТАЗИ НА ЕЛУАТА СЕ ИНХИБИРАТ ПРАКТИЧЕСКИ НАПЪЛНО ОТ 5 ml Mpl-X.

-65ПРИМЕР 3

ТРАНСФЕКЦИЯ НА МИШИ ИЛИ ЧОВЕШКИ Mpl РЕЦЕПТОР В МИША КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ

А. МИШИ Mpl РЕЦЕПТОР

ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА ДНК НА МИШИЯ Мр1 РЕЦЕПТОР БЕШЕ СУБКЛОНИРАНА В ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР, СЪДЪРЖАЩ ТРАНСКРИПЦИОНЕН ПРОМОТОР, ПРОИЗХОЖДАЩ ОТ ДЪЛГИТЕ ТЕРМИНАЛНИ ПОВТОРИ /LTR/ НА MOLONEY МИШИ САРКОМА ВИРУС. 5 цд ОТ ТОЗИ ВЕКТОР И 1 цд ОТ МАРКЕРЕН ПЛАЗМИД pWLNeo БЯХА КО-ЕЛЕКТРОПОРИРАНИ В IL-3 ЗАВИСИМА МИША КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ /32D, КЛОН 23, GREENBERGER ЕТ AL, PNAS 80:2931-2936 (1983)/. КЛЕТКИТЕ БЯХА КУЛТИВИРАНИ 5 ДНИ, ЗА ДА СЕ ВЪЗСТАНОВЯТ ОТ ПРОЦЕДУРАТА, СЛЕД КОЕТО БЯХА ИНКУБИРАНИ В СЕЛЕКТИВНА СРЕДА. СЪДЪРЖАЩА 800 ng/ml GENETICIN /G 418, SIGMA/ И 1 ng/ml МИШИ IL-3. ОЦЕЛЕЛИТЕ КЛЕТКИ БЯХА РАЗДЕЛЕНИ НА ГРУПИ ОТ ПО 2 х 10⁵ КЛЕТКИ И БЯХА КУЛТИВИРАНИ ДОКАТО БЕШЕ ПОЛУЧЕНА ПОПУЛАЦИЯ, КОЯТО МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗСЛЕДВАНА ПО-НАТАТЪК. ШЕСТ ПОЛУЛАЦИИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ЗА ПОВЪРХНОСТНА ЕКСПРЕСИЯ НА Mpl РЕЦЕПТОР ЧРЕЗ FACS АНАЗИЗИ /FACS - СОРТИРАНЕ НА ФЛУОРЕСЦЕНТНО АКТИВИРАНИ КЛЕТКИ/, С ПОМОЩТА НА ПОЛИКЛОНАЛЕН ЗАЕШКИ АНТИГЕНЕН СЕРУМ. ЕДНА ОТ КОЛОНИИТЕ БЕШЕ ИЗБРАНА ЗА FACS АНАЛИЗ ЧРЕЗ СЪЩИЯ АНТИГЕНЕН СЕРУМ. КЛОНОВЕ ОТ ЕДИНИЧНИ КЛЕТКИ ОТ РОДИТЕЛСКАТА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ БЯХА ИЗБРАНИ ЧРЕЗ КУЛТИВИРАНЕ В 10 % АРК9 И GENETICIN. СЛЕД СЕЛЕКЦИЯТА В АРК9 ЗА 35 ДНИ КЛЕТКИТЕ БЯХА ПОДДЪРЖАНИ В 1 ng/ml МИШИ IL-3 . ЕДИН ОТ СУБКЛОНОВЕТЕ 1.А6.1 БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН ЗА РАБОТА.

ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА СЕКВЕНЦИЯТА НА ЧОВЕШКИЯ Mpl РЕЦЕПТОР /VIGON, I.

ET.AL.PNAS 89: 5640-5644 (1992)/. БЕШЕ СУБКЛОНИРАНА В ЕКСПРЕСИОНЕН

ВЕКТОР, СЪДЪРЖАЩ ТРАНСКРИПЦИОННИЯ ПРОМОТОР НА MOLONEY МИШИ

-66САРКОМЕН ВИРУС /СЪЩИЯТ ВЕКТОР ИЗПОЛЗВАН ПРИ ПРИ МИШИЯ РЕЦЕПТОР/. ШЕСТ pg ОТ ТАКА КОНСТРУИРАНИЯ ВЕКТОР И 6 рд ОТ ИЗГРАДЕН ЕЛЕМЕНТ НА АМФОТРОПИЧНАТА РЕТРОВИРУСНА ОБВИВКА /LANDAN; N.R., LITTMAN P.R.J., VIROLOGY 66: 5110 - 5119 (1992)/ БЯХА ВНЕСЕНИ В 3 х 10^е 293 КЛЕТКИ С ПОМОЩТА НА СаРО КИТ ЗА ТРАНСфЕКЦИЯ ПРИ БОЗАЙНИЦИ /STRATAGENE/. ТРАНСФЕКЦИЯТА НА ТЕЗИ КЛЕТКИ БЕШЕ ИЗВЪРШЕНА СЛЕД 2 И СЛЕД 4 ДНИ. В ДЕНЯ СЛЕД ПОСЛЕДНАТА ТРАНфЕКЦИЯ 293 КЛЕТКИТЕ БЯХА КУЛТИВИРАНИ ЗАЕДНО С IL-3 ЗАВИСИМА МИША КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ /32D, КЛОН 23; GREENBERGGER ЕТ AL., PNAS 80: 2931-2936 (1983)/. СЛЕД 24 ЧАСА КЛЕТКИТЕ БЯХА ОТДЕЛЕНИ И СВЪРЗАНИ С BSA ГРАДИЕНТ /РАТН-OCYTE; MILES INC./. КЛЕТКИТЕ БЯХА ПОСТАВЕНИ В 1 ng/ml МИШИ IL-3 И СЛЕД ТОВА БЯХА ИЗБРАНИ ЗА РАЗСТЕЖ В 20 % АРК9. КЛЕТКИТЕ БЯХА СОРТИРАНИ ПО ЕКСПРЕСИЯТА НА РЕЦЕПТОР НА КЛЕТЪЧНАТА ПОВЪРХНОСТ ЧРЕЗ FACS С ПОМОЩТА НА ПОЛИКЛОНАЛЕН ЗАЕШКИ АНТИПЕПТИДЕН СЕРУМ. ТЕЗИ КЛЕТКИ В ПОСЛЕДСТВИЕ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ В ИЗСЛЕДВАНИЯТА.

ПРИМЕР 4

1А6.1ЛЗСЛЕДВАНЕ ЗА Мр1 ЛИГАНД

КЛЕТКИ 1А6.1 БЯХА ОТМИТИ ОТ КУКТУРА IL-3 И ПРЕПОСЯТИ В /1000 КЛЕТКИ 15 μΙ ПЪЛЕН ОБЕМ/СЪД/ В МИКРОТИТЪРНИ СЪДОВЕ ВИД TERASAKI В АЛфА МЕМ /GIBCO/, ДОПЪЛНЕНА С 10 % фЕТАЛЕН ТЕЛЕШКИ СЕРУМ /FCS/, GENETICIN /800 pg/ml/ И 1% PEN/STREP /GIBCO/, В 1:1 СЕРИЙНИ РАЗРЕЖДАНИЯ НА ПРОБИТЕ. СЛЕД 48 ЧАСА БРОЯТ НА ЖИЗНЕСПОСОБНИТЕ КЛЕТКИ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН МИКРОСКОПСКИ. ЕДНА ЕДИНИЦА АКТИВНОСТ БЕШЕ ДЕФИНИРАНА КАТО ТОВА КОЛИЧЕСТВО АКТИВНОСТ, РЕЗУЛТАТЪТ ОТ КОЕТО Е 200 ЖИЗНЕСПОСОБНИ КЛЕТКИ НА СЪД. АКТИВНОСТТА БЕШЕ ДЕФИНИРАНА КАТО ТАЗИ НА Мр1 ЛИГАНД, АКО ТЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ НАПЪЛНО БЛОКИРАНА ЧРЕЗ ВКЛЮЧВАНЕ НА 5 -10 pg/ml Мр1-Х В ИЗСЛЕДВАНЕТО. Mpl ЛИГАНДНАТА

-67АКТИВНОСТ В АРК9 БЕ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 4400 ± 539 ЕДИНИЦИ/ml АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА. ЕДИНИЦИТЕ Мр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ СА ОПРЕДЕЛЕНИ В АРК9 ИЗСЛЕДВАНЕ, ОСВЕН АКО НЕ Е ОТБЕЛЯЗАНО ДРУГО.

ИЗСЛЕДВАНИЯТА С КЛЕТКИ ТРАНСфЕКТИРАНИ С ГЕН НА ЧОВЕШКИ Мр1 РЕЦЕПТОР /ПРИМЕР ЗВ/ СА ПРОВЕДЕНИ ПО АБСОЛЮТНО СЪЩИЯ НАЧИН КАКТО С 1А6.1 КЛЕТКИ.

ПРИМЕР 5

ОНАГЛЕДЯВАНЕ НА ПРИСЪСТВИЕТО НА Мpl -АИГАНД В АПЛАСТИЧНА ИЗТОЧНИЦИ

Mpl ЛИГАНД ПРИСЪСТВА В АПЛАСТИЧНАТА ПЛАЗМА ОТ МИШИ, КУЧЕШКИ, СВИНСКИ И ЧОВЕШКИ ИЗТОЧНИЦИ /ТАБЛИЦА 2/. ПЛАЗМА БЕШЕ СЪБРАНА ОТ МИШКА BDF1 ПРЕДИ ОБЛЪЧВАНЕ И 12 ДНИ СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТО /500 rad/. ПЛАЗМАТА БЕШЕ ТЕСТУВАНА В 1А6.1 АНАЛИЗ, КЪДЕТО ПОКАЗА 2000 ЕДИНИЦИ/ml АКТИВНОСТ, КОЯТО БЕШЕ ПРАКТИЧЕСКИ НАПЪЛНО ИНХИБИРАНА ОТ Mpl-X /Юид/ml/. ОБЛЪЧЕНАТА МИША ПЛАЗМА ДАДЕ ПОЛОЖИТЕЛЕН РЕЗУЛТАТИ В ЧОВЕШКИЯ МЕГАКАРИОЦИТЕН АНАЛИЗ, КЪДЕТО ПОКАЗА АКТИВНОСТ 1833 ЕДИНИЦИ/ml. ПЛАЗМА БЕШЕ СЪБРАНА ОТ КУЧЕТА ПРЕДИ ОБЛЪЧВАНЕО И 10 ДНИ СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТО /450 rad/. ПЛАЗМАТА БЕШЕ ТЕСТУВАНА И В ДВАТА АНАЛИЗА 1А6.1 И ЧОВЕШКИЯ МЕГАКАРИОЦИТЕН. И В ДВАТА АНАЛИЗА БЕШЕ ОТКРИТА АКТИВНОСТ, КОЯТО БЕШЕ НАПЪЛНО ИНХИБИРАНА ОТ Mpl-X /Юид/ml/. ПЛАЗМА БЕШЕ СЪБРАНА ОТ ПРАСЕТА ПРЕДИ ОБЛЪЧВАНЕТО И 10 ДНИ СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТО /650 rad/. ПЛАЗМАТА БЕШЕ ТЕСТУВАНА И В ДВАТА АНАЛИЗА 1А6.1 И ЧОВЕШКИЯТ МЕГАКАРИОЦИТЕН. И В ДВАТА АНАЛИЗА ТЯ ПОКАЗА Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ /КОЯТО СЕ ИНХИБИРА ОТ Mpl-X /10ид/т1/„ СЪПОСТАВИМА С ТАЗИ, УСТАНОВЕНА В АПЛАСТИЧНАТА КУЧЕШКА ПЛАЗМА.

-68БЕШЕ ПОЛУЧЕНА SERA ОТ АПЛАСТИЧНИ ХОРА. ТОЗИ МАТЕРИАЛ БЕШЕ СЪБРАН ОТ ХОРА С ТРАНСПЛАНТИРАН КОСТЕН МОЗЪК. SERA ОТ 6 ПАЦИЕНТИ БЕШЕ АНАЛИЗИРАНА В 1А6.1 АНАЛИЗА, КЪДЕТО ТЯ ПОКАЗА АКТИВНОСТ 903 ЕДИНИЦИ/ml, 88 % ОТ КОЯТО СЕ ДЪЛЖЕШЕ НА Mpl ЛИГАНД /КОЯТО СЕ ИНХИБИРА ОТ Mpl-X /Юид/ml/. СЪЩО ТАКА БЕШЕ ТЕСТУВАНА SERA ОТ 14 ПАЦИЕНТИ В ЧОВЕШКИЯ МЕГАКАРИОЦИТЕН АНАЛИЗ. ТЯ ПОКАЗА ОБЩА АКТИВНОСТ 941 МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml, КОЯТО БЕШЕ НАПЪЛНО ИНХИБИРАНА ОТ 10ug/ml. Mpl-X. ВКЛЮЧЕНИ СА ДАННИ ЗА МИШИ IL-3, ЗА ДА СЕ ДЕМОНСТРИРА СПЕСИфИЧНОСТТА НА 1А6.1 АНАЛИЗА. ВЪПРЕКИ, ЧЕ ТОЗИ РЕКОМБИНАНТЕН ЦИТОКИН УСИЛВА РАСТЕЖА НА КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ, ТОЙ НЕ СЕ БЛОКИРА ОТ 10 ug/ml Mpl-X.

ТАБЛИЦА 2

ВИДОВЕ	1А6.1 АНАЛИЗ /ЕДИНИЦИ/пт	ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТЕН АНАЛИЗ /МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml/
	СРЕДА	+ Mpl-X	СРЕДА	+ Mpl-X
НОРМАЛНА МИША	0 +/- 0	0+ -0	0 +/-0	0+/-0
АПЛАСТИЧНА МИША	2000	0	1833	НЕ Е ПРАВЕНО
НОРМАЛНА КУЧЕШКА	0 +/-0	0+ -0	0 +/-0	0+/-0
АПЛАСТИЧНА КУЧЕШКА	4400+/-539	0 + -0	792+/-128	0 +/-0
НОРМАЛНА СВИНСКА	0 +/-0	0 +;- 0	0 +/-0	0+/-1
АПЛАСТИЧНА СВИНСКА	3866+/-1136	0 +.· 0	1284+/-182	10 +/-10
НОРМАЛНА ЧОВЕШКА	0+/-0	0 +; 0	0 +/-0	0 +/-0
АПЛАСТИЧНА ЧОВЕШКА	903+/-64	0+/-С	941+/-178	0+/-0
МИШИ IL3	6000+/-565	6000+, 565	НЕ Е ПРАВЕНО	НЕ Е ПРАВЕНО

-69ПРИМЕР 6

Mpl ЛИГАНДА СТИМУЛИРА РАСТЕЖА НА 1 А6.1 КЛЕТКИ И РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ

Mpl ЛИГАНД /КОНЦЕНТРИРАН ПОНЕ 100,000 ПЪТИ СЛЕД ПРОЦЕДУРИ НА ЛЕКТИН И АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ /ВИЖ ПРИМЕР 7/ СТИМУЛИРА РАСТЕЖА НА 1А6.1 КЛЕТКИ И РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ ОТ CD34 ИЗБРАНИ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ ПО ДОЗА-ЗАВИСИМ НАЧИН. АКТИВНОСТТА ОТГОВОРНА ЗА ТОВА СЕ ДЪЛЖИ НА Mpl ЛИГАНД, КАКТО Е ПОКАЗАНО НА ФИГ. 2 И 3, СЛЕД КАТО АКТИВНОСТИТЕ И В ДВАТА НКЛИЗА МОГАТ ДА БЪДАТ НАПЪЛНО БЛОКИРАНИ A Mpl-X.

СЪЩО ТАКА ИЗОБРЕТАТЕЛИТЕ ПОКАЗАХА, ЧЕ КОГАТО CD34+ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, ПРЕЧИСТЕНИ ЧРЕЗ FACS СЕ ИНКУБИРАТ С Mpl ЛИГАНД /100 ЕДИНИЦИ/ml ЗА 9 ДНИ В СЛУЧАЯ/ ТЕ СЕ РАЗВИВАТ ВЪВ фЕНОТИПНО НОРМАЛНИ, ЗРЕЛИ МЕГАКАРИОЦИТИ. ТАКА СЕ УСТАНОВЯВА, ЧЕ ПРЕЧИСТЕНИЯ Mpl ЛИГАНД ОКАЗАВА СЪЩИЯ ЕфЕКТ ВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, КАКЪВТО ИМА НЕОБРАБОТЕНАТА АРК9. В ДОПЪЛНЕНИЕ В ТОЗИ ЕКСПЕРИМЕНТ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ПРЕЧИСТЕНИ CD34+KAETKH /100 % CD34+/ ЗА СЪПОСТАВКА С СО34-ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ, КОИТО СА ОКОЛО 30-50 % CD34+.

ПРИМЕР 7

ПРЕЧИСТВАНЕ НА КУЧЕШКИ Mpl ЛИГАНД

I. РЕЗЮМЕ

БЯХА ПРЕЧИСТЕНИ БЕЛТЪЦИТЕ 25 kd И 31 kd, КОИТО ПОКАЗВАТ АКТИВНОСТ, ОЧАКВНА ЗА ЛИГАНДА НА Mpl РЕЦЕПТОРА. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ПРЕЧИСТЕНИ

-70ОТ ПЛАЗМА НА ОБЛЪЧЕНИ КУЧЕТА ПО СХЕМА, ВКЛЮЧВАЩА АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ, Mpl РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ, ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ И С4 ОБРАТНО фАЗО&Д HPLC. ВИЖ фИГ. 4 , ЗА ОНАГЛЕДЯВАНЕ НА ТАЗИ СХЕМА ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ. Mpl ЛИГАНДНИТЕ 25 kd И 31 kd БЯХА ВИСОКО ПРЕЧИСТЕНИ ДО ПРАКТИЧЕКИ ХОМОГЕННИ И БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕНО, ЧЕ ТЕ СЪДЪРЖАТ АМИНО КИСЕЛИННИТЕ СЕКВЕНЦИИ РАЗГЛЕДАНИ ТУК.

II. МЕТОДИ

А, ПРЕЧИСТВАНЕ НА ПЛАЗМА

ЗАМРАЗЕНА ПЛАЗМА /ОБЩО 20 ЛИТРА/ ОТ ОБЛЪЧЕНИ КУЧЕТА /ВИЖ ПРИМЕР 1/ БЕШЕ РАЗМРАЗЕНА В ТЕЧЕНИЕ НА ЕДНА НОЩ ПРИ 4 °C. РАЗМРАЗЯВАНЕТО НА ГОЛЕМИТЕ БУТИЛКИ ЗАПОЧНА ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА ЗА НЯКОЛКО ЧАСА, ПРЕДИ ПОСТАВЯНЕТО ИМ В СТУДЕНАТА СТАЯ. НЕРАЗТВОРИМИЯ МАТЕРИАЛ БЕШЕ ОТСТРАНЕН ЧРЕЗ ЦЕНТРОФУГИРАНЕ ЗА 4 ЧАСА ПРИ 11.000 хд. ПЛАЗМАТА БЕШЕ РАЗРЕДЕНА С РАЗТВОР НА ФОСФАТЕН БУфЕР, pH 7.3, СЪДЪРЖАЩ 0.01 % НАТРИЕВ АЗИД /PBS/АЗИД/, И ФИЛТРИРАНА ПРЕЗ 1.2 цт ФИЛТЪР. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ТАЗИ ПРОЦЕДУРА НА ПРЕЧИСТВАНЕ БЕШЕ ПРИБЛИЗИТЕЛНО ДВА ПЪТИ КОНЦЕНТРИРАНЕ НА ИЗХОДНИЯ МАТЕРИАЛ.

Б. АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧЕНИ ЗАРОДИШИ АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ

ВСИЧКИ ОПЕРАЦИИ БЯХА ПРОВЕДЕНИ ПРИ 4 °C. ПРЕЧИСТЕНАТА ПЛАЗМА /РАЗДЕЛЕНА В ДВЕ ПРОБИ/ БЕШЕ ПУСНАТА ПРЕЗ КОЛОНА С ИМОБИЛИЗИРАН АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧЕНИ ЗАРОДИШИ /1 ЛИТЪР, 10 х 12 CM, EY LABORATORIES/, КАЛИБРИРАНА С PBS/АЗИД. СЛЕД КАТО ПРЕМИНАХА ПРОБИТЕ НЕСВЪРЗАНИЯ МАТЕРИАЛ БЕШЕ ОТМИТ С PBS/АЗИД, С ПОСЛЕДВАЩО

-71ОТМИВАНЕ С 0.5 М NaCI В 20 mM TRIS-HCI, pH 8. Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ, СВЪРЗНА В WGA КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАНА С 0.35 М N-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИН /GIcNAc/ 0.5 М NaCI, 20 mM TRIS-HCI, pH 8. В ИЗТЕКЛИТЕ ИЛИ ОТМИТИТЕ ФРАКЦИИ НЕ БЕШЕ УСТАНОВЕНА Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ.

В. Mpl-Х РЕЦЕПТОР АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ

РАЗТВОРИМИЯТ Mpl РЕЦЕПТОР /Mpl-Х/, КОЙТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН, СЪОТВЕТСТВА НА ЦЕЛИЯ ИЗВЪНКЛЕТЪЧЕН ДОМЕН НА Mpl РЕЦЕПТОРА МИНУС ТРИПТОФАН В ПОЗИЦИЯ 483 /ВИЖ VIGON, ЕТ AL, 8: 2607 - 2615 (1993)/. ЗА ДА СЕ ОПТИМИЗИРА СВЪРЗВАНЕТО НА Mpl ЛИГАНДА КЪМ Mpl-X РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНАТА КОЛОНА КОЛИЧЕСТВОТО, ЕЛЮИРАНО ОТ WGA БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАНО С ПОМОЩТА НА МЕМБРАНЕН УЛТРАфИЛТЪР /ДО 10,000 МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО, YM-10, AMICON/ И NaCI, ДОВЕДЕН ДО 0.2 М ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИ РАЗРЕЖДАНИЯ. КОНЦЕНТРИРАНОТО WGA КОЛИЧЕСТВО БЕШЕ ПУСНАТО ПРЕЗ 20 ml m-Mpl-X (РАЗТВОРИМ МИШИ Mpl РЕЦЕПТОР)/СИВг АКТИВИРАНА SEPHAROSE КОЛОНА /2,6 х 4.2 СМ., 1,5 mg m-Mpl-X НА ml СМОЛА/ ПРИ СКОРОСТ НА ПОТОКА 0.9 ml/ МИН. КОЛОНАТА БЕШЕ ПРОМИТА С 40 ml PBS/АЗИД ПРИ 1,5т1Лмс., ПОСЛЕДВАНО ОТ СОЛЕВО ОТМИВАНЕ С 10 тМ TRISHCI, 1М NaCI, 1тМ CHAPS, pH 8.0. СЛЕД ТОВА КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАНА С 20 тМ CAPS, 1М NaCI, 5тМ CHAPS, pH 10.5. СЪОТВЕТНИТЕ ФРАКЦИИ БЯХА СЪБРАНИ. КЪМ ВСЯКА ОТ ФРАКЦИИТЕ БЕШЕ ПРИБАВЕН TRIS ЗА НЕУТРАЛИЗАЦИЯ НА pH. ЕЛУАЦИОННИЯ ПРОфИЛ НА Mpl-Х РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНАТА КОЛОНА, ИЗСЛЕДВАН ЧРЕЗ SDS-PAGE И АДСОРБЦИЯ ПРИ 280 пт ПОКАЗАВА РАНЕН БЕЛТЪЧЕН ПИК ВЪВ ФРАКЦИИ 1-4, И ПО-ГОЛЯМА Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ ЕЛЮИРАНА СЛЕД ФРАКЦИЯ 5.

Г. МОНО-О АНИОН ОБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ

НАЙ-ПРЕЧИСТЕНИТЕ ФРАКЦИИ ОТ НЯКОЛКО Mpl-X РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНИ

-72КОЛОНИ БЯХА ОБЕДИНЕНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И ДИАфИЛТРИРАНИ СРЕЩУ 20 тМ TRIS-HCI, 5тМ CHAPS, pH 8.7 ДО КРАЕН ОБЕМ 58.5 ml. ЧРЕЗ АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 пт БЕШЕ УСТАНОВЕНО, ЧЕ БЕЛТЪЧНАТА КОНЦЕНТРАЦИЯ В СРЕДАТА Е 0.12 mg/ml /ПРИБЛИЗИТЕЛНО 7 тд БЕЛТЪК/. ТОВА КОЛИЧЕСТВО БЕШЕ ПУСНАТО ПРИ 0.5т1/МИН ПРЕЗ MONO Q HR 5/5 КОЛОНА PHARMACIA/, КАЛИБРИРАНА С 20 тМ TRIS-HCI, 5 тМ CHAPS, pH 8.7. КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАНА С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0,36 М NaCI В СЪЩИЯ БУфЕР ПОВЕЧЕ ОТ 27 МИНУТИ. СЛЕД ТОВА КОЛОНАТА БЕШЕ ПРОМИТА С 6 МИНУТЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0.54 М NaCI И НА КРАЯ СТЪПАЛОВИДНО ОТМИТА С 0,9 М NaCI. БЯХА СЪБРАНИ ФРАКЦИИ ОТ 1 ml.

ЕЛУАЦИОННИЯТ ПРОфИЛ НА MONO Q КОЛОНАТА ПОКАЗВА, ЧЕ В ИЗТЕКЛИТЕ ПРЕЗ КОЛОНАТА И ОТМИТИТЕ ФРАКЦИИ НЕ СЕ ОТКРИВА Mpl ЛИГАНД. МНОГО ОТ Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ СЕ ПОЯВЯВА ВЪВ ФРАКЦИИ 5-7, В НАЧАЛНИТЕ СТАДИИ НА NaCI ГРАДИЕНТА. РАМО НА АКТИВНОСТ СЕ НАБЛЮДАВА ВЪВ ФРАКЦИИ 8-10, ПОСЛЕДВАНО ОТ ВТОРИ ОЛЯМ ПИК , ВКЛЮЧВАЩ ФРАКЦИИ 1115.

В АКТИВНИТЕ ФРАКЦИИ СЕ ВИЖДА ЯСНА 25 kd ИВИЦА ПРИ SDS-PAGE /НЕРЕДУКЦИОННА/. ИНТЕНЗИВНОСТТА НА ИВИЦАТА СЪОТВЕТСТВА НА Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ ВЪВ ФРАКЦИИТЕ. ИВИЦАТА ЛИПСАВАШЕ ВЪВ ФРАКЦИИ 3 И 4 /НЯМА АКТИВНОСТ/. ТЯ БЕШЕ ЗНАЧИТЕЛНА ВЪВ ФРАКЦИИ 5 И 6 /ПИК НА АКТИВНОСТ НА 1А6.1/ И ПОДОБНА ИНТЕНЗИВНА ИВИЦА ПРИСЪСТВАШЕ ВЪВ ФРАКЦИИ 11-14 /ПИК НА АКТИВНОСТ НА 1А6.1/. ИВИЦАТА Е СЛАБА ВЪВ ФРАКЦИИ 15 И 16, В СЪОТВЕТСТВИЕ СЪС ЗНАЧИТЕЛНО НИСКАТА АКТИВНОСТ НА ФРАКЦИЯ 16.

Д, ЕКСПЕРИМЕНТИ НА ГЕЛНО ЕЛЮИРАНЕ

ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ НА ГЕЛНО ЕЛЮИРАНЕ БЯХА ПРОВЕДЕНИ С АЛИКВОТНИТЕ ЧАСТИ НА MONO Q ФРАКЦИИ 5 И 6 ИЛИ MONO Q ФРАКЦИИ 13 И 14. ЗА ТЕЗИ

-73ЕКСПЕРИМЕНТИ ФРАКЦИИ 5 И 6 /6 μΙ ВСЯКА/ ИЛИ 13 И 14 /7,5 μΙ ВСЯКА/ БЯХА СМЕСЕНИ СЪС СТАНДАРТЕН SDS-PAGE БУфЕР /НЕРЕДУЦИРАЩ/ И ВНЕСЕНИ В 12 % SDS ГЕЛОВЕ. СЛЕД ЗАВЪРШВАНЕ НА ЕЛЕКТРОФОРЕЗАТА ИВИЦИТЕ, КОИТО ПРЕДСТАВЛЯВАХА ИНТЕРЕС БЯХА ИЗРЯЗАНИ /1 mm/ И ПОЛУЧЕНИТЕ СЛОЕВЕ БЯХА НАРЯЗАНИ НА МАЛКИ ПАРЧЕТА С БРЪСНАРСКО НОЖЧЕ. ТЕЗИ ПАРЧЕТА БЯХА СЛОЖЕНИ В 1.5 ml МИКРОЕПРУВЕТКИ,СЪДЪРЖАЩИ 0.5 ml PBS /5т CHAPS/ И БЯХА РАЗКЛАЩАНИ ВНИМАТЕЛНО В ПРОДЪЛЖЕНИЕ НА ЕДНА НОЩ ПРИ 4 ° С. НА СЛЕДВАЩИЯ ДЕН ЕПРУВЕТКИТЕ БЯХА ЦЕНТРОФУГИРАНИ ЗА КРАТКО, АЛИКВОТНАТА ЧАСТ БЕШЕ ОТДЕЛЕНА И ПРОБАТА БЕШЕ ДИАфИЛТРИРАНА СРЕЩУ СРЕДА ISCOVE, КЪМ КОЯТО КАТО НОСЕЩ БЕЛТЪК БЕШЕ ДОБАВЕН BSA. ДИАфИЛТРИРАНИТЕ ПРОБИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ.

РЕЗУЛТАТИТЕ ПОКАЗАХА НАЛИЧИЕ НА ДВА ПИКА НА Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ. ЕДИНИЯТ ПИК СЪОТВЕТСТВА НА 25 kd УЧАСТЪКА В ΓΕΛΑ, А ВТОРИЯ ПИК НА Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ Е ОТКРИТ В 31 kd УЧАСТЪКА.

Е. SUPERDEX200 ГЕЛНА ФИЛТРАЦИЯ

ФРАКЦИИ 13-16 ОТ MONO Q АНИОН ОБМЕННАТА КОЛОНА, КАКТО И ДВЕ АНАЛОГИЧНИ ФРАКЦИИ ОТ ВТОРО РАЗДЕЛЯНЕ С MONO Q БЯХА СЪБРАНИ И КОНЦЕНТРИРАНИ С ПОМОЩТА НА МЕМБРАНЕН УЛТРАфИЛТЪР /CENTRICON-10, AMICON/. БЕШЕ ДОБАВЕН НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ В КРАЙНА КОНЦЕНТРАЦИЯ 0,1 % И ПРОБАТА БЕШЕ ИНЖЕКТИРАНА В SUPERDEX 200 HR 10/30 /PARMACIA/ КОЛОНА. КОЛОНАТА БЕШЕ КАЛИБРИРАНА С 50 mMTRIS-HCI, 0.1 % НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛфАТ, pH 7,5 ПРИ СКОРОСТ НА ПОТОКА 0.3 ml/i<_{O i}., ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА. НА ВСЯКА МИНУТА БЯХА СЪБИРАНИ ФРАКЦИИ. РЕЗУЛТАЪТ Е, ЧЕ ПОВЕЧЕТО ОТ БЕЛТЪКА ОТ ПРОБИТЕ ЕЛЮИРА ВЪВ ФРАКЦИИ 32-40, ДОКАТО Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНИОСТ Е УСТАНОВЕНА ВЪВ ФРАКЦИИ 42-

46. SDS-PAGE АНАЛИЗИТЕ НА ФРАКЦИИТЕ ПОКАЗВАТ ЯСНА 25 kd ИВИЦА В АКТИВНИТЕ ФРАКЦИИ.

Ж. С4 ОБРАТНО ФАЗОВА HPLC

SUPERDEX200 ФРАКЦИИ 43-46 СЪБРАНИ ЗАЕДНО ИЛИ ФРАКЦИЯ 42 ВЗЕТА ОТДЕЛНО БЯХА КОНЦЕНТРИРАНИ С ПОМОЩТА НА МЕМБРАНЕН УЛТРАфИЛТЪР /MICROCON-Ю, AMICON/. КОНЦЕНТРИРАНИТЕ КОЛИЧЕСТВА БЯХА ПУСНАТИ ПООТДЕЛНО ПРЕЗ 1 х 100 mm С4 ОБРАТНО ФАЗОВА MICROBORE КОЛОНА /SYNCHROPAC RP-4/. КОЛОНАТА БЕШЕ СТАНДАРТИЗИРАНА С 0.04 % TFA ВЪВ ВОДА /БУФЕР А/; БУфЕР Б БЕШЕ 0.035 % TFA В 80 % АЦЕТОНИТРИЛ. СЛЕД ИНЖЕКТИРАНЕ НА ПРОБАТА БЕШЕ НАПРАВЕН ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 45% ЗА ПОВЕЧЕ ОТ 4mm, ПОСЛЕДВАН ОТ ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 75 % ЗА ПОВЕЧЕ ОТ 40 ГЩ η СКОРОСТА НА ПОТОКА БЕШЕ 75 μΙ/ РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ

ПРЕЧИСТВАНЕТО НА ФРАКЦИЯ 42 СА ПОКАЗАНИ НА фИГ. 5. ЯСНИ ПИКОВЕ НА Мр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ СА ВИДИМИ ВЪВ ФРАКЦИИ 21-23. ТЕЗИ ФРАКЦИИ БЯХА АНАЛИЗИРАНИ В 14 % ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ ПРИ РЕДУЦИРАЩИ И НЕРЕДУЦИРАЩИ УСЛОВИЯ. ФРАКЦИЯ 21 БЕШЕ СЪСТАВЕНА САМО ОТ 31 kd ИВИЦА, ФРАКЦИЯ 23 БЕШЕ СЪСТАВЕНА ОТ ШИРОКА 25 kd ИВИЦА И ФРАКЦИЯ 22 СЪДЪРЖАШЕ ЕДНОВРЕМЕННО ИВИЦИТЕ НА 25 kd И 31 kd РАЙОНИТЕ. ДРУГИ ВАЖНИ ИВИЦИ НЕ БЯХА УСТАНОВЕНИ. ОБЪРНЕТЕ ВНИМАНИЕ. ЧЕ РАННИТЕ ЕКСПЕРИМЕНТИ НА РАЗТВАРЯНЕ В ГЕЛ, ПОКАЗАХА Мр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ И В ДВАТА РАЙОНА. ЕДИНИЧНАТА ПО-ВИСОКО МОЛЕКУЛНА ИВИЦА БЕШЕ НАБЛЮДАВАНА ВЪВ ВСИЧКИ ФРАКЦИИ НА НЕРЕДУЦИРАЩИЯТ ГЕЛ, НО НЕ БЕШЕ ЗАБЕЛЯЗАНА В РЕДУЦИРАЩИЯТ ГЕЛ.

3. АНАЛИЗИ НА N-КРАЙНИТЕ СЕКВЕНЦИИ НА 25 kd И 31 kd ЛИГАНДИ

АНАЛИЗЪТ НА N-КРАЙНИТЕ СЕКВЕНЦИИ БЕШЕ ПРОВЕДЕН С С4 RP-HPLC ФРАКЦИИТЕ, СЪДЪРЖАЩИ АКТИВНОСТ. СЕКВЕНЦИИТЕ ОПРЕДЕЛЕНИ ЗА ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СА ПОСОЧЕНИ ПО-ГОРЕ. В ДОПЪЛНЕНИЕ КЪМ ГЛАВНАТА СЕКВЕНЦИЯ, СЪОТВЕТСТВАЩА НА 25 kd ИВИЦАТА /НАЙ-МАЛКО 90 % ОТ ПРОБАТА/ ПРИ СЕКВЕНИРАНЕ БЯХА ОТКРИТИ ДВЕ МАЛКИ СЕКВЕНЦИИ /КОИТО СА СВЪРЗАНИ С

-75ГЛАВНАТА ИВИЦА НА ЗАМЪРСЯВАНИЯТА, ОПИСАНА В ЧАСТ Е ПО-ГОРЕ/. СРАВНЕНИЕТО С ПОЗНАТИ СЕКВЕНЦИИ ПОКАЗА, ЧЕ МАЛКИТЕ СЕКВЕНЦИИ СА КУЧЕШКИ ИМУНОГЛОБОЛИНОВА ТЕЖКА ВЕРИГА И КАПА ВЕРИГА. АКО Е НУЖНО КОЛИЧЕСТВОТО НА ТЕЗИ МАЛКИ ЗАМЪРСЯВАНИЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ НАМАЛЕНО ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА СЛЕДВАЩ ЕТАП НА ПРЕЧИСТВАНЕ, КАТО ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ Е ДРУГ ГЕЛ ФИЛТРАЦИОНЕН ЕТАП.

И, СРАВНЕНИЕ НА Mpl ЛИГАНДНИТЕ АКТИВНОСТИ В С4 ПРЕЧИСТЕНИТЕ ФРАКЦИИ

ИЗЛОЖЕНИТЕ НА фИГ. 6 ДАННИ ПОКАЗВАТ, ЧЕ АКТИВНОСТИТЕ, ПРИСЪСТВАЩИ ВЪВ ФРАКЦИИ 22 И 23 НА С4 RP-HPLC ХРОМАТОГРАфИЯТА СА ПРАКТИЧЕСКИ ЕДНАКВИ. ФРАКЦИЯ 22 СЪДЪРЖАШЕ СМЕС ОТ 25 И 31 kd ИВИЦИТЕ, ДОКАТО ФРАКЦИЯ 23 СЪДЪРЖАШЕ САМО ИВИЦА 25 kd. АЛИКВОТНИТЕ ЧАСТИ НА ВСЯКА ФРАКЦИЯ БЯХА РАЗРЕДЕНИ 1 : 45 000. РАЗРЕДЕНИТЕ ФРАКЦИИ СТИМУЛИРАХА ПОЧТИ ЕДНАКВО РАСТЕЖА НА 1А6.1. КЛЕТКИ /ФРАКЦИЯ 22, 5400 КЛЕТКИ НА СЪД; ФРАКЦИЯ 23, 6000 КЛЕТКИ НА СЪД/. РАЗРЕДЕНИТЕ ФРАКЦИИ БЯХА ИНКУБИРАНИ С НАРАСТВАЩИ КОНЦЕНТРАЦИИ НА Mpl-X. ФРАКЦИИТЕ БЯХА ЕДНАКВО ЧУВСТВИТЕЛНИ КЪМ ИНХИБИРАНЕТО С Mpl-X, И ДВЕТЕ БЯХА НАПЪЛНО БЛОКИРАНИ С 7-1.4 ug/ml. ТОВА ПОКАЗВА, ЧЕ АКТИВНИТЕ БЕЛТЪЦИ ВЪВ ВСЯКА ОТ ФРАКЦИИТЕ СА ВИДОВЕ Mpl ЛИГАНДИ С ЕДНАКАВА БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ.

ПРИМЕР 8

СРАВНЕНИЕ МЕЖДУ Mpl И ДРУГИ ФАКТОРИ НА МЕГАКАРИОЦИТНОТО РАЗВИТИЕ

БЕШЕ ДОКЛАДВАНО, ЧЕ ГРУПА РЕКОМБИНАНТНИ ФАКТОРИ ИЛИ ОРГАНИЧНИ СЪСТАВКИ, КАТО PHORBAL MYSTIRIC ACETATE /FMA/, ВЪЗДЕЙСТВАТ ВЪРХУ

-76МЕГАКАРИОЦИТНИЯ РАСТЕЖ И РАЗВИТИЕ. СЪОТВЕТНО БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ЕФЕКТА НА ТЕЗИ ФАКТОРИ ВЪРХУ CD-34-ИЗБРАНИ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ. ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ИНТЕРЛЕВКИН 3 /IL-3; 1 - 2 ng/ml/; ФАКТОР НА СТВОЛОВИТЕ КЛЕТКИ /SCF, 50 ng ml/; ИНТЕРЛЕВКИН 6 /IL-б, 25 ng/ml/; ЕРИТРОПОЕТИН /ЕРО, 1 ЕДИНИЦИ/ml/; ЛЕВКВМИЯ ИНХИБИРАЩИЯТ ФАКТОР /LIF, 10 ng/ml/; ГРАНУЛОЦИТО-МАКРОфАГОВИЯ КОЛОНИЯ СТИМУЛИРАЩ ФАКТОР /GMCSF, 25 ng/ml, AMGEN., INC./; ИНТЕРЛЕЕКИН 11 /IL-11, 25 ng/ml, R+D SYSTEMS, MINNEAPOLIS, MN/; PHORBAL MYRISTIC ACETATE /РМА, 10 M, SIGMA/ БЯХА ДОБАВЕНИ В КУЛТУРИТЕ КАКТО Е ОТБЕЛЯЗАНО. БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН Mpl ЛИГАНД 275 ЕДИНИЦИ/ml И АРК9 5% /РАВНО 220 ЕДИНИЦИ/ml. В КОМБИНАЦИЯ ФАКТОРИТЕ БЯХА ТЕСТВАНИ В СЪЩИТЕ КОНЦЕНТРАЦИИ, КАКТО КОГАТО БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ИНДИВИДУАЛНО. СЛЕД 8 ДНИ В КУЛТУРА КЛЕТКИТЕ БЯХА ФИКСИРАНИ ДИРЕКТНО ВЪРХУ СЪДОВЕТЕ И ОЦВЕТЕНИ ЗА МЕГАКАРИОЦИТИ. /п=6 СЪДА/ ИЛИ БЕШЕ ПРЕБРОЕН ПЪЛНИЯ КЛЕТЪЧЕН БРОЙ /п=3 СЪДА/. ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИ ± СТАНДАРТНАТА ГРЕШКА НА ПРОБАТА.

ФИГ. 7 ПОКАЗВА, ЧЕ ПРИ Mpl ЛИГАНДА И АРК9 ИМА НАЙ-ГОЛЯМ БРОЙ МЕГАКАРИОЦИТИ НА СЪД. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ IL-3 Е СЪЩО МЕГАКАРИЦИТНО РАЗВИТИЕ, ОСОБЕНО АКО ТОЙ Е В КОМБИНАЦИЯ С SCF. IL-6, IL-11 И ЕРО САМОСТОЯТЕЛНО ИЗПОЛЗВАНИ ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С IL-3 ИМАТ МАЛЪК ЕфЕКГ ВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТНИЯ БРОЙ. РМА. LIF И GM-CSF ИМАТ СЪЩО МАЛЪК ЕФЕКТ. НА ФИГ. 8 СА ДАДЕНИ ДАННИТЕ ОТ СЪЩИЯ ЕКСПЕРИМЕНТ ЗА ОБЩИЯ БРОЙ КЛРТКИ НА СЪД /“КЛЕТЪЧНОСТ АРК9 И Mpl ЛИГАНДА ИМАТ МАЛЪК ЕФЕКТ ВЪРХУ КЛЕТЪЧНОСТТА, ДОКАТО IL-3 И SCF ИМАТ УМЕРЕН ЕфЕКТ. SCF И IL-3 В КОМБИНАЦИЯ ИМАТ НАЙ-ГОЛЯМ ЕФЕКТ. ДАННИТЕ, ПОКАЗАНИ НА ФИГ. 7 И 8 БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ, ЗА ДА СЕ ИЗЧИСЛИ ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ЗА СЪД, КАКТО Е ПОКАЗАНО НА фИГ. 9. ВИЖДА СЕ, ЧЕ ФАКТОРЪТ, КОЙТО ДАВА НАЙ-ГОЛЯМ ПРОЦЕНТ МЕГАКАРИОЦИТИ НА КУЛТУРАЛЕН СЪД Е Mpl ЛИГАНДА, АКТИВНАТА СЪСТАВКА НА АРК9. ТОВА ПОКАЗВА СПЕЦИФИЧНОСТТА НА Mpl ЛИГАНДА СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТИТЕ.

-77ПРИМЕР 9

АКТИВНОСТТА НА Мр1 ЛИГАНДА ЗА СПОМАГАНЕ РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ НЕ Е ЗАВИСИМА ОТ IL-3.

Mpl ЛИГАНДА СТИМУЛИРА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ, КОГАТО Е ИЗПОЛЗВАН КАТО ДОБАВКА КЪМ КУЛТУРАЛНАТА СРЕДА, ОПИСАНА В ПРИМЕР 2. ВЪПРЕКИ, ЧЕ IL-3 НЕ Е СЪСТАВНА ЧАСТ НА СРЕДАТА ТОЙ МОЖЕ ДА ПРИСЪСТВА В ПРЕНЕБРЕЖИМО МАЛКИ КОЛИЧЕСТВА В НОРМАЛНАТА ЧОВЕШКА ПЛАЗМА, ПРИСЪСТВАЩА В СРЕДАТА. ДОРИ И ДА ПРИСЪСТВА ОБАЧЕ IL-3 НЕ Е ВКЛЮЧЕН В Mpl ЛИГАНД-ИНДУЦИРАНАТА МЕГАКАРИОЦИТОПОЕЗА. ТОВА Е ПОКАЗАНО НА фИГ. 10. ПРИ 2 ng/ml IL-3 СЪДЪРЖА АКТИНОСТ 14,900 МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ В АНАЛИЗА НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ. ТАЗИ АКТИВНОСТ СЕ ИНХИБИРА 97 % С AHTH-IL-3 /3.3 ug/ml, GENZYME,

CAMBRIDGE,МА/. ПРИ 8203 МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml Мр1 ЛИГАНДА НЕ СЕ ИНХИБИРА ОТ AHTH-IL-3.

ПРИМЕР 10

АНАЛИЗ НА СВИНСКИЯ Мр! ЛИГАНД

I . РЕЗЮМЕ

БЕЛТЪЦИ ОТ ОБЛЪЧЕНА СВИНСКА ПЛАЗМА С Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ БЯХА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ЧРЕЗ WGA АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ, Mpl РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ, ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ И С4 ОБРАТНОФАЗОВА HPLC. АКТИВНОСТТА БЕШЕ ХАРАКТЕРИЗИРАНА СЪЩО ЧРЕЗ ЕЛЮИРАНЕ ОТ ПАРЧЕТА НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ-СУЛфАТ-ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ.

ХРОМАТОГРАФИЯ WGA АфИНИТЕТНА КОЛОНА	КОМЕНТАР 4.4 х 106 единици внесени 3.4 х 106 единици подучени
	2.7 х 106
	единици внесени
Mpl КОЛОНА	2.4 х 106
	единици получени
	2.4 х 106
	единици внесени
MONO S ЙОНООБМЕННА КОЛОНА pH 6.0	4.4 х 106
	единици получени

ЕКСПЕРИМЕНТИ НА ЯСНО ОПРЕДЕЛЕНИ ДВЕ

ЕЛЮИРАНЕ ОТ ГЕЛ АКТИВНОСТИ, ЕДНАТА ПРИ

ПРИБЛИЗИТЕЛНО 18 kd, ДРУГАТА ПРИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 28 kd

ПРИМЕР 11

КЛОНИРАНЕ НА ЧОВЕШКИЯТ Mpl ЛИГАНД. ЧОВЕШКИ MGDF

СЛЕДВА ОПИСАНИЕ НА ДВА ПОДХОДА:

I, ПЪРВИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ПОДХОД ЗА КЛОНИРАНЕ

А, СЪЗДАВАНЕ НА ПРОБА ЧОВЕШКИ MGDF.

НА БАЗАТА НА АМИНО КРАЙНАТА СЕКВЕНЦИЯ НА КУЧЕШКИЯ ПРОТЕИН БЯХА

ПРОЕКТИРАНИ НЯКОЛКО PCR ЗАЧАТЪКА. ЗА НАМНОЖАВАНЕТО НА MGDF ГЕНА

-79ОТ ЧОВЕШКА ГЕНОМНА ДНК БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ИЗПОЛЗВАНИ РАЗЛИЧНИ ДВОЙКИ ЗАРОДИШИ. СЛЕД 40 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕТО НА СМИСЛЕНИТЕ ЗАЧАТЪЦИ 5’ GCN CCN GCN TGY GA 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 4/, КОДИРАЩИ ПЪРВИТЕ 5 АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ КУЧЕШКИЯ БЕЛТЪК /СЕКВЕНЦИЯ No 1/ И НЕСМИСЛЕНИЯ ЗАЧАТЪК 5’ GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 5/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ 12 - 21 НА СЕКВЕНЦИЯ No 1, PCR ПРОДУКТЪТ БЕШЕ ПОСТАВЕН В 2.0 % АГАРОЗЕН ГЕЛ В ТВЕ БУфЕР.

ИВИЦАТА 63 бд БЕШЕ ОТРЯЗАНА ОТ АГАРОЗНИЯ ГЕЛ И НАМНОЖЕНА ОТНОВО ЧРЕЗ СЪЩАТА ГРУПА ЗАРОДИШИ. PCR ПРОДУКТЪТ БЕШЕ КЛОНИРАН В PCR II ВЕКТОР /INVOTROGEN, SAN DIEGO/. ГРУПА КОЛОНИИ БЯХА ПРЕТЪРСЕНИ ЧРЕЗ ДНК СЕКВЕНИРАНЕ. ПЛАЗМИДНАТА ДНК, КОДИРАЩА БЕЛТЪК, ПОДОБЕН НА КУЧЕШКИЯ MGDF БЕЛТЪК, БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА КАТО ИЗТОЧНИК ЗА СЪЗДАВАНЕ НА РАДИОАКТИВНА ПРОБА ЗА ПРЕТЪРСВАНЕ НА ДНК БИБЛИОТЕКА. АМИНО КИСЕЛИННАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, КОДИРАНА ОТ ГЕННИЯ ФРАГМЕНТ Е СЛЕДНАТА: АЛА-ПРО-ПРО-АЛА-ЦИС-АСП-ЛЕВ-АРГ-ВАА-ЛЕВ-СЕР-ЛИЗ-ЛЕВЛЕВ-АРГ-АСП-СЕР-ХИС-ВАЛ-ЛЕВ-ХИС СЕКВЕНЦИЯ No 6/.

АГАРОЗНАТА ИВИЦА, СЪДЪРЖАЩА ЧОВЕШКИ MGDF БЕШЕ ИЗПОЗВАНА ЗА

СЪЗДАВАНЕ НА ПРОБА ЧРЕЗ ГОРЕЩА PCR. 100 μΙ ОТ ТИПИЧНАТА PCR РЕАКЦИЯ СЪДЪРЖАШЕ СЛЕДНИТЕ СЪСТАВКИ:

МАТРИЧНА ДНК	2 - 3 μΙ
5’ ЗАРОДИШ /СЕКВ. No 4/	1 μΙ, 20 рмола
3’ ЗАРОДИШ /СЕКВ. No 5/	1 μΙ, 20 рмола
10 X БУФЕР	10 μΙ
дАТф /0.1 тМ/	2μΙ
дТТф/10 тМ/	2μΙ
д ГТф /10 тМ/	2 μΙ

-80д ЦТф/0.1 mM/ 2μΙ

Д ЦТф, р 32 /10 uC/ul/ 5 μΙ д АТФ, р 32 /10 uC/ul/ 5 μΙ

Tag ДНК ПОЛИМЕРАЗА 0,5 μΙ, 2,5 ЕДИНИЦИ

ВОДА 77 μ|

ПЪЛЕН ОБЕМ 100 μΙ

УСЛОВИЯТА ЗА НАМНОЖАВАНТО БЯХА СЛЕДНИТЕ:

НАЧАЛНО ЗАГРЯВАНЕ 94 ⁰ С , 2 МИН.

ТЕМПЕРИРАНЕ 53 ⁰ С , 30 СЕК.

УДЪЛЖАВАНЕ 72 ⁰ С , 30 СЕК.

ДЕНАТУРАЦИЯ 94 ³ С , 30 СЕК.

БЯХА ПРОВЕДЕНИ 40 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ В PERKIN ELMER GENE AMP. SYSTEM 9600.

ПРОДУКТА БЕШЕ ПРЕЧИСТЕН ЧРЕЗ ПРОПУСКАНЕ ПРЕЗ НАПОРНА КОЛОНА /STRATAGENE, SAN DIEGO/. ПРОБА ОТ 1 μΙ БЕШЕ ПРЕБРОЕНА В СЦИНТИЛАЦИОНЕН БРОЯЧ. ПРОБИТЕ СЪДЪРЖАЩИ ОТ 1 ДО 3 МИЛИОНА ИМПУЛСА ЗА ml БЯХА ДОБАВЕНИ КЪМ ХИ5РИДИЗАЦИОННАТА СМЕС.

Б, СЪЗДАВАНЕ НА БИБЛИОТЕКА ОТ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ

ОТ ЛАБОРАТОРИИТЕ CLONTECH БЕШЕ ЗАКУПЕНА ЧОВЕШКА ЕМБРИОНАЛНА ЧЕРНОДРОБНА ПОЛИ А* РНК. ЗА СИНТЕЗАТА НА ДНК БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА ОКОЛО 4 μ9 РНК. КАТО ЗАРОДИШ БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН ПРОИЗВОЛЕН ОЛИГО ХЕКСАМЕР 5’ GTA CGC GTT СТА GAN ΝΝΝ ΝΝΤ 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 7/, СЪДЪРЖАЩ X Ьа I МЯСТО.

-81ЗА ИЗГРАЖДАНЕТО НА ДВОЙНОВЕРИЖНАТА ДНК БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН МЕТОДЪТ GIBCO-BRL. КЪМ ДВОЙНОВЕРИЖНАТА СДНК БЕШЕ ЛИГИРАН АДАПТОРЪТ Eco R l-Bst X I /INVITROGEN, SAN DIEGO/, СЛЕД КОЕТО ТЯ БЕШЕ НАРЯЗАНА С РЕСТРИКЦИОННИЯ ЕНЗИМ Xba I. РАЗПРЕДЕЛЕНИЕТО НА СДНК ПО РАЗМЕРИ БЕШЕ НАПРАВЕНО В S 500 SEPHACRYL КОЛОНА /LIFE TECHNOLOGIES, INC/. ФРАГМЕНТИТЕ кДНК ПО-ГОЛЕМИ ОТ 400 бд БЯХА ЛИГИРАНИ В ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР V19.8 /MARTIN, F., CELL 63: 203-211 (1990)/, КОЙТО ПРЕДВАРИТЕЛНО БЕШЕ СРЯЗАН С Eco I И Xba I. КОМПЕТЕНТНИ Е. coli DH 10 КЛЕТКИ БЯХА ТРАНСФОРМИРАНИ И ПОЛУЧЕНАТА СДНК БЕШЕ РАЗДЕЛЕНА НА 7 ЧАСТИ ОТ ПО 100,000 СДНК ВСЯКА.

В. СКРИНИНГ НА ПАМБДАБИБЛИОТЕКА

ОТ CLONTECH БЕШЕ ЗАКУПЕНА БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН БЪБРЕК В ЛАМБДА gt 11, С ТИТЪР 650 МИЛИОНА pfu/ml. С ПРОБИ ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗ PCR /ВИЖ ПО-ГОРЕ/ БЯХА ПРЕТЪРСЕНИ ОКОЛО 2 МИЛИОНА ПЛАКИ. ХИБРИДИЗАЦИЯТА БЕШЕ ПРОВЕДЕНА В GX SSC, 5 X DENHARDT, 0,1 % SDS, 100 pg/ml ЕДНОВЕРИЖНА ДНК ОТ СПЕРМА ОТ СЬОМГА ЗА 15 ЧАСА ПРИ 56 ° С.

БЯХА ПРОВЕДЕНИ МНОГОКРАТНИ ЦИКЛИ НА ПРЕТЪРСВАНЕ. ЗА УСТАНОВЯВАНЕ НА ВЕРНИТЕ СЕКВЕНЦИИ ДНК БЕШЕ НАМНОЖЕНА ОТ ЕДИНИЧНИ ПЛАКИ И БЕШЕ ХИБРИДИЗИРАНА СЪС ЗАЧАТЪКА 5’AGT ТТА CTG AGG ACT CGG AGG 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 8/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 7 ДО 13 В СЕКВЕНЦИЯ No 6.

Г, 3 ПРИМ БЪРЗОНАМНОЖАВАНЕ НА С.ДНК КРАИЩАТА /RACE/.

ОТ CLONTECH БЕШЕ ЗАКУПЕНА ПОЛИАДЕНИЛИРАНА РНК ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН БЪБРЕК И ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ. ЕДИН МИКРОГРАМ РНК БЕШЕ ОБРАТНО ПРЕЗАПИСАНА, КАТО ЗА ЗАРОДИШ БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН ОЛИГО 5’ ТТС GGC CGG АТА GGC СТТ ТТТ ТТТ ТТТ ТТТ 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 9/.

-82ЗА ИЗГРАЖДАНЕ НА ПЪРВАТА ВЕРИГА ДНК БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН GIBCO-BRL £ДНК СИНТЕЗИОНЕН КИТ /LIFE TECHNOLOGIES INC., CAT # 18267-013/. КРАЙНИЯТ ОБЕМ БЕШЕ 30 μΙ. РЕАКЦИЯТА БЕШЕ СПРЯНА ЧРЕЗ ДОБАВЯНЕ НА 500 mM EDTA ДО КРАЙНА КОНЦЕНТРАЦИЯ 10 тМ И ПОДДЪРЖАНА ПРИ - 20 ° С.

ЗА НАЧАЛНАТА PCR КАТО МАТРИЦА БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА 0.5 μΙ сДНК. ЗАРОДИШЪТ СЪС СЕКВЕНЦИЯ No 9 И КОНКУРИРАЩИЯТ ГО ОЛИГО 5’ ТТС GGC CGG АТА GGC СТТ ТТТ ТТТ ТТТ ТТ-Р 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 10/ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ КАТО БЕЗМИСЛЕНИ ЗАРОДИШИ, ДОКАТО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА 5’ TGC GAC СТС CGA GTC STS AG 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 11/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ ОТ 5 ДО 11 В СЕЛВЕНЦИЯ No 6 БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН КАТО СМИСЛЕН ЗАРОДИШ. БЯХА ПРОВЕДЕНИ 40 ЦИЛЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ ЧРЕЗ ПРЕМИНАВАНЕ ПРЕЗ СЛЕДНИТЕ ЕТАПИ: НАЧАЛНО ИНКУБИРАНЕ 2 МИН, ПРИ 94 ° С ; 94 ° С, 30 СЕК.; 65 ⁰ С, 30 СЕК.; 72 ⁰ С, 30 СЕК. ЗА НАМНОЖАВАНЕТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА СИСТЕМА PERKIN ELMER GENEAMP SYSTEM 9600.

ВГРАЖДАНЕТО БЕШЕ ПРОВЕДЕНО ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА СМИСЛЕНИЯ ЗАРОДИШ 5’ GAG TCC ТСА GTA AAC TGC ТТС GT 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 12/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 8 ДО 14 В СЕКВЕНЦИЯ No 6, А СЕКВЕНЦИЯ No 9 И СЕКВЕНЦИЯ No 10 СЛУЖЕХА КАТО БЕЗСМИСЛЕНИ ЗАРОДИШИ. БЯХА ПРОВЕДЕНИ 40 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ С ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 65 ⁰ С. PCR ПРОДУКТИТЕ БЯХА ПОСТАВЕНИ В 0.8 % АГАРОЗЕН ГЕЛ И СЛЕД ТОВА ЗАСНЕТИ С ПОД УВ СВЕТЛИНА. ПОЛУЧИХА СЕ ВИДИМИ ИВИЦИ ОТ 0.8 ДО 1.2 кб.

СЛЕД ТОВА PCR ПРОДУКТИТЕ БЯХА КЛОНИРАНИ ВЪВ ВЕКТОРА PCR II /INVITROGEN/. БЯХА ВЗЕТИ ЕДИНИЧНИ КОЛОНИИ И ПЛАЗМИДИТЕ БЯХА ИЗОЛИРАНИ С ПОМОЩТА НА QIAGEN КИТОВЕ CAT #12143 И 12145. ДВОЙНО ВЕРИЖНОТО СЕКВЕНИРАНЕ БЕШЕ НАПРАВЕНО С ПОМОЩТА НА ВЕКТОРНИТЕ ЗАРОДИШИ. СЕКВЕНЦИИТЕ БЯХА АНАЛИЗИРАНИ С РАЗЛИЧНИ ВИДОВЕ GCG СОФТУЕЪР.

-83Д. УДЪЛЖАВАНЕ НА 5’ И 3 ‘

ЗА ДА СЕ ИЗОЛИРА СЕКВЕНЦИЯ С ПЪЛНАТА ДЪЛЖИНА НА MGDF ГЕНА БЕШЕ ПРОВЕДЕНО УДЪЛЖАВАНЕ НА 3’ И 5’ ЗАРОДИШИТЕ, КАТО ЗА МАТРИЦА БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ РАЗЛИЧНИ ЧАСТИ ОТ БИБЛИОТЕКАТА НА ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ. КАТО МАТРИЦА ЗА НАМНОЖАВАНЕТО НА 5 ‘ ЗАРОДИША НА СДНК БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ОКОЛО 20 ng СДНК ОТ ВСЯКА ЧАСТ. БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ MGFD СПЕЦИФИЧЕН БЕЗСМИСЛЕН ЗАРОДИШ 5' GGA GTC ACG AAG CAG ТТТ АС 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 13/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 12 ДО 17 НА СЕКВЕНЦИЯ No 6 И СМИСЛЕН ЗАРОДИШ ОТ ВЕКТОР V19.8 5’ CCT ТТА СТТ СТА GGC CTG 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 14/. НАМНОЖАВАНЕТО БЕШЕ ИЗВЪРШЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА С ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 53 ° С. ВГРАЖДАНЕТО БЕШЕ ИЗВЪРШЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА С БЕЗСМИСЛЕНИЯ ЗАРОДИШ 5’ GAG GTC АСА AGC AGG AGG A 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 15/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 1 ДО 6 НА СЕКВЕНЦИЯ No 6 И ВЕКТОРНИЯ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 14.

ЗА УДЪЛЖАВАНЕТО НА 3’ КРАИЩАТА НА сДНК БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ БЕЗСМИСЛЕНИЯ ВЕКТОРЕН ЗАРОДИШ 5' GGC АТА GTC CGG GAC GTC G 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 16/ И MGDF СПЕЦИФИЧЕН ЗАРОДИШ 5’ ТСС ТСС TGC TTG TGA CCT С 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 17/ КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 1 ДО 6 В СЕКВЕНЦИЯ No 6. НАМНОЖАВАНЕТО БЕШЕ ПРОВЕДЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА С ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 58 ⁰ С .

ВГРАЖДАНЕТО БЕШЕ НАПРАВЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ MGDF ЗАРОДИША СЕКВЕНЦИЯ No 12 И ВЕКТОРНИЯ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 16. СПЕЦИФИЧНИ ИВИЦИ БЯХА ПОЛУЧЕНИ В ЧАСТИ НОМЕР 1, 7 И 8, КОИТО БЯХА КЛОНИРАНИ В PCR II ВЕКТОР. ПРЕЧИСТЕНАТА ПЛАЗМИДНА ДНК ОТ ЕДИНИЧНИ КОЛОНИИ БЕШЕ ПРЕЧИСТЕНА И СЕКВЕНИРАНА.

-84Е. ИЗОЛИРАНЕ НА ЧОВЕШКИ MGDF КЛОНОВЕ С ПЪЛНА ДЪЛЖИНА

В МНОГО ОТ КЛОНОВЕТЕ ЛИПСВАШЕ ЧАСТ ОТ АМИНО КРАЯ НА MGDF, ТЪЙ КАТО ЧАСТ ОТ MGDF СЕКВЕНЦИЯТА БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА ЗА ЗАРОДИШИ И ЗА ВГРАЖДАНЕ. ЗАРОДИШЪТ 5’ CCA GGA AGG ATT CAG GGG А 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 18/, ЧИЯТО СЕКВЕНЦИЯ БЕШЕ ПОЛУЧЕНА ОТ ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ НА 5’ ЗАРОДИШНО УДЪЛЖАВАНЕ. КАКТО Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ, БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН КАТО СМИСЛЕН ЗАРОДИШ. ВЕКТОРНИЯТ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 16 ПОСЛУЖИ КАТО БЕЗСМИСЛЕН ЗАРОДИШ. БЯХА ПРОВЕДЕНИ 35 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ С ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 58° С. MGDF СПЕЦИФИЧНИЯТ ЗАРОДИШ 5’ CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA CCA GAC ACC CCG 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 19/ С Sal I МЯСТО И ВЕКТОРНИЯ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 15 БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ВГРАЖДАНЕ ЗА 35 ЦИКЪЛА. PCR ПРОДУКТЪТ БЕШЕ КЛОНИРАН В PCR II ВЕКТОР И СЕКВЕНИРАН.

1ГВТОРШПР11МЕРЕНПОДХОДНАКЛОНИРАНЕ

А. КЛОНИРАНЕ НА КУЧЕШКА MGDF N-КРАЙНА сДНК

НА БАЗАТА НА КУЧЕШКАТА MGDF N-КРАЙНА АМИНО КИСЕЛИННА СЕКВЕНЦИЯ, ОПИСАНА В ПРЕДИШНИЯ РАЗДЕЛ БЯХА КОНСТРУИРАНИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНИ ЗАРОДИШИ, КОИТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ КАТО ЗАРОДИШИ В ПОЛИМЕРАЗНИ ВЕРИЖНИ РЕАКЦИИ /PCRs/ ЗА НАМНОЖАВАНЕ НА сДНК СЕКВЕНЦИИ, КОДИРАЩИ MGDF. ЦЯЛАТА РНК БЕШЕ ПРИГОТВЕНА ОТ ПРОБИ ОТ КУЧЕШКИ БЪБРЕК ЧРЕЗ ГУАНИДИН ИЗОТИОЦИАНАТЕН МЕТОД НА CHOMZYNSKI И SACCHI /ВЮСНЕМ. 162: 156-159 (1987)/. ПЪРВАТА ВЕРИГА ДНК БЕШЕ ПРИДОТВЕНА С ПРОИЗВОЛЕН ЗАРОДИШ-АДАПТОР 5’GGC CGG АТА GGC CAC TON NNN NNT 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 20/ ЧРЕЗ MoMULV ОБРАТНА ТРАНСКРИПТАЗА И БЕШЕ ИЗПОЗВАНА КАТО МАТРИЦА В СЛЕДВАЩИТЕ PCRs.

PCR БЕШЕ ПРОВЕДЕНА С 0.5 МИКРОЛИТРА, ОКОЛО 50 ng сДНК, КАТО БЕШЕ

-85ИЗПОЛЗВАН ЗАРОДИШ А 5’ GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 4/, СМИСЛЕН ВЕРИЖЕН ЗАРОДИШ КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-6 В СЕКВЕНЦИЯ No 1 И ЗАРОДИШ Б 5’ GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 5/ ИЛИ ЗАРОДИШ В 5’ GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 21/, КОИТО СА НЕСМИСЛЕНИ ВЕРИЖНИ ЗАРОДИШИ КОДИРАЩИ АМИНО КИСЕЛИНИ 16-21 НА СЕКВЕНЦИЯ No 1 С ТРИ ДОПЪЛНИТЕЛНИ НУКЛЕОТИДА НА 5’ КРАЯ ЗА ПОВИШАВАНЕ НА СТАБИЛНОСТТА КЪМ НАГРЯВАНЕ. БЕШЕ ПРОВЕДЕНА PCR С Tag ПОЛИМЕРАЗА ЗА 35 ДО 45 ЦИКЪЛА, ДОКАТО ИВИЦИТЕ НА ПРОДУКТА СТАНАХА ВИДИМИ В АГАРОЗНИЯ ГЕЛ НА ЕЛЕКТЕОфОРЕТИЧНОТО ИЗСЛЕДВАНЕ. ЗА ПЪРВИТЕ ДВА ЦИКЪЛА НА PCR ЕТАПА НА ТЕМПЕРИРАНЕ БЕШЕ ПРОВЕДЕН ПРИ 37° С ЗА 2 МИНУТИ.; ЗА ОСТАНАЛИТЕ ЦИКЛИ ТЕМПЕРИРАНЕТО БЕШЕ ПРИ 50° С ЗА 1 МИНУТА. ПРИ ВСЯКА РЕАКЦИЯ БЯХА ВИДИМИ МНОГОБРОЙНИ ИВИЦИ ПРОДУКТ. ЧАСТИТЕ ОТ ΓΕΛΑ, СЪДЪРЖАЩИ ИВИЦИ С ПРИБЛИЗИТЕЛНО ОЧАКВАНАТА ГОЛЕМИНА /66 бд/ БЯХА СЪБРАНИ С ТИП НА ПИПЕТА PASTEUR И ПОВТОРНО НАМНОЖЕНИ СЪС СЪЩАТА ДВОЙКА ЗАРОДИШИ. ДНК ПРОДУКТИТЕ БЯХА КЛОНИРАНИ ВЪВ ВЕКТОР PCR II /INVITORGEN/, СПОРЕД УКАЗАНИЯТА НА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ. ТРИ КЛОНА БЯХА СЕКВЕНИРАНИ И ЗА ТЯХ БЕШЕ УСТАНОВЕНО ЧЕ КОДИРАТ, В ЕДНА РАМКА НА ЧЕТЕНЕ, ОЧАКВАНАТА КУЧЕШКА MGDF СЕКВЕНЦИЯ, ОСТАТЪЦИ 1-21. ПО ТОЗИ НАЧИН БЕШЕ ПОЛУЧЕНА УНИКАЛНА КУЧЕШКА MGDF сДНК СЕКВЕНЦИЯ, ОБХВАЩАЩА УЧАСТЪКА ОТ ТРЕТИЯ НУКЛЕОТИД НА КОДОН 6 ДО ТРЕТИЯ НУКЛЕОТИД НА КОДОН 15. ЕДИН ОТ ТЕЗИ КЛОНОВЕ ПОСЛУЖИ КАТО МАТРИЦА ЗА ПРИГОТВЯНЕТО НА БЕЛЯЗАНА ПРОБА КУЧЕШКА MGDF СДНК.

Б. КОНСТРУИРАНЕ НА ^ДНК БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ.

РНК ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ /INTERNATIONAL INSTITUTE FOR THE ADVANCEMENT OF MEDICINE, EXTON, РА/ БЕШЕ ИЗОЛИРАНА ЧРЕЗ ЛИЗИРАНЕ НА ТЪКАН В 5.5 М ГУАНИДИН ТИОЦИАНАТ И БЕШЕ ПРЕЧИСТЕНА ЧРЕЗ

-86CsTFA /PHARMACIA/ ЦЕНТРОФУГИРАНЕ. ПОЛИАД EH НАПРАНАТА РНК БЕШЕ ОТБРАНА С ПОМОЩТА НА ОЛИГО /dT 25 DINABEADS /DYNAL, СПОРЕД УКАЗАНИЯТА НА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ/. ДВОЙНОВЕРИЖНАТА ДНК БЕШЕ ПРОИЗВЕДЕНА ОТ ТАЗИ РНК С ПОМОЩТА НА SUPERSCRIPT ПЛАЗМИДНА СИСТЕМА ЗА СИНТАЗ НА СДНК /LIFE TECHNOLOGIES, INC./ С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ИЗПОЛЗВАНИТЕ РАЗЛИЧНИ СВЪРЗВАЩИ АДАПТОРИ: 5’ TTG GTG TGC ACT TGT G 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 22/ И 5’ CAC AAG TGC АСА CCA ACC СС 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 23/. СЛЕД РАЗДЕЛЯНЕТО ПО ГОЛЕМИНА ТАЗИ кДНК БЕШЕ ДИРЕКТНО ВКЛЮЧЕНА В Bst XI И Not I НА ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР ПРИ БОАЙНИЦИТЕ рВСВ /рВСВ Е ПОЛУЧЕН ОТ ПЛАЗМИДА Rc/CMV, INVITROGEN, ВКЛЮЧВАЩ pud9 СКЕЛЕТ, CMV ПРОМОТОР И BGH МЯСТО ЗА ПОЛИАДЕНИЛИРАНЕ. ДНК БЕШЕ ЕЛЕКТОПОРИРАНА В ЕЛЕКРО КОМПЕТЕНТЕН БАКТЕРИАЛЕН ЩАМ 10Б /LIFE TECHNOLOGIES, INC./.

В. ПРЕТЪРСВАНЕ НА СДНК БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ФИЛТЪРНИТЕ ОТПЕЧАТЪЦИ НА БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ БЯХА ХИБРИДИЗИРАНИ С РАДИОАКТИВНО БЕЛЯЗАН С КУЧЕШКИ

MGDF N-КРАЕН кДНК PCR ПРОДУКТ /5х SSPE, 2 х DENHADT’S, 0.05 % Na ПИРОФОСФАТ, 0.5 % SDS, 100 pg/ml ЛИЗАТ ОТ ДРОЖДЕВА тРНК И 100 цд/т!

ДЕНАТУРИРАНА ДНК ОТ СПЕРМА ОТ СЬОМГА/ ПРИ 64° С ЗА 18 ЧАСА. ФИЛТРИТЕ БЯХА ПРОМИТИ ПРИ 64° С В 5х SSPE, 0.5 % SDS И ЕКСПОНИРАНИ ЗА ЕДНА НОЩ. БЯХА ИЗОЛИРАНИ И АНАЛИЗИРАНИ ДВА РАЗЛИЧНИ КЛОНА ХИБРИДИЗИРАЩИ С ТАЗИ ПРОБА.

ПРЕЧИСТЕНАТА ДНК ОТ MGDF сДНК КЛОНОВЕТЕ БЕШЕ ВНЕСЕНА В 293 EBNA

КЛЕТКИ /INVITORGEN/. 1.5 цд ДНК БЕШЕ СМЕСЕНА С 7.5 ul ЛИПОФЕКТАМИН

-87/LIFE TECHNOLOGIES, INC./ B 100 ul DMEM ЧИСТ ОТ СЕРУМ. СЛЕД 20 МИНУТНО ИНКУБИРАНЕ ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА СМЕСТА ДНК-ЛИПОфЕКТАМИН БЕШЕ ПРИБАВЕНА КЪМ 5 х 10 ⁵КЛЕТКИ/СЪД /24 КРЪГЛИ СЪДА GREINER/ В 400 ul DMEM, 1% СЕРУМ /ЕМБРИОНАЛЕН КЛОН II/ И ИНКУБИРАНИ ЗА 6 ЧАСА ПРИ 37° С. КЪМ КЛЕТКИТЕ БЕШЕ ДОБАВЕНО 500 ul DMEM 20 % СЕРУМ /ЕМБРИОНАЛЕН КЛОН II/. СЛЕД 16 ЧАСА СРЕДАТА БЕШЕ АСПИРИРАНА И БЕШЕ ДОБАВЕНО 500 ul DMEM, 1 % СЕРУМ /ЕМБРИОНАЛЕН КЛОН II/. СЛЕД 72 ЧАСА ПОЛУЧЕНИТЕ СРЕДИ БЯХА СЪБРАНИ И ЦЕНТРОФУГИРАНИ ПРЕЗ 0.22 МИКРНЕН ФИЛТЪР. ПОЛУЧЕНИТЕ СРЕДИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ЗА MGDF БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ.

Ill, ОПИСАНИЕ НА АКТИВНОСТТА НА ЧОВЕШКИТЕ MGDF КЛОНОВЕ

НА БАЗАТА НА ГОРЕОПИСАНИТЕ КЛОНИРАЩИ МЕТОДИ БЯХА ПОЛУЧЕНИ ЧОВЕШКИ кДНК КЛОНОВЕ, ПОКАЗАНИ НА ФИГ. 11 / MGDF-1 И MGDF-2; СЕКВ. No 24, 25 И 26, 27/ И ФИГ. 12 / MGDF-З; СЕКВ No 28 И 29/. ВСЯКА ОТ СЕКВЕНЦИИТЕ, ПОКАЗАНА НА ФИГУРИТЕ СЪДЪРЖА ПРЕДПОЛАГАЕМА СИГНАЛНА СЕКВЕНЦИЯ ОТ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-21, ТАКА ЧЕ ЗРЕЛИЯТ БЕЛТЪК ЗАПОЧВА ОТ АМИНО КИСЕЛИНА 22 ВЪВ ВСЕКИ ЕДИН ОТ СЛУЧАИТЕ.

РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА НА АКТИВНОСТТА ПРОВЕДЕНИ В КЛЕТЪЧНО БАЗИРАНИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ , ОПИСАНИ В ПРИМЕР 4А ПО-ГОРЕ С MGDF 1-3 СА ПРЕДСТАВЕНИ В ТАБЛИЦИ 3 И 4 ДОЛУ. ЗА ТАБЛИЦА 3 ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ОТ 293 EBNA КЛЕТКИ, ТРАНСфЕКТИРАНИ С ВСЕКИ КЛОН БЕШЕ СЪБРАНА СЛЕД 2 ДНИ В КУЛТУРА И СЛЕД ТОВА ТЕСТУВАНА В 1А6.1 КЛЕТКИ /32D/mur-MPL+/ +/-10 ug/ml mur-MPL-X. ЗА ТАБЛИЦА 4 ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ОТ 293 EBNA КЛЕТКИ, ТРАНСФЕКТИРАНИ С ВСЕКИ КЛОН БЕШЕ СЪБРАНА СЛЕД 4 ДНИ В КУЛТУРА И ТЕСТУВАНА В 32D/mur-MPL+ КЛЕТКИ /ПРИМЕР ЗА/ И 32D/hu-MPL+ КЛЕТКИ /ПРИМЕР ЗБ/. КАКТО СЕ ВИЖДА MGDF-1 И MGDF-2, НО НЕ И MGDF-З СА ПОКАЗАЛИ АКТИВНОСТ В КЛЕТЪЧНИТЕ ЛИНИИ, ЕКСПРЕСИРАЩИИ И ДВЕТЕ

-88ФОРМИ НА Mpl - МИШАТА И ЧОВЕШКАТА. КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ ЕКСПРЕСИРАЩА ЧОВЕШКИЯ MPL РЕЦЕПТОР Е ПО-ПОДДХОДЯЩА ЗА ЧОВЕШКИЯ MGDF-1 И MGDF2, ОТКОЛКОТО КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ, ЕКСПРЕСИРАЩА МИШИЯ Mpl РЕЦЕПТОР.

ТАБЛИЦА 3

	ЕДИНИЦИ/ml	ЕДИНИЦИ/ml
КЛОН	(- mur-MPL-X)	(+mur-MPLX)
СРЕДА	0	0
РВСО /КОНТРОЛЕН ПЛАЗМИД/	0	0
MGDF-1	12,800	800
MGDF-1 /ПОВТОРЕНО/	12,800	566
MGDF-2	4525	400
MGDF-2/ПОВТОРЕНО/	12800	1131
MGDF-3	0	0
MGDF-1 /ПОВТОРЕНО/	0	0
АРК9 КОНТРОЛА	4400 +/- 400	0
	ТАБЛИЦА 4
	ЕДИНИЦИ/ml	ЕДИНИЦИ/ml
КЛОН	32D/ mur-MPL+	32D/ hu-MPL+
MGDF-1	1600	25,600
MGDF-2	6400	50,000
MGDF-2 /ПОВТОРЕНО/	6400	50,000-100,000

СЛЕДВАЩАТА ТАБЛИЦА 5 ПОКАЗВА, ЧЕ АКТИВНОСТИТЕ НА ЧОВЕШКИТЕ MGDF-1 И MGDF-2 В КЛЕТКИ 32D/hu-MPL+ /ПРИМЕР ЗБ/ СА ПРАКТИЧЕКИ НАПЪЛНО ИНХИБИРАНИ ОТ РАЗТВОРИМИЯ ЧОВЕШКИ Mpl РЕЦЕПТОР (hu-MPL-X). Hu-MPLX ПРИСЪСТВАШЕ КАТО СРЕДА, СЪБРАНА ОТ СНО КЛЕТКИ, ПРОИЗВЕЖДАЩИ БЕЛТЪКА. СНО hu-MPL-X СРЕДАТА БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАНА 120 ПЪТИ И

-89ДОБАВЕНА КЪМ КУЛТУРАТА В 6.6 %. СРЕДАТА ОТ КОНТРОЛНИ СНО КУЛТУРИ НЕ ПОКАЗА ЕФЕКТ ПРИ ИЗСЛЕДВАНИЯТА. ИЗСЛЕДВАНИЯТА БЯХА ПРОВЕДЕНИ КАКТО Е ОПИСАНО В ПРИМЕР 45. С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ТОВА, ЧЕ ЖИЗНЕСПОСОБНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА ОЦЕНЕНИ СЛЕД 3 ДНИ.

ТАБЛИЦА 5

КЛОН

MGDF-1

ЕДИНИЦИ/ml (- Hu-MPL-X)

570

ЕДИНИЦИ/ml (+Hu -MPL-X)

MGDF-2

270

ИЗСЛЕДВАНИЯ НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ

MGDF-1 И MGDF-2, НО НЕ И MGDF-З ИНДУЦИРАХА ФОРМИРАНЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИ ОТ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ CD-34-ИЗБРАНИ КЛЕТКИ. ЕКСПЕРИМЕНТА, ОПИСАН В ТАБЛИЦА 6 БЕШЕ ПРОВЕДЕН ОСНОВНО КАКТО Е ОПИСАНО В ПРИМЕР 2 С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ТОВА, ЧЕ ПЕРИФЕРНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ БЯХА СО34-ИЗБРАНИ БЕЗ ПРОМИВАНЕ И КУЛТУРАТА БЕШЕ СЪБРАНА СЛЕД 7 ДНИ. ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ОТ ВСЕКИ 293 EBNA MGDF БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА В КРАЕН ОБЕМ ОТ 20 % - - 30 ug/ml mur-MPL-X. АРК9 КОНТОЛА БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА В 6% КРАЕН ОБЕМ.

-90ТАБЛИЦА 6

	МЕГАКАРИОЦИТИ	МЕГАКАРИОЦИТИ
КЛОН	ЗА СЪД (-mur-MPL-X)	ЗА СЪД (+mur-MPL-X)
ВЕКТОРНА КОНТРОЛА	0	0
АРК9 КОНТРОЛА	100 +/-3	0
MGDF-1	142 +/- 48	17+/-2
MGDF-2	100 +/-3	6+/-2
MGDF-1 ПОВТОРЕНО	86 +/-10	0
MGDF-3	2+/-2	0

ПРИМЕР 12

СЛЕДВАЩИЯТ ПРИМЕР ОПИСВА СИНТЕЗАТА НА 12 РАЗЛИЧНИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF МОЛЕКУЛИ, PEG 9 - PEG 12 И PEG 14 - PEG 21. ВЪВ ВСЕКИ ОТ СЛУЧАИТЕ MGDF МОЛЕКУЛАТА БЕШЕ ПРОИЗВЕДЕНА В Е. coli MGDF-11 (АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184, АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД ИЛИ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-163, АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА ЗРЕЛИЯ БЕЛТЪК). ПОДРОБНОСТИТЕ ЗА ВСИЧКИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ВИДОВЕ СА ОБОЩЕНИ В ТАБЛИЦИ 7-10 ДОЛУ.

12.1. ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF КОНЮГАТИ ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ НА MGDF С АКТИВИРАНИ Me-PEG ПРОИЗВОДНИ.

ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ- MePEG(20 kDa)-MGDF КОНЮГАТ (PEG111.

ОХЛАДЕН /4° С/ РАЗТВОР НА MGDF /2.5 mg/ml/ В 0.1 М BICINE БУФЕР, pH 8, БЕШЕ

-91ПРИБАВЕН КЪМ 10-ПЪТИ МОААРЕН ИЗЛИШЪК ОТ ТВЪРД MePEG СУКЦИНИМИДИЛ ПРОПИОНАТ /МТ 20 kDa/ /SHEARWATER POLYMERS, INC./. ПОЛИМЕРЪТ БЕШЕ РАЗТВОРЕН ЧРЕЗ ВНИМАТРЛНО РАЗБЪРКВАНЕ, СЛЕД КОЕТО РЕАКЦИЯТА ПРОДЪЛЖИ ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА.

НИВОТО НА МОДИФИКАЦИЯ НА БЕЛТЪКА В ХОДА НА РЕАКЦИЯТА БЕШЕ ПРОСЛЕДЕНО ЧРЕЗ SEC HPLC, С SUPERDEX 200 HR 10/30 КОЛОНА /PHARMACIA ВЮТЕСН/, ЕЛЮИРАНА С 0.1 М НАТРИЕВО ФОСФАТЕН БУфЕР pH 6.9 ПРИ 0.7 ml/ ΐνμΗ

SEC HPLC АНАЛИЗИТЕ HA РЕАКЦИОННАТА СМЕС В 30 МИНУТА ПОКАЗАХА, ЧЕ В РЕАКЦИОННАТА СМЕС НЕ Е ОСТАНАЛ СВОБОДЕН БЕЛТЪК. В ТАЗИ ТОЧКА ОТ ВРЕМЕТО КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА БЕЛТЪКА В РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ НАМАЛЕНА ДО 1 mg/ml ЧРЕЗ ПРИБАВЯНЕ НА СТЕРИЛНА ВОДА И pH БЕШ~ ДОВЕДЕНО ДО 4 С НЯКОЛКО КАПКИ 0.5 М ОЦЕТНА КИСЕЛИНА.

MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ОТДЕЛЕН ОТ ИЗЛИШЪКА ОТ MePEG И ДРУГИТЕ СТРАНИЧНИ РЕАКЦИОННИ ПРОДУКТИ ЧРЕЗ ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ЗА КОЯТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА SP SEPHAROSE /PHARMACIA ВЮТЕСН/ ЙОНООБМЕННА СМОЛА.

РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ПОСТАВЕНА В КОЛОНАТА /2.5 mg/ml СМОЛА/ И НЕРЕАГИРАЛИТЕ MePEG БЯХА ЕЛЮИРАНИ С ТРИ ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ НАЧАЛНИЯ БУФЕР А /20 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2, 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. СЛЕД ТОВА MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0 % ДО 30 % В 10 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ КРАЙНИЯТ БУфЕР БДМ NaCI В БУфЕР А/. ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 nm. ФРАКЦИИТЕ СЪДЪРЖАЩИ MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЯХА СЪБРАНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И СТЕРИЛНО ФИЛТРИРАНИ.

-92ПРЕЧИСТЕНИЯТ ПОЛИ- MePEG-MGDF КОНЮГАТ БЕШЕ АНАЛИЗИРАН ЧРЕЗ HPLC SEK, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ TSK-GEL G40000SWXL И G2000SWXL ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИ КОЛОНИ, СВЪРЗАНИ В СЕРИИ. БЕЛТЪЦИТЕ БЯХА ОТКРИТИ ЧРЕЗ UV АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 nm. КАТО МАРКЕРИ ЗА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ BIO-RAD ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИ СТАНДАРТИ.

КАКТО СЕ ВИЖДА НА ФИГ. 17 A HPLC SEC ПОКАЗВА ДВА ОСНОВНИ КОМПОНЕНТА /В СЪОТНОШЕНИЕ ОКОЛО 2 КЪМ 1/, ЕЛУАЦИОННИТЕ ПОЗИЦИИ НА КОИТО ОТГОВАРЯТ СЪОТВЕТНО НА 370.9 kDa И 155.0 kDa ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ. ВИЖ СЪЩО ТАБЛИЦА 8 ДОЛУ.

КОНЮГАТИТЕ PEG 9, PEG 10 И PEG 12 ПРИГОТВЕНИ ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ НА MGDF СЪС СУКЦИНИМИДИЛОВИ ЕСТЕРИ НА MePEG С МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА =6 - 50 kDa БЯХА ПОЛУЧЕНИ ПО СЪШИЯ НАЧИН. ОСНОВНИТЕ ПАРАМЕТРИ НА РЕАКЦИЯТА СА ОБОБЩЕНИ В ТАБЛИЦА 7.

РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ HPLC SEC АНАЛИЗИТЕ НА ТЕЗИ КОНЮГАТИ СА ПОКАЗАНИ В ТАБЛИЦА 8.

12.2. ПРИГОТВЯНЕ-_HA__nOAH--MePEG-MGDF КОНЮГАТИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С АКТИВИРАНИ Me-PEG АЛДЕХИДИ

ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ- MePEG(20 kDa)-MGDF КОНЮГАТ (PEG 20).

КЪМ ОХЛАДЕН /4° С/, РАЗБЪРКАН РАЗТВОР НА MGDF /2 mg/ml/ В 100 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 5, СЪДЪРЖАЩ 20 тМ NaCNBH₃ БЕШЕ ПРИБАВЕН 10-ПЪТИ МОЛАРЕН ИЗЛИШЪК ОТ МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВ АЛДЕХИД /MePEG/ /ПРИБЛИЗИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО 20 kDa/ И РАЗБЪРКВАНЕТО НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС ПРОДЪЛЖИ ПРИ СЪЩАТА ТЕМПЕРАТУРА.

-93НИВОТО НА МОДИФИКАЦИЯ НА БЕЛТЪКА В ХОДА НА РЕАКЦИЯТА БЕШЕ ПРОСЛЕДЕНО ЧРЕЗ SEC HPLC, С SUPERDEX 200 HR 10/30 КОЛОНА /PHARMACIA BIOTECH/. ЕЛЮИРАНА C 0.1 M НАТРИЕВО ФОСФАТЕН БУфЕР pH 6.9 ПРИ 0.7 ml/ΠΜΠ

СЛЕД 16 ЧАСА SEC HPLC АНАЛИЗИТЕ ПОКАЗАХА, ЧЕ ПОВЕЧЕ ОТ 90 % ОТ НАЧАЛНОТО КОЛИЧЕСТВО БЕЛТЪК Е МОДИФИЦИРАНО. В ТОЗИ МОМЕНТ КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА БЕЛТЪКА В РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ДОВЕДЕНА ДО 1 mg/ml. ЧРЕЗ РАЗРЕЖДАНЕ НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС СЪС СТЕРИЛНА ВОДА И pH БЕШЕ ДОВЕДЕНО ДО 4 /0.5 М ОЦЕТНА КИСЕЛИНА/.

MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ОТДЕЛЕН ОТ ИЗЛИШЪКА ОТ MePEG И ДРУГИТЕ СТРАНИЧНИ РЕАКЦИОННИ ПРОДУКТИ С ПОМОЩТА НА ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ЗА КОЯТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА SP SEPHAROSE /PHARMACIA BIOTECH/ ЙОНООБМЕННА СМОЛА.

РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ПОСТАВЕНА В КОЛОНАТА /2.5 mg/ml СМОЛА/ И НЕРЕАГИРАЛИТЕ MePEG БЯХА ЕЛЮИРАНИ С ТРИ ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ НАЧАЛНИЯ БУФЕР А /20 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2, 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. СЛЕД ТОВА MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0 % ДО 30 % С 10 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ КРАЙНИЯТ БУфЕР Б /1 М NaCI В БУФЕР А/. ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 пт. ФРАКЦИИТЕ СЪДЪРЖАЩИ MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЯХА СЪБРАНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И СТЕРИЛНО ФИЛТРИРАНИ.

ПРЕЧИСТЕНИЯТ ПОЛИ- MePEG-MGDF КОНЮГАТ БЕШЕ АНАЛИЗИРАН ЧРЕЗ HPLC SEK, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ TSK-GEL G40000SWXL И G2000SWXL ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИ КОЛОНИ, СВЪРЗАНИ В СЕРИИ. БЕЛТЪЦИТЕ БЯХА ОТКРИТИ ЧРЕЗ UV АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 пт. КАТО МАРКЕРИ ЗА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ BIO-RAD ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИ СТАНДАРТИ.

-94ΚΑΚΤΟ СЕ ВИЖДА НА ФИГ. 17В HPLC SEC ПОКАЗВА ДВА ОСНОВНИ КОМПОНЕНТА /ПРЕДСТАВЛЯВАЩИ 52 % И 47 % ОТ ПЪЛНИЯ ОБЕМ/,

ЕЛУАЦИОННИТЕ ПОЗИЦИИ НА КОИТО ОТГОВАРЯТ СЪОТВЕТНО НА 359.4 kDa И 159.3 kDa ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ. ВИЖ СЪЩО ТАБЛИЦА 8.

КОНЮГАТИТЕ PEG 18, PEG 19 И PEG 21, ПРИГОТВЕНИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С MePEG АЛДЕХИДИ С МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА =6-25 kDa БЯХА ПОЛУЧЕНИ ПО СЪШИЯ НАЧИН. ОСНОВНИТЕ ПАРАМЕТРИ НА РЕАКЦИЯТА СА ОБОБЩЕНИ В ТАБЛИЦА 7.

РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ HPLC SEC АНАЛИЗИТЕ НА ТЕЗИ КОНЮГАТИ СА ПОКАЗАНИ В ТАБЛИЦА 8.

12.3, ПРИГОТВЯНЕ НА МОНОМЕТОКСИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ-MGDF КОНЮГАТИ С МЯСТО НА СВЪРЗВАНЕ В N-КРАЙНАТА α-АМИНО ГРУПА.

ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ- MePEG(20 kDa)-MGDF КОНЮГАТ (PEG 20).

КЪМ ОХЛАДЕН /4° С/, РАЗБЪРКАН РАЗТВОР НА MGDF / 2 ml, 2.5 mg/ml/ В 100 mM НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 5, СЪДЪРЖАЩ 20 mM NaCNBH₃ БЕШЕ ПРИБАВЕН 5-ПЪТИ МОЛАРЕН ИЗЛИШЪК ОТ МЕТОКСИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ АЛДЕХИД /MePEG/ /ПРИБЛИЗИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО 20 kDa/ И РАЗБЪРКВАНЕТО НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС ПРОДЪЛЖИ ПРИ СЪЩАТА ТЕМПЕРАТУРА.

НИВОТО НА МОДИФИКАЦИЯ НА БЕЛТЪКА В ХОДА НА РЕАКЦИЯТА БЕШЕ ПРОСЛЕДЕНО ЧРЕЗ SEC HPLC, С SUPERDEX 200 HR 10/30 КОЛОНА /PHARMACIA BIOTECH/, ЕЛЮИРАНА C 0.1 M НАТРИЕВО ФОСФАТЕН БУфЕР pH 6.9 ПРИ 0.7 ml/ m ί η

-95СЛЕД 16 ЧАСА SEC HPLC АНАЛИЗИТЕ ПОКАЗАХА, ЧЕ ОКОЛО 90 % ОТ НАЧАЛНОТО КОЛИЧЕСТВО БЕЛТЪК Е МОДИФИЦИРАНО. В ТОЗИ МОМЕНТ КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА БЕЛТЪКА В РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ДОВЕДЕНА ДО 1 mg/ml ЧРЕЗ РАЗРЕЖДАНЕ НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС СЪС СТЕРИЛНА ВОДА И pH НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ДОВЕДЕНО ДО 4 /0.5 М ОЦЕТНА КИСЕЛИНА/.

MOHO-MePEG(20 kDa) MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ОТДЕЛЕН ОТ ИЗЛИШЪКА ОТ MePEG И ДРУГИТЕ СТРАНИЧНИ РЕАКЦИОННИ ПРОДУКТИ ЧРЕЗ ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ, ЗА КОЯТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА SP SEPHAROSE /PHARMACIA BIOTECH/ ЙОНООБМЕННА СМОЛА.

РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ПОСТАВЕНА В КОЛОНАТА /2.5 mg/ml СМОЛА/ И НЕРЕАГИРАЛИТЕ MePEG БЯХА ЕЛЮИРАНИ С ТРИ ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ НАЧАЛНИЯ БУФЕР А /20 mM НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2, 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. СЛЕД ТОВА MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0 % ДО 25 % С 20 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ КРАЙНИЯТ БУФЕР Б /1 М NaCl В БУфЕР А/. ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 пт. ФРАКЦИИТЕ СЪДЪРЖАЩИ ПОЛИMePEG-MGDF КОНЮГАТА БЯХА СЪБРАНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И СТЕРИЛНО ФИЛТРИРАНИ.

ХОМОГЕННОСТТА НА МОНО- MePEG-MGDF КОНЮГАТИТЕ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕНА ЧРЕЗ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА В НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ 4-20 % ПРЕДВАРИТЕЛНО ИЗЛЯТИ ГРАДИЕНТНИ ГЕЛОВЕ /NOVEX/. БЕШЕ ОТКРИТА ЕДНА ОСНОВНА ИВИЦА, СЪОТВЕТСТВАЩА НА ПОЗИЦИЯТА НА 46,9 kDa БЕЛТЪКА.

ПРЕЧИСТЕНИЯТ ПОЛИ-MePEG-MGDF КОНЮГАТ БЕШЕ АНАЛИЗИРАН ЧРЕЗ HPLC SEK, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ TSK-GEL G40000SWXL И G2000SWXL ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИ КОЛОНИ, СВЪРЗАНИ В СЕРИИ. БЕЛТЪЦИТЕ БЯХА ОТКРИТИ ЧРЕЗ UV АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 пт. КАТО МАРКЕРИ ЗА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА

-96ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ BIO-RAD ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИ СТАНДАРТИ.

КАКТО СЕ ВИЖДА НА ФИГ. 17С HPLC SEC ПОКАЗВА ЕДИН ОСНОВЕН КОМПОНЕНТ, ЕЛУАЦИОННИТЕ ПОЗИЦИИ НА КОИТО ОТГОВАРЯТ НА 181.1 kDa НА ГЛОБУЛАРНИЯ БЕЛТЪК. ВИЖ СЪЩО ТАБЛИЦА 9.

MOHO-MePEG-MGDF КОНЮГАТИТЕ PEG 14. PEG 15 И PEG 17 ПРИГОТВЕНИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С MePEG АЛДЕХИДИ С МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА =6 - 25 kDa БЯХА ПОЛУЧЕНИ ПО СЪШИЯ НАЧИН. ОСНОВНИТЕ ПАРАМЕТРИ НА РЕАКЦИЯТА СА ОБОБЩЕНИ В ТАБЛИЦА 7.

РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ HPLC SEC АНАЛИЗИТЕ НА ТЕЗИ КОНЮГАТИ СА ПОКАЗАНИ В ТАБЛИЦА 9.

-97ТАБЛИЦА 7

ОБОБЩЕНИЕ НА ПАРАМЕТРИТЕ НА MGDF МОДИФИЦИРАЩИТЕ РЕАКЦИИ

код	РЕАКТИВ	MePEG	РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ
	ВИД	МТ	MGDF концентр. mg/ml	pH	Температура °C	Време часа	Моларно съотношение MePEG/MGDF
PEG 9	NHS естер	6 KDa	2.5	8	C.T.	0.5	15
PEG 10	NHS естер	6 KDa	2.5	8	C.T.	0.5	10
PEG 11	NHS естер	20 KDa	2.5	8	C.T.	0.5	10
PEG 12	NHS	50 KDa	2.5	8	C.T.	0.5	5
	естер
PEG 14	АЛДЕ- ХИД	6 KDa	2.5	5	4° C	16	5
PEG 15	АЛДЕ- ХИД	12 KDa	2.5	5	4° C	16	5
PEG 16	АЛДЕ- ХИД	20 KDa	2.5	5	4° C	16	5
PEG 17	АЛДЕ- ХИД	25 KDa	2.5	5	4° C	16	10
PEG 18	АЛДЕ- ХИД	6 KDa	5	5	4° C	16	10
PEG 19	АЛДЕ- ХИД	12 KDa	5	5	4° C	16	10
PEG 20 АЛДЕ- ХИД	20 KDa	5	5	4° C	16	10
PEG 21 АЛДЕ-	25 KDa	5	5	4° C	16	10

ХИД

-98ТАБЛИЦА 8

ОБОБЩЕНИЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF ХАРАКТЕРИСТИКИТЕ ЧРЕЗ SEC HPLC

КОД РЕАКТИВ	MePEG	MT УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ SEC ,kDa	MT УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ SDS PAGE , kDa
	ВИД	мт
PEG 14	АЛДЕ- ХИД	6 KDa	44.5	27.7
PEG 15	АЛДЕ- ХИД	12 KDa	104.7	38.3
PEG 16	АЛДЕ- ХИД	20 KDa	181.1	46.9
PEG 17	АЛДЕ- ХИД	25 KDa	226.4	55.5

ТАБЛИЦА 8

ОБОБЩЕНИЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF ХАРАКТЕРИСТИКИТЕ ЧРЕЗ SEC HPLC

КОД РЕАКТИВ	MePEG	MT УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ SEC , kDa	MT УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ SDS PAGE , kDa
	вид	MT
PEG 14	АЛДЕ- ХИД	6 KDa	44.5	27.7
PEG 15	АЛДЕ- ХИД	12 KDa	104.7	38.3
PEG 16	АЛДЕ- ХИД	20 KDa	181.1	46.9
PEG 17	АЛДЕ- ХИД	25 KDa	226.4	55.5

12.4. ПРИГОТВЯНЕ НА DiMePEG (12 kDa)- MGDF КОНЮГАТИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С МЕТОКСИ ПОЛИ (ЕТИЛЕН ГЛИКОЛ) АЛДЕХИД (PEG 22).

В РЕЗУЛТАТ НА СЛЕДВАЩИТЕ ПРОЦЕДУРИ БЕШЕ ПОЛУЧЕНА ПРЕЧИСТЕНА МОЛЕКУЛА, НАРЕЧЕНА ТУК PEG 22.

5-ПЪТИ ИЗЛИШЪК НА МЕТОКСИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВ АЛДЕХИД /MePEG; Т.Е. ОНС-(СН₂)₂О-(СН₂-СН₂О)п-СН₃; КЪДЕТО п=ПОВТОРЕНИЕ, ТАКОВА, ЧЕ МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО Е 12 kDa) (SHEARWATER POLYMERS), БЕШЕ ДОБАВЕН КЪМ 2.5 mg/ml РАЗТВОР НА MGDF /ПОЛУЧЕН В Е. coli, 1-163) В 100 mM НАТРИЕВ АЦЕТАТ, pH 5.0, ПРИ 5° С. СЛЕД СМЕСВАНЕ ЗА 10 ПЪП БЕШЕ ДОБАВЕНО ДОСТАТЪЧНО КОЛИЧЕСТВО НАТРИЕВ ЦИАНОБОРОХИДРИД /ALDRICH/, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ДОСТИГНЕ 20 тМ КОНЦЕНТРАЦИЯ В РЕАКЦИОННАТА СМЕС.

СМЕСТТА БЕШЕ РАЗБЪРКВАНА 16 ЧАСА ПРИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 5 ° С. СЛЕД ТОВА БЕШЕ ДОБАВЕНО ДОСТАТЪЧНО КОЛИЧЕСТВО ПРЕЧИСТЕНА ВОДА, ЗА ДА СЕ

ДОВЕДЕ КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА MGDF ДО 1 mg/ml. ТАКА ПОЛУЧЕНАТА СМЕС БЕШЕ ФИЛТРИРАНА ПРЕЗ 0.2 МИКРОНЕН ВАКУУМЕН ФИЛТЪР. ПО ТОЗИ НАЧИН БЯХА ПРИГОТВЕНИ 90 mg ОТ РЕАКЦИОННИЯ ПРОДУКТ. КЪМ СМЕСТТА НА РЕАКЦИОННИЯ ПРОДУКТ БЯХА ДОБАВЕНИ МАЛКИ КОЛИЧЕСТВА ОТ РАЗТВОРИ НА 1.0 М ЕДНООСНОВЕН ФОСФАТ И 1N НАТРИЕВ ХИДРООКИС, ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИ РАЗТВОР НА 10 mM ФОСФАТ, pH 6.8.

КОНЮГАТИТЕ БЯХА ПРЕЧИСТЕНИ В КАТИОН ОБМЕННА КОЛОНА. БЕШЕ ПРИГОТВЕНА 40 ml SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE КОЛОНА С ВИСОЧИНА 7.5 СМ. КОЛОНАТА БЕШЕ КАЛИБРИРАНА С КАЛИБРИРАЩ БУфЕР /10 mM ФОСФАТ, pH 6.8, С 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. В КОЛОНАТА БЕШЕ ПУСНАТА 2.2 mg/ml СМОЛА ПРИ 0.15 ОБЕМА НА КОЛОНАТА /CV/ ЗА МИН. ТОВА БЕШЕ ПОСЛЕДВАНО ОТ ПРОМИВАНЕ С КАЛИБРИРАЩИЯТ БУФЕР ДОКАТО БЕШЕ ПОЛУЧЕНА БАЗОВА ЛИНИЯ. КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛУИРАНА С 10 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ БУфЕР А /20 mM ФОСФАТ, pH 7.2 С 15 % ГЛИЦЕРОЛ/ ДО БУфЕР Б /БУфЕР А ПЛЮС 0.3 М NaHI/

-10ОБЕШЕ ПОДДЪРЖАНА СКОРОСТ НА ПОТОКА ОТ 0,12 CV ЗА МИНУТА. ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 nm.

ФРАКЦИИТЕ БЯХА ПУСНАТИ В SDS-PAGE ГЕЛОВЕ И ТЕЗИ, КОИТО СЪДЪРЖАХА DiPEG КОНЮГАТИТЕ БЯХА СЪБРАНИ И ФИЛТРИРАНИ ПРЕЗ 0.2 МИКРОНЕН ФИЛТЪР.

ПРИМЕР 13

БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИТЕ MGDF МОЛЕКУЛИ

A. PEG-9 - PEG12 И PEG-14- PEG-21

БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ОТ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ С РЕКОМБИНАНТЕН ЧОВЕШКИ MGDF И РЕЗУЛТАТИТЕ БЯХА ПРЕДСТАВЕНИ НА ФИГ. 18. MGDF ПОЛУЧЕН В СНО 22 -353 /НЕЗАПЪЛНЕНИ РОМБОИДИ/, НЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН, ПОЛУЧЕН В Е. coli 22-184 /НЕЗАПЪЛНЕНИ КРЪГОВЕ/ И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН, ПОЛУЧЕН В Е. coli 22-184 /ЗАПЪЛНЕНИ КРЪГОВЕ/ В КОНЦЕНТРАЦИИ ПОСОЧЕНИ В ОПИСАНИЕТО НА ФИГУРИТЕ ПО-ГОРЕ, БЕШЕ ИНЖЕКТИРАН ПОДКОЖНО В НОРМАЛНИ МИШКИ Balb/C ВЕДНЪЖ НА ДЕН, В ПРОДЪЛЖЕНИЕ НА 5 ДНИ. 24 ЧАСА СЛЕД ПОСЛЕДНАТА ИНЖЕКЦИЯ БЯХА СЪБРАНИ ПРОБИ КРЪВ ОТ МАЛЪК НАПРЕЧЕН СРЕЗ НА ОПАШНАТА ВЕНА. АНАЛИЗИТЕ НА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА ПРОВЕДЕНИ С ЕЛЕКТРОНЕН АНАЛИЗАТОР НА КРЪВНИ КЛЕТКИ SYSMEX /BAXTER DIAGNOSTICS, INC. IRVINE,СА/. ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИ, КАТО СРЕДНА СТОЙНОСТ ОТ 4 ЖИВОТНИ +/- СТАНДАРТНАТА ГРЕШКА НА МЕТОДА. ДРУГИТЕ ПАРАМЕТРИ НА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ КАТО ОБЩ БРОЙ НА БЕЛИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ ИЛИ БРОЙ НА ЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ НЕ БЯХА ЗАСЕГНАТИ ОТ ТОВА ВЪЗДЕЙСТВИЕ.

ДОПЪЛНИТЕЛНИ ФОРМИ НА РЕКОМБИНАНТЕН ЧОВЕШКИ MGDF БЯХА

-101ТЕСТУВАНИ, ПО НАЧИНА ПОСОЧЕН ПО-ГОРЕ. НА ФИГ 10 Е ПОКАЗАН БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ОТ МИШКА, ТРЕТИРАНА ИЛИ С 50 ug/КГ./ДЕН, ИЛИ С 10 ug/КГ./ДЕН, ОТ ПОСОЧЕНАТА ФОРМА r-HuMGDF. ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИ КАТО СРЕДНА СТОЙНОСТ ОТ 4 ЖИВОТНИ И СТАНДАРНИТЕ ГРЕШКИ СА ПОДЧЕРТАНИ.

ТАБЛИЦА 10

	50 ug/ КГ/ДЕН	10 ug/ КГ/ДЕН
ФОРМА	Средна стойност n=4	стандартна грешка на метода	Средна стойност п=4	стандартна грешка на метода
СНО 22-353	4343	309	2571	80
Е. coli 22-184	2021	29	1439	18
PEG 9	2728	56	2369	34
PEG 10	2431	291	1556	126
PEG 11	3778	59	1861	73
PEG 12	3885	156	1740	88
PEG 14	3567	80	2020	63
PEG 15	4402	57	2843	99
PEG 16	4511	239	3215	11
PEG 17	4140	188	3113	261
PEG 18	4586	59	2931	129
PEG 19	3980	330	4189	80
PEG 20	3942	285	3054	339
PEG 21	4195	145	4002	91

БАЗОВА ЛИНИЯ

939

25

ОБЯСНЕНИЕ КЪМ ТАБЛИЦА 10

ВЪВ ВСЕКИ ОТ СЛЕДВАЩИТЕ СЛУЧАИ MGDF МОЛЕКУЛАТА, КОЯТО Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНА Е Е. coli MGDF-11 /АМИНО КИСЕЛИНИ 22- 184, АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД ИЛИ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-163, АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА ЗРЕЛИЯ БЕЛТЪК/, КАКТО Е ОПИСАНО В ПРИМЕР 12 ГОРЕ:

-102-

ИМЕ	ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ	СРЕДНО МТ НА PEG	РЕАКТИВНА PEG МОЛЕКУЛА ЗА СИНТЕЗА
PEG 9	полиполиетилен	6 kDa	NHS естер на MePEG
PEG 10	гликолиран полиполиетилен	6 kDa	NHS естер на MePEG
PEG 11	гликолиран полиполиетилен	20 kDa	NHS естер на MePEG
PEG 12	гликолиран полиполиетилен	50 kDa	NHS естер на MePEG
	гликолиран
PEG 14	монополиетилен	6 kDa	Алдехид на MePEG
PEG 15	гликолиран монополиетилен	12 kDa	Алдехид на MePEG
PEG 16	гликолиран монополиетилен	20 kDa	Алдехид на MePEG
PEG 17	гликолиран монополиетилен	25 kDa	Алдехид на MePEG
	гликолиран
PEG 18	полиполиетилен	6 kDa	Алдехид на MePEG
PEG 19	гликолиран полиполиетилен	12 kDa	Алдехид на MePEG
PEG 20	гликолиран полиполиетилен	20 kDa	Алдехид на MePEG
PEG 21	гликолиран полиполиетилен	25 kDa	Алдехид на MePEG
	гликолиран

БАЗОВАТА ЛИНИЯ Е БРОЯ В НОРМАЛНИ ЖИВОТНИ, НА КОИТО НЕ СА ПРИЛАГАНИ НИКАКВИ ВЕЩЕСТВА.

ОЧЕВИДНО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА ЧОВЕШКИЯ MGDF НЕ ВЛИЯЕ ОТРИЦАТЕЛНО ВЪРХУ СПОСОБНОСТТА НА МОЛЕКУЛАТА ДА УВЕЛИЧАВА БРОЯ НА ТОРМБОЦИТИТЕ В ЖИВОТНИТЕ ГОСТОПРИЕМНИЦИ И МОЖЕ ДОРИ ДА УСИЛИ АКТИВНОСТТА НА Е. coii ПРОДУКТА 22-184, ТАКА ЧЕ ТЯ ДА СТАНЕ ГОЛЯМА КОЛКОТО ТАЗИ НА СНО МОЛЕКУЛАТА 22-353 ИЛИ ДОРИ ПО-ГОЛЯМА.

-103Б. PEG -22

РЕЗУЛТАТИТЕ С PEG-22 СА ПРЕДСТАВЕНИ НА ФИГ. 24. ОСОБЕНОТО Е, ЧЕ НОРМАЛИЗИРАНЕТО НА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ С PEG-22 НАСТЪПВА НЯКОЛКО ДНИ ПО-КЪСНО, ОТКОЛКОТО С ПОЛУЧЕН В СНО ПЪЛНОВЕРИЖЕН MGDF , PEG-16, ИЛИ PEG-17.

ПРИМЕР 14

ЕКСПРЕСИЯ НА РЕКОМБИНАНТНИЯ ЧОВЕШКИ MGDF[1 -163] В Е, coli.

ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF В Е. coli СЕКВЕНЦИЯТА, КОДИРАЩА ПЪРВИТЕ 163 АМИНО КИСЕЛИНИ НА ЗРЕЛИЯ БЕЛТЪК БЕШЕ СИНТЕЗИРАНА ПО ХИМИЧЕН ПЪТ, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ОПТИМИЗИРАНИ КОДОНИ НА Е. coll. В ДОПЪЛНЕНИЕ ДНК СЕКВЕНЦИИТЕ, КОДИРАЩИ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ МЕТИОНИН И ЛИЗИН, БЯХА ДОБАВЕНИ КЪМ 5' КРАЯ НА ГЕНА. ПОРАДИ ТОВА гHuMGDF БЕЛТЪКА, КОДИРАН ОТ ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ Е ДЪЛЪГ 165 АМИНО КИСЕЛИНИ И ЗАПОЧВА С МЕТ-ЛИЗ. СЕКВЕНЦИЯТА НА ТОЗИ ГЕН Е ПОКАЗНА НА ФИГ.25.

СИНТЕЗАТА НА r-HuMGDF /1-163/ ГЕНА БЕШЕ ИЗВЪРШЕНА НА НЯКОЛКО ЕТАПА. ПЪРВО, С ПОМОЩТА НА ОПТИМИЗИРАНИ Е. coli КОДОНИ БЯХА СИНТЕЗИРАНИ КОМЛПЕМЕНТАРНИ ОЛИГОНУКЛЕТИДИ ДЪЛГИ 60 -70 дб/, ПРЕДСТАВЛЯВАЩИ ФРАГМЕНТИТЕ НА ГЕНА. ПО ВРЕМЕ НА ТОЗИ СИНТЕЗ КОДОНИТЕ ЗА АМИНО КИСЕЛИНИТЕ МЕТИОНИН И ЛИЗИН БЯХА ПОСТАВЕНИ НА 5’ КРАЯ НА ЗРЕЛИЯ ГЕН И ЕДИН СТОП КОДОН БЕШЕ ПОСТАВЕН НА 3’ КРАЯ НА ГЕНА. В ДОПЪЛНЕНИЕ МЕСТАТА ЗА СРЯЗВАНЕ С РЕСТРИКТАЗНИТЕ ЕНЗИМИ Xbal И Hindlll БЯХА ПОСТАВЕНИ СЪОТВЕТНО В 5’ И 3 ‘ КРАИЩА НА ГЕНА, А МЯСТОТО ЗА СВЪРЗВАНЕ С РИБОЗОМАТА БЕШЕ ПОСТАВЕНО НА СЪОТВЕТНОТО РАЗСТОЯНИЕ СЛЕД НАЧАЛНИЯ МЕТИОНИН. ВТОРО, КОМПЛЕМЕНТАРНИТЕ ГЕННИ

-104ОЛИГОНУКЛЕОТИДИ ЗА ВСЕКИ ГЕНЕН ФРАГМЕНТ БЯХА ТЕМПЕРИРАНИ. ТРЕТО, ТЕЗИ САМОСТОЯТЕЛНИ СИНТЕТИЧНИ ГЕННИ ФРАГМЕНТИ БЯХА НАМНОЖЕНИ ЧРЕЗ ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ. НАМНОЖЕНИТЕ ЕЛЕМЕНТИ БЯХА СУБКЛОНИРАНИ В ПОДХОДЯЩ ВЕКТОР. ПЕТО, БЯХА ПРОВЕРЕНИ СЕКВЕНЦИИТЕ НА СУБКЛОНИРАНИТЕ ФРАГМЕНТИ. ШЕСТО, САМОСТОЯТЕЛНИТЕ ФРАГМЕНТИ БЯХА СВЪРЗАНИ ЗАЕДНО И СУБКЛОНИРАНИ В ПОДХОДЯЩ ВЕКТОР, ВЪЗПРОИЗВЕЖАЩ r-HuMGDF ГЕН С ПЪЛНА ДЪЛЖИННА. НАКРАЯ, СЕКВЕНЦИЯТА НА КОНСТРУИРАНИЯ ГЕН БЕШЕ ПРОВЕРЕНА.

СИНТЕТИЧНИЯТ r-HuMGDF ГЕНЕН ФРАГМЕНТ, СЪДЪРЖАЩ РЕСТРИКЦИОННИ МЕСТА Xbal И Hindlll СЪОТВЕТНО В 5' И 3’ КРАИЩАТА, СЪДЪРЖАШЕ МЯСТО ЗА СВЪРЗВАНЕ С РИБОЗОМАТА, НАЧАЛЕН АП КОДОН, СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА ЗРЕЛИЯ МЕТ-ЛИЗ r-HuMGDF БЕЛТЪК И СТОП КОДОН.

ГОРЕПОСОЧЕНИЯ ФРАГМЕНТ БЕШЕ СВЪРЗАН В Xbal И Hindlll МЕСТАТА НА ЛАКТОЗА-ЗАВИСИМИЯ ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР pAMG11. ВЕКТОРЪТ pAMG11 Е ПЛАЗМИД С МАЛЪК БРОЙ КОПИЯ И ИМА НАЧАЛО НА РЕПЛИКАЦИЯ. ПРОИЗХОЖДАЩО ОТ pR100. ЕКСПРЕСИОННИЯТ ПЛАЗМИД pAMG11 МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕН ОТ pCFM1656 /АТСС # 69576, ДЕПОЗИРАН НА 24 ФЕВРУАРИ 1994/ ЧРЕЗ СЕРИЯ ОТ МЯСТО-НАСОЧЕНИ ПРОМЕНИ НА БАЗИ ЧРЕЗ ДУБЛИРАЩА ОЛИГО МУТАЗЕНЕЗАТА PCR. АКО ЗАПОЧНЕМ ОТ Bgl II МЯСТОТО / дб #180 В ПЛАЗМИДА/ НЕПОСРЕДСТВЕНО НА 5' КЪМ РЕПЛИКАЦИОННИЯ ПРОМОТОР НА ПЛАЗМИДА РсорВ И ПРОДЪЛЖИМ КЪМ РЕПЛИКАЦИОННИТЕ ГЕНИ НА ПЛАЗМИДА ЗАМЕНИТЕ НА ДВОЙКИ БАЗИ СА КАКТО СЛЕДВА:

-105-

	oAMGl1 bo #	bo in OCFM1656	bo chanoed to in	©AMG11
	#	204	T/A	C/G
	#	428	A/T	G/C
5	#	509	G/C	A/T
	#	617	- -	insert two G/C	bp
	#	679	G/C	T/A
	#	980	T/A	C/G
	#	994	G/C	A/T
10	#	1004	A/T	C/G
	#	1007	C/G	T/A
	#	1028	A/T	T/A
	#	1047	C/G	T/A
	#	1178	G/C	T/A
15	#	1466	G/C	T/A
	#	2028	G/C	bp deletion
	#	2187	C/G	T/A
	#	2480	A/T	T/A
20	#	2499-2502	AGTG	GTCA
			TCAC	CAGT
	#	2642	.IGSGAGG	bp deletion
			AGGCTCG
25
	#	3435	G/C	A/T
	#	3446	G/C	A/T
	#	3643	A/T	T/A
30	#	4489-4512	— —	insert bps

gagctcactagtgtcgacctgcag

CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC /СЕКВЕНЦИЯ No 30,31/

ЗАМЯНА HA ДНК СЕКВЕНЦИЯТА МЕЖДУ РЕСТРИКЦИОННИТЕ МЕСТА Aatll И Clal Е СЪС СЛЕДНИТЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДИ:

-106Aatll (#4358)

5’ CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3’ TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3'

-CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAAATAGC 5’

Cla I (#4438) /СЕКВЕНЦИИ No 32,33/

ЕКСПРЕСИЯТА HA r-HuMGDF, КЛОНИРАН B pAMG11 Е ПРОВЕДЕНА ЧРЕЗ СИНТЕТИЧЕН ЛАКТОЗА-ЗАВИСИМ ПРОМОТОР, КАТО Ps4, КОЙТО ИМА СЛЕДНАТА СЕКВЕНЦИЯ:

5’ GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 34/

ПРОМОТОРЪТ Ps4 СЕ ПОДТИСКА ОТ ЛОКТОЗЕН РЕПРЕСОР /Lacl/ , ПРОДУКТ ОТ Е. coli lacl ГЕНА.

ПЛАЗМИДЪТ pAMG11 -r-HuMGDF БЕШЕ ВЪВЕДЕН В Е. coli ЩАМ К-12, ИМАЩ lac I⁴ АЛЕЛ. lac l^q АЛЕЛЪТ Е МУТАЦИЯ В ГРАНИЦИТЕ НА lac I ПРОМОТОРА, КОЯТО УСИЛВА ЕКСПРЕСИЯТА НА Lacl И ВОДИ ДО ПО-СТРОГ КОНТРОЛ НА ЕКСПРЕСИЯТА НА БЕЛТЪКА ОТ Ps4 ПРОМОТОРА. ПОРАДИ ТОВА В ТОЗИ ЩАМ ПРИ ЛИПСА НА ЛАКТОЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF Е ПОДТИСНАТА ОТ Lacl. СЛЕД ДОБАВЯНЕ НА ЛАКТОЗА Lac I БЕЛТЪКА, СВЪРЗАН С МЯСТОТО НА ОПЕРАТОРА В PS4 ПРОМОТОРА СЕ ОТДЕЛЯ И ЗАПОЧВА ТРАНСКРИПЦИЯТА НА гHuMGDF ОТ Ps4. КЛЕТКИТЕ ГОСТОПРИЕМНИЦИ Е. coli, ИЗПОЛЗВАНИ В ТОЗИ ПРИМЕР СА ЗАПАЗЕНИ ПОД АТСС #69717 ОТ 30 НОЕМВРИ 1994.

-107КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК Е. coli АТСС # 69171 БЕШЕ ТРАНСФОРМИРАНА С pAMGl1-r-HuMGDF ПЛАЗМИД И БЕШЕ РАЗМНОЖЕНА СПОРЕД СЛЕДНОТО ОПИСАНИЕ НА ФЕРМЕНТАЦИЯТА. ЩАМЪТ Е. coli БЕШЕ ПОСТАВЕН В ХРАНИТЕЛНА СРЕДА LURIA И ИНКУБИРАН ПРИ 37° С ЗА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 12 ЧАСА. СЛЕД ТОВА КЛЕТКИТЕ БЯХА ПРЕНЕСЕНИ АСЕПТИЧНО ВЪВ ФЕРМЕНТАТОР, СЪДЪРЖАЩ СЛОЖНА СРЕДА (20 g/L ДРОЖДЕН ЕКСТРАКТ; 3.4 g/L ЛИМОНЕНА КИСЕЛИНА; 15 g/L К₂НРО₄ ; 15 ml DOW Р2000; 5 g/L ГЛУКОЗА; 1 g/L MgSO₄ . 7H₂O; 5.5 ml/L СЛЕДИ ОТ МЕТАЛИ; 5.5 ml/L ВИТАМИНИ). ТАЗИ ФАЗА НА ПРОЦЕЦА ПРОДЪЛЖИ ДОКАТО КУЛТУРАТА ДОСТИГНА ОПТИЧНА ПЛЪТНОСТ 5.0 ±1.0 ПРИ 600 nm. СЛЕД ТОВА ЗАПОЧНА ФАЗАТА НА ПОДАВАНЕ НА СРЕДА С ВНАСЯНЕТО НА ПЪРВАТА СРЕДА (700 с L ГЛЮКОЗА; 6.75 g/L MgSO₄ . 7Н₂О). СКОРОСТТА НА ПОДАВАНЕ БЕШЕ РЕГУЛИРАНА НА ВСЕКИ ДВА ЧАСА ПО УСТАНОВЕНА СХЕМА. ВНАСЯНЕТО НА ВТОРАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА (129 g/L TRYPTICASE ПЕПТОН; 258 g/L ДРОЖДЕН ЕКСТРАКТ) ЗАПОЧНА, КОГАТО КУЛТУРАТА ДОСТИГНА ОПТИЧНА ПЛЪТНОСТ 20-25 ПРИ 600 nm. ЗА ВТОРАТА СРЕДА БЕШЕ ПОДДЪРЖАНА ПОСТОЯННА СКОРОСТ НА ПОТОКА, ДОКАТО СКОРОСТТА НА ПЪРВАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА ПРОДЪЛЖИ ДА СЕ РЕГУЛИРА. ПО ВРЕМЕ НА ЦЯКАТА ФЕРМЕНТАЦИЯ БЕШЕ ПОДДЪРЖАНА ТЕМПЕРАТУРА ОКОЛО 30° С. В КУЛТУРАТА БЕШЕ ПОДДЪРЖАНО pH 7 ЧРЕЗ ДОБАВЯНЕ СПОРЕД НУЖДАТА НА КИСЕЛИНА ИЛИ ОСНОВА ЖЕЛАНОТО НИВО НА РАЗТВОРЕНИЯ КИСЛОРОД БЕШЕ РЕГУЛИРАНО ЧРЕЗ РАЗБЪРКВАНЕ И СКОРОСТТА НА ПОДАВАНЕ НА ВЪЗДУХ И КИСЛОРОД ВЪВ ФЕРМЕНТАТОРА. КОГАТО ОПТИЧНАТА ПЛЪТНОСТ НА КУЛТУРАТА ДОСТИГНА 57-63 ПРИ 600 nm ЗАПОЧНА ДОБАВЯНЕТО НА ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА. ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА (300g/L ЛАКТОЗА) БЕШЕ ПОДАВАНА ВЪВ ФЕРМЕНТАТОРА С ПОСТОЯННА СКОРОСТ НА ПОТОКА; ДОБАВЯНЕТО НА ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛА СРЕДА Е ПРЕУСТАНОВЕНО И СКОРОСТТА НА ПОТОКА НА ВТОРАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА Е ПРОМЕНЕНА НА НОВА ПОСТОЯННА СКОРОСТ. ФЕРМЕНТАЦИЯТА ПРОДЪЛЖИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 10 ЧАСА СЛЕД ВНАСЯНЕ НА ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА. В КРАЯ НА

-108ФЕРМЕНТАЦИЯТА КУЛТУРАТА Е ОХЛАДЕНА ДО 15 ± 5° С. КЛЕТКИТЕ БЯХА ОТДЕЛЕНИ ЧРЕЗ ЦЕНТРОФУГИРАНЕ. ПОЛУЧЕНАТА МАСА БЕШЕ ОПАКОВАНА И СЪХРАНЯВАНА ПРИ < - 60⁰ С.

ПРЕЧИСТВАНЕТО НА РЕКОМБИНАНТНИЯ MGDF, ПРОИЗВЕДЕН В Е. coli, КАКТО Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ, БЕШЕ ПРОВЕДЕНО КАКТО СЛЕДВА. ХИЛЯДА И ОСЕМСТОТИН ГРАМА ОТ КЛЕТЪЧНАТА МАСА БЕШЕ СУСПЕНДИРАНА В ОКОЛО 18 ЛИТРА 10 mM EDTA И ПУСНАТА ПРЕЗ ХОМОГЕНИЗАТОР ПОД ВИСОКО НАЛЯГАНЕ ПРИ 15,000 psi. СУСПЕНЦИЯТА ОТ РАЗРУШЕНИ КЛЕТКИ БЕШЕ ЦЕНТРОФУГИРАНА И УТАЙКАТА БЕШЕ СУСПЕНДИРАНА В 10 ЛИТРА 10 mM EDTA. СУСПЕНЗИЯТА БЕШЕ ЦЕНТРОФУГИРАНА И 200 д. УТАЙКА БЕШЕ РАЗТВОРЕНА В 2 ЛИТРА 10 тМ ТРИС, 8 М ГУАНИДИН ХИДРОХЛОРИД, 10 mm DTT, 5 тМ EDTA, pH 8.7. ТОЗИ РАЗТВОР БЕШЕ ПРИБАВЕН БАВНО КЪМ 200 ЛИТРА 10 тМ CAPS, 3 М У РЕЯ. 30 % ГЛИЦЕРОЛ, 3 тМ ЦИСТАМИН, 1 тМ ЦИСТЕИН, рН10.55.

РАЗРЕДЕНИЯТ РАЗТВОР БЕШЕ РАЗБЪРКВАН БАВНО 16 ЧАСА ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРЕТУРА И СЛЕД ТОВА pH БЕШЕ ДОВЕДЕНО ДО 6.8. РАЗТВОРЪТ С КОРИГИРАНО pH БЕШЕ ПРЕЧИСТЕН И ПУСНАТ В 2 ЛИТРОВА CM SEEPHAROSE КОЛОНА, КАЛИБРИРАНА С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 1,5 М УРЕЯ, 15 % ГЛИЦЕРОЛ, pH 6.8. СЛЕД ТОВА КОЛОНАТА БЕШЕ ПРОМИТА С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 15 % ГЛИЦЕРОЛ pH 7.2. MGDF БЕШЕ ЕЛУИРАН С ГРАДИЕНТ ОТ 0 ДО 0.5 М НАТИРЕВ ХЛОРИД, 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2.

СМ ЕЛУАТА БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАН И БУфЕРИРАН С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 6.5 ЧРЕЗ МЕМБРАНА С РАЗДЕЛИТЕЛНА СПОСОБНОСТ 10.000 МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО. КОНЦЕНТРИРАНИЯТ ДО ОКОЛО 2 mg/ml РАЗТВОР БЕШЕ ТРЕТИРАН С CATEPCIN С (500 КЪМ 1 МОЛАРНО СЪОТНОШЕНИЕ) ЗА 90 МИНУТИ ПРИ ТЕМПЕРАТУРАТА НА СРЕДАТА.

-109РАЗТВОРЪТ БЕШЕ ПУСНАТ В 1.2ЛИТРОВА SP HPSC КОЛОНА, КАЛИБРИРАНА С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 15 % ГЛИЦЕРОЛ, pH 7.2. MGDF БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ГРАДИЕНТ ОТ 0.1 ДО 0.25 М НАТИРЕВ ХЛОРИД, 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2.

КЪМ ЕЛУАТА ОТ SP НРС БЕШЕ ДОБАВЕН 0.6 М АМОНИЕВ СУЛФАТ. ЕЛУАТЪТ БЕШЕ ПУСНАТ В 1.6 ЛИТРОВА PHENIL TOYOPEARL КОЛОНА, КАЛИБРИРАНА С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 0.6 М АМОНИЕВ СУЛФАТ, pH 7.2. MGDF БЕШЕ ЕЛУИРАН С ГРАДИЕНТ ОТ 0.6 ДО 0 М АМОНИЕВ СУЛфАТ, 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2.

PHENIL TOYOPEARL ЕЛУАТА БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАН И БУфЕРИРАН С МЕМБРАНА С РАЗДЕЛИТЕЛНА СПОСОБНОСТ 10.000 МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО В 10 тМ ТРИС, 5 % СОРБИТОЛ, pH 7.5.

ПРИМЕР 15

IN VIVO БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА НА r-HuMGDF /Е, coli 1 -163/

БИОЛОГИЧНАТА ЕФЕКТИВНОСТ НА r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/, ПРИГОТВЕН КАКТО Е ОПИСАНО В ПРИМЕР 14 ГОРЕ, БЕШЕ ОЦЕНЕНА В ГРИЗАЧИ. НОРМАЛНИ ЖЕНСКИ МИШКИ Balb/c БЯХА ИНЖЕКТИРАНИ ПОДКОЖНО ЗА 5 ДНИ С НАРАСТВАЩИ ДОЗИ r-HuMGDF. ДОЗИТЕ ВАРИРАХА ОТ 15 ug/КГ/ДЕН ДО 1500 ug/КГ/ДЕН. ДВАДЕСЕТ И ЧЕТИРИ ЧАСА СЛЕД ПОСЛЕДНАТА ИНЖЕКЦИЯ БРОЯТ НА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН С ЕЛЕКТРОНЕН БРОЯ НА КЛЕТКИ /SYSMEX, BAXTER/. БЕШЕ УСТАНОВЕНО ЧЕ ПРИ ЛОГАРИТМИЧНО УВЕЛИЧАВАНЕ НА ДОЗИТЕ НА ЦИТОКИНА, УВЕЛИЧЕНИЕТО НА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ Е ЛИНЕЙНО. ПРИ 1500 ug/КГ/ДЕН В СИСТЕМАТА БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ НАРАСТНА ДО 300 % ОТ ОСНОВНОТО НИВО. ПАРАМЕТРИТЕ НА ДРУГИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ КАТО БРОЙ НА БЕЛИТЕ И ЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ И ХЕМАТОКРИТА НЕ БЯХА ЗАСЕГНАТИ ОТ ТОВА ТРЕТИРАНЕ.

ОТ ЗАЙЦИ, ИНЖЕКТИРАНИ ПОДКОЖНО С 300 ug/КГ/ДЕН r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/ ЗА 6 ДНИ БЯХА СЪБРАНИ ТРОМБОЦИТИ И ОЦЕНЕНИ ЗА СПОСОБНОСТТА ИМ ДА

-110АГРЕГИРАТ В ОТГОВОР НА ADP. ДАННИТЕ ПОКАЗВАТ, ЧЕ ТРОМБОЦИТИТЕ НА ТРЕТИРАНИТЕ ЖИВОТНИ СА ПРАКТИЧЕСКИ НЕРАЗЛИЧИМИ ОТ ТЕЗИ НА КОНТРОЛНИТЕ ЖИВОТНИ. И ДВЕТЕ ПОПУЛАЦИИ СА ЕДНАКВО ЧУВСТВИТЕЛНИ КЪМ ADP.

СЪЩО ТАКА r-HuMGDF БЕШЕ ОЦЕНЕН ПО СПОСОБНОСТТА МУ ДА ПРОТИВОДЕЙСТВА НА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, ПОЛУЧЕНА ВСЛЕДСТВИЕ

ХИМИОТЕРАПИЯ И/ИЛИ ОБЛЪЧВАНЕ. В ТЕЗИ ИЗСЛЕДВАНИЯ БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА КАРБОПЛАТИНА - ХИМИОТЕРАПЕВТИКА, КОЙТО ПРЕДИЗВИКВА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ ПРИ ХОРА. МИШКИ Balb/c БЯХА ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ С 1.25 mg КАРБОПЛАТИНА В НАЧАЛОТО НА ИЗСЛЕДВАНЕТО. СЛЕД 24 ЧАСА И ЗА ОСТАТЪКА НА ИЗСЛЕДВАНЕТО МИШКИТЕ БЯХА ИНЖЕКТИРАНИ ВСЕКИ ДЕН С 100 ug/КГ/ДЕН r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/, ИЛИ ИНЕРТЕН НОСИТЕЛ. ДО 9 ДЕН БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МИШКИТЕ, ТРЕТИРАНИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ БЕШЕ НАМАЛЯЛ ДО ПРИБЛИЗИТЕЛНО 15 % ОТ НОРМАЛНОТО, НО БЕШЕ ОСТАНАЛ В НОРМАЛНИ ГРАНИЦИ ПРИ МИШКИТЕ ТРЕТИРАНИ С r-HuMGDF /ВИЖ ФИГ. 20/. ЗА РАДИАЦИОННИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ МИШКИТЕ БЯХА ОБЛЪЧЕНИ С ЕДИНИЧНА ДОЗА ОТ 500 RAD ГАМА-РАДИАЦИЯ /ЦЕЛЗИЕВ ИЗТОЧНИК/. ТОВА Е СУБЛЕТАЛНА ДОЗА, В РЕЗУЛТАТ НА КОЯТО СЕ ПОЛУЧАВА НАМАЛЕМНИЕ НА ТРОМБОЦИТИТЕ С 90 % ДО ДЕН 11. БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ НЕ СЕ ВЪЗСТАНОВИ В НОРМАЛНИ ГРАНИЦИ ДО ДЕН 21. КОГАТО НА ОБЛЪЧЕНИТЕ МИШКИТЕ БЕШЕ ПРИЛОЖЕН r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/ ВЕДНЪЖ НА ДЕН /100 ug/КГ/ДЕН/ ОТ ДЕН 1 ДО ДЕН 20, НАМАЛЯВАНЕТО НА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ БЕШЕ ПО-СЛАБО И ВЪЗСТАНОВЯВАНЕТО ДО НОРМАЛНИ ГРАНИЦИ ПО-БЪРЗО, ОТКОЛКОТО ПРИ МИШКИТЕ, ТРЕТИРАНИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ. /ФИГ.21/. ЗА ДА БЪДЕ ТЕСТВАН r-HuMGDF В МОДЕЛ СЪС СИЛНА И ПРОДЪЛЖИТЕЛНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, КАРБОПЛАТИНАТА И РАДИАЦИЯТА БЯХА ПРИЛОЖЕНИ В КОМБИНАЦИЯ /ФИГ.22/. ПРИ ТЕЗИ ОБСТОЯТЕЛСТВА БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ СПАДНА ДО ИЗКЛЮЧИТЕЛНО НИСКИ НИВА /3-5 % ОТ НОРМАЛНОТО/ И ПОВЕЧЕТО ОТ ЖИВОТНИТЕ (7/8) НЕ ОЦЕЛЯХА СЛЕД ТОВА

-111ТРЕТИРАНЕ. КОГАТО ОБАЧЕ НА ЖИВОТНИТЕ БЯХА ПРИЛАГАНИ ЕЖЕДНЕВНИ ПОДКОЖНИ ИНЖЕКЦИИ С 100 ug/КГДЕН r-HuMGDF ЗА ПЕРИОДА НА ИЗСЛЕДВАНЕТО, ТРОМБОЦИТОПЕНИЯТА БЕШЕ ЗНАЧИТЕЛНО ОБЛЕКЧЕНА, ВЪЗСТАНОВЯВАНЕТО НА НОРМАЛНИЯ БРОЙ БЕШЕ ПО-БЪРЗО И ВСИЧКИ ТРЕТИРАНИ С r-HuMGDF ЖИВОТНИ (8/8) ОЦЕЛЯХА.

r-HuMGDF БЕШЕ ОЦЕНЕН И В МАЙМУНИ RHESUS. НОРМАЛНИ МАЙМУНИ RHESUS БЯХА ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С 2.5 ИЛИ С 25 ug/КГ/ДЕН ЗА 10 ДНИ (ДНИ 0 - 9). ПРИ ГРУПАТА, ПОЛУЧИЛА ПО-НИСКА ДОЗА БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ СЕ УВЕЛИЧИ С 400 % ДО ДЕН 12, А ПРИ ГРУПАТА, ПОЛУЧИЛА ПО-ВИСОКАТА ДОЗА ТЕ СЕ УВЕЛИЧИХА СЪС 700 % ДО ДЕН 12. СЛЕД КАТО ИНЖЕКЦИИТЕ БЯХА СПРЯНИ БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ СЕ ВЪЗСТАНОВИ ДО НОРМАЛНИЯ ДО ДЕН 25-30. БРОЯ НА БЕЛИТЕ И НА ЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ НЕ БЕШЕ ПОВЛИЯН ОТ ТОВА ТРЕТИРАНЕ.

r-HuMGDF /Е. coli 1-163/ БЕШЕ ТЕСТВАН И В МОДЕЛ НА ПРИМАТ С ТЕЖКА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ (ФИГ. 23). ЖИВОТНИТЕ БЯХА ПОДЛОЖЕНИ НА РАДИАЦИЯ (700 RAD, КОБАЛТОВ ИЗТОЧНИК), В РЕЗУЛТАТ НА КОЕТО ДО 15 ДЕН БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ НАМАЛЯ ДО 1-2 % ОТ НОРМАЛНО. ДО ДЕН 35-40 БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ СЕ ВЪЗСТАНОВИ ДО НОРМАЛНИЯ. В КОНТРАСТ С ТОВА БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В ОБЛЪЧЕНИ ЖИВОТНИ, ТРЕТИРАНИ С 25 ul/КГ/ДЕН r-HuMGDF ДНЕВНО НАМАЛЯ САМО С 10 % ОТ НОРМАЛНОТО И ВЗЕТО СРЕДНО НЕ ПАДНА ПОД 20,000/ul, НИВОТО ОТ КОЕТОЗАПОЧВАТ ДА СЕ ПРАВЯТ ВЛИВАНИЯ НА ТРОМБОЦИТИ НА ХОРА С ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. СЪЩО ТАКА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕТО НА БРОЯ ДО НОРМАЛНОТО НИВО БЕШЕ ПО-БЪРЗО ПРИ ТРЕТИРАНИТЕ С r-HuMGDF ЖИВОТНИ, ДО ДЕН 20.

ТЕЗИ IN VIVO ДАННИ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА С ГРИЗАЧИ И ПРИМАТИ НАПЪЛНО ПОДКРЕПЯТ ИДЕЯТА, ЧЕ r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/ Е МОЩЕН ТЕРАПЕВТИЧЕН АГЕНТ, СПОСОБЕН ЗНАЧИТЕЛНО ДА ВЪЗДЕЙСТВА НАТРОМБОЦИТОПЕНИИ.

-112ПРИМЕР 16

ГЛИКОЗИЛИРАНИЯ r-HuMGDF 1-332 Е ПРОИЗВЕДЕН ОТ ТРАНСфЕКТИРАНИ КЛЕТКИ ОТ ЯЙЧНИК НА КИТАЙСКИ ХАМСТЕР, ЕКСПРЕСИРАЩИ кДНК ЗА r-HuMGDF 1-332 ПРИ ПОДХОДЯЩ ПРОМОТОР И СВЪРЗАН С ГЕН, КОДИРАЩ СЕЛЕКЦИОНЕН МАРКЕР DHFR. ПОДХОДЯЩ ПРОМОТОР ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF В КЛЕТКИ СНО Е SRa. ВИЖ MOL. CELL. BIOL. 8: 466-472 (1988) И WO 91/13160 (1991). ПОДХОДЯЩ ВЕКТОР ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF В СНО КЛЕТКИ Е pDSRa.2. ВИЖ WO90/14363 (1990). ПРИМЕРНИ ЛИНИИ ОТ СНО КЛЕТКИ МОГАТ ДА ПРОИЗВЕЖДАТ В СТАНДАРТНА КУЛТУРАЛНА СРЕДА СЕКРЕТИРАН MGDF В РАМКИТЕ НА 10-20 mg/L, КАТО ТОВА КОЛИЧЕСТВО МОЖЕ ДА БЪДЕ УВЕЛИЧЕНО ДО 25 - > 100 mg/L. ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF В ТИПИЧНА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ КУЛТУРАТА МОЖЕ ДА БЪДЕ РАЗШИРЕНА ЧРЕЗ ПАСИРАНЕ В СУСПЕНЗИЯ ИЛИ В СЪДОВЕ ЗА ТЪКАННИ КУЛТУРИ, ЧРЕЗ МЕТОДА НА ПРИЛЕПВАНЕ И С ИЗПОЛЗВАНЕТО НА СРЕДА, СЪСТАВЕНА ОТ ЕДНАКВИ ЧАСТИ DULBECCO МОДИФИЦИРАНА EAGLE СРЕДА (DMEM) И HAM’S 12 (DMEM/F12, GIBCO), КЪМ КОЯТО Е ДОБАВЕН 5-10 % ЕМБРИОНАЛЕН ТЕЛЕШКИ СЕРУМ (FBS) ИЛИ ДИАЛИЗИРАН ЕМБРИОНАЛЕН ТЕЛЕШКИ СЕРУМ И METHOTREXATE /МТХ/ /ТИПИЧНАТА КОНЦЕНТРАЦИЯ НА МТХ 200-600 пМ/ ЗА ПОДДЪРЖАНЕ НА СЕЛЕКЦИОННО НАЛЯГАНЕ. КЪМ ТАЗИ СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДАТ ДОБАВЕНИ В ИЗЛИШЪК НЕЗАМЕНИМИ АМИНО КИСЕЛИНИ /DEAA/ И ГЛУТАМИН.

СУСПЕНЗИОННИТЕ КУЛТУРИ МОГАТ ДА СЕ РАЗМНОЖАВАТ СВОБОДНО МЕЖДУ ПЪРВОНАЧАЛНАТА /РАЗДЕЛИТЕЛНА/ ПЛЪТНОСТ 1-4 х 10⁵ КЛЕТКИ/mL И МАКСИМАЛНАТА ПЛЪТНОСТ ОТ КОЛО 1 х 10⁶ КЛЕТКИ/ mL, ПРИ ДОСТИГАНЕТО НА КОЯТО КУЛТУТРИТЕ СЕ РАЗШИРЯВАТ ЧРЕЗ РАЗРЕЖДАНЕ В ПО-ГОЛЕМИ ОБЕМИ С ПЪРВОНАЧАЛНА ПЛЪТНОСТ НА КЛЕТКИТЕ ДО ДОСТИГАНЕ НА СПЕЦИФИЧНИ РАЗДЕЛИТЕЛНИ ПЛЪТНОСТИ.

-113ЗА ПРОИЗВОДСТВОТО НА MGDF В БУТИЛКИ ЗА КЛАТАЧКА СЪОТВЕТНИЯ ОБЕМ И КЕТЪЧНА ПЛЪТНОСТ НА СУСПЕНЗИЯТА МОГАТ ДА БЪДАТ ПОСТИГНАТИ ИЛИ ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА СЪДОВЕ С ВЪРТЯЩА СЕ МАГНИТНА БЪРКАЛКА, ПОСТАВЕНИ ТЕМПЕРАТУРНО КОНТРОЛИРАНА СРЕДА (37 ± 1 ⁰ С), ИЛИ ЧРЕЗ КОНТРОЛИРАНА БИОРЕАКТОРНА СИСТЕМА, СНАБДЕНА С КОНТРОЛНО-ИЗМЕРВАТЕЛНИ УСТРОЙСТВА И БЪРКАЧКА. В БУТИЛКИТЕ ЗА КЛАТАЧКА, ( КАТО 850 см² БУТИЛКИ ЗА КЛАТАЧКА FALKON) ТРЯБВА ДА БЪДАТ НАПРАВЕНИ ПОСЯВКИ С НАЧАЛНА ПЛЪТНОСТ ОТ 1.5 ДО 3 х 10⁷ КЛЕТКИ НА БУТИЛКА И ДА БЪДЕ ДОБАВЕНА ДОПЪЛНИТЕЛНА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА (DMEM/F12 С 5-10 % FBS, 1Х NEAA И 1Х LГЛУТАМИН) В КОЛИЧЕСТВА, ПОДХОДЯЩИ ЗА СЪЗДАВАНЕТО НА ПЛЪТЕН МОНОСЛОЙ ЗА 3-4 ДНИ (150 - 300 mL НА БУТИЛКА). ХРАНИТЕЛНАТА СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДЕ ПОДХОДЯЩО БУфЕРИРАНА С НАТРИЕВ БИКАРБОНАТ ДО ДОСТИГАНЕ НА pH ОТ 6.9 ДО 7.2 В РАВНОВЕСИЕ С ВЪГЛЕРОДЕН ДВУОКИС ПРИ ПАРЦИАЛНО НАЛЯГАНЕ ОТ 60 ДО 90 mm Hg. БУТИЛКИТЕ ТРЯБВА ДА БЪДАТ АЕРИРАНИ С 10 % СО₂ /ВЪЗДУХ И ИНКУБИРАНИ НА КЛАТАЧКИ /ОКОЛО 1 ОБОРОТ ЗА МИНУТА/ ПРИ 37 ± 1 ° С ЗА 3 - 4 ДНИ. СЛЕД СЛИВАНЕТО СРЕДАТА В БУТИЛИТЕ ТРЯБВА ДА БЪДЕ СМЕНЕНА СЪС СРЕДА НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ ЧРЕЗ ИЗЛИВАНЕ ИЛИ АСПИРИРАНЕ НА РАСТЕЖАТА СРЕДА, ПРОМИВАНЕ НА БУТИЛКИТЕ С ИЗОТОНИЧЕН БУФЕР, КАКЪВТО Е РАЗТВОРА НА DULBECCO ФОСФАТНИЯ БУфЕР (D-PBS), 50-100 ml НА БУТИЛКА; СЛЕДВА ДОБАВЯНЕ НА СЪОТВЕТНОТО КОЛИЧЕСТВО БУФЕРИРАН С БИКАРБОНАТ, НЕСЪДЪРЖАЩ СЕРУМ DMEM/F12 (1:1) (200-300 ml НА БУТИЛКА), КЪМ КОЕТО СА ДОБАВЕНИ И NEAA, L-ГЛУТАМИН И МЕДЕН СУЛФАТ (1-20 μΜ) ЗА НАМАЛЯВАНЕ НА КОВАЛЕНТНАТА АГРЕГАЦИЯ. БУТИЛКИТЕ ТРЯБВА ДА БЪДАТ АЕРИРАНИ С 10 % СО₂ /ВЪЗДУХ И ИНКУБИРАНИ НА КЛАТАЧКИ /ОКОЛО 1 ОБОРОТ ЗА МИНУТА/ ПРИ 37 ± 1 ° С ЗА 6± 1 ДНИ ИЛИ ДОКАТО МЕТАБОЛИТНАТА АКТИВНОСТ ДОВЕДЕ НИВОТО НА ГЛЮКОЗАТА ДО ПОНИСКО ОТ 0,5 g/L И/ИЛИ НИВОТО НА pH ПОД 6.6. ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДЕ СЪБРАНА ОТ БУТИЛКИТЕ ЧРЕЗ ИЗЛИВАНЕ ИЛИ АСПИРИРАНЕ И ТРЯБВА ДА БЪДЕ ЗАМЕНЕНА С НОВА, НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ СРЕДА, КАКТО Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ, ЗА ДА СЕ СЪБЕРАТ ДОПЪЛНИТЕЛНИ КОЛИЧЕСТВА. ТОВА МОЖЕ ДА

-114ПРОДЪЛЖИ ДОКАТО КЛЕТКИТЕ СТАНАТ НЕСПОСОБНИ ЗА НЕВКЛЮЧВАЩОТО СЕРУМ ПРОИЗВОДСТВО И СЕ ОТДЕЛЯТ ОТ БУТИЛКИТЕ.

СЪБРАНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОДЛОЖЕНА НА ПРЕЧИСТВАНЕ ЧРЕЗ МИКРОФИЛТРАЦИЯ ПРЕЗ 0.45 цт И/ИЛИ 0,2 μπι ФИЛТРИ (SARTORIUS SARTOBRAN pH ИЛИ PALL). ФИЛТРИРАНАТА СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДЕ ОХЛАДЕНА ДО 4 ° С ИЛИ ВЕДНАГА КОНЦЕНТРИРАНА И ДИАЛИЗИРАНА ПРИ НИСКА ЙОННА СИЛА ЧРЕЗ УЛТРАФИЛТРАЦИОННА СИСТЕМА С КРЪСТОСАНИ ПОТОЦИ (НАПР. FILTRON YM-50). УЛТРАфИЛТРИРАНЕТО И ДИАфИЛТРИРАНЕТО ТРЯБВА ДА СЕ ПРОВЕДАТ ПРИ 4 ⁰ С, ЗА ДА СЕ НАМАЛИ ДО МИНИМУМ РАЗГРАЖДАНЕТО НА БЕЛТЪКА. ПРЕДИ ЕТАПИТЕ НА ПРЕЧИСТВАНЕ С ХРОМАТОГРАФИЯ ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДЕ ДИАЛИЗИРАНА С ВОДЕН БУФЕРЕН РАЗТВОР (НАПР. 10 тМ КАЛИЕВ ФОСФАТ, pH 6.8).

КАЧЕСТВОТО НА ПРОДУКТА В ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ОЦЕНЕНО НАЙ-ДОБРЕ ЧРЕЗ НЕРЕДУКЦИОННИ SDS-PAGE WESTERN BLOTS, КОИТО ПОКАЗВАТ ОТНОСИТЕЛНИТЕ КОЛИЧЕСТВА НА АГРЕГИРАЛИТЕ, МОНОМЕРНИТЕ И ПРОТЕОЛИТИЧНО РАЗГРАДЕНИТЕ MGDF В ПРОБИТЕ.

ДРУГ МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF ОТ СНО КЛЕТКИ Е АДАПТИРАНЕТО НА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ, ЕКСПРЕСИРАЩА MGDF КЪМ НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ СРЕДА, КАКВАТО Е GIBCO S-SFM II. КЛЕТКИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ АДАПТИРАНИ ЧРЕЗ СЕРИЙНИ ПАСАЖИ В СРЕДА, СЪДЪРЖАЩА МИНИМАЛНИ КОЛИЧЕСТВА СЕРУМ ИЛИ НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ. СЛЕД КАТО СЕ УСТАНОВИ, ЧЕ КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ МОЖЕ ДА РАСТЕ В ТАКАВА СРЕДА И ДА ПРОИЗВЕЖДА ДОСТАТЪЧНИ КОЛИЧЕСТВА ОТ СЕКРЕТИРАНИЯ MGDF ПРОИЗВОДСТВОТО МОЖЕ ДА ПРОДЪЛЖИ ЧРЕЗ МАЩАБИРАНЕ НА НАЧАЛНАТА КУЛТУРА ЧРЕЗ СЕРИЙНИ ПАСАЖИ В НАРАСТВАЩИ ОБЕМИ НА КУЛТУРАТА, СЛЕД КОЕТО ДА СЕ НАПРАВИ ПОСЯВКА В ПОДХОДЯЩ ПРОИЗВОДСТВЕН СЪД /КОНТРОЛИРАН БИОРЕАКТОР, СНАБДЕН С КОНТРОЛНО-ИЗМЕРВАТЕЛНИИ ПРИБОРИ И БЪРКАЧКА/ И ДА СЕ

-115ОСТАВИ КУЛТУРАТА ДА ДОСТИГНЕ МАКСИМАЛНА ПЛЪТНОСТ ПРИ ОПТИМАЛНИ РАСТЕЖНИ УСЛОВИЯ ( pH, ХРАНИТЕЛНИ ВЕЩЕСТВА, ТЕМПЕРАТУРА, КИСЛОРОД, РАЗБЪРКВАНЕ). В ТОЧКАТА НА ОПТИМАЛНО ПРОИЗВОДСТВО /ЕКСПЕРИМЕНТАЛНО ОПРЕДЕЛЕНА ЧРЕЗ ИЗМЕРВАНЕ НА КОЛИЧЕСТВОТО И КАЧЕСТВОТО НА ПРОДУКТА/ КУЛТУРАТА МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗВАДЕНА ОТ БИОРЕАКТОРА, КЛЕТКИТЕ ДА СЕ ОТДЕЛЯТ ОТ СРЕДАТА ЧРЕЗ МИКРОННА ДЪЛБОЧИННА ФИЛТРАЦИЯ ИЛИ СУБ-МИКРОННА МИКРОФИЛТРАЦИЯ В ОБРАТНИ ПОТОЦИ. АКО СЕ ИЗПОЛЗВА МИКРОННА ФИЛТРАЦИЯ НА СРЕДАТА, ТО ТЯ ТРЯБВА ДА БЪДЕ ДОПЪЛНИТЕЛНО ПРЕЧИСТЕНА ЧРЕЗ СУБ-МИКРОННА DEADEND ФИЛТРАЦИЯ ПРЕДИ КОНЦЕНТРАЦИЯТА И ДИАЛИЗАТА КАКТО Е ОПАСАНО ПО-ГОРЕ.

* * *

ПО-ГОРЕ Е ПРЕДСТАВЕНО ОБЩОТО ОПИСАНИЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ И СЛУЧАИТЕ, В КОИТО ТО НАМИРА ПРИЛОЖЕНИЕ. РАЗБИРАЕМО Е, ЧЕ ЗА РАБОТЕЩИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ ЩЕ ВЪЗНИКНАТ ВАРИАНТИ И МОДИКАЦИИ НА ГОРНОТО ОПИСАНИЕ. ПОРАДИ ТОВА СЕ ПРЕДПОЛГА, ЧЕ ПРИЛОЖЕНИТЕ ПРЕТЕНЦИИ ПОКРИВАТ ВСИЧКИ ТАКИВА ВАРИАНТИ, ВЪЗНИКНАЛИ ОТ РАЗГЛЕЖДАНЕТО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ВЪВ ТОЗИ МУ ВИД.

В ДОПЪЛНЕНИЕ, ПУБЛИКАЦИИТЕ И ДРУГИТЕ МАТЕРИАЛИ, ЦИТИРАНИ ТУК, ЗА ДА ИЛЮСТРИРАТ ПРЕДИСТОРИЯТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО И ПО-СПЕЦИАЛНО В СЛУЧАИТЕ КОГАТО СЕ ДАВАТ ДОПЪЛНИ ДЕТАЙЛИ, КАСАЕЩИ НЕГОВОТО ПРИЛОЖЕНИЕ СА ВКЛЮЧЕНИ ТУК КАТО СПРАВКА.

-116SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Bartley, Timothy D.

Bogenberger, Jakob M.

Bosselman, Robert A.

Hunt, Pamela

Kinstler, Olaf B. Samal, Babru B.

(ii) TITLE OF INVENTION: Compositions and Methods for Stimulating Megakarvocyte Growth and Differentiation (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 34 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Amgen Inc.

(B) STREET: 1840 Dehavilland Drive (C) CITY: Thousand Oaks (D) STATE: California (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 91320-1789 (v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release *1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER:

(B) FILING DATE:

(C) CLASSIFICATION:

(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

(A) NAME: Cook, Robert R.

(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: A-290-C (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NC:l·:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp

5 10 15

-117Ser His Vai Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp lie Tyr

25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:2:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Vai Leu His (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 17 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:3:

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Vai Leu Gly Ala Vai Ala

10 15

Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:4:

GCNCCNCCNG CNTGYGA

-118(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 Ьазе pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:5:

GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:6:

Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Vai Leu His (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:7:

GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21

-119(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:8:

AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:9:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT _TTTTTTTTTT 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:10:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT ttTTTTTTT 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

-12020 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:11: TGCGACCTCC GAGTCCTCAG (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:12:

GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NC:13:

GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N1:14:

CCTTTACTTC TAGGCCTG

-121(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS :

(A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:15: GAGGTCACAA GCAGGAGGA (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:16:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:16:

GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:17:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:17:

TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:18:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

-12219 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:18:

CCAGGAAGGA TTCAGGGGA (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:19:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS; single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:19:

CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:20:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:20:

GGCCGGATAG GCCAC7CNNN NNNT 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:21:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:21:

GCARTGYAAN ACRTGNGART C

-123(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:22:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: CDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:

TTGGTGTGCA CTTGTG 16 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:23:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:23:

CACAAGTGCA CACCAACCCC (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:24:

<i) SEQUENCE CHARACTERISTICS;

(A) LENGTH: 1342 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 99..1094 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:24:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT Ser Pro Ala Pro Pro 1 5

113

-124-

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG CTT CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

161

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu Leu Arg

Asp

Ser

His

Vai

10

15

20

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG C-TT CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu Va_ His

Pro

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC TT3 GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser Leu Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

40

45

50

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT CTG GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

lie Leu Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA CAA CTG

C-GA

CCC

ACT

TGC

353

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly Glr. Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

c ;

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA CAG GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly Glr. Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG CGT CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

449

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin Leu Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC TGG CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

lie P.-.e Leu

Ser

Phe

Gin

His

120

125

130

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG CGT GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

545

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met Leu Vai

Gly

Gly

Ser

Thr

135

140

145

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA GOT GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

593

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr A-a Vai

Pro

Ser

Arg

Thr

150

155

1:0

165

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA AAC AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

641

Ser

Leu

Vai

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro Asn Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

170

175

180

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA ACT ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

689

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg Thr Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

185

190

195

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG ATT CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

737

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys He Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

200

205

210

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC C-GA TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

785

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

He

Pro Gly Tyr

Leu

Asn

. Arg

He

215

220

225

-125-

CAC His 230

GAA Glu

CTC Leu

TTG Leu

AAT Asn

GGA ACT Gly Thr 235

CGT GGA

CTC Leu

TTT Phe 240

CCT Pro

GGA Gly

CCC Pro

TCA Ser

CGC Arg 245

833

Arg

Gly

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

881

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

lie

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

250

255

260

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

929

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

265

270

275

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

977

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

280

285

290

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

1025

Thr

Pro

Vai

Vai

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

295

300

305

ACG

ccc

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

1073

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

310

315

320

325

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA

1124

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

330

TTGTCTCGTG	TACAGCTCCC	TTCCCTGCAG	GGCGCCCCTG	GGAGACAACT	GGACAAGATT	1184
TCCTACTTTC	TCCTGAAACC	CAAAGCCCTG	GTAAAAGGGA	TACACAGGAC	TGAAAAGGGA	1244
ATCATTTTTC	ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AGAAGCTATT	TTTTTAAGCT	ATCAGCAATA	1304
CTCATCAGAG	CAGCTAGCTC	TTTGGTCTAT	TTTCTGCA			1342

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:25:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 332 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:25:

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

1

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

л— a

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

-126-

Gly

Glu

Trp Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

lie

Leu

50

55

60

Gly

Ala

Vai Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Vai

Arg

Leu Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

He

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Vai

Gly

Gly Ser

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

145

150

155

160

Vai

Pro

Ser Arg

Thr

Ser

Leu

Vai

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

165

170

175

Arg

Thr

Ser Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

180

185

190

Thr

Gly

Ser Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

He

195

200

205

Pro

Gly

Leu Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

He

Pro

Gly

210

215

220

Tyr

Leu

Asn Arg

lie

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

225

230

235

240

Pro

Gly

Pro Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

lie

Ser

Ser

Gly

245

250

255

Thr

Ser

Asp Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

260

265

270

Pro

Ser

Pro Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

275

280

285

Pro

Pro

Thr Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Vai

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

290

295

300

Asp

Pro

Ser Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

305

310

315

320

Ser

Tyr

Thr His

Ser

Gin

Asn

Leu

. Ser

Gin

. Glu

Gly

325

330

-127(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:26:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1342 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: CDNA (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 99..621 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NC:26:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCT AGC COG GCT CCT CCT113

Ser Pro Ala Pro Pro

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG CTT

CGT GAC

TCC

CAT

GTC

161

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu Leu

Arg Asp

Ser

His

Vai

10

15

20

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG GTT

CAC CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu .'al

His Pro

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AC-C TTG

GGA GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Gly Glu

Trp

Lys

Thr

40

45

50

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT CTG

GGA GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

lie Leu

Gly Ala

Vai

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA CAA

CTG GGA

CCC

ACT

TGC

353

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly Gin

Leu Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA CAG

GTC CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly Gin

Vai Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG CTT

CCT CCA

CAG

GGC

AGG

449

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Glr. leu

Pro Pro

Gin

Gly

Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC TTC

CTG AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

He The

Leu Ser

Phe

Gin

His

120

125

130

-128TG СТС CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545

Leu Leu Arg Gly Lys Vai Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly Gly Ser Thr
135	140	145
CTC TGC GTC Leu Cys Vai 150	AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 155 160	GTC CCC AGC Vai Pro Ser	AGA ACC Arg Thr 165	593
TCT CTA GTC Ser Leu Vai	CTC ACA CTG AAC GAG СТС C CAAACAGGAC TTCTGGATTG Leu Thr Leu Asn Glu Leu 170	641
TTGGAGACAA	ACTTCACTGC	CTCAGCCAGA	ACTACTGGCT	CTGGGCTTCT	GAAGTGGCAG	701
CAGGGATTCA	GAGCCAAGAT	TCCTGGTCTG	CTGAACCAAA	CCTCCAGGTC	CCTGGACCAA	761
ATCCCCGGAT	ACCTGAACAG	GATACACGAA	CTCTTGAATG	GAACTCGTGG	ACTCTTTCCT	821
GGACCCTCAC	GCAGGACCCT	AGGAGCCCCG	GACATTTCCT	CAGGAACATC	AGACACAGGC	881
TCCCTGCCAC	CCAACCTCCA	GCCTGGATAT	TCTCCTTCCC	CAACCCATCC	TCCTACTGGA	941
CAGTATACGC	TCTTCCCTCT	TCCACCCACC	TTGCCCACCC	CTGTGGTCCA	GCTCCACCCC	1001
CTGCTTCCTG	ACCCTTCTGC	TCCAACGCCC	ACCCCTACCA	GCCCTCTTCT	AAACACATCC	1061
TACACCCACT	CCCAGAATCT	GTCTCAGGAA	GGGTAAGGTT	CTCAGACACT	GCCGACATCA	1121
GCATTGTCTC	GTGTACAGCT	CCCTTCCCTG	CAGGGCGCCC	CTGGGAGACA	ACTGGACAAG	1181
ATTTCCTACT	TTCTCCTGAA	ACCCAAAGCC	CTGGTAAAAG	GGATACACAG	GACTGAAAAG	1241
GGAATCATTT	TTCACTGTAC	ATTATAAACC	TTCAGAAGCT	ATTTTTTTAA	GCTATCAGCA	1301
ATACTCATCA	GAGCAGCTAG	CTCTTTGGTC	TATTTTCTGC	A		1342

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:27:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 174 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:27:

Ser 1

Pro

Ala Pro

Pro Ala 5

Cys

Asp

Leu Arg Vai 10

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Vai

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

-129-

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

lie

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

lie

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Vai

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

145

150

155

160

Vai

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Vai

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

165 170 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:28:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1164 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 97..894 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:28:

AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG

GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC

CCG GCT Pro Ala

CCT Pro

CCT Pro 5

GCT Ala

114

Ser 1

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

162

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

10

15

20

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

CCT

210

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Vai

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

35

130

GTC Vai

CTG Leu 40

CTG Leu

CCT Pro

GCT Ala

GTG GAC TTT AGC

TTG GGA GAA TGG

AAA ACC

CAG Gin

258

Vai

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

CTG

306

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

lie

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

354

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

75

80

85

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

402

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

450

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

105

110

115

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

498

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

lie

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTC

CGA

GGA

AAG

GAC

TTC

TGG

ATT

GTT

GGA

GAC

AAA

CTT

CAC

TGC

CTC

546

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

lie

Vai

Gly

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

135

140

145

150

AGC

CAG

AAC

TAC

TGG

CTC

TGG

GCT

TCT

GAA

GTG

GCA

GCA

GGG

ATT

CAG

594

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Vai

Ala

Ala

Gly

lie

Gin

155

160

165

AGC

CAA

GAT

TCC

TGG

TCT

GCT

GAA

CCA

AAC

CTC

CAG

GTC

CCT

GGA

CCA

642

Ser

Gin

Asp

Ser

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro

Asn

Leu

Gin

Vai

Pro

Gly

Pro

170

175

180

AAT

CCC

CGG

ATA

CCT

GAA

CAG

GAT

ACA

CGA

ACT

CTT

GAA

TGG

AAC

TCG

69C

Asn

Pro

Arg

lie

Pro

Glu

Gin

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

185

190

195

TGG

ACT

CTT

TCC

TGG

ACC

CTC

ACG

CAG

GAC

CCT

AGG

AGC

CCC

GGA

CAT

738

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

200

205

210

TTC

CTC

AGG

AAC

ATC

AGA

CAC

AGG

CTC

CCT

GCC

ACC

CAA

CCT

CCA

GCC

786

Phe

Leu

Arg

Asn

lie

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

215

220

225

230

TGG

ATA

TTC

TCC

TTC

CCC

AAC

CCA

TCC

TCC

TAC

TGG

ACA

GTA

TAC

GCT

834

Trp

lie

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

Tyr

Trp

Thr

Vai

Tyr

Ala

235

240

245

CTT

CCC

TCT

TCC

ACC

CAC

CTT

GCC

CAC

CCC

TGT

GGT

CCA

GCT

CCA

CCC

882

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro

250

255

260

-131931

CCT GCT ТСС TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT

Pro Ala Ser

265

CTAAACACAT	CCTACACCCA	CTCCCAGAAT	CTGTCTCAGG	AAGGGTAAGG	TTCTCAGACA	991
CTGCCGACAT	CAGCATTGTC	TCGTGTACAG	CTCCCTTCCO	TGCAGGGCGC	CCCTGGGAGA	1051
CAACTGGACA	AGATTTCCTA	CTTTCTCCTG	AAACCCAAAG	CCCTGGTAAA	AGGGATACAC	1111
AGGACTGAAA	AGGGAATCAT	TTTTCACTGT	ACATTATAAA	CCTTCAGAAG	CTA	1164

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:29:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 265 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:29:

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg V=1

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

1

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Vai

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr Lys

Ala

Gin

Asp

He

Leu

50

55

60

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

7 5

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys Asp

Pro

Asn

Ala

lie

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys Asp

Phe

Trp

lie

Vai

Gly

130

135

140

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

Ser

Gin

Asn

Tyr Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

145

150

155

160

Vai

Ala

Ala

Gly

lie

Gin

Ser

Gin

Asp

Ser Trp

Ser

Ala

Glu

Pro

Asn

165

170

175

-132-

Leu

Gin

Vai

Pro 180

Gly

Pro Asn

Pro Arg 185

lie

Pro

Glu

Gin

Asp 190

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

- -P

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

195

200

205

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Asn

He

Arg

His

Arg

Leu

Pro

210

-

215

220

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

Trp

He

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

225

230

235

240

Tyr

Trp

Thr

Vai

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

245

250

255

Cys

Gly

Pro

Ala

P ro

Pro

Pro

Ala

Ser

260

265

(2)

INFORMATION

FOR

SEQ

ID

N0:30:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N1:30:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:31:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:31:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:32:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 80 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

-133- (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:32:

CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60

TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:33:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 86 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:33:

CGATAAATTG TGAC-CGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60

TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:34:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 89 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:34:

GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60

TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT

Claims (51)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. ПОЛИПЕПТИД НА МЕГАКАРИОЦИТНИТЕ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ, КОЙТО ИМА АМИНОКИСЕЛИННАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА ИЗБРАН ПРЕДСТАВИТЕЛ ОТ ГРУПАТА, СЪСТОЯЩ СЕ ОТ MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7 И MGDF-8.
2. 2. ИЗОЛИРАН ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОЙТО КОДИРА MGDF ПОЛИПЕПТИДА СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 1.
3. 3. ИЗОЛИРАН ПОЛИНУКЛЕОТИД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 2, КОЙТО Е ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ.
4. 4. ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 3, КОЯТО Е сДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ.
5. 5. сДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 4, КОЯТО ИМА СЪОТВЕТСТВАЩА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, КАКТО Е ПОКАЗАНО НА ФИГ. 11 И 12.
6. 6. ДНК ВЕКТОР, СЪДЪРЖАЩ ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 4.
7. 7. ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА ОТ ВЕКТОРА СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 4 Е ЕФЕКТИВНО СВЪРЗАНА С ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, КОНТРОЛИРАЩА ЕКСПРЕСИЯ.
8. 8. КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК, ТРАНСФОРМИРАНА ИЛИ ТРАНСФЕКТИРА НА С ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 4.
9. 9. КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 8, КОЯТО ЕКСПРЕСИРА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД, КОДИРАН ОТ ЦИТИРАНАТА ДНК.
10. 10. МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF ПОЛИПЕПТИД, ВКЛЮЧВАЩ РАСТЕЖ НА КЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 9 В ПОДХОДЯЩА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА И ИЗОЛИРАНЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД ОТ ЦИТИРАНАТА КЛЕТКА ИЛИ ОТ ЦИТИРАНАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА.

    135
11. 11. МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF ПОЛИПЕПТИД СЪГЛАСНО

    ПРЕТЕНЦИЯ 10, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК Е Е. COLI КЛЕТКА.
12. 12. МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF ПОЛИПЕПТИД СЪГЛАСНО

    ПРЕТЕНЦИЯ 10, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК Е СНО КЛЕТКА.
13. 13. АНТИТЯЛО, РЕАГИРАЩО С MGDF ПОЛИПЕПТИД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 1.
14. 14. МОНОКЛОНАЛНО АНТИТЯЛО СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 13.
15. 15. РЕКОМБИНАНТНО АНТИТЯЛО СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 13.
16. 16. ПРОИЗВОДЕН MGDF, СЪСТАВЕН ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКО ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
17. 17. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 16. КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ MGDF ПОЛИПЕПТИД Е ИЗБРАН ОТ ГРУПАТА, СЪСТОЯЩА СЕ ОТ MGDF-1, MGDF-2, MGDF4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 И MGDF-15.
18. 18. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ПОЛИПЕПТИД Е РЕКОМБИНАНТНО ПРОИЗВЕДЕН В БАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА.
19. 19. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ФАРМАЦЕВТ; 1ЧНО ПРИЕМЛИВ.
20. 20. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ИЗБРАН ОТ ГРУПАТА СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: ДЕКСТРАН, ПОЛИ(И-ВИНИЛ-ПИРОЛИДОН), ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИ, ПОЛИПРОПИЛЕН ГЛИКОЛ ХОМОПОЛИМЕРИ, ПОЛИПРОПИЛЕНОВ ОКИС/ЕТИЛЕНОВ ОКИС КО-ПОЛИМЕРИ, ПОЛИОКСИЕТИЛИРАНИ ПОЛИОЛИ, ПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛИ И СМЕСИ ОТ ТЯХ.
21. 21. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
22. 22. ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 21, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е МОНОМЕТОКСИ-ПО.ШЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
23. 23. ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 21, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е СВЪРЗАН С ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД

    136

    ПОСРЕДСТВОМ АЦИЛНА ИЛИ АЛКИДНА ВРЪЗКА.
24. 24. ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 23, КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА Е СВЪРЗАНА С НЕГОВИЯ N-КРАЙ.
25. 25. ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 23, КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА ИМА ПРИБЛИЗИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 10 ДО 50 КИЛОДАЛТОНА.
26. 26. ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 16, СЪСТАВЕН ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИД, КОВАЛЕНТНО СВЪРЗАН С ДВЕ МОЛЕКУЛИ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
27. 27. ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО И ДВЕТЕ ЦИТИРАНИ МОЛЕКУЛИ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР СА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
28. 28. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КЪМ MGDF ПОЛИПЕПТИД ЗА ПРОИЗВОДСТВОТО НА ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ, ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИМА РЕАКТИВНА АЛДЕХИДНА ГРУПА, КОЙТО МЕТОД ВКЛЮЧВА РЕАКЦИЯ МЕЖДУ ПРОИЗВОДНО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ С КРАЙНА АЛДЕХИДНА ГРУПА И MGDF ПОЛИПЕПТИД В ПРИСЪСТВИЕТО НА РЕДУЦИРАЩ АГЕНТ П ИЗОЛИРАНЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СВЪРЗАН НАЙ-МАЛКО С ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
29. 29. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КЪМ MGDF ПОЛИПЕПТИД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИМА РЕАКТИВНА АЛДЕХИДНА ГРУПА, КОЙТО МЕТОД ВКЛЮЧВА :

    (а) СЪПРИКОСНОВЕНИЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД С ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ПРИ РЕДУКТИВНИ АЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ, ПРИ ДОСТАТЪЧНО КИСЕЛО pH , ТАКОВА, ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВА α-АМИНО ГРУПАТА НА АМИНО КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПЕПТИД ДА БЪДЕ РЕАКТИВНА; И (б) ИЗОЛИРАНЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СВЪРЗАН С НАЙМАЛКО ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР

    137
30. 30. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КЪМ MGDF ПОЛИПЕПТИД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 16, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИМА ИДЕНТИЧНА РЕАКТИВНА ЕСТЕРНА ГРУПА, КОЙТО МЕТОД ВКЛЮЧВА:

    (а) СЪПРИКОСНОВЕНИЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД С ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ПРИ ТАКИВА УСЛОВИЯ, ЧЕ ЦИТИРАНИЯТ MGDF ПОЛИПЕПТИД ДА СЕ СВЪРЖЕ С ВОДОРАЗТВОРИМИЯ ПОЛИМЕР ЧРЕЗ АЦИЛНА ВРЪЗКА; И (б) ИЗОЛИРАНЕ НА MGDF ПОЛИПЕПТИД, СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКО ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
31. 31. МЕТОД ОТ ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИТЕ ОТ 28 ДО 30, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ПОЛИМЕР Е ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ.
32. 32. МЕТОД ОТ ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИТЕ ОТ 28 ДО 30, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ИЗБРАН ОТ ГРУПАТА, СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: ДЕКСТРАН, ПОЛИ(Х-ВИНИЛ-ПИРОАИДОН), ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИ, ПОЛИПРОПИЛЕН ГЛИКОЛ ХОМОПОЛИМЕРИ, ПОЛИПРОПИЛЕНОВ окис/ ЕТИЛЕНОВ ОКИС КО-ПОЛИМЕРИ, ПОЛИОКСИЕТИЛИРАНИ ПОЛИОЛИ, ПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛИ.
33. 33. МЕТОД ОТ ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИТЕ ОТ 28 ДО 30, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
34. 34. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД.
35. 35. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ MGDF ПОЛИПЕПТИД Е ИЗБРАН ОТ ГРУПА, СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: MGDF1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8, MGDF-11, MGDF12, MGDF-13, MGDF-14 И MGDF-15.
36. 36. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА МОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ КЪМ MGDF ПОЛИПЕПТИД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН

    138

    MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 34, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТА МОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ИМА ЕДНА РЕАКТИВНА АЛДЕХИДНА ГРУПА, КОЙТО МЕТОД ВКЛЮЧВА:

    (а) СЪПРИКОСНОВЕНИЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД С ЦИТИРАНАТА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА МОЛЕКУЛА ПРИ РЕДУКЦИОННИ АЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ, И ДОСТАТЪЧНО КИСЕЛО pH, ТАКОВА, ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВА α-АМИНО ГРУПАТА НА АМИНО КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПЕПТИД ДА БЪДЕ РЕАКТИВНА; И (б) ПОЛУЧАВАНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД.
37. 37. МЕТОД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИД Е ПОЛУЧЕН СЛЕД ПРЕМАХВАНЕ НА MET- - ЛИ3¹ ОТ ПОЛИПЕПТИДА, ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ ЕКСПРЕСИЯ В E.COLI НА ДНК, КОДИРАЩА ПОЛИПЕПТИД, КОЙТО СЕ СЪСТОИ ОТ АМИНО КИСЕЛИНИ 22- 184 НА ФИГ.11 И СЕКВЕНЦИЯТА ОТ MET - ЛИЗ НА N-КРАЯ МУ.
38. 38. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДЪТ Е ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ:

    а) ЕКСПРЕСИЯ В E.COLI на ДНК, КОДИРАЩА ПОЛИПЕПТИД, КОЙТО СЕ СЪСТОИ ОТ АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 НА ФИГ. 11 И СЕКВЕНЦИЯ MET - ЛИЗ НА NКРАЯ МУ;

    б) ИЗОЛИРАНЕ НА ЕКСПРЕСИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИД; И

    в) ОТСТРАНЯВАНЕ НА МЕТ²-ЛИЗ-1 ОТ ИЗОЛИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИД.
39. 39. МЕТОД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 33 ИЛИ 36, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТА МОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ИМА МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 2 ДО 100 КИЛОДАЛТОНА.
40. 40. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИДЕН

    ПРОДУКТ, ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ ПРОЦЕСА ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 36.

    139
41. 41. ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕНЕН MGDF

    ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 34. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД.
42. 42. ПОЛУЧАВАНЕ НА ПОЛИПЕПТИД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 41, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТ MGDF ПОЛИПЕПТИД t МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, КОЙТО ИМА ОТНОСИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 5 ДО 50 КИЛОДАЛТОНА.
43. 43. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 34, КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА Е СВЪРЗАНА КЪМ N-КРАЯ НА ПОЛИПЕПТИДА
44. 44. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 34, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДЪТ Е ПРОИЗВЕДЕН В E.COLI.
45. 45. Фармацевтични състави, съдържащи производен mgdf СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 16 И фАРМАЦЕБТДЧНО ПРИЕМЛИВ РАЗТВОРИТЕЛ, АДЖУВАНТ ИЛИ НОСИТЕЛ.
46. 46. ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ. СЪДЪРЖАЩИ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 34 И ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ РАЗТВОРИТЕЛ, АДЖУВАНТ ИЛИ НОСИТЕЛ.
47. 47. МЕТОД ЗА ТРЕТИРАНЕ НА ПАЦИЕНТ С MGDF ПОЛИПЕПТИДНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ, КОЙТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИДА СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1 ИЛИ ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 16 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.
48. 48. МЕТОД ЗА ТРЕТИРАНЕ НА ПАЦИЕНТ С ТРОМБОЦИТОПЕНИЧНО СЪСТОЯНИЕ, КОЙТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИДА СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 1 ИЛИ ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 16 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.

    140
49. 49. МЕТОД СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 48, КЪДЕТО ЦИТИРАНОТО СЪСТОЯНИЕ Е ИЗБРАНО ОТ ГРУПА, СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: АПЛАСТИЧНА АНЕМИЯ, ИДИОПАТИЧНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, ПОЛУЧЕНА В РЕЗУЛТАТ ОТ МЕДИКАМЕНТОЗНО ИЛИ РАЩ1АЦИОННО ЛЕЧЕНИЕ.
50. 50. МЕТОД ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ЗРЕЛИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ ПРИ ПАЦИЕНТ, НУЖДАЕЩ СЕ ОТ ТЯХ, КОЙТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ MGDF ПОЛИНЕПТИДА СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 1 ИЛИ ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 16 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.
51. 51. МЕТОД ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ПРИ ПАЦИЕНТ, НУЖДАЕЩ СЕ ОТ ТЯХ, КОЙТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИДА СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ 1 ИЛИ ПРОИЗВОДЕН MGDF СЪГЛАСНО ПРЕТЕНЦИЯ. 16 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.