JP2010508297A5

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Description

ａ．網膜上および／または網膜下の膜形成を特徴とする病理学的新血管新生および疾患と関連した虚血性網膜症（ischemic retinopathy）
虚血性網膜症（ＩＲ）は、網膜血流の低下を特徴とする多様な障害群である。ＩＲの例としては、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、鎌状細胞網膜症および網膜静脈閉塞性疾患が含まれる。これらの障害は全て、ＶＥＧＦにより駆動される病理学的な網膜新血管新生の増殖に関連づけることができ、やがては眼球内出血、網膜上膜形成および牽引性網膜剥離に至り得る。特発性網膜上膜（ＥＲＭ）は、黄斑パッカーまたはセロファン網膜症（cellophane retinopathy）とも呼ばれ、網膜構造の変形に次いで視力低下を引き起こし得る。これらの膜は、外科的に除去しても再発することがあり、網膜虚血を伴うこともある。ＶＥＧＦおよびその受容体はＥＲＭに局在している。増殖性糖尿病網膜症、増殖性硝子体網膜症および黄斑パッカーと関連のある膜内にＶＥＧＦが存在することは、このサイトカインが、脈管形成において、虚血性網膜疾患において、また、増殖性硝子体網膜障害における膜増殖において、重要な役割を果たすことをさらに示唆する。さらにＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２もまた、ＥＲＭの細胞で同定される。これらのデータは、ＶＥＧＦが血管性および無血管性ＥＲＭの進行に関与し得る自己分泌および／またはパラ分泌刺激因子であり得るということを示す。ＰＤＧＦおよびその受容体[Robbins, et al. (1994), Invest Ophthalmol Vis Sci; vol 35: 3649-3663]は、増殖性網膜疾患に罹患している眼球において記載されている[Cassidy, et al. (1998), Br J Ophthamol; vol 82: 181-85およびFreyberger, et al. (2000), Exp Clin Endocrinol Diabetes, vol 108: 106-109]。これらの知見は、ＰＤＧＦリガンドおよび受容体は、種々の起源の増殖性網膜の膜中に拡散していることを示唆し、ＰＤＧＦによる自己分泌およびパラ分泌刺激はＥＲＭ病理に関与し得ることを示唆している。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ染色および免疫活性によって示されるように、ＥＲＭの形成と関与している[Pournaras, et al. (1998), Klin Monatsbl Augenheilkd, vol 212: 356-358]。さらに、ＴＧＦ−β受容体ＩＩは、糖尿病性膜およびＰＶＲ膜のＥＲＭの筋繊維芽細胞で発現される。これらの結果は、網膜およびＥＲＭの複数の細胞種で産生されたＴＧＦ−βは、ＰＶＲ、糖尿病性の、および二次的なＥＲＭの処置のための魅力的な標的であることを示唆する。インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）においてヒト硝子体中で増加するということが報告されており[La Heij, et al. (2002), Am J Ophthal, 134: 367-375]、ある研究では、研究された１００％糖尿病性ＥＲＭがＩＬ−６タンパク質を発現した[Yamamoto, et al. (2001) Am J Ophthal, vol 132: 369-377]。

Ｓ１Ｐの既知の多面発現作用、およびＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６との相互作用を考えれば、Ｓ１Ｐと結合する、Ｓ１Ｐに拮抗する、Ｓ１Ｐの作用または産生を阻害する薬剤は、虚血性網膜症および血管性または無血管性ＥＲＭ形成を特徴とする後眼部疾患において病理学的網膜新血管新生を抑制する際に有効であると考えられる。少なくとも部分的に、異常な新血管新生または脈管形成を特徴とする他の眼球症状には、加齢性黄斑変性、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、コンタクトレンズの過剰装着、角膜感染（単純ヘルペス、帯状疱疹および原虫感染を含む）、翼状片、感染性ブドウ膜炎、慢性網膜剥離、レーザー損傷、鎌状細胞網膜症、静脈閉塞疾患、脈絡膜新血管新生、網膜血管腫増殖（retinal angiomatous proliferation）および特発性ポリープ状脈絡膜血管障害（idiopathic polypoidal choroidal vasculopathy）を含む。

表４においていくつかのキメラ抗体可変（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）ドメインのアミノ酸配列を比較している。これらの変異体を、発現ベクター中へ、生殖系列リーダー配列の後ろにクローニングした。pATH200 (最初の 19 アミノ酸) および pATH300 配列 (最初の 22 アミノ酸) 上の生殖系列リーダー配列には、表４において下線が引かれている。CDR は太字で示されている。表 4 における重鎖および軽鎖配列の各々の C 末端に続くアミノ酸は、イタリック体で示されている。これらは定常ドメインの最初の数アミノ酸であり、可変ドメインの一部ではない。pATH200 および pATH300 シリーズの番号は通常、特定の可変ドメイン変異体の配列を含むベクターを指すが、便宜のため、本明細書において、この命名法は該変異体の可変ドメイン自体を指すため、および区別するために用いられ得ることに注意すべきである。ネズミＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインの配列を用いて、どのフレームワーク残基をヒト化抗体に組み込むべきかを確認するための分子モデルを構築した。

５．抗体変異体のＳ１Ｐに対する比較結合
下記表５では変異株とキメラ抗体との比較分析を示している。マウスまたはヒトＩｇＧに対して特異的な、ＨＲＰとコンジュゲートされた二次抗体によって結合抗体を検出して、これらの結果を得た。発色反応を測定し、光学密度（ＯＤ）として報告した。抗体パネルの濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。Ｓ１Ｐコーティングマトリックス単独との二次抗体の相互作用は全く検出されなかった。

実施例１２：ヒト化抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＬＴ１００９（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）の作製および特性解析
Ｓ１Ｐと特異的に結合するネズミ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体３０６Ｄ（ＬＴ１００２；Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））は、様々な動物モデルにおいて脈管形成および腫瘍成長を強く抑制することが証明されている。以下に記述するように、ＬＴ１００２を、ネズミＣＤＲをグラフトするヒトフレームワークの配列同一性および相同性検索といくつかのフレームワーク逆突然変異を導くコンピューター処理モデルを用いてヒト化した。２つの変異体、ＨｕＭＡｂＨＣＬＣ_３（ＬＴ１００４）（軽鎖に３つの逆突然変異を含む）およびＨｕＭＡｂＨＣＬＣ_５（ＬＴ１００６）（軽鎖に５つの逆突然変異を含む）はナノモル範囲で結合親和性を示した。ヒト化変異体の生物物理学的特性および生物学的特性を向上させる目的で、さらなる工学的処理を行った。ＨＣＤＲ２中のフリーシステイン残基がアラニンで置き換えられたヒト化変異体ＨｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_３（ＬＴ１００７）およびＨｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_５（ＬＴ１００９）はピコモル範囲で結合親和性を示した。全てのヒト化変異体が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）モデルにおいて脈管形成を阻害し、ＨｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_５（ＬＴ１００９）は、親ネズミ抗体と比較して、優れた安定性およびin vivo有効性を示した。この変異体ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_５（ＬＴ１００９）をＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標）と称した。

この研究では、構造アライメントプログラム（ＳＲｖ７．６）を用いたＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベース内のヒト抗体の相同性検索に基づいて、好適なアクセプター構造を選択した。最初のステップは、これらのヒト重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）配列データベース(these human heavy variable (VH) and light variable (VL) sequence databases)にＬＴ１００２ＶＨおよびＶＬタンパク質配列それぞれについて問い合わせること、バーニア残基(Foote, J. & Winter, G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol. 224, 487-499 (1992))、カノニカル残基(Morea, et al., Antibody modeling: implications for engineering and design, Methods 20, 267-279 (2000)およびＶＨ−ＶＬ界面残基(Chothia, C., Novotny, J., Bruccoleri, R., & Karplus, M. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol. 186, 651-663 (1985))において、ＦＲ内に高い配列同一性を有し、かつ同一カノニカルクラスおよび／または長さのＣＤＲを有するヒトフレームワーク（ＦＲ）を同定することである。このライブラリーの各メンバーの、マウス抗体の個別アライン残基に対する同一性を、前記プログラムを用いて計算した。マウスＦＲと最も同一性の高いＦＲ配列を有するヒト配列を同定し、ヒト「アクセプター」配列の最初のショートリストを作成した。バーニア残基、カノニカル残基およびＶＨ−ＶＬ界面（ＶＣＩ）残基においてマウス抗体と最も同一性の高い配列も計算した。ヒトとマウスとの間でのこれらの位置における相違は、保存的置換と非保存的置換に分類され、ＬＴ１００２との非保存的ＶＣＩの相違が最低値であることを最良のフレームワーク選択とした。ＬＴ１００２のＣＤＲループＬ３およびＨ１はカノニカル構造に分類することができた。これらのＬ３およびＨ１構造を用いて、同一カノニカル構造を有するヒト抗体ＦＲを選択した。分類されないＣＤＲについては、ＣＤＲ長さがマウス抗体と同一であるヒトフレームワークを選択するよう試みた。この理論的解釈は、ＣＤＲループ構造が、ＣＤＲループ配列自体だけでなく、その基礎となるフレームワーク残基（カノニカル残基）にも依存しているということである。そのため、マッチするカノニカルＣＤＲ構造および／またはＣＤＲ長さを有するヒトフレームワークは、グラフトしたマウスＣＤＲを、抗原結合親和性を維持するのに最も適した配向で保持する可能性が高い。ＣＤＲＨ３を除く全てのＣＤＲでは、これはヒトフレームワーク配列の選択によって行われた。加えて、可能であれば、普通でないシステインまたはプロリン残基を有するフレームワークを排除した。重鎖および軽鎖配列についてはこれらの計算を別々に実施した。最後に、最良にマッチする配列におけるフレームワーク領域全体での個別配列の相違を比較した。上記比較計算結果に最良にフィットするヒト抗体のうち、抗体ＡＹ０５０７０７およびＡＪ００２７７３を、軽鎖および重鎖それぞれについて最も適したヒトフレームワークとして選択した。ＡＹ０５０７０７フレームワークは、van den Brink らによって記載されており(Blood, 15 April 2002, Vol. 99, No. 8, pp 2828-2834)、その配列は Genbank を介して入手可能である(受入番号 AY050707; Homo sapiens clone WR3VL immunoglobulin light chain variable region mRNA, partial cds; 2001年11月13日提出, 最新の改訂は2002年4月8日)。同様に、ＡＪ００２７７３抗体フレームワークは Snow らによって記載されており[Eur. J. Immunol. 28 (10), 3354-3361 (1998)]、その配列は Genbank を介して入手可能である(受入番号 AJ002772; Homo sapiens mRNA for variable region 5 of immunoglobulin G4 heavy chain patient 2,2; 1998年11月6日提出, 最新の改訂は2006年10月16日)。AY050707(軽鎖)およびAJ002773(重鎖)の配列の両者とも、ヒトおよび他の脊椎動物種の免疫グロブリン(IG)および T 細胞受容体(TR)のヌクレオチド配列の総合データベースである IMGT/LIGM においても見出される。このデータベースは、Marie-Paule Lefranc, LIGM, Montpellier, France によって1989年に作成され、1995年7月以降、オンラインで利用可能となっている。

ＬＴ１００２Ｖ_ＬのＫａｂａｔＣＤＲ１、２および３を、ＡＹ０５０７０７のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることによりヒト化軽鎖を得た。ＡＹ０５０７０７に最も近い生殖細胞遺伝子はＬ１１であり、このリーダー配列をヒト化軽鎖構築物に組み込んだ。ｐＡＴＨ３００（ＬＴ１００２軽鎖）のタンパク質配列は、表４に示される。Ｖ_Ｌの場合では、４つの非保存バーニア位置４位、３６位、４９位、６４位はＣＤＲループの構造の支持に関与するため、ネズミ残基の逆突然変異のためにそれらの位置を選択した。ＬＴ１００２の分子モデルの検討により、Ｔｙｒ６７がＣＤＲ表面に近く、抗原結合面に向かって配向しており、Ｓ１Ｐと相互作用することができる示唆された。そのため、後のヒト化型にＳ６７Ｙ逆突然変異も追加した。２つの突然変異を別々に導入して、Ｙ４９ＳまたはＹ３６Ｆのいずれかを含む２つの型を作製した。次の突然変異組合せを用いていくつかの型を作出した：（Ｙ４９Ｓ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）。

ｅ．ヒト化リード候補の最適化
ネズミ抗Ｓ１Ｐ抗体は、重鎖のＣＤＲ２内に遊離システイン残基（Ｃｙｓ５０）を含み、この残基は抗体分子を多少不安定にさせる可能性があった。部位特異的突然変異誘発を用いて、システイン残基を、アラニン（ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_３）（ｐＡＴＨ２０７）、グリシン（ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_３）、セリン（ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＳｅｒ}ＬＣ_３）およびフェニルアラニン（ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＰｈｅ}ＬＣ_３）と置換することによりｐＡＴＨ２０１変異体を作出した。また、システイン変異株の重鎖を、５つの逆突然変異を含むヒト化軽鎖（ｐＡＴＨ３０８）（ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_５＝ＬＴ１００９）を用いて試験した。これらの変異体を哺乳類細胞で発現させた後、in vitroアッセイのパネルで特性解析した。重要なことには、ヒト化変異体の発現率はｃｈＭＡｂＳ１Ｐの場合よりも著しく高かった。

ｉｉｉ．安定性ヒト化変異体を高温でのチャレンジ後の安定性について試験した。各ヒト化変異体について、上清を６０〜７４℃の範囲の温度に供することによって熱変性転移の近似中心点（Ｔ_Ｍ）を決定した。これらの温度は、幅広い範囲の温度の間５０〜８０℃間での温度刺激の後にネズミ抗体分子で見られた変性プロフィールに基づいて選択した。各変異体の結合特性を温度刺激の前後に決定した。ネズミ抗体はＴ_Ｍ６５℃を示した。変異体ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_５（ＬＴ１００９）は、他の全ての変異体と比較して、優れたＴ_Ｍを示した。表６ではリードヒト化候補とそれらの特性を示している。

表６：リードヒト化Ｓ１ＰｍＡｂ候補と特性
重鎖および軽鎖中の突然変異の数を示している。種類欄に重鎖および軽鎖の識別を記載する。

ｉｖ．配列
天然に存在する抗体と同様に、ＬＴ１００９は、１抗体分子に含まれる２つの軽鎖ポリペプチドそれぞれと２つの重鎖ポリペプチドそれぞれに３つの相補性決定領域（それぞれ「ＣＤＲ」）を含む。これらの６つのＣＤＲそれぞれのアミノ酸配列を直下に記載する（「ＶＬ」は免疫グロブリン軽鎖の可変領域を示し、一方「ＶＨ」は免疫グロブリン重鎖の可変領域を示す）：
ＣＤＲ１ＶＬ：ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ［配列番号１０］
ＣＤＲ２ＶＬ：ＥＧＮＩＬＲＰ［配列番号１１］
ＣＤＲ３ＶＬ：ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ［配列番号１２］
ＣＤＲ１ＶＨ：ＤＨＴＩＨ［配列番号１３］
ＣＤＲ３ＶＨ：ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ［配列番号１５］
ＣＤＲ２ＶＨ：ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ［配列番号１８］

ＬＴ１００９の重鎖および軽鎖ポリペプチドについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を直下に記載する：
LT1009 HC 可変ドメインのアミノ酸配列［配列番号１９］：

LT1009 LC可変ドメインのアミノ酸配列［配列番号２０］：

重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする対応するヌクレオチド配列を直下に示す。リーダー配列(Lonza社の GS 発現ベクターからの)には下線が引かれており; 該リーダーに先行する配列は、HindIII 切断部位(aagctt) および翻訳過程の開始において主要な役割を果たす Kozak コンセンサス配列(gccgccacc)であり; CDR は太字で示される:

LT1009 HC可変ドメインのヌクレオチド配列［配列番号２１］：

LT1009 LC可変ドメインのヌクレオチド配列［配列番号２２］：

LT1009 の完全長 HC ヌクレオチド(cDNA)配列（配列番号２３）; CDR は太字で示され、リーダー領域に下線が引かれており、ヒンジ領域はイタリック体である。リーダーに先行する配列は、HindIII 切断部位(aagctt) および Kozak 配列(gccgccacc)である:

リーダー(下線付き)を有し、ヒンジ領域を有さない LT1009 HCアミノ酸配列。CDR は太字で示される。［配列番号２４］：

LT1009 LC 完全長ヌクレオチド配列［配列番号２５］；リーダーに下線が引かれ、CDR が太字で示される; リーダーに先行する配列は、HindIII 切断部位(aagctt) および Kozak 配列(gccgccacc)である：

下線付きのリーダーおよび太字の CDR を有する、LT1009 LCアミノ酸配列［配列番号２６］：

リーダー配列を有さない（かつ、先行するヌクレアーゼ切断部位および Kozak 配列を有さない）LT1009 重鎖および軽鎖の配列は、以下の通りである。CDR は太字で示される。

LT1009 HC の可変ドメインのアミノ酸配列 [配列番号２７]:

該可変ドメインをコードする、対応する LT1009 HC のヌクレオチド配列 [配列番号２８]:

LT1009 LC の可変ドメインのアミノ酸配列 [配列番号２９]:

該可変ドメインをコードする、対応する LT1009 LC のヌクレオチド配列 [配列番号３０]

リーダーを有さない完全長の LT1009 重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである(CDR は太字で示される):

リーダーを有さず（かつ、先行するヌクレアーゼ切断部位および Kozak 配列を有さず）、かつ、ヒンジ（下線）を含む、LT1009 の完全長重鎖アミノ酸配列。（配列番号３１）

リーダーを有さない LT1009 の完全長軽鎖アミノ酸配列。[配列番号３２]:

対応するヌクレオチド配列（リーダーまたは先行するヌクレアーゼもしくは Kozak 部位を有さない）は、以下の通りである。遺伝コードの縮重のため、代替のヌクレオチド配列もまた、事実上あらゆる所与のアミノ酸配列をコードし得ることが理解される。

LT1009 の完全長重鎖ヌクレオチド(cDNA)配列 [配列番号３３]:

LT1009 の完全長軽鎖ヌクレオチド配列 [配列番号３４]:

LT1009 の重鎖上の C 末端リジンは、成熟した重鎖タンパク質上に常に存在するわけではない。
LT1009 重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、タンパク質の最後の(最も C 末端側の)アミノ酸残基としてリジンを示しているが、例えば CHO 細胞クローン LH1 275 において発現する場合、LT1009 は C 末端リジンを含まない。この事はペプチドマッピングによって示され、理論に束縛されることなく、哺乳類の系におけるタンパク質の翻訳後修飾の結果として生じると考えられる。また、理論に束縛されることなく、他の発現系、特に非哺乳類の系においては、成熟した LT1009 重鎖上に C 末端リジンが存在すると考えられる。

CHO 細胞において発現する LT1009 重鎖のアミノ酸配列（即ち、リーダーを有さず、かつ、C 末端リジンを有さない）を以下に示す（CDR は太字で示され、ヒンジはイタリック体で示される）[配列番号３５]:

このアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列の例を、以下に配列番号３６として示す。遺伝コードの縮重により、複数のヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードし得ることが理解され、そのため、アミノ酸配列をコードするものとして本明細書に示されるこれらのおよび他のヌクレオチド配列は、例示を目的とするものであると認められる。CDR は太字で示され、ヒンジ領域はイタリック体で示される:

ヒト化可変ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）をLonza社のＧＳ遺伝子発現系にクローニングして、プラスミドｐＡＴＨ１００９を作製した。該Lonza社のＧＳ発現系は、抗体遺伝子の定常ドメインを有する発現ベクターと、選択マーカーであるグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）とからなる。ＧＳは、グルタミン酸とアンモニアからのグルタミン生合成に関与する酵素である。抗体遺伝子と選択マーカーの両方を有するベクターを、細胞が外因性グルタミンなしに生存するのに十分なグルタミンを供給した無血清培地中での増殖に適したプロプライエタリーチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞系統（ＣＨＯＫ１ＳＶ）にトランスフェクトする。加えて、ベクターによって提供されるＧＳ活性を有する細胞系統だけが生存し得るように内因性ＧＳの活性を阻害するために、この培地に特異的ＧＳ阻害剤であるメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を添加する。その結果得られる、ｐＡＴＨ１００９を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系統をＬＨ１と命名する。
上記の実施例に記載される天然の生殖系列遺伝子のリーダー配列が、プラスミドｐＡＴＨ１００９を作成するために用いられるＧＳ発現ベクター骨格中のリーダー配列によって置換されることに注意すべきである。後者のリーダー配列は、ＬＴ１００９重鎖（配列番号１９および２４）の N 末端における“mewswv”で始まる 19 個のアミノ酸として見出すことができ、LC のリーダーは、“msvpt”で始まる 20 個のアミノ酸（配列番号２０および２６の N 末端に示される）である。
トランスフェクトされたＣＨＯＬＨ１細胞を、ＭＳＸの存在下でグルタミンフリー培地中で増殖するそれらの能力について選択し、分離株（クローン）を活性ＬＴ１００９の高レベル分泌について選択した。ＬＨ１２７５とは、ＬＴ１００９抗体生産物の全てのロットの生産のためのマスター細胞バンク(Master Cell Bank)(MCB)の作成のために選択された、ｐＡＴＨ１００９ベクターを含むＬＨ１ＣＨＯ細胞系統のリードクローンに与えられた名称である。こうして、毒性学および臨床開発に毒性学研究および臨床開発のための材料がもたらされた。

ＡＴＣＣ寄託：ｐＡＴＨ１００９プラスミドを含む大腸菌ＳｔＢ１２は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号ＰＴＡ−８４２１）。ｐＡＴＨ１００９ベクターを含むＣＨＯ細胞系統ＬＨ１２７５もＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号ＰＴＡ−８４２２）。ＡＴＣＣは、10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 に所在する。

カスパーゼ−３活性化は、Ｓ１Ｐの存在下で抗Ｓ１ＰｍＡｂを加えることによって増加し、この抗体によるＳ１Ｐの選択的吸収によってＳ１Ｐの保護的抗アポトーシス作用が除かれることが示唆された。ヒト化抗体変異体、ｈｕＭＡｂＨＣＬＣ_３（ＬＴ１００４）およびｈｕＭＡｂＨＣＬＣ_５（ＬＴ１００６）の両方が、ＬＴ１００２と比較して優れた活性を示した。同時に、全ての変異体を、癌細胞からのＳ１Ｐ誘発性サイトカイン放出に対するそれらの作用について試験した。Ｓ１Ｐは、癌細胞からの細胞馴化培地への著しいＩＬ−８放出を引き起こすことが分かっている。マウス対照抗Ｓ１ＰｍＡｂを加えることによって卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出が濃度依存的に減少した。２つのヒト化変異体ｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_３（ＬＴ１００７）およびｈｕＭＡｂＨＣ_{ＣｙｓＡｌａ}ＬＣ_５（ＬＴ１００９）は、ＨｕＭＡｂＨＣＬＣ_３（ＬＴ１００４）およびｈｕＭＡｂＨＣＬＣ_５（ＬＴ１００６）よりも大きなＩＬ−８放出の減少を示した。

虚血性および炎症性網膜症モデルでは、これまでに、抗Ｓ１Ｐ抗体での処置後にマクロファージ浸潤の５５％阻害が示されている。これらのデータは十分に確立されたネズミ酸素誘発性網膜症モデル（未熟児網膜症（ＲＯＰ）モデルとしても知られている）を用いて得られた。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを生後７日に７５％酸素中に置き、生後１２日に大気に戻し、片側の眼に３μｇのヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体（ＬＴ１００９、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））の、他側の眼にビヒクルの眼内圧注射を行った。これらのマウスに生後１７日目にＦ４／８０（汎マクロファージマーカー）に対するＦＩＴＣ標識抗体の眼内圧注射を行い、８時間後に、マウスを安楽死させた。眼球を摘出し、ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に室温で５時間固定した。網膜を切開し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、全てを装着した。Nikon社製蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察し、網膜マクロファージを定量した。これらの結果を下記の表７に示す。

Claims

スフィンゴシン−１−リン酸（S1P）のレベル上昇に関連する眼の疾患または障害の処置または予防のための、生理的条件下でS1Pに対して反応性の免疫誘導部分である抗S1P剤を含む医薬組成物。
S1Pのレベルの上昇に関連する眼の疾患または障害が、加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、角膜移植拒絶反応、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、特発性ポリープ状脈絡膜血管障害、虚血性網膜症、レーザー損傷、網膜静脈閉塞性疾患、血管新生緑内障、黄斑パッカー、セロファン網膜症、ＥＲＭ形成、コンタクトレンズの過剰装着、牽引性網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、外傷性眼損傷、眼の瘢痕性類天疱瘡、眼ヒストプラスマ症、網膜血管腫増殖、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮剥離症、翼状片、角膜の感染症、および眼手術の影響からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
角膜の感染症が、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、および原虫感染症からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
眼手術が、屈折矯正手術、硝子体茎切除術および緑内障手術からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
S1Pのレベルの上昇に関連する眼の疾患または障害が、異常な新血管形成、異常な線維成長、線維症、瘢痕化および／または炎症によって少なくとも部分的に特徴付けられるものである、請求項２に記載の医薬組成物。
全身、眼内または局所で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
加齢性黄斑変性症が、乾燥型加齢黄斑変性症である、請求項２に記載の医薬組成物。
加齢性黄斑変性症が、湿潤型加齢黄斑変性症である、請求項２に記載の医薬組成物。
眼投与用組成物であって、担体、および生理的条件下でスフィンゴシン−１−リン酸（S1P）に対して特異的に反応し、かつ、DHTIH (配列番号: 13), AISPRHDITKYNEMFRG (配列番号: 18), GGFYGSTIWFDF (配列番号: 15), ITTTDIDDDMN (配列番号: 10), EGNILRP (SEQ ID NO: 11)および LQSDNLPFT (配列番号: 12)からなる群から選択されるペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲペプチドを含む単離された抗S1P剤を含む、組成物。
少なくとも１つのＣＤＲペプチドの配列同一性が、DHTIH (配列番号: 13), AISPRHDITKYNEMFRG (配列番号: 18), GGFYGSTIWFDF (配列番号: 15), ITTTDIDDDMN (配列番号: 10), EGNILRP (SEQ ID NO: 11)および LQSDNLPFT (配列番号: 12)からなる群から選択されるペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％および少なくとも９５％からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
抗Ｓ１Ｐ剤が、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体および抗体由来でない分子からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
抗Ｓ１Ｐ剤が、親和性が成熟した抗体であってもよい完全長抗体である、請求項１１に記載の組成物。
抗Ｓ１Ｐ剤が、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖から構成され、それぞれの免疫グロブリン重鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ、それぞれの免疫グロブリン軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖から構成され、それぞれの免疫グロブリン重鎖が配列番号３１のアミノ酸配列を含み、かつ、それぞれの免疫グロブリン軽鎖が配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
担体が、眼投与に適した医薬的に許容される得る担体である、請求項９に記載の組成物。
リン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項９に記載の組成物。
担体、および精製された抗S1P抗体またはそのフラグメントを含む抗S1P剤を含む眼投与用の組成物であって、抗体またはそのフラグメントのそれぞれの免疫グロブリン重鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含み、かつ、抗体またはそのフラグメントのそれぞれの免疫グロブリン軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む、組成物。
担体が、眼投与に適した医薬的に許容され得る担体である、請求項１８に記載の組成物。
リン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項１９に記載の組成物。