KR20220069076A - 항-nrp1a 항체와 안구 또는 안구 질환 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뉴로필린-1의 A 도메인 (Nrp1A)을 표적화하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항-Nrp1A 항체 및 다양한 질환 또는 장애의 치료를 위한 사용 방법이 개시된다.
Description
본 발명은 일반적으로 뉴로필린 1 (Neuropilin 1: Nrp1), 보다 정확하게는 Nrp1의 A 도메인 (Nrp1A)을 표적화하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항-Nrp1A 항체 및 다양한 질환 또는 장애의 치료를 위한 사용 방법이 개시된다. 상기 항-Nrp1A 항체를 포함하는 약제학적 조성물도 또한 개시된다.
당뇨병성 망막병증은 당뇨병의 가장 쇠약성 합병증 중 하나이다. 이러한 질환의 발병 기전과 현재 요법의 효능을 이해하는데 큰 진전이 있었음에도 불구하고, 당뇨병성 망막병증은 노동 연령 인구에서 새로 발병하는 실명의 주요 원인으로 남아 있다.
당뇨병성 망막병증은 혈관, 아교 세포 및 뉴런 수준에서 발생하는 비정상의 진행을 특징으로 한다. 혈관 합병증 중 하나는 망막 허혈을 초래하는 작은 모세 혈관의 손실이다. 허혈성 망막병증은 혈류 감소 및 저산소 상태를 초래하는 망막 혈관계의 손실 또는 기능 장애를 특징으로 한다. 모세 혈관 소실은 종종 중심와 무혈관 구역 (foveal avascular zone: FAZ) 주변에 나타나서 당뇨병성 황반 허혈 (diabetic macular ischemia: DMI)로 호칭되는 병태로 이의 크기를 확장시킨다. 망막의 허혈은 혈관 형성 촉진 성장 인자와 혈관 반발 인자 (vasorepulsion factor)의 상향 조절을 동시에 유발하는데, 이는 혈관 형성의 잘못된 방향을 초래한다. 허혈성 망막의 재생 혈관 형성은 일어나지 않는 반면, 일반적으로 혈관이 없는 안구의 영역인 유리체 내로의 강력한 병리학적 신생 혈관 형성이 있다. 증식성 망막병증에서 이러한 비정상적인 새로운 혈관의 성장은 시력에 대한 위협의 대부분을 만드는데, 이는 이들이 누출되거나 출혈로 이어지거나 망막 박리로 끝날 수 있는 흉터로 이어질 수 있기 때문이다. 증식성 망막병증에 대한 현재 치료는 기존의 병리학적 혈관을 파괴하려고 시도하지만 이의 성장을 유발하는 근본적인 허혈을 다루지 않는다. 현재, 증식성 망막병증의 표준 치료는 새로운 혈관 성장을 정지시키고 중심 시력을 보존하려는 시도로 레이저로 망막의 일부에 대한 파괴를 포함한다. 그러나, 이러한 치료는 어느 정도 비효율적이다. 일부 환자는 수년 동안 안정적인 시력을 유지할 수 있지만, 망막병증을 앓고 있는 환자의 높은 비율은 결국 완전한 시력 상실로 고통받는다.
망막병증은 또한 망막 혈관 누출을 증가시켜 황반 부종을 초래하는 것을 특징으로 할 수 있다. 현재, 당뇨병성 황반 부종을 앓고 있는 환자는 혈관 형성과 혈관 투과성을 모두 유발하는 성장 인자인 혈관 내피 성장 인자 A (vascular endothelial growth factor A: VEGF-A)를 표적화하는 화합물로 치료된다. 이러한 치료학적 전략은 황반 허혈과 황반 부종을 모두 앓고 있는 환자를 치료하는데 불충분한 것으로 판명될 수 있다.
따라서, 특히 황반 허혈과 황반 부종을 모두 앓고 있는 환자에서 VEGF-A의 혈관 형성 촉진 특성으로부터 이익을 얻을 수 있는 환자를 치료하기 위한 치료학적 접근이 여전히 필요하다. 결과적으로, 안구 또는 망막 질환을 효율적으로 치료하기 위한 새로운 치료학적 접근법에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 존재한다.
발명의 개요
뉴로필린 (NRP)은 축삭 유도 인자의 클래스-3 세마포린 계열 (SEMA)의 구성원 및 혈관 형성 인자의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 계열의 구성원에 대한 수용체로서 뉴런 및 혈관 시스템의 발달에 중요한 역할을 하는 막 관통 당단백질 수용체이다. 2개의 뉴로필린 단백질인 뉴로필린-1 (Nrp-1)과 뉴로필린-2 (Nrp-2)가 확인되었다. 이들의 세포외 영역은 다음 3가지 도메인을 포함한다: Sema3 리간드 결합 도메인으로서의 2개의 CUB 상동성 도메인 (본 출원에서 "Nrp1A"로도 또한 지칭되는 Nrp1의 A 도메인), VEGF 결합 도메인으로서의 2개의 응고 인자 V/VIII 상동성 도메인 (본 출원에서 "Nrp1B"로도 또한 지칭되는 Nrp1의 B 도메인), 및 Nrp-1 이량체화에 관여하는 MAM 도메인 (c). Nrp-1은 VEGF-A165, VEGF-B, VEGF-E, PlGF, Sema3A, Sema3B 및 Sema3C에 결합할 수 있는 반면, Nrp2는 VEGF-A165, VEGF-A145, VEGF-C, VEGF-D, SEMA3B, Sema3C, Sema3F 및 Sema3G에 결합한다. VEGF 리간드에 대한 결합 부위는 Nrp1의 B 도메인에 국한되어 있는 반면, 세마포린의 결합은 Nrp1의 A 도메인에 국한되어 있다.
사람 Nrp1의 서열은 온라인에서 이용 가능하고, Nrp1 이소타입 A 전구체는 서열 번호 26에 표시되어 있으며, 참조 단백질 서열 NP_003864로 이용 가능하다. Nrp1은 수년 동안 종양 혈관 형성 및 전이에서 연구되었지만, 망막 재생 혈관 형성 및 신생 혈관 형성에 대한 이의 효과는 완전히 이해되지 않았다. 본 발명자들은 본 출원에서 Nrp1, 특히, Nrp1의 A 도메인을 표적화하는 것이 안구 및 망막 질환을 치료하기 위한 매우 효과적인 전략이다는 것을 밝혀냈다.
제1 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며;
여기서,
- 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1), 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2) 및 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하고;
- 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1), 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2) 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함한다.
더 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
a. 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
b. 서열 번호 12 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
c. 서열 번호 13 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
d. 서열 번호 14 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
e. 서열 번호 15 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
f. 서열 번호 16 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄; 또는
g. 서열 번호 17 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄.
더 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 중쇄; 및
- 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 경쇄.
특별한 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
a. 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
b. 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
c. 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
d. 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
e. 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
f. 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
g. 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 항-Nrp1A 항체는 사람화 항-Nrp1A 항체이다.
제2 양태에서, 본 발명은 서열 번호 26에 표시된 바와 같은 사람 Nrp1의 68~77번 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 영역에 결합하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 Sema3A의 혈관 반발 효과를 억제하고/하거나 망막의 재생 혈관 형성을 개선하기 위한 항-Nrp1A 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 추가의 실시 형태에서, 본 발명은 Sema3A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 (blood retinal barrier: BRB)의 투과성을 억제하고 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 억제하기 위한 항-Nrp1A 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
더 추가의 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 위한 항-Nrp1A 또는 항원 결합 단편을 제공한다:
- 망막의 재생 혈관 형성을 개선하기 위해 허혈성 영역으로 혈관 형성을 재지시하는 것;
- 유리체 영역의 병리학적 신생 혈관 형성을 방지하는 것;
- Sema3A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지하는 것; 및
- VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지하는 것.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 망막 또는 안구 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 약제학적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에 따라 투여하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 망막 또는 안구 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 망막병증, 미숙아 망막병증과 같은 증식성 망막병증 (proliferative retinopathy: PR), 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 (proliferative diabetic retinopathy: PDR) 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy: DR), 당뇨병성 황반 부종 (diabetic macular edema: DME), 당뇨병성 황반 허혈 (diabetic macular ischemia: DMI), 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 정맥 폐색, 망막 동맥 폐색, 안구내염, 포도막염, 낭포 황반 부종, 임의의 망막 질환에 이은 맥락막 신생 혈관 막 질환, 시신경 병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유발성 망막 혈관병증, 망막 신생 혈관 형성, 결절성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세 동맥류, 푹스 이영양증 (Fuch's dystrophy), 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군 및 스타가르트병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신생 혈관 형성, 녹내장 및 맥락막 신생 혈관 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 바람직하게, 상기 질환은 당뇨병성 황반 부종 및/또는 당뇨병성 황반 허혈이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 허혈성 망막 내의 혈관 재생 (재생 혈관 형성)을 촉진하고 안구의 유리체 영역의 병리학적 신생 혈관 형성을 감소시킴으로써 당뇨병성 황반 허혈의 치료에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체는 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 형성을 억제하지 않는다.
또 다른 바람직한 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 Sema3A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시키고, 바람직하게는 방지하고, VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소, 바람직하게는 방지함으로써 당뇨병 황반 부종의 치료에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비경구 경로, 정맥내 경로, 유리체내 경로 또는 피하 투여 경로, 바람직하게는 유리체내 경로에 의해 투여된다.
제6 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및
- 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법은 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1 : 사람 안구에서 Sema3A의 국부화
본 도면은 연령 일치 대조군 (연령 대조군) 및 당뇨병이 있지만 안구 병리가 없는 대상체 (DM 대조군)와 비교하여 당뇨병성 망막병증 또는 원발성 개방각 녹내장 (primary open angle glaucoma: POAG)의 병력을 갖는 사람 공여자 유래의 사전 지정된 망막 샘플의 사람 안구에서 Sema3A의 국부화를 도시한 것이다. Sema3A는 망막 혈관의 혈관벽에서 발견되었다. 또한, 미확인된 독특한 Sema3A 형광 물체가 망막 신경절 세포층에서 관찰되었다.
도 2 : VEGF 매개성 효과의 억제 - 브라운 노르웨이 래트의 망막에서 VEGF-A 유도된 투과성
망막의 에반스 청색 (Evans Blue) 형광은 혈관 누출을 평가하기 위해 투과성에 대한 판독값으로서 사용된다. VEGF-A의 유리체내 주사는 망막의 과투과성을 유도한다. Nrp1의 A 도메인에 결합하는 본 발명의 항체는 VEGF 트랩 (애플리버셉트)과 유사하게 VEGF-A 유도된 망막 투과성을 억제한다. Nrp1 리간드 세마포린 3A에 대해 지시된 항체 (Sema3A 항체)는 망막에서 VEGF-A 유도된 투과성을 억제하지 않는다.
도 3 : 마우스 OIR 모델에서 정단 세포 밀도, 무혈관 부위 및 망막전 다발에 대한 본 발명의 항체 및 항-VEGF 처리의 효과
정단 세포 밀도, 무혈관 부위 및 망막전 신생 혈관 형성 (다발)을 새끼 마우스의 산소 유도된 망막병증 모델에서 조사하였다. 동물을 P7에서 P12까지 75% 산소에 노출시키고, P12에서 정상 산소 상태로 복귀한 후 항체의 단일 유리체내 주사를 투여하였다. 대조군 항체는 트리니트로페놀에 대해 표적화된다. P17에서, 망막의 평면 표본 (flatmount)을 준비하고, 이소렉틴 B4로 염색하고, 정단 세포의 계수 및 망막의 무혈관 부위의 크기 결정에 사용하였다. Nrp1의 A 도메인에 결합하는 본 발명의 항체는 정단 세포 밀도를 증가시키고 무혈관 부위를 감소시키는 반면, VEGF 트랩 애플리버셉트는 그렇지 않다 (도 3a, 3c). 정단 세포 밀도와 무혈관 부위 사이의 상관 관계는 (도 3b)에 도시되어 있다. 반대쪽 안구를 아이컵의 조직학적 절편에 사용하고, 망막전 핵을 계수하였다. 망막전 신생 혈관 형성은 본 발명의 항체에 의해서 보다 애플리버셉트에 의해서 더 강하게 억제되었다 (도 3d).
도 4 : VEGF 및 Nrp1에 대한 본 발명의 항체의 결합
비오티닐화된 사람 혈관 내피 세포 성장 인자-165 (hVEGF165)의 존재하의 사람 Nrp1 (hNrp1)에 대한 본 발명의 항체의 결합을 생물층 간섭법 (Bio-Layer Interferometry: BLI)을 사용하여 완료하였다. 비오틴화된 hVEGF165를 10 ug/ml 비오틴 hNFAM1 (또는 완충제)을 사용하여 스트렙타비딘 센서 팁 상에서 포획하였다 (도 4의 A 지점). 센서 팁을 세척한 후, 100 nM의 사람 Nrp1을 VEGF165를 통해 포획하였다 (도 4의 B 지점). 마지막으로, 센서를 다양한 농도의 본 발명의 항체 (100 nM 및 400 nM)에 침지하여 결합이 관찰되는지 여부를 확인하였다 (도 4의 C 지점). 상기 도면은 hNrp1이 비오틴화된 hVEGF165에 결합되었다는 것을 확인시켜 준다. 상기 도면은, 이러한 상호 작용 후, 본 발명의 항체가 hVEGF165에 동시에 결합되는 동안에도 hNrp1에 여전히 결합할 수 있다는 것을 추가로 나타낸다. 이는 본 발명의 항체가 VEGF와 사람 Nrp1의 결합을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 5: VEGF-A 유도된 내피 세포 증식
Incucyte 시스템 (Sartorius)을 사용하여 내피 세포 증식을 사람 망막 미세 혈관 내피 세포 (human retinal microvascular endothelial cell: HRMEC)에서 조사하였다. 본 기능성 검정에서, HRMEC의 덜 합류된 (subconfluent) 층에 대한 재조합 VEGF-A 단백질의 첨가는 이의 증식을 유도한다. 본 발명의 항체는 VEGF-A에 의해 유도된 내피 세포 증식을 방지하지 않는 반면, VEGF 트랩 애플리버셉트 (아일리아®)는 VEGF-A 유도된 HRMEC 증식의 용량 의존적 감소를 나타낸다.
도 6: VEGF-A 유도된 내피 네트워크 형성 검정
시험관내 혈관 형성을 내피/섬유 아세포 공동 배양에서 네트워크 형성 검정으로 평가하였다. 본 기능성 검정에서, VEGF-A는 섬유 아세포의 합류된 층 위에 내피 네트워크의 형성을 유도한다. 본 발명의 예시적인 항체 및 VEGF 트랩 (베바시주맙, 아바스틴®)의 효능 및 역가 (IC50)를 평가하여 10 ng/mL VEGF-A 유도된 네트워크 형성을 방지하였다. 본 발명의 항체는 VEGF-A에 의해 유도된 내피 네트워크 형성을 방지하지 않는 반면, VEGF 트랩 (베바시주맙, 아바스틴®)은 VEGF-A 유도된 네트워크 형성의 용량 의존적 감소를 나타낸다.
도 7: 안구 레이저 광응고 후 브라운 노르웨이 래트에서 맥락막 신생 혈관 병변의 부위
동물은 1 일차 및 8 일차에 IgG 대조군 항체(109 μg/안구), 본 발명의 항체 (저용량 54.5 mg/안구, 고용량 109 mg/안구) 또는 VEGF 트랩 아일리아® (200 mg/안구)의 유리체내 주사를 2회 투여받았다. 레이저 광응고를 제1 유리체내 주사 직전 1 일차에 수행하였다. 병변 부위를 RPE/맥락막/공막 평면 표본의 이소렉틴 B4 염색에 의해 15 일차에 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 비대응 양측 t 검정 (****, p < 0.0001)에 의해 수행되었다.
본 도면은 연령 일치 대조군 (연령 대조군) 및 당뇨병이 있지만 안구 병리가 없는 대상체 (DM 대조군)와 비교하여 당뇨병성 망막병증 또는 원발성 개방각 녹내장 (primary open angle glaucoma: POAG)의 병력을 갖는 사람 공여자 유래의 사전 지정된 망막 샘플의 사람 안구에서 Sema3A의 국부화를 도시한 것이다. Sema3A는 망막 혈관의 혈관벽에서 발견되었다. 또한, 미확인된 독특한 Sema3A 형광 물체가 망막 신경절 세포층에서 관찰되었다.
도 2 : VEGF 매개성 효과의 억제 - 브라운 노르웨이 래트의 망막에서 VEGF-A 유도된 투과성
망막의 에반스 청색 (Evans Blue) 형광은 혈관 누출을 평가하기 위해 투과성에 대한 판독값으로서 사용된다. VEGF-A의 유리체내 주사는 망막의 과투과성을 유도한다. Nrp1의 A 도메인에 결합하는 본 발명의 항체는 VEGF 트랩 (애플리버셉트)과 유사하게 VEGF-A 유도된 망막 투과성을 억제한다. Nrp1 리간드 세마포린 3A에 대해 지시된 항체 (Sema3A 항체)는 망막에서 VEGF-A 유도된 투과성을 억제하지 않는다.
도 3 : 마우스 OIR 모델에서 정단 세포 밀도, 무혈관 부위 및 망막전 다발에 대한 본 발명의 항체 및 항-VEGF 처리의 효과
정단 세포 밀도, 무혈관 부위 및 망막전 신생 혈관 형성 (다발)을 새끼 마우스의 산소 유도된 망막병증 모델에서 조사하였다. 동물을 P7에서 P12까지 75% 산소에 노출시키고, P12에서 정상 산소 상태로 복귀한 후 항체의 단일 유리체내 주사를 투여하였다. 대조군 항체는 트리니트로페놀에 대해 표적화된다. P17에서, 망막의 평면 표본 (flatmount)을 준비하고, 이소렉틴 B4로 염색하고, 정단 세포의 계수 및 망막의 무혈관 부위의 크기 결정에 사용하였다. Nrp1의 A 도메인에 결합하는 본 발명의 항체는 정단 세포 밀도를 증가시키고 무혈관 부위를 감소시키는 반면, VEGF 트랩 애플리버셉트는 그렇지 않다 (도 3a, 3c). 정단 세포 밀도와 무혈관 부위 사이의 상관 관계는 (도 3b)에 도시되어 있다. 반대쪽 안구를 아이컵의 조직학적 절편에 사용하고, 망막전 핵을 계수하였다. 망막전 신생 혈관 형성은 본 발명의 항체에 의해서 보다 애플리버셉트에 의해서 더 강하게 억제되었다 (도 3d).
도 4 : VEGF 및 Nrp1에 대한 본 발명의 항체의 결합
비오티닐화된 사람 혈관 내피 세포 성장 인자-165 (hVEGF165)의 존재하의 사람 Nrp1 (hNrp1)에 대한 본 발명의 항체의 결합을 생물층 간섭법 (Bio-Layer Interferometry: BLI)을 사용하여 완료하였다. 비오틴화된 hVEGF165를 10 ug/ml 비오틴 hNFAM1 (또는 완충제)을 사용하여 스트렙타비딘 센서 팁 상에서 포획하였다 (도 4의 A 지점). 센서 팁을 세척한 후, 100 nM의 사람 Nrp1을 VEGF165를 통해 포획하였다 (도 4의 B 지점). 마지막으로, 센서를 다양한 농도의 본 발명의 항체 (100 nM 및 400 nM)에 침지하여 결합이 관찰되는지 여부를 확인하였다 (도 4의 C 지점). 상기 도면은 hNrp1이 비오틴화된 hVEGF165에 결합되었다는 것을 확인시켜 준다. 상기 도면은, 이러한 상호 작용 후, 본 발명의 항체가 hVEGF165에 동시에 결합되는 동안에도 hNrp1에 여전히 결합할 수 있다는 것을 추가로 나타낸다. 이는 본 발명의 항체가 VEGF와 사람 Nrp1의 결합을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 5: VEGF-A 유도된 내피 세포 증식
Incucyte 시스템 (Sartorius)을 사용하여 내피 세포 증식을 사람 망막 미세 혈관 내피 세포 (human retinal microvascular endothelial cell: HRMEC)에서 조사하였다. 본 기능성 검정에서, HRMEC의 덜 합류된 (subconfluent) 층에 대한 재조합 VEGF-A 단백질의 첨가는 이의 증식을 유도한다. 본 발명의 항체는 VEGF-A에 의해 유도된 내피 세포 증식을 방지하지 않는 반면, VEGF 트랩 애플리버셉트 (아일리아®)는 VEGF-A 유도된 HRMEC 증식의 용량 의존적 감소를 나타낸다.
도 6: VEGF-A 유도된 내피 네트워크 형성 검정
시험관내 혈관 형성을 내피/섬유 아세포 공동 배양에서 네트워크 형성 검정으로 평가하였다. 본 기능성 검정에서, VEGF-A는 섬유 아세포의 합류된 층 위에 내피 네트워크의 형성을 유도한다. 본 발명의 예시적인 항체 및 VEGF 트랩 (베바시주맙, 아바스틴®)의 효능 및 역가 (IC50)를 평가하여 10 ng/mL VEGF-A 유도된 네트워크 형성을 방지하였다. 본 발명의 항체는 VEGF-A에 의해 유도된 내피 네트워크 형성을 방지하지 않는 반면, VEGF 트랩 (베바시주맙, 아바스틴®)은 VEGF-A 유도된 네트워크 형성의 용량 의존적 감소를 나타낸다.
도 7: 안구 레이저 광응고 후 브라운 노르웨이 래트에서 맥락막 신생 혈관 병변의 부위
동물은 1 일차 및 8 일차에 IgG 대조군 항체(109 μg/안구), 본 발명의 항체 (저용량 54.5 mg/안구, 고용량 109 mg/안구) 또는 VEGF 트랩 아일리아® (200 mg/안구)의 유리체내 주사를 2회 투여받았다. 레이저 광응고를 제1 유리체내 주사 직전 1 일차에 수행하였다. 병변 부위를 RPE/맥락막/공막 평면 표본의 이소렉틴 B4 염색에 의해 15 일차에 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 비대응 양측 t 검정 (****, p < 0.0001)에 의해 수행되었다.
정의
항체 또는 면역글로불린의 일반화된 구조는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지되어 있으며, 이들 분자는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 전형적으로 약 150,000 달톤의 이종 사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 이황화 결합에 의해 중쇄에 공유적으로 연결되어 이종 이량체를 형성하고, 이종 삼량체 분자는 이종 이량체의 동일한 2개의 중쇄들 사이에 공유 이황화 결합을 통해 형성된다. 상기 경쇄와 중쇄가 하나의 이황화 결합으로 연결되어 있지만, 상기 2개의 중쇄들 사이의 이황화 결합 수는 면역글로불린 이소타입에 따라 달라진다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 이룬 쇄내 이황화 가교를 가지고 있다. 각 중쇄는 아미노 말단에 가변 도메인 (VH = 가변 중쇄), 그 뒤에 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4) 뿐만 아니라 CH1과 CH2 사이에 힌지 영역을 갖는다. 각 경쇄는 아미노 말단 가변 도메인 (VL = 가변 경쇄)과 카복시 말단 불변 도메인 (CL)의 2개의 도메인을 갖는다. 상기 VL 도메인은 상기 VH 도메인과 비공유적으로 연합하는 반면, 상기 CL 도메인은 일반적으로 이황화 결합을 통해 상기 CH1 도메인에 공유적으로 연결된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다 (문헌 [Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663]).
상기 가변 도메인들 내의 특정 도메인은 상이한 항체들 사이에서 광범위하게 상이하며, 즉, "초가변"이다. 이러한 초가변 도메인은 특이적 항원 결정 인자에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관여하는 잔기를 포함한다. 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 모두에서의 초가변은 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR) 또는 초가변 루프 (hypervariable loop: HVL)로서 공지된 3개의 분절에 집중되어 있다. CDR은 문헌 [Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]의 서열 비교에 의해 정의되는 반면, HVL은 문헌 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 의해 기재된 바와 같이 가변 도메인의 3차원 구조에 따라 구조적으로 정의된다. 이러한 2가지 방법이 CDR을 약간 상이한 식별을 초래하는 경우, 구조적 정의가 바람직하다. Kabat에 의해 정의된 바와 같이, CDR-L1은 경쇄 가변 도메인에서 약 24~34번 잔기에, CDR-L2는 약 50~56번 잔기에, CDR-L3은 약 89~97번 잔기에 위치하며; CDR-H1은 중쇄 가변 도메인에서 약 31~35번 잔기에, CDR-H2는 약 50~65번 잔기에, CDR-H3은 약 95~102번 잔기에 위치한다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 주어진 항체에 대해 특이적인 특유의 기능적 특성을 정의한다.
각 중쇄 및 경쇄 내의 3개의 CDR은 덜 가변적인 경향이 있는 서열을 함유하는 프레임워크 영역 (framework region: FR)에 의해 분리되어 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단에서 카복시 말단까지, FR 및 CDR은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된다. FR의 대부분 β-시트 배열 형태는 각 쇄 내의 CDR들을 다른 쇄 유래의 CDR들과 매우 근접하게 만들 뿐만 아니라 서로에 대해 매우 근접하게 만든다. 생성된 입체 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만 (문헌 [Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669] 참조), 모든 CDR 잔기가 항원 결합에 반드시 직접적으로 관여하는 것은 아니다.
FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 이펙터 기능을 매개한다. 일부 FR 잔기는 적어도 다음 3가지 방식에 의해 항원 결합에 중요한 영향을 미치는 것으로 생각된다: 에피토프에 직접 비공유적으로 결합함으로써, 하나 이상의 CDR 잔기와 상호 작용함으로써, 및 중쇄와 경쇄 사이의 계면에 영향을 미침으로써. 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포성 세포독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC), 보체 의존적 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity: CDC) 및 항체 의존적 세포성 식세포 작용 (antibody-dependent cellular phagocytosis: ADCP)에 대한 항체의 참여와 같은 다양한 Ig 이펙터 기능을 매개한다.
척추 동물 면역글로불린의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여 명확하게 구별되는 2개의 클래스인 카파 (κ)와 람다 (λ) 중 하나에 배정된다. 이에 비해, 포유 동물 면역글로불린의 중쇄는 불변 도메인의 서열에 따라 다음 5가지 주요 클래스 중 하나에 배정된다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. IgG 및 IgA는 하위 클래스 (이소타입), 예를 들어, 각각 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어 진다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 호칭된다. 본래의 면역글로불린 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배열 형태는 널리 공지되어 있다.
"항체", "항-Nrp1A 항체", "사람화 항-Nrp1A 항체" 및 "변이체 사람화 항-Nrp1A 항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 본 출원에서 사용되며, 구체적으로 단클론 항체 (전장 단클론 항체 포함), 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체) 및 항체 단편, 예를 들어, 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, Nrp1A에 대한 결합을 나타내는 항체의 가변 도메인 및 다른 부분을 포괄한다.
"단클론 항체" (mAb)라는 용어는 실질적으로 균질한 항체 집단의 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단의 각각의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이어서 단일 항원 결정 인자인 "에피토프"에 대해 지시된다. 따라서, 변경 유전자 (modifier) "단클론"은 동일한 에피토프에 대해 지시된 항체의 실질적으로 균질한 집단을 가리키며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법 (문헌 [Kohler et al., 1975, Nature 256: 495]), 또는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 US 4,816,567 참조), 또는 문헌 [Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리를 사용하여 재조합적으로 생산된 단클론의 분리 방법을 비롯한 당해 분야에 공지된 임의의 기술 또는 방법에 의해 제조될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
키메라 항체는 하나의 종 (예를 들어, 마우스와 같은 비사람 포유 동물) 유래의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 다른 종 (예를 들어, 사람) 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어지며, 제1 종 (예를 들어, 마우스) 유래의 항체의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 제2 종 (예를 들어, 사람) 유래의 항체의 불변 영역에 대한 DNA 서열에 연결하고 숙주를 연결된 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환하여 키메라 항체를 생산할 수 있도록 함으로써 수득될 수 있다. 대안으로, 상기 키메라 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 영역 또는 도메인이 또 다른 면역글로불린 클래스 또는 이소타입 유래 또는 공통 또는 생식 세포 서열 유래의 단클론 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동이거나 이의 변이체인 것일 수 있다. 키메라 항체는 이러한 항체의 단편을 포함할 수 있는데, 단, 상기 항체 단편은 모체 항체의 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, 동일한 에피토프에 대한 결합을 나타낸다 (예를 들어, 미국 특허 US 4,816,567 및 문헌 [Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855] 참조).
"항체 단편", "향원 결합 단편", "항-Nrp1A 항체 단편", "사람화 항-Nrp1A 항체 단편", "사람화 항-Nrp1A 항체 단편 ", "변이체 사람화 항-Nrp1A 항체 단편"이라는 용어는, 가변 영역 또는 기능적 능력, 예를 들어, 특이적 Nrp1A 에피토프 결합이 유지되는 전장 항-Nrp1A 항체의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 미니바디, 항체 단편으로부터 형성된 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 포함된다.
전장 항체는 유용한 항체 단편을 생성하기 위해 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리될 수 있다. 파파인 분해는 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 Fab 단편으로 호칭되는 2개의 동일한 항원 결합 항체 단편과 나머지 Fc 단편을 생성한다. 상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차 결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
Fab' 단편은 CH1 도메인의 C-말단에서 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 추가의 잔기의 존재에 의해 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결된 Fab' 단편의 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 공지되어 있다.
"Fv" 단편은 단단한 비공유 연합으로 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함한다. 이러한 배열 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호 작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 쇄 Fv 변이체이다. 단일 쇄 Fv는 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있다. scFv 폴리펩타이드는 또한 scFv에 의한 항원 결합을 위한 목적하는 3차원 구조의 형성을 용이하게 하기 위해 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 위치한 폴리펩타이드 링커를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315] 참조).
다른 인식된 항체 단편은 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하기 위해 한 쌍의 탠덤 (tandem) Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 것들을 포함한다. 이러한 "선형 항체"는, 예를 들어, 문헌 [Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기재된 바와 같이 이중 특이적 또는 단일 특이적일 수 있다.
사람화 항체 또는 사람화 항체 단편은 예정된 항원에 결합할 수 있으며 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 하나 이상의 FR, 및 비사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 아미노산 서열 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. 종종 "유입 (import)" 서열로서 지칭되는 이러한 비사람 아미노산 서열은 전형적으로 "유입" 항체 도메인, 특히, 가변 도메인으로부터 취해진다. 일반적으로, 사람화 항체는 사람 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 비사람 항체의 적어도 CDR 또는 HVL을 포함한다.
본 발명은 사람 생식 세포 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 쥐과 동물 또는 키메라 항체로부터 유래된 CDR을 함유하는 특정 사람화 항-Nrp1A 항체를 기재한다. 특정한 쥐과 동물 FR 잔기는 사람화 항체의 기능에 중요할 수 있으므로 특정한 사람 생식 세포 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기는 상응하는 쥐과 동물 서열의 것들과 동일하도록 변형된다는 것이 이해될 것이다.
본 출원에서 사용되는 "본 발명의 항체" 및 "본 발명의 항-Nrp1A 항체"라는 표현은 본 출원에서 기재된 Nrp1, 바람직하게는 Nrp1의 A 도메인, 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 지시된 항체를 지칭한다. 바람직하게, 본 발명의 상기 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 사람화 항-Nrp1A에 관한 것이다. 사람화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및 Fv 단편에 함유됨)을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비사람 면역글로불린의 것들에 상응하고, 구체적으로는 본 출원의 CDR은 쥐과 동물 서열이고, FR은 사람 면역글로불린 공통 또는 생식 세포 서열의 것들이다. 또 다른 양태에서, 사람화 항-Nrp1A 항체는 또한 면역글로불린 Fc 영역의 일부, 전형적으로는 사람 면역글로불린의 일부를 적어도 포함한다. 통상적으로, 상기 항체는 경쇄 뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인을 모두 포함할 것이다. 적절한 경우, 상기 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및/또는 CH4 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
사람화 항-Nrp1A 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의 클래스의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 비롯한 임의의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 사람화 항체가 세포독성 활성을 나타내고 상기 이소타입이 전형적으로 IgG1인 것이 바람직한 경우, 상기 불변 도메인은 보체 고정 불변 도메인일 수 있다. 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우, 상기 불변 도메인은 또 다른 이소타입, 예를 들어, IgG2일 수 있다. 대안적인 사람화 항-Nrp1A 항체는 하나 초과의 면역글로불린 클래스 또는 이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있으며, 목적하는 이펙터 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 도메인을 선택하는 것은 당해 분야의 통상의 기술 내에 있다. 구체적인 실시 형태에서, 본 발명은 감소된 이펙터 기능을 특징으로 하는 IgG1 항체, 보다 구체적으로는 IgG1 항체인 항체를 제공한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 IgG1KO로서 형식화된 사람화 항체이다.
사람화 항-Nrp1A 항체의 FR 및 CDR 또는 HVL은 모체 서열에 정확히 상응할 필요는 없다. 예를 들어, 생성된 아미노산 잔기가 어느 한 모체 서열의 상응하는 위치에서 원래의 잔기와 더 이상 동일하지 않고 상기 항체가 그럼에도 불구하고 Nrp1에 결합하는 기능을 유지하도록, 유입 CDR 또는 HVL, 또는 공통 또는 생식 세포 FR 서열 중의 하나 이상의 잔기는 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변경 (예를 들어, 돌연변이 유발)될 수 있다. 이러한 변경은 전형적으로 광범위하지 않을 것이며 보존적 변경일 것이다. 일반적으로, 상기 사람화 항체 잔기 중 적어도 75%, 보다 종종 적어도 90%, 가장 빈번하게는 95% 초과 또는 98% 초과 또는 99% 초과는 모체 공통 또는 생식 세포 FR 및 유입 CDR 서열의 것들에 상응할 것이다.
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 계면 ("VL-VH 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기는 서로에 대한 2개의 쇄의 근접성 또는 배향에 영향을 미치는 것들이다. 쇄간 상호 작용에 관여할 수 있는 특정 잔기는 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 및 98번 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987]에 제시된 넘버링 시스템 활용) VL 잔기와 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 및 103번 VH 잔기를 포함한다. 미국 특허 US 6,407,213은 또한 43 및 85번 VL 잔기와 43 및 60번 VH 잔기와 같은 잔기가 이러한 상호 작용에 관여할 수 있다는 것을 논의하고 있다. 이러한 잔기는 사람 IgG에 대해서만 표시되지만, 이는 종에 걸쳐 적용 가능하다. 쇄간 상호 작용에 관여할 것으로 합리적으로 예상되는 중요한 항체 잔기는 공통 서열 내로의 치환을 위해 선택된다.
"공통 서열" 및 "공통 항체"라는 용어는 임의의 특정 클래스, 이소타입 또는 서브유닛 구조, 예를 들어, 사람 면역글로불린 가변 도메인의 모든 면역글로불린의 각 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 공통 서열은 특정 종 또는 많은 종의 면역글로불린을 기반으로 할 수 있다. "공통" 서열, 구조 또는 항체는 특정 실시 형태에서 기재된 바와 같은 공통 사람 서열을 포괄하고, 임의의 특정 클래스, 이소타입 또는 서브유닛 구조의 모든 사람 면역글로불린의 각 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, 상기 공통 서열은 하나 이상의 공지된 면역글로불린에 존재하지만 임의의 단일 면역글로불린의 전체 아미노산 서열을 정확히 복제하지 않을 수 있는 아미노산을 각 위치에 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 가변 영역 공통 서열은 자연적으로 생성된 임의의 항체 또는 면역글로불린 (문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]) 및 이의 변형체로부터 수득되지 않는다. 중쇄 및 경쇄 공통 서열의 FR, 및 이의 변이체는 사람화 항-Nrp1A 항체의 제조에 유용한 서열을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 US 6,037,454 및 US 6,054,297을 참조한다.
사람 생식 세포 서열은 사람 집단에서 자연적으로 발견된다. 이러한 생식 세포 유전자의 조합은 항체 다양성을 생성한다. 상기 항체의 경쇄에 대한 생식 세포 항체 서열은 보존적 사람 생식 세포 카파 또는 람다 v-유전자 및 j-유전자로부터 유래한다. 유사하게, 상기 중쇄 서열은 생식 세포 v-유전자, d-유전자 및 j-유전자로부터 유래한다 (문헌 [LeFranc, M-P, and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001]).
"단리된" 항체는 자연 환경의 한 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것을 지칭한다. 상기 항체의 자연 환경의 오염 성분은 상기 항체의 진단적 또는 치료학적 용도를 방해할 수 있고 효소, 호르몬 또는 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질일 수 있는 물질이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 항체의 중량을 기준으로 적어도 95% 초과의 단리로 정제될 것이다.
"항체 성능"이라는 용어는 항원에 대한 항체 인식 또는 생체내 항체의 유효성에 기여하는 요인/특성을 지칭한다. 바람직한 실시 형태에서, 이는 망막 세포에서 세포골격 붕괴를 방지하는 항체의 능력을 지칭한다. 항체의 아미노산 서열의 변화는 폴딩과 같은 항체 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 항원에 대한 항체의 초기 결합 속도 (ka), 항원으로부터의 항체의 해리 상수 (kd), 항원에 대한 항체의 친화 상수 (Kd), 항체의 입체 형태, 단백질 안정성 및 항체의 반감기와 같은 물리적 요인에 영향을 미칠 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "동일한" 또는 "% 동일성"이라는 용어는, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 최대 대응을 위해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 지칭한다. % 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭을 도입할 수 있다). 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열들 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # (예를 들어, 중첩 위치)×100). 일부 실시 형태에서, 비교되는 2개의 서열들은, 적절한 경우, 갭이 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다 (예를 들어, 비교되는 서열을 초과하여 연장되는 추가의 서열 제외). 예를 들어, 가변 영역 서열을 비교할 때, 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 2개의 서열 사이의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 두 서열 (예를 들어, 각 서열의 CDR-H1)에서 동일한 위치의 CDR을 지칭한다.
2개의 서열들 사이의 % 동일성 또는 % 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예로는 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이 있으며, 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 관심 대상 단백질을 인코딩하는 핵산에 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 관심 대상 단백질과 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST는 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안으로, PSI-Blast를 사용하여 분자들 사이의 원연 관계 (Id.)를 탐지하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적인 예로는 문헌 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당해 분야에 공지되어 있으며, 문헌 [Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]; 및 [FASTA described in Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM을 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 민감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup = 2인 경우, 정렬된 잔기 쌍을 살펴봄으로써 비교되는 2개의 서열 내의 유사한 영역을 발견하며; ktup = 1인 경우, 단일 정렬된 아미노산을 검사한다. ktup은 단백질 서열에 대해 2 또는 1, DNA 서열에 대해 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup이 명시되지 않는 경우, 디폴트는 단백질에 대해 2, DNA에 대해 6이다. 대안으로, 문헌 [Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에서 기재된 바와 같은 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 단백질 서열 정렬을 수행할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호 교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭은 이들의 자손을 포함한다. 따라서, "형질 전환체" 및 "형질 전환 세포"는 전달 횟수와 상관 없이 일차 대상 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다.
치료의 목적상, "포유 동물"이라는 용어는 사람, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯하여 포유 동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 포유 동물은 사람이다.
본 출원에서 사용되는 "질환" 또는 "장애"는 본 출원에서 기재된 사람화 항-Nrp1A 항체에 의한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 병태이다. 이는 포유 동물이 문제의 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 병태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
"유리체내 주사"라는 용어는 당해 분야에서 통상적인 의미를 가지며, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자의 유리체 내로 도입하는 것을 지칭한다.
"피하 투여"라는 용어는 약물 용기로부터 비교적 느리고 지속적인 전달에 의해 동물 또는 사람 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내로 항-Nrp1A 또는 이의 항원 결합 단편을 도입하는 것을 지칭한다. 피부를 꼬집거나 하부 조직으로부터 위로 멀리 잡아 당기면 포켓이 생길 수 있다.
"피하 주입"이라는 용어는 30분 이하 또는 90분 이하를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기간 동안 약물 용기로부터 비교적 느리고 지속적인 전달에 의해 동물 또는 사람 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에 약물을 도입하는 것을 지칭한다. 임의로, 상기 주입은 동물 또는 사람 환자의 피부 아래에 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서, 상기 펌프는 30분, 90분과 같은 예정된 시간 또는 치료 계획의 길이에 걸친 기간 동안 예정된 양의 약물을 전달한다.
"피하 볼루스"라는 용어는 동물 또는 사람 환자의 피부 아래에 약물을 투여하는 것을 지칭하며, 여기서, 볼루스 약물 전달은 약 15분 미만; 또 다른 양태에서는 5분 미만, 더 또 다른 양태에서는 60초 미만이다. 더 또 다른 양태에서, 투여는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내이며, 여기서, 상기 포켓은 피부를 꼬집거나 하부 조직으로부터 위로 멀리 잡아 당김으로써 생성될 수 있다.
"치료학적 유효량"이라는 용어는 치료되는 장애의 증상 중 하나 이상을 경감 또는 개선하는 항-Nrp1A 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 지칭하는데 사용된다. 그렇게 함으로써, 이는 유익한 환자 결과를 갖는 그 양이다. 효능은 치료되는 병태에 따라 통상적인 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, Nrp1A를 발현하는 세포를 특징으로 하는 안구/망막 질환 또는 장애에서, 효능은 반응률, 예를 들어, 시력 회복을 결정하거나 질환 진행까지의 지연 시간을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "치료" 및 "요법" 등이라는 용어는 하나 이상의 증상의 완화 또는 경감, 질환 또는 장애의 진행의 퇴행, 지연 또는 중단을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 임상적으로 바람직하거나 유익한 효과를 유발하는 질환 또는 장애에 대한 치료학적, 예방학적 또는 억제적 조치를 포함하는 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들어, 치료라는 용어는 질환 또는 장애의 증상의 발생 전에 또는 후에 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하여 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 예방하거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, 상기 용어는 질환의 임상 소견 후 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하여 질환의 증상을 예방하는 것을 포함한다. 또한, 치료가 질환의 개선을 초래하는지 여부에 관계 없이, 투여가 질환 또는 장애의 임상 파라미터에 영향을 미치는 발병 후 및 임상 증상이 발생한 후에 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여는 본 출원에서 사용되는 바와 같은 "치료" 또는 "요법"을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 조성물이 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 항-Nrp1A 항체 조성물 또는 이의 항원 결합 단편의 사용의 부재하의 증상과 비교하여 치료되는 장애의 적어도 하나의 증상을 완화 또는 개선하는 한, 그 결과는 장애의 모든 증상이 완화되었는지 여부에 관계 없이 기저 장애의 효과적인 치료로서 간주되어야 한다.
"패키지 삽입물"이라는 용어는, 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
본 발명의 항체
제1 양태에서, 본 발명은 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항체는 바람직하게는 사람화 항-Nrp1A 항체, 보다 바람직하게는 사람화 단클론 항-Nrp1A 항체이다.
초기 특성화에서, Nrp1A 변이체를 표적화하는 항체의 라이브러리는 쥐과 동물 항체의 CDR 또는 파지 라이브러리로부터 유래된 사람 항체의 CDR을 사람 공통 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR 내에 배치하고 또한 FR을 상이한 변경으로 조작함으로써 생성되었다.
이는 본 출원에서 개시된 바와 같이 증진된 특성을 갖는 Nrp1A에 대해 지시된 사람화 항체를 생성하였다. 본 발명의 항체의 서열은 하기 표 1에 제시되어 있다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
더 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
a. 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
b. 서열 번호 12 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
c. 서열 번호 13 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
d. 서열 번호 14 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
e. 서열 번호 15 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
f. 서열 번호 16 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄; 또는
g. 서열 번호 17 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄.
더 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
- 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 중쇄; 및
- 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 경쇄.
더 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
a. 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론 I"로서 지칭됨);
b. 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론 II"로서 지칭됨);
c. 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론 III"으로서 지칭됨);
d. 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론 IV"로서 지칭됨);
e. 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론
f. V"로서 지칭됨);
g. 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론
h. VI"으로서 지칭됨); 또는
i. 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (상기 항체는 "클론 VII"로서 지칭됨).
IgG1-KO 돌연변이체는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하여 제조되었다. 이펙터 기능을 감소 또는 억제하는 돌연변이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 종래 기술, 예를 들어, 문헌 [Wang et al, Protein Cell 2018, 9(1):63-73] 및 [Stewart et al. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014, 2:29]에 완전히 개시되어 있다. 전형적으로, Fc의 이펙터 기능을 감소시키기 위해 IgG1 Fc 영역에 도입된 돌연변이의 비제한적인 목록은
- L234A 및 L235A;
- L234A, L235A 및 N297Q;
- L234A, L235A 및 P329G; 또는
- L234A, L235A 및 D265A
를 포함하며;
여기서, 상기 잔기는 Kabat의 EU 색인에 따라 넘버링된다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 이펙터 기능을 감소시키기 위해 Fc 영역에 2개의 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함한다.
본 출원에서 개시되고 서열 번호 1 내지 6에 나타낸 CDR은 하기 표 2에서 CCG (문헌 [Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066] 및 [Maier et al, Proteins 2014; 82:1599-1610]에서 예시된 바와 같은 화학 컴퓨팅 그룹 (Chemical Computing Group))에 따라 제시된다.
Kabat 넘버링을 기반으로 한 추가의 넘버링 시스템은 아래 표 3에 요약되어 있다.
Chothia를 기반으로 한 추가의 넘버링 시스템은 하기 표 4에 제시되어 있다.
그러므로, 구체적인 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
- 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
- 서열 번호 7의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
- 서열 번호 8의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 9의 아미노산 서열 (H-CDR2); 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 항-Nrp1A 항체는 사람 Nrp1A에 대해 높은 친화도로 결합한다. 이러한 양태와 관련된 실시 형태에서, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 KD < 50 nM에서 사람 Nrp1A에 결합한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 실시예 8에서 예시된 바와 같이 KD < 15 nM에서 사람 Nrp1A에 결합한다.
본 발명의 항-Nrp1A 항체는 또한 cyno-Nrp1A, 마우스 Nrp1A, 래트 Nrp1A 및 게르빌루스쥐 (gerbil) Nrp1A에 결합한다.
본 발명의 항체의 높은 결합 친화도는 유리체내 주사 후 Nrp1A의 중화 시간을 연장하는데 기여하며, 추가로 감소된 주사 빈도를 가능하게 한다. 보다 높은 결합 친화도는 보다 낮은 용량의 투여를 추가로 가능하게 하여 잠재적인 부작용을 제한한다. 개선된 결합 친화도 및 감소된 주사 빈도는 이를 필요로 하는 환자의 치료 효능을 상당히 개선시킨다. 이는 또한 환자에게 이익, 특히, 향상된 약물 준수 및 순응도를 제공한다.
본 발명의 항-Nrp1A 항체는 130 pM 미만, 바람직하게는 110 pM 미만, 보다 바람직하게는 100 pM 미만의 기능적 역가로 망막 세포에서 Sema3A 유도된 세포 골격 붕괴를 예방한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항-Nrp1 항체는 실시예 4에서 예시된 바와 같이 98 pM의 기능적 역가로 망막 세포에서 Sema3A 유도된 세포 골격 붕괴를 예방한다. 그 결과는 Sema3A에 의해 유도된 혈관 반발을 억제하는 본 발명의 항체의 효율을 예시한다.
본 발명의 항-Nrp1A 항체는 4 nM 미만, 바람직하게는 3 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만의 기능적 역가로 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 추가로 억제한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 실시예 5에서 예시된 바와 같이 0.74 nM의 기능적 역가로 망막 세포 완전성의 VEGF 유도된 손실을 예방한다. 그 결과는 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 억제하는 본 발명의 항체의 효율을 예시한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 실시예 9에 기재된 바와 같이 낮은 면역원성 위험을 갖는 것으로 판명되었다. 이는 상기 항체의 면역원성의 인실리코 (in silico) 예측에 의존한다. 상기 면역원성 위험은 전형적으로 주요 면역원성 영향 인자인 T 세포 에피토프를 예측하기 위한 컴퓨터 알고리즘과 같이 널리 공지된 다양한 방법에 의해 평가된다. 관심 대상 단백질에 존재하는 T 세포 에피토프를 포함하는 서열은 EpiMatrix (EpiVax에 의해 제조)라는 명칭으로 이용 가능한 컴퓨터 매트릭스 접근법을 기반으로 하는 알고리즘을 사용하여 예측될 수 있다고 실제로 보고되었다. 당해 분야의 통상의 기술자는 문헌 [Van Walle et al., Expert Opin Biol Ther. 2007 March; 7(3): 405-18] 및 [Jawa and al., Clin Immunol. 2013 Dec;149(3):534-55]을 참조할 수 있다.
본 발명의 항체는 Sema3의 표적화를 기반으로 하는 치료학적 접근법과 상이하다. 실제로, 본 발명에 따른 항체는 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 억제하지만, 이러한 효과는 Sema3A를 표적화하는 화합물에 의해서는 관찰되지 않는다. 그러므로, 본 발명의 항체를 기반으로 하는 항-Nrp1A 치료학적 접근법은 다음과 같은 이점을 갖는다:
- Sema3A의 혈관 반발 효과를 억제하는 것;
- Sema3A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 억제하는 것; 및
- VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 억제하는 것.
본 발명의 항체는 VEGF 억제를 기반으로 하는 치료학적 접근법과 상이하다. 실제로, 본 발명의 항체는 Nrp1에 대한 Sema3A의 결합을 억제하여 Sema3A에 의해 유도된 혈관 반발의 억제를 초래하여 결국 특히 DMI를 앓고 있는 환자에서 재생 혈관 형성을 향상시킨다.
또한, 본 발명자들은 실시예 5에 예시된 바와 같이 VEGF 유도된 세포 완전성 손실 검정에서 특히 아바스틴®, 아일리아® 및 루센티스®와 비교하여 본 발명의 항체의 역가를 비교하였다. 아바스틴®, 아일리아® 및 루센티스®는 모두 VEGF를 표적화하는 반면, 본 발명의 항체는 Nrp1의 A 도메인을 표적화한다. VEGF 유도된 세포 완전성 손실 검정에서의 본 발명의 항체의 역가가 아바스틴® 및 아일리아®의 역가와 유사하고 루센티스®의 역가 보다 우수하다는 것은 주목할 만하다. 따라서, 본 발명자들은
- 혈관 반발과 Sema3A에 의한 혈액 망막 장벽의 투과성의 유도를 억제하기 위해 Nrp1과 Sema3A의 결합을 방지하고,
- 놀랍게도, VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성에 영향을 미치는 항체를 개발하였다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 종래 기술에서 언급되고 본 출원의 실시예 3에서 기재된 Nrp1을 표적화하는 다른 항체 또는 단편 보다 더 유리한 특성을 나타낸다는 것을 예시하였다. 상기 추가의 항체는 Nrp1 상의 상이한 에피토프를 표적화한다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 항체와
- Nrp1 (YW64.3)의 A 도메인에 대해 지시된 항체; 및
- Nrp1 (YW107.4.87)의 B 도메인에 대해 지시된 항체
의 특성을 비교하였다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 Sema3A 유도된 세포 골격 붕괴 검정에서 효과적인 반면, YW107.4.87은 그렇지 않다는 것을 증명하였다 (실시예 4). 이러한 결과는 본 발명의 항체가 Sema3A에 의해 유도된 혈관 반발을 억제하여, 특히 DMI를 앓고 있는 환자에서 재생 혈관 형성에 대한 향상된 특성을 초래한다는 것을 예시한다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 DSC로 측정될 때 YW64.3과 비교하여 향상된 열 안정성을 갖는다는 것을 추가로 증명하였다 (실시예 11). 이러한 결과는 본 발명의 항체가 생리학적 온도에서 본래의 활성 입체 형태로 남아 있다는 것을 예시한다. 보다 높은 열 전이 중간점 (T m)이 보다 낮은 온도에서 단백질의 향상된 안정성을 반영한다는 것은 주목할 만하다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 환자에 대한 감소된 주사 용량 및 빈도를 가능하게 하면서 향상된 치료학적 효능에 기여하는 향상된 열 안정성 특성을 나타낸다는 것을 증명하였다. 또한, T m 은 치료 제품의 보다 높은 저장 수명 및 향상된 경시 안정성을 나타낸다.
사람화 및 아미노산 서열 변이체
추가의 변이체 항-Nrp1A 항체 및 항체 단편은 서열 번호 1 내지 6에 나타낸 서열에서 확인된 CDR 세트에 기초하여 조작될 수 있다. 상기 변이체 항-Nrp1A 항체 및 항체 단편에서의 CDR의 아미노산 서열은 변하지 않은 상태로 남아 있지만 주위 영역, 예를 들어, FR 영역은 조작될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 상기 항-Nrp1A 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 상기 항-Nrp1A 항체 DNA 내에 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 본 출원의 실시예의 항-Nrp1A 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 목적하는 특성을 갖는다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 상기 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경하는 것과 같은 사람화 또는 변이체 항-Nrp1A 항체의 번역 후 과정을 변경할 수 있다.
상기 항체의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 상기 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경하는 것을 포함한다. 이러한 문맥에서의 "변경하는"이라는 용어는 상기 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티 (moiety)를 결실시키고/거나 상기 항체에 이전에 존재하지 않았던 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 출원에서 기재된 항-Nrp1A 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 항-Nrp1A 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법으로는 올리고뉴클레오타이드 매개성 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 상기 항-Nrp1A 항체의 미리 제조된 변이체 또는 비변이체 버전의 카세트 돌연변이 유발에 의한 천연 공급원 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 제제로부터의 단리가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시 형태에서, 상기 항-Nrp1A 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생성을 위해 개발된 기술들이 존재한다. 단편은 온전한 항체들의 단백질 가수분해 소화를 통해 유도될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117]; 및 [Brennan et al., 1985, Science 229: 81] 참조). 대안으로, 상기 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이 (E. coli)로부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링하여 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167] 참조). 또 다른 접근법으로, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술들은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
상기 항-Nrp1A 항체 및 이의 항원 결합 단편은 변형을 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 온전한 항체 보다는 오히려 항-Nrp1A 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 회수 수용체 결합 에피토프를 상기 항체 단편 내로 도입으로써 달성될 수 있다. 하나의 방법에서, 상기 항체 단편의 적절한 영역은 변경 (예를 들어, 돌연변이)될 수 있거나, 상기 에피토프는, 예를 들어, 이후에 DNA 또는 펩타이드 합성에 의해 말단 또는 중간에서 상기 항체 단편에 융합되는 펩타이드 태그 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 국제공개공보 WO 96/32478을 참조한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 상기 항-Nrp1A 항체의 공유 변형을 포함한다. 공유 변형으로는 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노 말단 잔기, 아르기닐 잔기, 타이로실 잔기, 카복실 측기 (아스파르틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴 또는 트레오닐 잔기의 변형이 포함된다. 또 다른 유형의 공유 변형은 글리코사이드를 상기 항체에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것을 포함한다. 이러한 변형은, 적용 가능한 경우, 화학적 합성에 의해, 또는 상기 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 상기 항체의 다른 유형의 공유 변형은 상기 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 아미노 또는 카복시 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입될 수 있다.
상기 항체 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52] 및 [Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 기재되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다아제 및 엑소글리코시다아제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
유용한 공유 변형의 또 다른 유형은 미국 특허 US 4,640,835, US 4,496,689, US 4,301,144, US 4,670,417, US 4,791,192 및 US 4,179,337 중 하나 이상에서 제시된 방식으로 상기 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결하는 것을 포함한다.
에피토프 결합
제2 양태에서, 본 발명은 특정 "Nrp1A 에피토프"를 인식하는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 서열 번호 26에 제시된 바와 같은 사람 Nrp1A의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열 번호 26에 제시된 바와 같은 사람 Nrp1A의 68~77번 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 27에 제시된 서열에 결합하는 Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
서열 번호 26 및 27의 서열은 하기 표 5에 나타나 있다.
본 출원에서 사용되는 "Nrp1A 에피토프"라는 용어는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합할 수 있는 분자 (예를 들어, 펩타이드) 또는 분자의 단편을 지칭한다. 이러한 용어는, 예를 들어, 서열 번호 1 내지 3의 중쇄 CDR 및 서열 번호 4 내지 6의 경쇄 CDR로부터 선택된 경쇄 및 중쇄 CDR 조합을 갖는 본 발명의 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나에 의해 인식되는 Nrp1A 항원 결정 인자를 추가로 포함한다.
Nrp1A 항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편, 펩타이드 등에 포함될 수 있다. 상기 에피토프는 가장 일반적으로 단백질, 짧은 올리고펩타이드, 올리고펩타이드 모방체 (즉, 상기 Nrp1 항원의 항체 결합 특성을 모방하는 유기 화합물) 또는 이의 조합이다.
본 발명의 항체는 사람 Nrp1A의 특유의 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 바람직하게, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 26에 제시된 바와 같은 사람 Nrp1A의 세포외 도메인의 68~77번 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합한다.
에피토프 결합의 문맥에서, "...의 X-Y번 아미노산 영역 내에서 결합한다"라는 문구는 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열에 명시된 아미노산 영역 내의 적어도 하나, 바람직하게는 모든 아미노산 잔기에 결합한다는 것을 의미한다.
또 다른 양태에서, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%에 결합한다. 바람직하게, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 27에 제시된 서열에 결합한다.
치료학적 용도
제3 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
이전에 언급된 바와 같이, Sema3A는 NRP1에 대한 천연 리간드이다. 보다 정확하게, Sema3A는 Nrp1의 A 도메인에 결합한다. 본 발명자들은 세마포린 3A가 허혈성/무혈관 망막에서 저산소성 망막 신경절 세포에 의해 분비되고 혈관 반발 신호로서의 역할을 한다는 것을 예시하였다. 본 발명자들은 Sema3A가 이러한 세포에서 세포 골격 붕괴를 유도하여 허혈성 영역으로부터 신생 혈관을 실제로 제거함으로써 망막의 혈관 재생을 억제하고 병리학적 망막전 신생 혈관 형성을 증진시킨다는 것을 확인하였다.
Nrp1, 바람직하게는 Nrp1의 A 도메인을 표적화함으로써, 본 발명의 항체는 Nrp1과 Sema3A의 결합을 방지한다. 본 발명자들은 Nrp1A 항체에 의한 혈관 반발 작용의 조절이 정단 세포의 수를 증가시키고, 당뇨병성 황반 허혈이 있는 사람에서 병리학적으로 확대된 중심와 무혈관 구역과 같은 허혈성 영역으로 혈관 형성을 재지시한다는 것을 증명하였다 (실시예 6).
Nrp1의 A도메인과 Sema3A의 결합을 방지하는 것에 추가하여, 본 발명의 항체는 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A에 의해 유도된 망막 투과성을 억제하는 예상치 못한 특성을 나타낸다. 이전에 언급된 바와 같이, VEGF-A는 Nrp1의 B 도메인에 대한 천연 리간드이다. 본 발명의 항체는 Nrp1의 A 도메인을 표적화하지만, Nrp1B과 VEGF-A의 결합을 특이적으로 표적화하지 않는다. 그러나, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 억제한다는 것을 관찰하였다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 Nrp1의 A 도메인에 대한 항체, 바람직하게는 본 발명의 항체에 의한 VEGF-A에 의해 유도된 망막 투과성의 억제가 Nrp1, VEGF 수용체 2 및 추가의 공동 수용체로 이루어진 신호 전달 홀로리셉터 (holoreceptor) 복합체의 입체적 방해에 기인한다는 가설을 세웠다.
VEGF-A는 특히 저산소성 성상 교세포에 의해 분비된다. VEGF-A는 증식성 DR과 DME 모두의 발달에서 중요한 요소이며, 이는 VE-카데린과 같은 부착 연접 또는 오클루딘과 같은 밀착 연접을 조절하여 망막 모세 혈관 투과성을 변경한다. VEGF-A는 내피 세포를 자극하여 기질 메탈로프로테이나아제 (matrix metalloproteinase: MMP)와 우로키나아제형 플라스미노겐 활성 인자를 방출하는데 이는 기저막의 분해를 초래하고 세포 이동을 가능하게 한다.
그러므로, 저산소 상태에서의 VEGF-A 분비는 망막 투과성에 기여하여 황반 부종을 악화시키는 악화 요인이다. 또한, 본 발명자들은 Sema3A와 VEGF-A 모두가 Nrp1에 대한 결합에 의해 혈관 투과성을 촉진하여 혈관 누출을 일으킴으로써 황반 부종에 기여한다는 것을 증명하였다.
본 발명자들은 Nrp1A를 표적화하는 항체를 개발함으로써 이러한 병리학적 상황을 해결했으며, 이는 다음에 대해 매우 유익한 것으로 판명된다:
- 망막의 재생 혈관 형성을 개선하기 위해 허혈성 영역으로 혈관 형성을 재지시하는 것;
- 유리체 영역의 병리학적 신생 혈관 형성을 방지하는 것;
- Sema3A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지하는 것; 및
- VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지하는 것.
따라서, 2가지 예상치 못한 효과를 결합함으로써, 본 발명의 항체는 다음에 대해 매우 유익한 것으로 판명된다:
- 전형적으로는 PDR, 특히, DMI를 앓고 있는 환자의 망막에서 허혈성 무혈관 영역의 재생 혈관 형성을 향상시키는 것;
- 전형적으로는 PDR, 특히, DME를 앓고 있는 환자에서 Sema3A의 분비에 의해 유도된 혈관 누출을 방지하는 것; 및
- 전형적으로는 PDR, 특히, DME를 앓고 있는 환자에서 VEGF-A의 분비에 의해 유도된 혈관 누출을 방지하는 것.
결과적으로, 본 발명은 망막 또는 안구 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에 따른 항체가 실시예 12에서 예시된 바와 같이 VEGF와 Nrp1의 결합을 방지하지 않는다는 것은 주목할 만하다. 본 발명의 항체는 VEGF 유도된 혈관 형성에 영향을 미치지 않으며 (본 발명의 항체는 VEGF-A 유도된 내피 세포 증식을 방지하지 않기 때문임), VEGF-A 유도된 망막 투과성에만 영향을 미친다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 실시예 13에서 예시된 바와 같이 내피 세포 증식을 방지하지 않는다는 것을 실제로 증명하였다. 본 발명자들은 본 발명의 항체가 VEGF 유도된 네트워크 형성 검정 (실시예 14) 뿐만 아니라 레이저 유도된 맥락막 신생 혈관 형성 (실시예 15)에서 VEGF 유도된 혈관 형성에 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 증명하였다. 그러므로, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 형성을 억제하지 않다는 것을 확인하였다.
본 발명의 개시 내용 전체에 걸쳐 설명된 바와 같이, 본 발명의 항체는 Sema3A의 혈관 반발 효과를 억제함으로써 혈관 형성을 허혈성 영역으로 재지정할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 항체는 Sema3A와 VEGF-A 모두에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지한다. VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성에 대한 억제 효과에도 불구하고, 본 발명의 항체는 놀랍게도 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 형성에 영향을 미치지 않는다.
또한, 본 발명의 항체는 재생 혈관 형성을 방지하지 않는다. 따라서, 이는 허혈성 영역의 혈관 형성을 방해하지 않는다. 그러므로, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 전형적으로는 PDR, 특히, DMI를 앓고 있는 환자의 망막에서 허혈성 무혈관 영역의 재생 혈관 형성을 향상시키기 위해 재생 혈관 형성이 촉진되어야 하는 임상 상황에서 매우 유익하다.
제4 양태에서, 본 발명은 망막병증, 미숙아 망막병증과 같은 증식성 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 정맥 폐색, 망막 동맥 폐색, 안구내염, 포도막염, 낭포 황반 부종, 임의의 망막 질환에 이은 맥락막 신생 혈관 막 질환, 시신경 병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유발성 망막 혈관병증, 망막 신생 혈관 형성, 결절성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세 동맥류, 푹스 이영양증, 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군 및 스타가르트병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 항-Nrp1A 항체는 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신생 혈관 형성 및 맥락막 신생 혈관 형성을 치료 또는 예방하는데 특히 유용하다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 질환은 당뇨병성 황반 허혈이며, 본 발명의 항체는 허혈성 망막 내의 혈관 재생 (재생 혈관 형성)을 촉진하고 안구의 유리체 영역의 병리학적 신생 혈관 형성을 방지한다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 질환은 당뇨병성 황반 부종이며, 본 발명의 항체는 Sema3A 및 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시킨다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 허혈성 영역으로부터 Sema3A 유도된 혈관 퇴행을 억제하고, 혈액 망막 장벽의 Sema3A 유도된 투과성을 억제하고, 혈액 망막 장벽의 VEGF-A 유도된 투과성을 억제하기 위한 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 출원에서 사용되는 "혈액 망막 장벽 (BRB)의 투과성의 억제", "망막 투과성의 억제" 및 "혈관 투과성의 억제"라는 표현은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 잠재적으로 혈관 누출로 이어지는 혈액 망막 장벽의 파괴를 지칭한다. 상기 혈관 누출은 한편으로는 Sema3A에 의해, 다른 한편으로는 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A에 의해 유도될 수 있다. 본 발명자들은 이제 Sema3A에 의해 유도된 BRB의 투과성을 억제할 뿐만 아니라 VEGF-A에 의해 유도된 BRB의 투과성을 억제할 수 있는 항체를 개발하였다. 따라서, 본 발명의 항체는 혈액 망막 장벽의 파괴를 방지하며, Sema3A 및/또는 VEGF-A에 의해 유도된 망막 세포 완전성의 손실을 방지한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 당뇨병성 황반 부종 (DME) 및/또는 당뇨병성 황반 허혈 (DMI)의 치료에 유용하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 DME 및 DMI를 앓고 있는 환자를 치료하는데 유용하다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 중심와 무혈관 구역 (FAZ)의 15%, 20%, 25%, 보다 바람직하게는 30% 이상으로 정의된 DMI를 치료하는데 사용된다.
본 발명은 VEGF-A가 허혈성 망막 내의 혈관 재생에 미칠 수 있는 혈관 형성 촉진 효과에 영향을 미치지 않으면서 본 발명의 항체가 VEGF-A에 의해 유도된 망막 투과성을 억제하기 때문에 DMI와 DME 모두를 앓고 있는 환자에게 매우 유용한 것으로 판명되었다.
제5 양태에서, 본 발명은 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유리체내, 경구, 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 상기 항-Nrp1A 항체는 특히 상기 항체의 감소 용량으로 펄스 주입에 의해 적절하게 투여된다. 하나의 양태에서, 상기 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 만성인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 바람직하게, 상기 항-Nrp1A 항체는 안구 내로의 유리체내 주사를 통해 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적절한 투약량은 상기에서 정의된 바와 같은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 상기 항체가 예방적 또는 치료학적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 상기 항체에 대한 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량과 같은 다양한 요인에 좌우될 것이다. 상기 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
바람직한 실시 형태에서, 주사 당 적용 가능한 본 발명의 항체의 용량 범위는 일반적으로는 1 mg/안구 내지 10 mg/안구, 바람직하게는 1.5 mg/안구 내지 5 mg/안구, 보다 바람직하게는 2 mg/안구 내지 3 mg/안구, 보다 더 바람직하게는 약 2.5 mg/안구이다.
"억제"라는 용어는 "개선" 및 "완화"와 동일한 맥락에서 질환의 하나 이상의 특징을 감소 또는 경감시키는 것을 의미하기 위해 본 출원에서 사용된다.
상기 항체 조성물은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투여 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 요인으로는 치료 중인 구체적인 장애, 치료 중인 구체적인 포유 동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 진료 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여되는 상기 항체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 통제될 것이며, 본 발명의 항체에 의해 다루어지는 안구 또는 망막 질환을 예방, 개선 또는 치료하는데 필요한 최소량이다.
상기 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의로 제형화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 상기 제형에 존재하는 항-Nrp1A 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 기타 요인에 좌우된다. 이들은 일반적으로 이전에 기재된 바와 동일한 투약량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 투약량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
치료 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 환자에서 안구 또는 안구 질환을 치료 또는 예방하는 임의의 방법을 포함하며, 상기 방법은 본 발명의 항-Nrp1A 항체의 투여를 포함한다.
바람직하게, 본 발명은 SemaA3의 혈관 억제 효과를 억제하기 위한 본 발명에 따른 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게, 본 발명은 망막의 재생 혈관 형성을 향상시키는 상기 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명은 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 또는 망막 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 질환은 망막병증, 미숙아 망막병증과 같은 증식성 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 정맥 폐색, 망막 동맥 폐색, 안구내염, 포도막염, 낭포 황반 부종, 임의의 망막 질환에 이은 맥락막 신생 혈관 막 질환, 시신경 병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유발성 망막 혈관병증, 망막 신생 혈관 형성, 결절성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세 동맥류, 푹스 이영양증, 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군 및 스타가르트병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 질환은 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신생 혈관 형성, 녹내장 및 맥락막 신생 혈관 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직한 양태에서, 상기 질환은 당뇨병성 황반 부종 및/또는 당뇨병성 황반 허혈이다.
본 출원에서 기재된 모든 개시된 기술적 특징은 상기 치료 방법에 적용 가능하다.
약제학적 조성물 및 이의 투여
항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 안구 또는 망막 질환을 갖거나 이의 위험에 처해 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 Nrp1A 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 추가로 제공한다. 본 출원에서 사용되는 "대상체"라는 용어는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여될 수 있는 임의의 포유 동물 환자를 의미하며, 예를 들어, 사람 및 영장류, 설치류 및 개와 같은 비사람 포유 동물을 포함한다. 본 출원에서 기재된 방법을 사용하여 치료하도록 특별히 의도된 대상체로는 사람이 포함된다. 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템들이 공지되어 있으며, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는데 사용될 수 있다. 도입 방법으로는 유리체내, 점안약, 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 주입, 볼루스 또는 주사에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 투여는 유리체내 주사에 의한다. 이러한 주사용 제형은, 예를 들어, 사전 충전 주사기로 제조될 수 있다.
대표적인 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 사람에 대한 정맥내 또는 피하 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 주사에 의한 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약품은 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제 및 가용화제를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은 개별적으로 또는 단위 투여 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 사셰제와 같은 밀폐 용기 중의 건조 동결 건조 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합되어 공급된다. 상기 의약품이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 의약품 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입용 병과 함께 분배될 수 있다. 상기 의약품이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플은 상기 성분이 투여 전에 혼합되도록 제공될 수 있다.
또한, 상기 약제학적 조성물은 (a) 동결 건조 형태의 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 용기 및 (b) 약제학적으로 허용되는 주사용 희석제 (예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 희석제는 상기 동결 건조된 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 임의로, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지가 이러한 용기(들)와 관련되어 있으며, 당해 통지는 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.
안구 또는 망막 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 검정은 최적의 투약량 범위를 식별하는데 도움이 되도록 임의로 사용될 수 있다. 상기 제형 중에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 장애의 단계에 좌우될 것이며, 진료 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
예를 들어, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 독성 및 치료학적 효능은 ED50 (집단 중 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 바람직하다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 사람에서 사용하기 위한 투약량의 범위를 수립하는데 사용될 수 있다. 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 투약량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의의 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경우, 상기 치료학적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 수립될 수 있다. 이러한 정보는 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, ELISA 등에 의해 측정될 수 있다.
상기 항-Nrp1A 항체의 유리체내 주사의 경우, 치료들 사이의 긴 간격이 일반적으로 바람직하다. 향상된 역가로 인해, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 보다 긴 간격으로 투여될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 항-Nrp1A 항체는 6주 마다, 바람직하게는 7주 마다, 바람직하게는 8주 마다, 바람직하게는 9주 마다, 바람직하게는 10주 마다, 바람직하게는 11주 마다, 보다 바람직하게는 12주 마다 투여된다. 더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 3 개월 마다 1회 투여된다.
안구에 투여될 수 있는 양이 엄격히 제한되기 때문에, 본 발명의 항-Nrp1A 항체는 고농도로 제형화될 수 있다는 것이 매우 중요하다. 또한, 상기 항-Nrp1A 항체의 역가는 강력한 항체가 보다 더 낮은 용량에서도 효과를 발휘하여 활성 및 또한 치료들 사이의 간격을 연장할 수 있기 때문에 매우 중요하다.
본 발명의 항체는 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml 또는 100 mg/ml를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 매우 고용량으로 제형화될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 약 50 mg/ml의 액상 제형으로 제형화될 수 있다.
환자에게 투여될 수 있는 대표적인 투약량은 약 2.5 mg/안구이다. 이러한 제형에 사용될 수 있는 대표적인 완충 성분은, 예를 들어, 아세트산 나트륨, PS20 및 트레할로오스 이수화물을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 항-Nrp1A 항체는 60 mg/mL의 최종 단백질 농도로 pH 5.5에서 10 mM 히스티딘 완충제, 240 mM 수크로오스, 0.02 w/v % 폴리소르베이트 20과 함께 제형화된다.
일부 실시 형태에서, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 결합제에 컨쥬게이트되거나 컨쥬게이트되지 않은 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
조합 투여를 위한 치료 계획과 관련하여, 구체적인 실시 형태에서는 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 치료제와 동시에 투여된다. 또 다른 구체적인 실시 형태에서, 상기 치료제는 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 전 또는 후에 적어도 1 시간 내지 최대 수개월까지, 예를 들어, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 전 또는 후에 적어도 1 시간, 5 시간, 12 시간, 1일, 1주, 1 개월 또는 3 개월에 투여된다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
제6 양태에서, 본 발명은 항-Nrp1A 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 전장 단클론 항체, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하는 임의의 목적하는 형태의 항-Nrp1A 항체를 인코딩할 수 있다.
항-Nrp1A 항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)는 당해 분야에 공지된 바와 같이 하나 이상의 조절 또는 제어 서열에 융합될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 바와 같이 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 포함될 수 있다. 상기 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 분자는 사람 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 독립적으로 융합되어 온전한 항체의 생산을 가능하게 할 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부는 함께 융합되어 단일 쇄 항체의 생산을 위한 주형을 제공할 수 있다.
재조합 생산을 위해, 상기 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위한 복제 가능한 벡터 내에 삽입된다. 상기 재조합 항체를 발현시키기 위한 다수의 적합한 벡터가 이용 가능하다. 상기 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 항-Nrp1A 항체는 또한 융합 폴리펩타이드로서 생산될 수 있으며, 여기서, 상기 항체는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드 또는 신호 서열과 같은 이종 폴리펩타이드와 융합된다. 선택된 이종 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되어 가공되는 (즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 상기 항-Nrp1A 항체 신호 서열을 인식하고 가공하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 상기 신호 서열은 원핵 생물 신호 서열에 의해 치환될 수 있다. 상기 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리성 포스파타아제, 페니실리나아제, 지질단백질, 열 안정성 장 독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 본래의 신호 서열은, 예를 들어, 효모 인버타아제 알파-인자 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 산성 포스파타아제, 칸디다 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라아제, 또는 국제공개공보 WO 90/13646에 기재된 신호로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유 동물 세포에서, 포유 동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 리딩 프레임에서 사람화 항-Nrp1A 항체를 인코딩하는 DNA에 연결된다.
발현 및 클로닝 벡터는 상기 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 상기 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있도록 하는 서열이며, 복제 원점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2-υ 플라스미드 원점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 원점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 및 BPV)은 포유 동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유 동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 원점은 전형적으로 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 발현의 식별을 용이하게 하기 위해 선택 마커를 인코딩하는 유전자를 함유할 수 있다. 대표적인 선택 마커 유전자는 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나 다르게는 보체 영양 요구성 결핍이거나 다르게는 복합 배지에 존재하지 않는 특정 영양소, 예를 들어, 바실러스에 대한 D-알라닌 라세마아제를 인코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
선택 방법의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질 전환된 이러한 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하여 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신 약물을 사용한다. 포유 동물 세포에 대한 일반적인 선택 마커는 사람화 항-Nrp1A 항체를 인코딩하는 핵산을 흡수하는 능력을 갖는 세포의 식별을 가능하게 하는 것들, 예를 들어, DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타아제), 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 메탈로티오네인-II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나아제, 오르니틴 데카복실라아제 등이다. DHFR 선택 유전자로 형질 전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질 전환체를 배양함으로써 식별된다. 야생형 DHFR이 사용될 때의 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포주 (예를 들어, DG44)이다.
대안으로, 항-Nrp1 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택 마커, 예를 들어, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라아제 (APH)를 인코딩하는 DNA 서열로 형질 전환되거나 공동 형질 전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코사이드성 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택 마커에 대한 선택 물질 (selection agent)을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 4,965,199를 참조한다.
상기 재조합 생산이 숙주 세포로서 효모 세포에서 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자 (문헌 [Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39])가 선택 마커로서 사용될 수 있다. 상기 TRP1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1 (문헌 [Jones, 1977, Genetics 85:12])에 대한 선택 마커를 제공한다. 그 다음, 효모 숙주 세포 게놈에서의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재하의 성장에 의한 형질 전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, ATCC 번호 20,622 및 38,626과 같은 Leu2p 결핍 효모 균주는 LEU2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질 전환에 사용될 수 있다. 대안으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis)에 대해 보고되었다 (문헌 [Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135]). 클루이베로마이세스의 산업 균주에 의한 성숙한 재조합 사람 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터가 또한 개시되었다 (문헌 [Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975]).
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-Nrp1A 항체 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 인코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타아제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 세균 프로모터도 또한 적합하다. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 사람화 항-Nrp1A 항체를 인코딩하는 DNA에 작동 가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgamo: S.D.) 서열을 포함할 것이다.
다수의 진핵 생물 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵 생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25~30개 염기 업스트림에 위치하는 AT 풍부 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사 개시부터 70~80개 염기 업스트림에서 발견된 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 생물 유전자의 3' 말단에 있다. 이들 서열 모두는 진핵 생물 발현 벡터 내에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 촉진 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어, 엔올라아제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제, 헥소키나아, 피루베이트 데카복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 아이소머라아제, 포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 아이소머라아제, 포스포글루코오스 아이소머라제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터가 포함된다.
유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는다. 이들로는 알코올 데하이드로게나아제 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타아제, 질소 대사와 관련된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소에 대한 효모 프로모터 영역이 포함된다. 효모 인핸서는 또한 유리하게는 효모 프로모터와 함께 사용된다.
포유 동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항-Nrp1A 항체 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유 동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열 충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어되는데, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용 가능하다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스의 복제 원점을 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 사람 사이토메갈로바이러스의 급초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유 동물 숙주에서 DNA를 발현시키는 시스템은 미국 특허 US 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 US 4,601,978에 개시되어 있다. 단순 헤르페스 바이러스 유래의 티미딘 키나아제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 사람 p-인터페론 cDNA의 발현을 개시하고 있는 문헌 [Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]을 또한 참조한다. 대안으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
재조합 발현 벡터에 사용될 수 있는 또 다른 유용한 요소는 고등 진핵 생물에 의해 항-Nrp1A 항체를 인코딩하는 DNA의 전사를 증가시키는데 사용되는 인핸서 서열이다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유 동물 유전자 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-태아 단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스 유래의 인핸서가 사용된다. 그 예로는 복제 원점의 후기 측 상의 SV40 인핸서 (bp 100~270), 사이토메갈로바이러스의 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기 측 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵 생물 프로모터의 활성화를 위한 강화 요소의 기재에 대해 문헌 [Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]을 또한 참조한다. 상기 인핸서는 항-Nrp1A 항체 인코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 상기 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람, 또는 기타 다세포 유기체 유래의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 생물 또는 바이러스의 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3'의 비번역 영역으로부터 이용 가능하다. 이러한 영역은 항-Nrp1A 항체를 인코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 분절을 포함한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 국제공개공보 WO 94/11026 및 여기서 개시된 발현 벡터를 참조한다. 일부 실시 형태에서, 항-Nrp1A 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 US 5,888,809를 참조하며, 이의 개시 내용은 본 출원에 참조로 포함된다)
본 출원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기에서 기재된 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵 생물로는 진정 세균, 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 예를 들어, 에세리키아 (Escherichia), 예를 들어, 이 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라, 예를 들어, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아, 예를 들어, 세라티아 마르세칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실러스, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 바실러스 리케니포르미스 41P), 슈도모나스, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주 중 하나는 이. 콜라이 294 (ATCC 번호 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 번호 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 번호 27,325)과 같은 다른 균주도 적합하다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
원핵 생물에 추가하여, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 항-Nrp1A 항체 인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 스키조사카로바이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500)3, 클루이베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum), 클루이베로마이세스 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (유럽 특허 EP 402,226); 피키아 파스토르스 (Pichia pastors) (유럽 특허 EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코더마 리시아 (Trichoderma reesia) (유럽 특허 EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 슈완니오마이세스, 예를 들어, 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 숙주, 예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스 (A. nidulans) 및 아스퍼질러스 니게르 (A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종 및 균주가 본 출원에서 일반적으로 이용 가능하고 유용하다.
글리코실화된 항-Nrp1A 항체의 발현에 적합한 숙주 세포가 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포, 예를 들어, 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (초파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) (누에)와 같은 숙주 유래의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 포함된다. 형질 감염을 위한 다양한 바이러스주, 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 바이러스주가 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질 감염에 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항-Nrp1A 항체는 또한 바이러스 벡터에 도입될 수 있으며, 즉, 상기 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 바이러스 벡터 내에 도입된 다음, 바이러스 감염 후 환자의 체내에서 발현된다.
또 다른 양태에서, 항-Nrp1A 항체의 발현은 척추 동물 세포에서 수행된다. 배양 (조직 배양)에서의 척추 동물 세포 증식은 일상적인 절차가 되었으며, 기술은 널리 이용 가능하다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질 전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 사람 배아 신장 세포주 (293, 또는 현탁 배양 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293개의 세포, 문헌 [Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59]), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR1 (CHO, 문헌 [Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216], 예를 들어, DG44), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251]), 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 사람 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 사람 간 세포 (Hep G2, HB 8065), 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 세포 (문헌 [Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68]), MRC 5 세포, FS4 세포 및 사람 간암 세포주 (Hep G2)가 있다.
숙주 세포는 항-Nrp1A 항체 생산을 위한 상기에서 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질 전환되고, 프로모터의 유도, 형질 전환체의 선택 또는 목적하는 서열을 인코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본 출원에서 기재된 항-Nrp1A 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄 (Ham)의 F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), 최소 필수 배지 ((Minimal Essential Medium: MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) 및 둘베코의 변형 이글 배지 ((Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), Sigma-Aldrich Co.)와 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44], [Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255], 미국 특허 US 4,767,704, US 4,657,866, US 4,927,762, US 4,560,655, US 5,122,469, 국제공개공보 WO 90/103430 및 WO 87/00195 중 하나 이상에 기재된 배지들 중 임의의 것이 숙주 세포의 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 배지들 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES ), 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 겐타마이신), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코오스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 다른 보충제도 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
재조합 기술을 사용할 때, 상기 항체는 세포 내에서 또는 원형질막 주위 공간에서 생산되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 상기 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 상기 세포는 제1 단계로서 단백질을 방출하기 위해 파괴될 수 있다. 숙주 세포 또는 용해된 단편과 같은 미립자 잔해물은, 예를 들어, 원심 분리 또는 한외 여과에 의해 제거될 수 있다. 문헌 [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167]은 이. 콜라이의 원형질막 주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기재하고 있다. 간단히 말하자면, 세포 페이스트는 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 잔해물은 원심 분리로 제거될 수 있다. 상기 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제가 단백질 가수분해를 억제하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있으며, 항생제가 외래 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 다양한 방법이 숙주 세포로부터 상기 항체를 단리하기 위해 사용될 수 있다.
상기 세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 대표적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 상기 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A가 사람 감마1, 감마2 또는 감마4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13] 참조). 단백질 G가 모든 마우스 이소타입 및 사람 감마3에 대해 권장된다 (예를 들어, 문헌 [Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575] 참조). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로오스이지만, 다른 매트릭스도 이용 가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 상기 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스TM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전과 같은 단백질 정제를 위한 기타 기술이 또한 회수되는 항체에 따라 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심 대상 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 전형적으로 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0~0.25 M 염)로 수행되는 약 2.5~4.5의 pH의 용리 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
또한, 항-Nrp1A 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)로 표시되는 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부 (예를 들어, 가변 영역을 인코딩하는 부분)에 본 출원에서 정의된 바와 같은 낮은, 중간 및 높은 엄격도 조건하에 하이브리드화하는 핵산이 또한 포함된다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 전형적으로 적어도 15개 (예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개) 뉴클레오타이드 길이이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 항-Nrp1A 폴리펩타이드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역)를 인코딩하는 핵산의 일부 또는 전부 또는 이의 보체의 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다. 본 출원에서 기재된 유형의 하이브리드화 핵산은, 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들에 관한 것이다.
상기 항-Nrp1A 항체 및 항체 단편에서, CDR을 인코딩하는 핵산 서열은 변경되지 않은 상태 (이들이 인코딩하는 아미노산과 관련하여 변경되지 않은 상태, 코돈의 축퇴로 인한 DNA 서열의 등가물은 가능함)로 유지되지만, 주위 영역, 예를 들어, FR 영역은 조작될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
제조 물품
또 다른 양태에서, 상기에서 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 상기 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 테스트 튜브가 포함된다. 상기 용기들은 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 병태의 치료에 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균된 접속 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 상기 조성물의 활성제는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 관련된 라벨은 해당 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 상기 제조 물품은 포스페이트 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 갖는 패키지 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: DME 및 PDR 환자의 유리체에서 Sema3A의 상향 조절
당뇨병성 망막병증의 병력을 갖는 사람 공여자 유래의 샘플의 망막에서 Sema3A의 발현을 면역 조직 화학으로 조사하였다. 상기 면역 염색 프로토콜은 다음과 같았다:
1. 슬라이드를 해동하고 샘플을 실온 (room temperature: RT)에서 30분 동안 공기 건조시킨다;
2. 팝 펜 상자 (pap pen box)를 그리고 건조시킨다;
3. RT에서 5분 동안 1% SDS에서 항원을 검색한다;
4. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3회 세척한다;
5. RT에서 30분 동안 1% BSA/0.3% Triton X100/PBS 용액 (차단 용액)에서 절편을 차단한다;
6. 차단 용액에 토끼 항 Sema3a (abcam, ab23393) 일차 항체를 1:200으로 희석한다. RT에서 슬라이드에 절편을 밤새 인큐베이션한다;
7. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3회 헹군다;
8. DAPI/0.3% Triton X100/PBS 용액에서 1:400 희석으로 당나귀 항-토끼 Alexa fluor546 (invitrogen, A10040)과 함께 이차 항체 인큐베이션한다; RT에서 3 시간 동안 슬라이드 상에서 절편을 인큐베이션한다;
9. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3~5회 헹군다;
10. Aquamount로 절편을 커버슬립으로 덮고 공기 건조시킨다;
11. 40X 배율로 절편 및 등급 강도를 이미지화한다.
각 사람 공여자 당 3개의 절편 세트를 Sema3A에 대해 면역 염색하였다. 5점 등급 방식 (0=검출되지 않음, 1=낮은 강도, 약간의 반점, 2=중간 강도, 여러 반점, 3=밝은 강도, 광범위한 염색 및 4=매우 밝은 강도, 풍부한 검출)를 사용하여, 이러한 특정 작업에 대해 이전에 훈련된 관찰자에 의해 Sema3A 라벨링을 이러한 각 영역에서 독립적으로 평가하였다. 관찰자들은 안구 공여자의 건강 상태를 알지 못하였다. 망막 내에서, Sema3A는 망막 혈관의 혈관벽과 관련이 있었다. 망막 혈관계와 망막 실질에서의 Sema3A 발현은 안구 병변이 없는 당뇨병 환자와 비교하여 당뇨병 황반 부종이 있는 환자에서 증가하였다 (도 1).
실시예 2: VEGF 유도된 투과성의 억제
브라운 노르웨이 래트의 망막에서 투과성을 측정하였다. 재조합 사람 VEGF-A (250 ng/2.5 μl)를 유리체내 주사하여 과투과성을 유도한다. 항체를 VEGF와 동시에 주사한다. Evans Blue 염료 (45 mg/ml)를 VEGF 처리 후 24 시간에 미측 정중 정맥 (1 ml/kg) 내에 정맥 주사한다. 30분 후 안구를 적출하고, 포르말린에 고정한다. 망막의 평면 표본을 준비하고, 공초점 형광 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 620 nm에서 에반스 청색 형광을 측정한다.
그 결과는 도 2에 도시되어 있다. 본 발명의 항체는 VEGF에 의해 유도된 투과성을 완전히 억제한다. 이는 VEGF 트랩 애플리버셉트 (아일리아®)에 의해 관찰된 결과와 유사하다. Nrp1 리간드 세마포린 3A에 대한 항체는 망막에서 VEGF-A 유도된 투과성을 억제하지 않는다. 이는 Nrp1의 A 도메인에 대해 지시된 본 발명의 항체가 VEGF-A 매개성 효과를 억제하며 이러한 능력이 Nrp1 리간드 세마포린 3A에 대해 지시된 항체와 구별된다는 것을 확인시켜 준다. 본 발명자들은 Sema3A에 대해 지시된 항체가 Sema3A에 의해 유도된 투과성을 완전히 억제하지만 VEGF-A에 의해 유도된 투과성을 억제하지 않는다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 Nrp1의 A 도메인에 대한 항체에 의해 VEGF-A 유도된 망막 투과성의 억제가 Nrp1, VEGF 수용체 2 및 추가의 공동 수용체로 이루어진 신호 전달 홀로리셉터 복합체의 입체적 방해에 기인한다는 가설을 세운다.
실시예 3: 비교 목적을 위한 Nrp1A 및 Nrp1B에 대해 지시된 항체의 생성
비교 목적을 위해, 본 발명자들은 국제공개공보 WO 2008/143666 및 WO 2007/056470에 개시된 바와 같이 각각 Npr1A 및 Nrp1B에 대해 지시된 항체를 개발하였다. 이러한 항체로는 다음이 포함된다:
- "YW64.3"으로 지칭되는 Nrp1A에 대해 지시된 항체; 및
- "YW107.4.87"로 지칭되는 Nrp1B에 대해 지시된 항체.
상기 항-Nrp1A 항체는 국제공개공보 WO 2007/056470에서 클론 "YW64.3"으로 개시되어 있으며, 하기와 같은 특징을 갖는다:
- 중쇄 가변 도메인이 국제공개공보 WO 2007/056470에서 서열 번호 4이고,
- 경쇄 가변 도메인이 국제공개공보 WO 2007/056470에서 서열 번호 3이다.
상기 항-Nrp1B 항체는 국제공개공보 WO 2007/056470에서 클론 "YW107.4.87"로 개시되어 있으며, 하기와 같은 특징을 갖는다:
- 중쇄가 국제공개공보 WO 2007/056470에서 서열 번호 6이고,
- 경쇄가 국제공개공보 WO 2007/056470에서 서열 번호 5이다.
YW64.3 및 YW107.4.87의 서열은 하기 표 6과 같이 요약된다.
실시예 4: Sema3A 유도된 세포 골격 붕괴 검정 - Sema3A 유도된 임피던스 강하에서의 본 발명의 항체의 역가 및 본 발명의 항체와 클론 YW64.3 및 YW107.4.87 사이의 비교
XCELLigence 시스템 (Real Time Cell Analysis Instruments, ACEA Biosciences에 의해 상업화됨)을 사용하여, Nrp1 항체의 세포 활성을 사람 망막 미세 혈관 내피 세포 (human retinal microvascular endothelial cell: HRMEC)의 세포 골격 붕괴 측정에 의해 평가하였다. 상기 시스템은 세포 임피던스를 통해 세포 부착, 합류 및 완전성을 측정한다. HRMEC는 클래스 3 세마포린 홀로리셉터의 성분인 뉴로필린-1 (Nrp1)과 플렉신을 내인성으로 발현한다. 이러한 수용체 복합체에 결합함으로써, 세마포린은 상기 내피에서 F-액틴 섬유의 붕괴를 유도한다. 이러한 기능성 검정에서, 사람 망막 미세 혈관 내피 세포의 합류된 층에 대한 재조합 Sema3A 단백질의 첨가는 세포 임피던스의 감소로 측정될 때 세포 골격 붕괴 및 세포의 후속 수축으로 인해 세포 임피던스를 낮춘다.
간단히 말하자면, E-Plate를 부착 인자로 코팅하였다. 세포를 20000개 세포/웰의 밀도로 씨딩한 다음, XCELLigence 장치 내부의 정상적인 성장 조건하에 밤새 단층으로 성장하도록 하였다. Nrp1 항체 조합 함유 및 미함유 Sema3A를 3 mM CaCl2의 존재하에 첨가하였다. 세포 지수를 물질의 첨가 전 시점으로 정규화하였다. 자극 후 5 시간에 계산을 수행하였다.
기능적 역가의 결정 및 세포 골격 붕괴 검정에서 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I), 클론 YW64.3 및 YW107 .4.87, 및 Sema3A에 대해 지시된 항체 사이의 비교를 위해, Sema3A 농도 반응 곡선을 IC50 이동 실험으로서 증가하는 항체 농도와 조합하였다. pA2 값 (Sema3A 농도 반응 곡선을 인자 2 만큼 이동시키는데 필요한 항체 농도의 역대수 (negative logarithm))을 계산하기 위해 Gaddum Schild 플롯을 수행하였다. M의 역가를 pA2 값으로부터 =역가(10;-X)로 계산하였으며, 하기 표 7에 개시되어 있다.
실시예 5: VEGF 유도된 세포 완전성 손실 검정 - VEGF-A 유도된 임피던스 강하에서의 본 발명의 항체의 역가 및 본 발명의 항체, 클론 YW64.3 및 YW107.4.87, 및 VEGF 트랩 사이의 비교
VEGF-A는 내피 세포에서 일시적인 임피던스 강하로서 측정될 수 있는 세포-세포 접촉의 이완을 유도한다. 본 발명의 항체는 기능적 VEGF-A 유도된 임피던스 강하를 방지한다. XCELLigence 시스템 (Real Time Cell Analysis Instruments, ACEA Biosciences에 의해 상업화됨)을 사용하여, VEGF 유도된 세포 완전성 손실을 방지하는 Nrp1 항체의 세포 활성을 사람 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMEC)의 임피던스 강하 측정에 의해 평가하였다. HRMEC는 VEGF 홀로리셉터의 성분인 뉴로필린-1 (Nrp1)과 VEGFR2를 내인성으로 발현한다. VEGF-A는 내피 세포들 사이에서 세포 연접의 이완을 유도한다. 이러한 기능성 검정에서, 사람 망막 미세 혈관 내피 세포의 합류된 층에 대한 재조합 VEGF-A 단백질의 첨가는 세포 완전성의 손실로 인해 세포 임피던스를 낮춘다.
간단히 말하자면, E-Plate를 부착 인자로 코팅하였다. 세포를 20000개 세포/웰의 밀도로 씨딩한 다음, XCELLigence 장치 내부의 정상적인 성장 조건하에 밤새 단층으로 성장하도록 하였다. VEGF-A 및 항체를 첨가하기 전 3 시간 동안 배양 배지를 0.5% BSA를 함유하는 무혈청 배지로 교체하였다. 세포 지수를 물질의 첨가 전 시점으로 정규화하였다. 자극 후 약 30분에 최소의 VEGF 유도된 임피던스에서 계산을 수행하였다.
기능적 역가의 결정을 위해, 고정 농도의 재조합 사람 VEGF-A에 의해 유도된 세포 완전성의 손실을 방지하는 항체의 EC50을 측정하였다. 개별 실험의 EC50 값의 기하 평균값을 계산하였다. 그 결과는 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I) 및 여러 비교 분자에 대해 하기 표 8에 요약되어 있다.
실시예 6: 마우스 OIR 모델에서 정단 세포 밀도, 무혈관 부위 및 망막전 다발에 대한 항-VEGF 처리 및 항-Nrp1A의 효과
허혈성 무혈관 부위의 재생 혈관 형성에 대한 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)의 효과를 산소 유도된 망막병증 (OIR)의 마우스 모델에서 조사하였다. C57Bl/6J 마우스의 한배새끼들을 생후 7 일차부터 생후 12 일차까지 75% 산소의 대기에 노출시켰다. 이는 중심 망막의 혈관 퇴행과 무혈관 부위의 형성을 유도한다. 정상 산소 상태로 복귀한 후, 이러한 부위는 허혈이 된다. 상기 새끼들은 생후 12 일차에 이소플루란에 의한 마취하에 각 안구에 0.5 μl 용액 중의 10 μg 항체의 단일 유리체내 주사를 투여받는다. 생후 17 일차에, 동물을 희생시키고, 안구를 적출한다. 안구를 포르말린에 고정하고, 망막 혈관을 이소렉틴 B4로 염색한 망막의 평면 표본을 준비한다. 정단 세포 (신생 혈관의 형성을 개시하는 특수 내피 세포)의 수를 전체 망막 (망막의 혈관 형성된 말초 부위와 무혈관 중심 부위 사이의 경계)을 따라 무혈관 경계에서 계수한다. 정단 세포는 사상위족 확장을 나타내는 특별한 형태에 의해 확인되었다. 분석을 위해, 정단 세포의 수를 무혈관 경계의 길이로 정규화한다. 공초점 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 무혈관 부위의 크기를 결정한다. 반대쪽 안구를 아이컵의 조직학적 절편에 사용하고, 망막전 핵을 계수하였다.
본 발명의 항체는 마우스 OIR 모델에서 정단 세포 밀도를 증가시킨다 (도 3a). 또한, 이는 무혈관 부위의 감소를 나타낸다 (도 3c). 대조적으로, VEGF 트랩 애플리버셉트 (아일리아®)는 정단 세포 밀도를 증가시키지도 않고 무혈관 부위를 감소시키지도 않는다. 정단 세포 밀도와 무혈관 부위의 크기 사이에는 음의 상관 관계가 있으며 (도 3b), 이는 상기 2개의 파라미터의 기계적 의존성을 나타낸다. 전반적으로, 본 발명의 항체는 산소 유도된 망막병증의 동물 모델에서 허혈성 무혈관 부위 크기를 감소시키며, 이는 당뇨병성 황반 허혈에서 유익한 효과를 나타낸다. 망막전 핵에 의해 입증되는 유리체의 병리학적 신생 혈관 형성은 애플리버셉트에 의해 억제된 반면, 본 발명의 항체는 이러한 병리학적 병태의 적당한 감소를 나타냈다 (도 3d).
실시예 7: 토끼 안구에서 본 발명의 항체와 아바스틴 t1/2의 비교
본 발명자들은 다양한 조건에서 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)의 반감기를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 9에 요약되어 있다.
계산된 반감기는 유리체, 망막 및 안방수에서 각각 4.8, 3.5 및 4.5일이었다. 이러한 반감기는 임상적으로 사용된 재조합 사람화 단클론 IgG1 항체 아바스틴에 대한 문헌에 보고된 것들 (항-VEGF, 베바시주맙, 문헌 [Bakri et al., Opthalmology, 2007])과 유사하며, 이는 내부에서도 또한 실험적으로 확인되었다. 전장 IgG의 유리체내 제거율이 본 발명의 항체 및 아바스틴®에 대해 유사한 이의 분자 크기에 주로 좌우되기 때문에, 이러한 결과는 예상된 바와 같았다. 그러므로, 본 발명의 항체 및 아바스틴®의 안구 반감기를 비롯한 사람 PK는 유사할 것으로 예상된다. 아바스틴®의 보고된 사람 안구 반감기는 9.73 ± 1.48일이다 (문헌 [Hutton-Smith, 2016]).
실시예 8: 사람 Nrp1A에 대한 결합 친화도
본 발명자들은 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)의 결합 친화도를 평가하였다.
본 실험을 위한 실행 완충액 및 모든 희석액 (명시된 경우 제외)을 0.01% Tween20을 함유하는 PBS-T-EDTA [100 ul의 100% Tween20을 2L의 PBS-T-EDTA에 첨가하여 0.01%의 최종 Tween 20 농도를 제조함]에서 수행하였다. GLM 센서칩을 제조업자의 권고 사항에 따라 정규화하고 예비 조건화하였다. 센서 칩을 30 μl/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 EDC/s-NHS의 동일 혼합물에 의해 활성화시키고, 30 μl/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 Recombinant Protein A/G (10 mM 아세테이트 (pH 4.5) 중의 6 μg/ml)에 의해 고정시켜 표면 상에서 약 4370~4875 RU의 Protein A/G를 생성하였다. 센서칩을 30 μl/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 1M 에탄올아민-HCl에 의해 탈활성화시켰다. 센서칩을 100 μl/분의 유속에서 수평으로 3회, 수직으로 3회 18초 동안 0.85% 인산에 의해 안정화하였다.
본 발명의 항체 (0.6 μg/ml)를 300초 동안 30 μl/분의 유속으로 Protein A/G 표면 상에 수직으로 포획하여 약 1678 RU 포획 수준을 수득하였다. PBS-T-EDTA를100 μl/분의 유속 및 120초의 해리로 60초 동안 수평으로 주사하여 기준선을 안정화시켰다. 분석물을 포획된 항체 위에 30 μl/분의 유속 및 1800초의 해리로 300초 동안 수평으로 주사하였다. 분석물의 농도는 0 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM이었다. 0.85% 인산을 100 μl/분의 유속에서 18초 동안 수평으로 1회, 수직으로 1회 주사하여 표면을 재생시켰다. PBS-T-EDTA를 100 μl/분의 유속에서 60초 동안 수직으로 1회, 수평으로 1회 주사하였다.
미가공 데이터로부터 인터스팟 (interspot) (센서 표면과의 상호 작용) 및 블랭크 (0.01% Tween20을 함유하는 PBS-T-EDTA 또는 0 nM 분석물)를 공제한다. 그다음, 온-레이트 (on-rate) (ka), 오프-레이트 (off-rate) (kd) 및 친화도 (KD) 값을 제공하기 위해 센서그램을 1:1 Langmuir 결합에 전체적으로 피팅하였다.
그 결과는 하기 표 10에 요약되어 있다.
실시예 9: 본 발명의 항체의 면역원성 평가
본 발명자들은 본 발명에 따른 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)의 예측된 면역원성을 평가하였다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자들은 이러한 T 세포 에피토프를 예측하기 위한 인실리코 도구 (EpiVax에 의해 개발된 EpiMatrix)를 사용하였다.
다수의 사람 항체 분리물의 서열을 스크리닝함으로써, EpiVax는 조절 잠재력을 갖는 것으로 여겨지는 몇 가지 고도로 보존된 HLA 리간드를 확인하였다. 실험적 증거는 이러한 펩타이드들 중 다수가 대부분의 대상체에서 적극적으로 면역 관용적이다는 것을 제시한다. 이러한 고도로 보존되고 조절되고 뒤섞인 T 세포 에피토프는 트레지토프 (Tregitope)로서 공지되어 있다 (문헌 [De Groot et al. Blood. 2008 Oct 15;112(8):3303-11]). 사람화 항체에 포함된 네오-에피토프의 면역원성 잠재력은 유효 수의 트레지토프의 존재하에 효과적으로 제어될 수 있다.
항체 면역원성 분석의 목적을 위해, EpiVax는 항-치료학적 항체 반응의 트레지토프 조정된 EpiMatrix Score 및 상응하는 예측을 포함한다. 트레지토프 조정된 EpiMatrix Score를 계산하기 위해, 트레지토프의 점수는 EpiMatrix Protein Score로부터 공제된다. 트레지토프 조정된 점수는 23개의 상업용 항체 세트에 대해 관찰된 임상 면역 반응과 매우 상관 관계가 있는 것으로 나타났다 (문헌 [De Groot et al. Clin Immunol. 2009 May;131(2):189-201]).
EpiMatrix 척도에 대한 결과는 하기 표 11에 요약되어 있다.
본 발명의 항체의 서열은 EpiMatrix 척도의 하한점에서 점수를 받았으며, 이는 본 발명의 항체가 면역원성에 대해 강력하게 제한된 잠재력을 갖는 다는 것을 나타낸다. 상기 EpiMatrix 척도는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 특히 문헌 [Mufarrege et al. Clin Immunol., 2017 Mar;176:31-41]의 도 2에서 발견될 수 있다.
실시예 10: 본 발명의 항체, YW64.3 및 YW107.4.87의 사람 Nrp1에 대한 결합 친화도의 비교
본 발명자들은 사람 Nrp1에 대한 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)의 결합 친화도 뿐만 아니라 사람 Nrp1에 대한 YW64.3 및 YW107.4.87의 결합 친화도를 평가하였다.
본 실험을 위한 실행 완충액 및 모든 희석액 (명시된 경우 제외)을 0.01% Tween20을 함유하는 PBS-T-EDTA [100 ul의 100% Tween20을 2L의 PBS-T-EDTA에 첨가하여 0.01%의 최종 Tween 20 농도를 제조함]에서 수행하였다. GLM 센서칩을 제조업자의 권고 사항에 따라 정규화하고 예비 조건화하였다. 센서 칩을 30 μl/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 EDC/s-NHS의 동일 혼합물에 의해 활성화시키고, 30 μl/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 Recombinant Protein A/G (10 mM 아세테이트 (pH 4.5) 중의 60 μg/ml)에 의해 고정시켰다. 센서칩을 30 μl/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 1M 에탄올아민-HCl에 의해 탈활성화시켰다. 센서칩을 100 μl/분의 유속에서 수평으로 3회, 수직으로 3회 18초 동안 0.85% 인산에 의해 안정화하였다.
본 발명의 예시적인 항체 및 YW64.3 및 YW107.4.87을 6개의 수직 채널 중 3개에 걸쳐 Protein A/G 표면 위에 포획하였다. 사람 Nrp1A를 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 0 nM의 농도로 PBS-T-EDTA 완충액에서 제조하였다. PBS-T-EDTA 완충액 주사는 동력학 데이터 분석을 위한 이중 참조로서 사용되었다. 각각의 사람 Nrp1A 용액과 PBS-T-EDTA 완충액을 40 μL/분의 유속으로 5분 동안 6개의 수평 채널에 걸쳐 동시에 주사한 후 30분 해리 단계를 수행하였다. 100 μL/분의 유속으로 0.85% 인산을 18초 동안 주사한 후 100 μL/분의 유속으로 60초 동안 PBS-T-EDTA를 주사하여 표면을 재생하였다. 미가공 데이터로부터 인터스팟 (interspot) (센서 표면과의 상호 작용) 및 블랭크 (0.01% Tween20을 함유하는 PBS-T-EDTA 또는 0 nM 분석물)를 공제한다. 그다음, 온-레이트 (ka), 오프-레이트 (kd) 및 친화도 (KD) 값을 제공하기 위해 센서그램을 1:1 Langmuir 결합에 전체적으로 피팅하였다.
사람 Nrp1에 대한 본 발명의 항체, YW64.3 및 YW107.4.87 결합의 동력학 및 친화도 데이터는 각각 하기 표 12에 열거되어 있다.
실시예 11: 본 발명의 항체와 YW64.3의 단백질 열 안정성의 비교
시차 주사 열량 측정법 (differential scanning calorimetry: DSC)은, 온도의 함수로서 열용량을 측정하고 단백질 입체 형태의 열 안정성을 평가하는 가장 정확한 방법을 구성하는 열역학적 기술이다. DSC는 단백질 열 안정성과 입체 형태 변화를 평가하는데 널리 사용된다. 동일한 용액 환경에서 단백질이 부족한 참조 세포와 샘플 세포로부터의 신호를 비교한다. 세포의 온도가 증가함에 따라, 참조 세포와 샘플 세포 사이의 온도 차이가 지속적으로 측정되고 전력 단위 (power unit)로 보정된다. 이러한 데이터 채널은 DP 신호, 또는 참조 세포와 샘플 세포 사이의 차동 전력으로서 지칭된다. 상기 DP 신호는 열용량으로 변환된다. 상기 열용량은 온도의 함수로서 지속적으로 기록된다. 완충액 공제 및 생성된 서모그램 (thermogram) 분석 후, 각 전이에 대한 엔탈피 및 (겉보기) 열 전이 중간점 (T m)을 수득할 수 있다.
단백질 언폴딩 온도 (T m)는 항체의 안정성, 특히, 보관 동안의 응집 및 치료 제품의 장기간 안정성과 관련이 있다. 단클론 항체 CH2 및 CH3 도메인의 열 전이는 전형적으로 이소타입 내의 상이한 항체에 대해 변하지 않으며, CH2 도메인은 CH3 도메인 보다 먼저 언폴딩된다.
본 발명자들은
- 본 발명의 항체, 보다 정확하게는 VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I, 및
- 비교 목적으로 사용된 본 출원의 실시예 3에 개시된 바와 같은 클론 YW64.3
의 T m을 비교하였다.
10 mM 히스티딘 (pH 6.0) 중 1 mg/ml의 납 (lead) 화합물 및 YW64.3의 열 언폴딩 및 응집을 자동 모세관 시차 주사 열량계 (MicroCal, LLC)를 통해 60 ℃/시간의 주사 속도로 25℃에서 110℃까지 모니터링하였다. Origin 7.0 소프트웨어 (Origin-Lab)를 사용하여 상기 데이터를 분석하였다. 모든 서모 그램을 기준선 수정하고, Origin의 2-상태 모델을 사용하여 피팅하여 언폴딩에 대한 겉보기 중간점 온도 (T m)를 수득하였다.
납 화합물과 YW64.3의 용융 곡선은 하기 표 13에 개시시되어 있다.
10 mM 히스티딘 (pH 6) 중의 본 발명의 항체의 경우, 제1 T m은 68.33℃에서 발생하였으며, 이는 CH2 도메인의 언폴딩에 상응할 가능성이 있다. 상기 2개의 추가의 T m의 83.23℃ 및 89.70℃는 각각 CH3 도메인 및 Fab 영역에 상응한다. 유사하게, YW64.3의 경우, CH2 도메인이 68.5℃에서, CH3이 81.96℃에서, 마지막으로 Fab 도메인이 84.65℃에서 언폴딩된다. 그러므로, Fab 언폴딩 온도는 YW64.3과 비교하여 본 발명의 항체에 대해 약 5℃ 더 높다.
보다 높은 T m 값은 보다 적은 수의 분자가 주어진 온도에서 언폴딩 상태를 채운다는 것을 의미한다. 따라서, 높은 T m 값이 생리학적 온도에서 활성 입체 형태를 유지하므로, 보다 높은 T m 값이 치료용 단백질 약물에 유리한다.
실시예 12: 본 발명의 항체는 VEGF에 대한 Nrp1의 결합을 방지하지 않는다
본 발명자들은 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)가 VEGF의 존재 및 경쟁적 검정에서의 Nrp1에 대한 결합하에서도 사람 Nrp1에 결합할 수 있다는 것을 추가로 밝혀냈다.
이러한 목적을 위해, 샘플 플레이트에서 2분 동안 1x 운동 완충액 (kinetic buffer) (Molecular Devices)에서 제조된 10 ug/mL 비오티닐화된 hVEGF165 용액 중에 각 센서를 침지함으로써, 비오티닐화된 사람 혈관 내피 성장 인자-165 (hVEGF165)를 스트렙타비딘 센서 팁 상에서 포획하였다. 그 다음, 상기 센서를 2분 동안 임의의 미결합 분자를 세척 제거하기 위해 1x 운동 완충액을 함유하는 웰로 이동시켰다. 1x 운동 완충액에서 제조된 100 nM의 사람 Nrp1을 10분 동안 hVEGF165를 통해 포획하였다. 마지막으로, 센서를 다양한 농도의 본 발명의 항체 (100 nM 및 400 nM)에 10분 동안 침지하였다.
활성 센서로부터의 데이터를 hVEGF165 포획 없음, hNrp1 없음 및 항체 없음을 비롯한 여러 대조군과 비교하였다.
상기 데이터는 본 발명의 항체가 VEGF의 존재 및 Nrp1에 대한 결합에서도 사람 Nrp1에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 4).
이는 본 발명의 항체가 VEGF와 사람 Nrp1의 결합을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 본 발명의 항체는 VEGF-A 유도된 내피 세포 증식을 방지하지 않는다
VEGF-A는 증식을 유도하는 내피 세포에 대한 가장 중요한 성장 인자 중 하나이다. Incucyte 시스템 (Sartorius)을 사용하여 내피 세포 증식을 사람 망막 미세 혈관 내피 세포 (human retinal microvascular endothelial cell: HRMEC)에서 조사하였다. 본 기능성 검정에서, HRMEC의 덜 합류된 (subconfluent) 층에 대한 재조합 VEGF-A 단백질의 첨가는 이의 증식을 유도한다.
간단히 말하자면, 96-웰 플레이트를 젤라틴으로 코팅하였다. 세포를 3000개 세포/웰의 밀도로 씨딩한 다음, 18 시간 동안 전체 내피 성장 배지에서 부착되도록 하였다. 2% FCS로 보충된 내피 기본 배지로 세포를 1회 세척한 다음, 8 시간 동안 동일한 배지에서 배양하였다. VEGF-A 및/또는 항체, 예를 들어, 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I)를 첨가하고, 세포를 Incucyte 장치 내부에서 성장하도록 하였다. 위상 대비 사진을 총 96 시간 동안 4 시간 마다 촬영하였다. 이미지를 사용하여 세포 수를 평가하였다. 세포 수를 물질의 첨가 전 시점으로 정규화하였다. 곡선 아래 면적을 성장 곡선으로부터 계산하고, 기준값을 공제하였다 (도 5).
본 발명자들은 본 발명의 항체가 10 ng/mL VEGF-A에 의해 유도된 내피 세포 증식을 방지하지 않는 반면, VEGF 트랩 애플리버셉트 (아일리아®)가 VEGF-A 유도된 HRMEC 증식의 용량 의존적 감소를 나타낸다는 것을 밝혀냈다.
실시예 14: VEGF 유도된 네트워크 형성 검정 - 섬유 아세포와의 공동 배양에서 VEGF-A 유도된 내피 네트워크 유사 구조 형성에서의 본 발명의 항체의 효능, 및 본 발명의 항체와 VEGF 트랩 사이의 비교
VEGF-A는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장을 강력하게 유도하는 혈관 형성의 핵심 조절 인자이다. 혈관 형성은 섬유 아세포 층 위에서 배양될 때 네트워크 유사 구조로 배열되는 내피 세포의 능력으로서 시험관 내에서 측정될 수 있다. 내피 세포 마커 CD31에 의한 염색 후 네트워크 형성을 정량화할 수 있다.
본 발명자들은
- 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I), 및
- 항-VEGF 항체 (베바시주맙, 아바스틴®)
의 VEGF 유도된 내피 네트워크 형성을 방지하는 능력을 평가하고 비교하였다.
보다 정확하게, VEGF 유도된 내피 네트워크 형성을 방지하는 상기 화합물의 세포 활성을, 섬유 아세포와의 공동 배양에서 VEGF-A 유도된 내피 네트워크 구조 형성을 방지하는 이의 능력에 의해 평가하였다. HUVEC는 VEGF 홀로리셉터의 성분인 뉴로필린-1 (Nrp1)과 VEGFR2를 내인성으로 발현한다. 본 기능성 검정에서, 섬유 아세포의 합류된 층 위에서 씨딩된 내피 세포에 대한 재조합 VEGF-A 단백질의 첨가는 내피 네트워크의 형성을 증가시킨다.
간단히 말하자면, 청소년 포피 유래의 정상 사람 진피 섬유 아세포 (normal human dermal fibroblast: NHDF)를 FGM-2 배지와 EGM 배지의 혼합물 중의 25000개 세포/웰의 밀도로 동일한 부분으로 CellCarrier Ultra 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. NHDF를 1회의 배지 교체와 함께 7일 동안 정상 성장 조건하에 배양하였다. 배지를 제거하고, 사람 제대 정맥 내피 세포 (human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)를 NHDF 위에 1/10 EGM/EBM 혼합물 중의 5000개 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다.
HUVEC를 인큐베이터에서 4 시간 동안 부착하도록 하였다. 배지를 제거하고, 세포를 고정 농도의 재조합 사람 VEGF-A로 자극하고, 1/10 EGM/EBM 배지에서 항체의 농도 반응 곡선을 자극하였다. 3 일차에 새로 준비된 자극 배지로 교체하면서 세포를 정상 배양 조건하에 7일 동안 배양하였다.
그 다음, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 70% 에탄올/H2O에 고정한 후, DPBS + 1% BSA에서 30분 동안 차단하였다. 내피 세포를 실온에서 60분 동안 CD31 항체 (Miltenyi 130-108-038)로 염색하였다. DPBS로 3회 세척한 후, 488 라벨링된 이차 항체 (항-마우스 IgG PAb-A488 PLUS; Thermo A32723)와 Hoechst를 첨가하고, 실온의 암실에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 DPBS로 3회 세척하였다. AF488 및 Hoechst를 위한 채널에서 5x 에어 대물 렌즈를 갖는 Opera Phenix를 사용하여 플레이트를 이미지화하였다. 핵의 Hoechst 염색은 세포 층이 염색 절차 후 온전하다는 것을 확인시켜 주는 역할만 하였지만, 이미지 분석에는 포함되지 않았다. Harmony 4.9 소프트웨어를 사용하여 웰 당 488 양성 네트워크 부위를 계산하였다.
기능적 역가의 결정을 위해, 고정 농도의 재조합 사람 VEGF-A에 의해 유도된 내피 네트워크 형성을 방지하는 항체의 IC50을 측정하였다.
VEGF-A 유도된 네트워크 부위 (= 평균 VEGF-A 유도된 네트워크 부위 - 평균 기본 네트워크 부위)를 계산하여 100%로 설정하였다. 그 결과는 도 6에 도시되어 있다.
상기 데이터를 VEGF-A 효과에 대해 평균 ± SD로서 표시한다. 개별 실험의 IC50 값의 기하 평균값을 계산하였다. 최대 효능을 VEGF 유도된 네트워크 부위의 억제 퍼센트로서 최고 항체 농도에서 계산하고, 평균을 계산하였다. 그 결과는 표 14에 요약되어 있다.
본 발명자들은 본 발명의 항체가 VEGF-A 유도된 시험관내 혈관 형성에 실질적인 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀냈다. 대조적으로, VEGF 트랩 (베바시주맙, 아바스틴®)은 VEGF-A 유도된 네트워크 형성을 효과적이고 강력하게 방지하였다.
이러한 결과는 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지하면서 VEGF-A 유도된 혈관 형성에 영향을 미치지 않는 본 발명의 항체의 놀랍고도 예상치 못한 특성을 확인시켜 준다.
실시예 15: 브라운 노르웨이 래트에서의 레이저 유도된 맥락막 신생 혈관 형성 - 브라운 노르웨이 래트에서 맥락막 신생 혈관 형성에 대한 본 발명의 항체의 효능, 및 본 발명의 항체와 VEGF 트랩 사이의 비교
VEGF-A는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장을 강력하게 유도하는 혈관 형성의 핵심 조절 인자이다. 혈관 형성은 레이저 광응고에 의한 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelium: RPE)와 브루크 막 (Bruch's membrane)에서의 병변 생성 후 VEGF-A 의존적 맥락막 신생 혈관 형성으로서 생체내 안구에서 측정될 수 있다. RPE, 맥락막 및 공막의 평면 표본에서 이소렉틴 B4에 의한 병변 염색 후 신생 혈관 형성을 정량화할 수 있다. 본 실험적 생체내 모델은 부르크 막을 천공하기 위해 레이저 손상에 의존하며, 이는 맥락막에서 망막하 혈관 동원을 초래한다. 이는 테스트 항혈관 형성 요법에 유용한 것으로 판명된다.
본 발명자들은
- 본 발명의 예시적인 항체 (VH로서 서열 번호 10에 나타낸 서열 및 VL로서 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 클론 I), 및
- VEGF 트랩 (애플리버셉트, 아일리아®)
의 레이저 유도된 맥락막 신생 혈관 형성에 대한 효과를 평가하고 비교하였다.
160 g 내지 180 g의 체중을 갖는 수컷 브라운 노르웨이 래트 (BN/Crl)를 Charles River Labs (Sulzfeld, Germany)으로부터 입수하였다. 마취하에, 동물을 안저 카메라 앞에 배치하여 시신경을 이미지의 중심에 위치시켰다. Micron IV 시스템 (Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA)을 사용하여, 레이저 처리를 532 nm 파장의 녹색 아르곤 레이저 (Merilas)로 수행하였다.
레이저 빔의 직경을 시신경의 직경과 일치시키고, 400 mW의 에너지와 150 msec의 지속 시간을 갖는 레이저 펄스를 사용하여 안구 당 4개의 병변을 생성하였다.
직경의 약 2배인 시신경으로부터 일정 거리를 갖는 큰 혈관들 사이에 병변을 배치하였다. 부르크 막의 성공적인 파괴를 레이저 빔 직후 기포의 형성으로 인식하고, OCT 스캔으로 확인하였다.
유리체내 주사를 위해, 래트를 케타민 (67 mg/kg) 및 자일라진 (6.7 mg/kg)의 복강내 주사에 의해 마취시켰다. 동공을 Mydrum 점안약의 국소 도포에 의해 확장시키고, 추가로, 동물에게 진통제 점안약 (Novesine 0.4%)을 투여하였다. 유리체내 주사를 거상연에서 34G Hamilton 주사기로 수행하였다. 각 안구에 5 μl의 양의 2회 유리체내 주사를 투여하였다. 제1 유리체내 주사를 1 일차에 레이저 처리 (동일한 마취 내에서) 직후 수행하고, 제2 유리체내 주사를 8 일차에 수행하였다.
동물을 마취하의 경부 탈구에 의한 레이저 처리 후 14일에 희생시켰다. 안구를 적출하여 거상연를 따라 절단하였다. 각막, 홍채, 수정체, 유리체 및 망막을 제거하고, 나머지 아이컵 (RPE, 맥락막 및 공막으로 이루어짐)을 4℃에서 1 시간 동안 PFA (4%)에 고정한 다음, 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 4℃에서 1 시간 동안 옮겼다. 상기 아이컵을 FITC 라벨링된 이소렉틴 B4 (식염수 중의 10 μg/ml)로 실온의 암실에서 밤새 염색하고, PBS로 3회 세척하였다. 상기 아이컵을 유리 슬라이드로 옮기고, 4회 절단하여 평평한 클로버잎 유사 구조를 달성하였다. 조직을 봉입제 (DAPI를 포함하는 Vectashield H-1200)로 덮고, 커버슬립을 그 위에 올려 RPE/맥락막/공막 평면 표본 (RPE 측을 위로)을 수득하였다. 상기 샘플을 LSM 700 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Carl Zeiss, Jena)으로 488 nm의 파장에서 분석하고, 병변 크기를 이미지 분석에 의해 결정하였다.
그 결과는 도 7에 도시되어 있다. 본 발명의 항체는 병변 부위에 영향을 미치지 않은 반면, VEGF 트랩 아일리아®는 병변 부위를 24%까지 감소시켰다. 그러므로, 본 발명의 항체는 브라운 노르웨이 래트에서 VEGF-A 의존적 맥락막 신생 혈관 형성에 영향을 미치지 않았다.
상기 결과는 본 발명의 항체가 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 형성을 억제하지 않다는 것을 확인시켜 준다. 이는 본 발명의 항체가 재생 혈관 형성이 촉진되어야 하는 임상 상황, 예를 들어, 망막의 재생 혈관 형성으로부터 이익을 얻을 당뇨병성 황반 허혈을 앓고 있는 환자에서 매우 유용하다는 것을 확인시켜 준다.
본 발명의 개시 내용 전체에 걸쳐 설명된 바와 같이, 본 발명의 항체는 Sema3A의 혈관 반발 효과를 억제함으로써 혈관 형성을 허혈성 영역으로 재지정할 수 있도록 한다. 또한, 이는 한편으로는 Sema3A에 의해, 다른 한편으로는 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽 파괴를 방지한다.
VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성에 대한 억제 효과에도 불구하고, 본 발명의 항체는 놀랍게도 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 형성에 영향을 미치지 않는다.
결과적으로, 본 출원에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 재생 혈관 형성을 방지하지 않으며, 이는 허혈성 영역의 혈관 형성을 방해하지 않을 것이다는 것을 나타낸다. 그러므로, 이러한 결과는 본 발명의 항체가 전형적으로는 PDR, 특히, DMI를 앓고 있는 환자의 망막에서 허혈성 무혈관 영역의 재생 혈관 형성을 향상시키는데 매우 유익하다는 것을 확인시켜 준다.
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light Chain - Clone I
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain - Clone II
<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 21
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain - Clone III
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gln Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 22
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain- Clone IV
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Gln Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 23
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain- Clone V
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 24
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain- Clone VI
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gln Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Gln Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 25
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain- Clone VII
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Gln Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 26
<211> 923
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human Nrp1A
<400> 26
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys
20 25 30
Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr
35 40 45
His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr
50 55 60
Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg
65 70 75 80
Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn
85 90 95
Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val
100 105 110
Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
115 120 125
Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Ile Phe Lys Arg Gly
130 135 140
Pro Glu Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser
145 150 155 160
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile
165 170 175
Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe
180 185 190
Asp Leu Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr
195 200 205
Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile
210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser
275 280 285
Asp Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu
290 295 300
Arg Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp
305 310 315 320
Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val
325 330 335
Thr Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys
340 345 350
Tyr Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp
355 360 365
Trp Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn
370 375 380
Thr Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile
385 390 395 400
Thr Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser
405 410 415
Met Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser
420 425 430
Gly Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr
435 440 445
Ser Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu
450 455 460
Val Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr
465 470 475 480
Ile Asn Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg
485 490 495
Gly Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met
500 505 510
Arg Lys Phe Lys Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met
515 520 525
Ile Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn
530 535 540
Asn Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg
545 550 555 560
Phe Ile Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu
565 570 575
Arg Met Glu Leu Leu Gly Cys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala Gly Pro
580 585 590
Thr Thr Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Glu Cys Asp Asp Asp Gln Ala
595 600 605
Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly Gly Thr
610 615 620
Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser Thr Ile Gln
625 630 635 640
Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp Gly Ser
645 650 655
His Lys Thr Phe Cys His Trp Glu His Asp Asn His Val Gln Leu Lys
660 665 670
Trp Ser Val Leu Thr Ser Lys Thr Gly Pro Ile Gln Asp His Thr Gly
675 680 685
Asp Gly Asn Phe Ile Tyr Ser Gln Ala Asp Glu Asn Gln Lys Gly Lys
690 695 700
Val Ala Arg Leu Val Ser Pro Val Val Tyr Ser Gln Asn Ser Ala His
705 710 715 720
Cys Met Thr Phe Trp Tyr His Met Ser Gly Ser His Val Gly Thr Leu
725 730 735
Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln Leu Val
740 745 750
Trp Met Ala Ile Gly His Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly Arg Val
755 760 765
Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu Gly Glu
770 775 780
Ile Gly Lys Gly Asn Leu Gly Gly Ile Ala Val Asp Asp Ile Ser Ile
785 790 795 800
Asn Asn His Ile Ser Gln Glu Asp Cys Ala Lys Pro Ala Asp Leu Asp
805 810 815
Lys Lys Asn Pro Glu Ile Lys Ile Asp Glu Thr Gly Ser Thr Pro Gly
820 825 830
Tyr Glu Gly Glu Gly Glu Gly Asp Lys Asn Ile Ser Arg Lys Pro Gly
835 840 845
Asn Val Leu Lys Thr Leu Asp Pro Ile Leu Ile Thr Ile Ile Ala Met
850 855 860
Ser Ala Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Val Leu Tyr
865 870 875 880
Cys Ala Cys Trp His Asn Gly Met Ser Glu Arg Asn Leu Ser Ala Leu
885 890 895
Glu Asn Tyr Asn Phe Glu Leu Val Asp Gly Val Lys Leu Lys Lys Asp
900 905 910
Lys Leu Asn Thr Gln Ser Thr Tyr Ser Glu Ala
915 920
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Epitope
<400> 27
Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW64.3- HC
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Glu
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW64.3-LC
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Val Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW64.3-VH
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Glu
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW64.3-VL
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Val Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 32
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW107.4.87- HC
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met Ser Lys Val Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW107.4.87- LC
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Gly Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 34
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW107.4.87- VH
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
35 40 45
Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met Ser Lys Val Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YW107.4.87- VL
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Gly Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
Claims (25)
- 하기를 포함하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
- 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역. - 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서,
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고; 여기서,
- 상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 1의 아미노산 서열 (H-CDR1), 서열 번호 2의 아미노산 서열 (H-CDR2) 및 서열 번호 3의 아미노산 서열 (H-CDR3)을 포함하고;
- 상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열 번호 5의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 (L-CDR3)을 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
- 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
a. 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
b. 서열 번호 12 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
c. 서열 번호 13 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
d. 서열 번호 14 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
e. 서열 번호 15 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄;
f. 서열 번호 16 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄; 또는
g. 서열 번호 17 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄
를 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
- 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 중쇄; 및
- 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 경쇄
를 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
a. 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
b. 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
c. 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
d. 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
e. 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
f. 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
g. 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 서열 번호 26에 제시된 바와 같은 사람 Nrp1A의 68~77번 아미노산 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 서열 번호 27에 제시된 서열에 결합하는 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 또는 망막 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제11항에 있어서, 상기 질환이 망막병증, 미숙아 망막병증과 같은 증식성 망막병증, 허혈성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 변성, 색소성 망막염, 유전성 망막 이영양증, 근시 변성, 망막 정맥 폐색, 망막 동맥 폐색, 안구내염, 포도막염, 낭포 황반 부종, 임의의 망막 질환에 이은 맥락막 신생 혈관 막 질환, 시신경 병증, 녹내장, 망막 박리, 독성 망막병증, 방사선 망막병증, 외상성 망막병증, 약물 유발성 망막 혈관병증, 망막 신생 혈관 형성, 결절성 맥락막 혈관병증, 망막 혈관염, 망막 미세 동맥류, 푹스 이영양증 (Fuch's dystrophy), 황반 모세혈관 확장증, 어셔 증후군 및 스타가르트병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 질환이 증식성 당뇨병성 망막병증 및 비증식성 당뇨병성 망막병증을 포함한 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 황반 허혈, 노인성 황반 부종, 망막 신생 혈관 형성, 녹내장 및 맥락막 신생 혈관 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병성 황반 부종 및/또는 당뇨병성 황반 허혈인, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
- 상기 질환이 당뇨병성 황반 허혈이고,
- 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 허혈성 망막 내의 혈관 재생 (재생 혈관 형성)을 촉진하고 안구의 유리체 영역의 병리학적 신생 혈관 형성을 방지하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 형성을 억제하지 않는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
- 상기 질환이 당뇨병성 황반 부종이고;
- 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 Sema3A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시키고;
- 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 VEGF-A에 의해 유도된 혈액 망막 장벽의 투과성을 감소시키는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 비경구 경로, 정맥내 경로, 유리체내 경로 또는 피하 투여 경로에 의해 투여되는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제18항에 따른 약제학적 조성물.
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 유리체내 경로에 의해 투여되는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제18항에 따른 약제학적 조성물.
- 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들:
- 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 중쇄 또는 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 서열 번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열; 및
- 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 경쇄 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열. - 제21항의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 발현 벡터.
- 제21항에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들 또는 제22항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 하기 단계를 포함하는, 항-Nrp1A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법:
a. 제23항에 따른 숙주 세포를 수득하는 단계; 및
b. 상기 숙주 세포를 배양하는 단계. - 제24항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19199099.3 | 2019-09-24 | ||
| EP19199099 | 2019-09-24 | ||
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