JP2010154842A - Egfrを標的にした新規抗がんキメラペプチド - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞内安定性や正常細胞への機能障害などから副作用を避けることができる抗がん剤またはDDSとして使用可能な物質を提供すること。
【解決手段】本発明者らは、EGFRに結合するペプチド配列等の結合ペプチドおよび溶解型ペプチド配列を用いて、EGFR等を過剰に発現するがん細胞を標的とする新規キメラペプチドを開発したことによって、かかる課題を解決した。特に、EGF受容体結合ペプチド等と、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドを用いることによって、この課題を解決した。
【選択図】なし
【解決手段】本発明者らは、EGFRに結合するペプチド配列等の結合ペプチドおよび溶解型ペプチド配列を用いて、EGFR等を過剰に発現するがん細胞を標的とする新規キメラペプチドを開発したことによって、かかる課題を解決した。特に、EGF受容体結合ペプチド等と、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドを用いることによって、この課題を解決した。
【選択図】なし
Description
本発明は、新規の標的化治療薬であるペプチドトキシンに関する。
がん細胞表面上に過剰発現されるタンパク質に対するモノクローナル抗体またはリガンドに植物または細菌の毒素を結合させたイムノトキシンは、抗がん剤としてのその使用可能性について、広く研究されている(非特許文献1)。多数のイムノトキシンが、前臨床試験および臨床試験において試験されており、インターロイキン−2−ジフテリア毒素(IL2−DT;OntakTM)が、慢性T細胞リンパ球性白血病(CLL)の処置について認可されている(非特許文献2;非特許文献3)。さらに、インターロイキン−4−緑膿菌外毒素[IL4(38−37)−PE38KDEL]およびインターロイキン−13−緑膿菌外毒素(IL13−PE38QQR)を含めた緑膿菌外毒素ベースのイムノトキシンが、臨床試験で試験中である(非特許文献4;非特許文献5)。ジフテリア毒素および緑膿菌外毒素は共に、リソソーム中に取り込まれ、活性化され、そして、サイトゾルへとトランスロケーションした後、リボソーム複合体中の伸長因子−2(elongation factor−2)タンパク質を触媒的に不活性化することによって作用する。この作用機構は、イムノトキシンが、休止状態の非複製腫瘍細胞を効率的に破壊することを可能にする。
細菌毒素ベースのイムノトキシンを利用してがんに向けてターゲティングするアプローチは魅力的ではあるが、細菌毒素に起因する肝毒性と、毒素タンパク質により引き起こされる免疫原性により、その使用が制約を受ける(非特許文献2;非特許文献4;非特許文献6)。さらに、イムノトキシンの分子サイズは、一般に、化合物またはフラグメント抗体薬物に比べて大きく、薬物が、ヒトの体内の腫瘍塊へと効率的に浸透することを妨げ得る。この問題を克服するために、進化したアプローチを有する新世代のイムノトキシンが、確実に必要とされる。
上皮増殖因子レセプター(EGFR)は、長年にわたって、重要な腫瘍特異的な標的であった(非特許文献7;非特許文献8)。EGFRは、細胞の増殖、分化および移動において重要な役割を担う。その正のシグナル伝達が、増殖の増加、アポトーシスの減少、ならびに腫瘍細胞の運動性および血管新生の増強を引き起こすことが見出された(非特許文献9)。EGFRの過剰発現は、広範な上皮起源のヒト腫瘍(乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がんおよび卵巣がん)において頻繁に見出されている(非特許文献10)。これら全ての知見からEGFRが薬物のレセプター媒介性の送達システムのための標的として重要であることが示された。最近、いくつかの研究が、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、EGFRのペプチドリガンドを首尾よく同定したことを報告しており、EGFRを標的とした薬物送達の可能性が示唆されている(非特許文献11;非特許文献12)。
治療用ペプチドは、種々の用途(例えば、腫瘍ワクチン(非特許文献13)、抗菌治療(非特許文献14)および核酸送達(非特許文献15))において広く使用が進みつつある(非特許文献16)。さらに、ペプチドベースの薬物を含む新規のがん治療の研究および開発が着手されている(非特許文献17;非特許文献18)。また、ペプチド治療薬は、組換え技術または固相化学合成技術のいずれかを用いて比較的容易に作製され、そして、一般的には、抗体ベースの治療薬と比較して、安価であることが知られる。近年、D型およびL型のロイシンおよびリジンを含む15アミノ酸のジアステレオマー配列から構成される新規溶解型ペプチドが原形質膜を破壊し得ることが報告されている(非特許文献19)。このペプチドは、正常細胞よりも優先的に腫瘍細胞を殺傷し、そして、界面活性剤様の様式で細胞膜を崩壊させる。細胞の選択性は、おそらく、主として、がん細胞壁上の酸性成分またはホスファチジルセリンのレベルの減少により決定される(非特許文献19)。このジアステレオマー配列は、血清中およびタンパク質分解酵素の存在下で、活性を保持する(非特許文献20)。このペプチドの選択性は、おそらく、主として、がん細胞壁上の酸性成分すなわちホスファチジルセリンのレベルの上昇が影響していることが示唆された(非特許文献19)。この溶解型ペプチドは、正常細胞とがん細胞との間で選択的な細胞傷害性を有するが、このペプチドは、依然として、低濃度で正常細胞を殺傷し、したがって、ペプチドと標的化部分との組合せに適していない。
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本発明は、新規抗がん剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、EGFRに結合するペプチド配列および溶解型ペプチド配列の最近の同定を用いて、EGFRを過剰に発現するがん細胞を標的とする新規キメラペプチドを開発した。EGFR標的化ペプチドトキシンと呼ばれるこのキメラペプチドは、3つのグリシンスペーサーと共にEGFR結合部分および細胞膜溶解性部分から構成され、このキメラペプチドは、標的化ペプチドと合わされたときに安定であり、かつ、オリジナルの溶解型ペプチドと比較して正常細胞株に対する毒性作用が少ない。この研究において、本発明者らは、乳がん、膵臓がん、肺がん、前立腺がんおよび脳腫瘍に由来する8種のヒトがん細胞株において、EGFR標的化ペプチドトキシンにより誘導されるインビトロ細胞傷害活性および細胞死の選択性を実証した。本発明者らはまた、EGFR標的化ペプチドトキシンのがん細胞表面との相互作用、および、ペプチドトキシンにより誘導されるがん細胞死の作用様式を研究した。インビボ実験もまた、この新規キメラペプチドが有意な抗腫瘍活性を示したことを明らかにした。このことから、抗がん剤の実際の医薬としての用途以外に応用すること可能な分野、たとえば、これまでに知られていない薬物スクリーニング等への応用も可能となった。受容体等の特定タンパク質への結合ペプチド配列を見出すために、その候補配列とLyticのキメラペプチドを多種類合成してin vitro殺細胞効果を指標としたスクリーニングという形での応用化は可能であるからである。例えば、EGFR高発現がん細胞におけるEGFRとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬/抗がん剤のスクリーニング方法を実現することができる。従来技術の溶解型ペプチドは、正常細胞とがん細胞との間で選択的な細胞傷害性を有することは上記に述べたとおりであるが、本発明のペプチドは、正常細胞への殺傷性が減少した。したがって、ペプチドと標的化部分との組合せに適していることが判明した。
このペプチドトキシンは、標的結合ペプチドおよび細胞殺傷性の溶解性ペプチド成分から構成される化学合成したペプチドである。上皮増殖因子レセプター(EGFR)結合ペプチドを、正電荷により細胞膜を崩壊させてがん細胞を殺傷する、カチオンリッチなアミノ酸を含む溶解型ペプチドと結合させた。EGFR標的化ペプチドトキシンは、EGFRを過剰発現するがん細胞株において、溶解性ペプチドのみと比較して、IC50(コントロール細胞の増殖の50%阻害を誘導するペプチド濃度)の約3倍の改善を誘導した。対照的に、正常細胞株は、EGFR標的化ペプチドトキシンまたは溶解性ペプチドのみに対して感受性が低く、正常細胞において、がん細胞よりも4〜8倍高いIC50を示した。興味深いことに、細胞表面上のEGFRの発現は、EGFR標的化によるペプチドトキシンの殺細胞効果増強度合と十分に相関しており、特異性が示唆された。驚くべきことに、EGFR標的化ペプチドトキシンの10分未満の曝露は、がん細胞の50%以上を殺傷するに十分であった。さらに、本発明者らは、ペプチドトキシンを与えたがん細胞においてポリカスパーゼの活性化とアポトーシスとが誘導されることを見出した。まとめると、がん細胞に高発現しているタンパク質を標的化したペプチドトキシンは、新規がん標的化治療のための画期的なツールとなり得る。
したがって、本発明は、以下を提供する。
本発明の主な局面において、本発明は、受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
1つの実施形態では、この受容体結合ペプチドは、EGF受容体結合ペプチド、インターロイキン4(IL−4)受容体結合ペプチド、インターロイキン13(IL−13)受容体結合ペプチド、ニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチド、ヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチド、血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチド、トランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチド、エフリンB1(EphB1)、エフリンB2(EphB2)、グルコース調節タンパク質78(GRP78)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)などでありうる。
別の観点から述べると、本発明の主な局面において、本発明は、抗がん標的ペプチドと細胞膜溶解性ペプチド成分からなるキメラペプチドであるペプチドトキシンを提供する。
本発明の主な局面における具体的な実施形態としては、たとえば、上皮増殖因子(EGF)、ヒト上皮増殖因子受容体2型(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2(HER2)、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)、トランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)、インターロイキン4(IL4)、インターロイキン13(IL13)、ニューロピリン(neuropilin;NRP)、ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR)、エフリンB1(EphB1)、エフリンB2(EphB2)、グルコース調節タンパク質(GRP78)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)などの受容体に結合するペプチドを用いるペプチドトキシンを挙げることができ、以下がキメラペプチドとして例示される。
EGF−Lytic:YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)
EGF−Lytic(2R):YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号14)
HER2−Lytic:YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号15)
VEGFR−Lytic:WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号16)
TfR−Lytic:THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号17)
LyticLペプチド:KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号27)
IL4−LyticL:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号18)
IL13−LyticL:KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号19)
Sema3A−LyticL<ヒトニューロピリン−1への結合>:NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号20)
EGFbuf:YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(配列番号21)。
EGF−Lytic:YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)
EGF−Lytic(2R):YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号14)
HER2−Lytic:YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号15)
VEGFR−Lytic:WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号16)
TfR−Lytic:THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号17)
LyticLペプチド:KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号27)
IL4−LyticL:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号18)
IL13−LyticL:KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号19)
Sema3A−LyticL<ヒトニューロピリン−1への結合>:NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号20)
EGFbuf:YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(配列番号21)。
1つの実施形態では、本発明において用いられる細胞膜溶解性ペプチド成分は、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有する。
1つの実施形態では、本発明において用いられる抗がん標的ペプチドは、がん細胞高発現受容体特異的結合配列を有し、前記溶解性ペプチド成分は、がん細胞膜溶解型配列を有し、スペーサーを有する。
1つの実施形態では、本発明において用いられる溶解性ペプチド成分は、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有する。
1つの実施形態では、本発明において用いられるスペーサーは、G、Pからなる0〜5アミノ酸の配列である。
1つの局面において、本発明は、EGF受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドまたは細胞溶解性ペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
1つの実施形態において、本発明において使用されるEGF受容体結合ペプチドは、アミノ酸配列YHWYGYTPQNVI(ここで、アルファベットは、アミノ酸の1文字表示である。)またはその改変配列を有するものである。
1つの実施形態において、本発明において使用されるEGF受容体結合ペプチドは、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するアミノ酸である、
好ましい実施形態では、X1は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸である。
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するアミノ酸である、
好ましい実施形態では、X1は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸である。
さらに好ましい実施形態では、X1は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸である。
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸である。
さらにこのましい実施形態では、X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸である。
さらに好ましい実施形態では、本発明のキメラペプチドは、YRWYGYTPQNVI(配列番号9)またはYKWYGYTPQNVI(配列番号10)という配列を有する。
1つの実施形態において、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、前記細胞殺傷性ペプチドは、細胞膜溶解性ペプチド、細胞膜電位不安定化ペプチド、細胞膜溶解ペプチドおよびミトコンドリア膜崩壊ペプチドからなる群より選択される。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜溶解性ペプチドは、KおよびLのみからなる10〜20個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、L体、D体もしくはDL混合である。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜溶解性ペプチドは、KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号48、具体的には配列番号1または27など)であり、該アミノ酸は、L体、D体もしくはDL混合である。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜電位不安定化ペプチドは、FLKLLKKLAAKLF(配列番号11)である。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜溶解ペプチドは、RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(配列番号12)またはRLLRRLLRRLLRK(配列番号13)である。
好ましい実施形態では、本発明において使用されるミトコンドリア膜崩壊ペプチドは、KLAKLAKKLAKLAK(配列番号4)である。
1つの実施形態では、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有する。
好ましい実施形態では、本発明において使用されるプラスチャージを持つアミノ酸は、K、RまたはHである。
好ましい実施形態では、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、I、L、V、AまたはFである。
さらに好ましい実施形態では、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号1)であり、ここで、各アミノ酸はL体またはD体であり、下線は、D体を示す。
1つの実施形態において、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有する。
1つの実施形態において、本発明において使用されるプラスチャージを持つアミノ酸は、K、RまたはHである。
1つの実施形態において、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、I、L、V、AまたはFである。
1つの実施形態において、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号1)であり、ここで、各アミノ酸はL体またはD体であり、下線は、D体を示す。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、スペーサーペプチドをさらに有する。
1つの実施形態において、本発明において使用されるスペーサーペプチドはグリシン(G)またはプロリン(P)の0〜4個純粋または混合して連なった配列を示し、好ましくはGGGである。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)の配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、インターロイキン4(IL−4)受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列KQLIRFLKRLDRN(配列番号26)またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、インターロイキン13(IL−13)受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番28)またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、ニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29)またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、ヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチドであり、アミノ酸配列YCDGFYACYMDV(配列番号30)またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドであり、アミノ酸配列WHSDMEWWYLLG(配列番号31)、VEPNCDIHVMWEWECFERL−NH2(配列番号32)もしくはGGNECDAIRMWEWECFERL(配列番号33)またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチドであり、アミノ酸配列THRPPMWSPVWP(配列番号34)またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)であり、MQLPLAT(配列番号5)またはAAVALLPAVLLALLAP(配列番号6)であるか;ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)であり、ATWLPPR(配列番号36)であるか;エフリンB1(EphB1)であり、EWLS(配列番号37)であるか;エフリン2(EphB2)であり、SNEW(配列番号38)であるか;インターロイキン11受容体(IL11R)であり、CGRRAGGSC(環状)(配列番号22)であるか;グルコース調節タンパク質78(GRP78)であり、WDLAWMFRLPVG(配列番号39)またはCTVALPGGYVRVC(環状)(配列番号40)であるか;前立腺特異的膜抗原(PSMA)であり、CQKHHNYLC(配列番号35)であるか、あるいは、これらの改変配列である。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号2、14、21、42、43または21からなる群より選択される配列またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号15に示す配列またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号16に示す配列またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号17に示す配列またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号18または44またはその改変配列に示す配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号19に示す配列またはその改変配列を有する。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号20、46または47に示す配列またはその改変配列を有する。
1つの局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドをコードする核酸を提供する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドをコードする核酸を含む細胞に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを含む医薬、好ましくは医薬組成物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを含む抗がん剤に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドの、医薬組成物の製造のための使用に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドの、抗がん剤の製造のための使用に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを投与する工程を包含する治療方法に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを投与する工程を包含するがんの治療方法に関する。
1つの局面において、本発明は、本発明のEGF受容体結合ペプチドがターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬のスクリーニング方法に関する。
1つの局面において、本発明は、本発明のEGF受容体結合ペプチドがターゲットとするアミノ酸配列を用いる、抗がん剤のスクリーニング方法に関する。
様々な種類のキメラポリペプチドの特許化がなされているところ、本発明は、最も近い先行技術との対比において、がん細胞膜溶解型ペプチド単独に比べ、本発明によるキメラ化によりがん細胞標的化、がん細胞に対する殺細胞効果の増強さらにはその即効性を実現した点顕著な効果であるということができる。すなわち、もう一つの最も近い先行技術である細菌毒素ベースのイムノトキシンを利用したがんに向けてターゲティングするアプローチは魅力的ではあるが、細菌毒素に起因する肝毒性と、毒素タンパク質により引き起こされる免疫原性により、その使用が制約を受ける(非特許文献2,4,6)。さらに、イムノトキシンの分子サイズは、一般に、化合物またはフラグメント抗体薬物に比べて大きく、薬物が、ヒトの体内の腫瘍塊へと効率的に浸透することを妨げ得る(非特許文献2,4,6)。これらの文献は、文献は単にイムノトキシン等の蛋白製剤の問題点を提示しているだけであり、なんら解決手段を提示していない。この問題を克服するために、進化したアプローチを有する新世代のイムノトキシンが、確実に必要とされる。
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
細胞内安定性や正常細胞への機能障害などから副作用を避けることができ、あるいは即効性のある抗がん剤またはDDSとして使用可能な物質が提供される。
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現(例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など)は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。
(用語の定義)
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「上皮増殖因子(epidermal growth factor;EGF)」とは、EGFスーパーファミリーに属する増殖因子であり、雄マウスの顎下腺に存在する生理活性物質として報告した.アミノ酸53個からなる分子量約6千のポリペプチドで,分子内に6個のシステインからなる3つのジスルフィド結合を有する。当初,上皮細胞の増殖に特異的に働くとされていたが,非上皮系細胞にも作用し,さまざまな生物活性を示す。
本明細書において「上皮増殖因子受容体」「上皮増殖因子レセプター」「EGF受容体」「EGFレセプター」(epidermal growth factor receptor;EGFR)」は、交換可能に使用され、EGFをリガンドとするレセプターであり、トリ赤芽球症ウイルス(avian erythroblastosis virus,AEV)のゲノム中に存在するウイルスがん遺伝子の一つv−erbBとして発見された。ヒトゲノム中に存在する該当遺伝子c−erbB1はEGFR遺伝子である。その構造は、以下のとおりである。
EGF受容体は、単一ポリペプチドから成り、N末端側はリガンド結合部位を有する細胞外領域に続き、1回貫通型の膜貫通領域を形成している。C末端側はチロシンキナーゼ活性をもつ細胞内領域を形成しており、リガンドの結合によって受容体が会合し、結果としてチロシンキナーゼが活性化される。ヒトのEGF受容体は、分子質量約170kDaの膜貫通型糖タンパク質で、このうちリガンド依存的に受容体の会合を引き起こす細胞外領域は、約95kDaの糖タンパク質である。(Ogiso H,et al.,2002,Cell,110 :775−87.)EGFRに対するEGFまたはTGF−αの結合は、シグナル伝達経路を活性化して、細胞増殖を生じる。二量体化、高次構造変化、およびEGFR分子のインターナリゼーションは、細胞内シグナルを伝達して細胞増殖制御を生じるように機能する(G.Carpenter and S.Cohen,1979,Ann.Rev.Biochem.,48:193−216)。成長因子受容体の制御に影響を及ぼす遺伝子変化により、受容体および/またはリガンドの過剰発現するように機能し、または導き、細胞増殖を生じることとなる。(M.−J.Oh et al.,2000,Clin.Cancer Res.,6:4760−4763)。なお、GenBank#は、NM_005228(ヒト)である。
本明細書において「標的結合」ペプチド、「標的結合」配列とは、標的(たとえば、EGF受容体、または他の標的物など)に結合するペプチドまたは配列をいう。たとえば、がん細胞高発現受容体特異的結合配列を挙げることができる。
本明細書において「がん細胞高発現受容体特異的結合配列」とは、がん細胞に高発現する受容体に特異的に結合する配列をいう。具体的には以下のように定義できるがん細胞に高い発現がみられる受容体としては、細胞増殖に関わる増殖因子受容体、血管新生に関与する受容体、サイトカイン・ケモカイン受容体等にそれぞれ特異的に結合するペプチド配列であり、ファージディスプレイ法、立体構造解析等により特異的結合配列が見出される。
本明細書において「EGF受容体結合ペプチド」または「EGF受容体結合配列」とは、EGF受容体に結合するペプチドまたは配列をいう。
代表的には、EGF受容体結合配列としては、以下のようなものを挙げることができる。
1) YHWYGYTPQNVI(配列番号7;ここでHはRまたはKに置き換えられうる)。これらの改変配列は、ペプチドライブラリーからファージディスプレイ法によりスクリーニングされた配列であり、これまでの変異解析等では一切公表されていない。受容体−リガンド結合において重要と思われるチャージを有するアミノ酸に着目し、プラスチャージを持つHをRとKに換えた変異体であり、本発明において顕著な効果を有すると予想される。
本明細書において特に言及しないときは、「溶解性ペプチド成分」、「細胞殺傷性ペプチド」「細胞殺傷性配列」は、「細胞溶解性ペプチド(配列)」または「細胞膜溶解性ペプチド(配列)」と交換可能に用いられる。細胞膜を溶解する可能性のあるペプチドを有する。代表的には、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有するものが挙げられる。本発明において特に用いられうるがん細胞膜に対して作用し殺細胞効果を示すものとして代表的なペプチド配列を以下に示す。
KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号48、具体的には配列番号1または27など):細胞膜溶解
FLKLLKKLAAKLF(配列番号11):抗菌性ペプチド誘導体、細胞膜電位崩壊
RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(配列番号12)、RLLRRLLRRLLRK(配列番号13):抗菌性ペプチド誘導体、細胞膜溶解・核酸結合
KLAKLAKKLAKLAK(配列番号4):ミトコンドリア膜崩壊
したがって、これらの情報から、細胞殺傷性ペプチドとして代表的なものは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列ということができる。
KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号48、具体的には配列番号1または27など):細胞膜溶解
FLKLLKKLAAKLF(配列番号11):抗菌性ペプチド誘導体、細胞膜電位崩壊
RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(配列番号12)、RLLRRLLRRLLRK(配列番号13):抗菌性ペプチド誘導体、細胞膜溶解・核酸結合
KLAKLAKKLAKLAK(配列番号4):ミトコンドリア膜崩壊
したがって、これらの情報から、細胞殺傷性ペプチドとして代表的なものは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列ということができる。
そして、KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号1、下線はD体アミノ酸)を用いた場合、オリジナルの配列として知られているLKLLKKLLKKLLKLL(配列番号41、下線はD体アミノ酸)と比較して、以下の点で顕著な効果を奏することが明らかになった:たとえば、前にEGFR結合配列を組み合わせると、癌細胞特異的に殺細胞活性において相乗効果が出ることが明らかになった。また、正常細胞との選択性がよりでてくることも明らかになった。いろいろなターゲットタンパク質とのハイブリッド化が可能である。このことから、癌細胞に対して、より標的化(ターゲット化)することができることが理解される。
また、nLyticと称する(LLKLLKKLLKKLLKL;配列番号45、下線はD体アミノ酸)では、以下の点で顕著な効果を奏することが明らかになった:正常細胞との選択性がでていることが判明したことから、毒性が低いことが考えられる。また、Sema3Aペプチドと組み合わせにおいて、癌細胞特異的に殺細胞活性において相乗効果がでることも判明した。このことから、癌細胞に対して、より標的化(ターゲット化)することができることが理解される。
本明細書において「スペーサー」とは、橋をかけるように,鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる部分をいう。代表的には、G、Pからなる0〜5アミノ酸の配列が挙げられる。本明細書では、特に、溶解性ペプチドと、EGF所様態結合ペプチドとの間に介在して結合されうる。このようなスペーサーの例としては、たとえば、GGG,GG,G,PP,GPGが挙げられる。スペーサーは必須ではなく、存在しなくてもよいが、本発明において、好ましくは、これらのスペーサーが含まれる。
本明細書において「ペプチドトキシン」とは、抗がん標的化されたペプチドであって、細胞傷害性、殺傷能力を有するものをいう。本発明のペプチドトキシンは、爆薬部分に当たる、細胞傷害性部分と、弾頭部分にあたるがん細胞に対する特異性を担当する部分(たとえば、がん細胞に高発現している受容体に対して特異的に結合するペプチド・配列)とを組み合わせてできるペプチドを挙げることができる。「爆薬部分」については細胞膜溶解型配列が現状では好ましく、「弾頭部分」についてはがん細胞に高発現しているタンパク質(特に受容体)特異的に結合する配列であればなんでもよい。たとえば、がん細胞高発現受容体特異的結合配列+スペーサー+がん細胞膜溶解型配列から構成される「がん細胞膜溶解型ペプチドトキシン」が代表例として挙げることができる。
がん細胞高発現受容体特異的結合配列+スペーサー+がん細胞膜溶解型配列から構成される「がん細胞膜溶解型ペプチドトキシン」の製造法および使用法を以下に記載する。本明細書では、任意のがん細胞高発現受容体特異的結合配列、任意のスペーサー、任意のがん細胞膜溶解型配列を任意に組み合わせることができ、その製造法および使用法を下記に具体的に記載する。
(製造法)
がんの個別化治療が早期に実現可能な、多数の弾頭と爆薬配列の組み合わせからなるペプチドトキシンには短期間で入手可能な化学合成法が相応しいが、遺伝子組換えにより強制発現させ精製する方法も可能である。
がんの個別化治療が早期に実現可能な、多数の弾頭と爆薬配列の組み合わせからなるペプチドトキシンには短期間で入手可能な化学合成法が相応しいが、遺伝子組換えにより強制発現させ精製する方法も可能である。
(使用法)
治療しようとするがん細胞について、細胞表面に高発現しているタンパク質のプロファイルおよび爆薬ペプチドに対するがん細胞の傷害感受性を調べる。その結果をもとに弾頭と爆薬を選択し、そのがん細胞に最適なペプチドトキシンをデザインする。化学合成等により得られたオーダーメイドペプチドトキシンを必要に応じてアテロコラーゲン等のDDSと組み合わせ、局所投与または全身投与を行い治療する。
治療しようとするがん細胞について、細胞表面に高発現しているタンパク質のプロファイルおよび爆薬ペプチドに対するがん細胞の傷害感受性を調べる。その結果をもとに弾頭と爆薬を選択し、そのがん細胞に最適なペプチドトキシンをデザインする。化学合成等により得られたオーダーメイドペプチドトキシンを必要に応じてアテロコラーゲン等のDDSと組み合わせ、局所投与または全身投与を行い治療する。
本発明者らが使用している細胞膜溶解性配列は単独ではがん細胞への殺細胞効果を示すのに長時間の接触が必要であり殺細胞効果もマイルドである。しかしこれにがん細胞標的化配列を結合しキメラ化するとその標的分子が高発現しているがん細胞に優先的に結合するようになり、接触時間も短縮でき殺細胞効果も増強される。実際にIL4受容体、her2等の結合配列キメラ化で殺細胞効果増強および接触時間短縮を確認した。したがって、他の同様のキメラ配列であっても、同様の殺細胞効果増強および接触時間短縮の効果を奏することが合理的に期待できる。
また、このような個別化治療を早期可能にするペプチドトキシンは弾頭、爆薬の組み合わせは、がん患者にとって、画期的な治療となりうる可能性がある。したがって、本発明のペプチドトキシンという新しい概念は、がん患者の最大限の利益を提供する点において重要である。
本発明のキメラペプチドまたはペプチドトキシンは、様々な種類のキメラポリペプチドの特許化がなされているなか、最も近い先行技術と対比しても細胞膜溶解型ペプチド単独に比べ、キメラ化によりがん細胞標的化、がん細胞に対する殺細胞効果の増強さらにはその即効性を実現した点で注目されるべきである。
本明細書において使用されうるがん細胞に対する特異性を担当する部分を製造するために参酌されうる受容体の配列は以下のとおりである。共通する特徴としては、たとえば、有電荷アミノ酸が大量に含まれていることが挙げられる。
本明細書において「細胞透過性ペプチド」とは、細胞の膜を通過して、細胞内部に侵入しうるペプチドをいう。あるペプチドが「細胞透過性ペプチド」であるかどうかは、以下の試験によって評価することができる。すなわち、本明細書において、Antpに関しては、論文(Derossi,et al.J.Biol.Chem.1996,271,18188−18193.)でビオチン化したAntpペプチドを細胞に添加してその後、ストレプとアビジン化学標識化合物を添加し、蛍光顕微鏡で細胞内局在を確認することができる。あるいは、ストレプトアビジン結合抗体で反応後同様に化学標識された抗体を蛍光顕微鏡で同様に局在を確認することで細胞内に進入していることを確認することができる。
細胞透過性ペプチドとしては、たとえば、アンテナペディアホメオボックス配列(Antp)、YGRKKRRQRRR(TAT;配列番号23)、またはRRRRRRRRRRR(配列番号24)などを挙げることができる。代表的には、その構造は、以下のとおりである。代表的には、その構造は、たとえば、Gene ID 155871(TATタンパク質自体)を挙げることができる。
本明細書において使用される代表的な細胞殺傷性ペプチドは、細胞膜溶解性ペプチド、細胞膜電位不安定化ペプチド、細胞膜溶解・核酸結合ペプチドおよびミトコンドリア膜崩壊ペプチドを挙げることができる。
本明細書において「細胞膜溶解性ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有し細胞膜を外側から崩壊させ殺細胞効果を示すペプチドをさす。代表的な具体例としては、以下が挙げられる:KおよびLのみからなる10〜20個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、L体、D体もしくはDL混合であるものが挙げられ、たとえば、KLLLKLLKKLLKLLKK(配列番号48、具体的には配列番号1または27など)。
本明細書において「細胞膜電位不安定化ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、10から30アミノ酸からなる配列を有し、細胞膜を外側から孔をあけて細胞膜電位を不安定化させ崩壊させ殺細胞効果を示すペプチドをさす。代表的な具体例としては、FLKLLKKLAAKLF(配列番号11)などが挙げられる。
本明細書において「細胞膜溶解・核酸結合ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有し、細胞膜を外側から崩壊させて内部に侵入し核酸へ結合し細胞死を誘導するペプチドをさす。代表的な具体例としては、KおよびLのみからなる10〜20個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、L体、D体もしくはDL混合であるものが挙げられ、たとえば、RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(配列番号12)、RLLRRLLRRLLRK(配列番号13)などが挙げられる。
本明細書において「ミトコンドリア膜崩壊ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有し、細胞内部に侵入できた場合にのみミトコンドリア膜を崩壊させて細胞死を誘導するペプチドをさす。代表的な具体例としては、KLAKLAKKLAKLAK(配列番号4)などが挙げられる。
好ましい細胞殺傷性ペプチドとしては、プラスチャージを持つアミノ酸[K,R,(H)]と疎水性アミノ酸[L,A,F等]から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有するものが挙げられる。好ましくは、このプラスチャージを持つアミノ酸は、K、RまたはHであり得る。この疎水性アミノ酸は、I、L、V、AまたはFであり得る。
本発明において使用される疎水性アミノ酸は、KLLLKLLKKLLKLLKKKであり、ここで、各アミノ酸はL体またはD体であり、下線は、D体を示す。
本明細書において明らかになった事項として、EGF−R等の受容体結合ペプチドを結合したキメラペプチドは、両親媒性ヘリックス構造、好ましくはαヘリックス構造をしていることが有利であることが判明した。したがって、他の受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドを構成する場合も、両親媒性ヘリックス構造、好ましくはαヘリックス構造をしていることが有利である。これらは、図1Dに示す結果からも演繹できることが理解される。すなわち、EB−溶解性ペプチドの場合は、正常な細胞膜表面上で最も多い脂質種であるホスファチジルコリン(PC)から構成される小さな単層状小胞(SUV)への結合が弱く、PCリポソームではあまり上手く構造化されなかったが、このEB−溶解性ペプチドが、がん細胞膜上で特異的に露出されるホスファチジルセリン(PS)を含むSUVに結合し得、そして、209〜210nmおよび222nmにおける2つの極小値によって特徴付けられる部分的ならせん構造をとっていたことが実証されている。EB−オリジナル溶解性ペプチドは、PCリポソームおよびPC/PSリポソームの両方に強く結合し得、そして、らせん構造をとったことが判明した(図1D(c))。本発明において新たに設計したキメラペプチドが、PSを含む膜に対して選択性を有し、そして、細胞表面上に孔をつくるために必須と考えられているらせん構造をとることを示す(Papo,N.& Shai,Y.New Lytic peptides based on the D,L−amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 42,9346−9354(2003)。したがって、これらのデータを参酌して、溶解性ペプチドの別の形態の設計において役立てることができる。
そのような例としては、配列番号2および43からなる群より選択される配列またはその改変配列が挙げられる。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号15に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号16に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号17に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号18または44またはその改変配列に示す配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号19に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号20、46または47に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、1または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
これらの改変配列について、好ましい両親媒性(α)ヘリックス構造を有するように改変することは、本明細書の記載にもとづいて当業者が実施することができる。そして、たとえば1アミノ酸置換については、EGF−Rについてのキメラペプチドにおいて、両親媒性(α)ヘリックス構造が保持されることが実証されており、他のキメラペプチドについても、同様に、両親媒性(α)ヘリックス構造が保持されると予想されることが理解される。また、複数のアミノ酸置換等の他の改変についても、実施例における記載等を参酌して、当業者が適宜実施することができることが理解される。
別の好ましい実施形態では、細胞障害性ペプチドとしては、RQIKIQFQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK(配列番号25)の配列を有するものが使用される。あるいは、TATという名称で呼ばれる(YGRKKRRQRRR)(配列番号23)も使用されうる。Rを11つなげた、RRRRRRRRRRR−(配列番号24)という配列が細胞透過することが知られており、これも使用することができる。また、当業者は、適宜、好ましい細胞透過性ペプチドとTPRドメイン結合ペプチドとの組み合わせを決定することができる。好ましくは、Antpとの組み合わせの方を使用することができる。
本明細書において「キメラペプチド」とは、二つ以上の異なった遺伝子型の部分(ペプチド)から作られた1個のペプチドをいう。融合タンパク質ともいう。タンパク質のドメインの機能を吟味したり、目的とするタンパク質の発現を検出するために用いられる。
本明細書において「類似するアミノ酸」とは、保存的置換の関係にあるアミノ酸をいい、以下のアミノ酸が該当する。
A:G、I、V、L
C:M(含Sアミノ酸)
D:QまたはE
E:NまたはD
F:Y、Aなど
G:A
H:W、R、Kなど、
I:A、L、V、(G)
K:R、H
L:A、I、V、(G)
M:Sなど
N:EまたはQ
P:HyP
Q:NまたはD
R:K、H
S:T、Y
T:S、Y
V:I、L、A、(G)
W:H
Y:F、S、T。
A:G、I、V、L
C:M(含Sアミノ酸)
D:QまたはE
E:NまたはD
F:Y、Aなど
G:A
H:W、R、Kなど、
I:A、L、V、(G)
K:R、H
L:A、I、V、(G)
M:Sなど
N:EまたはQ
P:HyP
Q:NまたはD
R:K、H
S:T、Y
T:S、Y
V:I、L、A、(G)
W:H
Y:F、S、T。
これらのアミノ酸の間の置換は、本明細書において「保存的置換」ともいう。
本明細書においてEGF受容体結合ペプチドに頻繁に見出されるアミノ酸は、種々のEGF受容体結合ペプチドにおいて頻度が高く見出されるものをいい、代表的には、保存的置換の関係にあるアミノ酸が含まれ、以下のアミノ酸が該当する。
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するアミノ酸であり、
好ましくは、X1は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり、
より好ましくは、X1は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸である。
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するアミノ酸であり、
好ましくは、X1は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり、
より好ましくは、X1は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸である。
配列において、X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であるもの(たとえば、YRWYGYTPQNVI(配列番号9)またはYKWYGYTPQNVI(配列番号10))が好ましい。増強活性が見出されたからである。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがインターロイキン4(IL−4)受容体結合ペプチドである場合、アミノ酸配列KQLIRFLKRLDRN(配列番号26)またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Thorsten Hage et al.,Cell.1999,vol.97,No.2,p.271−81.を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがインターロイキン13(IL−13)受容体結合ペプチドである場合、アミノ酸配列KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番28)またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Yuichiro Yoshida et al.,Biochem Biophys Res Commun.2007,vol.358,No.1,p.292−297.を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチドである場合、アミノ酸配列NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29)またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Alexander Antipenko et al.,Neuron.2003,vol.39,No.4,p.589−598を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。これらの文献は単にイムノトキシン等の蛋白製剤の問題点を提示しているだけであり、本発明のようにキメラペプチドを提供するものではない。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチドである場合、アミノ酸配列YCDGFYACYMDV(配列番号30)またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Valeria R.Fantin et al.,Cancer Res.2005,vol.65,No.15,p.6891−6900を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドが血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドである場合、アミノ酸配列WHSDMEWWYLL(配列番号31)またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Kimberly J.Peterson et al.,AnaLytical Biochemistry 2008,vol.378,No.1,p.8−14(VEPNCDIHVMWEWECFERL−NH2(配列番号32)について)、Borlan Pan et al.,J.Mol.Biol.2002,vol.316,No.3,p.769−787(GGNECDAIRMWEWECFERL(配列番号33)について)を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがトランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチドである場合、アミノ酸配列THRPPMWSPVWP(配列番号34)またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Jae H.Lee et al.,Eur.J.Biochem.2001,vol.268,p.2004−2012を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
このほか、受容体結合ペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)であり、MQLPLAT(配列番号5)またはAAVALLPAVLLALLAP(配列番号6)であるか;ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)であり、ATWLPPR(配列番号36)であるか;エフリンB1(EphB1)であり、EWLS(配列番号37)であるか;エフリン2(EphB2)であり、SNEW(配列番号38)であるか;インターロイキン11受容体(IL11R)であり、CGRRAGGSC(環状)(配列番号22)であるか;グルコース調節タンパク質78(GRP78)であり、WDLAWMFRLPVG(配列番号39)またはCTVALPGGYVRVC(環状)(配列番号40)であるか;前立腺特異的膜抗原(PSMA)であり、CQKHHNYLC(配列番号35)であるか、あるいは、これらの改変配列でありうる。ここで、この改変配列は、EGFR結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、FGFR(MQLPLAT(配列番号5))について、Fukuto Maruta et al.,Cancer Gene Therapy.2002,vol.9,p.543−552;FGFR(AAVALLPAVLLALLAP(配列番号6))について、Akiko Komi et al.,Exp.Cell Res.2003,Vol.283,No.1,p.91−100;NRP1/VEGFR2(ATWLPPR(配列番号36))についてLoraine Tirand et al.,J.Control Release.2006,vol.111,p.153−164、EphB1およびEphB2についてMitchell Koolpe et al.,J Biol.Chem.2005,vol.280,No.17,p.17301−11;IL11RについてAmado J.Zurita et al.,Cancer Res.2004,vol.64,p.435−439;GRP78(WDLAWMFRLPVG(配列番号39))についてMarco A.Arap et al.,Cancer Cell.2004,vol.6,p.275−284;GRP78(CTVALPGGYVRVC(配列番号40))についてYing Liu et al.,Mol.Pharmaceutics.2007,Vol.4,No.3,p.435−447;PSMAについてKaushal Rege et al.,Cancer Res.2007,vol.67,No.13,p.6368−6375を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
これらの置換は、1またはそれより多い組み合わせで使用され得る。これらの好ましい置換は任意の組み合わせが有効でありうることが理解される。これらの置換によって、効果の増強が見出されたからである。なお、これらの変異は一つ導入されても複数導入されてもよいことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、ある変異が許容されることが理解されると、もとの活性型の立体構造および対象となる生物学的標的との相互作用などでの活性が保持または増強されることが理解されることから、これらを複数組み合わせても、同様の効果を有すると期待されるからである。本発明の場合、一アミノ酸置換で活性が変化したものに関しては、そのパートナータンパク質との相互作用に影響を与えたことが予測されるが、本件の最終目的である、抗がん活性という観点からは、保持していることからこれらアミノ酸の置換を組み合わせても同様の効果が得られると期待できる。
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変(例えば、標識成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1またはそれより多いアナログを含むポリペプチド(例えば、非天然のアミノ酸などを含む)、ペプチド様化合物(例えば、ペプトイド)および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる(別の)核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物(組換え形態のスプライス産物を含む)がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン(phenoxazine−modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体(例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれより多い選択された(または、すべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る(Batzerら、Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsukaら、J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985);Rossoliniら、Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および/または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403−410(1990))、FASTA(Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:2444−2448(1988))、Smith and Waterman法(Smith and Waterman,J.Mol.Biol.147:195−197(1981))、およびNeedleman and Wunsch法(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443−453(1970))などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムDNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ(マイクロアレイアッセイ)、PCRおよびin situハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子(たとえば、HSP90など)には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書において、特定の遺伝子配列にハイブリダイズする核酸配列も、機能を有する限り使用することができる。ここで、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列(例えば、Aに対するT、Gに対するC)をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定の配列についての熱融解温度(Tm)より約5℃低く選択される。Tmは、規定されたイオン強度、pH、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Tijssen(Tijssen(1993)、Laboratory Technniques In Biochemistry And MolecularBiology−Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第2章 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassay」、Elsevier,New York)に見出される。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0M Na+未満であり、代表的には、pH7.0〜8.3で約0.01〜1.0MのNa+濃度(または他の塩)であり、そして温度は、短いヌクレオチド(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃、そして長いヌクレオチド(例えば、50ヌクレオチドより長い)については少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、50%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDS(37℃)の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および0.1×SSCで60℃での洗浄が挙げられる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(Saline−sodium citrate)溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウムである)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning 2nd ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1〜38、DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University Press(1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAの塩基配列と少なくとも60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、90%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50%同一である場合、好ましくは少なくとも70%同一である場合、より好ましくは少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子(例えば、EGFR)に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物(マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど)においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど)の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド(長さがn)に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15,20、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15,20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個(または例えば上下10%)のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも1つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において、「改変体」、「改変配列」または「アナログ」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮(truncated)改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子(allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ(homolog)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性(好ましくは、60%以上の相同性、より好ましくは、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上の相同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを1つ以上、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に1つ以上、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから1つ以上、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化(例えば、アセチル化)などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
このような核酸は、周知のPCR法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および/または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および/または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能(例えば、TPRドメインへの結合など)が保持される限り、この核酸分子の5’末端もしくは3’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、1つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能(例えば、TPRドメインへの結合など)が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの20%以内、15%以内、10%以内、5%以内、または150個以下、100個以下、50個以下、25個以下などであり得る。
(ペプチドの製法および分析)
本発明のペプチド(たとえば、キメラペプチド)は、当該分野で周知の方法(例えば、化学合成、以下に考察される一般的な工学技術)により得られ、または産生され得る。例えば、所望の領域もしくはドメインを含むペプチドの一部と一致するペプチドか、またはインビトロで所望の活性を媒介するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。ペプチドはまた、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定するために使用され得る親水性分析(例えば、HoppおよびWoods、1981.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:3824〜3828を参照のこと)により分析され得、従って実験操作(例えば、結合実験、抗体合成)のための物質の設計において助けとなる。二次構造分析はまた、特定の構造的モチーフを確立するペプチドの領域を同定するために行われ得る(例えば、ChouおよびFasman、1974、Biochem. 13:222〜223を参照のこと)。操作、翻訳、二次構造の予想、親水性および疎水性プロファイル、オープンリーディングフレームの予想およびプロッティング、ならびに配列の相同性の決定は、当該分野で利用可能なコンピューターソフトプログラムを使用して達成され得る。構造分析の他の方法として、例えば、X線結晶解析(例えば、Engstrom、1974.Biochem.Exp.Biol.11:7〜13を参照のこと));質量分析およびガスクロマトグラフィー(例えば、METHODSINPROTEINSCIENCE、1997.J.WileyおよびSons、NewYork、NYを参照のこと)が挙げられ、そしてコンピュータモデリング(例えば、FletterickおよびZoller、編、1986.Computer Graphics and Molecular Modeling:CURRENT COMMUNICATION IN MOLECULAR BIOLOGY、Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと)もまた使用され得る。
本発明のペプチド(たとえば、キメラペプチド)は、当該分野で周知の方法(例えば、化学合成、以下に考察される一般的な工学技術)により得られ、または産生され得る。例えば、所望の領域もしくはドメインを含むペプチドの一部と一致するペプチドか、またはインビトロで所望の活性を媒介するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。ペプチドはまた、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定するために使用され得る親水性分析(例えば、HoppおよびWoods、1981.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:3824〜3828を参照のこと)により分析され得、従って実験操作(例えば、結合実験、抗体合成)のための物質の設計において助けとなる。二次構造分析はまた、特定の構造的モチーフを確立するペプチドの領域を同定するために行われ得る(例えば、ChouおよびFasman、1974、Biochem. 13:222〜223を参照のこと)。操作、翻訳、二次構造の予想、親水性および疎水性プロファイル、オープンリーディングフレームの予想およびプロッティング、ならびに配列の相同性の決定は、当該分野で利用可能なコンピューターソフトプログラムを使用して達成され得る。構造分析の他の方法として、例えば、X線結晶解析(例えば、Engstrom、1974.Biochem.Exp.Biol.11:7〜13を参照のこと));質量分析およびガスクロマトグラフィー(例えば、METHODSINPROTEINSCIENCE、1997.J.WileyおよびSons、NewYork、NYを参照のこと)が挙げられ、そしてコンピュータモデリング(例えば、FletterickおよびZoller、編、1986.Computer Graphics and Molecular Modeling:CURRENT COMMUNICATION IN MOLECULAR BIOLOGY、Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと)もまた使用され得る。
本発明はさらにL型アミノ酸を有する本発明のペプチドをコードする核酸に関する。本発明のペプチドをコードする核酸の適切な供給源はヒトゲノム配列を含む。他の供給源としては、ラットゲノム配列が挙げられ、そしてタンパク質配列は、それぞれGenBankから入手可能であり、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。ペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の任意の方法(例えば、配列の3’−および5−末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するPCR増幅により、および/またはcDNAもしくは所定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するゲノムライブラリーからのクローニングにより)により得られ得る。
ペプチドの組換え体の発現のために、ペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部分を含む核酸が、適切な発現ベクター(すなわち、挿入されたペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター)に挿入され得る。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、異種(すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターでない)である。あるいは、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、遺伝子および/またはそれらの隣接する領域についてネイティブなプロモーターにより供給され得る。種々の宿主ベクター系は、ペプチドをコードする配列を発現するために利用され得る。これらは以下を含むが、限定ではない:(i)ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系;(ii)バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系;(iii)酵母ベクターを含む酵母または(iv)バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換された細菌。利用される宿主細胞系により、多数の適する転写エレメントおよび翻訳エレメントの任意の1つが使用され得る。
発現ベクター中のプロモーター/エンハンサー配列は、本発明において提供される植物、動物、昆虫、または真菌の調節配列を利用し得る。例えば、プロモーター/エンハンサーエレメントは、酵母および他の真菌(例えば、GAL4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼプロモータ、アルカリホスファターゼプロモータ)から使用され得る。発現ベクターまたはそれらの誘導体としては、例えば、ヒトまたは動物ウイルス(例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス);昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス);酵母ベクター;バクテリオファージベクター(例えば、λファージ);プラスミドベクターおよびコスミドベクターが挙げられる。
宿主細胞株は、挿入された目的の配列の発現を調節するか、または所望される特定の手段において、この配列によりコードされる発現されたペプチドを改変するか、もしくは処理するか選択され得る。さらに、特定のプロモーター由来の発現は、選択された宿主細胞株における特定のインデューサーの存在下で増強され得る;従って、一般的に設計されたペプチドの発現の制御を容易にする。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳プロセスおよび翻訳後のプロセスならびに発現されたペプチドの改変(例えば、グリコシル化、リン酸化など)に対する特定の特徴付けられたメカニズムを有する。従って、適切な細胞株または宿主系は、外来のペプチドの所望される改変およびプロセスが達成されたことを保証するために選択され得る。例えば、細菌系でのペプチド発現は、グリコシル化されていないコアペプチドを産生するために使用され得る;一方、哺乳動物細胞での発現は、異種のペプチドの「ネイディブ」グリコシル化を保証する。
ペプチドの誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび変異体、ならびにこれらのペプチドをコードする核酸を含む。核酸に関しては、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログが、少なくとも6個の(隣接する)核酸配列として規定され、そしてこれらは特異的なハイブリダイゼーションをさせるに十分な長さを有する。アミノ酸に関して、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログは少なくとも4個の(隣接する)アミノ酸配列として規定され、特異的な認識をさせるに十分な長さである。
改変体の設計には、IL−13についてYuichiro Yoshida et al.,Biochem Biophys Res Commun.2007,vol.358,No.1,p.292−7.、IL−4についてThorsten Hage et al.,Cell.1999,vol.97,No.2,p.271−81.、ニューロピリン−1についてAlexander Antipenko et al.,Neuron.2003,vol.39,No.4,p.589−98.;Transferrin RについてJae H.Lee et al.,Eur.J.Biochem.2001,vol.268,p.2004−2012.;VEGFR(WHSDMEWWYLLG(配列番号31))についてPing AN et al.,2004,Int.J.Cancer.Vol.111,p.165−173.;HER−2についてValeria R.Fantin et al.,Cancer Res.2005,vol.65,No.15,p.6891−6900.;VEGFR(VEPNCDIHVMWEWECFERL−NH2(配列番号32))についてKimberly J.Peterson et al.,AnaLytical Biochemistry 2008,vol.378,No.1,p.8−14.;VEGFR(GGNECDAIRMWEWECFERL(配列番号33))についてBorlan Pan et al.,J.Mol.Biol.2002,vol.316,No.3,p.769−87.;BuforinについてHyun Soo Lee et al.,Cancer Lett.2008,vol.271,No.1,p.47−55;FGFR(MQLPLAT(配列番号5))について、Fukuto Maruta et al.,Cancer Gene Therapy.2002,vol.9,p.543−552;FGFR(AAVALLPAVLLALLAP(配列番号6))について、Akiko Komi et al.,Exp.Cell Res.2003,Vol.283,No.1,p.91−100;NRP1/VEGFR2(ATWLPPR(配列番号36))についてLoraine Tirand et al.,J.Control Release.2006,vol.111,p.153−164、EphB1およびEphB2についてMitchell Koolpe et al.,J Biol.Chem.2005,vol.280,No.17,p.17301−11;IL11RについてAmado J.Zurita et al.,Cancer Res.2004,vol.64,p.435−439;GRP78(WDLAWMFRLPVG(配列番号39))についてMarco A.Arap et al.,Cancer Cell.2004,vol.6,p.275−284;GRP78(CTVALPGGYVRVC(配列番号40))についてYing Liu et al.,Mol.Pharmaceutics.2007,Vol.4,No.3,p.435−447;PSMAについてKaushal Rege et al.,Cancer Res.2007,vol.67,No.13,p.6368−6375の文献に記載された他の受容体等の配列の情報に基づき、類似の受容体結合ペプチドを設計することができる(これらの文献は本明細書において参考として援用する)。そのような改変としては、保存的置換が挙げられるがこれに限定されない。ここで、IL4、IL13、ニューロピリン−1結合配列については立体構造解析結果をもとに設計された。またHER2、VEGFR、TfRについてはEGFRと同様に上記文献の結合配列情報をそのまま使ったものに活性が見出されている。
また、細胞透過性ペプチドの改変についても、従来の知見を参考にして本明細書の記載に基づき改変することができる。たとえば、Daniele Derossi et al.,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.271,No.30,Issue of July 26,pp.18188−18193,1996は、Antpに関して、そのメカニズムおよび一部変異を加えた改変体に関する知見を提供する。これらには、細胞透過に重要な部位が記載されており、本発明の改変体、アナログを生産する際に参照することができ、この文献は、その全体を参考として本明細書中で援用する。
他の文献としては、Genevie Ave Dom et al.,Nucleic Acids Research,2003,Vol.31,No.2 556±561;Wenyi Zhang and Steven O.Smith,Biochemistry 2005,44,10110−10118;およびISABELLE LE Roux,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.90,pp.9120−9124,October 1993は、細胞貫通メカニズムおよび変異についての情報を提供しており、これらの文献もまた、本発明の改変体、アナログを生産する際に参照することができ、これらの文献は、その全体を参考として本明細書中で援用する。
(医薬)
本発明の化合物またはその製薬上許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。
本発明の化合物またはその製薬上許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口または例えば、直腸内、口腔内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口をあげることができる。投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、p−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性製剤からなる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
局所製剤は、活性化合物を1種もしくはそれ以上の媒質、例えば鉱油、石油、多価アルコール等または局所医薬製剤に使用される他の基剤中に溶解または懸濁させて調製する。腸内投与のための製剤は、通常の担体、例えばカカオ脂、水素化脂肪、水素化脂肪カルボン酸等を用いて調製し、座剤として提供される。
本発明では、非経口剤においても、経口剤で例示したグリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤(抗酸化剤を含む)、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明の化合物もしくはその製薬上許容される塩の有効用量および投与回数は、投与形態、患者の年令、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、投与量は、1日当たり0.01〜1000mg/人、好ましくは5〜500mg/人であり、投与回数は、1日1回または分割して投与するのが好ましい。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を製造するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
本発明はまた、本発明の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの水和物等プロドラッグを使用するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
(DDS)
本明細書において「送達剤」または「送達媒体」とは、目的の物質の送達を媒介する担体(ビヒクル)をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。薬物送達システム(Drug Delivery System、DDS)とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型DDS、放出制御型DDS、標的指向型DDSに分類することもある。理想的なDDSは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティングDDSは、パッシブ・ターゲティングDDSとアクティブ・ターゲティングDDSとに分類される。前者はキャリアー(薬物担体または薬物運搬体)の粒子径や親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しようとする方法であり、例えば、標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体(たとえば、本発明のTPR結合ペプチド)などを結合したキャリアを利用する方法があり「ミサイルドラッグ」と呼ばれることもある。
本明細書において「送達剤」または「送達媒体」とは、目的の物質の送達を媒介する担体(ビヒクル)をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。薬物送達システム(Drug Delivery System、DDS)とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型DDS、放出制御型DDS、標的指向型DDSに分類することもある。理想的なDDSは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティングDDSは、パッシブ・ターゲティングDDSとアクティブ・ターゲティングDDSとに分類される。前者はキャリアー(薬物担体または薬物運搬体)の粒子径や親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しようとする方法であり、例えば、標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体(たとえば、本発明のTPR結合ペプチド)などを結合したキャリアを利用する方法があり「ミサイルドラッグ」と呼ばれることもある。
本明細書において「薬物送達媒体」とは、所望の薬物を送達するためのビヒクルをいう。
本明細書において「目的物質」とは、特に、送達媒体により細胞内に送達されることが所望される物質をいう。
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物または遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでDDS用のナノ粒子性キャリア材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、リンカーまたは架橋剤等を必要に応じて使用することによって、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位(例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど)またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位(例えば、ホスファチジルエタノールアミン)として、有させることができる。
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、a)脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびb)混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明において使用される糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の2段階反応によって行うことができる。a)リポソーム膜上のガングリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、およびb)還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法(GPC)、走査型電顕(SEM)、動的光散乱法(DLS)などを使うことができる。
本明細書において「リンカー」とは、表面結合分子(たとえば、 TRP結合ペプチド)とリポソーム表面との結合を介在する分子である。本発明において使用される糖鎖修飾リポソームにおいて、ペプチドはリンカーを介してリポソーム表面に結合してもよい。リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において「リンカータンパク質」とは、リンカー分子のうち、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のポリマーをいう。
本明細書において「リンカー(タンパク質)基」とは、リンカー(タンパク質)が別の基と結合したときに付される名称である。リンカー(タンパク質)基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、哺乳動物由来タンパク質基、ヒト由来タンパク質基、ヒト血清タンパク質基、血清アルブミン基が挙げられる。リンカー(タンパク質)基は「ヒト」由来が好ましい。ヒト投与において適合性が高いと考えられるからである。また、免疫原性がないタンパク質が好ましい。
本明細書において「架橋基」とは、橋をかけるように,鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる基をいう。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子(例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖)との間に作用し、分子内または分子間で、共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる基をいう。本明細書において架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、グルタルアルデヒドを用いることができる。
本明細書において「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液(CBS)、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液(TAPS)、2−[4−(2−ヒドロキシルエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)、その他のグット緩衝液(例えば、2−モルホリノエタンスルホン酸,モノヒドレート(MES)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−tris)、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)、1,3−ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン(Bis−trisプロパン)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、コラミンクロリド、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−プロパンスルホン酸(HEPPS)、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン(Tricine)、アミノアセトアミド(グリシンアミド)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)およびN−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS))などが挙げられるが、これらに限定されない。
以上のように、本発明は、EGFRドメイン結合ペプチドを含む、目的物質のがん細胞への送達剤を提供する。目的物質は、EGFRドメイン結合ペプチドと結合していても結合していなくてもよい。結合した場合は融合物質となり、ペプチドの場合はキメラペプチドと呼ばれる。本発明のキメラペプチドは、この実施形態であるということもできる。このような物質は、媒体(ビヒクル)によって複合剤を形成してもよい。このような媒体としては、リポソームを使用することができ、目的物質は、リポソームの外側にあっても内部に包含されていてもよい。
(スクリーニング)
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作/評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の特異的部分を使用することができる。
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作/評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の特異的部分を使用することができる。
本明細書において、たとえば、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類(immunophenotyping)」ともいう。この場合、本発明のペプチドは、細胞株および生物学的サンプルの分類のために利用され得る。本発明は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および/または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス(すなわち、プレート)に付着した抗体を用いる「パニング(panning)」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる(例えば、米国特許第5,985,660号;およびMorrisonら、Cell,96:737−49(1999)を参照)。
たとえば、ヒト臍帯血において見出され得るような細胞増殖および/または分化を起こし得るかまたは未分化状態への改変処置を行ったような細胞集団のような、未分化の細胞(例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞など)を含む細胞集団についてスクリーニングするために利用され得る。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限りナカライテスク、Sigma等から得ることができる。
(実施例1:EGFR標的化キメラペプチド)
[材料および方法]
(細胞株)
ヒト乳がん細胞株(BT−20およびT47D)、肺がん細胞株(H322およびH460)、膵臓がん細胞株(SU.86.86)、前立腺がん細胞株(LNCap)、脳腫瘍細胞株(U251)および肺線維芽細胞株(MRC−5およびWI−38)を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入した。ヒト膵臓がん細胞株(BXPC−3)を、Europiean Collection of Cell Cultures(ECACC;Salisbury,Wiltshire,UK)から購入した。ヒト胚性腎臓細胞株(HEK293)を、RIKEN Cell Bank(つくば市)から購入した。細胞は、10% FBS(BioWest,Miami,FL)、100μg/ml ペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシン(ナカライテスク株式会社、京都市)を含有する、RPMI 1640(BT−20、T47D、H322、H460、SU.86.86、LNCap、U251およびBXPC−3)、MEM(MRC−5およびWI−38)またはD−MEM(HEK293)中で培養した。
[材料および方法]
(細胞株)
ヒト乳がん細胞株(BT−20およびT47D)、肺がん細胞株(H322およびH460)、膵臓がん細胞株(SU.86.86)、前立腺がん細胞株(LNCap)、脳腫瘍細胞株(U251)および肺線維芽細胞株(MRC−5およびWI−38)を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入した。ヒト膵臓がん細胞株(BXPC−3)を、Europiean Collection of Cell Cultures(ECACC;Salisbury,Wiltshire,UK)から購入した。ヒト胚性腎臓細胞株(HEK293)を、RIKEN Cell Bank(つくば市)から購入した。細胞は、10% FBS(BioWest,Miami,FL)、100μg/ml ペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシン(ナカライテスク株式会社、京都市)を含有する、RPMI 1640(BT−20、T47D、H322、H460、SU.86.86、LNCap、U251およびBXPC−3)、MEM(MRC−5およびWI−38)またはD−MEM(HEK293)中で培養した。
(ペプチド)
以下のペプチドをInvitrogen,Carlsbad,CAから購入した:
1.がん細胞膜溶解性ペプチド:KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号1:下線の文字はD−アミノ酸である)
2.EGFR結合(EB)−がん細胞膜溶解性キメラペプチド:YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)
3.オリジナル溶解性ペプチド:LKLLKKLLKKLLKLL−NH2(配列番号41)
4.EB−オリジナル溶解性キメラペプチド:YHWYGYTPQNVIGGGLKLLKKLLKKLLKLL−NH2(配列番号42)
これらのペプチドを、固相化学を用いて化学合成し、そして、高速液体クロマトグラフィーにより均質(すなわち、90%より高い純度)になるまで精製して、質量分析法により評価した。ペプチドを水中に溶解させ、そして、pH7.4に緩衝化させた。ペプチド溶液は、使用直前に毎回新たに調製し、使い回しを避けた。
以下のペプチドをInvitrogen,Carlsbad,CAから購入した:
1.がん細胞膜溶解性ペプチド:KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号1:下線の文字はD−アミノ酸である)
2.EGFR結合(EB)−がん細胞膜溶解性キメラペプチド:YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)
3.オリジナル溶解性ペプチド:LKLLKKLLKKLLKLL−NH2(配列番号41)
4.EB−オリジナル溶解性キメラペプチド:YHWYGYTPQNVIGGGLKLLKKLLKKLLKLL−NH2(配列番号42)
これらのペプチドを、固相化学を用いて化学合成し、そして、高速液体クロマトグラフィーにより均質(すなわち、90%より高い純度)になるまで精製して、質量分析法により評価した。ペプチドを水中に溶解させ、そして、pH7.4に緩衝化させた。ペプチド溶液は、使用直前に毎回新たに調製し、使い回しを避けた。
(小さな単層状小胞(SUV)の調製)
小さな単層状小胞(SUV)を、先に記載されたように調製した(Matsuzaki,K.& Horikiri,C.Interactions of Amiloid β−peptide(1−40)with Ganglioside−containing membranes.Biochemistry 38,4137−4142(1999))。簡単に述べると、所望の組成の脂質膜を水中またはTris緩衝液(10mM Tris/150mM NaCl/1mM EDTA、pH7.4)中に分散させた。得られたMLVを5回の凍結−溶解サイクルに供し、次いで、プローブ型の超音波処理装置(Tomy UD−201)を用いて、氷冷水中、窒素雰囲気下で15分間超音波処理した。プローブのチタン先端部からの金属片を遠心分離により除いた。リン解析により、脂質濃度を三連で決定した(Bartlett,G.R.Phosphorus assay in column chromatography.J.Biol.Chem.234,466−468(1959))。
小さな単層状小胞(SUV)を、先に記載されたように調製した(Matsuzaki,K.& Horikiri,C.Interactions of Amiloid β−peptide(1−40)with Ganglioside−containing membranes.Biochemistry 38,4137−4142(1999))。簡単に述べると、所望の組成の脂質膜を水中またはTris緩衝液(10mM Tris/150mM NaCl/1mM EDTA、pH7.4)中に分散させた。得られたMLVを5回の凍結−溶解サイクルに供し、次いで、プローブ型の超音波処理装置(Tomy UD−201)を用いて、氷冷水中、窒素雰囲気下で15分間超音波処理した。プローブのチタン先端部からの金属片を遠心分離により除いた。リン解析により、脂質濃度を三連で決定した(Bartlett,G.R.Phosphorus assay in column chromatography.J.Biol.Chem.234,466−468(1959))。
(CDスペクトル)
CDスペクトルは、1mm光路長の石英セルを用いて、Jasco J−820にて測定し、緩衝液成分に起因する吸収を最小限にした。各サンプルにつき、8回の走査の平均をとった。平均化したブランクスペクトル(小胞懸濁物または溶媒)を差し引いた。ペプチドおよび脂質の濃度は、それぞれ、50μMおよび4mMであった。
CDスペクトルは、1mm光路長の石英セルを用いて、Jasco J−820にて測定し、緩衝液成分に起因する吸収を最小限にした。各サンプルにつき、8回の走査の平均をとった。平均化したブランクスペクトル(小胞懸濁物または溶媒)を差し引いた。ペプチドおよび脂質の濃度は、それぞれ、50μMおよび4mMであった。
膜透過の可視化(Imura Y.,Choda,N.,& Matsuzaki,K.Magainin 2 in action:distinct modes of membrane permeabilization in living bacterial and mammalian cells.Biophys.J.95,5757−5765(2008))。可溶性蛍光分子であるカルセインを、ガラス底のディッシュ内のMDA−MB−231細胞に2μMの最終濃度で加えた。少量の標識ペプチド、EB−Lytic−TAMRA−OHまたはLytic−TAMRA−OH(Invitrogen)(15μl)を、10μMの最終濃度でディッシュに直接加えた。Olympus FV1000共焦点レーザ走査顕微鏡(Olympus)を用いて共焦点像を撮影した。
(細胞生存性アッセイ)
1ウェルあたり合計3×103細胞を、96ウェルプレートに播種し、10% FBSを含有する培地中で24時間培養し、100μlにおいて漸増濃度のペプチドと共に、37℃にて48〜72時間インキュベートした。細胞の生存率を、WST−8溶液(Cell Count Reagent SF;ナカライテスク株式会社)を用いて測定した。
1ウェルあたり合計3×103細胞を、96ウェルプレートに播種し、10% FBSを含有する培地中で24時間培養し、100μlにおいて漸増濃度のペプチドと共に、37℃にて48〜72時間インキュベートした。細胞の生存率を、WST−8溶液(Cell Count Reagent SF;ナカライテスク株式会社)を用いて測定した。
(免疫蛍光染色)
フローサイトメトリーによるEGFR発現を、FITCを結合したEGFRに対するヒトモノクローナル抗体(Santa Cruz)と共に、1×105細胞をインキュベートすることにより決定した。全ての染色は、室温にて40分間行った。細胞の蛍光を、フローサイトメトリー(FACSCalibur,Becton Dickinson,San Jose,CA)により測定した。EGFR陽性細胞の平均蛍光強度(MFI)を、CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて決定した。
フローサイトメトリーによるEGFR発現を、FITCを結合したEGFRに対するヒトモノクローナル抗体(Santa Cruz)と共に、1×105細胞をインキュベートすることにより決定した。全ての染色は、室温にて40分間行った。細胞の蛍光を、フローサイトメトリー(FACSCalibur,Becton Dickinson,San Jose,CA)により測定した。EGFR陽性細胞の平均蛍光強度(MFI)を、CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて決定した。
(アポトーシスアッセイおよびカスパーゼアッセイ)
H322細胞およびBT−20細胞を、20μMのEB−溶解性キメラペプチドを用いて、または、これを用いずに、37℃にて6時間処理した。カスパーゼの活性化またはアポトーシスを決定するために、ペプチドで処理した培養物を、カルボキシフルオレセインFLICAポリカスパーゼアッセイ(Immunochemistry Technologies,Bloomington,MN)を用いてカスパーゼ活性およびヨウ化プロピジウム(PI)染色について、あるいは、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンV標識およびPI染色について、同時に解析した。また、製造業者の説明書に従い、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL)により、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを行った。
H322細胞およびBT−20細胞を、20μMのEB−溶解性キメラペプチドを用いて、または、これを用いずに、37℃にて6時間処理した。カスパーゼの活性化またはアポトーシスを決定するために、ペプチドで処理した培養物を、カルボキシフルオレセインFLICAポリカスパーゼアッセイ(Immunochemistry Technologies,Bloomington,MN)を用いてカスパーゼ活性およびヨウ化プロピジウム(PI)染色について、あるいは、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンV標識およびPI染色について、同時に解析した。また、製造業者の説明書に従い、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL)により、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを行った。
(生体分子の相互作用)
BIACOREバイオセンサーシステム3000(BIACORE Inc,Uppsala,Sweden)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)実験を行った。N−ヒドロキシスクシンイミドおよびN−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド活性化化学により約5000RUのストレプトアビジン(Sigma)をCM5センサーチップの表面に固定し、次いで、ビオチンを結合した2000〜3000RUのペプチドを、このストレプトアビジンを固定したセンサーチップの上に注入した。非特異的な結合のコントロールとして、ストレプトアビジンを固定していないセンサーチップの反応していないカルボキシメチル基を、エタノールアミンでブロックした。分析物として、Mem−PER真核生物膜タンパク質抽出試薬キット(Pierce)を用いて調製した細胞表面タンパク質を、25℃にて20μl/分の流速のフローセルに注入した。アッセイの間に非特異的な結合を防ぐために、HBS緩衝液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005% Tween 20、3mM EDTA[pH7.4])を泳動緩衝液として用いた。組換えヒトEGFレセプター(rhEGFR)のEB−溶解性キメラペプチドとの相互作用解析を、以下のように行った:上述のように、約5000RUのrhEGFR(配列番号3)をCM5のセンサーチップ上に固定し、次いで、いくつかの濃度のペプチドをこのセンサーチップの上に注入した。これらの実験において用いた全てのタンパク質濃度は、Bradford法(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding.Anal Biochem 1976;72:248−54)により決定した。データの解析は、BIA evaluation ver.3.2ソフトウェア(BIACORE)を用いて行った。
BIACOREバイオセンサーシステム3000(BIACORE Inc,Uppsala,Sweden)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)実験を行った。N−ヒドロキシスクシンイミドおよびN−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド活性化化学により約5000RUのストレプトアビジン(Sigma)をCM5センサーチップの表面に固定し、次いで、ビオチンを結合した2000〜3000RUのペプチドを、このストレプトアビジンを固定したセンサーチップの上に注入した。非特異的な結合のコントロールとして、ストレプトアビジンを固定していないセンサーチップの反応していないカルボキシメチル基を、エタノールアミンでブロックした。分析物として、Mem−PER真核生物膜タンパク質抽出試薬キット(Pierce)を用いて調製した細胞表面タンパク質を、25℃にて20μl/分の流速のフローセルに注入した。アッセイの間に非特異的な結合を防ぐために、HBS緩衝液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005% Tween 20、3mM EDTA[pH7.4])を泳動緩衝液として用いた。組換えヒトEGFレセプター(rhEGFR)のEB−溶解性キメラペプチドとの相互作用解析を、以下のように行った:上述のように、約5000RUのrhEGFR(配列番号3)をCM5のセンサーチップ上に固定し、次いで、いくつかの濃度のペプチドをこのセンサーチップの上に注入した。これらの実験において用いた全てのタンパク質濃度は、Bradford法(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding.Anal Biochem 1976;72:248−54)により決定した。データの解析は、BIA evaluation ver.3.2ソフトウェア(BIACORE)を用いて行った。
(コロニー形成アッセイ)
H322細胞に対する溶解性ペプチドまたはキメラペプチドのインビトロ細胞傷害活性を、コロニー形成アッセイにより決定した。10%FBSを含むRPMI−1640(3ml)を入れた6cmディッシュに細胞を播種し付着させた。細胞/ディッシュの数は、コントロール群において、100未満のコロニーが得られるように設定した。細胞播種から24時間後に、種々の濃度の溶解性ペプチドまたはEB−溶解性キメラペプチド(0〜22.5μM)を細胞に曝露させ、10日間培養した。このディッシュをリン酸緩衝液で洗浄し、クリスタルバイオレット(25%アルコール中0.25%)で染色した。コントロール群および処理群において形成されたコロニーの数から、コロニーの生存率を決定した。
H322細胞に対する溶解性ペプチドまたはキメラペプチドのインビトロ細胞傷害活性を、コロニー形成アッセイにより決定した。10%FBSを含むRPMI−1640(3ml)を入れた6cmディッシュに細胞を播種し付着させた。細胞/ディッシュの数は、コントロール群において、100未満のコロニーが得られるように設定した。細胞播種から24時間後に、種々の濃度の溶解性ペプチドまたはEB−溶解性キメラペプチド(0〜22.5μM)を細胞に曝露させ、10日間培養した。このディッシュをリン酸緩衝液で洗浄し、クリスタルバイオレット(25%アルコール中0.25%)で染色した。コントロール群および処理群において形成されたコロニーの数から、コロニーの生存率を決定した。
[結果]
(二次構造に基づいた新規キメラペプチドの設計)
これまでに、PapoおよびShaiが、ロイシンおよびリジンのD型およびL型を含む15アミノ酸のジアステレオマー配列から構成される新規溶解型ペプチドを報告している(Papo,N.& Shai,Y.New Lytic peptides based on the D,L−amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 42,9346−9354(2003))。本研究において、本発明者らは、二次構造におけるその両親媒性に基づいて、EGFR結合(EB)ペプチドと組み合わせるのに適した新規溶解型ペプチドを設計した。図1Dに示すように、新たに設計した溶解性ペプチドの正に荷電したアミノ酸(Lys)のクラスターの位置は、EBペプチドと組み合わせた後、EB−溶解性ペプチドのものと比較して保存されたままであった(図1D(a,b))。CDスペクトル解析は、EB−溶解性ペプチドは、正常な細胞膜表面上で最も多い脂質種であるホスファチジルコリン(PC)から構成される小さな単層状小胞(SUV)への結合が弱く、PCリポソームではあまり上手く構造化されなかったが、このEB−溶解性ペプチドが、がん細胞膜上で特異的に露出されるホスファチジルセリン(PS)を含むSUVに結合し得、そして、209〜210nmおよび222nmにおける2つの極小値によって特徴付けられる部分的ならせん構造をとっていたことを実証した(図1D(d))。一方、EB−オリジナル溶解性ペプチドは、PCリポソームおよびPC/PSリポソームの両方に強く結合し得、そして、らせん構造をとった(図1D(c))。これらの結果は、本研究において新たに設計したキメラペプチドが、PSを含む膜に対して選択性を有し、そして、細胞表面上に孔をつくるために必須と考えられているらせん構造をとることを示す(Papo,N.& Shai,Y.New Lytic peptides based on the D,L−amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 42,9346−9354(2003))。
(二次構造に基づいた新規キメラペプチドの設計)
これまでに、PapoおよびShaiが、ロイシンおよびリジンのD型およびL型を含む15アミノ酸のジアステレオマー配列から構成される新規溶解型ペプチドを報告している(Papo,N.& Shai,Y.New Lytic peptides based on the D,L−amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 42,9346−9354(2003))。本研究において、本発明者らは、二次構造におけるその両親媒性に基づいて、EGFR結合(EB)ペプチドと組み合わせるのに適した新規溶解型ペプチドを設計した。図1Dに示すように、新たに設計した溶解性ペプチドの正に荷電したアミノ酸(Lys)のクラスターの位置は、EBペプチドと組み合わせた後、EB−溶解性ペプチドのものと比較して保存されたままであった(図1D(a,b))。CDスペクトル解析は、EB−溶解性ペプチドは、正常な細胞膜表面上で最も多い脂質種であるホスファチジルコリン(PC)から構成される小さな単層状小胞(SUV)への結合が弱く、PCリポソームではあまり上手く構造化されなかったが、このEB−溶解性ペプチドが、がん細胞膜上で特異的に露出されるホスファチジルセリン(PS)を含むSUVに結合し得、そして、209〜210nmおよび222nmにおける2つの極小値によって特徴付けられる部分的ならせん構造をとっていたことを実証した(図1D(d))。一方、EB−オリジナル溶解性ペプチドは、PCリポソームおよびPC/PSリポソームの両方に強く結合し得、そして、らせん構造をとった(図1D(c))。これらの結果は、本研究において新たに設計したキメラペプチドが、PSを含む膜に対して選択性を有し、そして、細胞表面上に孔をつくるために必須と考えられているらせん構造をとることを示す(Papo,N.& Shai,Y.New Lytic peptides based on the D,L−amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 42,9346−9354(2003))。
(EGFR標的化は、EGFRを発現するがん細胞において溶解性ペプチドの細胞傷害作用を増強する)
8種のEGFRを発現するがん細胞株に対して、溶解性ペプチドの細胞傷害性を、EGFR結合(EB)−溶解性キメラペプチドであるEGFR標的化ペプチドトキシンの細胞傷害性と比較した。図1Aに示すように、溶解性ペプチドまたはキメラペプチドでの処理は、試験した全てのがん細胞株において濃度依存性の細胞傷害性を生じた。キメラペプチドは、溶解性ペプチドのみの場合と比較して、がん細胞に対する細胞傷害活性のかなりの増強を示した。全ての細胞株において80%を超える細胞死を誘導するのに、キメラペプチドは15〜20μMの濃度で十分であった。対照的に、同じ濃度の溶解性ペプチドのみでは、がん細胞の十分な細胞殺傷を誘導できなかった。表1に示されるように、溶解性ペプチドはEGFR標的化することにより、がん細胞におけるIC50(コントロール細胞の増殖の50%阻害を誘導するペプチドの濃度)を1.6〜3.1倍増強させ、EGFR標的化により、溶解性ペプチドのみに比してEB−溶解性キメラペプチドに対するがん細胞の感受性が増強されたことが示唆された。本発明者らは、次いで、3種の正常細胞株におけるEB−溶解性キメラペプチドおよび溶解性ペプチドの細胞傷害性を評価した。図1Bに示されるように、MRC−5、WI−38およびHEK293を含む3種の正常細胞株は、溶解性ペプチドに対する感受性が低く、がん細胞株と比較してより低い細胞傷害性を示した。正常細胞株におけるキメラペプチドのIC50は、がん細胞と比較して正常細胞において3.6〜8.0倍高い(表1)。EB−溶解性キメラペプチドは正常細胞に対しても細胞傷害性が増強されたが、これはがん細胞における現象に類似する。これらの知見から、溶解性ペプチドは正常細胞よりもがん細胞において強い細胞傷害活性を有し、さらにEGFR標的化ペプチドトキシンはEGFR高発現がん細胞に対して優れた細胞傷害活性を有することを示唆する。興味深いことに、オリジナル溶解性ペプチドと組み合わせたEBペプチドは、細胞傷害活性の増強を示さず、そればかりか、EB−オリジナル溶解性ペプチドは、より低いペプチド濃度で正常細胞株(MRC−5)までも殺傷し、オリジナル溶解性ペプチドがEBペプチドとのキメラ化に適していないことが示唆された(図1C)。
8種のEGFRを発現するがん細胞株に対して、溶解性ペプチドの細胞傷害性を、EGFR結合(EB)−溶解性キメラペプチドであるEGFR標的化ペプチドトキシンの細胞傷害性と比較した。図1Aに示すように、溶解性ペプチドまたはキメラペプチドでの処理は、試験した全てのがん細胞株において濃度依存性の細胞傷害性を生じた。キメラペプチドは、溶解性ペプチドのみの場合と比較して、がん細胞に対する細胞傷害活性のかなりの増強を示した。全ての細胞株において80%を超える細胞死を誘導するのに、キメラペプチドは15〜20μMの濃度で十分であった。対照的に、同じ濃度の溶解性ペプチドのみでは、がん細胞の十分な細胞殺傷を誘導できなかった。表1に示されるように、溶解性ペプチドはEGFR標的化することにより、がん細胞におけるIC50(コントロール細胞の増殖の50%阻害を誘導するペプチドの濃度)を1.6〜3.1倍増強させ、EGFR標的化により、溶解性ペプチドのみに比してEB−溶解性キメラペプチドに対するがん細胞の感受性が増強されたことが示唆された。本発明者らは、次いで、3種の正常細胞株におけるEB−溶解性キメラペプチドおよび溶解性ペプチドの細胞傷害性を評価した。図1Bに示されるように、MRC−5、WI−38およびHEK293を含む3種の正常細胞株は、溶解性ペプチドに対する感受性が低く、がん細胞株と比較してより低い細胞傷害性を示した。正常細胞株におけるキメラペプチドのIC50は、がん細胞と比較して正常細胞において3.6〜8.0倍高い(表1)。EB−溶解性キメラペプチドは正常細胞に対しても細胞傷害性が増強されたが、これはがん細胞における現象に類似する。これらの知見から、溶解性ペプチドは正常細胞よりもがん細胞において強い細胞傷害活性を有し、さらにEGFR標的化ペプチドトキシンはEGFR高発現がん細胞に対して優れた細胞傷害活性を有することを示唆する。興味深いことに、オリジナル溶解性ペプチドと組み合わせたEBペプチドは、細胞傷害活性の増強を示さず、そればかりか、EB−オリジナル溶解性ペプチドは、より低いペプチド濃度で正常細胞株(MRC−5)までも殺傷し、オリジナル溶解性ペプチドがEBペプチドとのキメラ化に適していないことが示唆された(図1C)。
(EB−溶解性キメラペプチドにより誘導される細胞傷害活性の増強度合は、細胞表面上のEGFRの発現レベルに依存する)
本発明者らは、次に、EB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害性における増加が、細胞表面上のEGFRの発現レベルと相関するかどうかを調べた。8種のがん細胞株および3種の正常細胞株におけるEGFRの発現レベルを、FITC結合抗EGFRポリクローナル抗体を用い、フローサイトメトリーにより評価した。図2Aおよび表1に示されるように、EGFRの発現レベルは、EB−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのIC50とは相関しなかった(キメラペプチドにおいてr=−0.37(図2A左)、溶解性ペプチドにおいて、r=−0.14(図2A中央))。しかし、EGFRの発現レベルは、EB−溶解性キメラペプチドに対する溶解性ペプチドのIC50の比とは十分に相関しており、溶解性ペプチドのみに比較したEB−溶解性キメラペプチドによる細胞傷害活性の増強度合が、細胞表面上のEGFR発現レベルに依存する(r=0.89、図2A右)ことが示唆された。
本発明者らは、次に、EB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害性における増加が、細胞表面上のEGFRの発現レベルと相関するかどうかを調べた。8種のがん細胞株および3種の正常細胞株におけるEGFRの発現レベルを、FITC結合抗EGFRポリクローナル抗体を用い、フローサイトメトリーにより評価した。図2Aおよび表1に示されるように、EGFRの発現レベルは、EB−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのIC50とは相関しなかった(キメラペプチドにおいてr=−0.37(図2A左)、溶解性ペプチドにおいて、r=−0.14(図2A中央))。しかし、EGFRの発現レベルは、EB−溶解性キメラペプチドに対する溶解性ペプチドのIC50の比とは十分に相関しており、溶解性ペプチドのみに比較したEB−溶解性キメラペプチドによる細胞傷害活性の増強度合が、細胞表面上のEGFR発現レベルに依存する(r=0.89、図2A右)ことが示唆された。
EB−溶解性キメラペプチドのEGFRに対する特異性をさらに確認するために、EB−溶解性キメラペプチドへの曝露の1時間前に、抗EGFRポリクローナル抗体(Ab)または組換えヒトEGFをBXPC−3培養液中に加え、細胞に対する細胞傷害活性を評価した。図2Bに示されるように、EGFタンパク質およびEGFR−Abは、共に、EB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害性をブロックでき、EGFリガンドによる27%の阻害、およびEGFR−Abによる23%の阻害が実証された。これらの結果から、EB−溶解性キメラペプチドの細胞への結合は、EGFRの細胞表面発現レベルに依存することが示唆される。
(EGFRタンパク質および細胞表面膜タンパク質へのEB−溶解性キメラペプチドの結合についての相互作用プロファイル)
EGFRに対するペプチドの結合特性を理解するために、EGFRタンパク質をセンサーチップ上に固定し、EB−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみとの相互作用プロファイルを、BIACOREを用いて解析した。図3Aに示されるように、共鳴シグナル強度は、EB−溶解性キメラペプチドの濃度に応じて増加し、EGFRタンパク質に結合したEB−溶解性キメラペプチドの量は、EB−溶解性キメラペプチド濃度の増加に比例することが示された。対照的に、溶解性ペプチドのみによる共鳴シグナル強度は、濃度に応じて最低限に増加した。EGFRタンパク質に結合するEB−溶解性キメラペプチドのKD値は、2.6×10−5(M)であった。次に、ペプチドの細胞への結合特性を理解するために、EB−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみのいずれかをセンサーチップ上に固定し、そして、H322、BT−20またはMRC−5から抽出した細胞表面膜タンパク質との相互作用プロファイルを、BIACOREを用いて解析した。図3Bおよび3Cに示されるように、共鳴シグナル強度は、細胞膜タンパク質の濃度に応じて増加し、ペプチドに結合した細胞膜タンパク質の量は、細胞膜タンパク質濃度の増加と比例することが示された。溶解性ペプチドのみに対する細胞膜タンパク質の相互作用は、ペプチドの濃度を増加させても各細胞株において同程度の結合定数を示した。一方、H322がん細胞またはBT−20がん細胞の膜タンパク質に対するEB−溶解性キメラペプチドの結合定数は、溶解性ペプチドのみよりも4.2倍(H322)または4.4倍(BT−20)強かった(図3B、3Cおよび3D)。対照的に、MRC−5正常細胞の膜タンパク質に対する結合定数は、溶解性ペプチドのみと比較して有意に異ならなかった(図3D)。これらの結果は、WSTアッセイから得られたデータ(図1)と一致しており、EB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害活性が、細胞膜に対する親和性と十分に相関したことが示された。
EGFRに対するペプチドの結合特性を理解するために、EGFRタンパク質をセンサーチップ上に固定し、EB−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみとの相互作用プロファイルを、BIACOREを用いて解析した。図3Aに示されるように、共鳴シグナル強度は、EB−溶解性キメラペプチドの濃度に応じて増加し、EGFRタンパク質に結合したEB−溶解性キメラペプチドの量は、EB−溶解性キメラペプチド濃度の増加に比例することが示された。対照的に、溶解性ペプチドのみによる共鳴シグナル強度は、濃度に応じて最低限に増加した。EGFRタンパク質に結合するEB−溶解性キメラペプチドのKD値は、2.6×10−5(M)であった。次に、ペプチドの細胞への結合特性を理解するために、EB−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみのいずれかをセンサーチップ上に固定し、そして、H322、BT−20またはMRC−5から抽出した細胞表面膜タンパク質との相互作用プロファイルを、BIACOREを用いて解析した。図3Bおよび3Cに示されるように、共鳴シグナル強度は、細胞膜タンパク質の濃度に応じて増加し、ペプチドに結合した細胞膜タンパク質の量は、細胞膜タンパク質濃度の増加と比例することが示された。溶解性ペプチドのみに対する細胞膜タンパク質の相互作用は、ペプチドの濃度を増加させても各細胞株において同程度の結合定数を示した。一方、H322がん細胞またはBT−20がん細胞の膜タンパク質に対するEB−溶解性キメラペプチドの結合定数は、溶解性ペプチドのみよりも4.2倍(H322)または4.4倍(BT−20)強かった(図3B、3Cおよび3D)。対照的に、MRC−5正常細胞の膜タンパク質に対する結合定数は、溶解性ペプチドのみと比較して有意に異ならなかった(図3D)。これらの結果は、WSTアッセイから得られたデータ(図1)と一致しており、EB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害活性が、細胞膜に対する親和性と十分に相関したことが示された。
(EB−溶解性キメラペプチドは、がん細胞の迅速な殺傷を誘導する)
EB−キメラペプチドががん細胞を殺傷する適切な持続時間を評価するために、H322細胞またはBT−20細胞を、EB−キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみのいずれかで、10分間、30分間、1時間、または48時間処理した。図4に示されるように、H322細胞またはBT−20細胞の溶解性ペプチドのみでの処理は、時間依存性の様式で生存性の喪失をもたらした。対照的に、H322細胞またはBT−20細胞をほんの10分間EBM−キメラペプチド(10μM)に曝露するだけで、がん細胞は十分に殺傷され、70%を超える殺細胞効果を示した。共焦点顕微鏡解析もまた、このキメラペプチドが細胞膜に透過して、がん細胞表面上に孔を形成することを示し、そして、20分以内にがん細胞の細胞質へのカルセイン標識した媒体の流入が観察された(図4B)。しかしながら、この迅速な透過は、溶解性ペプチドのみでは観察されなかった(図4C)。これらの結果から、EB−キメラペプチドが、溶解性ペプチドのみと比較して、かなり迅速に細胞を殺傷することが示唆される。インビトロコロニー形成アッセイもまた、このキメラペプチドが、濃度依存性の様式でH322がん細胞の細胞増殖を阻害することを示した(図4D)。
EB−キメラペプチドががん細胞を殺傷する適切な持続時間を評価するために、H322細胞またはBT−20細胞を、EB−キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみのいずれかで、10分間、30分間、1時間、または48時間処理した。図4に示されるように、H322細胞またはBT−20細胞の溶解性ペプチドのみでの処理は、時間依存性の様式で生存性の喪失をもたらした。対照的に、H322細胞またはBT−20細胞をほんの10分間EBM−キメラペプチド(10μM)に曝露するだけで、がん細胞は十分に殺傷され、70%を超える殺細胞効果を示した。共焦点顕微鏡解析もまた、このキメラペプチドが細胞膜に透過して、がん細胞表面上に孔を形成することを示し、そして、20分以内にがん細胞の細胞質へのカルセイン標識した媒体の流入が観察された(図4B)。しかしながら、この迅速な透過は、溶解性ペプチドのみでは観察されなかった(図4C)。これらの結果から、EB−キメラペプチドが、溶解性ペプチドのみと比較して、かなり迅速に細胞を殺傷することが示唆される。インビトロコロニー形成アッセイもまた、このキメラペプチドが、濃度依存性の様式でH322がん細胞の細胞増殖を阻害することを示した(図4D)。
(EB−キメラペプチドは、がん細胞におけるカスパーゼの活性化とアポトーシスを誘導する)
EB−キメラペプチドにより引き起こされる細胞死の作用機構を調べるために、マルチパラメトリックフローサイトメトリー解析を用いるアポトーシスアッセイを行った。図5Aに示されるように、BT−20乳がん細胞に対するEB−溶解性キメラペプチド(20μM)の6時間の曝露は、カスパーゼ活性およびアネキシンV染色を誘導し、EB−溶解性キメラペプチドが、がん細胞におけるアポトーシス性の細胞死の80%を誘導することが示唆された。このキメラペプチドを用いたアポトーシスはまた、TUNELアッセイ(図5B)によっても検出された。これらの結果は、EB−溶解性キメラペプチドが、原形質膜を透過し、がん細胞のアポトーシスおよび迅速な殺傷を誘導し得ることを示す。
EB−キメラペプチドにより引き起こされる細胞死の作用機構を調べるために、マルチパラメトリックフローサイトメトリー解析を用いるアポトーシスアッセイを行った。図5Aに示されるように、BT−20乳がん細胞に対するEB−溶解性キメラペプチド(20μM)の6時間の曝露は、カスパーゼ活性およびアネキシンV染色を誘導し、EB−溶解性キメラペプチドが、がん細胞におけるアポトーシス性の細胞死の80%を誘導することが示唆された。このキメラペプチドを用いたアポトーシスはまた、TUNELアッセイ(図5B)によっても検出された。これらの結果は、EB−溶解性キメラペプチドが、原形質膜を透過し、がん細胞のアポトーシスおよび迅速な殺傷を誘導し得ることを示す。
(H322がん細胞増殖のインビトロ阻害)
H322がん細胞に対するEB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害活性をさらに確認するために、コロニー形成アッセイを行った(Kawakami K,Kawakami M,Leland P,Puri RK.Internalization property of interleukin−4 receptor alpha chain increases cytotoxic effect of interleukin−4 receptor−targeted cytotoxin in cancer cells.Clin Cancer Res 2002;8:258−66;Kawakami K,Joshi BH,Puri RK.Sensitization of cancer cells to interleukin 13−pseudomonas exotoxin−induced cell death by gene transfer of interleukin 13 receptor alpha chain.Hum Gene Ther 2000;11:1829−35)。図6に示されるように、H322細胞は、溶解性ペプチドのみ(IC50、14.2μM)に対して感受性であったが、この細胞は、キメラペプチドに対して少なくとも2倍高い感受性(IC50<7.5μM)を示した。コロニー形成アッセイによる2つのペプチドのIC50値は、WSTアッセイにより決定したIC50値と十分に相関する。
H322がん細胞に対するEB−溶解性キメラペプチドの細胞傷害活性をさらに確認するために、コロニー形成アッセイを行った(Kawakami K,Kawakami M,Leland P,Puri RK.Internalization property of interleukin−4 receptor alpha chain increases cytotoxic effect of interleukin−4 receptor−targeted cytotoxin in cancer cells.Clin Cancer Res 2002;8:258−66;Kawakami K,Joshi BH,Puri RK.Sensitization of cancer cells to interleukin 13−pseudomonas exotoxin−induced cell death by gene transfer of interleukin 13 receptor alpha chain.Hum Gene Ther 2000;11:1829−35)。図6に示されるように、H322細胞は、溶解性ペプチドのみ(IC50、14.2μM)に対して感受性であったが、この細胞は、キメラペプチドに対して少なくとも2倍高い感受性(IC50<7.5μM)を示した。コロニー形成アッセイによる2つのペプチドのIC50値は、WSTアッセイにより決定したIC50値と十分に相関する。
[考察]
この研究において、本発明者らは、「ペプチドトキシン」と呼ばれる新規キメラペプチドを生成するために、アミノ酸の2つの機能性ドメインを連結した。この「ペプチドトキシン」は、EGFRを過剰発現するがん細胞を標的化するために、EGFRに結合して細胞膜を溶解する二機能性ペプチドとして設計した。本発明者らは、EB−溶解性キメラペプチドが、溶解性ペプチドのみと比較したとき、より迅速かつ効率的にがん細胞を殺傷することを見出した。一方で、正常細胞は、両方のペプチドに対し、あまり感受性は高くない。
この研究において、本発明者らは、「ペプチドトキシン」と呼ばれる新規キメラペプチドを生成するために、アミノ酸の2つの機能性ドメインを連結した。この「ペプチドトキシン」は、EGFRを過剰発現するがん細胞を標的化するために、EGFRに結合して細胞膜を溶解する二機能性ペプチドとして設計した。本発明者らは、EB−溶解性キメラペプチドが、溶解性ペプチドのみと比較したとき、より迅速かつ効率的にがん細胞を殺傷することを見出した。一方で、正常細胞は、両方のペプチドに対し、あまり感受性は高くない。
本発明者らは、以下のように、がんの殺傷におけるEB−溶解性キメラペプチドの作用機構を提案する。まず、キメラペプチドのEB部分が、細胞表面上のEGFRに結合し、その後、キメラペプチドの溶解性部分が結合し、そして、遊離の溶解性ペプチドよりも迅速に細胞膜を崩壊させる。EBペプチドは、22nMの解離定数でEGFRに対し特異的かつ効率的に結合した(Li Z,Zhao R,Wu X,et al.Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics.FASEB J 2005;19:1978−85)。したがって、EB−EGFR相互作用の親和性は、溶解性ペプチドと細胞膜との親和性よりも高いことが示唆された。
溶解性ペプチドと同様に、ミトコンドリア毒性およびアポトーシス促進性ペプチドは、ポリカチオン性の配列(KLAKLAK)2(配列番号4)を有し、細胞膜を崩壊させることなく、膜透過性配列を有するペプチドによって細胞内区画へと侵入し、そしてミトコンドリアの損傷を誘導する(Ellerby HM,Arap W,Ellerby LM,et al.Anti−cancer activity of targeted pro−apoptotic peptides.Nat Med 1999;5:1032−8)。細胞膜溶解性ペプチドでは細胞膜を崩壊させた後に細胞内へと侵入し、ミトコンドリアの損傷とカスパーゼの活性化を誘導し、そして、アポトーシスを誘発する。一方、緑膿菌外毒素ベースのイムノトキシン(インターロイキン−13−緑膿菌外毒素(IL13−PE38QQR)(配列番号6))は、部分的なアポトーシスを誘導し、そして、頭頚部がん細胞のほんの10〜30%のみがアポトーシス性の細胞死をこうむる(Kawakami M,Kawakami K,Puri RK.Apoptotic pathways of cell death induced by an interleukin−13 receptor−targeted recombinant cytotoxin in head and neck cancer cells.Cancer Immunol Immunother 2002;50:691−700)。したがって、ペプチドトキシンは、細菌毒素ベースのイムノトキシンと比べて、より多くのアポトーシス性の細胞死を誘導するという利点があり、インビボにおいて処置部位でバイスタンダー作用または自然免疫を誘導し得るようである。
一般に、ペプチドは、ヒトの体内で血清成分により比較的容易に不活性化される(Papo N,Braunstein A,Eshhar Z,Shai Y.Suppression of human prostate tumor growth in mice by a cytoLytic D−,L−amino acid peptide:membrane lysis,increased necrosis,and inhibition of prostate−specific antigen secretion.Cancer Res 2004;64:5779−86)。ジアステレオマーペプチドは、血清中で不活性化を比較的逃れ、腫瘍内投与または静脈内投与のいずれかにより投与された溶解性のジアステレオマーペプチドは、血中でペプチドが迅速に分解することなく、ヒトの前立腺がんの動物モデルの腫瘍増殖を減少させることが示されている(Papo N,Braunstein A,Eshhar Z,Shai Y.Suppression of human prostate tumor growth in mice by a cytoLytic D−,L−amino acid peptide:membrane lysis,increased necrosis,and inhibition of prostate−specific antigen secretion.Cancer Res 2004;64:5779−86)。最近報告されている、がん細胞のHsp90に結合してそのクライアントタンパク質を不安定にする他のタイプのペプチドベースの薬物もまた、50mg/kgの濃度で静脈内注射されると、マウスにおけるヒト乳がん細胞の増殖を阻害する(Plescia,J.et al.Rational design of shepherdin,a novel anticancer agent.Cancer Cell 7,457−468(2005))。本研究において、本発明者らが新たに設計したEB−溶解性ペプチドの静脈内投与が、他のペプチド薬物候補と比較してより低い濃度において腫瘍の増殖を低減させたことが見出され、この新規キメラペプチドの、がん治療のための新規かつ有用なツールとしての可能性の高さが示唆された。EB−溶解性キメラペプチドは、血流における不活性化に対して抵抗性を示す可能性もあるが、インビボ使用でのこのペプチドの有効性をより高めるための方法としては、他の物質と組み合わせるか、あるいは局所投与が有効ではないかと考えられる。例えば、ペプシン処理により高度に精製されたウシの真皮のI型コラーゲンであるアテロコラーゲンは、タンパク質およびsiRNA薬剤のための魅力的な薬物送達システム(DDS)であることが示されている(Fujioka K,Maeda M,Hojo T,Sano A.Protein release from collagen matrices.Adv Drug Deliv Rev 1998;31:247−66;Takeshita F,Minakuchi Y,Nagahara S,et al.Efficient delivery of small interfering RNA to bone−metastatic tumors by using atelocollagen in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:12177−82)。アテロコラーゲンと共に局所投与されたタンパク質薬剤は、長時間にわたり注入部位から徐放され続けることが報告されている(Fujioka K,Maeda M,Hojo T,Sano A.Protein release from collagen matrices.Adv Drug Deliv Rev 1998;31:247−66)。したがってヒトのがんのインビボモデルにおいて、アテロコラーゲンは本発明者らのペプチドトキシンと共に組み合わせた試験する価値が十分にあると思われる。現在、これらの可能性について本発明者らの研究室において研究中である。
イムノトキシンは、殺傷性部分を有するタンパク質毒素と、これに連結された、がん細胞に対する選択性のためのリガンドまたは抗体のようなターゲティング部分とから構成される。イムノトキシンは、第一世代のイムノトキシンとしての化学結合体、および、第二世代のイムノトキシンとしての組換えタンパク質という2つの分類に分けられ得る(Reiter Y,Pastan I.Recombinant Fv immunotoxins and Fv fragments as novel agents for cancer therapy and diagnosis.Trens Biotechnol 1998;16:513−20)。従来のイムノトキシンは、通常、臨床上の使用において障害(例えば、免疫原性、望ましくない毒性、生産の困難さ、体内での限られた半減期および中和抗体産生)を呈する(Kreitman RJ.Immunotoxins for Targeted Cancer Therapy.AAPS J 2006;8:E532−51;Li Z,Yu T,Zhao P,Ma J.Immunotoxins and Cancer Therapy.Cell Mol Immunol 2005;2:106−12;Posey JA,Khazaeli MB,Bookman MA,et al.A phase I trial of the single−chain immunotoxin SGN−10(BR96 sFv−PE40) in patients with advanced solid tumors.Clin Cancer Res 2002;8:3092−9)。しかし、ペプチドは化学的に合成され得るので、ペプチドの生産は、タンパク質薬物と比べ手ごろな費用で行われ得る。さらに、ターゲティングのための候補ペプチドと毒素部分との種々の組み合わせは、一般的に前臨床の環境で容易に試験され得る。例えば、ミトコンドリア毒素(Ellerby HM,Arap W,Ellerby LM,et al.Anti−cancer activity of targeted pro−apoptotic peptides.Nat Med 1999;5:1032−8)または抗生物質様誘導体ペプチド(Kim S,Kim SS,Bang YJ,Kim SJ,Lee BJ.In vitro activities of native and designed peptide antibiotics against drug sensitive and resistant tumor cell lines.Peptides 2003;24:945−53)のような、腫瘍殺傷活性を有する毒素部分が利用され得る。ターゲティング部分として、インターロイキン−11(Zurita AJ,Troncoso P,Cardo−Vila M,Logothetis CJ,Pasqualini R,Arap W.Combinatorial screenings in patients:the Interleukin−11 receptor α as a candidate target in the progression of human prostate cancer.Caccer Res 2004;64:435−9)および前立腺特異的膜抗原(PSMA;Rege K,Patel SJ,Megeed Z,Yarmush ML.Amphipathic peptide−based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells.Cancer Res 2007;67:6368−75)が、EGFRに加えて標的となり得る。しかし、爆薬ペプチドは、植物毒素または細菌毒素のようなより強力な殺細胞活性を必要とし、さらにがん細胞をターゲティングするための弾頭ペプチドと共に広範に探索されなければならない。
まとめると、本発明において提供されるがん細胞上の特有のタンパク質を標的とするペプチドトキシンは、抗がん標的療法のための可能性のある新規ツールである。本発明者らはこのキメラペプチドであるペプチドトキシンについての概念を、次世代イムノトキシンという概念として提唱する。ペプチドトキシンの研究および開発は、将来的には個々のプロファイルに応じたがんの個別化治療、つまり患者からの切除腫瘍に対して特異的に標的化された、キメラペプチドによる治療を可能にする。結局のところ、この戦略は、がんだけでなく他の疾患の処置にも有用であり得る。
(実施例2:EGF受容体結合ペプチドの網羅的解析)
本実施例では、EGF受容体結合ペプチドのアナログ(アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここでX1は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸であるものが使用可能であるかどうかを決定するための実験を行う。ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例1に準じる。
本実施例では、EGF受容体結合ペプチドのアナログ(アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここでX1は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸であるものが使用可能であるかどうかを決定するための実験を行う。ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例1に準じる。
(プロトコール)
上記変異体ペプチドのうち、まず電荷を有する2番目のHに着目しKとRの変異体を化学合成し、実施例1に記載されるように、BIACOREにてリコンビナントヒトEGFRとの結合親和性を野生型EGFR結合ペプチドとの比較により評価した。その結果においてより効果が高いもののみがん細胞膜溶解配列とのキメラペプチドを合成し、ヒト肺がん細胞株H322に対する殺細胞効果を野生型EGFR結合キメラペプチドとがん細胞膜溶解単独との比較をした。
上記変異体ペプチドのうち、まず電荷を有する2番目のHに着目しKとRの変異体を化学合成し、実施例1に記載されるように、BIACOREにてリコンビナントヒトEGFRとの結合親和性を野生型EGFR結合ペプチドとの比較により評価した。その結果においてより効果が高いもののみがん細胞膜溶解配列とのキメラペプチドを合成し、ヒト肺がん細胞株H322に対する殺細胞効果を野生型EGFR結合キメラペプチドとがん細胞膜溶解単独との比較をした。
(結果)
結果を図7に示した。野生型(wild−type)ペプチドに比べK置換ペプチドは若干バイオセンサー応答の増強がみられ、R置換体はwild−typeの2倍の応答がみられた(図7A)。H322に対する殺細胞効果は野生型EGFR結合キメラペプチドよりもR置換体キメラペプチドの方が増強された(図7B)。
結果を図7に示した。野生型(wild−type)ペプチドに比べK置換ペプチドは若干バイオセンサー応答の増強がみられ、R置換体はwild−typeの2倍の応答がみられた(図7A)。H322に対する殺細胞効果は野生型EGFR結合キメラペプチドよりもR置換体キメラペプチドの方が増強された(図7B)。
(実施例3:がん細胞膜溶解性配列(L体アミノ酸のみ)とがん細胞標的化配列としてIL−4受容体(IL4R)標的化配列との組み合わせ)
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ;配列番号27)のがん細胞膜溶解性配列とIL4R標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
IL4−LyticL:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号18)。
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ;配列番号27)のがん細胞膜溶解性配列とIL4R標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
IL4−LyticL:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号18)。
(プロトコール)
IL4RおよびIL−4との結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列(KQLIRFLKRLDRN(配列番号26))を設計し化学合成し、BIACORE解析によりヒトリコンビナントIL4Rタンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト乳がん細胞株MDA−MB−231およびヒト膵臓がん細胞株BXPC−3に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
IL4RおよびIL−4との結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列(KQLIRFLKRLDRN(配列番号26))を設計し化学合成し、BIACORE解析によりヒトリコンビナントIL4Rタンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト乳がん細胞株MDA−MB−231およびヒト膵臓がん細胞株BXPC−3に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
(結果)
結果を図8に示した。IL4R結合ペプチド配列(KQLIRFLKRLDRN(配列番号26))はBIACORE解析によりヒトリコンビナントIL4Rタンパク質との結合親和性が認められた(図8A)。IL4R標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド(IL4−LyticL)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(LyticL)よりも殺細胞効果が増強された(図8B)。キメラ化することにより、10分間の接触でがん細胞(BXPC−3)を十分に細胞死へ誘導することが示された(図8C)。
結果を図8に示した。IL4R結合ペプチド配列(KQLIRFLKRLDRN(配列番号26))はBIACORE解析によりヒトリコンビナントIL4Rタンパク質との結合親和性が認められた(図8A)。IL4R標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド(IL4−LyticL)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(LyticL)よりも殺細胞効果が増強された(図8B)。キメラ化することにより、10分間の接触でがん細胞(BXPC−3)を十分に細胞死へ誘導することが示された(図8C)。
(実施例4:がん細胞膜溶解性配列(L体アミノ酸のみ)とがん細胞標的化配列としてIL−13受容体(IL13R)標的化配列との組み合わせ)
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ;配列番号27)のがん細胞膜溶解性配列とIL13R標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
IL13−LyticL:KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号19)。
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ;配列番号27)のがん細胞膜溶解性配列とIL13R標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
IL13−LyticL:KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号19)。
(プロトコール)
IL13RとIL−13との結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列(KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番号28))を設計し化学合成し、BIACORE解析によりヒトリコンビナントIL13Rタンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト脳腫瘍細胞株U251およびヒト頭頚部がん細胞株HN−12に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
IL13RとIL−13との結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列(KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番号28))を設計し化学合成し、BIACORE解析によりヒトリコンビナントIL13Rタンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト脳腫瘍細胞株U251およびヒト頭頚部がん細胞株HN−12に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
(結果)
結果を図9に示した。IL13R結合ペプチド配列(KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番号28))はBIACORE解析によりヒトリコンビナントIL13Rタンパク質との結合親和性が認められた(図9A)。IL13R標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド(IL13−LyticL)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(LyticL)よりも殺細胞効果が増強された(図9B)。キメラ化することにより、10分間の接触でがん細胞(U251)を十分に細胞死へ誘導することが示された(図9C)。
結果を図9に示した。IL13R結合ペプチド配列(KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番号28))はBIACORE解析によりヒトリコンビナントIL13Rタンパク質との結合親和性が認められた(図9A)。IL13R標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド(IL13−LyticL)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(LyticL)よりも殺細胞効果が増強された(図9B)。キメラ化することにより、10分間の接触でがん細胞(U251)を十分に細胞死へ誘導することが示された(図9C)。
(実施例5:がん細胞膜溶解性配列(L体アミノ酸のみ)とがん細胞標的化配列としてニューロピリン−1(NRP1)標的化配列との組み合わせ)
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ;配列番号27)のがん細胞膜溶解性配列とNRP1標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
Sema3A−LyticL:NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号20)
(プロトコール)
NRP1とそのリガンドSema3Aとの結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列(NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29))を設計し化学合成し、BIACORE解析によりヒトリコンビナントNRP1タンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト膵臓がん細胞株SU86.86およびヒト乳がん細胞株SKBR3に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ;配列番号27)のがん細胞膜溶解性配列とNRP1標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
Sema3A−LyticL:NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号20)
(プロトコール)
NRP1とそのリガンドSema3Aとの結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列(NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29))を設計し化学合成し、BIACORE解析によりヒトリコンビナントNRP1タンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト膵臓がん細胞株SU86.86およびヒト乳がん細胞株SKBR3に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
(結果)
結果を図10に示した。NRP1結合ペプチド配列(NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29))はBIACORE解析によりヒトリコンビナントNRP1タンパク質との結合親和性が認められた(図10A)。NRP1標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド(Sema3A−LyticL)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(LyticL)よりも殺細胞効果が増強された(図10B)。
結果を図10に示した。NRP1結合ペプチド配列(NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29))はBIACORE解析によりヒトリコンビナントNRP1タンパク質との結合親和性が認められた(図10A)。NRP1標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド(Sema3A−LyticL)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(LyticL)よりも殺細胞効果が増強された(図10B)。
(実施例6:細胞膜溶解・核酸結合配列とがん細胞標的化配列としてEGFR標的化配列との組み合わせ)
本実施例では細胞膜溶解・核酸結合配列(RLLRRLLRRLLRK(配列番号13)、以下bufと略)とEGFR標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
EGFbuf:YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(配列番号21)。
本実施例では細胞膜溶解・核酸結合配列(RLLRRLLRRLLRK(配列番号13)、以下bufと略)とEGFR標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
EGFbuf:YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(配列番号21)。
(プロトコール)
上記キメラペプチド(EGFbuf)および爆薬部ペプチド単独(buf)を合成しヒト肺がん細胞株H322、ヒト前立腺がん細胞株DU145およびヒト肺正常細胞株MRC5に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
上記キメラペプチド(EGFbuf)および爆薬部ペプチド単独(buf)を合成しヒト肺がん細胞株H322、ヒト前立腺がん細胞株DU145およびヒト肺正常細胞株MRC5に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
(結果)
結果を図11に示した。EGFR標的化キメラペプチド(EGFbuf)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(buf)よりも殺細胞効果が増強された(図11A)。またEGFbufを肺がん細胞株H322と肺正常細胞株MRC5で殺細胞効果を比較したところ、がん細胞に殺細胞感受性が高かった(図11B)。
結果を図11に示した。EGFR標的化キメラペプチド(EGFbuf)は2種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独(buf)よりも殺細胞効果が増強された(図11A)。またEGFbufを肺がん細胞株H322と肺正常細胞株MRC5で殺細胞効果を比較したところ、がん細胞に殺細胞感受性が高かった(図11B)。
(実施例7:がん細胞膜溶解性配列(L体D体混合アミノ酸構成)と3種類のがん細胞高発現受容体結合配列との組み合わせ)
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸;配列番号1)のがん細胞膜溶解性配列と3種類のがん細胞高発現受容体結合配列(her2、VEGF受容体、Transferrin受容体)とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである(下線はD体、他はL体アミノ酸である。)。
HER2−Lytic:YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号15)
VEGFR−Lytic:WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号16)
TfR−Lytic:THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号17)。
本実施例ではKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸;配列番号1)のがん細胞膜溶解性配列と3種類のがん細胞高発現受容体結合配列(her2、VEGF受容体、Transferrin受容体)とを組み合わせたキメラペプチドで実施例1と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである(下線はD体、他はL体アミノ酸である。)。
HER2−Lytic:YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号15)
VEGFR−Lytic:WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号16)
TfR−Lytic:THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号17)。
(プロトコール)
文献検索により上記3つの受容体結合ペプチド配列を見出し、がん細胞膜溶解性配列(KLLLKLLKKLLKLLKKK、下線D体、以下Lyticと略;配列番号1)とのキメラペプチドを設計し化学合成した。上記キメラペプチドを合成しヒト肺がん細胞株H322、ヒト前立腺がん細胞株DU145およびヒト肺正常細胞株MRC5に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
文献検索により上記3つの受容体結合ペプチド配列を見出し、がん細胞膜溶解性配列(KLLLKLLKKLLKLLKKK、下線D体、以下Lyticと略;配列番号1)とのキメラペプチドを設計し化学合成した。上記キメラペプチドを合成しヒト肺がん細胞株H322、ヒト前立腺がん細胞株DU145およびヒト肺正常細胞株MRC5に対するin vitro殺細胞効果を評価した。
(結果)
結果を図12に示した。3種類の抗がん標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチドはいずれも2種類のがん細胞株ともに、Lyticペプチド単独よりも殺細胞効果が増強された(図12A)。またヒト肺正常細胞株MRC5に対するin vitro殺細胞効果は2種類のがん細胞に比べマイルドであった(図12B)。
結果を図12に示した。3種類の抗がん標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチドはいずれも2種類のがん細胞株ともに、Lyticペプチド単独よりも殺細胞効果が増強された(図12A)。またヒト肺正常細胞株MRC5に対するin vitro殺細胞効果は2種類のがん細胞に比べマイルドであった(図12B)。
(実施例8:他のがん細胞高発現受容体ペプチドの試験)
本実施例では、他のがん細胞高発現受容体ペプチドが使用可能かを調べる。
本実施例では、他のがん細胞高発現受容体ペプチドが使用可能かを調べる。
使用するペプチドは以下のとおりである。ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例1に準じる。
(がん細胞増殖系受容体)
繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR):MQLPLAT(配列番号5)またはAAVALLPAVLLALLAP(配列番号6)
(血管新生系受容体)
ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2):ATWLPPR(配列番号36)
血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR/Flt1):VEPNCDIHVMWEWECFERL−NH2(配列番号32)またはGGNECDAIRMWEWECFERL(配列番号33)
エフリン1(EphB1):EWLS(配列番号37)
エフリン2(EphB2):SNEW(配列番号38)
(サイトカイン/ケモカイン系受容体)
インターロイキン11受容体(IL11R):CGRRAGGSC(環状)(配列番号22)
(その他がん細胞高発現受容体)
グルコース調節タンパク質78(GRP78):WDLAWMFRLPVG(配列番号39)またはCTVALPGGYVRVC(環状)(配列番号40)
(がん抗原表面タンパク質)
前立腺特異的膜抗原(prostate−specific membrane antigen;PSMA):CQKHHNYLC(配列番号35)。
(がん細胞増殖系受容体)
繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR):MQLPLAT(配列番号5)またはAAVALLPAVLLALLAP(配列番号6)
(血管新生系受容体)
ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2):ATWLPPR(配列番号36)
血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR/Flt1):VEPNCDIHVMWEWECFERL−NH2(配列番号32)またはGGNECDAIRMWEWECFERL(配列番号33)
エフリン1(EphB1):EWLS(配列番号37)
エフリン2(EphB2):SNEW(配列番号38)
(サイトカイン/ケモカイン系受容体)
インターロイキン11受容体(IL11R):CGRRAGGSC(環状)(配列番号22)
(その他がん細胞高発現受容体)
グルコース調節タンパク質78(GRP78):WDLAWMFRLPVG(配列番号39)またはCTVALPGGYVRVC(環状)(配列番号40)
(がん抗原表面タンパク質)
前立腺特異的膜抗原(prostate−specific membrane antigen;PSMA):CQKHHNYLC(配列番号35)。
(結果)
EGFRを使用した場合と同様、BIACORE解析によりそれぞれの受容体特異的に結合親和性を確認でき、それぞれの結合配列とがん細胞膜溶解性配列とのキメラペプチドはがん細胞膜溶解性ペプチド単独に比べ殺細胞効果が増強されることが期待できる。
EGFRを使用した場合と同様、BIACORE解析によりそれぞれの受容体特異的に結合親和性を確認でき、それぞれの結合配列とがん細胞膜溶解性配列とのキメラペプチドはがん細胞膜溶解性ペプチド単独に比べ殺細胞効果が増強されることが期待できる。
(実施例9:抗がん標的化キメラペプチド(ペプチドトキシン)を用いた治療)
実施例1において製造したキメラペプチドを用いて治療効果を確認した。がん細胞に高発現している受容体等の分子に結合する弾頭部ペプチドと、がん細胞に対して強力な殺細胞効果を示す爆薬部ペプチドを結合させた抗がん標的化キメラペプチド(ペプチドトキシン)を設計し、担がん動物モデルでの抗腫瘍効果を研究したものである。
実施例1において製造したキメラペプチドを用いて治療効果を確認した。がん細胞に高発現している受容体等の分子に結合する弾頭部ペプチドと、がん細胞に対して強力な殺細胞効果を示す爆薬部ペプチドを結合させた抗がん標的化キメラペプチド(ペプチドトキシン)を設計し、担がん動物モデルでの抗腫瘍効果を研究したものである。
(プロトコール)
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μl リン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、50μl リン酸緩衝液/マウスで腫瘍内投与した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出した。
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μl リン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、50μl リン酸緩衝液/マウスで腫瘍内投与した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出した。
(結果)
結果を図13に示す。
結果を図13に示す。
リン酸緩衝液投与群では腫瘍の経時的な増大がみられたが、EB−溶解性キメラペプチド投与群では0.3mg/kgおよび1mg/kg投与群とも腫瘍肥大化が大きく抑制された。0.3mg/kgという投与量としてはかなり少ない量であり、ヒトにおいても十分な抗腫瘍効果が期待される。この結果は、従来技術に比べると、ペプチドはこれまで体内ですぐに分解され効果も弱いと思われていたが、かなり強力に効くことが判明した。ペプチド化学修飾等による安定化、DDS等との組み合わせ等によりさらに体内安定性が増し薬効増強も期待できる。
本実施例の結果を検討すると、実際のヒトに対する抗がん剤であることを実証するデータであることの理論的説明を提示することができる。すなわち、図13に記載のデータを用いれば、ヒトのデータと「同一視」できることが当業者には理解される。これは、移植したがん細胞株はヒト由来であり、多くの臨床で用いられている抗がん剤も同様な研究経過を経ていることから、当該分野において確立した理論であるといえる。したがって、本実施例の結果から、本発明のキメラペプチドは、ヒトに対する「抗がん剤」であると言い切ることがきることが理解される。
(実施例10:EGF−Lyticの静脈内投与による抗腫瘍効果)
前項と同様に、実施例1において製造したキメラペプチドを用いて治療効果を確認した。本実施例では全身投与による抗腫瘍効果を調べた。
前項と同様に、実施例1において製造したキメラペプチドを用いて治療効果を確認した。本実施例では全身投与による抗腫瘍効果を調べた。
(プロトコール)
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μlリン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0,1,5mg/kg、50μlリン酸緩衝液/マウスで静脈内投与した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出した。
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μlリン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0,1,5mg/kg、50μlリン酸緩衝液/マウスで静脈内投与した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出した。
(結果)
結果を図14に示す。
結果を図14に示す。
リン酸緩衝液投与群では腫瘍の経時的な増大がみられたが、EB−溶解性キメラペプチド投与群では1および5mg/kg投与群とも腫瘍肥大化が大きく抑制された。1mg/kgという投与量は全身投与法においては非常に少ない量であり、ヒトにおいても十分な抗腫瘍効果が期待される。この結果は、従来技術に比べると、ペプチドはこれまで体内ですぐに分解され効果も弱く、全身投与は非常に困難であろうと思われていたが、かなり強力に効くことが判明した。ペプチド化学修飾等による安定化、DDS等との組み合わせ等によりさらに体内安定性が増し薬効増強も期待できる。
(実施例11:治療法)
本実施例では、実際の治療への応用を調べる。
本実施例では、実際の治療への応用を調べる。
ここでは、DDS(薬物送達系;Drug Delivery system)を用いた体内動態安定化および徐放化等の検討とともに担がん動物モデルでの抗腫瘍効果を研究する。
(DDS)
EB−溶解性キメラペプチドをアテロコラーゲンと混合させ、局所投与用のゲル化製剤により分解抑制および徐放効果を検討する。また、全身投与用にゲル化せずにペプチド分解抑制効果を示す製剤化を検討する。そのためにin vitroでのペプチドのアテロコラーゲン混合体からの遊離プロファイル解析を行い、最適なアテロコラーゲン含有率を決定する。
EB−溶解性キメラペプチドをアテロコラーゲンと混合させ、局所投与用のゲル化製剤により分解抑制および徐放効果を検討する。また、全身投与用にゲル化せずにペプチド分解抑制効果を示す製剤化を検討する。そのためにin vitroでのペプチドのアテロコラーゲン混合体からの遊離プロファイル解析を行い、最適なアテロコラーゲン含有率を決定する。
(担がん動物モデルでの抗腫瘍効果)
実施例9と同様にヌードマウス担がんモデルに局所投与用のゲル化混合物(EB−溶解性キメラペプチドとアテロコラーゲン)を腫瘍内投与し、抗腫瘍効果を評価する。また全身投与用の混合物を静脈内投与し、同様に抗腫瘍効果を評価する。両投与方法とも用法・用量設定試験を行う。
実施例9と同様にヌードマウス担がんモデルに局所投与用のゲル化混合物(EB−溶解性キメラペプチドとアテロコラーゲン)を腫瘍内投与し、抗腫瘍効果を評価する。また全身投与用の混合物を静脈内投与し、同様に抗腫瘍効果を評価する。両投与方法とも用法・用量設定試験を行う。
このような実験を行うことで、EB−溶解性キメラペプチドとアテロコラーゲンとの混合ゲル化した製剤を腫瘍内投与するとペプチド分解抑制および徐放効果から投与回数を減らしても十分な抗腫瘍効果が期待できる。ゲル化しない全身投与用の混合物を静脈内投与すると、ペプチド単独に比べより高い抗腫瘍効果が期待される。
(実施例12:インビボでの用量設定試験)
実施例1において製造したキメラペプチドを用いて用量設定について検討する。
実施例1において製造したキメラペプチドを用いて用量設定について検討する。
(プロトコール)
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μlリン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、50μl リン酸緩衝液/マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出する。
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μlリン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、50μl リン酸緩衝液/マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出する。
(実施例13:インビボでの用法設定試験)
実施例1において製造したキメラペプチドを用いて用法設定について検討する。
実施例1において製造したキメラペプチドを用いて用法設定について検討する。
(プロトコール)
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μl リン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間、週5回1週間でEB−溶解性キメラペプチドを1mg/kg、50μlリン酸緩衝液/マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出する。
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株BXPC−3、5×106 cells/150μl リン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間、週5回1週間でEB−溶解性キメラペプチドを1mg/kg、50μlリン酸緩衝液/マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出する。
(実施例14:他のがん細胞での試験)
実施例1において製造したキメラペプチドを用いてがん種を変えて抗腫瘍効果を検討した。
実施例1において製造したキメラペプチドを用いてがん種を変えて抗腫瘍効果を検討した。
(プロトコール)
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト乳がん細胞株MDA−MB−231またはヒト前立腺がん細胞株DU145、5×106 cells/150μl リン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0.5mg/kg、50μl リン酸緩衝液/マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出する。
ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌5週齢の皮下にヒト乳がん細胞株MDA−MB−231またはヒト前立腺がん細胞株DU145、5×106 cells/150μl リン酸緩衝液を注入し、移植から5日後より週3回3週間でEB−溶解性キメラペプチドを0.5mg/kg、50μl リン酸緩衝液/マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出する。
(乳がん細胞株MDA−MB−231)
ヒトのがんの異種移植モデルにおいてEB−溶解性キメラペプチドの抗腫瘍効果を評価するために、インビボでの腫瘍異種移植片におけるEB−溶解性キメラペプチドの抗腫瘍活性。乳がん細胞株MDA−MB−231(5×106細胞/150μl リン酸緩衝液)を、ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌7〜9週齢(体重17〜21g)の側腹部領域の皮下に注入した。腫瘍が20〜60mm3の体積に達した時点で、動物を無作為に3群に分け、そして、生理食塩水(コントロール)またはEB−溶解性ペプチド(2mg/kgまたは5mg/kg)を、週3回3週間(合計9回の投薬)で静脈内投与(50μl/注射)した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出した。処置の終了時に、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出し、ヘマトキシリン染色の後に光学顕微鏡を用いて組織学検査を行った。全ての値は、平均±SDとして表し、統計的解析は、一元配置ANOVAおよびDunnet検定により行った。差はP<0.01で有意とみなした。
ヒトのがんの異種移植モデルにおいてEB−溶解性キメラペプチドの抗腫瘍効果を評価するために、インビボでの腫瘍異種移植片におけるEB−溶解性キメラペプチドの抗腫瘍活性。乳がん細胞株MDA−MB−231(5×106細胞/150μl リン酸緩衝液)を、ヌードマウスbalb/c−nu/nu、雌7〜9週齢(体重17〜21g)の側腹部領域の皮下に注入した。腫瘍が20〜60mm3の体積に達した時点で、動物を無作為に3群に分け、そして、生理食塩水(コントロール)またはEB−溶解性ペプチド(2mg/kgまたは5mg/kg)を、週3回3週間(合計9回の投薬)で静脈内投与(50μl/注射)した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×0.5として腫瘍径(mm3)を算出した。処置の終了時に、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出し、ヘマトキシリン染色の後に光学顕微鏡を用いて組織学検査を行った。全ての値は、平均±SDとして表し、統計的解析は、一元配置ANOVAおよびDunnet検定により行った。差はP<0.01で有意とみなした。
コントロール群は、48日目に1885mm3に達する段階的な腫瘍増殖を示した。一方、EB−溶解性ペプチドの投与(2mg/kgまたは5mg/kg、1週間に3回の静脈内投与)は、顕著に腫瘍の増殖を抑制した(図15A、B)。48日目に、平均腫瘍径は、2mg/kg投薬群において933mm3、そして、5mg/kg投薬群において419mm3であった(コントロール群のマウスと比較してP<0.01)。図15Cに示されるように、腫瘍細胞の数は、EB−溶解性ペプチドで処置したマウスにおいて劇的に減少した(図15Cの右パネル)。これらの結果は、新たに設計したEB−溶解性ハイブリッドペプチドが、インビボにおいて、腫瘍の死を首尾よく誘導することを示唆する。
(実施例15:EB(H2R)−Lyticキメラペプチド)
本実施例では、EB(H2R)−Lyticキメラペプチドの活性を調べた。
本実施例では、EB(H2R)−Lyticキメラペプチドの活性を調べた。
野生型のEB−Lytic(YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号2、下線はD体アミノ酸)および変異型のEB(H2R)−Lytic(YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号43、下線はD体アミノ酸)について、BIACOREシステムにより結合親和性の比較を行った。結果を図16Aに示す。また、CDスペクトルを用いて、EB−溶解性ペプチドおよびEB(H2R)−溶解性ペプチドの二次構造解析を行った。結果を図16Bに示す。ペプチド濃度は50μMであった。ペプチド配列が異なること以外は、プロトコールは実施例1に準じる。
(細胞生存性アッセイ)
溶解性ペプチド、野生型EB−溶解性ペプチド、およびEB(H2R)−溶解性ペプチドを用いて、BT20細胞に対する細胞傷害性の比較を行った。1ウェルあたり合計3×103細胞を、96ウェルプレートに播種し、10% FBSを含有する培地中で24時間培養し、100μlにおいて漸増濃度のペプチドと共に、37℃にて48〜72時間インキュベートした。細胞の生存率を、WST−8溶液(Cell Count Reagent SF;ナカライテスク株式会社)を用いて測定した。結果を図16Cに示す。
溶解性ペプチド、野生型EB−溶解性ペプチド、およびEB(H2R)−溶解性ペプチドを用いて、BT20細胞に対する細胞傷害性の比較を行った。1ウェルあたり合計3×103細胞を、96ウェルプレートに播種し、10% FBSを含有する培地中で24時間培養し、100μlにおいて漸増濃度のペプチドと共に、37℃にて48〜72時間インキュベートした。細胞の生存率を、WST−8溶液(Cell Count Reagent SF;ナカライテスク株式会社)を用いて測定した。結果を図16Cに示す。
(EB(H2R)−Lyticは、がん細胞に対する細胞傷害活性を高める)
がん細胞株H322、BT−20、U251、BXPC−3、SU.86.86およびLNcapを、種々の濃度(0〜20μM)のEB−溶解性キメラペプチドまたはEB(H2R)−溶解性キメラペプチドと共に72時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図17Aに示す。また、正常細胞株MRC−5およびHEK293を、種々の濃度(0〜20μM)の上記ペプチドと共に72時間培養し、細胞傷害活性を評価し、そして、上記のように細胞傷害性アッセイを行った。結果を図17Bに示す。以上の結果から、新たに設計した溶解性ペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることが示された。
がん細胞株H322、BT−20、U251、BXPC−3、SU.86.86およびLNcapを、種々の濃度(0〜20μM)のEB−溶解性キメラペプチドまたはEB(H2R)−溶解性キメラペプチドと共に72時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図17Aに示す。また、正常細胞株MRC−5およびHEK293を、種々の濃度(0〜20μM)の上記ペプチドと共に72時間培養し、細胞傷害活性を評価し、そして、上記のように細胞傷害性アッセイを行った。結果を図17Bに示す。以上の結果から、新たに設計した溶解性ペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることが示された。
(EB(H2R)−Lyticは、がん細胞のアポトーシスおよび迅速な殺傷を誘導する)
H322細胞を、EB−溶解性キメラペプチド(白い棒)またはEB(H2R)−溶解性キメラペプチド(黒い棒)で、2分間、5分間、10分間、30分間、1時間、2時間または24時間処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに24時間細胞を培養した。WST−8を用いて、細胞生存率を解析した。結果を図18に示す。以上の結果から、EB−溶解性キメラペプチドが、原形質膜に透過して、がん細胞のアポトーシスおよび迅速な殺傷を誘導することが示された。
H322細胞を、EB−溶解性キメラペプチド(白い棒)またはEB(H2R)−溶解性キメラペプチド(黒い棒)で、2分間、5分間、10分間、30分間、1時間、2時間または24時間処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに24時間細胞を培養した。WST−8を用いて、細胞生存率を解析した。結果を図18に示す。以上の結果から、EB−溶解性キメラペプチドが、原形質膜に透過して、がん細胞のアポトーシスおよび迅速な殺傷を誘導することが示された。
結果を表2にまとめる。
(実施例16:TfR−Lyticキメラペプチド)
本実施例では、TfR−Lyticキメラペプチドの活性を調べた。
本実施例では、TfR−Lyticキメラペプチドの活性を調べた。
(TfR−Lyticは、がん細胞に対する細胞傷害活性を高める)
TfR−Lyticキメラペプチド(THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号17、下線はD体アミノ酸)を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
TfR−Lyticキメラペプチド(THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号17、下線はD体アミノ酸)を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
1ウェルあたり合計3×103細胞のがん細胞株T47D、MDA−MB−231およびSKBR−3を、種々の濃度(0〜30μM)のTfR−溶解性キメラペプチドまたは溶解性ペプチドと共に72時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図19Aに示す。また、正常細胞株MRC−5、PEおよびHCを、種々の濃度(0〜100μM)の上記ペプチドと共に72時間培養し、そして、細胞傷害活性を評価した。未処理の細胞から得た絶対値を100%とした。結果を図19Bに示す。さらに、TfR−溶解性キメラペプチドを加えることによる細胞傷害性の増強について、TfR−溶解性キメラペプチドのIC50および溶解性ペプチドのIC50、または溶解性ペプチド/TfR−溶解性キメラペプチドのIC50比を検討した。IC50値間に相関性が認められた。これらの結果から、TfR−溶解性ペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることが示された。結果を表3にまとめる。
(TfR−Lyticは、がん細胞のアポトーシスおよび迅速な殺傷を誘導する)
TfR−溶解性ペプチドが、原形質膜に透過して、T47Dがん細胞を迅速に殺傷することを示す。T47D細胞を、TfR−溶解性キメラペプチド(黒い棒)または溶解性ペプチド(白い棒)で、種々の時間(1〜180分)にわたり処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、そして、さらに72時間細胞を培養し、WST−8を用いて細胞生存率を解析した。結果を図21Aに示す。
TfR−溶解性ペプチドが、原形質膜に透過して、T47Dがん細胞を迅速に殺傷することを示す。T47D細胞を、TfR−溶解性キメラペプチド(黒い棒)または溶解性ペプチド(白い棒)で、種々の時間(1〜180分)にわたり処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、そして、さらに72時間細胞を培養し、WST−8を用いて細胞生存率を解析した。結果を図21Aに示す。
また、10μMの濃度でTfR−溶解性キメラペプチドを加えてから、0分後、5分後、10分後および15分後の、カルセイン溶液中の細胞を観察した。T47D乳がん細胞において膜を透過したTfR−溶解性キメラペプチドが認められた(図21B)。
さらに、ペプチド(5μM)処理前に、T47D細胞を、増大する濃度の抗TfRモノクローナル抗体または非特異的なマウスIgG1(アイソタイプコントロール)と共に3時間インキュベートしたところ、TfR−溶解性キメラペプチドの細胞生存性の阻害が示された(図22A)。
(がん細胞株に対するsiRNAまたはスクランブルの配列(sc)RNAの細胞傷害性)
T47D細胞およびMDA−MB−231細胞を、siRNAまたはscRNAでトランスフェクトし、トランスフェクションから4日後に、フローサイトメトリー解析により細胞における標的遺伝子のレベルを解析した(データ示さず)。WST−8試薬を用いて阻害率を評価した。結果は、三連の測定の平均±SD(バー)として表し、そして、アッセイは3回繰り返した(有意差は、それぞれのscRNAトランスフェクションと比較した、**[P<0.05])。結果を図22Bに示す。
T47D細胞およびMDA−MB−231細胞を、siRNAまたはscRNAでトランスフェクトし、トランスフェクションから4日後に、フローサイトメトリー解析により細胞における標的遺伝子のレベルを解析した(データ示さず)。WST−8試薬を用いて阻害率を評価した。結果は、三連の測定の平均±SD(バー)として表し、そして、アッセイは3回繰り返した(有意差は、それぞれのscRNAトランスフェクションと比較した、**[P<0.05])。結果を図22Bに示す。
(TfR−溶解性キメラペプチドは、がん細胞においてアポトーシスを誘導する)
T47D細胞およびPE細胞を、TfR−溶解性キメラペプチド(10μM)および溶解性ペプチド(10μM)と共にインキュベートし、2時間後に、緑色チャネルにおいて、カスパーゼ3&7活性について、そして、赤色チャネルにおいては、ヨウ化プロピジウム染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図23Aに示す。全細胞における二重ポジティブの集団についての、細胞集団におけるアポトーシス(%)の値が示される。また、T47D細胞およびPE細胞を、TfR−溶解性キメラペプチド(10μM)および溶解性ペプチド(10μM)と共にインキュベートし、2時間後に、緑色チャネルにおいて、カスパーゼ3&7活性について、そして、赤色チャネルにおいては、ヨウ化プロピジウム染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図23Bに示す。全細胞における二重ポジティブの集団についての、細胞集団におけるアポトーシス(%)の値が示される。
T47D細胞およびPE細胞を、TfR−溶解性キメラペプチド(10μM)および溶解性ペプチド(10μM)と共にインキュベートし、2時間後に、緑色チャネルにおいて、カスパーゼ3&7活性について、そして、赤色チャネルにおいては、ヨウ化プロピジウム染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図23Aに示す。全細胞における二重ポジティブの集団についての、細胞集団におけるアポトーシス(%)の値が示される。また、T47D細胞およびPE細胞を、TfR−溶解性キメラペプチド(10μM)および溶解性ペプチド(10μM)と共にインキュベートし、2時間後に、緑色チャネルにおいて、カスパーゼ3&7活性について、そして、赤色チャネルにおいては、ヨウ化プロピジウム染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図23Bに示す。全細胞における二重ポジティブの集団についての、細胞集団におけるアポトーシス(%)の値が示される。
(がん細胞株におけるアポトーシスの誘導に対する、種々の溶解性ペプチドの作用の比較)
ミトコンドリア膜貫通型電位依存性蛍光色素JC−1で標識したT47D細胞を、未処理のまま(処理なし:上左パネル)か、Staurosporine(コントロールミトコンドリア膜電位:上右パネル)もしくは、溶解性ペプチド(下左パネル)、もしくはTfR−溶解性キメラペプチド(下右パネル)で処理し、その2時間後に、フローサイトメトリーにより、膜貫通電位を示す赤色蛍光または緑色蛍光の変化における差示的な割合を解析した。結果を図23Cに示す。
ミトコンドリア膜貫通型電位依存性蛍光色素JC−1で標識したT47D細胞を、未処理のまま(処理なし:上左パネル)か、Staurosporine(コントロールミトコンドリア膜電位:上右パネル)もしくは、溶解性ペプチド(下左パネル)、もしくはTfR−溶解性キメラペプチド(下右パネル)で処理し、その2時間後に、フローサイトメトリーにより、膜貫通電位を示す赤色蛍光または緑色蛍光の変化における差示的な割合を解析した。結果を図23Cに示す。
また、T47D細胞を、Staurosporine、TfR−溶解性キメラペプチド(10μM)および溶解性ペプチド(10μM)と共にインキュベートし、2時間後に細胞質抽出物を単離し、そして、チトクロムcに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析により、チトクロムcの放出を調べた。ウェスタンブロット解析の結果を図23Dに示す。
(インビボでのTfR−溶解性キメラペプチドの抗腫瘍活性)
MDA−MB−231乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、5日目から、生理食塩水(コントロール)またはTfR−溶解性ペプチド(0.3mg/kg、1mg/kgまたは3mg/kg)のいずれかを腫瘍内注射した。各群は3匹の動物(n=3)から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図24Aに示す。
MDA−MB−231乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、5日目から、生理食塩水(コントロール)またはTfR−溶解性ペプチド(0.3mg/kg、1mg/kgまたは3mg/kg)のいずれかを腫瘍内注射した。各群は3匹の動物(n=3)から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図24Aに示す。
また、同様にしてMDA−MB−231乳がん細胞を皮下移植した無胸腺ヌードマウスに、矢印で示すように、5日目から、生理食塩水(コントロール)またはTfR−溶解性ペプチド(0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kgまたは5mg/kg)のいずれかを静脈内注射した。各群は3匹の動物(n=3)から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図24Bに示す。
インビボでのTfR−溶解性キメラペプチドの抗腫瘍活性が認められた。
(実施例17:IL4−Lyticキメラペプチド)
本実施例では、IL4−Lyticキメラペプチドの活性を調べた。
本実施例では、IL4−Lyticキメラペプチドの活性を調べた。
(IL4−Lytic(L,D)はがん細胞に選択的な毒性を示す)
L体のみのIL4−LyticL(KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号18)およびDL混合IL4−Lytic(D,L)(KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号44、下線はD体アミノ酸)を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
L体のみのIL4−LyticL(KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号18)およびDL混合IL4−Lytic(D,L)(KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK;配列番号44、下線はD体アミノ酸)を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
1ウェルあたり合計3×103細胞の正常細胞株WI−38(A,B)およびがん細胞株KCCT873(C,D)を、96ウェルプレートに播種し、10% FBSを含有する培地中で24時間培養し、100μlにおいて漸増濃度(0〜30μM)のIL4−溶解性(L)キメラペプチド、溶解性(L)ペプチド、IL−4−溶解性(L,D)キメラペプチド、または、溶解性(L,D)ペプチドと共に、37℃にて72時間インキュベートした。細胞の生存率を、WST−8溶液(Cell Count Reagent SF;ナカライテスク株式会社)を用いて測定した。結果を、図26および表4に示す。
以上の結果から、D,L体の混合配列を用いるほうが、そうでない
L体のみのものに比べて、治療上好ましいものが得られたといえる。そして、がん細胞と正常細胞との選択性も保持されたことが確認された。
L体のみのものに比べて、治療上好ましいものが得られたといえる。そして、がん細胞と正常細胞との選択性も保持されたことが確認された。
(がん細胞株の細胞表面におけるIL−4Rα発現の検出)
A172、BXPC−3および正常細胞株HEK293からの総RNAをcDNAに逆転写し、次いで、IL−4Rα特異的プライマーを用いた定量的PCRにより検出した。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を内部標準として用いた。結果を図27に示す。
A172、BXPC−3および正常細胞株HEK293からの総RNAをcDNAに逆転写し、次いで、IL−4Rα特異的プライマーを用いた定量的PCRにより検出した。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を内部標準として用いた。結果を図27に示す。
(IL4−Lytic(L,D)キメラペプチドは、がん細胞を迅速に殺傷する)
PE細胞(A)、KCCT873細胞、BXPC−3細胞(B)を、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチド(黒い棒)または溶解性(L,D)ペプチド(白い棒)で、2分間、5分間、10分間、30分間、1時間、または2時間処理した。ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに72時間細胞を培養した。WST−8試薬を用いて細胞生存率を決定した。結果を図28に示す。
PE細胞(A)、KCCT873細胞、BXPC−3細胞(B)を、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチド(黒い棒)または溶解性(L,D)ペプチド(白い棒)で、2分間、5分間、10分間、30分間、1時間、または2時間処理した。ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに72時間細胞を培養した。WST−8試薬を用いて細胞生存率を決定した。結果を図28に示す。
(IL4−Lytic(L,D)キメラペプチドは、がん細胞のアポトーシスを誘導する)
正常細胞であるPE細胞、およびがん細胞であるKCCT873細胞を、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドまたは溶解性(L,D)ペプチド(10μM)と共に2時間インキュベートし、次いで、緑色チャネルにおいてアネキシンV標識について、そして、赤色チャネルにおけるPI染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図29Aに示す。各四分区画における細胞の割合を示している。また、図29Bには、未処理の細胞に対する、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドおよび溶解性(L,D)ペプチドの相対的なアポトーシスの値を示す。さらに、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドで処理した細胞のTUNELアッセイを行った。BXPC−3細胞を、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドまたは溶解性(L,D)ペプチド(10μM)と共に30分間インキュベートした。製造業者のプロトコールに従い、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、TUNELアッセイを行った。上および下のパネルは、それぞれ、蛍光(FITC)および位相(DIC)の像を示す。全ての共焦点像は25℃で撮影した。結果を図29Cに示す。
正常細胞であるPE細胞、およびがん細胞であるKCCT873細胞を、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドまたは溶解性(L,D)ペプチド(10μM)と共に2時間インキュベートし、次いで、緑色チャネルにおいてアネキシンV標識について、そして、赤色チャネルにおけるPI染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図29Aに示す。各四分区画における細胞の割合を示している。また、図29Bには、未処理の細胞に対する、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドおよび溶解性(L,D)ペプチドの相対的なアポトーシスの値を示す。さらに、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドで処理した細胞のTUNELアッセイを行った。BXPC−3細胞を、IL4−溶解性(L,D)キメラペプチドまたは溶解性(L,D)ペプチド(10μM)と共に30分間インキュベートした。製造業者のプロトコールに従い、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、TUNELアッセイを行った。上および下のパネルは、それぞれ、蛍光(FITC)および位相(DIC)の像を示す。全ての共焦点像は25℃で撮影した。結果を図29Cに示す。
(インビボでのIR4−Lytic(L,D)キメラペプチドの抗腫瘍活性)
MDA−MB−231乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、5日目から、生理食塩水(コントロール)またはIL4−溶解性(L,D)ペプチド(0.5mg/kgまたは2mg/kg)のいずれかを腫瘍内注射した。各群は3匹の動物(n=3)から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図30Aに示す。
MDA−MB−231乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、5日目から、生理食塩水(コントロール)またはIL4−溶解性(L,D)ペプチド(0.5mg/kgまたは2mg/kg)のいずれかを腫瘍内注射した。各群は3匹の動物(n=3)から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図30Aに示す。
また、同様にしてMDA−MB−231乳がん細胞を皮下移植した無胸腺ヌードマウスに、矢印で示すように、5日目から、生理食塩水(コントロール)またはIL4−溶解性(L,D)ペプチド(2mg/kgまたは5mg/kg)のいずれかを静脈内注射した。各群は3匹の動物(n=3)から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図30Bに示す。
(実施例18:Sema3A−nLyticキメラペプチド)
本実施例では、Sema3A−nLyticキメラペプチドの活性を調べた。
本実施例では、Sema3A−nLyticキメラペプチドの活性を調べた。
(種々の細胞株に対するSema3A−nLyticの細胞傷害活性)
新たに設計したnLyticペプチド(LLKLLKKLLKKLLKL;配列番号45、下線はD体アミノ酸)、Sema3A(aa363−377)−nLyticペプチド(NYQWVPYQGRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL;配列番号46、下線はD体アミノ酸)およびSema3A(aa371−377)−nLyticペプチド(D,L)(GRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL;配列番号47、下線はD体アミノ酸)を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
新たに設計したnLyticペプチド(LLKLLKKLLKKLLKL;配列番号45、下線はD体アミノ酸)、Sema3A(aa363−377)−nLyticペプチド(NYQWVPYQGRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL;配列番号46、下線はD体アミノ酸)およびSema3A(aa371−377)−nLyticペプチド(D,L)(GRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL;配列番号47、下線はD体アミノ酸)を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
1ウェルあたり合計3×103細胞の膵臓細胞株を、96ウェルプレートに播種し、10% FBSを含有する培地中で24時間培養し、100μlにおいて漸増濃度(0〜50μM)のSema3A−nLyticペプチドまたはnLyticペプチドのみと共に、37℃にて48時間インキュベートした。細胞の生存率を、WST−8溶液(Cell Count Reagent SF;ナカライテスク株式会社)を用いて測定した。結果を図31Aおよび表5に示す。
(乳がん細胞株に対するSema3A−nLyticの細胞傷害活性)
乳がん細胞を、種々の濃度(0〜20μM)のSema3A−nLytic(371−377)またはSema3A−nLytic(363−377)と共に48時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図31Bおよび表6に示す。
乳がん細胞を、種々の濃度(0〜20μM)のSema3A−nLytic(371−377)またはSema3A−nLytic(363−377)と共に48時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図31Bおよび表6に示す。
正常細胞では、表5にあるように、IC50が>50程度の数値であることから、表6に示される癌細胞の方が低濃度で効果が出ていることを考慮すると、正常細胞と癌細胞との選択性があると考えられる。
(種々の細胞株に対するSema3A−nLyticの細胞傷害活性)
種々の細胞を、種々の濃度(0〜20μM)のSema3A−nLytic(363−377)またはSema3A−nLytic(371−377)と共に48時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果は、三連の測定の平均±SD(バー)として表し、そして、アッセイは3回繰り返した。結果を図31Cおよび表7に示す。
種々の細胞を、種々の濃度(0〜20μM)のSema3A−nLytic(363−377)またはSema3A−nLytic(371−377)と共に48時間培養し、そして、WST−8試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果は、三連の測定の平均±SD(バー)として表し、そして、アッセイは3回繰り返した。結果を図31Cおよび表7に示す。
また、BIACOREを用いて、Sema3Aの野生型ペプチドおよびいくつかの変異ペプチドの、NP−1との相互作用を解析した。結果を図32に示す。(A)Sema3A野生型ペプチドのNP−1タンパク質への結合。段階希釈した種々の濃度(1.6μM、13μM、26μM)のSema3A野生型ペプチドのサンプルを、パラレルセンサ表面上で解析した。(B)Sema3Aの野生型ペプチドおよび変異ペプチド(R372K;R372K,R377K)のNP−1タンパク質への結合。段階希釈した種々のSema3Aペプチド(26μM)のサンプルを、パラレルセンサ表面上で解析した。(C)種々のSema3AペプチドのNP−1タンパク質への結合能のまとめ。(D)Sema3Aの野生型ペプチドおよび変異ペプチドのペプチド配列。
(膵臓がん細胞株および乳がん細胞株におけるニューロピリン−1の発現)
いくつかの膵臓がん細胞株(BxPC−3、CFPAC−1、Panc−1およびSU8686)および膵臓上皮細胞、ならびに乳がん細胞株(BT−20、MDA−MB−231、SKBR−3、T47DおよびZR−75−1)におけるニューロピリン−1の発現を、RT−PCR解析により見積もった。全てのRT−PCR解析において、β−アクチンをポジティブコントロールとして用いた。結果を図33に示す。
いくつかの膵臓がん細胞株(BxPC−3、CFPAC−1、Panc−1およびSU8686)および膵臓上皮細胞、ならびに乳がん細胞株(BT−20、MDA−MB−231、SKBR−3、T47DおよびZR−75−1)におけるニューロピリン−1の発現を、RT−PCR解析により見積もった。全てのRT−PCR解析において、β−アクチンをポジティブコントロールとして用いた。結果を図33に示す。
(Sema3A−Lyticはがん細胞においてアポトーシスを誘導する)
PE細胞(上パネル)およびBxPC−3細胞(下パネル)を、Sema3A−Lyticペプチド(5μM)と共に37℃で3時間インキュベートし、6時間後に、アネキシンV標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。結果を図34に示す。
PE細胞(上パネル)およびBxPC−3細胞(下パネル)を、Sema3A−Lyticペプチド(5μM)と共に37℃で3時間インキュベートし、6時間後に、アネキシンV標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。結果を図34に示す。
(実施例19:ペプチド安定性試験)
実施例1において製造したキメラペプチドの安定性を検討する。
実施例1において製造したキメラペプチドの安定性を検討する。
(プロトコール)
−20℃、4℃、25℃で、生理食塩中、もしくは血清中にペプチドトキシンを短期あるいは長期保存し、HPLCによる定量解析および培養がん細胞への殺細胞効果等によって、化学的、生物学的活性を評価する。
−20℃、4℃、25℃で、生理食塩中、もしくは血清中にペプチドトキシンを短期あるいは長期保存し、HPLCによる定量解析および培養がん細胞への殺細胞効果等によって、化学的、生物学的活性を評価する。
(実施例20:EGFR高発現がん細胞におけるEGFRとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬/抗がん剤のスクリーニング方法)
本実施例では、EGFR高発現がん細胞におけるEGFRとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬/抗がん剤のスクリーニング方法を実証する。
本実施例では、EGFR高発現がん細胞におけるEGFRとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬/抗がん剤のスクリーニング方法を実証する。
(プロトコール)
EGFR高発現がん細胞(ヒト前立腺がん細胞株DU145等)の細胞膜標品を調製し、以下のようにBIACORE解析を行う。スクリーニングされる被験薬物はビオチン化しておく必要がある。
EGFR高発現がん細胞(ヒト前立腺がん細胞株DU145等)の細胞膜標品を調製し、以下のようにBIACORE解析を行う。スクリーニングされる被験薬物はビオチン化しておく必要がある。
BIACOREバイオセンサーシステム3000(BIACORE Inc,Uppsala,Sweden)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)実験を行う。N−ヒドロキシスクシンイミドおよびN−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド活性化化学により約5000RUのストレプトアビジン(Sigma)をCM5センサーチップの表面に固定し、次いで、ビオチンを結合した2000〜3000RUのペプチド等被験薬物を、このストレプトアビジンを固定したセンサーチップの上に注入する。非特異的な結合のコントロールとして、ストレプトアビジンを固定していないセンサーチップの反応していないカルボキシメチル基を、エタノールアミンでブロックする。分析物として、Mem−PER真核生物膜タンパク質抽出試薬キット(Pierce)を用いて調製した細胞表面タンパク質を、25℃にて20μl/分の流速のフローセルに注入する。アッセイの間に非特異的な結合を防ぐために、HBS緩衝液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005% Tween 20、3mM EDTA[pH7.4])を泳動緩衝液として用いる。これらの実験において用いた全てのタンパク質濃度は、Bradford法(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding.Anal Biochem 1976;72:248−54)により決定する。データの解析は、BIA evaluation ver.3.2ソフトウェア(BIACORE)を用いて行う。
(結果)
被験薬物を固定化したセンサーチップへEGFR高発現がん細胞の膜標品を反応させる。
被験薬物を固定化したセンサーチップへEGFR高発現がん細胞の膜標品を反応させる。
EGFR及びがん細胞膜の両方へ結合する被験薬物の場合にはより高い応答を示し、被験薬物をスクリーニングできる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明により、副作用が軽減された抗がん剤が提供される。
配列番号1:がん細胞膜溶解性ペプチドのアミノ酸配列である。
KLLLKLLKKLLKLLKKK(下線は、D体を示す)
配列番号2:EB(EGFR結合)−がん細胞膜溶解性キメラペプチドのアミノ酸配列である。
YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
(下線は、D体を示す)
配列番号3:組換えヒトEGFレセプター(rhEGFR)のアミノ酸配列である。NP_005219(1210AAのうちのN末側24AA下線部を除いた部分の残り1186AA)
配列番号4:ミトコンドリア毒性ペプチドおよびアポトーシス促進性ペプチドに含まれるポリカチオン性のアミノ酸配列である。
KLAKLAKKLAKLAK
配列番号5:繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の受容体結合ペプチドのアミノ酸配列:MQLPLAT
配列番号6:繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の受容体結合ペプチドのアミノ酸配列:AAVALLPAVLLALLAP
配列番号7:EGF受容体結合ペプチドであるアミノ酸配列YHWYGYTPQNVI
配列番号8:EGF受容体結合ペプチドであるアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12
配列番号9:YRWYGYTPQNVI
配列番号10:YKWYGYTPQNVI
配列番号11:FLKLLKKLAAKLF
配列番号12:RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR
配列番号13:RLLRRLLRRLLRK
配列番号14:EGF−Lytic(2R):YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号15:HER2−Lytic:YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号16:VEGFR−Lytic:WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号17:TfR−Lytic:THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号18:IL4−LyticL:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号19:IL13−LyticL:KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号20:Sema3A−LyticL<ヒトニューロピリン−1への結合>:NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号21:EGFbuf:YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK
配列番号22:インターロイキン11受容体(IL11R)の結合ペプチドのアミノ酸配列:CGRRAGGSC(環状)
配列番号23:細胞透過性ペプチドTAT配列:YGRKKRRQRRR
配列番号24:細胞透過性ペプチドR11配列:RRRRRRRRRRR
配列番号25:細胞障害性ペプチド:RQIKIQFQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK
配列番号26:IL4R結合ペプチド配列:KQLIRFLKRLDRN
配列番号27:KLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ)
配列番号28:IL13R結合ペプチド配列:KDLLLHLKKLFREGQFN
配列番号29:ニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチドとの結合に必要な配列(リガンドSema3Aとの結合に重要な配列):NYQWVPYQGRVPYPR
配列番号30:ヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチド配列:YCDGFYACYMDV
配列番号31:血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドのアミノ酸配列:WHSDMEWWYLLG
配列番号32:血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドのアミノ酸配列:VEPNCDIHVMWEWECFERL
配列番号33:血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドのアミノ酸配列:GGNECDAIRMWEWECFERL
配列番号34:トランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチドのアミノ酸配列:THRPPMWSPVWP
配列番号35:前立腺特異的膜抗原(PSMA)の結合ペプチドのアミノ酸配列:CQKHHNYLC
配列番号36:ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)の結合ペプチドのアミノ酸配列:ATWLPPR
配列番号37:エフリンB1(EphB1)の結合ペプチドのアミノ酸配列:EWLS
配列番号38:エフリン2(EphB2)の結合ペプチドのアミノ酸配列:SNEW
配列番号39:グルコース調節タンパク質78(GRP78)の結合ペプチドのアミノ酸配列:WDLAWMFRLPVG
配列番号40:グルコース調節タンパク質78(GRP78)の結合ペプチドのアミノ酸配列:CTVALPGGYVRVC(環状)
配列番号41:オリジナルLyticペプチド:KLLKKLLKKLLKLL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号42:EB−オリジナルLytic:YHWYGYTPQNVIGGGL KLLKKLLKKLLKLL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号43:EB(2R)−Lytic:YRWYGYTPQNVIGGG KLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号44:IL4−Lytic(D,L):KQLIRFLKRLDRNGGG KLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号45:nLytic:LLKLLKKLLKKLLKL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号46:Sema3A(aa363−377)−nLytic:NYQWVPYQGRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号47:Sema3A(aa371−377)−nLytic:GRVPYPRGG LLKLLKKLLKKLLKL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号48:KLLLKLLKKLLKLLKKK、ここで各アミノ酸は、独立してL体、D体もしくはDL混合である。
KLLLKLLKKLLKLLKKK(下線は、D体を示す)
配列番号2:EB(EGFR結合)−がん細胞膜溶解性キメラペプチドのアミノ酸配列である。
YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
(下線は、D体を示す)
配列番号3:組換えヒトEGFレセプター(rhEGFR)のアミノ酸配列である。NP_005219(1210AAのうちのN末側24AA下線部を除いた部分の残り1186AA)
配列番号4:ミトコンドリア毒性ペプチドおよびアポトーシス促進性ペプチドに含まれるポリカチオン性のアミノ酸配列である。
KLAKLAKKLAKLAK
配列番号5:繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の受容体結合ペプチドのアミノ酸配列:MQLPLAT
配列番号6:繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の受容体結合ペプチドのアミノ酸配列:AAVALLPAVLLALLAP
配列番号7:EGF受容体結合ペプチドであるアミノ酸配列YHWYGYTPQNVI
配列番号8:EGF受容体結合ペプチドであるアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12
配列番号9:YRWYGYTPQNVI
配列番号10:YKWYGYTPQNVI
配列番号11:FLKLLKKLAAKLF
配列番号12:RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR
配列番号13:RLLRRLLRRLLRK
配列番号14:EGF−Lytic(2R):YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号15:HER2−Lytic:YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号16:VEGFR−Lytic:WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号17:TfR−Lytic:THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号18:IL4−LyticL:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号19:IL13−LyticL:KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号20:Sema3A−LyticL<ヒトニューロピリン−1への結合>:NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
配列番号21:EGFbuf:YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK
配列番号22:インターロイキン11受容体(IL11R)の結合ペプチドのアミノ酸配列:CGRRAGGSC(環状)
配列番号23:細胞透過性ペプチドTAT配列:YGRKKRRQRRR
配列番号24:細胞透過性ペプチドR11配列:RRRRRRRRRRR
配列番号25:細胞障害性ペプチド:RQIKIQFQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK
配列番号26:IL4R結合ペプチド配列:KQLIRFLKRLDRN
配列番号27:KLLLKLLKKLLKLLKKK(すべてL体アミノ酸のみ)
配列番号28:IL13R結合ペプチド配列:KDLLLHLKKLFREGQFN
配列番号29:ニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチドとの結合に必要な配列(リガンドSema3Aとの結合に重要な配列):NYQWVPYQGRVPYPR
配列番号30:ヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチド配列:YCDGFYACYMDV
配列番号31:血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドのアミノ酸配列:WHSDMEWWYLLG
配列番号32:血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドのアミノ酸配列:VEPNCDIHVMWEWECFERL
配列番号33:血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドのアミノ酸配列:GGNECDAIRMWEWECFERL
配列番号34:トランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチドのアミノ酸配列:THRPPMWSPVWP
配列番号35:前立腺特異的膜抗原(PSMA)の結合ペプチドのアミノ酸配列:CQKHHNYLC
配列番号36:ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)の結合ペプチドのアミノ酸配列:ATWLPPR
配列番号37:エフリンB1(EphB1)の結合ペプチドのアミノ酸配列:EWLS
配列番号38:エフリン2(EphB2)の結合ペプチドのアミノ酸配列:SNEW
配列番号39:グルコース調節タンパク質78(GRP78)の結合ペプチドのアミノ酸配列:WDLAWMFRLPVG
配列番号40:グルコース調節タンパク質78(GRP78)の結合ペプチドのアミノ酸配列:CTVALPGGYVRVC(環状)
配列番号41:オリジナルLyticペプチド:KLLKKLLKKLLKLL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号42:EB−オリジナルLytic:YHWYGYTPQNVIGGGL KLLKKLLKKLLKLL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号43:EB(2R)−Lytic:YRWYGYTPQNVIGGG KLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号44:IL4−Lytic(D,L):KQLIRFLKRLDRNGGG KLLLKLLKKLLKLLKKK(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号45:nLytic:LLKLLKKLLKKLLKL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号46:Sema3A(aa363−377)−nLytic:NYQWVPYQGRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号47:Sema3A(aa371−377)−nLytic:GRVPYPRGG LLKLLKKLLKKLLKL(下線はD体、他はL体アミノ酸)
配列番号48:KLLLKLLKKLLKLLKKK、ここで各アミノ酸は、独立してL体、D体もしくはDL混合である。
Claims (55)
- 受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、EGF受容体結合ペプチド、インターロイキン4(IL−4)受容体結合ペプチド、インターロイキン13(IL−13)受容体結合ペプチド、ニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチド、ヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチド、血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドおよびトランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチドからなる群より選択される、請求項1に記載のキメラペプチド。
- EGF受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含む請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、EGF受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列YHWYGYTPQNVI(配列番号7)(ここで、アルファベットは、アミノ酸の1文字表示である。)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、EGF受容体結合ペプチドであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するアミノ酸である、
請求項1に記載のキメラペプチド。 - 前記受容体結合ペプチドは、EGF受容体結合ペプチドであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するOH基を有するアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸である、
請求項1に記載のキメラペプチド。 - 前記受容体結合ペプチドは、EGF受容体結合ペプチドであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(配列番号8)を有するものであって、ここで
X1は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸であり;
X3は、Wまたはそれに類似するY、FもしくはHであるアミノ酸であり;
X4は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X5は、Gまたはそれに類似するA、V、IもしくはLであるアミノ酸であり;
X6は、Yまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X7は、Tまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X8は、Pまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり;
X9は、Qまたはそれに類似するNであるアミノ酸であり;
X10は、Nまたはそれに類似するS、HもしくはFであるアミノ酸であり;
X11は、Vまたはそれに類似するG、A、LもしくはIであるアミノ酸であり;
X12は、Iまたはそれに類似するG、A、VもしくはLであるアミノ酸である、
請求項1に記載のキメラペプチド。 - 前記配列において、X2は、Hまたはそれに類似するRもしくはKであるアミノ酸である、請求項5に記載のキメラペプチド。
- 前記EGF受容体結合ペプチドは、YRWYGYTPQNVI(配列番号9)またはYKWYGYTPQNVI(配列番号10)を有する、請求項3に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞殺傷性ペプチドは、細胞膜溶解性ペプチド、細胞膜電位不安定化ペプチド、細胞膜溶解・核酸結合ペプチドおよびミトコンドリア膜崩壊ペプチドからなる群より選択される、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞膜溶解性ペプチドは、KおよびLのみからなる10〜20個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、L体、D体もしくはDL混合である、請求項10に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞膜溶解性ペプチドは、KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号48)であり、該アミノ酸は、L体、D体もしくはDL混合である、請求項11に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞膜電位不安定化ペプチドは、FLKLLKKLAAKLF(配列番号11)である、請求項10に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞膜溶解・核酸結合ペプチドは、RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(配列番号12)またはRLLRRLLRRLLRK(配列番号13)である、請求項10に記載のキメラペプチド。
- 前記ミトコンドリア膜崩壊ペプチドは、KLAKLAKKLAKLAK(配列番号4)である、請求項10に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞殺傷性ペプチドは、プラスチャージを持つアミノ酸と疎水性アミノ酸から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記プラスチャージを持つアミノ酸は、K、RまたはHであり、前記疎水性アミノ酸は、I、L、V、AまたはFである、請求項16に記載のキメラペプチド。
- 前記細胞殺傷性ペプチドは、KLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号1)であり、ここで、各アミノ酸はL体またはD体であり、下線は、D体を示す、請求項16に記載のキメラペプチド。
- スペーサーペプチドをさらに有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記スペーサーペプチドはグリシンまたはプロリンまたはその混合0〜5個連なった配列である、請求項19に記載のキメラペプチド。
- 前記スペーサーペプチドはGGGである、請求項19に記載のキメラペプチド。
- YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)の配列を有するものであり、下線は、D体を示す、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、インターロイキン4(IL−4)受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列KQLIRFLKRLDRN(配列番号26)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、インターロイキン13(IL−13)受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列KDLLLHLKKLFREGQFN(配列番28)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、ニューロピリン(neuropilin)受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列NYQWVPYQGRVPYPR(配列番号29)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、ヒト上皮増殖因子受容体2型(HER2)結合ペプチドであり、アミノ酸配列YCDGFYACYMDV(配列番号30)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、血管上皮増殖因子受容体(VEGFR)結合ペプチドであり、アミノ酸配列WHSDMEWWYLLG(配列番号31)、VEPNCDIHVMWEWECFERL−NH2(配列番号32)もしくはGGNECDAIRMWEWECFERL(配列番号33)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体(Transferrin Receptor,TfR)結合ペプチドであり、アミノ酸配列THRPPMWSPVWP(配列番号34)またはその改変配列を有するものである、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 前記受容体結合ペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)であり、MQLPLAT(配列番号5)またはAAVALLPAVLLALLAP(配列番号6)であるか;ニューロピリン1(NRP1)/血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)であり、ATWLPPR(配列番号36)であるか;エフリンB1(EphB1)であり、EWLS(配列番号37)であるか;エフリン2(EphB2)であり、SNEW(配列番号38)であるか;インターロイキン11受容体(IL11R)であり、CGRRAGGSC(環状)(配列番号22)であるか;グルコース調節タンパク質78(GRP78)であり、WDLAWMFRLPVG(配列番号39)またはCTVALPGGYVRVC(環状)(配列番号40)であるか;前立腺特異的膜抗原(PSMA)であり、CQKHHNYLC(配列番号35)であるか、あるいは、これらの改変配列である、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号2、14、21、42、43または21からなる群より選択される配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号15に示す配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号16に示す配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号17に示す配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号18または44に示す配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号19に示す配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 配列番号20、46または47に示す配列またはその改変配列を有する、請求項1に記載のキメラペプチド。
- 請求項1〜36のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸。
- 請求項1〜36のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸を含むベクター。
- 請求項1〜36のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸を含む細胞。
- 請求項1〜36に記載のキメラペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項1〜36に記載のキメラペプチドを含む抗がん剤。
- 請求項1〜36に記載のキメラペプチドの、医薬組成物の製造のための使用。
- 請求項1〜36に記載のキメラペプチドの、抗がん剤の製造のための使用。
- 請求項1〜36に記載のキメラペプチドを投与する工程を包含する治療方法。
- 請求項1〜36に記載のキメラペプチドを投与する工程を包含するがんの治療方法。
- EGF受容体結合ペプチドがターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬のスクリーニング方法。
- EGF受容体結合ペプチドがターゲットとするアミノ酸配列を用いる、抗がん剤のスクリーニング方法。
- 標的結合ペプチドと細胞殺傷性の溶解性ペプチド成分とを含む標的化キメラペプチドであるペプチドトキシン。
- 前記標的結合ペプチドは、がん細胞高発現受容体特異的結合配列を有し、前記溶解性ペプチド成分は、がん細胞膜溶解型配列を有し、スペーサーを有する、請求項48に記載のペプチドトキシン。
- 前記溶解性ペプチド成分は、プラスチャージを持つアミノ酸と疎水性アミノ酸から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる10から30アミノ酸からなる配列を有する、請求項49に記載のペプチドトキシン。
- 前記プラスチャージを持つアミノ酸は、K、RまたはHであり、前記疎水性アミノ酸を持つアミノ酸は、I、L、V、AまたはFである、請求項50に記載のペプチドトキシン。
- 前記スペーサーは、グリシンまたはプロリンまたはその混合0〜5個連なった配列である、請求項49に記載のペプチドトキシン。
- EGFR高発現がん細胞におけるEGFRおよび該EGFR高発現がん細胞のがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いることを特徴とする、医薬のスクリーニング方法。
- 前記医薬は抗がん剤である、請求項53に記載のスクリーニング方法。
- 前記アミノ酸配列は、YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(配列番号2)である、請求項53に記載のスクリーニング方法。
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