CN109790225B - 用于靶向dsRNA的嵌合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文描述了重组嵌合蛋白，其包含双链RNA(dsRNA)结合结构域和癌细胞靶向结构域，用于将dsRNA靶向癌细胞。本文还提供了所述嵌合蛋白的使用方法。

Description

用于靶向dsRNA的嵌合蛋白
相关申请的交叉引用
要求在2016年9月4日提交的美国临时专利申请号62/383,466的权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本文提供了重组嵌合蛋白，其包含双链RNA(dsRNA)结合结构域和癌细胞靶向结构域，用于将dsRNA靶向癌细胞。本文还提供了所述嵌合蛋白的使用方法。
背景技术
***癌是全球第二大常见癌症，占美国男性每年诊断的新癌症情况的25％以上(1)。在转移性***癌的情况下，患者大多数用雄激素剥夺疗法(ADT)治疗。
虽然该疗法通常实现短期缓解，但患者通常会发展去势抵抗性***癌(CRPC)。对CRPC患者的新疗法有很大需求，因为这些患者很少对现有疗法有反应并且显示中位生存期为约3年(1-3)。
现今大多数靶向癌症疗法延迟但很少阻止肿瘤进展。由于肿瘤细胞在基因组学上不稳定，它们最终会获得突变和基因改变，使它们能够逃避治疗并产生抗药性。由靶向药剂引发的杀伤速率太慢，使肿瘤有足够的时间适应治疗在它们身上施加的恒定压力。另外，肿瘤是异质的并且具有许多不同的亚群。靶向治疗通常仅靶向这些亚群中的一些而不靶向其它亚群，因此不能期望根除整个肿瘤。
转移性CRPC通常呈现可用于靶向治疗的独特细胞表面分子：***特异性膜抗原(PSMA)。在所有Gleason评分中PSMA过度表达高达1000倍水平(4)，而过度表达随着肿瘤进展而增加(5、6)。尽管该疾病具有异质性，但完全PSMA阴性的原发性肿瘤或转移是罕见的(7)。虽然上述发现支持PSMA是一种非常有前途的治疗靶标的观点，但目前没有PSMA靶向疗法被批准用于临床。然而，很少有药物处于临床试验阶段(8-11)。
因此，持续存在对CPRC的靶向治疗的需要。
发明内容
本文描述了将dsRNA靶向癌细胞的改进方法，即产生可将dsRNA递送至PSMA过表达细胞的嵌合蛋白分子。
本公开提供了一种嵌合重组蛋白及其编码核酸，其包含双链RNA(dsRNA)结合结构域；和结合***表面膜抗原(PSMA)的靶向结合部分。
另外描述的是包含所述嵌合重组蛋白和dsRNA的复合物。还描述了所述复合物在治疗***癌或抑制肿瘤新血管形成中的用途，以及治疗***癌或抑制肿瘤新血管***的相应方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述复合物。
通过参考附图进行以下详细描述，前述和其它目的、特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1A-1D：GFP-SCP结合并选择性内化到PSMA过表达细胞中。图1A：GFP-SCP的示意图。图1B：将LNCaP、PC3和MCF7细胞与25nM GFP-SCP一起温育5小时。固定细胞并用抗GFP抗体(Cy3)和4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，并通过激光扫描共聚焦显微镜观察。图1C：将LNCaP和MCF7细胞与GFP-SCP一起温育，然后进行流式细胞术分析。图1D：上图：在加入200nMGFP-SCP后0至72分钟通过激光共聚焦成像监测LNCaP细胞。在添加GFP-SCP之前立即将磺酰罗丹明B添加到培养基中，以标记细胞外部。下图显示了使用ImageJ测量的细胞内的GFP荧光。
图2A-2C：dsRB-SCP的设计，表达和纯化。图2A：dsRB-SCP的示意图。图2B：dsRB-SCP的表达和纯化：L：清除的裂解物，M：分子量标记物，E1：在IMAC(镍琼脂糖凝胶柱)后的洗脱液，E2：从IEX(离子交换柱)洗脱的纯化的dsRB-SCP。虚线表示凝胶图片被切割和重组的位置。图2C：dsRB-SCP与dsRNA的结合：将dsRB-SCP(0.5-3μg)与500bp长dsRNA一起预温育，并在2％琼脂糖凝胶上电泳。M：100bp DNA分子量标记物。
图3A-3C：dsRB-SCP/polyIC选择性诱导PSMA过表达细胞的凋亡。图3A：将细胞一式三份接种，生长过夜，并按照指示处理100小时。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)定量活力。图3B：存活细胞保持永久停滞。将细胞一式三份接种，生长过夜，并按照指示进行处理。更换培养基并使用CellTiter-Glo在100/172/344小时后定量活力。(对照细胞不能增殖超过2.5倍，因为它们已达到完全融合)。图3C：用单独的dsRB-SCP/polyIC或polyIC处理LNCaP细胞指定的时间，裂解并进行蛋白质印迹分析以检测全长和裂解的半胱天冬酶-3和PARP。
图4A-4D：dsRB-SCP/polyIC导致促炎细胞因子的分泌和PBMC的募集。图4A和4B：按照指示处理LNCaP细胞48小时，之后收集培养基并通过ELISA测定法测量IP-10和RANTES细胞因子。图4C：按照指示处理LNCaP细胞4小时，并通过qRT-PCR测量IFN-β转录。图4D：dsRB-SCP/polyIC诱导PBMC的趋化性。按照指示生长和处理LNCaP细胞。处理48小时后，将细胞培养基转移到Transwell趋化性平板的下室中。将PBMC加入上室中，并将板温育3.5小时。然后，从下室收集培养基，通过FACS定量迁移至下室的淋巴细胞。
图5A-5B：dsRB-SCP/polyIC诱导直接和PBMC介导的旁观者效应。图5A：按照指示处理LNCaP-Luc/GFP细胞。24小时后，将PBMC加入到测试孔(黑色条)中，并将培养基加入对照孔(灰色条)中。使用荧光素酶测定***(Promega)测量LNCaP-Luc/GFP细胞的存活。图5B：PC3-Luc/GFP+LNCaP：按照指示处理LNCaP细胞。24小时后，将PC3-Luc/GFP细胞加入培养物中。6小时后，将PBMC(黑色条)或培养基加入培养物(阴影条)中。PC3-Luc/GFP：按照指示处理LNCaP生长培养基。24小时后，加入PC3-Luc/GFP细胞，6小时后加入PBMC(黑色条)或培养基(阴影条)。使用荧光素酶测定***(Promega)测量PC3-Luc/GFP细胞的存活。T检验表明高显著性(***P≤0.001)。
图6A-6B：dsRB-SCP/polyIC处理与PBMC一起导致LNCaP球状体的破坏。图6A：R＝300-400μm的球状体按如下处理：(a)未处理，(b)400nM dsRB-SCP，(c)2.5μg/ml polyIC，(d)400nM dsRB-SCP+2.5μg/ml polyIC。在第1、2、4和5天处理球状体四次，然后再培养10天。在指定的时间通过激光扫描共聚焦显微镜捕获球状图像；每次处理显示一个代表性的球状体。注意来自处理过的球状体的细胞突出脱落(红色箭头)。在第15天，用Calcein AM(活细胞；绿色)和碘化丙啶(死细胞；红色)标记球状体。使用ImageJ测量的球状体的最大面积显示在图表中(平均值和标准偏差)。图6B：上图：按照指示处理的LNCaP-Luc/GFP球状体。24小时后，将8×104个用CellTracker TM Violet BMQC(Molecular Probes-LifeTechnologies)标记的PBMC加入到球状体中。下图：将没有细胞的PBMC培养基加入到球状体中。在处理开始后0、72、96、168小时，通过激光扫描共聚焦显微镜捕获两个板中的球状体。通过其GFP荧光检测活细胞。PI被添加到下图中的球状体，以突出死细胞。未显示上图的PI染色，因为无法区分死亡的LNCaP-Luc/GFP细胞和死亡的PBMC。
所述序列的简要说明
本文提供的核酸和/或氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示，如37C.F.R.1.822中所定义。仅显示了每个核酸序列的一条链，但互补链应理解为包括在对所展示的链的任何参考中。序列表作为2016年12月12日创建的名称为SeqList_3152_1_2.txt的ASCII文本文件提交，约21KB，其通过引用并入本文。在序列表中：
SEQ ID NO：1是GFP-SCP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是编码GFP-SCP蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO：3是dsRB-SCP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是编码dsRB-SCP蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO：5是Arg9接头肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6和7是用于IFN-β定量的正向和反向寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：8和9是用于GAPDH定量的正向和反向寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：10是SCP-N引物的核酸序列。
SEQ ID NO：11是SCP-C引物的核酸序列。
SEQ ID NO：12是GFP-N引物的核酸序列。
SEQ ID NO：13是GFP-C引物的核酸序列。
SEQ ID NO：14是dsRB-N引物的核酸序列。
SEQ ID NO：15是dsRB-C引物的核酸序列。
SEQ ID NO：16是9ARG1引物的核酸序列。
SEQ ID NO：17是9ARG2引物的核酸序列。
SEQ ID NO：18是PKR dsRNA的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是PKR dsRNA的核酸序列。
SEQ ID NO：20是ScFvJ591的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21是ScFvJ591的核酸序列。
具体实施方式
I、术语
除非另有说明，否则本文使用的技术术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子重量或分子质量值是近似的，并且提供用于描述。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”表示“包括”。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如”同义。
如有冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。此外，所有材料、方法和实施例都是说明性的而不是限制性的。
施用：通过选择的途径将组合物引入受试者。活性化合物或组合物的施用可以通过本领域技术人员已知的任何途径进行。施用可以是局部的或***的。局部施用的实例包括但不限于局部施用，皮下施用，肌肉内施用，鞘内施用。此外，局部施用包括通常用于全身施用的施用途径，例如通过将血管内施用引导至动脉以供应特定器官。因此，在特定的实施方式中，局部施用包括动脉内施用和静脉内施用，此时施用针对供应特定器官的脉管***。局部施用还包括将活性化合物和药剂掺入可植入装置或构建体中，例如血管支架或其它储库，其在延长的时间间隔内释放活性剂和化合物以获得持续的治疗效果。
全身施用包括设计用于通过循环***在全身广泛分布活性化合物或组合物的任何施用途径。因此，全身施用包括但不限于动脉内和静脉内施用。全身施用还包括但不限于局部施用，皮下施用，肌内施用或通过吸入施用，此时施用是针对通过循环***在全身吸收和分布。
抗体：包含至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性识别并结合抗原例如PSMA的表位。抗体由重链和轻链组成，每个都具有可变区，称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。VH区和VL区一起负责结合抗体识别的抗原。如本文所用，“抗体”包括完整的免疫球蛋白及其本领域熟知的变体和部分，例如Fab'片段，F(ab)'2片段，单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。该术语还包括重组形式，例如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)，异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。
嵌合体：核酸序列、氨基酸序列或蛋白质，其包含来自两种或更多种来源的核酸序列、氨基酸序列或蛋白质，例如来自两种或更多种不同物种的氨基酸序列。通常，嵌合序列是基因工程的结果。
表达控制序列：调节与其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列，例如编码本文所述的嵌合重组蛋白的核酸的表达。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和翻译(适当时)时，表达控制序列与核酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可包括合适的启动子，增强子，转录终止子，蛋白质编码基因前的起始密码子(ATG)，内含子的剪接信号，维持该基因的正确阅读框架以允许mRNA的正确翻译，并停止密码子。
多肽的功能片段和变体：包括维持亲本多肽的一种或多种功能的那些片段和变体。已经认识到，编码多肽的基因或cDNA可以显著突变而不会实质上改变一种或多种多肽的功能，包括与野生型或亲本多肽具有60％-99％序列同一性的变体。首先，众所周知遗传密码是简并的，因此不同的密码子编码相同的氨基酸。其次，即使引入氨基酸取代，突变也可以是保守的，并且对蛋白质的基本功能没有实质性影响。第三，可以缺失多肽链的一部分而不损害或消除其所有功能。第四，可以在多肽链中进行***或添加，例如添加表位标签，而不损害或消除其功能。功能片段和变体可以具有不同的长度。例如，一些片段具有至少10、25、50、75、100或200个氨基酸残基。提供功能相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员所熟知的。以下六组是被认为是彼此保守替代的氨基酸的示例：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
接头：一个或多个核苷酸或氨基酸，用作两个分子之间的间隔区，例如两个核酸分子或两个肽之间的间隔区。
模拟物：模拟物是一种模仿另一种分子(如生物活性分子)活性的分子。生物活性分子可包括模拟化合物的生物活性的化学结构。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白质编码区。
药学上可接受的载体：可用于本公开的药学上可接受的载体是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)，描述了适用于本文公开的化合物的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水，生理盐水，平衡盐溶液，葡萄糖水溶液或甘油等作为媒介物。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
序列同一性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，否则称为序列同一性。序列同一性通常根据百分比同一性(或相似性或同源性)来测量；百分比越高，两个序列越相似。
受试者：活的多细胞生物，包括脊椎动物生物，包括人类和非人类哺乳动物两者的类别。
治疗有效量：足以在被治疗的受试者中获得所需效果的化合物的量。在治疗过程中，有效量的化合物可以单剂量或数剂量施用，例如每天施用。然而，有效量将取决于所应用的化合物，所治疗的受试者，痛苦的严重程度和类型，以及化合物的施用方式。
II、几个实施方式的概述
本文描述了嵌合重组蛋白，其包含双链RNA(dsRNA)结合结构域；和结合***表面膜抗原(PSMA)的靶向结合部分。
在特定实施方式中，嵌合重组蛋白还包含dsRNA结合结构域和靶向结合部分之间的间隔肽。
在一些实施方式中，嵌合重组蛋白的dsRNA结合结构域包括至少一种双链RNA结合基序(dsRBM)，例如dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)，TRBP，PACT，Staufen，NFAR1，NFAR2，SPNR，RHA或NREBP的dsRBM。在一个实例中，至少一种dsRBM包括与如SEQ ID NO：18所示的人PKR的氨基酸1-197至少70％相同的多肽序列。
在嵌合重组蛋白的特定实施方式中，靶向结合部分是多肽，抗体，抗体片段或抗体模拟物。
在嵌合重组蛋白的其它特定实施方式中，间隔肽选自包含蛋白酶识别序列的寡肽；带正电荷氨基酸的同型寡肽；及其组合。在一个实例中，间隔肽是精氨酸的同型寡肽。
在所述嵌合重组蛋白的特定实施方式中，双链RNA(dsRNA)结合结构域是如SEQ IDNO：18所示的人PKR的至少一种dsRNA结合结构域或其功能变体，间隔肽是如SEQ ID NO：5所示的ARG9或其功能变体，并且靶向结合部分是如SEQ ID NO：20所示的单链抗-PSMA抗体或其功能变体。
在另一个特定实施方式中，嵌合重组蛋白包括与SEQ ID NO：3所示序列至少70％相同的多肽。
本文另外描述的是包含所述嵌合重组蛋白和dsRNA的复合物，例如包括聚肌苷酸链和聚胞苷酸链(poly IC)的dsDNA。
在特定实施方式中，所述复合物用于治疗***癌或抑制肿瘤新血管***发展，例如用于治疗***癌或抑制肿瘤新血管***的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述复合物，从而治疗癌症或抑制肿瘤新生血管的生长。
在所述方法的一些实施方式中，复合物全身或局部施用。在其它实施方式中，该方法还包括向受试者施用治疗有效量的外周血单核细胞(PBMC)。
本文进一步描述了编码任何所述嵌合重组蛋白的核酸。
在特定实施方式中，所述核酸序列被优化用于在细菌或植物宿主细胞中表达。
III、用于将dsRNA靶向至PSMA表达细胞的嵌合多肽
本文描述了嵌合重组多肽，其可用于将dsRNA靶向至表达***特异性膜抗原(PSMA)的细胞。所描述的嵌合重组多肽包括至少dsRNA结合结构域和特异性靶向PSMA的结构域(在本文中也称为部分)。在特定实施方式中，所述多肽还包括dsRNA结合结构域和靶向结合结构域之间的接头。还描述了嵌合重组多肽的功能变体。
可以使用本领域普通技术人员可获得的方法在肽序列中容易地鉴定dsRNA结合结构域。任何一种所述重组蛋白的dsRNA结合结构域可包括一个或多个双链RNA结合基序(dsRBM)，例如α-β-β-β-α折叠。
在某些实施方式中，所述一种或多种dsRBM选自dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)，TRBP，PACT，Staufen，NFAR1，NFAR2，SPNR，RHA或NREBP的dsRBM。特别地，dsRNA结合结构域可包含PKR的两个dsRBM，任选地通过柔性接头连接。
在特定实施方式中，dsRNA结合结构域是人dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)或其功能变体的dsRNA结合结构域，包括与如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列共享约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％序列同一性的多肽。
在某些实施方式中，本文所述的任何一种重组蛋白的靶向结合部分包括(i)细胞表面受体的配体；(ii)抗体，例如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单结构域抗体，如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；或(iii)抗体模拟物，例如affibody分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；anticalin；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和monobody，
在某些实施方式中，靶向结合部分是***表面膜抗原(PSMA)配体，例如DUPA或其类似物；抗PSMA抗体，例如抗PSMA scFv或人源化或人抗PSMA抗体(例如全长抗体J591)；或抗PSMA affibody。
在特定实施方式中，PSMA靶向部分是针对PSMA的单链抗体ScFvJ591或其功能变体，包括与如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列共享约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％序列同一性的多肽。
所描述的间隔肽可以是本领域已知的用于连接多肽嵌合体的两个功能结构域的任何寡肽。在某些实施方式中，间隔肽(接头)包括含有蛋白酶识别序列的寡肽；或者带正电荷的氨基酸例如精氨酸的同型寡肽(在生理pH下)。
在特定实施方式中，dsRNA结合结构域和靶向结合部分之间的接头(间隔肽)是ARG9肽或其功能变体，包括与如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列共享约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％序列同一性的多肽。
在特定实施方式中，嵌合重组多肽是具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，包括与SEQ ID NO：4共享约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％序列同一性的肽。
在其它实施方式中，来自所述序列的变体可以是保守取代，本领域技术人员不会期望显著改变多肽的形状或电荷。所描述的多肽还包括与所示多肽具有100％序列同一性但在翻译后修饰与天然或天然产生的序列不同的那些多肽。
在特定实施方式中，所述重组多肽作为不连续的生物分子提供。在其它实施方式中，所述多肽是较大多肽的结构域，例如独立折叠的结构域，或环境可及的功能结构域。
本文另外描述的是包含任何一种所述重组蛋白和dsRNA的复合物。在某些实施方式中，复合物的dsRNA是PKR活化dsRNA，例如包含聚肌苷酸链和聚胞苷酸链(poly IC)的dsRNA。在某些实施方式中，poly IC在每条链中包含至少22个核糖核苷酸，例如每条链中85-300个核糖核苷酸。在某些实施方式中，复合物的dsRNA包含至少一种针对促癌蛋白的siRNA序列，例如但不限于Bcl-xl，Bcl-2，Mcl-1，Stat3，Pkb/Akt。
在特定的实施方式中，所述复合物是药物组合物的组分，其包括如上所述的药学上可接受的载体。
本文还提供了编码所述嵌合重组多肽的核酸，例如SEQ ID NO：4所示的核酸。
应当理解，由于遗传密码的简并性，所述核酸的序列可以与SEQ ID NO 4所示的序列显著不同。并且编码的多肽没有任何变化。还可以包括所述多肽中的其它和/或另外的突变，例如保守氨基酸突变，而没有明显的差异。因此，在一些实施方式中，所述核酸与SEQ IDNO 4具有60％-100％的序列同一性，例如60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％序列同一性。在特定实例中，调节核酸序列以解释特定生物体(例如细菌或植物细胞)中的天然密码子偏倚。这种调整是本领域已知的，并且可以找到(12)
在特定实施方式中，所述核酸序列包含在本领域标准的DNA克隆和/或表达质粒中。应理解，任何标准表达质粒可用于表达一种或多种所述编码嵌合多肽的核酸。此类质粒将最低限度地含有复制起点，选择序列(例如但不限于抗生素抗性基因)，以及与所述核酸可操作地连接的表达控制序列。在特定实施方式中，表达质粒包括与所述核酸框内编码的翻译后序列(例如指导多肽加工和输出的信号序列)。在特定实施方式中，表达控制序列是本领域已知的用于在细菌或植物宿主中优化表达控制的序列。
细菌表达质粒的具体非限制性实例包括IPTG诱导型质粒和***糖诱导型质粒等。表达诱导的其它非限制性实例包括光诱导，温度诱导，营养诱导和自诱导，植物和哺乳动物特异性DNA表达质粒。定制的表达质粒可从供应商例如New England Biolabs(Ipswich，MA)和DNA 2.0(Menlo Park，CA)商购获得。
在特定的实施方式中，所述多肽可以配制成立即释放，由此它们可以立即被周围环境接近，从而在给予受试者时提供有效量的活性剂，并且直到施用的剂量被受试者代谢。
在又一个实施方式中，所述多肽可以配制在持续释放制剂或***中。在这样的制剂中，治疗剂提供延长的持续时间，例如1、2、3、4或更多天，包括1-72小时，24-48小时，16-36小时，12-24小时，以及其间的任何时间长度。在特定的实施方式中，持续释放制剂在施用后立即可用，并提供有效剂量的治疗组合物，并且在延长的时间段内以有效剂量保持可用。在其它实施方式中，持续释放制剂不能立即在受试者体内获得，并且仅在提供治疗有效量的活性化合物且在制剂被代谢或降解以释放活性化合物到周围环境后才可获得。
在一个实施方式中，可以使用泵。在另一个实施方式中，持续释放的制剂包括本领域常用的聚合物材料，例如植入物，凝胶和胶囊等。
治疗制剂含有治疗有效量的至少一种活性成分，优选以纯化形式，与适量的载体一起，以便为患者提供适当的施用。该制剂应适合施用方式。
IV、治疗PSMA相关疾病的方法
PSMA表达与癌细胞相关，特别是***癌和肿瘤相关的新血管***(13)。在又一方面，本公开提供了一种用于治疗特征为表达PSMA的癌症的方法，所述方法通过向有需要的受试者施用本文所述的任何一种复合物或药物组合物。
在一些实施方式中，将所述复合物与其它药剂组合施用于受试者，用于治疗正在治疗的癌症。例如，在癌症治疗的特定实例中，所述的施用可以与手术，细胞疗法，化学疗法和/或放射疗法组合。与所述多肽组合的一种或多种疗法可以按顺序(在之前或之后)或与所述多肽同时施用于受试者。在适用的情况下，在特定的实施方式中，活性成分的组合可以以单一或多种制剂施用于受试者，并且可以通过单次或多次施用途径施用。在特定的实施方式中，治疗方法包括顺序或同时施用外周血单核细胞(PBMC)。
用于所述方法并且将是有效的每种治疗剂的量将取决于待治疗的癌症的性质，以及其疾病或病症的阶段。治疗有效量可通过标准临床技术确定。制剂中使用的精确剂量也取决于施用途径，并应根据保健医师的判断和每位患者的情况来决定。任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且取决于多种因素，包括特定化合物的活性，该化合物的代谢稳定性和作用时长，年龄，体重，一般健康，性别，饮食，施用方式和时间，***率，药物组合和接受治疗的宿主的病情严重程度。
本公开的治疗化合物和组合物可以在整个治疗期间以约相同剂量，以逐步增加的剂量方案或以负荷-剂量方案(例如其中负荷剂量是维持剂量的约2至5倍)施用。在一些实施方式中，基于所治疗的受试者的状况，疾病或病症的严重程度，对治疗的明显反应和/或本领域普通技术人员判断的其它因素，在治疗过程中改变剂量。在一些实施方式中，考虑了用药物的长期治疗。
提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些示例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方式。
实施例
实施例1：方法
GFP-SCP和dsRB-SCP的克隆
质粒pGFP-SCP(编码通过Arg9与单链抗体连接的GFP，ScFvJ591，针对PSMA；56kDa)和psRB-SCP(编码通过Arg9与ScFvJ591连接的人PKR的dsRB；48kDa)(图1A)构建如下：
使用引物SCP-N和SCP-C，通过PCR从质粒SFG-Pz1(14)扩增SCP(针对PSMA的单链抗体，ScFvJ591)。使用引物GFP-N和GFP-C，通过PCR从质粒pEGFP-N3(Clontech)扩增GFP。使用引物dsRB-N和dsRB-C，通过PCR从质粒DRBM-DT-EGF(15)扩增dsRB。为了制备Arg9接头(GSRRRRRRRRGRKA；SEQ ID NO：5)，将寡核苷酸9ARG1与其互补寡核苷酸9ARG2退火。使用的寡核苷酸列于表1中。GFP-SCP在细菌表达载体pET28a(Novagen)中分阶段构建：GFP在质粒pET28a的His6标签后克隆在NdeI和BamHI限制性位点之间，SCP克隆在将HindIII和XhoI位点之间，并且Arg9接头***BamH1和HindIII位点之间，以得到融合物His6-GFP-Arg9-SCP(图1A)。为了构建dsRB-SCP，使用限制性位点NdeI和BamHI用dsRB序列替换GFP片段，以得到融合物His6-dsRB-Arg9-SCP(图2A)。预期的序列在耶路撒冷希伯来大学的基因组技术中心得到确认(补充)。
表1：用于构建pGFP-SCP和psRB-SCP的寡核苷酸。
Figure BDA0001983271010000161
GFP-SCP和dsRB-SCP的表达
嵌合蛋白在已用质粒pRARE转化的大肠杆菌BL21trxB(DE3)(Novagen)中表达，该质粒编码稀有密码子的tRNA。细菌在37℃下在2XYT培养基中培养，该培养基中补充有25μg/ml氯霉素，30μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨苄青霉素，1％葡萄糖和5％NPS缓冲液(1M KH2PO4，1M Na2HPO4，0.5M(NH4)2SO4)。当培养物达到OD600～0.3时，加入0.1％甘油和0.1mM L-谷氨酸，并将培养物移至42℃，以诱导大肠杆菌伴侣蛋白的表达并增强蛋白质的溶解度。当培养物达到O.D600～0.9时，将其在冰上冷却并转移至14℃。调整期10分钟后，加入0.5mmol/LIPTG，然后培养24小时。收获细菌，将沉淀储存在-80℃直至纯化。
GFP-SCP和dsRB-SCP的纯化
GFP-SCP：从1.2L大肠杆菌BL21trxB(DE3，pRARE，pGFP-SCP)获得的沉淀在60ml结合缓冲液(缓冲液A，30mM HEPES pH 8.3，0.5M NaCl，10％甘油，10mM咪唑)中在冰上解冻，该缓冲液中补充有蛋白酶抑制剂混合物，3mg/ml溶菌酶和DNA酶，并使用LV1微流化器(Microfluidics)裂解。通过离心30分钟(15000×g，4℃)将提取物澄清，上样到8ml镍琼脂糖凝胶FF IMAC柱(GE Healthcare)上，并用10倍柱体积(CV)的结合缓冲液，然后6CV的5％缓冲液B(30mM HEPES pH 8.3，0.5M NaCl，10％甘油，1M咪唑)，6CV的10％缓冲液B和1CV的15％缓冲液B洗涤。用60％缓冲液B洗脱蛋白质。将含有嵌合体(总共8ml)的级分上样到用GF缓冲液(30mM HEPES pH 8.3，0.5M NaCl，10％甘油)预平衡的500ml sephacryl S-200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。合并0.5CV后洗脱的级分，使用Vivaspin-20(MWCO：30000，GEHealthcare)浓缩，并上样到350ml superdex-75上。0.5CV后洗脱的级分进行SDS-PAGE并用InstantBlue(Expedeon)染色。合并含有高度纯化的嵌合体的级分，使用Vivaspin-20(GEHealthcare)浓缩，并以等分试样储存在-80℃。
dsRB-SCP：将得自6L大肠杆菌BL21trxB(DE3，pRARE，pdsRB-SCP)的沉淀在300ml结合缓冲液A中解冻，该缓冲液中补充有蛋白酶抑制剂，溶菌酶和DNA酶，如上所述裂解和澄清。为了释放结合的宿主核酸，将澄清的裂解物与8M尿素以1：1(体积：体积)混合。将混合物在4℃下温育1.5小时，然后上样到用缓冲液C(补充有0.5％吐温80和4M尿素的缓冲液A)预平衡的60ml镍琼脂糖凝胶FF柱上，并用12.4CV缓冲液C洗涤。为了重新折叠蛋白质，应用缓慢线性梯度的缓冲液C与缓冲液D(补充有0.5％吐温80的缓冲液A)，10CV，0.8ml/min流速。用3CV的10％和3CV的25％缓冲液E(30mM HEPES pH 8.3，0.5M NaCl，10％甘油，500mM咪唑，0.5％吐温80)洗涤柱子，并用100％缓冲液E洗脱蛋白质。合并含有嵌合体的级分，并用稀释缓冲液(30mM MES pH，10％甘油，0.5％吐温)1：1稀释。通过离心30分钟(15000×g，4℃)澄清稀释的蛋白质，并上样到66ml Fracto-gel EMD SO3IEX柱(Merck)上。应用手动梯度(7CV)的缓冲液F(30mM MES pH，100mM NaCl，10％甘油，0.001％吐温)和25％，27％，30％，37％和38％缓冲液G(30mM HEPES pH 8.3，2M NaCl，10％甘油，0.001％吐温80)。将洗脱的级分样品进行SDS-PAGE并用InstantBlue(Expedeon)染色。如上所述合并含有纯化嵌合体的级分，浓缩，并储存在-80℃。
细胞系
LNCaP细胞在补充有10mM HEPES pH 7.4和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中培养。将VCaP细胞在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中培养。PC3和DU145细胞在补充有1％非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，10mM Hepes pH 7.4和1％MEM维生素混合物的MEM(最低必需培养基)中培养。将MCF7细胞在RPMI 1640培养基中培养。所有组织培养基补充有青霉素(100U/ml)，链霉素(100mg/l)和10％FBS(胎牛血清)。所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，测试并显示不含支原体。
如前所述，使用编码融合基因荧光素酶-GFP(Luc/GFP)的慢病毒载体产生LNCaP-Luc/GFP和PC3-Luc/GFP(16)。通过标准Ficoll密度梯度离心从新鲜人外周血中分离PBMC(17)。将所有细胞在37℃和5％CO2下在潮湿的培养箱中温育。所有细胞培养试剂均购自Biological Industries，Bet Ha'emek和Israel。
流式细胞仪
将细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到12孔板上，生长40小时并与GFP-SCP一起温育。温育后，将细胞用胰蛋白酶消化，在PBS中洗涤，重悬于1ml冷PBS中，并使用配备有488nm激光的BD FACS ARIAIII(BD Biosciences，USA)进行流式细胞术分析。每次处理获得10000个细胞。门控细胞以仅包括活细胞，并分析亚群的GFP水平。使用FlowJo软件(BectonDickinson)分析所有数据。
免疫组化
使LNCaP，PC3和MCF7细胞生长48小时，并与25nM GFP-SCP在37℃下温育5小时。温育后，将细胞用4％多聚甲醛固定，用PBS洗涤两次，透化并用山羊抗GFP抗体(1：1000，Abcamab5450)染色，然后与DyLight 488偶联的抗山羊二抗(1：300，Jackson ImmunoResearchLaboratories)一起温育。使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色DNA。用共聚焦显微镜(FLUOVIEW FV-1000，Olympus，Japan)观察染色样品。
活细胞成像
使用延时共聚焦显微镜(FLUOVIEW FV-1000，Olympus，Japan)在活LNCaP细胞中观察到GFP-SCP定位。LNCaP细胞在8孔μ-载玻片(Ibidi，目录号80826)中生长48小时。更换培养基后，将200nM GFP-SCP直接加入室中，立即观察细胞，每6分钟拍摄一次，共72分钟。使用FLUOVIEW Viewer软件(Ver.4.2)分析图像。
dsRNA电泳迁移率变动分析(EMSA)
使用Label
Figure BDA0001983271010000191
Nuleic Acid Reagents试剂盒(Mirus)标记从
Figure BDA0001983271010000192
RNAi Kit(AM1626)的对照模板转录的500bp长dsRNA。将1μg标记的dsRNA与递增量的纯化dsRB-SCP(0.5-3μg)一起温育30分钟，并将混合物在2％琼脂糖凝胶上电泳。通过用溴化乙锭染色使凝胶可视化。
dsRB-SCP/polyIC复合物的制备
用于所有实验的PolyIC是低分子量(LMW)polyIC(InvivoGen)。对于所有实验，仅在文本中指出的浓度下在结合缓冲液(30mM HEPES pH 8.3，0.5M NaCl，10％甘油)中制备单独的dsRB-SCP/polyIC，polyIC或dsRB-SCP，并在室温下预温育45分钟，然后加入细胞。
生存测定
将LNCaP，VCaP，PC3和MCF7细胞一式三份(5000个细胞/孔)接种在96孔板中并生长过夜。将dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或dsRB-SCP加入细胞中，然后再温育100小时。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)测量存活率。
对于拯救实验，将LNCaP细胞接种(5000个细胞/孔)在预先涂有聚赖氨酸的三个96孔板中。对于每个平板，在一式三份孔中重复处理，并使细胞生长过夜。然后用dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或单独的dsRB-SCP处理细胞。100小时后测定第一板的存活率。100小时后更换第二板中的培养基，并在172小时后测定存活率。100小时后又172小时后更换第三板中的培养基，并在344小时后测定存活率。
免疫印迹
将LNCaP细胞接种在6孔板(1×106个细胞/孔)中，生长过夜并用指定浓度的dsRB-SCP/polyIC或polyIC处理。用沸腾的Laemmli样品缓冲液(10％甘油，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，3％SDS和5％2-巯基乙醇)裂解7、16或24小时细胞后，然后将裂解物进行免疫印迹分析(18)。使用抗PARP(目录号95425)，抗半胱天冬酶3(目录号96625)和抗裂解的半胱天冬酶-3(目录号96615)(均来自Cell Signaling Technology)监测PARP和半胱天冬酶-3的裂解。作为标准化每个泳道中施用的蛋白质量的内部对照，还将印迹与抗GAPDH(Santa Cruz，sc-25778)一起温育。
通过ELISA检测分泌的趋化因子(IP-10和RANTES)
将LNCaP细胞一式三份接种在96孔板中并生长过夜(10000个细胞/孔)。然后用指定浓度的dsRB-SCP/polyIC或polyIC处理细胞。48小时后，收集培养基，用商业ELISA试剂盒(PeproTech)测定IP-10和RANTES的浓度。
RNA分离、cDNA合成和定量实时PCR
将LNCaP细胞接种在24孔板(每孔500000个细胞)中并生长过夜。然后用指定浓度的dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或单独的dsRB-SCP处理细胞4小时。裂解细胞并使用EZ-10DNA Away RNA-Miniprep Kit(Bio Basic)提取总RNA。使用High Capacity cDNAReverse Transcription Kit(Applied Biosystems)合成互补DNA(cDNA)。使用定量实时PCR比较IFN-β基因表达水平，并使用ΔΔCT方法归一化至GAPDH表达。用于IFN-β定量的引物是：正向的：5'ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC 3'(SEQ ID NO：6)和反向的：5'GCTCATGGAAAGAGCTGTAGTG 3'(SEQ ID NO：7)。用于GAPDH定量的引物是正向的：5'GAGCCACATCGCTCAGAC 3'(SEQ ID NO：8)和反向：5'CTTCTCATGGTTCACACCC 3'(SEQ ID NO：9)。
PBMC的趋化性
将LNCaP细胞接种在预先涂有聚赖氨酸(250000个细胞/孔)的24孔板中并生长过夜。然后，用低血清培养基(0.15％FBS)代替培养基，用指定浓度的dsRB-SCP/polyIC处理细胞。48小时后，从细胞中收集条件培养基并置于24孔Transwell***(微孔聚碳酸酯膜(0.5μm)Corning；Costar)的底部孔中。将在低血清培养基(0.15％FBS)中的新鲜分离的PBMC(1×106)加入上室。3.5小时后，收集来自下室的培养基，通过FACS分析定量迁移的细胞，对淋巴细胞进行散射门控。
共培养***中旁观者效应的分析
为了测量与其它细胞共培养的单细胞系的活力，我们生成了表达荧光素酶的细胞(LNCaP-Luc/GFP或PC3-Luc/GFP)。
使用与PBMC共培养的LNCaP-Luc/GFP细胞分析免疫细胞介导的旁观者效应：将LNCaP-Luc/GFP细胞一式三份接种在预先涂有聚赖氨酸的96孔板中(10000个细胞/孔)并且成长过夜。然后用指定浓度的dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或单独的dsRB-SCP处理细胞。24小时后，将新鲜分离的PBMC加入培养物中(每孔1×105个)。48小时后，使用荧光素酶测定***(Promega)，基于荧光素酶活性测量LNCaP-Luc/GFP细胞的存活率。
使用与PC3-Luc/GFP和PBMC共培养的LNCaP细胞分析组合的直接和免疫细胞介导的旁观者效应：将LNCaP细胞一式三份接种在预先涂有聚赖氨酸的96孔板中(6000个细胞/孔)并且生长过夜，并且用dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或单独的dsRB-SCP处理细胞。16小时后，向培养物中加入PC3-Luc/GFP细胞(4000个细胞/孔)。处理后24小时，将新鲜分离的PBMC(1×105/孔)加入培养物中。48小时后，使用荧光素酶测定***(Promega)，基于荧光素酶活性测量PC3-Luc/GFP细胞的存活率。
肿瘤球状体模型
使用琼脂包被的平板产生肿瘤球状体。根据参考文献(19)，用50μl/孔琼脂(1.5％(wt/vol)溶于RPMI)包被96孔板。接种LNCaP或LNCaP-Luc/GFP细胞(每孔2000个细胞)并温育。97小时后，在每个孔中形成R＝300-400μm的单个球形球状体。
为了测量用dsRB-SCP/polyIC处理后的LNCaP球状体，我们将球状体单独转移到预先涂有非常薄的均匀聚乙二醇(120mg/ml溶于95％乙醇)的96孔板(1个球状体/孔)中。为了转移球状体，我们首先将每个球状体与其200μl培养基一起提升到96U孔板(具有U形孔)中。将板在220g下离心10分钟，并用80μl新鲜培养基替换培养基。然后将球状体与其80μl培养基一起转移到polyHEMA涂覆的板上。以指定浓度添加dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或单独的dsRB-SCP。处理持续5天。在第1、2、4和5天，取出每个孔中的一半培养基并用含有适当处理的新鲜培养基替换。在第15天，用钙黄绿素AM(1：1000，Molecular Probes c3099)和0.5μg/ml碘化丙啶染色球状体。使用共聚焦显微镜监测球状体，并使用ImageJ软件测量大小。
为了分析免疫细胞介导的旁观者对肿瘤球状体的影响，我们直接在琼脂平板上用dsRB-SCP/polyIC，单独的polyIC或单独的dsRB-SCP以指定的浓度处理LNCaP-Luc/GFP球状体一次。24小时后，根据制造商的方案，使用1μM CellTrackerTM Violet BMQC(MolecularProbes-Life Technologies)标记新鲜PBMC。将8×104个PBMC加入到球状体培养物中。使用共聚焦显微镜监测共培养物。
实施例2：靶向PSMA的嵌合蛋白的构建和测定
ScFvJ591选择性地靶向PSMA过表达***癌细胞并有效地将其货物递送到细胞中
我们首先测试了单链抗体ScFvJ591是否可以用作归巢配体，作为嵌合蛋白的一部分。我们通过包含内体逃逸序列的接头产生pGFP-Arg9-ScFvJ591，其编码GFP作为与针对PSMA的单链抗体ScFvJ591融合的跟踪标记(图1A)。56kDa重组蛋白GFP-SCP(GFP-Arg9-ScFvJ591)在大肠杆菌中表达，并在3步纯化过程中纯化，其包括亲和纯化和然后两步凝胶过滤(参见方法)。
我们使用共聚焦显微镜测试了GFP-SCP的选择性。我们将嵌合蛋白与过表达PSMA的LNCaP细胞一起温育，并在5小时后分析结合。不表达PSMA的PC3和MCF7细胞用作阴性对照。共聚焦图像显示GFP-SCP与LNCaP细胞结合并被选择性内化，而PC3或MCF7细胞中没有明显结合(图1B)。接下来，我们使用流式细胞仪比较了GFP-SCP对LNCaP和MCF7细胞的摄取。我们在两个时间段(30分钟，60分钟)内使用了两剂GFP-SCP(200nM，400nM)。通过产生的荧光偏移测量GFP-SCP的积累。正如预期的，观察到的荧光水平与GFP-SCP的浓度和潜伏期相关(图1C)。这些结果表明GFP-SCP的时间依赖性和剂量依赖性内化。相反，在缺乏PSMA的MCF7细胞中，未观察到GFP-SCP的积累(图1C)。为了监测GFP-SCP的定位，我们将LNCaP细胞与GFP-SCP温育并使用活细胞共聚焦显微镜观察它们。最初，GFP-SCP荧光被限制在细胞表面，没有观察到自由扩散(图1D)。几分钟后，GFP-SCP通过内吞作用进入细胞，如小细胞内点状结构的出现所示(图1D)。随着时间，这些结构的数量增加。此外，观察到细胞内扩散的粉末荧光增加(图1D)，表明GFP已从内体逃逸并扩散至胞质溶胶。细胞内GFP的积累在结合后的前40分钟内线性增加(图1D)。
设计、表达和纯化嵌合蛋白，其可以将polyIC选择性地携带并内化到PSMA过表达的***癌细胞中
基于GFP-SCP嵌合体的结构，我们设计了一种嵌合蛋白，其可以将polyIC特异性地传递到PSMA过表达细胞中。我们用PKR的dsRNA结合结构域(dsRBD)替换GFP部分(图2A)。嵌合48kDa蛋白质dsRB-SCP(dsRB-9Arg-ScFvJ591)在大肠杆菌中表达。如实施例1中所述，使用解折叠和重折叠步骤(图2B)纯化，并评估纯化蛋白质与dsRNA的结合。将dsRB-SCP与限定长度(500bp)的dsRNA一起温育，并将混合物在琼脂糖凝胶上电泳(图2C)。裸dsRNA对照在凝胶中的预期位置处运行(图2C)。已经与dsRB-SCP一起温育的dsRNA的电泳以剂量依赖性方式延迟(图2C)，证实了嵌合蛋白结合dsRNA。
与polyIC复合的dsRB-SCP通过诱导细胞凋亡选择性地杀死PSMA过表达细胞
我们使用四种细胞系评估了dsRB-SCP/polyIC复合物的杀伤效应：过表达PSMA的LNCaP和VCaP，以及不表达PSMA的MCF7和PC3。dsRB-SCP选择性地将polyIC递送到过表达PSMA的细胞(LNCaP和VCaP)中，杀死高达80％的细胞(图3A)。不表达PSMA(MCF7和PC3)的细胞未被处理杀死(图3A)。其余20％的LNCaP细胞被认为是永久停滞的，因为在洗出嵌合体后250小时(处理后350小时)没有观察到再生长(图3B)。dsRB-SCP/polyIC通过激活凋亡途径诱导细胞死亡，如半胱天冬酶-3和PARP的裂解所示(图3C)。在仅用polyIC处理的细胞中，未检测到半胱天冬酶-3或PARP的裂解(图3C)。
dsRB-SCP/polyIC处理诱导细胞因子分泌和免疫细胞的趋化性
细胞内dsRNA的存在激活了抗增殖和促凋亡细胞因子和趋化因子的产生(20)。为了确定dsRB-SCP/polyIC是否可以触发类似的效应，我们分析了细胞中三种主要细胞因子的产生：IP-10和RANTES，两者都参与免疫细胞的化学吸引，和IFN-β，其在免疫细胞的分化中起着关键作用(21)。如先前所报道的，通过ELISA测量的IP-10和RANTES分泌到培养基中是由单独的polyIC部分诱导的(22)。用dsRB-SCP/polyIC处理导致IP-10和RANTES分泌进一步增加2倍(图4A-B)。IFN-γ表达不受单独的polyIC或dsRB-SCP影响，但是通过qRT-PCR测量，用dsRB-SCP/polyIC处理导致IFN-β表达的诱导非常强(图4C)。
为了研究分泌的细胞因子是否吸引免疫细胞，我们检查了来自dsRB-SCP/polyIC处理的LNCaP细胞的培养基是否诱导了新鲜分离的PBMC的趋化性。图4D显示与来自未处理细胞的培养基相比，增加数量的PBMC从用dsRB-SCP/polyIC处理的细胞向条件培养基迁移。
dsRB-SCP/polyIC诱导的旁观者效应
我们接下来测试了募集的免疫细胞是否能够引起免疫细胞介导的旁观者效应。我们用低剂量的dsRB-SCP/polyIC处理稳定表达荧光素酶的LNCaP-Luc/GFP细胞，然后与PBMC共温育。我们使用荧光素酶活性作为LNCaP-Luc/GFP细胞存活的量度。结果显示根除LNCaP-Luc/GFP细胞(图5A)。相反，在没有PBMC的情况下，荧光素酶水平几乎没有受到影响。这些结果表明dsRB-SCP/polyIC诱导强大的免疫细胞介导的旁观者效应。
为了评估dsRB-SCP/polyIC是否也诱导直接旁观者效应，将LNCaP细胞与不表达PSMA的PC3-Luc/GFP细胞共温育。dsRB-SCP/polyIC处理导致高达60％的PC3-Luc/GFP细胞被杀死(图5B)。由于PC3-Luc/GFP细胞不是dsRB-SCP/polyIC的靶标(图5B)，我们推断这些细胞的死亡是由dsRB-SCP/polyIC靶向LNCaP细胞引起的直接旁观者效应的结果。向该共培养***中添加人PBMC导致PC3-Luc/GFP细胞的杀伤率显著增加(图5B)，表明在这些条件下额外参与免疫细胞介导的旁观者效应。
dsRB-SCP/polyIC破坏肿瘤球状体
我们接下来评估了dsRB-SCP/polyIC在3D肿瘤球状体模型中的功效。体外3D模型非常类似于人类肿瘤的结构(23)并具有对抗癌药物的高抗性(24)。产生LNCaP球状体并使其达到300-400μm的直径。然后将球状体转移至polyHEMA板并在5天的过程中用dsRB-SCP/polyIC(400nM dsRB-SCP，2.5μg/ml polyIC)重复处理。到第5天，用dsRB-SCP/polyIC处理的球状体开始收缩并脱落死细胞，而未处理的球状体尺寸增加(图6A)。在第15天，用钙黄绿素AM和碘化丙啶染色球状体以监测活力(图6A)。dsRB-SCP/polyIC处理的球状体表现出显著的结构损伤并含有大量死细胞(图6A)。相比之下，未处理的球状体和仅用polyIC或仅用dsRB-SCP处理的球状体保持典型的完整结构(11)，其中表面处的细胞存活并且核心处的细胞坏死(图6A)。
为了更接近地模拟体内条件并测试对球状体的免疫细胞介导的旁观者效应，我们将PBMC添加到经处理的球状体中。用dsRB-SCP/polyIC处理LNCaP-Luc/GFP球状体一次，24小时后将新鲜分离的PBMC加入培养物中。即使在dsRB-SCP/polyIC的最低剂量下，在开始处理后72小时或在加入PBMC后48小时，球状体的解体已经很明显(图6B)。在较高剂量下，在开始处理后96小时观察到完全的球状体破坏。再过72小时后，只有死细胞明显而没有GFP荧光(图6B)。作为对照，在不存在PBMC的情况下进行相同的处理。在终点(168小时)，处理导致可见的细胞死亡和球状体的分解(图6B下图)，但与在PBMC存在下观察到的水平相比，效果较弱。因此，dsRB-SCP/polyIC对球状体具有强效作用，并且这种效应通过添加免疫细胞而大大放大。
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鉴于可以应用所公开发明的原理的许多可能的实施方式，应该认识到，所示实施方式仅是本发明的优选示例，不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们要求保护落入这些权利要求的范围和精神内的我们所有发明。
Figure IDA0001983271060000011
Figure IDA0001983271060000021
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Figure IDA0001983271060000171

Claims (10)

1.一种嵌合重组蛋白，其包含：
双链RNA（dsRNA）结合结构域；
结合***表面膜抗原（PSMA）的靶向结合部分；和
所述dsRNA结合结构域和所述靶向结合部分之间的间隔肽，其中
所述双链RNA（dsRNA）结合结构域是如SEQ ID NO：18所示的人PKR的至少一种dsRNA结合结构域，
所述间隔肽是如SEQ ID NO：5所示的ARG9，并且
所述靶向结合部分是如SEQ ID NO：20所示的单链抗PSMA抗体。
2.根据权利要求1所述的嵌合重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种复合物，其包含根据权利要求1或2所述的嵌合重组蛋白和dsRNA。
4.根据权利要求3所述的复合物，其中，所述dsRNA包含聚肌苷酸链和聚胞苷酸链（polyIC）。
5.一种核酸，其包含编码根据权利要求1或2所述的重组蛋白的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中，所述核酸序列被优化用于在细菌或植物宿主细胞中表达。
7.根据权利要求1或2所述的嵌合重组蛋白或根据权利要求3或4所述的复合物，其用于治疗***癌或抑制肿瘤新血管***发展。
8.根据权利要求3或4所述的复合物在制造用于治疗***癌或抑制肿瘤新血管发展的药物中的用途，其中根据权利要求3或4所述的复合物以治疗有效量施用于有需要的受试者，从而治疗所述癌症或抑制所述肿瘤新血管***发展。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述复合物是全身或局部施用的。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其还包括向所述受试者施用治疗有效量的外周血单核细胞（PBMC）。
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