KR101875809B1 - 리피바디-항암 단백질 약물 복합체, 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

리피바디-항암 단백질 약물 복합체, 그 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리피바디(repebody)를 이용한 항암 단백질 약물 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif)를 가지는 LRR(leucine-rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단에 VLR(variable lymphocyte receptor)에서 기인한 LRR 구조가 가변부위로 연결되어 기질특이성을 나타내는 리피바디에 자기조립되고, 항암 활성을 가지는 단백질 약물이 접합된 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate)와 이를 제조하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리피바디-항암 단백질 약물 복합체는 리피바디가 제공하는 높은 기질특이성과 우수한 조직 및 종양 침투력과, 자기조립 되고, 항암 활성을 가지는 단백질 약물이 결합한 것으로써, 리피바디 단독으로 사용하는 경우에 비해 월등한 효능을 지니고, 항암 단백질 약물 단독으로 사용하는 경우에 비해 특이적 선택성을 지니는 장점을 가지고 있으며, 이를 활용하여 암세포에 과발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 리피바디에, 세포를 사멸시키는 항암 단백질 약물을 결합시켜 암세포만을 선택적으로 사멸시킴으로써 종양 치료에 유용하다.

Description

리피바디-항암 단백질 약물 복합체, 그 제조방법 및 용도 {Repebody-Anticancer Protein Drug Conjugate, Preparation Methods and Use Thereof}
본 발명은 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif)를 가지는 LRR(leucine-rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단에 VLR(variable lymphocyte receptor)에서 기인한 LRR 구조가 가변부위로 연결되어 기질특이성을 나타내는 리피바디 또는 리피바디를 기본 골격으로 갖는 단백질 유도체에 자기조립되고 항암 활성을 가지는 단백질 약물이 결합된 리피바디-항암 단백질 약물 복합체, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
임상 종양학 분야의 최종 목표 중 하나는 확실한 치료효과를 가지면서 세포 독성은 거의 없는 항암제를 개발하는 것이다(M. Huang et al., Trends Pharmacol. Sci. Vol. 35. pp. 41-50. 2014). 암 예방 및 치료에 대한 상기 목표를 달성하기 위해 필요한 것은 선택성 세포 독성 및 암 세포에 특이적으로 항암제를 전달하는 방법이다(R.V.J. Chari, Acc. Chem. Res. Vol. 41. pp. 98-107. 2008). 지난 수십년간 수많은 약물이 환자에게 적용되었으나, 작은-화합물 항암제(small-chemical drug)를 체계적으로 전달하는 방법은 낮은 민감도, 낮은 생체 적합성 및 심각한 부작용으로 크게 효과를 나타내지 못하고 있는 실정이다(K. Masui, et al., Carcinogenesis. Vol. 34. pp. 725-738, 2013).
상기 문제점을 해결하기 위해 다양한 전략이 시도되고 있으며, 그 중 하나는 단백질 기반의 약물 복합체인데 이미 다양한 종류의 단백질 약물이 임상적으로 이용되고 있다(B. leader., Nat. Rev. Drug Discov. Vol. 7, pp. 21-39, 2008). 주목할 만한 결과에도 불구하고, 표면 항원의 낮은 발현 레벨에 따른 정상 세포에 대한 낮은 단백질 약물의 노출 등에 의해 원하지 않는 세포에 세포독성을 나타낼 수 있어, 적용 범위가 좁은 단점이 있다(G.K. Dy et al., Cancer J. Clin. Vol. 63, pp. 249-279, 2013). 암 세포 내의 발암 활성에 따른 암 세포 특이적 세포 독성을 나타내는 분자적으로 타겟팅된 약물이 최근 상기 단점의 해결 방법으로 대두되고 있다.
바이러스 유래 항암 단백질 및 인간 암 억제 단백질을 포함하는 암 특이적 성질을 가지는 프로-아팝틱 단백질(pro-apoptic protein)은 선택적으로 암 세포를 사멸시키는 능력 때문에 최근 관심의 대상이 되고 있다(M.H.M. Noteborn, Eur. J. Pharmacol. Vol. 625. pp. 165-173, 2009). 이들 중에서 특히 닭 빈혈 바이러스(chicken anaemia virus, CAV) 유래 13.6kDa의 아팝틴(apoptin) 단백질은 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서, 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도하여 큰 관심을 받고 있다(C. Backendorf et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. Vol. 48, pp. 143-169, 2008). 흥미롭게도 아팝틴의 암 세포 특이적 활성은 암 억제 단백질은 p53과는 무관하게 작동하며, 세포 내 다양한 발암 단백질들의 상호작용에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있다(O.M. Rollano Preialoza et al., Trends Mol. Med. Vol. 20, pp. 519-528, 2014). 아팝틴을 임상에서 이용하기 위해서는 세포 내로 전달할 수 있는 시스템이 필요한데, 먼저 바이러스 기반의 전달 시스템이 개발되었으나, 낮은 전달 효율, 조절되지 않는 유전자 발현, 면역독성 등의 단점이 보고되었다(Y. Seow et al., Mol. Ther. Vol. 17, pp. 767-777, 2009). 따라서, 상기 부작용 없이 효과적으로 아팝틴을 암 세포로 전달할 수 있는 시스템이 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존의 약물 전달 시스템에서 일반적으로 사용되는 항체를 대체할 수 있는 비 항체 단백질 골격 (non-antibody protein scaffold)인 리피바디 (repebody)를 성공적으로 개발하였다. 리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고 대장균에서 대량생산 되며 동물 실험결과 면역원성이 거의 없음을 확인하였다. 또한 열 및 pH 안정성이 매우 우수하고 표적 물질에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며 표적 물질에 대한 특이성이 매우 탁월함을 입증한 바가 있다(대한민국 공개특허공보 10-2011-0099600).
상기와 같은 연구 흐름에 따라 본 발명자들도 보다 효과적인 항암 단백질 약물 전달 시스템을 개발하기 위하여 연구를 계속하던 중, 특정 타겟 결합 단백질로 리피바디를 이용하여 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 제조할 경우, 리피바디의 장점들, 즉 대장균에서 수용성 형태(soluble form)로 발현되어 저렴한 비용으로 쉽게 대량생산이 가능한 점과, 리피바디의 Tm 이 85 ℃ 이상으로 열역학적으로 매우 안정되어 있다는 점, 리피바디는 그 분자량이 25~30 kDa 로 진단 및 치료용 단백질로 개발 시 조직침투력이 매우 우수한 점 등을 유지하면서도, 표적 단백질에 특이적으로 결합함으로써 표적 세포를 사멸시키는 아팝틴 등의 항암 단백질 약물 결합체로서 치료 효능을 충분히 발휘할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 리피바디-항암 단백질 약물 복합체, 상기 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR (Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단과 VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합되어 있는 리피바디(repebody)에 상기 리피바디와 자기조립되고 항암 활성을 가지는 단백질 약물이 결합되어 있는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 리피바디-항암 단백질 약물 복합체는 리피바디가 제공하는 높은 기질특이성과 우수한 조직 및 종양 침투능에, 암 세포만 선별적으로 사멸 시킬 수 있는 단백질 약물이 결합된 것으로서, 리피바디 단독으로 사용하는 경우에 비해 월등한 효능을 지니고, 단백질 약물 단독으로 사용하는 경우에 비해 표적 세포에 대한 특이적 선택성을 지님으로써 부작용을 최소화 할 수 있다는 장점을 가지고 있을 뿐만 아니라, 대장균에서 수용성 형태(soluble form)로 발현되어 저렴한 비용으로 쉽게 대량생산이 가능하고, 열역학적으로 매우 안정하며, 조직침투력이 매우 우수한 점 등의 장점을 가지고 있으면서, 표적 단백질에 특이적으로 결합함으로써 표적 세포를 사멸시키는데 유용하다.
도 1의 (a)는 자기조립되는 리피바디-아팝틴 나노입자(Rb-Apo-NPs)를 나타낸 개념도이고, (b)는 E. coli에서 발현시킨 Rb-Apo 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과이며, (c)는 2μm X 2μm 크기의 자기조립된 Rb-Apo-NPs의 AFM 이미지이다.
도 2의 (a)는 Rb-Apo-NPs의 DLS 분석을 통한 크기 분포 프로파일을 나타낸 것이고, (b)는 배양 시간에 따른, Rb-Apo-NPs의 Z-average diameter의 변화값을 측정한 결과이며, (c)는 다양한 조건에서 Rb-Apo-NPs의 분해 정도를 측정한 인 분석 결과이고, (d)는 생리학적 조건(10% mouse serum과 함께 37℃에서 배양)에서 Rb-Apo-NPs의 안정성을 분석한 DLS 결과이다.
도 3의 (a)의 왼쪽 패널은 EGFR을 과발현하는 A431 세포와 적게 발현하는 MCF7 세포를 함께 배양한 다음, 형광-라벨된 리피바디를 3시간 동안 반응 시킨 다음, confocal 현미경으로 고나찰한 결과이고, 오른쪽 패널은 각 세포주의 EGFR 발현 레벨을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이며, (b)는 다양한 종류의 EGFR 세포외 도메인에 대한 RB-Apo-NPs의 타겟 특이성을 측정한 ELISA 결과이고, (c)는 Rb-Apo-NPs와 리피바디의 hEGFR에 대한 농도별 결합량을 측정한 ELISA 결과이며, (d)는 형광 라벨된 MBP-Apo-NPs와 Rb-Apo-NPs를 각각 A431 세포와 서로 다른 시간을 배양한 다음, 고정 시켜 세포 내 분포 상태를 관찰한 컨포칼 현미경 이미지이다.
도 4의 (a) 내지 (d)는 자유 리피바디(검은 동그라미), MBP-Apo-NPs(흰 동그라미) 및 Rb-Apo-NPs(검은 삼각형)을 각각의 세포주에 주입한 다음, 72시간 동안 배양한 후, 세포의 생존량을 CCK-8 분석으로 측정한 결과로서, (a)는 A431 세포주, (b)는 MDA-MB-468 세포주, (c)는 H1650 세포주 및 (d)는 MCF7 세포주를 의미하고, 이들 각각의 IC50 값은 표 1에 개시되어 있으며, (e)는 Rb-Apo-NPs가 타겟 특이적으로 세포내로 운반된 후, 아팝틴에 의해 유도되는 세포 자살을 일으키는 과정을 나타낸 개념도이다.
도 5의 (a)는 MDA-MB-468 세포주가 이종 이식된 마우스 모델에 각각 형광 라벨된 Rb-Apo-NPs 또는 MBP-Apo-NPs를 주입한 다음, 4일 후, 마우스 내 각 나노입자들의 위치를 측정한 결과이고, (b)는 Rb-Apo-NPs 및 암 세포를 주입하는 스케쥴을 나타낸 개념도이며, (c)는 MDA-MB-468 세포주가 이종 이식된 마우스 모델에 Rb-Apo-NPs를 12일간 3일 간격으로 정맥 주입한 다음, PBS 대조군과 함께 종양 크기를 30일간 측정한 결과이고, (d)는 30일째 되는 날 측정한 각 대조군 및 실험군의 종양 샘플을 나타낸 결과이며, (e)는 Rb-Apo-NPs의 세포 내 독성을 측정하기 위해 PBS 대조군 대비 체중을 측정한 결과이고, (f) 및 (g)는 ㄱㆍㄱ각 Rb-Apo-NPs의 간 독성 및 신독성을 측정한 결과로서, 30일간 Rb-Apo-NPs를 주입한 다음, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT 및 AST) 와 크레아틴 및 BUN 레벨을 측정한 결과이며, (h)는 Rb-Apo-NPs를 주입한 다음, 30일째 조직의 H&E 염색 및 apoptosis TNEL 분석 결과이고, (i)는 암 세포 특이적으로 Rb-Apo-NPs가 작용하는 지를 종양 크기로 측정한 결과이다.
본 발명은 ‘리피바디’에 자기조립되고, 항암 활성을 가지는 단백질 약물이 유전자적 결합을 통하여 직접 결합된 새로운 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 제공한다.
본 발명의 용어 “리피바디”란, 인터날린 단백질의 N-말단 및 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질이 융합된 수용성 융합 폴리펩타이드 및 이를 기본 구조로 하여 부분적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미하는데, 한국 KAIST의 김학성 교수팀에 의해 최초로 개발되어 ‘리피바디(Repebody)’로 명명된 것(대한민국 공개특허공보 10-2011-0099600 A1, 대한민국 등록특허공보 1356075, 국제공개특허공보 WO2013-129852 A1 및 리피바디 관련 논문 Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 28;109(9):3299-304 참조)이다. 보다 구체적으로는, 상기 리피바디는 미생물 유래이고 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif)를 가지는 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단, VLR(vaciable lymphocyte receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된 것으로서, 이 리피바디는, 예컨대, 암세포에서만 특이적으로 발현되거나 과다하게 발현되는 수용체(receptor)와 같은 특정의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 특성이 있으며, 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질 및 이의 생물리학적 성질을 향상 시킨 모든 융합 LRR 패밀리 단백질을 포함할 수 있다. 또한 상기 리피바디의 구성 성분인 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있고, 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.
본 발명은 일관점에서, 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR (Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단과 VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합되어 있는 리피바디(repebody)에 상기 리피바디와 자기조립되고 항암 활성을 가지는 단백질 약물이 결합되어 있는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-protein toxin conjugate)에 관한 것이다.
본 발명에서 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 구성하는 리피바디는, 전술한 공지의 리피바디 단량체이거나, 2 이상의 리피바디 단량체로 이루어진 리피바디 다량체(이하, “리피바디 다량체”라 한다)일 수 있고, 또한, 이들 리피바디 단량체나 리피바디 다량체에 Fc 단백질과 같은 단백질 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 유기/무기 화합물이 도입된 것이다. 리피바디 단량체나 다량체, 또는 이들 각각에 Fc 단백질나 PEG가 도입된 전술한 리피바디 외에도, 본 발명의 분야에서 잘 알려져 있는 방법에 의하여 다양한 종류의 단백질이나 특정의 아미노산 서열 및 유기/무기 화합물 등을 도입하는 것이 가능하고, 그 결과 얻어진 리피바디들도 본 발명의 목적을 벗어나지 않는 범위 내에서라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "항암 단백질 약물"은 자기조립되고, 항암 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 바람직하게는 자기조립 단백질 나노입자의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 아팝틴(Apoptin)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체가 자기조립 단백질 나노입자의 형태일 경우 그 크기는 10-100nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 자기조립 단백질에 항암제를 투입하고, 표면에 리피바디가 표출되어 있는 복합체 역시 본 발명의 일례일 수 있다. 상기 일례에서, 자기조립 단백질은 세포 내에서 발현 시 자기조립 되는 단백질이면 모두 이용가능하며, 바람직하게는 페리틴(ferritin), 페리틴 유사 단백질(ferritin-like protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질 및 바이러스 구성단백질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항암제는 자기조립 단백질 나노입자에 결합 또는 주입될 수 있는 작은 화합물(small-molecule)이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 핵산알킬화제, 대사길항제, 천연물 유래 알칼로이드제 및 호르몬제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산알킬화제는 비스클로로에틸아민(Bischloroethylamines), 아지리딘(Aziridines), 니트로소우레아(Nitrosoureas), 테트라진(tetrazines), 알킬 알케인 설포네이트(alkyl alkane sulphonates), 논-클래식 에이전트(non-classic agent) 및 플래티넘 컴파운드(platinum compounds)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 비스클로로에틸아민은 사이클로포스포아마이드(cyclophosphamide), 멜파란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil) 또는 이포스파마이드(ifosphamide)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 아지리딘은 싸이오테파(thiotepa) 또는 미토마이신 C(mitomycin c)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 니트로소우레아는 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 포테무스틴(fotemustine) 또는 스트렙토조토신(straptozotocin) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 테트라진은 다카르바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide) 또는 미토졸로마이드(mitozolomide) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 알킬 알케인 설포네이트는 부술판(busulphan)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 논 클래식 에이전트는 알트레타민(altretamine) 또는 프로카바진(procarbazine)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 플레티넘 컴파운드는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 또는 옥살로플라틴(oxaloplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 대사길항제는 피리미딘유도체, 엽산유도체 및 퓨린유도체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 피리미딘유도체는 플로오우라실(5-FU), 시타라빈 또는 젬시타빈 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 엽산유도체는 메소프렉세이트 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 퓨린유도체는 메르캅토퓨린(6-MP)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 천연물 유래 알칼로이드제는 빈카 알칼로이드(vinca alkalroid), 탁세인(Taxane) 및 안티바이오틱스(antibiotics)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 빈카 알칼로이드는 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 탁세인은 파클리탁셀 또는 도세탁셀 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 안티바이틱스는 독소루비신, 다우노루비신 또는 마이토마이신일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 호르몬제는 부신피질 스테로이드, 성호르몬, 및 항에스트로젠으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 부신피질 스테로이드는 프레드니손 또는 프레드니솔론일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 성호르몬은 프로게스틴, 에스트로겐 또는 안드로겐일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 항에스트젠은 타목시펜일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 자기조립 단백질의 N-말단에 리피바디를 융합하고, C-말단에 항암 활성을 가지는 단백질을 융합하여, 자기조립 단백질 나노입자의 형태를 가지는 복합체 역시 본 발명의 범위에 속하는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에서, 상기 항암 활성을 가지는 단백질은 단백질 독소, 인터페론, 인터루킨, 조혈성장인자 및 종양괴사인자로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 단백질 독소는 녹농균 외독소 A, 디프테리아 황독소, 보튤리움 독소, 파상풍 항독소, 이질 독소, 콜레라 독소, 시구아톡신 또는 리신 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 인터페론은 인터페론-알파, -베타 또는 감마 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 인터루킨은 인터루킨 2 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 조혈성정인자는 G-CSF 또는 GM-CSF일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기종양괴사인자는 TNF-α 또는 TNF-β 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항암 단백질 약물은 단백질의 본래 구조를 온전히 보존하며 활성을 최대화 시킬 수 있도록 하는 목적으로 링커(linker)를 통하여 리피바디의 C-말단에 연결될 수 있다. 여기서 링커는 일반적으로 아미노산으로 구성되지만, 그 종류와 길이가 특별히 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 하나의 실시예에서와 같이 flexable 한 성질을 가진 (G3S)n spacer, 즉, glycine 3개와 serine 1개가 반복적으로 배열될 수 있고, 또는 GSAGSAAGSG 링커 혹은 rigid 한 성질을 가진 alpha-helix likner, 즉 (EAAAK)n (여기서 E는 glutamate, A 는 alanine, K는 lysine, G는 glysine, S는 aerine 이며, 상기 n 은 일반적으로 1 이상 정수이나 G3S 의 경우 glycine 과 serine 의 숫자 및 배열이 다양한 변형체도 가능하다) 도 가능하며, 물성을 고려하여 보다 hydrophilic 한 성질을 도입하기 위해 DRDD (여기서 D는 aspartate, R은 arginine) 등의 charged 아미노산이 포함된 다양한 링커들도 이용될 수 있다.
본 발명에서 리피바디-항암 단백질 약물 복합체의 리피바디는 CD19, CD20, CD21, CD22, CD37, CD70, CD72, CD79a/b, CD180, CD30, CD33, CD43, CD56, CD74, CD138, endothelin B receptor, EGFR, VEGF, CRIPTO, FAP, mesothelin, G2D, 5T4, alpha v beta6, CD174, CD227 (MUC-1), CD326 (Epcam), ED-B, CD227(MUC-1), nectin-4 (ASG-22ME), HER2, GPNMB, LIV1A, MUC16 (CA125), TIM-1 (CDX-014), GD2, GPNMB, PMEL 17, SMA, STEAP-1, TENB2 및 CAIX로 구성된 군에서 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 항암치료제로서 개발할 경우, 제한되지는 않으나 그 표적 단백질은 암세포에서 특이적 혹은 과발현 되는 단백질로서, 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma) 을 주된 적응증으로 할 경우 CD19, CD20, CD21, CD22, CD37, CD70, CD72, CD79a/b, 그리고 CD180 등이 될 수 있으며, 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma) 을 주된 적응증으로 할 경우 CD30, 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia) 을 주된 적응증으로 할 경우 CD33 과 CD43, 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia) 을 주된 적응증으로 할 경우 CD43, 다발성 골수종 (multiple myeloma) 을 주된 적응증으로 할 경우 CD56, CD74, CD138, 그리고 endothelin B receptor, 두경부암 (head and neck cancer) 을 주된 적응증으로 할 경우 EGFR, 폐암을 주된 적응증으로 할 경우 EGFR, CD56, CD326, CRIPTO, FAP, mesothelin, G2D, 5T4, 그리고 alpha v beta6, 교모세포종 (glioblastoma) 을 주된 적응증으로 할 경우 EGFR, EGFRvIII, 대장/직장암을 주된 적응증으로 할 경우 EGFR, CD74, CD174, CD227 (MUC-1), CD326 (Epcam), CRIPTO, FAP, 그리고 ED-B, 췌장암을 주된 적응증으로 할 경우 CD74, CD227 (MUC-1), nectin-4 (ASG-22ME), 그리고 alpha v beta6, 유방암을 주된 적응증으로 할 경우 HER2, CD174, GPNMB, CRIPTO, nectin-4 (ASG-22ME), 그리고 LIV1A, 난소암을 주된 적응증으로 할 경우 MUC16 (CA125), TIM-1 (CDX-014), 그리고 mesothelin, 흑색종 (melanoma) 을 주된 적응증으로 할 경우 GD2, GPNMB, ED-B, PMEL 17, 그리고 endothelin B receptor, 전립선암을 주된 적응증으로 할 경우 PSMA, STEAP-1, 그리고 TENB2, 신장암을 주된 적응증으로 할 경우 CAIX, 그리고 TIM-1 (CDX-014), 중피종 (mesothelioma) 을 주된 적응증으로 할 경우 mesothelin 등이 될 수 있다.
상기 열거한 적응증과 표적 단백질은 반드시 일치해야 할 필요는 없으며, 특히 EGFR 과 HER2 의 경우 다양한 암에서 과발현 되는 경우들이 많아 적응증을 국한시킬 필요는 없다.
본 발명에서는 하나의 실시예로 EGFR (내피세포 성장인자 수용체)에 결합하는 리피바디를 이용한 항-EGFR 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 제조하여 그 효능을 확인하였다.
본 발명에서 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체는 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체에서, 상기 리피바디는 서열번호 9 내지 16으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “재조합 미생물”이란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되거나, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 미생물에 도입되어 폴리뉴클레오타이드가 염색체에 통합되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한 본 발명은 (ⅰ) 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 발현시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 발현된 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 리피바디-항암 단백질 약물 복합체의 생산방법에 관한 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예:팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예:아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 생산된 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 리피바디-독소 단백질 복합체를 수집할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 유효성분으로 함유하는 질병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 질병은 제한되지는 않으나 통상적으로 알려져 있는 모든 질병을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소화기 질환, 호흡기 질환, 심장혈관 질환, 신장 질환, 내분비 질환, 면역 질환, 혈액질환, 유전병, 선천성 대사 장애, 성병, 암, 정신과 질환, 중독 또는 외과계 질환에 해당하는 질병 등을 포함한다. 일예로서 보다 상세하게는 뇌암, 백혈병, 위암, 대장암, 직장암, 간암, 폐암, 식도암, 전립선암, 유방암, 피부암, 자궁암 등의 암을 포함하여, 감기, 폐렴, 결핵, 에이즈(AIDS), 흑사병, 프리온 병 등의 전염병, B형 간염, 동맥경화, 탈장, 천연두, 빈혈, 소아마비, 알레르기, 천식, 당뇨병, 동맥경화, 신장병, 중풍, 알츠하이머병, 비만 등의 기타 질병 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 질병은 바람직하게는 암 일수 있고, 보다 바람직하게는 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암 (head and neck cancer), 폐암, 교모세포종 (glioblastoma), 대장/직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 흑색종 (melanoma), 전립선암, 신장암 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여로 질병이나 그로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 증상을 억제하거나 완화하는 것뿐만 아니라 질환의 증상을 반전시키는 질병의 치료 또는 패혈증의 진행을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 질병의 예방 또는 치료는 본 발명에서 개발한 리피바디-항암 단백질 약물 복합체가 리피바디의 기질과 결합하여 이루어지는 것으로, 예를 들어, 리피바디의 기질이 EGFR일 경우, 리피바디와 EGFR이 결합하여, EGFR을 과발현한 세포에 항암 단백질 약물이 작용하여 질병을 예방 또는 치료하는 것이다.
본 발명의 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 유효성분으로 함유하는 질병 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화 되리 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물 리피바디-항암 단백질 약물 복합체의 양은 제한되지는 않지만 전체 조성물 중량의 0.01 내지 95 중량%로 가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험방법>
본 실험에 사용된 방법은 다음과 같다.
단백질 발현 및 정제
모든 유전자 컨스트럭트는 pET21a 발현 벡터(Novagen, USA0에 NdeI 및 XhoI 제한효소를 이용하여 클로닝 하였다. 단백질 정제를 위하여, 리피바디-아팝틴 융합 단백질(Rb-Apo) 및 말토스 결합 단백질-아팝틴 융합 단백질(MBP-Apo)의 N말단에 폴리-히스티딘 태그를 결합시켰으며, 자유 리피바디(rEgH9)의 경우, C-말단에 폴리 히스티딘 태그를 결합시켜 발현하였다.
제작한 Rb-Apo 나노입자(Rb-Apo-NPs) 및 자유 리피바디(rEgH9) 컨스트럭트를 대장균(BL21(DE3) 또는 OrigamiB(DE3))에 각각 형질전환 시킨 다음, 각 컨스트럭트가 포함된 하나의 콜로니를 100μg의 앰피실린이 함유된 10ml의 LB배지에 접종한 다음, 37℃에서 밤새 배양하였다. 자유 리피바디(rEgH9)의 경우에는 카나마이신(50μg/ml) 및 테트라사이클린(10μg/ml)을 추가로 함유한 배지에서 배양하였다.
상기 배양액을 1:100으로 희석하여 OD 0.5까지 37℃에서 배양한 다음, IPTG를 Rb-Apo의 경우에는 0.1mM이 되도록, 리피바디의 경우에는 0.5mM이 되도록 첨가한 다음, 18℃에서 밤새 키워 단백질 발현을 유도하였다. 상기 배양액을 6,000rpm에서 15분간 원심분리하여, 세포를 분리한 다음, 라이시스 버퍼(20mM Tris, 150mM NaCl, 10mM Imidazole pH 8.0)에서 펠렛을 녹인 다음, 울트라 소니케이션으로 세포를 분쇄한 후, 13,000rpm에서 60분간 원심분리하여 상등액을 수득하여, 0.22μm 필터를 통해 필터링을 수행하였다.
상기 필터링 된 상등액을 Ni-NTA 크로마토그래피 컬럼(Qiagen, USA0에 로딩하여 워싱 버퍼(20mM Tris, 500mM NaCl, Rb-Apo의 경우 150mM NaCl, 20mM Imidazole, pH 8.0)로 3회 워싱한 다음, 일루션 버퍼(20mM Tris, 150mM NaCl, 250mM Imidazole, pH 8.0)로 단백질을 수득하였고, 버퍼를 pH7.4의 Tris 또는 PBS 버퍼로 교체하였다.
수득한 자유 리피바디 단백질은 4℃에 보관하였으며, Rb-Apo 및 MBP-Apo단백질의 경우에는 25℃에 보관하였으며, 각각의 단백질 농도는 UV-Visible 분광광도계(GE healthcare, USA)를 이용하여 280nm 흡광도를 측정하여 계산하였다. 본 발명에서 사용되는 융합 단백질의 농도는 모노머릭 융합 단백질의 몰라 농도로 표현되는 것이다.
원자력 현미경 실험(Atomic force microscopy)
20μl의 단백질(1mg/ml)을 10mM MgCl2가 함유된 pH 7.4의 PBS 버퍼에 녹인 다음, 새롭게 자른 마이카(mica Ted Pella Corp., USA)에 올린 다음, 5분간 배양한 뒤, 마이카 표면을 DDW(double distilled water)로 3회로 워싱한 다음 질소 가스로 건조시킨 후, 진공 데시케이터에서 밤새 말린 후, Park NX-10 ADM과 NC-NCH tip(Park System Corp., Korea)을 이용하여 non-contact mode로 표면을 스캐닝 하였다.
동적빛산란 실험(Dynamic light scttering)
1mg/ml의 단백질을 pH 7.4의 PBS 버퍼에 녹인다음, 0.22μm 필터를 통해 필터링하였다. Rb-Apo-NPs의 생리학적 조건에서의 안정성을 테스트하기 위하여, 최종 농도 1mg/ml의 Rb-Apo-NPs를 트리스 버퍼(20mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0)에 녹인 다음, 10% 마우스 혈청 또는 10NIH units/ml의 트롬빈(Sigma, USA)와 섞어서 37℃에서 배양하였다. 전체 150ul의 샘플을 마이크로 큐벳(ZED0040, Malvern, UK)에 옮긴 다음, Zetasizer instrument(Malvern, UK)를 이용하여 25℃에서 수동력학적 크기를 측정하였으며, 모든 측정은 3회 반복하였다.
원이색성 분석(Circular dichroism analysis)
J-815 CD spectropolarimeter(Jasco, Japan)을 이용하여, 190에서 260nm에서 자유 리피바디(rEgH9)와 Rb-Apo-NPs의 원이 색상 스텍트럼을 25℃에서 측정하였다. 쿼츠 큐벳의 패스 길이는 자유 리피바디의 경우 0.2mm이고, Rb-Apo-NPs의 경우에는 1mm 였으며, 모든 샘플은 pH 7.4의 PBS 버퍼에 녹여서 1mg/ml의 농도로 사용하였다.
222nm에서의 몰랄 타원율(molar ellipticity)를 25도에서 90℃로 온도를 올려가면서 측정한 다음, SigmaPlot program(Systat Software, USA)로 데이터를 필터링 하여 융해 온도를 계산하였다.
ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent assay)
Rb-Apo-NPs의 타겟 특이성을 검증하기 위하여 먼저 96 웰 Maxisorp 플레이트(SPL, Korea)를 BSA 및 EGFR 패밀리 단백질로 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 상온에서 1시간 동안 2% BSA(20mg/ml)가 함유된 PBST 용액(0.1% Tween 20가 함유된 PBS)에 배양하여 블로킹을 수행하였다. 코팅되는 모든 단백질의 농도는 10μg/ml이었다.
블로킹 이후, 1시간 동안 5mM의 Rb-Apo-NPs를 주입하여 반응시킨 다음, 다시 1시간 동안 1:5000으로 희석된 토끼 항-리피바디 항체(10.1 mg/ml, Abcion, Korea)를 주입하여 반응시켰다. 결합 신호는 1:3000으로 희석된HRP-결합 염소 항-토끼 항체(Bio-Rad, USA)와 테트라메틸벤진(TMB) 용액(SIgma, USA)를 이용하여 현상하였으며, 1N 설폰산 용액을 주입한 다음, 450mm에서의 흡광도를 microplate reader(Tecan, Swiss)를 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
공초점 형광 현미경 실험(Confocal fluorescence microscopy)
염색액 대 단백질 비율이 8이 되도록 2mg/ml의 단백질들과 플루오레신-NHS(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 섞은 다음, 4℃에서 밤새 배양하여, 단백질을 염색한 다음, PD-10 컬럼(GE healthcare, USA)에 pH 7.4의 PBS 버퍼를 이용하여 흘려서, 반응하지 않은 플루오레신-NHS를 제거하였다. 실험 대상이 되는 세포들을 8-웰 슬라이드 글라스(SPL, Korea)에 위치시킨 다음, 1μg/ml의 염색된 단백질을 무혈청 DMEM 배지를 각각 다른 시간 동안 처리한 후, 5% 이산화탄소가 포함된 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. DPBS로 3회 세포를 세척한 다음, 4% 파라포름알데하이드를 밤새 처리하여 세포를 고정하였다.
DBPS(Dulbecco’s PBSwithout calcium and magmesium; Thermo FIsher, USA)로 세포가 고정된 슬라이드 글라스를 3회 세척한 다음, DDW로 1회 세척한 후, DAPI 염색을 통해 핵을 염색하였다.
LSM780 공초점 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여, Rb-Apo-NPs의 경우에는 60x로, MBP-Apo-NPs의 경우에는 40x의 배율로 DAPI(ex. 405 nm, em, 410-492 em) 채널 및 FITC(ex. 488nm, em. 493-634em) 채널로 형광을 측정하였다.
세포 배양 실험(Cell co-culture assay)
인간 암 세포 주(A431 및 MCF7)을 100mm X 20mm 세포 배양 플레이트에서 37℃ 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. A431 세포주는 DMEM 배지를 이용하였으며, MCF7 세포주는 PRMI 배지를 이용하였다. 모든 배양 배지에는 10% 소태아혈청을 추가하였다. DPBS로 세포를 세척한 다음, trypsin-EDTA를 37℃에서 5-10분간 처리하여 표면으로 분리한 다음, 각각의 배양 배지에 다시 풀어 주었다.
자유 리피바디의 결합 특이성을 확인하기 위하여, MCF 세포를 먼저 1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine(Did) 트레이서(Thermo Fisher, USA)로 염색하였는데, 그 과정은 먼저 5μl의 DiD 트레이서를 세포에 주입한 다음 20분간 배양한 뒤, 회수하여 1 X 106 MCF7 세포주를 1μl의 무혈청 RPMI 배지에 섞는 것이다. 염색한 MCF7 세포들을 1X106 개의 A431 세포와 섞은 다음, 40μl의 세포 혼합액(1X105 세포/ml)을 세포 배양 슬라이드에 주입한 다음, 2일 동안 배양하였다.
염색 다이가 함유된 리피바디(1μl/ml)를 무혈청 배지에 녹인 다음, 세포의 면역 염색을 위해 3시간 동안 37℃에 처리하였다. DPBS로 3회간 세포를 세척한 다음, 15분간 4% 파라포름알데하이드가 함유된 PBS에서 고정하였고, 다시 DPBS로 3회 세척 후, PBS로 1회 세척하였다. DAPI 염색 후, 배양 슬라이드에 커버 글라스를 덮었다.
형광 세포이미지를 LSM780 공초점 현미경의 40x 배율 DAPI(ex. 405nm, em. 410-492nm) 채널, FITC(ex. 488nm, em. 493-634nm) 및 DiD(ex. 644nm, em. 665nm) 채널로 관찰하였다.
웨스턴 블롯 분석(Wesstern blot analysis)
A431, MDA-MB-468 및 MCF7 세포주를 2x106 세포 밀도로 100mm x 20mm 세포 배양 플레이트에 10ml의 배양배지와 함께 접종하여 배양하였다. 3일간 배양한 다음, 세포들을 pH 7.4 DPBS 버퍼로 2회 세척한 다음, 단백질 분해효소 억제제 칵테일(complete, EDTA-free, Roche, NSW. Australia)을 함유한 500μl의 라이시스 버퍼(1% SDS, 100mM Tris-HCl, pH 7.4)에 풀어준 뒤, 프로브 타입 소니케이터로 4℃에서 30분간 분쇄하였다. 3000 x g에서 10분간 원심분리하여 불용성 부분을 제거하였고, 수용성 단백질의 농도는 BCA 분석키트(bicinchoninic acid protein assay kit, Pierce, Rockford, Il, USA)를 이용하여 측정하였다.
각각의 샘플(20μg)에 로딩버퍼를 추가한 다음, 95℃에서 열을 가한 후, 10% SDS PAGE-Gel에서 전기영동을 수행한 이후, 단백질을 Hybond P 멤브레인(Amercham, st. Albans, UK)로 트랜스퍼 한 다음, 5% BSA(50mg/ml)이 함유된 TBST 버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 2시간 동안 블러킹을 수행하였다.
발현된 EGFR 및 β-액틴 단백질의 양은 항-EGFR 및 항 β-액틴 항체(1:5000 희석 in PBS; Pierce, USA) 1차 항체로 밤새 반응 시킨 다음, HRP 결합 항 토끼 IgG(1:10,000 희석 in PBS; Pierce, USA) 2차 항체로 1시간 반응 시킨 후, TBST로 멤브레인을 3회 세척한 다음, ECL 웨스턴 블로팅 기질(Pierce, USA)을 이용하여 측정하였다.
세포 외 세포독성 실험(In vitro cytotoxicity)
실험 대상 세포주들을 웰당 3x103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트(SPL., Korea) 에 분주한 다음, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 서로 다른 농도의 Rb-Apo-NPs를 각 웰에 72시간 동안 처리한 다음, 배양 배지를 제거하였다. 10% CCK-8 reagent(Dojindo, Japan)을 포함하는 무혈청 배지를 각 웰에 주입한 다음 37℃에서 1시간 배양한 다음, 세포 생존률을 450nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 음성 대조군으로 MBP-APo-NPs 및 자유 리피바디를 사용하였으며, IC50 값을 SigmaPlot 프로그램 12.0(Systat Software, USA)을 이용하여 계산하였다.
제노그래프트 쥐 제작(Xenograft mice)
유방암 세포주(ATCC 유래 MDA-MB-468)를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(최종 농도 100U/ml)이 함유된 RPMI 배지(Life Technologigies, Inc., USA)에서 37℃, 5% 이산화탄소 함유 배양기에서 배양하였다. 6주령 수컷 BALB/c nu/nu 마우스는 Orient Bio, Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 마우스의 어깨에 MBD-MB-468 암세포 5 x 106 개와 100μl의 BD Matrigel Matirx(BD Biosciences, USA)가 섞인 용액을 피하 주사하여 제노그래프트 마우스를 제작하였다.
모든 동물들은 일정한 온도(23 ± 2℃), 습도(55±5%), 및 빛 강도(12시간 명/암 사이클)의 조건으로 Central Animal Research laboratory(Advanced Radiation Technology Institue(ARTI),Korea Atomic Energy Institute (KAERI))에서 키웠으며, 모든 동물 관련 실험은 Institutional Animal Ethical Committee에 승인을 받고 상기 위원회의 가이드라인을 따라 진행하였다.
세포 내 형광 라벨 및 이미징(Fluorescence labelling and in vivo imaging)
Rb-Apo-NPs와 Cy5.5 NHS ester(GE healthcare, USA)를 DMSO 함유 pH 7.4 PBS 버퍼에 녹여서 Cy5.5로 염색된 Rb-Apo-NPs를 수득하였다. 상기 염색은 10mg/ml 농도의 Cy5.5와 염색약 대 단백질 비율이 10이 되는 농도의 단백질을 상온에서 24시간 반응시켜 수행하였으며, 염색된 단백질은 PD-10 컬럼으로 정제한 다음, 30 kDa 분자량 컷오프를 가지는 원심분리 필터(Millipore, USA)를 이용하여 농축하였으며, 염색된 Rb-Apo-NPs의 농도는 BSA를 이용한 브래드포드 분석으로 측정하였다.
염색된 Rb-Apo-NPs의 체내 분포를 살피기 위하여 제작된 제노그래프트 쥐의 종양 부피가 50mm3이 될 때, 꼬리 정맥을 통해 100μl의 5μM 농도의 Rb-Apo-NPs를 투입하였고, 동일한 과정을 거쳐 Cy5.5가 라벨된 MBP-Apo-NPs를 음성 대조군으로 이용하였다.
형광신호는 투입 후, 1시간에서 5일 동안 ccd 카메라로 관찰한 다음, 쥐를 희생하여 주요 기관을 수확해 ex vivo 이미징을 위해 사용하였다. MaestroTM 2.4 이미징 시스템(Cambridge Research & Instrumentation)을 이용하여 노출시간 100초의 조건으로 이미지를 수득하였으며, 오렌지 필터셋을 excitation filter: 581-631nm, emmission filter: 645nm 조건으로 세팅하고 accquisition 세팅을 10nm 간격으로 640-820nm로 설정하여 수득하였다.
세포 내 항암 활성( in vivo anti-tumour activity)
MDA-MB-468(EGFRHigh) 및 MCF7(EGFRLow) 세포주를 5 x 106 농도로 100μl Matrigel과 섞은 다음 쥐의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 10일 뒤, 종양 볼륨이 약 100mm3에 이르렀을 때, 쥐들을 세포 내 항암 활성 분석에 사용하였다. 각각 3개의 그룹으로 각 그룹당 7마리의 쥐를 이용하였다. Rb-Apo-NPs의 항암 활성을 확인하기 위하여 MDA-MB-468 및 MCF7 세포주가 제노그래프트 된 마우스에 5mg 또는 10mg/kg 농도의 Rb-Apo-NPs 또는 MBP-Apo-NPs를 3일에 한 번씩 정맥 주사하였으며, PBS를 대조군으로 이용하였다.
각 쥐의 몸무게와 암 크기를 15-30일간 이틀에 한번씩 측정하였으며,종양 볼륨은 캘리퍼(calliper)를 이용하여 하기의 식으로 계산하였다.
tumour volume(mm3): length X width2 X 0.5
종양 볼륨이 700mm3이 되거나, 피부 퀘양이 발생한 쥐의 경우 안락사 하였다.
간독성 및 신독성 분석(Assessment of hepatotoxicity and nephrotoxicity)
혈액을 뭉치게 한 다음, 3000g에서 20분간 원심분리하여 플라즈마를 분리하여 4℃에 보관하였다. 간독성은 혈중 AST(aspartate transminase) 및 ALT(alanine transaminases) 효소 활성을 키트(Asan Pharmaceuticals, Korea)를 이용해 측정하여 분석하였다. 신독성은 혈중 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아틴 농도를 Fuji dri-Chem NX 7000i(Fuji Photo Film CO., Ltd, Japan) 키트를 이용하여 측정한 다음 분석하였다.
터널 분석(TUNEL assay)
TACS TdT-DAB In Situ Apoptosis Detection Kit(Trevigen, Gaithersburg, ND)의 이용자 매뉴얼의 지시에 따라 터널 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로는, 제노그래프트 마우스의 조직 섹션을 3.7% 포름알데하이드 용액에서 7분간 고정시킨 다음 PBS로 세척한 뒤, 100% 메탄올을 20분간 처리하고 PBS로 2회 세척 후, 단백질 분해효소 K로 15분간 처리한 다음, 3% 과산화수소로 퀀칭한 뒤, PBS로 세척하였다. 상기 세척한 섹션들을 TdT로 라벨한 다음, 37℃ humidified 챔버에서 1시간 동안 배양한 뒤, 스톱 버퍼로 반응을 정지시켰다.
스트렙타비딘-HRP를 StrepBlue Diluent 용액에 희석한 다음, 상기 샘플에 처리한 뒤, 상온에서 15분간 반응시켰다. 증류수로 상기 샘플을 세척한 다음 TACS Blue Label로 처리한 뒤, 세포 자살이 발생하는 세포 핵을 측정하였다.
통계 분석(Stastical analysis)
실험 데이터들은 ±S.D 평균으로 표현하였다. 추가로, ANOVA를 이용해 통계 분석하였으며, 대응 그룹 간의 비교는 Tukey’s multiple comparsion test를 이용해 수행하였고, p<0.05인 값들을 통꼐적으로 의미있는 값으로 처리하였다.
실시예 1. 박테리아에서 리피바디-아팝틴 나노입자 제조
수용성 리피바디-아팝틴(Rb-Apo) 융합 단백질을 발현하기 위하여 아팝틴의 N-말단에 GSAGSAAGSG 링커를 부착한 다음 리피바디가 발현되는 발현 컨스트럭트를 제작하여 대장균에서 발현시킨 결과, 수용성 형태로 융합 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(도 1).
또한, 상기 융합 단백질이 대장균에서 자기조립된 단백질 나노입자로 제작되는지 확인하기 위하여 원자력 현미경(atomicforce microscopy)을 이용한 결과, 지름 약 40nm 크기의 나노입자 형태로 발현되는 것을 확인 하였다(도 1).
실시예 2. Rb-Apo-NPs의 성질 확인
실시예 1에서 제작한 Rb-Apo-NPs의 크기를 측정하기 위하여 DLS 분석을 수행한 결과, RB-APo-NPs는 일정한 크기 분포(PDI: 0.27) 및 입자 크기(Z-average 48.0)을 가지는 것을 확인하였다(도 2a). 또한 상온에서 상기 단백질 나노입자를 보관한 결과, 4주가 지나도 별다른 크기 변화 없이 안정적이라는 것을 확인할 수 있었으며(도 2b), 다양한 조건에서도 별다른 크기 변화 없이 안정하다는 것을 확인할 수 있었다(도 2c).
상기 Rb-Apo-NPs의 체내 안정성을 확인하기 위하여 10% 쥐 혈청과 섞은 후, 크기 변화를 관찰한 결과, 72시간이 지나도 그 크기에 큰 변화가 없어, 매우 안정적이라는 것을 확인할 수 있었다(도 2d).
실시예 3. Rb-Apo-NPs의 EGFR 과발현 세포에 대한 타겟팅 능력 확인 및 세포 내 위치 변화 확인
형광으로 표지한 Rb-Apo-NPs를 EGFR을 과발현하는 A431 세포와 EGFR을 적게 발현하는 MCF7 세포를 섞은 세포들에 투입한 다음, 형광을 측정한 결과, A431세포에서만 형광이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 3a). 또한 Rb-Apo-NPs를 EGFR 패밀리 단백질 들과 결합시켜 ELISA 분석을 수행한 결과, 자유 리피바디(rEgH9)와 비슷한 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3b,c).
도 3d에 개시된 바와 같이 EGFR을 과발현 하는 A431 세포주에 형광 표지된 Rb-Apo-NPs와 음성 대조군인 형광 표지된 MBP-Apo-NPs를 3-24시간 동안 투입하고 배양한 결과, Rb-APo-NPs는 시간이 지남에 따라 EGFR에 결합하여 세포 표면에서 핵 내로 이동하는 것을 확인할 수 있는 반면, 음성 대조군에서는 그러한 이동이 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. Rb-Apo-NPs의 EGFR 과발현 세포 특이적 세포 독성 확인
도 4의 a 내지 d에 개시된 바와 같이 EGFR을 발현하는 양에 따라 Rb-Apo-NPs만 특이적으로 세포 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, EGFR을 과발현하는 A431 또는 MDA-MB-468 세포주는 낮은 농도의 Rb-Apo-NPs에서도 세포가 생존하지 못하였으며, EGFR 발현량이 낮은 MCF7 세포주는 RB-Apo-NPs, 자유 리피바디 및 MBP-APo-NPs 모두에서 세포 독성이 거의 나타나지 않는 것을 호가인할 수 있었으며, 각 세포주 별, 단백질 나노입자 또는 자유 리피바디의 IC50 값은 표 1과 같다.
세포주별 단백질 IC50 값

IC50(nM)a
A431 MDA-MB-468 H1650 MCF7
Rb-Apo-NP 88.4 ± 4.5 83.1 ± 10.6 332.9 ± 54.9 ND
MBP-Apo-NP ND ND ND ND
Repebody ND ND ND ND
여기서 a는 IC50값을 정의하는 것으로, IC50 값은 세포의 절반이 살아남을 수 있는 농도를 의미하며, b는 ND를 나타내는 것을 값이 없다는 의미이다.
도 4e에 개시된 바와 같이 RB-Apo-NPs는 EGF-수용체 매개 엔도시토시스를 통해 암세포의 핵으로 이동되고, 핵 내에서 아팝틴에 의한 아팝토시스(apoptosis)를 유발하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. Rb-Apo-NPs의 세포 내 항암 활성 및 분포도 확인
Cy5.5로 표지한 Rb-Apo-NPs 또는 MBP-Apo-NPs를 EGFR 과발현 암세포가 제노그래프트된 마우스에 정맥 주사한 다음, 관찰한 결과, Rb-Apo-NPs 만이 마우스 내 암세포 주변에 위치하는 것을 확인할 수 있었다(도 5a).
Rb-Apo-NPs의 세포 내 항암 활성을 확인하기 위하여 도 5b에 개시된 스케쥴을 따라, MDA-MB-468 또는 MCF7이 제노그래프트하여 종양 볼륨이 약 100mm3이 된 마우스에 PBS 또는 5mg/kg 또는 10mg/kg의 Rb-Apo-NPs를 3일에 한 번씩 주사하였다. 그 결과, Rb-Apo-NPs가 획기적으로 종양 볼륨을 감소시키는 것을 확인하였다(도 5c, d). 또한 실험군에서 체중변화(도 5e), 간독성(도 5f) 및 신독성(도 5g)이 나타나지 않는 다는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 항암 효과가 아팝틴의 세포 자살(apoptosis)에 의한 것임을 H&E 염색 및 TUNEL 분석을 통해 확인하였다(도 5h).
이에 비해, EGFR이 적게 발현되는 MCF7 세포주가 제노그래프트된 마우스의 경우에는 항암 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 5i).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Repebody-Anticancer Protein Drug Conjugate, Preparation Methods and Use Thereof <130> P16-B351 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 379 <212> PRT <213> Aritificial Sequence <400> 1 Met His His His His His His Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile 1 5 10 15 Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn 20 25 30 Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn 35 40 45 Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln 50 55 60 Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn Val Arg Met Leu His Leu Pro Ser Asn 65 70 75 80 Lys Leu His Asp Ile Ser Ala Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr 85 90 95 Leu Met Leu His Tyr Asn Gln Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe 100 105 110 Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu Tyr Leu Ser Glu Asn Gln Leu 115 120 125 Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Leu Asp Leu Ala Arg Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly 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Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 14 <211> 266 <212> PRT <213> Aritificial Sequence <400> 14 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Leu Leu Cys Gly Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Cys Leu Phe Ser Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 15 <211> 242 <212> PRT <213> Aritificial Sequence <400> 15 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Met Leu His Tyr Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Tyr Leu Ser Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ala Arg Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr <210> 16 <211> 242 <212> PRT <213> Aritificial Sequence <400> 16 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Met Leu His Tyr Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Tyr Leu Ser Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ala Arg Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Glu Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr

Claims (15)

  1. 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR (Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단과 VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합되어 있는 리피바디(repebody)에 상기 리피바디와 자기조립되고 항암 활성을 가지는 아팝틴(Apoptin)이 결합되어 있는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate).
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 표면에 리피바디가 표출되어 있는 단백질 나노입자인 것을 특징으로 하는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate).
  3. 제1항에 있어서, 상기 리피바디는 CD19, CD20, CD21, CD22, CD37, CD70, CD72, CD79a/b, CD180, CD30, CD33, CD43, CD56, CD74, CD138, endothelin B receptor, EGFR, CRIPTO, FAP, mesothelin, G2D, 5T4, alpha v beta6, CD174, CD227 (MUC-1), CD326 (Epcam), ED-B, CD227 (MUC-1), nectin-4 (ASG-22ME), HER2, GPNMB, LIV1A, MUC16 (CA125), TIM-1 (CDX-014), GD2, GPNMB, PMEL 17, SMA, STEAP-1, TENB2 및 CAIX로 구성된 군에서 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate).
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate)는 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate).
  8. 제1항에 있어서, 상기 리피바디는 서열번호 9 내지 16으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 리피바디-항암 단백질 약물 복합체(Repebody-anticancer protein drug conjugate).
  9. 제1항의 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  11. 제9항의 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  12. 제10항의 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  13. (ⅰ) 제11항 또는 제12항의 재조합 미생물을 배양하여 제1항의 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 생성시키는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 생성된 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 리피바디-항암 단백질 약물 복합체의 생산방법.
  14. 제1항의 리피바디-항암 단백질 약물 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암 (head and neck cancer), 폐암, 교모세포종 (glioblastoma), 대장/직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 흑색종 (melanoma), 전립선암, 신장암 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160069667A (ko) * 2014-12-09 2016-06-17 전남대학교산학협력단 상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 신규 항암제
KR20160080832A (ko) * 2014-12-29 2016-07-08 주식회사 레고켐 바이오사이언스 리피바디 유도체-약물 복합체, 그 제조방법 및 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160069667A (ko) * 2014-12-09 2016-06-17 전남대학교산학협력단 상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 신규 항암제
KR20160080832A (ko) * 2014-12-29 2016-07-08 주식회사 레고켐 바이오사이언스 리피바디 유도체-약물 복합체, 그 제조방법 및 용도

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200047364A (ko) * 2018-10-24 2020-05-07 한국과학기술원 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도
KR102273123B1 (ko) 2018-10-24 2021-07-05 한국과학기술원 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도

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