JP5734865B2 - 選択性に優れた抗がんキメラペプチド - Google Patents

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Description

本願は、特願２００８−３０９１７６（２００８年１２月５日出願）および特願２００９−１３８２７９（２００９年６月９日出願）に対する優先権を主張し、これらの両出願は、あたかも本明細書中に記載されているかのようにその全体が本明細書中に参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、新規の標的化治療薬であるペプチドトキシンに関する。
がん細胞表面上に過剰発現されるタンパク質に対するモノクローナル抗体またはリガンドに植物または細菌の毒素を結合させたイムノトキシンは、抗がん剤としてのその使用可能性について、広く研究されている（非特許文献１）。多数のイムノトキシンが、前臨床試験および臨床試験において試験されており、インターロイキン−２−ジフテリア毒素（ＩＬ２−ＤＴ；ＯｎｔａｋＴＭ）が、慢性Ｔ細胞リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置について認可されている（非特許文献２；非特許文献３）。さらに、インターロイキン−４−緑膿菌外毒素［ＩＬ４（３８−３７）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ］およびインターロイキン−１３−緑膿菌外毒素（ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ）を含めた緑膿菌外毒素ベースのイムノトキシンが、臨床試験で試験中である（非特許文献４；非特許文献５）。ジフテリア毒素および緑膿菌外毒素は共に、リソソーム中に取り込まれ、活性化され、そして、サイトゾルへとトランスロケーションした後、リボソーム複合体中の伸長因子−２（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−２）タンパク質を触媒的に不活性化することによって作用する。この作用機構は、イムノトキシンが、休止状態の非複製腫瘍細胞を効率的に破壊することを可能にする。
細菌毒素ベースのイムノトキシンを利用してがんに向けてターゲティングするアプローチは魅力的ではあるが、細菌毒素に起因する肝毒性と、毒素タンパク質により引き起こされる免疫原性により、その使用が制約を受ける（非特許文献２；非特許文献４；非特許文献６）。さらに、イムノトキシンの分子サイズは、一般に、化合物またはフラグメント抗体薬物に比べて大きく、薬物が、ヒトの体内の腫瘍塊へと効率的に浸透することを妨げ得る。この問題を克服するために、進化したアプローチを有する新世代のイムノトキシンが、確実に必要とされる。
上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、長年にわたって、重要な腫瘍特異的な標的であった（非特許文献７；非特許文献８）。ＥＧＦＲは、細胞の増殖、分化および移動において重要な役割を担う。その正のシグナル伝達が、増殖の増加、アポトーシスの減少、ならびに腫瘍細胞の運動性および血管新生の増強を引き起こすことが見出された（非特許文献９）。ＥＧＦＲの過剰発現は、広範な上皮起源のヒト腫瘍（乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がんおよび卵巣がん）において頻繁に見出されている（非特許文献１０）。これら全ての知見からＥＧＦＲが薬物のレセプター媒介性の送達システムのための標的として重要であることが示された。最近、いくつかの研究が、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、ＥＧＦＲのペプチドリガンドを首尾よく同定したことを報告しており、ＥＧＦＲを標的とした薬物送達の可能性が示唆されている（非特許文献１１；非特許文献１２）。
治療用ペプチドは、種々の用途（例えば、腫瘍ワクチン（非特許文献１３）、抗菌治療（非特許文献１４）および核酸送達（非特許文献１５））において広く使用が進みつつある（非特許文献１６）。さらに、ペプチドベースの薬物を含む新規のがん治療の研究および開発が着手されている（非特許文献１７；非特許文献１８）。また、ペプチド治療薬は、組換え技術または固相化学合成技術のいずれかを用いて比較的容易に作製され、そして、一般的には、抗体ベースの治療薬と比較して、安価であることが知られる。近年、Ｄ型およびＬ型のロイシンおよびリジンを含む１５アミノ酸のジアステレオマー配列から構成される新規溶解型ペプチドが原形質膜を破壊し得ることが報告されている（非特許文献１９）。このペプチドは、正常細胞よりも優先的に腫瘍細胞を殺傷し、そして、界面活性剤様の様式で細胞膜を崩壊させる。細胞の選択性は、おそらく、主として、がん細胞壁上の酸性成分またはホスファチジルセリンのレベルの増加により決定される（非特許文献１９）。このジアステレオマー配列は、血清中およびタンパク質分解酵素の存在下で、活性を保持する（非特許文献２０）。このペプチドの選択性は、おそらく、主として、がん細胞壁上の酸性成分すなわちホスファチジルセリンのレベルの上昇が影響していることが示唆された（非特許文献１９）。この溶解型ペプチドは、正常細胞とがん細胞との間で選択的な細胞傷害性を有するが、依然として低濃度で正常細胞を殺傷し、したがって、ペプチドと標的化部分との組合せに適していない。また、文献１７、１９および２０において開示されているペプチドは、ＥＧＦＲ標的化による殺細胞効果の増強がみられず、分子標的化に適していない。
いくつかの可能性のある市販の分子標的化抗がん薬は、レセプターチロシンキナーゼおよび腫瘍の増殖を阻害する。ある場合には、がん細胞におけるキナーゼ関連のシグナル分子遺伝子の変異が、チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）薬に対する抵抗性をもたらす。最近、非小細胞肺がんおよび進行した結腸直腸がんの患者において、ｋ−ｒａｓ変異が上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）ＴＫＩおよびセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）に対する応答性の欠如と有意に関連していることが明らかになった（非特許文献２１）。この重大な問題を克服するため、シグナル伝達経路ブロッカーよりも優れた、がん細胞を直接殺傷する新規分子標的化抗がん剤の開発が求められている。
Ｐａｓｔａｎ Ｉ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７；１３３３：Ｃ１−６ Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｏ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ，Ｎａｇａｉ Ｒ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ．Ｔｈｅ Ｓｃｉ Ｗｏｒｌｄ Ｊ ２００６；６：７８１−９０ Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．ＡＡＰＳ Ｊ ２００６；８：Ｅ５３２−５１ Ｒａｎｄ ＲＷ，Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ，Ｐａｔｒｏｎａｓ Ｎ，Ｖａｒｒｉｃｃｈｉｏ Ｆ，Ｐａｓｔａｎ Ｉ，Ｐｕｒｉ ＲＫ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６：２１５７−６５ Ｋｕｎｗａｒ Ｓ，Ｐｒａｄｏｓ ＭＤ，Ｃｈａｎｇ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ Ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ Ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ（ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ） ｉｎ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ Ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ Ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７；２５：８３７−４４ Ｆｒａｎｋｅｌ ＡＥ，Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ ＥＡ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏｘｉｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６：３２６−３４ Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｖ，Ｈｉｄａｌｇｏ Ｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２００３；９５：８５１−６７ Ｊａｎｎｅ ＰＡ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＢＥ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００５；２３：３２２７−３４ Ｗｏｏｄｂｕｒｎ ＪＲ．Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９９９；８２：２４１−５０ Ｓａｌｏｍｏｎ ＤＳ，Ｂｒａｎｄｔ Ｒ，Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ Ｆ，Ｎｏｒｍａｎｎｏ Ｎ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９５；１９：１８３−２３２ Ｌｉ Ｚ，Ｚｈａｏ Ｒ，Ｗｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００５；１９：１９７８−８５ Ｙａｏ Ｇ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｌｕｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ＩＬ−４ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１８：１９−２９ Ｆｕｅｓｓｅｌ Ｓ，Ｍｅｙｅ Ａ，Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２００６；６６：８１１−２１ Ｃｈｒｏｍｅｋ Ｍ，Ｓｌａｍｏｖa Ｚ，Ｂｅｒｇｍａｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６；１２：６３６−４１ Ｋｕｍａｒ Ｐ，Ｗｕ Ｈ，ＭｃＢｒｉｄｅ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２００７；４４８：３９−４３ Ｌｉｅｎ Ｓ，Ｌｏｗｍａｎ ＨＢ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００３；２１：５５６−６２ Ｅｌｌｅｒｂｙ ＨＭ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｅｌｌｅｒｂｙ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９；５：１０３２−８ Ｐｌｅｓｃｉａ Ｊ，Ｓａｌｚ Ｗ，Ｘｉａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００５；７：４５７−６８ Ｐａｐｏ Ｎ，Ｓｈａｉ Ｙ．Ｎｅｗ ｌｙｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｄ，Ｌ−ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｋｉｌｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３；４２，：９３４６−５４ Ｐａｐｏ Ｎ，Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｅｓｈｈａｒ Ｚ，Ｓｈａｉ Ｙ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｄ−，Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ：ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｙｓｉｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：５７７９−８６ Ｋａｒａｐｅｔｉｓ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｋ−ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５９，１７５７−１７６５（２００８）
本発明は、新たな構造の新規医薬（例えば、抗がん剤）を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＥＧＦＲに結合するペプチド配列および溶解型ペプチド配列の最近の同定情報を用いて、ＥＧＦＲを過剰に発現するがん細胞を標的とする新規キメラペプチドを開発し、受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドが抗がん剤などの医薬として用いられることができることを見出した。本明細書においてＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンと呼ばれるこのキメラペプチドは、好ましくはスペーサー（例えば、３つのグリシンスペーサー）と共に受容体結合ペプチド（例えば、ＥＧＦＲ結合部分）および細胞殺傷性ペプチド（例えば、細胞膜溶解性部分）から構成され、このキメラペプチドは、標的化ペプチドと合わされたときに安定であり、かつ、オリジナルの溶解型ペプチドと比較して正常細胞株に対する毒性作用が少ないという特徴を有する。本発明において、本発明者らは、乳がん、膵臓がん、肺がん、前立腺がんおよび脳腫瘍に由来する７種のヒトがん細胞株において、本発明のキメラペプチド（例えば、ＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシン）により誘導されるインビトロ細胞傷害活性および細胞死の選択性を実証した。本発明者らはまた、ＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンのがん細胞表面との相互作用、および、ペプチドトキシンにより誘導されるがん細胞死の作用様式を研究した。インビボ実験もまた、本発明のキメラペプチドが有意な抗腫瘍活性を示したことを明らかにした。このことから、抗がん剤の実際の医薬としての用途以外に応用することが可能な分野、たとえば、これまでに知られていない薬物スクリーニング等への応用も可能となった。受容体等の特定タンパク質への結合ペプチド配列を見出すために、その候補配列とＬｙｔｉｃのキメラペプチドを多種類合成してｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を指標としたスクリーニングという形での応用化は可能であるからである。例えば、ＥＧＦＲ高発現がん細胞におけるＥＧＦＲとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬／抗がん剤のスクリーニング方法を実現することができる。従来技術の溶解型ペプチドは、正常細胞とがん細胞との間で選択的な細胞傷害性を有することは上記に述べたとおりであるが、本発明のペプチドは、正常細胞への殺傷性が減少した。したがって、ペプチドと標的化部分との組合せに適していることが判明した。
このペプチドトキシンは、標的結合ペプチドおよび細胞殺傷性の溶解性ペプチド成分から構成される化学合成したペプチドである。１つの例示として、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）結合ペプチドを、正電荷により細胞膜を崩壊させてがん細胞を殺傷する、カチオンリッチなアミノ酸を含む溶解型ペプチドと結合させた。ＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンは、ＥＧＦＲを過剰発現するがん細胞株において、溶解性ペプチドのみと比較して、ＩＣ５０（コントロール細胞の増殖の５０％阻害を誘導するペプチド濃度）の約３倍の改善を誘導した。対照的に、正常細胞株は、ＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンまたは溶解性ペプチドのみに対して感受性が低く、正常細胞において、がん細胞よりも４〜８倍高いＩＣ５０を示した。興味深いことに、細胞表面上のＥＧＦＲの発現は、ＥＧＦＲ標的化によるペプチドトキシンの殺細胞効果増強度合と十分に相関しており、特異性が示唆された。驚くべきことに、ＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンの１０分未満の曝露は、がん細胞の５０％以上を殺傷するに十分であった。さらに、本発明者らは、ペプチドトキシンを与えたがん細胞においてポリカスパーゼの活性化とアネキシンＶ陽性化が誘導され、アポトーシス性機構の誘導が示唆されることを見出した。まとめると、がん細胞に高発現しているタンパク質を標的化したペプチドトキシンは、新規がん標的化治療のための画期的なツールとなり得る。
したがって、本発明は、以下を提供する。
本発明の主な局面において、本発明は、受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
１つの実施形態では、この受容体結合ペプチドは、ＥＧＦ受容体結合ペプチド、インターロイキン４（ＩＬ−４）受容体結合ペプチド、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）受容体結合ペプチド、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）受容体結合ペプチド、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド、血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）結合ペプチド、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴｆＲ）結合ペプチド、エフリンＢ１（ＥｐｈＢ１）結合ペプチド、エフリンＢ２（ＥｐｈＢ２）結合ペプチド、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）結合ペプチド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ペプチドなどでありうる。
別の観点から述べると、本発明の主な局面において、本発明は、抗がん標的ペプチドと細胞膜溶解性ペプチド成分とを含むキメラペプチドであるペプチドトキシンを提供する。
本発明の主な局面における具体的な実施形態としては、たとえば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒト上皮増殖因子受容体２型（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ ２（ＨＥＲ２）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴｆＲ）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ；ＮＲＰ）、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）／血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、エフリンＢ１（ＥｐｈＢ１）、エフリンＢ２（ＥｐｈＢ２）、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）などの受容体に結合するペプチドを用いるペプチドトキシンを挙げることができ、以下がキメラペプチドとして例示される（本明細書では、アルファベットは、アミノ酸の１文字表示である。）。
ＥＢ−Ｌｙｔｉｃ：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号２）
ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ：ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１４）
ＨＥＲ２−Ｌｙｔｉｃ：ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１５）
ＶＥＧＦＲ１−Ｌｙｔｉｃ：ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬＧＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１６）
ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃ：ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１７）
ＬｙｔｉｃＬペプチド：ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号２７）
ＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ：ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１８）
ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ：ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１９）
Ｓｅｍａ３Ａ−ＬｙｔｉｃＬ＜ヒトニューロピリン−１への結合＞：ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号２０）
ＥＧＦｂｕｆ：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＧＧＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ（配列番号２１）。
１つの実施形態では、本発明において用いられる細胞膜溶解性ペプチド成分は、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有する。
１つの実施形態では、本発明において用いられる抗がん標的ペプチドは、がん細胞高発現受容体特異的結合配列を有し、前記溶解性ペプチド成分は、がん細胞膜溶解型配列を有し、スペーサーを有する。
１つの実施形態では、本発明において用いられる溶解性ペプチド成分は、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有する。
１つの実施形態では、本発明において用いられるスペーサーは、Ｇ、Ｐからなる０〜５アミノ酸の配列である。
１つの局面において、本発明は、ＥＧＦ受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドまたは細胞溶解性ペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
１つの実施形態において、本発明において使用されるＥＧＦ受容体結合ペプチドは、アミノ酸配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号７；ここで、アルファベットは、アミノ酸の１文字表示である。）またはその改変配列を有するものである。
１つの実施形態において、本発明において使用されるＥＧＦ受容体結合ペプチドは、
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸である。
好ましい実施形態では、Ｘ１は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸である。
さらに好ましい実施形態では、Ｘ１は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するＲもしくはＫであるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似するＹ、ＦもしくはＨであるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似するＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するＮであるアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似するＧ、Ａ、ＬもしくはＩであるアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似するＧ、Ａ、ＶもしくはＬであるアミノ酸である。
さらにこのましい実施形態では、Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するＲもしくはＫであるアミノ酸である。
さらに好ましい実施形態では、本発明のキメラペプチドは、ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号９）またはＹＫＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号１０）という配列を有する。
１つの実施形態において、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、前記細胞殺傷性ペプチドは、細胞膜溶解性ペプチド、細胞膜電位不安定化ペプチド、細胞膜溶解ペプチドおよびミトコンドリア膜崩壊ペプチドからなる群より選択される。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜溶解性ペプチドは、ＫおよびＬのみからなる１０〜２０個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合である。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜溶解性ペプチドは、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４８、具体的には配列番号１または２７など）であり、該アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合である。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜電位不安定化ペプチドは、ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ（配列番号１１）である。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞膜溶解ペプチドは、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ（配列番号１２）またはＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ（配列番号１３）である。
好ましい実施形態では、本発明において使用されるミトコンドリア膜崩壊ペプチドは、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４）である。
１つの実施形態では、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有する。
好ましい実施形態では、本発明において使用されるプラスチャージを持つアミノ酸は、Ｋ、ＲまたはＨである。
好ましい実施形態では、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＦである。
さらに好ましい実施形態では、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１）であり、ここで、各アミノ酸はＬ体またはＤ体であり、下線は、Ｄ体を示す。
１つの実施形態において、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有する。
１つの実施形態において、本発明において使用されるプラスチャージを持つアミノ酸は、Ｋ、ＲまたはＨである。
１つの実施形態において、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＦである。
１つの実施形態において、本発明において使用される疎水性アミノ酸は、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１）であり、ここで、各アミノ酸はＬ体またはＤ体であり、下線は、Ｄ体を示す。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、スペーサーペプチドをさらに有する。
１つの実施形態において、本発明において使用されるスペーサーペプチドはグリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）の０〜４個純粋または混合して連なった配列を示し、好ましくはＧＧＧである。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号２）の配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４３）の配列を有する。ここで、下線は、Ｄ体を示す。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、インターロイキン４（ＩＬ−４）受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮ（配列番号２６）またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮ（配列番号２８）またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）受容体結合ペプチドであり、アミノ酸配列ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲ（配列番号２９）またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチドであり、アミノ酸配列ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶ（配列番号３０）、ＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号５２）、ＡＬＶＲＹＫＤＰＬＦＶＷＧＦＬ（配列番号５３）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号５４）、ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ（配列番号５５）、ＤＴＤＭＣＷＷＷＳＲＥＦＧＷＥＣＡＧＡＧ（配列番号５６）またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、血管上皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）結合ペプチドであり、アミノ酸配列ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬＧ（配列番号３１）、ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−ＮＨ２（配列番号３２）もしくはＧＧＮＥＣＤＡＩＲＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ（配列番号３３）またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴｆＲ）結合ペプチドであり、アミノ酸配列ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号３４）またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドにおける受容体結合ペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）結合ペプチドであり、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号５）またはＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号６）であるか；ニューロピリン１（ＮＲＰ１）／血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）結合ペプチドであり、ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号３６）であるか；エフリンＢ１（ＥｐｈＢ１）結合ペプチドであり、ＥＷＬＳ（配列番号３７）であるか；エフリンＢ２（ＥｐｈＢ２）結合ペプチドであり、ＳＮＥＷ（配列番号３８）であるか；インターロイキン１１受容体（ＩＬ１１Ｒ）結合ペプチドであり、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（環状）（配列番号２２）であるか；グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）結合ペプチドであり、ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ（配列番号３９）またはＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（環状）（配列番号４０）であるか；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ペプチドであり、ＣＱＫＨＨＮＹＬＣ（配列番号３５）であるか、あるいは、これらの改変配列である。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号２、１４、２１、４２および４３からなる群より選択される配列またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１５に示す配列またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１６に示す配列またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１７に示す配列またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１８または４４またはその改変配列に示す配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１９に示す配列またはその改変配列を有する。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号２０、４６または４７に示す配列またはその改変配列を有する。
１つの局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドをコードする核酸を提供する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドをコードする核酸を含む細胞に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを含む医薬、好ましくは医薬組成物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを含む抗がん剤に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドの、医薬組成物の製造のための使用に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドの、抗がん剤の製造のための使用に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを投与する工程を包含する治療方法に関する。
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを投与する工程を包含するがんの治療方法に関する。
１つの局面において、本発明は、本発明のＥＧＦ受容体結合ペプチドがターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬のスクリーニング方法に関する。
１つの局面において、本発明は、本発明のＥＧＦ受容体結合ペプチドがターゲットとするアミノ酸配列を用いる、抗がん剤のスクリーニング方法に関する。
様々な種類のキメラポリペプチドの創作が試みられているところ、本発明は、最も近い先行技術（Ｅｌｌｅｒｂｙ ＨＭ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｅｌｌｅｒｂｙ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９；５：１０３２−８；Ｐａｐｏ Ｎ，Ｓｈａｉ Ｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３；４２，：９３４６−５４；およびＰａｐｏ Ｎ，Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｅｓｈｈａｒ Ｚ，Ｓｈａｉ Ｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：５７７９−８６）との対比において、がん細胞膜溶解型ペプチド単独に比べ、本発明によるキメラ化によりがん細胞標的化、がん細胞に対する殺細胞効果の増強さらにはその即効性を実現した点顕著な効果であるということができる。すなわち、もう一つの最も近い先行技術である細菌毒素ベースのイムノトキシンを利用したがんに向けてターゲティングするアプローチは魅力的ではあるが、細菌毒素に起因する肝毒性と、毒素タンパク質により引き起こされる免疫原性により、その使用が制約を受ける（非特許文献２，４，６）。さらに、イムノトキシンの分子サイズは、一般に、化合物またはフラグメント抗体薬物に比べて大きく、薬物が、ヒトの体内の腫瘍塊へと効率的に浸透することを妨げ得る（非特許文献２，４，６）。これらの文献は、単にイムノトキシン等の蛋白製剤の問題点を提示しているだけであり、なんら解決手段を提示していない。この問題を克服するために、進化したアプローチを有する新世代のイムノトキシンが、確実に必要とされる。
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
細胞内安定性や正常細胞への機能障害などから副作用を避けることができ、あるいは即効性のある抗がん剤またはＤＤＳとして使用可能な物質が提供される。
図１Ａは、各種ヒトがん細胞株における、ＥＧＦＲ結合（ＥＢ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみの殺細胞効果を示す。がん細胞株Ｈ３２２、ＢＴ−２０、Ｈ４６０、Ｕ２５１、ＢｘＰＣ−３、ＳＵ．８６．８６、またはＬＮＣａＰを、種々の濃度（０〜３０μＭ）のＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドと共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。これらの結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表し、このアッセイを３回繰り返した。黒丸、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド；白丸、溶解性ペプチド。 図１Ｂは、各種ヒト正常細胞株における、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみの殺細胞効果を示す。正常細胞株ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８またはＨＥＫ２９３を、種々の濃度（０〜１００μＭ）のペプチドと共に７２時間培養し、そして細胞傷害活性を評価した。これらの結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表し、このアッセイを３回繰り返した。黒丸、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド；白丸、溶解性ペプチド。 図１Ｃは、各種ヒトがん細胞および正常細胞における、ＥＢ−オリジナルの溶解性キメラペプチドまたはオリジナルの溶解性ペプチドのみの殺細胞効果を示す。がん細胞株Ｈ３２２、ならびに正常細胞株ＭＲＣ−５を、種々の濃度（０〜３０μＭ）のＥＢ−オリジナル溶解性キメラペプチドまたはオリジナル溶解性ペプチドのみと共に培養し、そして、上述のようにして細胞傷害性アッセイを行った。黒丸、ＥＢ−オリジナル溶解性キメラペプチド；白丸、オリジナル溶解性ペプチド。 図１Ｄは、ＣＤスペクトルを用いた新規キメラペプチドの設計および二次構造解析を示す。上段は、ＰａｐｏおよびＳｈａｉにより報告された溶解型ペプチド（オリジナル溶解性ペプチド）（ａ）または新たに設計した溶解性ペプチド（ｂ）に結合させたＥＧＦＲ結合（ＥＢ）ペプチドのＳｃｈｉｆｆｅｒ Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎのホイール投影図を示す。ペプチド配列の下線を付した斜体文字は、Ｄ体アミノ酸を示す。ホイールダイアグラム内の太字は、親水性アミノ酸（主にＬｙｓ）を示す。矢印は、これらのペプチドの親水性表面の方向を示す。ＰＣ ＳＵＶまたはＰＣ／ＰＳ（４：１）ＳＵＶの存在下での、ＥＢ−オリジナル溶解性ペプチド（ｃ）およびＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（ｄ）のＣＤスペクトル。ペプチドおよび脂質の濃度は、それぞれ、５０μＭおよび４ｍＭであった。 図１Ｅは、ｋ−ｒａｓ変異がん細胞株のチロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）に対する耐性を示す。ｋ−ｒａｓ野生型がん細胞株（Ｈ３２２（黒丸）およびＢＴ−２０（黒三角））およびｋ−ｒａｓ変異がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（白丸）、ＨＣＴ１１６（白三角）、ＳＷ８３７（白菱形）およびＤＬＤ−１（×印））を、種々の濃度のエルロチニブ（左；０〜８０μＭ）または抗ＥＧＦＲ抗体（右；０〜２０μｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。縦軸は、コントロールに対する細胞生存率（％）、横軸は、エルロチニブ（左）および抗ＥＧＦＲ抗体（右）の濃度を示す。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。 図１Ｆは、ｋ−ｒａｓ野生型細胞株におけるＴＫＩとＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドとの間の細胞傷害性の比較を示す。がん細胞株(Ｈ３２２、ＢＴ−２０およびＢｘＰＣ−３）および肺正常細胞株（ＭＲＣ−５）を、種々の濃度のＴＫＩ（エルロチニブ（白丸）、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（白三角）およびＰＤ１５３０３５（白菱形）；０〜２０μＭ）またはＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒丸；０〜２０μＭ）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。縦軸は、コントロールに対する細胞生存率（％）、横軸は、ＴＫＩおよびＥＢ−ｌｙｔｉｃの濃度（μＭ）を示す。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。 図１Ｇは、ＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドでの処理が、ｋ−ｒａｓ変異を持つＴＫＩ耐性がん細胞株に対して十分な細胞傷害活性を及ぼすことを示す。４種のｋ−ｒａｓ変異がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、種々の濃度のＴＫＩ（エルロチニブ（白丸）、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（白三角）およびＰＤ１５３０３５（白菱形）；０〜２０μＭ）またはＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒丸；０〜２０μＭ）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。縦軸は、コントロールに対する細胞生存率（％）、横軸は、ＴＫＩおよびＥＢ−ｌｙｔｉｃの濃度（μＭ）を示す。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。 図２Ａは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる殺細胞効果の増強は、ＥＧＦＲの細胞表面での発現に依存することを示す。７種のがん細胞株および３種の正常細胞株における、ＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＩＣ５０（左）、溶解性ペプチドのＩＣ５０（中央）、または、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドに対する溶解性ペプチドのＩＣ５０の比（右）の、ＥＧＦＲ抗体結合の相対的な平均蛍光強度との相関性。 図２Ｂは、ＢｘＰＣ−３細胞に対するＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド殺細胞効果をＥＧＦＲ抗体または組換えＥＧＦタンパク質添加により阻害できることを示す。ＢｘＰＣ−３細胞に対するＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの殺細胞効果の阻害を、ペプチドに対して曝露する１時間前に、ポリクローナル抗ＥＧＦＲ抗体または組換えＥＧＦタンパク質を加えることによって評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図３Ａは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドおよび溶解性ペプチドに対するＥＧＦＲタンパク質への結合特性を示す。段階希釈したＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（２７μＭ〜１３μＭ）または溶解性ペプチド（２４μＭ〜１２μＭ）のサンプルを、センサー表面上で解析した。 図３Ｂは、溶解性ペプチド単独に対するＨ３２２細胞またはＭＲＣ−５細胞から抽出した細胞表面膜タンパク質への結合についての相互作用プロファイルを示す。段階希釈した膜タンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．０２５ｍｇ／ｍｌ）のサンプルをセンサー表面上で解析した。 図３Ｃは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドに対するＨ３２２細胞またはＭＲＣ−５細胞から抽出した細胞表面膜タンパク質への結合についての相互作用プロファイルを示す。段階希釈した膜タンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．０２５ｍｇ／ｍｌ）のサンプルをセンサー表面上で解析した。 図３Ｄは、Ｈ３２２細胞、ＢＴ−２０細胞またはＭＲＣ−５細胞から抽出した細胞表面膜タンパク質に対する、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒色の柱）または溶解性ペプチドのみ（白色の柱）の相対的なＫＤ値を示す。 図４Ａは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドは、がん細胞の迅速な殺傷を誘導することを示す。Ｈ３２２細胞およびＢＴ−２０細胞を、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒色の柱）または溶解性ペプチド（白色の柱）で、１０分間、３０分間、１時間、または４８時間処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに４８時間培養した。これらの細胞を、ＷＳＴ−８により細胞の生存率について解析した。 図４Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞におけるＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる細胞膜の透過化を示す。１０μＭの最終濃度でＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド−ＴＡＭＲＡを加えてから、０分後、２分後、５分後、１０分後および２０分後の、カルセイン溶液中の細胞（３×１０４細胞／ｍｌ）。矢印および矢じりは、それぞれ、透過された細胞と、膜を透過したペプチドとを示す。 図４Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞における溶解性ペプチドによる細胞膜の透過化を示す。１０μＭの最終濃度で溶解性ペプチド−ＴＡＭＲＡを加えてから、０分後、２分後、５分後、１０分後および２０分後の、カルセイン溶液中の細胞（３×１０４細胞／ｍｌ）。 図４Ｄは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる細胞増殖の阻害を示す。Ｈ３２２細胞を、種々の濃度（０〜２２．５μＭ）のＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを含む培地中で１０日間培養した。クリスタルバイオレットで染色した後、少なくとも５０個の細胞から構成されるコロニーをスコア付けし、そして、この結果を、コロニー数に基づき、未処理細胞に対する割合として表す。未処理細胞は、１１７±１０コロニーを形成した。データは、二連の測定の平均である；バーは、ＳＤを示す。 図５は、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドは、がん細胞においてカスパーゼ活性化及びアネキシンＶ陽性化を誘導することを示す。ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（５μＭ）と共にインキュベートしたＢＴ−２０細胞を、２時間後に、緑色チャネルにおいて、二色フローサイトメトリーによりアネキシンＶ標識（上のパネル）について、または、ＤＥＶＤａｓｅ活性によりカスパーゼ活性（下のパネル）について、そして、赤色チャネルにおいてＰＩ染色について解析した。数値は各四分割面における細胞の割合を示す。 図６は、Ｈ３２２肺がん細胞のインビトロ細胞増殖阻害を示す。Ｈ３２２細胞を、種々の濃度（０〜２２．５μＭ）のＥＢ−キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみを含む培地中で１０日間培養した。クリスタルバイオレットで染色した後、少なくとも５０個の細胞からなるコロニーをスコア付けし、結果をコロニー数の割合として表す（１００％、未処理の細胞）。未処理の細胞は、１１７±１０のコロニーを形成した。データは、二連の測定の平均である；バーは標準偏差である。 図７Ａは、ＥＧＦＲ結合配列変異体ペプチドとリコンビナントヒトＥＧＦＲとの結合親和性ＢＩＡＣＯＲＥ解析結果を示す。野生型ＥＧＦＲ結合ペプチド配列中の電荷を有する２番目のＨについてＫとＲの変異体を化学合成し、ＢＩＡＣＯＲＥのバイオセンサー応答の増強を指標としてＥＧＦＲとの結合親和性を評価した。 図７Ｂは、ＥＧＦＲとの結合親和性が高かったＲ変異体ペプチドとがん細胞膜溶解ペプチド単独との殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト肺がん細胞株Ｈ３２２を、段階希釈した濃度の２種類のペプチド（０〜３０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。これらの結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表し、このアッセイを３回繰り返した。三角、ＥＢ−キメラペプチド；黒丸、Ｒ変異体ＥＢ−キメラペプチド；白丸、膜溶解性ペプチド。 図８Ａは、ＩＬ４Ｒ結合ペプチドおよびスクランブル配列ペプチドに対するリコンビナントヒトＩＬ４Ｒへの結合特性を示す。段階希釈したＩＬ４Ｒ結合ペプチド（２９μＭ〜７．４μＭ）のサンプルを、センサー表面上で解析した。 図８Ｂは、ＩＬ４Ｒ標的化がん細胞膜溶解キメラペプチド（ＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ；四角）とがん細胞膜溶解ペプチド単独（ＬｙｔｉｃＬ；菱形）との殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（左）およびヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３（右）を、段階希釈した濃度の２種類のペプチド（０〜１０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。 図８Ｃは、ＩＬ４Ｒ標的化がん細胞膜溶解キメラペプチド（ＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ）は、がん細胞の迅速な殺傷を誘導することを示す。ＢｘＰＣ−３細胞を、１０μＭのＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ（黒色の柱）またはＬｙｔｉｃＬ（灰色の柱）で、２分間、５分間、１０分間、３０分間、または１時間処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに４８時間培養した。これらの細胞を、ＷＳＴ−８により細胞の生存率について解析した。 図９Ａは、ＩＬ１３Ｒ結合ペプチドおよびスクランブル配列ペプチドに対するリコンビナントヒトＩＬ１３Ｒへの結合特性を示す。段階希釈したＩＬ１３Ｒ結合ペプチド（２４μＭ〜６．０μＭ）のサンプルを、センサー表面上で解析した。 図９Ｂは、ＩＬ１３Ｒ標的化がん細胞膜溶解キメラペプチド（ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ）とがん細胞膜溶解ペプチド単独（ＬｙｔｉｃＬ）との殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ２５１（左）およびヒト頭頚部がん細胞株ＨＮ−１２（右）を、段階希釈した濃度の２種類のペプチド（０〜２０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。菱形、ＬｙｔｉｃＬ；四角、ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ。 図９Ｃは、ＩＬ１３Ｒ標的化がん細胞膜溶解キメラペプチド（ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ）は、がん細胞の迅速な殺傷を誘導することを示す。Ｕ２５１細胞を、１０μＭのＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ（黒色の柱）またはＬｙｔｉｃＬ（灰色の柱）で、２分間、５分間、１０分間、３０分間、または１時間から２４時間まで処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに４８時間培養した。これらの細胞を、ＷＳＴ−８により細胞の生存率について解析した。 図１０Ａは、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）結合ペプチドおよびスクランブル配列ペプチドに対するリコンビナントヒトＮＲＰ１への結合特性を示す。段階希釈したＮＲＰ１結合ペプチド（２４μＭ〜６．０μＭ）のサンプルを、センサー表面上で解析した。 図１０Ｂは、ＮＲＰ１標的化がん細胞膜溶解キメラペプチド（Ｓｅｍａ３Ａ−ＬｙｔｉｃＬ；黒丸）とがん細胞膜溶解ペプチド単独（ＬｙｔｉｃＬ；白丸）との殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト膵臓がん細胞株ＳＵ８６８６（左）およびヒト乳がん細胞株ＳＫＢＲ−３（右）を、段階希釈した濃度の２種類のペプチド（０〜１０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。 図１１Ａは、細胞膜溶解・核酸結合配列（ｂｕｆ；白丸）とそのＥＧＦＲ標的化キメラペプチド（ＥＧＦｂｕｆ；黒丸）との殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト肺がん細胞株Ｈ３２２（左）およびヒト前立腺がん細胞株ＤＵ１４５（右）を、段階希釈した濃度の２種類のペプチド（０〜３０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。これらの結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。 図１１Ｂは、上記ＥＧＦＲ標的化キメラペプチド（ＥＧＦｂｕｆ）の殺細胞効果を肺がん細胞株Ｈ３２２（白丸）と肺正常細胞株ＭＲＣ−５（黒丸）で比較した結果を示す。２つの細胞を、段階希釈した濃度のＥＧＦｂｕｆペプチド（０〜２０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。これらの結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。 図１２ＡおよびＢは、がん細胞膜溶解性配列（ＤＬ混合、実施例１と同じ配列）単独と３種類のがん細胞高発現受容体結合配列（ｈｅｒ２，ＶＥＧＦ受容体、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ受容体）による標的化キメラペプチドの殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト肺がん細胞株Ｈ３２２（図１２Ａ）またはヒト肺正常細胞株ＭＲＣ−５（図１２Ｂ）を、段階希釈した濃度の上記４種類のペプチド（０〜８０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。黒三角、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃ；白丸、Ｈｅｒ２−Ｌｙｔｉｃ；白三角、ＶＥＧＦＲ１−Ｌｙｔｉｃ；黒丸、Ｌｙｔｉｃ。 図１２ＡおよびＢは、がん細胞膜溶解性配列（ＤＬ混合、実施例１と同じ配列）単独と３種類のがん細胞高発現受容体結合配列（ｈｅｒ２，ＶＥＧＦ受容体、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ受容体）による標的化キメラペプチドの殺細胞効果の比較結果を示す。ヒト肺がん細胞株Ｈ３２２（図１２Ａ）またはヒト肺正常細胞株ＭＲＣ−５（図１２Ｂ）を、段階希釈した濃度の上記４種類のペプチド（０〜８０μＭ）と共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬を用いて殺細胞効果を評価した。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。黒三角、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃ；白丸、Ｈｅｒ２−Ｌｙｔｉｃ；白三角、ＶＥＧＦＲ１−Ｌｙｔｉｃ；黒丸、Ｌｙｔｉｃ。 図１３は、ヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３担がんマウスモデルにおける実施例１と同じＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍効果を示す。ヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３をヌードマウスの皮下に移植し、移植５日後から週３回で３週間、腫瘍内投与した。各群４匹の平均±ＳＤ（バー）として表した。白丸は溶媒投与群、白三角はＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド０．３ｍｇ／ｋｇ投与群、黒丸はＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド１ｍｇ／ｋｇ投与群である。 図１４は、ヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３担がんマウスモデルにおける実施例１と同じＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド全身投与の抗腫瘍効果を示す。ヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３をヌードマウスの皮下に移植し、移植５日後から週３回で３週間、静脈内投与した。各群３匹の平均±ＳＤ（バー）として表した。白丸は生理食塩水投与群、白三角はＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド１ｍｇ／ｋｇ投与群、黒丸はＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド５ｍｇ／ｋｇ投与群である。 図１５Ａは、ヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３担がんマウスモデル（上）およびヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担がんマウスモデル（下）における実施例１と同じＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍効果を示す。ＢｘＰＣ−３膵臓がん細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール（白丸））またはＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（２ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、５ｍｇ／ｋｇ（白四角）または１０ｍｇ／ｋｇ（黒三角））のいずれかを静脈内注射した。各群は６匹の動物（ｎ＝６）から構成され、そして、実験は２回繰り返した。データは平均±ＳＤとして表す。 図１５Ｂは、静脈内処置後の無胸腺ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の縮小を示す。マウスの背側部にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植し、生着後に、生理食塩水（左パネル）またはＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（右パネル）の静脈内注射により処置した。矢印は腫瘍の位置を示す。 図１５Ｃは、実施例１と同じＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドでの処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の組織学的検査を示す。生理食塩水（左パネル）またはＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（右パネル）で処置した動物からの腫瘍のホルマリン固定し、パラフィン包埋した切片を、ヘマトキシリン染色し、そして、光学顕微鏡により解析した。 図１６Ａは、ＢＩＡＣＯＲＥシステムを用いた結合解析を示す。 図１６Ｂは、ＣＤスペクトルを用いたＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（点線）およびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド（実線）の二次構造解析を示す。ペプチド濃度は５０μＭであった。 図１６Ｃは、ＢＴ２０細胞におけるＬｙｔｉｃペプチド（菱形）、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（四角）、およびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド（三角）の細胞傷害性を示す。 図１７Ａは、新たに設計したＬｙｔｉｃペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることを示す。がん細胞株Ｈ３２２、ＢＴ−２０、Ｕ２５１、ＢｘＰＣ−３、ＳＵ８６８６およびＬＮＣａｐを、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒丸）またはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（白丸）と共に培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。 図１７Ｂは、各種ヒト正常細胞株における、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ＬｙｔｉｃキメラペプチドまたはＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドの細胞傷害性を示す。正常細胞株ＭＲＣ−５およびＨＥＫ２９３を、種々の濃度（０〜２０μＭ）の上記ペプチドと共に培養し、細胞傷害活性を評価し、そして、上記のように細胞傷害性アッセイを行った。白丸、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド；黒丸、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド。 図１８は、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、細胞膜を崩壊させてがん細胞の迅速な殺傷を誘導することを示す。Ｈ３２２細胞を、各々１０μＭのＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（白色の柱）またはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒色の柱）で、２分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間または２４時間処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに２４時間細胞を培養した。ＷＳＴ−８を用いて、細胞生存率を解析した。結果は、平均±ＳＤ（バー）として表す。 図１９Ａは、Ｈ３２２肺癌細胞におけるＬｙｔｉｃペプチドによる細胞膜の透過の様子を示す。１０μＭの最終濃度で溶解性ペプチドを加えてから、０分、２分、５分、１０分、２０分後のカルセイン溶液中の細胞の共焦点顕微鏡像。上段から順に、Ｌｙｔｉｃペプチド単独、ＥＢ−ＬｙｔｉｃペプチドおよびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドの像を示す。これらの写真から、Ｌｙｔｉｃペプチド単独では緑色になった細胞（膜が破壊された細胞）の数が時間が経過しても変化していないのに対し、ＥＢ−ＬｙｔｉｃペプチドおよびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドでは、緑色になった細胞の数が時間と共に増加しており、さらに、その数は、ＥＢ−ＬｙｔｉｃペプチドよりもＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドのほうが短時間で多くなることがわかる。 図１９Ｂは、細胞に培地の流入量の割合を図１９Ａの結果から計算した時間経過後との割合を示したグラフである。この図からも、細胞に培地が流入した割合が、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド（白四角）のほうが、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（黒四角）よりも迅速であることがわかる。 図２０Ａは、がん細胞においてＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドが、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドよりも強くアネキシンＶ陽性化を誘導することを示す。ヒト乳がん細胞株ＢＴ２０細胞をＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド、またはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド（各々、５μＭ）と共に３７℃で２時間インキュベートし、アネキシンＶ標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。 図２０Ｂは、がん細胞においてＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドが、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドよりも強くカスパーゼ３＆７活性を誘導することを示す。ヒト乳がん細胞株ＢＴ２０細胞をＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド、またはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド（各々、５μＭ）と共に３７℃で２時間インキュベートし、カスパーゼ３＆７標識についてカルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡポリカスパーゼアッセイにより解析した。 図２１は、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担がんマウスモデルにおける、ＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドとＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植し、グラフに矢印で示すように、移植の５日後から、生理食塩水（コントロール；黒丸）、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（１ｍｇ／ｋｇ；四角）または、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１ｍｇ／ｋｇ；三角）のいずれかを静脈内注射した。各群は６匹の動物（ｎ＝６）から構成されている。縦軸は腫瘍容積（ｍｍ３）を示し、横軸は乳がん細胞移植後の日数（日）を示す。データは平均±ＳＤとして表す。ＥＢペプチドの２番目をＨからＲに変えたキメラペプチド（ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ）の方がｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果がＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（ＥＢ−Ｌｙｔｉｃ）に比べて高いことがわかる。 図２２Ａは、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることを示す。がん細胞株Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫＢＲ−３を、種々の濃度（０〜３０μＭ）のＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（白四角）またはＬｙｔｉｃペプチド（黒四角）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。 図２２Ｂは、種々の正常細胞株における、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞傷害性を示す。正常細胞株ＭＲＣ−５、ＰＥおよびＨＣを、種々の濃度（０〜１００μＭ）の上記ペプチドと共に７２時間培養し、そして、細胞傷害活性を評価した。未処理の細胞から得た絶対値を１００％とした。黒四角、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド；白四角、Ｌｙｔｉｃペプチド。 図２３は、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを加えることによる細胞傷害性の増強についてのＩＣ５０値間の相関性を示す。ＴｆＲ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＩＣ５０（Ａ）およびＬｙｔｉｃペプチドのＩＣ５０（Ｂ）、またはＬｙｔｉｃペプチド／ＴｆＲ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＩＣ５０比（Ｃ）、ならびに、７種のがん細胞株についてのＴｆＲモノクローナル抗体結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。 図２４Ａは、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチドが、細胞膜を崩壊させてＴ４７Ｄがん細胞を迅速に殺傷することを示す。Ｔ４７Ｄ細胞を、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒色の柱）またはＬｙｔｉｃペプチド（白色の柱）で、種々の時間（１〜１８０分）にわたりペプチドを曝露し、一定時間の暴露後に新しい培地に置換し、最終的に７２時間細胞を培養し、ＷＳＴ−８を用いて細胞生存率を解析した。結果は、平均±ＳＤ（バー）として表す。 図２４Ｂは、Ｔ４７Ｄ乳がん細胞におけるＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる膜の透過化を示す。１０μＭの濃度でＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを加えてから、０分後、５分後、１０分後および１５分後の、カルセイン溶液中の細胞。矢印は、透過された細胞および膜を透過したペプチドを示す。 図２５Ａは、がん細胞株に対するＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞生存性の阻害を示す。ペプチド（５μＭ）処理前に、Ｔ４７Ｄ細胞を増大する濃度の抗ＴｆＲモノクローナル抗体（黒色の柱）または非特異的なマウスＩｇＧ１（アイソタイプコントロール；白色の柱）と共に３時間インキュベートした。 図２５Ｂは、がん細胞株に対するｓｉＲＮＡまたはスクランブルの配列（ｓｃ）ＲＮＡの細胞傷害性を示す。Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ｓｉＲＮＡまたはｓｃＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションから４日後に、フローサイトメトリー解析により細胞における標的遺伝子のレベルを解析した（データ示さず）。ＷＳＴ−８試薬を用いて阻害率を評価した。アッセイは３回繰り返し、結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。 図２６Ａは、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、がん細胞においてアネキシンＶ陽性化を誘導したことを示す。Ｔ４７Ｄ細胞およびＰＥ細胞を、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１０μＭ）および溶解性ペプチド（１０μＭ）と共にインキュベートし、２時間後に、緑色チャネルにおいて、アネキシンＶ陽性化について、そして、赤色チャネルにおいては、ヨウ化プロピジウム染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。 図２６Ｂは、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、がん細胞においてカスパーゼ活性化を誘導したことを示す。Ｔ４７Ｄ細胞およびＰＥ細胞を、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１０μＭ）および溶解性ペプチド（１０μＭ）と共にインキュベートし、２時間後に、緑色チャネルにおいて、カスパーゼ３＆７活性について、そして、赤色チャネルにおいては、ヨウ化プロピジウム染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。 図２６Ｃは、がん細胞株における種々の溶解性ペプチドの作用の比較を示す。ミトコンドリア膜貫通型電位依存性蛍光色素ＪＣ−１で標識したＴ４７Ｄ細胞を、未処理のまま（処理なし：上左パネル）か、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（コントロールミトコンドリア膜電位：上右パネル）もしくは、溶解性ペプチド（下左パネル）、もしくはＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（下右パネル）で処理し、その２時間後に、フローサイトメトリーにより、膜貫通電位を示す赤色蛍光または緑色蛍光の変化における差示的な割合を解析した。 図２６Ｄは、種々の溶解性ペプチドで処理した細胞におけるチトクロムｃの放出のウェスタンブロット解析を示す。Ｔ４７Ｄ細胞を、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１０μＭ）および溶解性ペプチド（１０μＭ）と共にインキュベートし、２時間後に細胞質抽出物を単離し、そして、チトクロムｃに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析により、チトクロムｃの放出を調べた。 図２７Ａは、インビボでのＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（腫瘍内注射）の抗腫瘍活性を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール（黒丸））またはＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチド（０．３ｍｇ／ｋｇ（黒菱形）、１ｍｇ／ｋｇ（白三角）または３ｍｇ／ｋｇ（白四角））のいずれかを腫瘍内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。データは平均±ＳＤとして表す。 図２７Ｂは、インビボでのＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（静脈内注射）の抗腫瘍活性を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール（黒丸））またはＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチド（０．５ｍｇ／ｋｇ（白三角）、１ｍｇ／ｋｇ（黒菱形）、２ｍｇ／ｋｇ（白四角）または５ｍｇ／ｋｇ（白丸））のいずれかを静脈内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。データは平均±ＳＤとして表す。 図２８は、インターロイキン−４（ＩＬ４）およびインターロイキン−４レセプターα鎖（ＩＬ−４Ｒα）の三次元複合構造を示す。（Ａ）ＩＬ４およびＩＬ−４Ｒαの全体的な構造。（Ｂ）ＩＬ４とＩＬ−４Ｒαとの界面の部位を拡大した領域。ＩＬ４をＩＬ−４Ｒαに結合させる重要な残基を黒文字で示す。 図２９は、Ｌ，Ｄ型溶解性ペプチドに結合させた設計したキメラペプチド［ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）］の、正常細胞とがん細胞との間の選択的な毒性を示す。正常細胞株ＷＩ−３８（Ａ，Ｂ）およびがん細胞株ＫＣＣＴ８７３（Ｃ，Ｄ）を、種々の濃度（０〜３０μＭ）のＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ）キメラペプチド、溶解性（Ｌ）ペプチド、ＩＬ−４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチド、または、溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチドと共に７２時間培養した。ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。白四角、溶解性（Ｌ）ペプチド；黒四角、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ）ペプチド；白三角、溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチド；黒三角、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）ペプチド。 図３０は、がん細胞株の細胞表面におけるＩＬ−４Ｒα発現の検出を示す。Ａ１７２、ＢｘＰＣ−３、および正常細胞株ＨＥＫ２９３からの総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで、ＩＬ−４Ｒα特異的プライマーを用いた定量的ＰＣＲにより検出した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として用いた。 図３１は、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドが、がん細胞を迅速に殺傷することを示す。ＰＥ細胞（Ａ）、ＫＣＣＴ８７３細胞、ＢｘＰＣ−３細胞（Ｂ）を、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチド（黒色の柱）または溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチド（白色の柱）で、２分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、または２時間処理した。ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに７２時間細胞を培養した。ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞生存率を決定した。結果は、平均±ＳＤ（バー）として表す。 図３２は、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドが、がん細胞のアネキシンＶ陽性を誘導することを示す。正常細胞であるＰＥ（上段）、およびがん細胞であるＫＣＣＴ８７３（下段）を、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドまたは溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチド（１０μＭ）と共に２時間インキュベートし、次いで、緑色チャネルにおいてアネキシンＶ標識について、そして、赤色チャネルにおけるＰＩ染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。各四分区画における細胞の割合を示す。 図３３Ａは、インビボでのＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチド（腫瘍内注射）の抗腫瘍活性を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール（白菱形））またはＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）ペプチド（０．５ｍｇ／ｋｇ（黒四角）または２ｍｇ／ｋｇ（黒三角））のいずれかを腫瘍内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。 図３３Ｂは、インビボでのＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチド（静脈内注射）の抗腫瘍活性を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール（白菱形））またはＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）ペプチド（２ｍｇ／ｋｇ（黒四角）または５ｍｇ／ｋｇ（黒丸））のいずれかを静脈内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。データは平均±ＳＤ（バー）として表す。 図３４Ａは、種々の細胞株についてのＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃの細胞傷害活性を示す。膵臓細胞株を、種々の濃度（０〜５０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃペプチドまたはｎＬｙｔｉｃペプチドのみと共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。菱形、ｎＬｙｔｉｃペプチド；四角、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３６３−３７７）ペプチド；三角、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３７１−３７７）ペプチド。 図３４Ｂは、種々の細胞株についてのＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃの細胞傷害活性を示す。乳がん細胞を、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３７１−３７７）またはＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３６３−３７７）と共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。アッセイは３回繰り返し、結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。四角、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３６３−３７７）ペプチド；三角、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３７１−３７７）ペプチド。 図３４Ｃは、種々の細胞株についてのＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃの細胞傷害活性を示す。２種類の細胞（左、ＨｕＣＣＴ１；右、ＨＥＫ２９３Ｔ）を、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３６３−３７７）またはＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３７１−３７７）と共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。アッセイは３回繰り返し、結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。四角、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３６３−３７７）ペプチド；三角、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３７１−３７７）ペプチド。 図３５は、ＢＩＡＣＯＲＥを用いた、Ｓｅｍａ３Ａの野生型ペプチドおよびいくつかの変異ペプチドのニューロピリン−１（ＮＲＰ１）との相互作用の解析を示す。（Ａ）Ｓｅｍａ３Ａ野生型ペプチドのＮＲＰ１タンパク質への結合。段階希釈した種々の濃度（１．６μＭ、１３μＭ、２６μＭ）のＳｅｍａ３Ａ野生型ペプチドのサンプルを、パラレルセンサ表面上で解析した。（Ｂ）Ｓｅｍａ３Ａの野生型ペプチドおよび変異ペプチド（Ｒ３７２ＫおよびＲ３７２Ｋ／Ｒ３７７Ｋ）のＮＲＰ１タンパク質への結合。段階希釈した種々のＳｅｍａ３Ａペプチド（２６μＭ）のサンプルを、パラレルセンサ表面上で解析した。（Ｃ）種々のＳｅｍａ３ＡペプチドのＮＲＰ１タンパク質への結合能のまとめ。（Ｄ）Ｓｅｍａ３Ａの野生型ペプチドおよび変異ペプチドのペプチド配列。 図３６は、膵臓がん細胞株および乳がん細胞株におけるＮＲＰ１の発現を示す。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ解析による、いくつかの膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ−３、ＣＦＰＡＣ−１、Ｐａｎｃ−１およびＳＵ８６８６）および膵臓上皮細胞におけるＮＲＰ１の発現。（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ解析による、乳がん細胞株（ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ−３、Ｔ４７ＤおよびＺＲ−７５−１）におけるＮＲＰ１の発現。全てのＲＴ−ＰＣＲ解析において、β−アクチンをポジティブコントロールとして用いた。 図３７は、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃががん細胞においてアネキシンＶ陽性化を誘導することを示す。ＰＥ細胞（上パネル）およびＢｘＰＣ−３細胞（下パネル）を、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃペプチド（５μＭ）と共に３７℃で３時間インキュベートし、６時間後に、アネキシンＶ標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。 図３８Ａは、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃまたはｋＬｙｔｉｃ単独によるがん細胞に対する殺細胞効果のグラフを示す。４種類の膵臓がん細胞株（（ａ）ＢｘＰＣ−３、（ｂ）ＣＦＰＡＣ−１、（ｃ）Ｐａｎｃ−１および（ｄ）ＳＵ８６８６）を、種々の濃度のＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃ（四角）またはｋＬｙｔｉｃ（三角）と共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。縦軸は細胞生存率（％）を示し、横軸は、ペプチド濃度（μＭ）を示す。 図３８Ｂは、ｋＬｙｔｉｃ（三角）またはＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃ（四角）による正常細胞株に対する殺細胞効果のグラフを示す。３種類の正常細胞株（（ａ）ＰＥ、（ｂ）ＭＲＣ−５および（ｃ）ヒト正常肝細胞）を、種々の濃度のＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃまたはｋＬｙｔｉｃと共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。縦軸は細胞生存率（％）を示し、横軸は、ペプチド濃度（μＭ）を示す。 図３９Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ解析により見積もったいくつかの膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ−１、ＳＵ８６８６およびＣＦＰＡＣ−１）および膵臓上皮細胞におけるニューロピリン−１の発現を示す。全てのＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＧＡＰＤＨをポジティブコントロールとして用いた。 図３９Ｂは、リアルタイムＰＣＲによるニューロピリン−１の発現の定量を示す。図３９Ａのグラフに示されているそれぞれの細胞に対して、リアルタイムＰＣＲを用いて、ニューロピリン−１の発現の定量を行った。すべてのコントロールには、ＧＡＰＤＨを用いて解析を行った。 図４０は、ヒト膵臓がん細胞株ＳＵ８６８６細胞をＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチド（１０μＭ）と共に３７℃で３時間インキュベートし、アネキシンＶ標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。この結果から、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃも同様に、がん細胞に対して、アネキシンＶ陽性化を誘導することがわかる。 図４１は、ＶＥＧＦＲ２−ｌｙｔｉｃペプチドによるがん細胞および正常細胞に対する細胞傷害活性を示す。５種類のがん細胞株（ＯＥ１９（白三角）、Ｔ４７Ｄ（黒三角）、Ｂｘｐｃ３（白菱形）、Ｕ９３７（黒菱形）およびＬｎｃａｐ（×印））および２種類の正常細胞株（ＨＥＫ２９３（白丸）およびＭＲＣ−５（黒丸））を、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＶＥＧＦＲ２−ｌｙｔｉｃペプチドと共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。縦軸は細胞生存率（％）を示し、横軸は、ペプチド濃度（μＭ）を示す。アッセイは３回繰り返し、そして、結果は三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表す。ＶＥＧＦＲ２−ｌｙｔｉｃペプチドががん細胞特異的な細胞傷害活性を有することがわかる。
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）」とは、ＥＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子であり、歴史的には雄マウスの顎下腺に存在する生理活性物質として報告されたアミノ酸５３個からなる分子量約６千のポリペプチドで，分子内に６個のシステインからなる３つのジスルフィド結合を有するものが代表例である。当初，上皮細胞の増殖に特異的に働くとされていたが、非上皮系細胞にも作用し、さまざまな生物活性を示す。ＥＧＦとしては、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号等の遺伝子を代表例として挙げることができる：ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿００１９６３（ヒト）またはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １９５０。
本明細書において「上皮増殖因子受容体」「上皮増殖因子レセプター」「ＥＧＦ受容体」「ＥＧＦレセプター」（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）」は、交換可能に使用され、ＥＧＦをリガンドとするレセプターであり、トリ赤芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＡＥＶ）のゲノム中に存在するウイルスがん遺伝子の一つｖ−ｅｒｂＢとして発見された。ヒトゲノム中に存在する該当遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ１はＥＧＦＲ遺伝子である。その構造は、以下のとおりである。
すなわち、ＥＧＦ受容体は、単一ポリペプチドから成り、Ｎ末端側はリガンド結合部位を有する細胞外領域に続き、１回貫通型の膜貫通領域を形成している。Ｃ末端側はチロシンキナーゼ活性をもつ細胞内領域を形成しており、リガンドの結合によって受容体が会合し、結果としてチロシンキナーゼが活性化される。ヒトのＥＧＦ受容体は、分子質量約１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質で、このうちリガンド依存的に受容体の会合を引き起こす細胞外領域は、約９５ｋＤａの糖タンパク質である。（Ｏｇｉｓｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０ ：７７５−８７）。ＥＧＦＲに対するＥＧＦまたはＴＧＦ−αの結合は、シグナル伝達経路を活性化して、細胞増殖を生じる。二量体化、高次構造変化、およびＥＧＦＲ分子のインターナリゼーションは、細胞内シグナルを伝達して細胞増殖制御を生じるように機能する（Ｇ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４８：１９３−２１６）。成長因子受容体の制御に影響を及ぼす遺伝子変化により、受容体および／またはリガンドの過剰発現するように機能し、または導き、細胞増殖を生じることとなる。（Ｍ．−Ｊ．Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６：４７６０−４７６３）。なお、ＧｅｎＢａｎｋ＃は、ＮＭ＿００５２２８（ヒト）である。ＥＧＦＲとしては、このほか、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号等の遺伝子を代表例として挙げることができる：Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １９５６。
本明細書において「標的結合」ペプチド、「標的結合」配列とは、標的（たとえば、ＥＧＦ受容体、または他の標的物など）に結合するペプチドまたは配列をいう。たとえば、がん細胞高発現受容体特異的結合配列を挙げることができる。
本明細書において「がん細胞高発現受容体特異的結合配列」とは、がん細胞に高発現する受容体に特異的に結合する配列をいう。具体的には以下のように定義できるがん細胞に高い発現がみられる受容体としては、細胞増殖に関わる増殖因子受容体、血管新生に関与する受容体、サイトカイン・ケモカイン受容体等にそれぞれ特異的に結合するペプチド配列であり、ファージディスプレイ法、立体構造解析等により特異的結合配列が見出される。
本明細書において「ＥＧＦ受容体結合ペプチド（ＥＢペプチド）」または「ＥＧＦ受容体結合配列（ＥＢ配列）」とは、ＥＧＦ受容体に結合するペプチドまたは配列をいう。
代表的には、ＥＧＦ受容体結合配列としては、以下のようなものを挙げることができる。
１）ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号７；ここでＨはＲまたはＫに置き換えられうる）。これらの改変配列は、ペプチドライブラリーからファージディスプレイ法によりスクリーニングされた配列であり、これまでの変異解析等では一切公表されていない。受容体−リガンド結合において重要と思われるチャージを有するアミノ酸に着目し、プラスチャージを持つＨをＲとＫに換えた変異体であり、本発明において顕著な効果を有すると予想される。
本明細書において特に言及しないときは、「溶解性ペプチド成分」、「細胞殺傷性ペプチド」「細胞殺傷性配列」は、「細胞溶解性ペプチド（配列）」または「細胞膜溶解性ペプチド（配列）」と交換可能に用いられる。細胞膜を溶解する可能性のあるペプチドを有する。代表的には、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有するものが挙げられる。本発明において特に用いられうるがん細胞膜に対して作用し殺細胞効果を示すものとして代表的なペプチド配列を以下に示す。
ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４８、具体的には配列番号１または２７など）：細胞膜溶解、ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ（配列番号１１）：抗菌性ペプチド誘導体、細胞膜電位崩壊、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ（配列番号１２）及びＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ（配列番号１３）：抗菌性ペプチド誘導体、細胞膜溶解・核酸結合、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４）：ミトコンドリア膜崩壊。
したがって、これらの情報から、細胞殺傷性ペプチドとして代表的なものは、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列ということができる。
そして、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１、下線はＤ体アミノ酸）を用いた場合、オリジナルの配列として知られているＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬ−ＮＨ２（配列番号４１、下線はＤ体アミノ酸）と比較して、以下の点で顕著な効果を奏することが明らかになった：たとえば、前にＥＧＦＲ結合配列を組み合わせると、がん細胞特異的に殺細胞活性において相乗効果が出ることが明らかになった。また、正常細胞との選択性がよりでてくることも明らかになった。いろいろなターゲットタンパク質とのハイブリッド化が可能である。このことから、がん細胞に対して、より標的化（ターゲット化）することができることが理解される。
また、ｎＬｙｔｉｃと称する（ＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ；配列番号４５、下線はＤ体アミノ酸）では、以下の点で顕著な効果を奏することが明らかになった：正常細胞との選択性がでていることが判明したことから、毒性が低いことが考えられる。また、Ｓｅｍａ３Ａペプチドと組み合わせにおいて、がん細胞特異的に殺細胞活性において相乗効果がでることも判明した。このことから、がん細胞に対して、より標的化（ターゲット化）することができることが理解される。
本明細書において「スペーサー」とは、橋をかけるように，鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる部分をいう。代表的には、Ｇ、Ｐからなる０〜５アミノ酸の配列が挙げられる。本明細書では、特に、溶解性ペプチドと、ＥＧＦ受容体結合ペプチドとの間に介在して結合されうる。このようなスペーサーの例としては、たとえば、ＧＧＧ，ＧＧ，Ｇ，ＰＰ，ＧＰＧが挙げられる。スペーサーは必須ではなく、存在しなくてもよいが、本発明において、好ましくは、これらのスペーサーが含まれる。
本明細書において「ペプチドトキシン」とは、抗がん標的化されたペプチドであって、細胞傷害性、殺傷能力を有するものをいう。本発明のペプチドトキシンは、爆薬部分に当たる、細胞傷害性部分と、弾頭部分にあたるがん細胞に対する特異性を担当する部分（たとえば、がん細胞に高発現している受容体に対して特異的に結合するペプチド・配列）とを組み合わせてできるペプチドを挙げることができる。「爆薬部分」については細胞膜溶解型配列が現状では好ましく、「弾頭部分」についてはがん細胞に高発現しているタンパク質（特に受容体）特異的に結合する配列であればなんでもよい。たとえば、がん細胞高発現受容体特異的結合配列＋スペーサー＋がん細胞膜溶解型配列から構成される「がん細胞膜溶解型ペプチドトキシン」が代表例として挙げることができる。
がん細胞高発現受容体特異的結合配列＋スペーサー＋がん細胞膜溶解型配列から構成される「がん細胞膜溶解型ペプチドトキシン」の製造法および使用法を以下に記載する。本明細書では、任意のがん細胞高発現受容体特異的結合配列、任意のスペーサー、任意のがん細胞膜溶解型配列を任意に組み合わせることができ、その製造法および使用法を下記に具体的に記載する。
（製造法）
がんの個別化治療が早期に実現可能な、多数の弾頭と爆薬配列の組み合わせからなるペプチドトキシンには短期間で入手可能な化学合成法が相応しいが、遺伝子組換えにより強制発現させ精製する方法も可能である。
（使用法）
治療しようとするがん細胞について、細胞表面に高発現しているタンパク質のプロファイルおよび爆薬ペプチドに対するがん細胞の傷害感受性を調べる。その結果をもとに弾頭と爆薬を選択し、そのがん細胞に最適なペプチドトキシンをデザインする。化学合成等により得られたオーダーメイドペプチドトキシンを必要に応じてアテロコラーゲン等のDDSと組み合わせ、局所投与または全身投与を行い治療する。
本発明者らが使用している細胞膜溶解性配列は単独ではがん細胞への殺細胞効果を示すのに長時間の接触が必要であり殺細胞効果もマイルドである。しかしこれにがん細胞標的化配列を結合しキメラ化するとその標的分子が高発現しているがん細胞に優先的に結合するようになり、接触時間も短縮でき殺細胞効果も増強される。実際にＩＬ４受容体、ｈｅｒ２等の結合配列キメラ化で殺細胞効果増強および接触時間短縮を確認した。したがって、他の同様のキメラ配列であっても、同様の殺細胞効果増強および接触時間短縮の効果を奏することが合理的に期待できる。
また、このような個別化治療を早期可能にするペプチドトキシンは弾頭、爆薬の組み合わせは、がん患者にとって、画期的な治療となりうる可能性がある。したがって、本発明のペプチドトキシンという新しい概念は、がん患者の最大限の利益を提供する点において重要である。
本発明のキメラペプチドまたはペプチドトキシンは、様々な種類のキメラポリペプチドの特許化がなされているなか、最も近い先行技術と対比しても細胞膜溶解型ペプチド単独に比べ、キメラ化によりがん細胞標的化、がん細胞に対する殺細胞効果の増強さらにはその即効性を実現した点で注目されるべきである。
本明細書において使用されうる細胞膜透過性を担当する部分の配列は以下のとおりである。共通する特徴としては、たとえば、有電荷アミノ酸が大量に含まれていることが挙げられる。
本明細書において「細胞透過性ペプチド」とは、細胞の膜を通過して、細胞内部に侵入しうるペプチドをいう。あるペプチドが「細胞透過性ペプチド」であるかどうかは、以下の試験によって評価することができる。すなわち、本明細書において、Ａｎｔｐに関しては、公知の方法（Ｄｅｒｏｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，１８１８８−１８１９３．を参照）において記載されるように、ビオチン化したＡｎｔｐペプチドを細胞に添加してその後、ストレプトアビジン化学標識化合物を添加し、蛍光顕微鏡で細胞内局在を確認することができる。あるいは、ストレプトアビジン結合抗体で反応後同様に化学標識された抗体を蛍光顕微鏡で同様に局在を確認することで細胞内に侵入していることを確認することができる。
細胞透過性ペプチドとしては、たとえば、アンテナペディアホメオボックス配列ＲＱＩＫＩＱＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（Ａｎｔｐ；配列番号５８）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ；配列番号２３）、またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２４）などを挙げることができる。代表的には、その構造は、以下のとおりである。代表的には、その構造は、たとえば、Ｇｅｎｅ ＩＤ １５５８７１（ＴＡＴタンパク質自体）を挙げることができる。細胞透過性ペプチドとしては、このほか、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号等の遺伝子を代表例として挙げることができる：ＮＰ＿０５７８５３；Ｔａｔ［ヒト免疫不全ウイルス１、アミノ酸配列］
ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰ ＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴ ＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣ ＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴ ＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ ＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱ ＮＳＱＴＨＱＡＳＬＳ ＫＱＰＴＳＱＰＲＧＤ ＰＴＧＰＫＥ（配列番号５７）。
本明細書において使用されうる細胞質内でがん細胞増殖に対する特異的阻害を担当する部分の配列として、ＨＳＰ９０をするＴＰＲドメイン結合ペプチドＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＴＰＲ；配列番号５９）などを挙げることができる。
本明細書において使用される代表的な細胞殺傷性ペプチドは、細胞膜溶解性ペプチド、細胞膜電位不安定化ペプチド、細胞膜溶解・核酸結合ペプチドおよびミトコンドリア膜崩壊ペプチドを挙げることができる。
本明細書において「細胞膜溶解性ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸[Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有し細胞膜を外側から崩壊させ殺細胞効果を示すペプチドをさす。代表的な具体例としては、以下が挙げられる：ＫおよびＬのみからなる１０〜２０個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合であるものが挙げられ、たとえば、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫ（配列番号４８、具体的には配列番号１または２７など）。
本明細書において「細胞膜電位不安定化ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、１０から３０アミノ酸からなる配列を有し、細胞膜を外側から孔をあけて細胞膜電位を不安定化させ崩壊させ殺細胞効果を示すペプチドをさす。代表的な具体例としては、ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ（配列番号１１）などが挙げられる。
本明細書において「細胞膜溶解・核酸結合ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有し、細胞膜を外側から崩壊させて内部に侵入し核酸へ結合し細胞死を誘導するペプチドをさす。代表的な具体例としては、ＫおよびＬのみからなる１０〜２０個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合であるものが挙げられ、たとえば、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ（配列番号１２）、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ（配列番号１３）などが挙げられる。
本明細書において「ミトコンドリア膜崩壊ペプチド」とは、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有し、細胞内部に侵入できた場合にのみミトコンドリア膜を崩壊させて細胞死を誘導するペプチドをさす。代表的な具体例としては、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４）などが挙げられる。
好ましい細胞殺傷性ペプチドとしては、プラスチャージを持つアミノ酸［Ｋ，Ｒ，（Ｈ）］と疎水性アミノ酸［Ｌ，Ａ，Ｆ等］から構成され、両親媒性ヘリックス構造をとる１０から３０アミノ酸からなる配列を有するものが挙げられる。好ましくは、このプラスチャージを持つアミノ酸は、Ｋ、ＲまたはＨであり得る。この疎水性アミノ酸は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＦであり得る。
本発明において使用される疎水性アミノ酸は、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫであり、ここで、各アミノ酸はＬ体またはＤ体であり、下線は、Ｄ体を示す。
本発明により明らかになった事項として、ＥＧＦＲ等の受容体結合ペプチドを結合したキメラペプチドは、両親媒性ヘリックス構造、好ましくはαヘリックス構造をしていることが有利であることが判明した。したがって、他の受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドを構成する場合も、両親媒性ヘリックス構造、好ましくはαヘリックス構造をしていることが有利である。これらは、図１Ｄに示す結果からも演繹できることが理解される。すなわち、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドの場合は、正常な細胞膜表面上で最も多い脂質種であるホスファチジルコリン（ＰＣ）から構成される小さな単層状小胞（ＳＵＶ）への結合が弱く、ＰＣリポソームではあまり上手く構造化されなかったが、このＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドが、がん細胞膜上で特異的に露出されるホスファチジルセリン（ＰＳ）を含むＳＵＶに結合し得、そして、２０９〜２１０ｎｍおよび２２２ｎｍにおける２つの極小値によって特徴付けられる部分的ならせん構造をとっていたことが実証されている。ＥＢ−オリジナル溶解性ペプチドは、ＰＣリポソームおよびＰＣ／ＰＳリポソームの両方に強く結合し得、そして、らせん構造をとったことが判明した（図１Ｄ（ｃ））。本発明において新たに設計したキメラペプチドが、ＰＳを含む膜に対して選択性を有し、そして、細胞表面上に孔をつくるために必須と考えられているらせん構造をとることを示す（Ｐａｐｏ，Ｎ．＆ Ｓｈａｉ，Ｙ．Ｎｅｗ Ｌｙｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｄ，Ｌ−ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｋｉｌｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２，９３４６−９３５４（２００３）。したがって、これらのデータを参酌して、溶解性ペプチドの別の形態の設計において役立てることができる。
そのような例としては、配列番号２、１４、２１、４２および４３からなる群より選択される配列またはその改変配列が挙げられる。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１５に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１６に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１７に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１８または４４またはその改変配列に示す配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号１９に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明のキメラペプチドは、配列番号２０、４６または４７に示す配列またはその改変配列を有する。ここで、改変配列としては、ここで具体的に記載された配列において、１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、好ましくは保存的置換されたものが挙げられる。
これらの改変配列について、好ましい両親媒性（α）ヘリックス構造を有するように改変することは、本明細書の記載にもとづいて当業者が実施することができる。そして、たとえば１アミノ酸置換については、ＥＧＦ−Ｒについてのキメラペプチドにおいて、両親媒性（α）ヘリックス構造が保持されることが実証されており、他のキメラペプチドについても、同様に、両親媒性（α）ヘリックス構造が保持されると予想されることが理解される。また、複数のアミノ酸置換等の他の改変についても、実施例における記載等を参酌して、当業者が適宜実施することができることが理解される。
別の好ましい実施形態では、細胞障害性ペプチドとしては、ＲＱＩＫＩＱＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２５）の配列を有するものが使用される。あるいは、ＴＡＴという名称で呼ばれる（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号２３）も使用されうる。Ｒを１１つなげた、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２４）という配列が細胞透過することが知られており、これも使用することができる。また、当業者は、適宜、好ましい細胞透過性ペプチドとＴＰＲドメイン結合ペプチドとの組み合わせを決定することができる。好ましくは、Ａｎｔｐとの組み合わせの方を使用することができる。
本明細書において「キメラペプチド」とは、二つ以上の異なった遺伝子型の部分（ペプチド）から作られた１個のペプチドをいう。融合タンパク質ともいう。タンパク質のドメインの機能を吟味したり、目的とするタンパク質の発現を検出するために用いられる。
本明細書において「類似するアミノ酸」とは、保存的置換の関係にあるアミノ酸をいい、以下のアミノ酸が該当する。
Ａ：Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ
Ｃ：Ｍ（含Ｓアミノ酸）
Ｄ：Ｎ、ＱまたはＥ
Ｅ：Ｑ、ＮまたはＤ
Ｆ：Ｙ、Ａなど
Ｇ：Ａ
Ｈ：Ｗ、Ｒ、Ｋなど、
Ｉ：Ａ、Ｌ、Ｖ、（Ｇ）
Ｋ：Ｒ、Ｈ
Ｌ：Ａ、Ｉ、Ｖ、（Ｇ）
Ｍ：Ｓなど
Ｎ：Ｄ、ＥまたはＱ
Ｐ：ＨｙＰ
Ｑ：Ｅ、ＮまたはＤ
Ｒ：Ｋ、Ｈ
Ｓ：Ｔ、Ｙ
Ｔ：Ｓ、Ｙ
Ｖ：Ｉ、Ｌ、Ａ、（Ｇ）
Ｗ：Ｈ
Ｙ：Ｆ、Ｓ、Ｔ。
これらのアミノ酸の間の置換は、本明細書において「保存的置換」ともいう。
本明細書においてＥＧＦ受容体結合ペプチドに頻繁に見出されるアミノ酸は、種々のＥＧＦ受容体結合ペプチドにおいて頻度が高く見出されるものをいい、代表的には、保存的置換の関係にあるアミノ酸が含まれ、あるいは以下のアミノ酸が該当する。
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり、
好ましくは、Ｘ１は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸または芳香族基を有するアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するプラスチャージを有するアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するイミノ酸系のアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するＯＨ基を有するアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系側鎖を有するアミノ酸であり、
より好ましくは、Ｘ１は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するＲもしくはＫであるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似するＹ、ＦもしくはＨであるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似するＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するＮであるアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似するＧ、Ａ、ＬもしくはＩであるアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似するＧ、Ａ、ＶもしくはＬであるアミノ酸である。
配列において、Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するＲもしくはＫであるアミノ酸であるもの（たとえば、ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号９）またはＹＫＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号１０））が好ましい。増強活性が見出されたからである。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがインターロイキン４（ＩＬ−４）受容体結合ペプチドである場合、アミノ酸配列ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮ（配列番号２６）またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｈａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９９，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．２，ｐ．２７１−８１．を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがインターロイキン１３（ＩＬ−１３）受容体結合ペプチドである場合、アミノ酸配列ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮ（配列番号２８）またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Ｙｕｉｃｈｉｒｏ Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７，ｖｏｌ．３５８，Ｎｏ．１，ｐ．２９２−２９７．を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがニューロピリン１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ１）受容体結合ペプチドである場合、アミノ酸配列ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲ（配列番号２９）またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ａｎｔｉｐｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２００３，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．４，ｐ．５８９−５９８を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。これらの文献は単にイムノトキシン等の蛋白製剤の問題点を提示しているだけであり、本発明のようにキメラペプチドを提供するものではない。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチドである場合、アミノ酸配列ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶ（配列番号３０）、ＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号５２）、ＡＬＶＲＹＫＤＰＬＦＶＷＧＦＬ（配列番号５３）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号５４）、ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ（配列番号５５）、ＤＴＤＭＣＷＷＷＳＲＥＦＧＷＥＣＡＧＡＧ（配列番号５６）またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Ｖａｌｅｒｉａ Ｒ．Ｆａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５，ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．１５，ｐ．６８９１−６９００を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドが血管上皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）結合ペプチドである場合、アミノ酸配列ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬ（配列番号３１）またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８，ｖｏｌ．３７８，Ｎｏ．１，ｐ．８−１４（ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−ＮＨ２（配列番号３２）について）、Ｂｏｒｌａｎ Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２，ｖｏｌ．３１６，Ｎｏ．３，ｐ．７６９−７８７（ＧＧＮＥＣＤＡＩＲＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ（配列番号３３）について）を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
本明細書において、使用される受容体結合ペプチドがトランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴｆＲ）結合ペプチドである場合、アミノ酸配列ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号３４）またはその改変配列が使用されうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、Ｊａｅ Ｈ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，ｖｏｌ．２６８，ｐ．２００４−２０１２を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
このほか、受容体結合ペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）結合ペプチドであり、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号５）またはＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号６）であるか；ニューロピリン１（ＮＲＰ１）／血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）結合ペプチドであり、ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号３６）であるか；エフリンＢ１（ＥｐｈＢ１）結合ペプチドであり、ＥＷＬＳ（配列番号３７）であるか；エフリンＢ２（ＥｐｈＢ２）結合ペプチドであり、ＳＮＥＷ（配列番号３８）であるか；インターロイキン１１受容体（ＩＬ１１Ｒ）結合ペプチドであり、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（環状）（配列番号２２）であるか；グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）結合ペプチドであり、ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ（配列番号３９）またはＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（環状）（配列番号４０）であるか；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ペプチドであり、ＣＱＫＨＨＮＹＬＣ（配列番号３５）であるか、あるいは、これらの改変配列でありうる。ここで、この改変配列は、ＥＧＦＲ結合ペプチドと同様に改変することができる。この改変においては、ＦＧＦＲ（ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号５））について、Ｆｕｋｕｔｏ Ｍａｒｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００２，ｖｏｌ．９，ｐ．５４３−５５２；ＦＧＦＲ（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号６））について、Ａｋｉｋｏ Ｋｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００３，Ｖｏｌ．２８３，Ｎｏ．１，ｐ．９１−１００；ＮＲＰ１／ＶＥＧＦＲ２（ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号３６））についてＬｏｒａｉｎｅ Ｔｉｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００６，ｖｏｌ．１１１，ｐ．１５３−１６４、ＥｐｈＢ１およびＥｐｈＢ２についてＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｋｏｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．１７，ｐ．１７３０１−１１；ＩＬ１１ＲについてＡｍａｄｏ Ｊ．Ｚｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４，ｖｏｌ．６４，ｐ．４３５−４３９；ＧＲＰ７８（ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ（配列番号３９））についてＭａｒｃｏ Ａ．Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２００４，ｖｏｌ．６，ｐ．２７５−２８４；ＧＲＰ７８（ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（配列番号４０）など）についてＹｉｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２００７，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，ｐ．４３５−４４７、Ｈａｒｄｙ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｈｉｎｄ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＧＲＰ７８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７５，８９１−８９９，２００８；ＰＳＭＡについてＫａｕｓｈａｌ Ｒｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．１３，ｐ．６３６８−６３７５を参酌することができ、この文献を本明細書において参考として援用する。
これらの置換は、１またはそれより多い組み合わせで使用され得る。これらの好ましい置換は任意の組み合わせが有効でありうることが理解される。これらの置換によって、効果の増強が見出されたからである。なお、これらの変異は一つ導入されても複数導入されてもよいことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、ある変異が許容されることが理解されると、もとの活性型の立体構造および対象となる生物学的標的との相互作用などでの活性が保持または増強されることが理解されることから、これらを複数組み合わせても、同様の効果を有すると期待されるからである。本発明の場合、一アミノ酸置換で活性が変化したものに関しては、そのパートナータンパク質との相互作用に影響を与えたことが予測されるが、本件の最終目的である、抗がん活性という観点からは、保持していることからこれらアミノ酸の置換を組み合わせても同様の効果が得られると期待できる。
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１またはそれより多いアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれより多い選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子（たとえば、ＨＳＰ９０など）には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書において、特定の遺伝子配列にハイブリダイズする核酸配列も、機能を有する限り使用することができる。ここで、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＥＧＦＲ）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において、「改変体」、「改変配列」または「アナログ」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されており、好ましくは実質的にもとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を少なくとも１つ保持しているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、ＴＰＲドメインへの結合など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＴＰＲドメインへの結合など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
（ペプチドの製法および分析）
本発明のペプチド（たとえば、キメラペプチド）は、当該分野で周知の方法（例えば、化学合成、以下に考察される一般的な工学技術）により得られ、または産生され得る。例えば、所望の領域もしくはドメインを含むペプチドの一部と一致するペプチドか、またはインビトロで所望の活性を媒介するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。ペプチドはまた、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定するために使用され得る親水性分析（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：３８２４〜３８２８を参照のこと）により分析され得、従って実験操作（例えば、結合実験、抗体合成）のための物質の設計において助けとなる。二次構造分析はまた、特定の構造的モチーフを確立するペプチドの領域を同定するために行われ得る（例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３：２２２〜２２３を参照のこと）。操作、翻訳、二次構造の予想、親水性および疎水性プロファイル、オープンリーディングフレームの予想およびプロッティング、ならびに配列の相同性の決定は、当該分野で利用可能なコンピューターソフトプログラムを使用して達成され得る。構造分析の他の方法として、例えば、Ｘ線結晶解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７〜１３を参照のこと））；質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９７．Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）が挙げられ、そしてコンピュータモデリング（例えば、ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ、編、１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＣＵＲＲＥＮＴ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）もまた使用され得る。
本発明はさらにＬ型アミノ酸を有する本発明のペプチドをコードする核酸に関する。本発明のペプチドをコードする核酸の適切な供給源はヒトゲノム配列を含む。他の供給源としては、ラットゲノム配列が挙げられ、そしてタンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。ペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、配列の３’−および５’−末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、および／またはｃＤＮＡもしくは所定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するゲノムライブラリーからのクローニングにより）により得られ得る。
ペプチドの組換え体の発現のために、ペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部分を含む核酸が、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、異種（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターでない）である。あるいは、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、遺伝子および／またはそれらの隣接する領域についてネイティブなプロモーターにより供給され得る。種々の宿主ベクター系は、ペプチドをコードする配列を発現するために利用され得る。これらは以下を含むが、限定ではない：（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含む酵母または（ｉｖ）バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌。利用される宿主細胞系により、多数の適する転写エレメントおよび翻訳エレメントの任意の１つが使用され得る。
発現ベクター中のプロモーター／エンハンサー配列は、本発明において提供される植物、動物、昆虫、または真菌の調節配列を利用し得る。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメントは、酵母および他の真菌（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼプロモータ、アルカリホスファターゼプロモータ）から使用され得る。発現ベクターまたはそれらの誘導体としては、例えば、ヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）；プラスミドベクターおよびコスミドベクターが挙げられる。
宿主細胞株は、挿入された目的の配列の発現を調節するか、または所望される特定の手段において、この配列によりコードされる発現されたペプチドを改変するか、もしくは処理するか選択され得る。さらに、特定のプロモーター由来の発現は、選択された宿主細胞株における特定のインデューサーの存在下で増強され得る；従って、一般的に設計されたペプチドの発現の制御を容易にする。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳プロセスおよび翻訳後のプロセスならびに発現されたペプチドの改変（例えば、グリコシル化、リン酸化など）に対する特定の特徴付けられたメカニズムを有する。従って、適切な細胞株または宿主系は、外来のペプチドの所望される改変およびプロセスが達成されたことを保証するために選択され得る。例えば、細菌系でのペプチド発現は、グリコシル化されていないコアペプチドを産生するために使用され得る；一方、哺乳動物細胞での発現は、異種のペプチドの「ネイディブ」グリコシル化を保証する。
ペプチドの誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび変異体、ならびにこれらのペプチドをコードする核酸を含む。核酸に関しては、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログが、少なくとも６個の（隣接する）核酸配列として規定され、そしてこれらは特異的なハイブリダイゼーションをさせるに十分な長さを有する。アミノ酸に関して、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログは少なくとも４個の（隣接する）アミノ酸配列として規定され、特異的な認識をさせるに十分な長さである。
改変体の設計には、ＩＬ−１３についてＹｕｉｃｈｉｒｏ Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７，ｖｏｌ．３５８，Ｎｏ．１，ｐ．２９２−７．、ＩＬ−４についてＴｈｏｒｓｔｅｎ Ｈａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９９，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．２，ｐ．２７１−８１．、ニューロピリン−１についてＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ａｎｔｉｐｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２００３，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．４，ｐ．５８９−９８．；Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ＲについてＪａｅ Ｈ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，ｖｏｌ．２６８，ｐ．２００４−２０１２．；ＶＥＧＦＲ１（ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬＧ（配列番号３１））についてＰｉｎｇ ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｖｏｌ．１１１，ｐ．１６５−１７３．；ＨＥＲ−２についてＶａｌｅｒｉａ Ｒ．Ｆａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５，ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．１５，ｐ．６８９１−６９００．、Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｃ． Ｐｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００４，ｖｏｌ．１１１，ｐ．９５１−９６０， Ｂｅｉｈａｉ Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６，ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．６，ｐ．４６５６−４６６２．；ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−ＮＨ２（配列番号３２））についてＫｉｍｂｅｒｌｙ Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡｎａＬｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８，ｖｏｌ．３７８，Ｎｏ．１，ｐ．８−１４．；ＶＥＧＦＲ１（ＧＧＮＥＣＤＡＩＲＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ（配列番号３３））についてＢｏｒｌａｎ Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２，ｖｏｌ．３１６，Ｎｏ．３，ｐ．７６９−８７．；ＢｕｆｏｒｉｎについてＨｙｕｎ Ｓｏｏ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００８，ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．１，ｐ．４７−５５；ＦＧＦＲ（ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号５））について、Ｆｕｋｕｔｏ Ｍａｒｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００２，ｖｏｌ．９，ｐ．５４３−５５２；ＦＧＦＲ（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号６））について、Ａｋｉｋｏ Ｋｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００３，Ｖｏｌ．２８３，Ｎｏ．１，ｐ．９１−１００；ＮＲＰ１／ＶＥＧＦＲ２（ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号３６））についてＬｏｒａｉｎｅ Ｔｉｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００６，ｖｏｌ．１１１，ｐ．１５３−１６４、ＥｐｈＢ１およびＥｐｈＢ２についてＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｋｏｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．１７，ｐ．１７３０１−１１；ＩＬ１１ＲについてＡｍａｄｏ Ｊ．Ｚｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４，ｖｏｌ．６４，ｐ．４３５−４３９；ＧＲＰ７８（ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ（配列番号３９））についてＭａｒｃｏ Ａ．Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２００４，ｖｏｌ．６，ｐ．２７５−２８４；ＧＲＰ７８（ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（配列番号４０））についてＹｉｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２００７，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，ｐ．４３５−４４７；ＰＳＭＡについてＫａｕｓｈａｌ Ｒｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．１３，ｐ．６３６８−６３７５の文献に記載された他の受容体等の配列の情報に基づき、類似の受容体結合ペプチドを設計することができる（これらの文献は本明細書において参考として援用する）。そのような改変としては、保存的置換が挙げられるがこれに限定されない。ここで、ＩＬ４、ＩＬ１３、ニューロピリン−１結合配列については立体構造解析結果をもとに設計された。本明細書においてはまた、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＴｆＲについてはＥＧＦＲと同様に上記文献の結合配列情報をそのまま使ったものに活性が見出されている。
また、細胞透過性ペプチドの改変についても、従来の知見を参考にして本明細書の記載に基づき改変することができる。たとえば、Ｄａｎｉｅｌｅ Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．３０，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｊｕｌｙ ２６，ｐｐ．１８１８８−１８１９３，１９９６は、Ａｎｔｐに関して、そのメカニズムおよび一部変異を加えた改変体に関する知見を提供する。これらには、細胞透過に重要な部位が記載されており、本発明の改変体、アナログを生産する際に参照することができ、この文献は、その全体を参考として本明細書中で援用する。
他の文献としては、Ｇｅｎｅｖｉｅ Ａｖｅ Ｄｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．２ ５５６−５６１；Ｗｅｎｙｉ Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎ Ｏ．Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，４４，１０１１０−１０１１８；およびＩＳＡＢＥＬＬＥ ＬＥ Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．９１２０−９１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９３は、細胞貫通メカニズムおよび変異についての情報を提供しており、これらの文献もまた、本発明の改変体、アナログを生産する際に参照することができ、これらの文献は、その全体を参考として本明細書中で援用する。
（医薬）
本発明の化合物またはその製薬上許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口または例えば、直腸内、口腔内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口をあげることができる。投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性製剤からなる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
局所製剤は、活性化合物を１種もしくはそれ以上の媒質、例えば鉱油、石油、多価アルコール等または局所医薬製剤に使用される他の基剤中に溶解または懸濁させて調製する。腸内投与のための製剤は、通常の担体、例えばカカオ脂、水素化脂肪、水素化脂肪カルボン酸等を用いて調製し、座剤として提供される。
本発明では、非経口剤においても、経口剤で例示したグリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤（抗酸化剤を含む）、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明の化合物もしくはその製薬上許容される塩の有効用量および投与回数は、投与形態、患者の年令、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、投与量は、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ／人、好ましくは５〜５００ｍｇ／人であり、投与回数は、１日１回または分割して投与するのが好ましい。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を製造するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
本発明はまた、本発明の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの水和物等プロドラッグを使用するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
（ＤＤＳ）
本明細書において「送達剤」または「送達媒体」とは、目的の物質の送達を媒介する担体（ビヒクル）をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＤＳ）とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型ＤＤＳ、放出制御型ＤＤＳ、標的指向型ＤＤＳに分類することもある。理想的なＤＤＳは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティングＤＤＳは、パッシブ・ターゲティングＤＤＳとアクティブ・ターゲティングＤＤＳとに分類される。前者はキャリアー（薬物担体または薬物運搬体）の粒子径や親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しようとする方法であり、例えば、標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体（たとえば、本発明のＴＰＲ結合ペプチド）などを結合したキャリアを利用する方法があり「ミサイルドラッグ」と呼ばれることもある。
本明細書において「薬物送達媒体」とは、所望の薬物を送達するためのビヒクルをいう。
本明細書において「目的物質」とは、特に、送達媒体により細胞内に送達されることが所望される物質をいう。
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物または遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでＤＤＳ用のナノ粒子性キャリア材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、リンカーまたは架橋剤等を必要に応じて使用することによって、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）として、有させることができる。
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、ａ）脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびｂ）混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明において使用される糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の２段階反応によって行うことができる。ａ）リポソーム膜上のガングリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、およびｂ）還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法（ＧＰＣ）、走査型電顕（ＳＥＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）などを使うことができる。
本明細書において「リンカー」とは、表面結合分子（たとえば、 ＴＲＰ結合ペプチド）と他の分子（例えば、リポソーム表面）との結合を介在する分子である。本発明において使用される糖鎖修飾リポソームにおいて、ペプチドはリンカーを介してリポソーム表面に結合してもよい。リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において「リンカータンパク質」とは、リンカー分子のうち、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のポリマーをいう。
本明細書において「リンカー（タンパク質）基」とは、リンカー（タンパク質）が別の基と結合したときに付される名称である。リンカー（タンパク質）基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、哺乳動物由来タンパク質基、ヒト由来タンパク質基、ヒト血清タンパク質基、血清アルブミン基が挙げられる。リンカー（タンパク質）基は「ヒト」由来が好ましい。ヒト投与において適合性が高いと考えられるからである。また、免疫原性がないタンパク質が好ましい。
本明細書において「架橋基」とは、橋をかけるように，鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる基をいう。したがって、概念としては、一部「リンカー」と重複する。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子（例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖）との間に作用し、分子内または分子間で、共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる基をいう。本明細書において架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、グルタルアルデヒドを用いることができる。
本明細書において「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（ＣＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシルエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、その他のグット緩衝液（例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミンクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、アミノアセトアミド（グリシンアミド）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ））などが挙げられるが、これらに限定されない。
以上のように、本発明は、ＥＧＦＲドメイン結合ペプチドなどの受容体結合ペプチドを含む、目的物質のがん細胞への送達剤を提供する。目的物質は、ＥＧＦＲドメイン結合ペプチドなどの受容体結合ペプチドと結合していても結合していなくてもよい。結合した場合は融合物質となり、ペプチドの場合はキメラペプチドと呼ばれる。本発明のキメラペプチドは、この実施形態であるということもできる。このような物質は、媒体（ビヒクル）によって複合剤を形成してもよい。このような媒体としては、リポソームを使用することができ、目的物質は、リポソームの外側にあっても内部に包含されていてもよい。
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の特異的部分を使用することができる。
本明細書において、たとえば、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、本発明のペプチドは、細胞株および生物学的サンプルの分類のために利用され得る。本発明は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
たとえば、ヒト臍帯血において見出され得るような細胞増殖および／または分化を起こし得るかまたは未分化状態への改変処置を行ったような細胞集団のような、未分化の細胞（例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞など）を含む細胞集団についてスクリーニングするために利用され得る。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限りナカライテスク、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬等から得ることができる。動物実験については、京都大学において定められた基準に基づき、動物愛護精神に則って行った。
（実施例１：ＥＧＦＲ標的化キメラペプチド）
[材料および方法]
（細胞株）
ヒト乳がん細胞株（ＢＴ−２０およびＴ４７Ｄ）、肺がん細胞株（Ｈ３２２およびＨ４６０）、膵臓がん細胞株（ＳＵ．８６．８６）、前立腺がん細胞株（ＬＮＣａｐ）、脳腫瘍細胞株（Ｕ２５１）および肺線維芽細胞株（ＭＲＣ−５およびＷＩ−３８）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。ヒト膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ−３）および結腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６およびＤＬＤ−１）を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。ヒト胚性腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３）を、ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（つくば市）から購入した。細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、１００μｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社、京都市）を含有する、ＲＰＭＩ １６４０（ＢＴ−２０、Ｔ４７Ｄ、Ｈ３２２、Ｈ４６０、ＳＵ．８６．８６、ＬＮＣａｐ、Ｕ２５１、ＢｘＰＣ−３、ＤＬＤ−１およびＳＷ８３７）、ＭＥＭ（ＭＲＣ−５およびＷＩ−３８）、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ（ＨＣＴ１１６）またはＤ−ＭＥＭ（ＨＥＫ２９３）中で培養した。
（ペプチド）
以下のペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから購入した：
１．がん細胞膜溶解性ペプチド：ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１：下線の文字はＤ−アミノ酸である）
２．ＥＧＦＲ結合(ＥＢ)−がん細胞膜溶解性キメラペプチド：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号２）
３．オリジナル溶解性ペプチド：ＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬ−ＮＨ２（配列番号４１）
４．ＥＢ−オリジナル溶解性キメラペプチド：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬ−ＮＨ２（配列番号４２）
これらのペプチドを、固相化学を用いて化学合成し、そして、高速液体クロマトグラフィーにより均質（すなわち、９０％より高い純度）になるまで精製して、質量分析法により評価した。ペプチドを水中に溶解させ、そして、ｐＨ７．４に緩衝化させた。ペプチド溶液は、使用直前に毎回新たに調製し、使い回しを避けた。
（薬物）
ゲフィニチブ（Ｇｅｆｉｎｉｔｉｂ）およびエルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）は、Ｔｏｒｏｎｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）より購入した。抗ＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体（クローン２２５）およびＰＤ１５３０３５は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より購入した。
（小さな単層状小胞（ＳＵＶ）の調製）
小さな単層状小胞（ＳＵＶ）を、先に記載されたように調製した（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｋ．＆ Ｈｏｒｉｋｉｒｉ，Ｃ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｍｉｌｏｉｄ β−ｐｅｐｔｉｄｅ（１−４０）ｗｉｔｈ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８，４１３７−４１４２（１９９９））。簡単に述べると、所望の組成の脂質膜を水中またはＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中に分散させた。得られたＭＬＶを５回の凍結−溶解サイクルに供し、次いで、プローブ型の超音波処理装置（Ｔｏｍｙ ＵＤ−２０１）を用いて、氷冷水中、窒素雰囲気下で１５分間超音波処理した。プローブのチタン先端部からの金属片を遠心分離により除いた。リン解析により、脂質濃度を三連で決定した（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｇ．Ｒ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｓｓａｙ ｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４，４６６−４６８（１９５９））。
（ＣＤスペクトル）
ＣＤスペクトルは、１ｍｍ光路長の石英セルを用いて、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８２０にて測定し、緩衝液成分に起因する吸収を最小限にした。各サンプルにつき、８回の走査の平均をとった。平均化したブランクスペクトル（小胞懸濁物または溶媒）を差し引いた。ペプチドおよび脂質の濃度は、それぞれ、５０μＭおよび４ｍＭであった。
膜透過の可視化（Ｉｍｕｒａ Ｙ．，Ｃｈｏｄａ，Ｎ．，＆ Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｋ．Ｍａｇａｉｎｉｎ ２ ｉｎ ａｃｔｉｏｎ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９５，５７５７−５７６５（２００８））。可溶性蛍光分子であるカルセインを、ガラス底のディッシュ内のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に２μＭの最終濃度で加えた。少量の標識ペプチド、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃ−ＴＡＭＲＡ−ＯＨまたはＬｙｔｉｃ−ＴＡＭＲＡ−ＯＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１５μｌ）を、１０μＭの最終濃度でディッシュに直接加えた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて共焦点像を撮影した。
（細胞生存性アッセイ）
１ウェルあたり合計３×１０３細胞を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度のペプチドと共に、３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。
（免疫蛍光染色）
フローサイトメトリーによるＥＧＦＲ発現を、ＦＩＴＣを結合したＥＧＦＲに対するヒトモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に、１×１０５細胞をインキュベートすることにより決定した。全ての染色は、室温にて４０分間行った。細胞の蛍光を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により測定した。ＥＧＦＲ陽性細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて決定した。
（アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼアッセイ）
ＢＴ−２０細胞を、５μＭのＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを用いて、または、これを用いずに、３７℃にて２時間処理した。カスパーゼの活性化またはアネキシンＶ陽性化を評価するために、ペプチドで処理した培養物を、カルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡカスパーゼ３＆７アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）を用いてカスパーゼ活性およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色について、あるいは、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンＶ標識およびＰＩ染色について、同時に解析した。また、製造業者の説明書に従い、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、ＭＥＢＳＴＡＩＮ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ Ｄｉｒｅｃｔ（ＭＢＬ）により、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを行った。
（生体分子の相互作用）
ＢＩＡＣＯＲＥバイオセンサーシステム３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド活性化化学により約５０００ＲＵのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）をＣＭ５センサーチップの表面に固定し、次いで、ビオチンを結合した２０００〜３０００ＲＵのペプチドを、このストレプトアビジンを固定したセンサーチップの上に注入した。非特異的な結合のコントロールとして、ストレプトアビジンを固定していないセンサーチップの反応していないカルボキシメチル基を、エタノールアミンでブロックした。分析物として、Ｍｅｍ−ＰＥＲ真核生物膜タンパク質抽出試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて調製した細胞表面タンパク質を、２５℃にて２０μｌ／分の流速のフローセルに注入した。アッセイの間に非特異的な結合を防ぐために、ＨＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、３ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ７．４］）を泳動緩衝液として用いた。組換えヒトＥＧＦレセプター（ｒｈＥＧＦＲ）のＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドとの相互作用解析を、以下のように行った：上述のように、約５０００ＲＵのｒｈＥＧＦＲ（配列番号３）をＣＭ５のセンサーチップ上に固定し、次いで、いくつかの濃度のペプチドをこのセンサーチップの上に注入した。これらの実験において用いた全てのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭＭ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７６；７２：２４８−５４）により決定した。データの解析は、ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒ．３．２ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて行った。
（コロニー形成アッセイ）
Ｈ３２２細胞に対するＬｙｔｉｃペプチドまたはキメラペプチドのインビトロ細胞傷害活性を、コロニー形成アッセイにより決定した。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（３ｍｌ）を入れた６ｃｍディッシュに細胞を播種し付着させた。細胞／ディッシュの数は、コントロール群において、１００を超えるコロニーが得られるように設定した。細胞播種から２４時間後に、種々の濃度のＬｙｔｉｃペプチドまたはＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（０〜２２．５μＭ）を細胞に曝露させ、１０日間培養した。このディッシュをリン酸緩衝液で洗浄し、クリスタルバイオレット（２５％アルコール中０．２５％）で染色した。コントロール群および処理群において形成されたコロニーの数から、コロニーの生存率を決定した。
[結果]
（二次構造に基づいた新規キメラペプチドの設計）
これまでに、ＰａｐｏおよびＳｈａｉが、ロイシンおよびリジンのＤ型およびＬ型を含む１５アミノ酸のジアステレオマー配列から構成される新規溶解型ペプチドを報告している(Ｐａｐｏ，Ｎ．＆ Ｓｈａｉ，Ｙ．Ｎｅｗ Ｌｙｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｄ，Ｌ−ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｋｉｌｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２，９３４６−９３５４（２００３））。本研究において、本発明者らは、二次構造におけるその両親媒性に基づいて、ＥＧＦＲ結合（ＥＢ）ペプチドと組み合わせるのに適した新規溶解型ペプチドを設計した。図１Ｄに示すように、新たに設計した溶解性ペプチドの正に荷電したアミノ酸（Ｌｙｓ）のクラスターの位置は、ＥＢペプチドと組み合わせた後、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドのものと比較して保存されたままであった（図１Ｄ（ａ，ｂ））。ＣＤスペクトル解析は、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドは、正常な細胞膜表面上で最も多い脂質種であるホスファチジルコリン（ＰＣ）から構成される小さな単層状小胞（ＳＵＶ）への結合が弱く、ＰＣリポソームではあまり上手く構造化されなかったが、このＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドが、がん細胞膜上で特異的に露出されるホスファチジルセリン（ＰＳ）を含むＳＵＶに結合し得、そして、２０９〜２１０ｎｍおよび２２２ｎｍにおける２つの極小値によって特徴付けられる部分的ならせん構造をとっていたことを実証した（図１Ｄ（ｄ））。一方、ＥＢ−オリジナル溶解性ペプチドは、ＰＣリポソームおよびＰＣ／ＰＳリポソームの両方に強く結合し得、そして、らせん構造をとった（図１Ｄ（ｃ））。これらの結果は、本研究において新たに設計したキメラペプチドが、ＰＳを含む膜に対して選択性を有し、そして、細胞表面上に孔をつくるために必須と考えられているらせん構造をとることを示す（Ｐａｐｏ，Ｎ．＆ Ｓｈａｉ，Ｙ．Ｎｅｗ Ｌｙｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｄ，Ｌ−ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｋｉｌｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２，９３４６−９３５４（２００３））。
（ＥＧＦＲ標的化は、ＥＧＦＲを発現するがん細胞において溶解性ペプチドの細胞傷害作用を増強する）
７種のＥＧＦＲを発現するがん細胞株に対して、溶解性ペプチドの細胞傷害性を、ＥＧＦＲ結合（ＥＢ）−ＬｙｔｉｃキメラペプチドであるＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンの細胞傷害性と比較した。図１Ａに示すように、溶解性ペプチドまたはキメラペプチドでの処理は、試験した全てのがん細胞株において濃度依存性の細胞傷害性を生じた。キメラペプチドは、溶解性ペプチドのみの場合と比較して、がん細胞に対する細胞傷害活性のかなりの増強を示した。全ての細胞株において８０％を超える細胞死を誘導するのに、キメラペプチドは１５〜２０μＭの濃度で十分であった。対照的に、同じ濃度の溶解性ペプチドのみでは、がん細胞の十分な細胞殺傷を誘導できなかった。表１に示されるように、溶解性ペプチドはＥＧＦＲ標的化することにより、がん細胞におけるＩＣ５０（コントロール細胞の増殖の５０％阻害を誘導するペプチドの濃度）を１．６〜３．１倍増強させ、ＥＧＦＲ標的化により、溶解性ペプチドのみに比してＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドに対するがん細胞の感受性が増強されたことが示唆された。本発明者らは、次いで、３種の正常細胞株におけるＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドおよび溶解性ペプチドの細胞傷害性を評価した。図１Ｂに示されるように、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８およびＨＥＫ２９３を含む３種の正常細胞株は、溶解性ペプチドに対する感受性が低く、がん細胞株と比較してより低い細胞傷害性を示した。正常細胞株におけるキメラペプチドのＩＣ５０は、がん細胞と比較して正常細胞において３．６〜８．０倍高い（表１）。ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドは正常細胞に対しても細胞傷害性が増強されたが、これはがん細胞における現象に類似する。これらの知見から、溶解性ペプチドは正常細胞よりもがん細胞において強い細胞傷害活性を有し、さらにＥＧＦＲ標的化ペプチドトキシンはＥＧＦＲ高発現がん細胞に対して優れた細胞傷害活性を有することを示唆する。興味深いことに、オリジナル溶解性ペプチドと組み合わせたＥＢペプチドは、細胞傷害活性の増強を示さず、そればかりか、ＥＢ−オリジナル溶解性ペプチドは、より低いペプチド濃度で正常細胞株（ＭＲＣ−５）までも殺傷し、オリジナル溶解性ペプチドがＥＢペプチドとのキメラ化に適していないことが示唆された（図１Ｃ）。
（ＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドを用いた処理は、チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）耐性のがん細胞に対して十分な細胞傷害性を及ぼす）
ｋ−ｒａｓ変異を有するかまたは有さないがん細胞において、ＥＢ−ｌｙｔｉｃペプチドおよびＴＫＩの細胞傷害活性を比較した。
（ｋ−ｒａｓ変異がん細胞のＴＫＩに対する感受性の評価）
ｋ−ｒａｓ変異の有無による各種がん細胞のエルロチニブまたは抗ＥＧＦＲ抗体に対する感受性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３個のｋ−ｒａｓ野生型（ＷＴ）がん細胞株（Ｈ３２２およびＢＴ−２０）およびｋ−ｒａｓ変異がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６、ＳＷ８３７およびＤＬＤ−１）を９６ウェルプレートに撒き、１０％ ＦＢＳを含む培地中で２４時間インキュベートした。これらの細胞を、種々の濃度のエルロチニブ（０〜８０μＭ）または抗ＥＧＦＲ抗体（右；０〜２０μｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｕｑｕｅ）を用いて細胞傷害活性を評価した。
ｋ−ｒａｓ ＷＴがん細胞株（Ｈ３２２およびＢＴ−２０）は、エルロチニブおよび抗ＥＧＦＲ抗体に対して感受性であったが、ｋ−ｒａｓ変異がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６、ＳＷ８３７およびＤＬＤ−１）は、エルロチニブに対しても抗ＥＧＦＲ抗体に対しても抵抗性であった（図１Ｅ）。
（ｋ−ｒａｓ野生型細胞におけるＴＫＩまたはＥＢ−ｌｙｔｉｃの細胞傷害性）
ｋ−ｒａｓ変異を持たないがん細胞および正常細胞に対するＴＫＩまたはＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる細胞傷害性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３個のｋ−ｒａｓ野生型（ＷＴ）の３種類のがん細胞株(Ｈ３２２、ＢＴ−２０およびＢｘＰＣ−３）および肺正常細胞株（ＭＲＣ−５）を９６ウェルプレートに撒き、１０％ ＦＢＳを含む培地中で２４時間インキュベートした。これらの細胞を、種々の濃度のＴＫＩ（エルロチニブ、ゲフィニチブおよびＰＤ１５３０３５；０〜２０μＭ）またはＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチド（０〜２０μＭ）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｕｑｕｅ）を用いて細胞傷害活性を評価した。
３種類のＴＫＩ（エルロチニブ、ゲフィニチブおよびＰＤ１５３０３５）での処理は、ｋ−ｒａｓ ＷＴがん細胞株（Ｈ３２２、ＢＴ−２０およびＢｘＰＣ−３）において、濃度依存性の増殖阻害をもたらしたが、細胞傷害活性は不十分であった。一方で、ＥＢ−ｌｙｔｉｃペプチドでの処理は、これらのがん細胞株に対して十分な細胞傷害活性を示したが、肺正常細胞株ＭＲＣ−５に対しては細胞傷害活性を示さなかった（図１Ｆ）。
（ｋ−ｒａｓ変異を持つＴＫＩ耐性がん細胞株に対するＥＢ−ｌｙｔｉｃの細胞傷害活性）
ｋ−ｒａｓ変異を持つＴＫＩ耐性がん細胞に対するＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる細胞傷害性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３個の４種類のｋ−ｒａｓ変異がん細胞株(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６、ＳＷ８３７およびＤＬＤ−１）を９６ウェルプレートに撒き、１０％ ＦＢＳを含む培地中で２４時間インキュベートした。これらの細胞を、種々の濃度のＴＫＩ（エルロチニブ、ゲフィニチブおよびＰＤ１５３０３５；０〜２０μＭ）またはＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチド（０〜２０μＭ）と共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。
ｋ−ｒａｓ変異がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６、ＳＷ８３７およびＤＬＤ−１）は、エルロチニブ、ゲフィニチブおよびＰＤ１５３０３５に対して抵抗性であったが、ＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドでの処理は、これらのｋ−ｒａｓ変異を持つＴＫＩ耐性がん細胞株に対して十分な細胞傷害活性を示した（図１Ｇ）。
以上のことから、ＥＢ−ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、ｋ−ｒａｓ変異がん細胞株特異的な細胞傷害活性を示すことがわかった。
（ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドにより誘導される細胞傷害活性の増強度合は、細胞表面上のＥＧＦＲの発現レベルに依存する）
本発明者らは、次に、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞傷害性における増加が、細胞表面上のＥＧＦＲの発現レベルと相関するかどうかを調べた。７種のがん細胞株および３種の正常細胞株におけるＥＧＦＲの発現レベルを、ＦＩＴＣ結合抗ＥＧＦＲポリクローナル抗体を用い、フローサイトメトリーにより評価した。図２Ａおよび表１に示されるように、ＥＧＦＲの発現レベルは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドのＩＣ５０とは相関しなかった（キメラペプチドにおいてｒ＝−０．３７（図２Ａ左）、溶解性ペプチドにおいて、ｒ＝−０．１４（図２Ａ中央））。しかし、ＥＧＦＲの発現レベルは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドに対する溶解性ペプチドのＩＣ５０の比とは十分に相関しており、溶解性ペプチドのみに比較したＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドによる細胞傷害活性の増強度合が、細胞表面上のＥＧＦＲ発現レベルに依存する（ｒ＝０．８９、図２Ａ右）ことが示唆された。
ＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＥＧＦＲに対する特異性をさらに確認するために、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドへの曝露の１時間前に、抗ＥＧＦＲポリクローナル抗体（Ａｂ）または組換えヒトＥＧＦをＢｘＰＣ−３培養液中に加え、細胞に対する細胞傷害活性を評価した。図２Ｂに示されるように、ＥＧＦタンパク質およびＥＧＦＲ−Ａｂは、共に、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞傷害性をブロックでき、ＥＧＦリガンドによる２７％の阻害、およびＥＧＦＲ−Ａｂによる２３％の阻害が実証された。これらの結果から、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞への結合は、ＥＧＦＲの細胞表面発現レベルに依存することが示唆される。
（ＥＧＦＲタンパク質および細胞表面膜タンパク質へのＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの結合についての相互作用プロファイル）
ＥＧＦＲに対するペプチドの結合特性を理解するために、ＥＧＦＲタンパク質をセンサーチップ上に固定し、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみとの相互作用プロファイルを、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて解析した。図３Ａに示されるように、共鳴シグナル強度は、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの濃度に応じて増加し、ＥＧＦＲタンパク質に結合したＥＢ−溶解性キメラペプチドの量は、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド濃度の増加に比例することが示された。対照的に、溶解性ペプチドのみによる共鳴シグナル強度は、濃度に応じて最低限に増加した。ＥＧＦＲタンパク質に結合するＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＫＤ値は、２．６×１０−５（Ｍ）であった。次に、ペプチドの細胞への結合特性を理解するために、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみのいずれかをセンサーチップ上に固定し、そして、Ｈ３２２、ＢＴ−２０またはＭＲＣ−５から抽出した細胞表面膜タンパク質との相互作用プロファイルを、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて解析した。図３Ｂおよび３Ｃに示されるように、共鳴シグナル強度は、細胞膜タンパク質の濃度に応じて増加し、ペプチドに結合した細胞膜タンパク質の量は、細胞膜タンパク質濃度の増加と比例することが示された。溶解性ペプチドのみに対する細胞膜タンパク質の相互作用は、ペプチドの濃度を増加させても各細胞株において同程度の結合定数を示した。一方、Ｈ３２２がん細胞またはＢＴ−２０がん細胞の膜タンパク質に対するＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの結合定数は、溶解性ペプチドのみよりも４．２倍（Ｈ３２２）または４．４倍（ＢＴ−２０）強かった（図３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）。対照的に、ＭＲＣ−５正常細胞の膜タンパク質に対する結合定数は、溶解性ペプチドのみと比較して有意に異ならなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、ＷＳＴアッセイから得られたデータ（図１）と一致しており、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞傷害活性が、細胞膜に対する親和性と十分に相関したことが示された。
（ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドは、がん細胞の迅速な殺傷を誘導する）
ＥＢ−キメラペプチドががん細胞を殺傷する適切な持続時間を評価するために、Ｈ３２２細胞またはＢＴ−２０細胞を、ＥＢ−キメラペプチドまたは溶解性ペプチドのみのいずれかで、１０分間、３０分間、１時間、または４８時間処理した。図４に示されるように、Ｈ３２２細胞またはＢＴ−２０細胞の溶解性ペプチドのみでの処理は、時間依存性の様式で生存性の喪失をもたらした。対照的に、Ｈ３２２細胞またはＢＴ−２０細胞をほんの１０分間ＥＢ−キメラペプチド（１０μＭ）に曝露するだけで、がん細胞は十分に殺傷され、７０％を超える殺細胞効果を示した。共焦点顕微鏡解析もまた、このキメラペプチドが細胞膜に透過して、がん細胞表面上に孔を形成することを示し、そして、２０分以内にがん細胞の細胞質へのカルセイン標識した媒体の流入が観察された（図４Ｂ）。しかしながら、この迅速な透過は、溶解性ペプチドのみでは観察されなかった（図４Ｃ）。これらの結果から、ＥＢ−キメラペプチドが、溶解性ペプチドのみと比較して、かなり迅速に細胞を殺傷することが示唆される。インビトロコロニー形成アッセイもまた、このキメラペプチドが、濃度依存性の様式でＨ３２２がん細胞の細胞増殖を阻害することを示した（図４Ｄ）。
（ＥＢ−キメラペプチドは、がん細胞におけるカスパーゼの活性化とアネキシンＶ陽性化を誘導する）
ＥＢ−キメラペプチドにより引き起こされる細胞死の作用機構を調べるために、マルチパラメトリックフローサイトメトリー解析を用いるアネキシンＶアッセイおよびカスパーゼアッセイを行った。図５Ａに示されるように、ＢＴ−２０乳がん細胞に対するＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（５μＭ）の２時間の曝露は、カスパーゼ活性化およびアネキシンＶ陽性化を誘導した。この結果から、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドはがん細胞の膜を崩壊させ、アポトーシス性の機構による細胞死に誘導することが示唆された。
（Ｈ３２２がん細胞増殖のインビトロ阻害）
Ｈ３２２がん細胞に対するＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞傷害活性をさらに確認するために、コロニー形成アッセイを行った（Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ，Ｋａｗａｋａｍｉ Ｍ，Ｌｅｌａｎｄ Ｐ，Ｐｕｒｉ ＲＫ．Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；８：２５８−６６；Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ，Ｊｏｓｈｉ ＢＨ，Ｐｕｒｉ ＲＫ．Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３−ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００；１１：１８２９−３５）。図６に示されるように、Ｈ３２２細胞は、溶解性ペプチドのみ（ＩＣ５０、１４．２μＭ）に対して感受性であったが、この細胞は、キメラペプチドに対して少なくとも２倍高い感受性（ＩＣ５０＜７．５μＭ）を示した。コロニー形成アッセイによる２つのペプチドのＩＣ５０値は、ＷＳＴアッセイにより決定したＩＣ５０値と十分に相関する。
[考察]
この研究において、本発明者らは、本発明の「ペプチドトキシン」と呼ばれる新規キメラペプチドを生成するために、アミノ酸の２つの機能性ドメインを連結した。この「ペプチドトキシン」は、ＥＧＦＲを過剰発現するがん細胞を標的化するために、ＥＧＦＲに結合して細胞膜を溶解する二機能性ペプチドとして設計した。本発明者らは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、溶解性ペプチドのみと比較したとき、より迅速かつ効率的にがん細胞を殺傷することを見出した。一方で、正常細胞は、両方のペプチドに対し、あまり感受性は高くないことが見出された。
本発明者らは、以下のように、がんの殺傷におけるＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの作用機構を提案する。まず、キメラペプチドのＥＢ部分が、細胞表面上のＥＧＦＲに結合し、その後、キメラペプチドの溶解性部分が結合し、そして、遊離の溶解性ペプチドよりも迅速に細胞膜を崩壊させる。ＥＢペプチドは、２２ｎＭの解離定数でＥＧＦＲに対し特異的かつ効率的に結合した（Ｌｉ Ｚ，Ｚｈａｏ Ｒ，Ｗｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００５；１９：１９７８−８５）。したがって、ＥＢ−ＥＧＦＲ相互作用の親和性は、溶解性ペプチドと細胞膜との親和性よりも高いことが示唆された。
溶解性ペプチドと同様に、ミトコンドリア毒性およびアポトーシス促進性ペプチドは、ポリカチオン性の配列（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号４）を有し、細胞膜を崩壊させることなく、膜透過性配列を有するペプチドと組み合わせることによって細胞内区画へと侵入し、そしてミトコンドリアの損傷を誘導する（Ｅｌｌｅｒｂｙ ＨＭ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｅｌｌｅｒｂｙ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９；５：１０３２−８）。細胞膜溶解性ペプチドでは細胞膜を崩壊させた後に細胞内へと侵入し、ミトコンドリアの損傷とカスパーゼの活性化を誘導し、そして、アポトーシスを誘発する。一方、緑膿菌外毒素ベースのイムノトキシン（インターロイキン−１３−緑膿菌外毒素（ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ）（配列番号６））は、部分的なアポトーシスを誘導し、そして、頭頚部がん細胞のほんの１０〜３０％のみがアポトーシス性の細胞死をこうむる（Ｋａｗａｋａｍｉ Ｍ，Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ，Ｐｕｒｉ ＲＫ．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００２；５０：６９１−７００）。このキメラペプチドで処理したがん細胞はフローサイトメトリーで評価するとアネキシンＶおよびカスパーゼ３，７陽性であり、なおかつ、このペプチドはまた、迅速ながん細胞の死を引き起こしたことから、この標的化キメラペプチドは、細菌毒素ベースのイムノトキシンと比べて、がん細胞の死を迅速に誘導するという利点があり、また、インビボにおいて処置部位でバイスタンダー作用または自然免疫を誘導し得るようである。
一般に、ペプチドは、ヒトの体内で血清成分により比較的容易に不活性化される（Ｐａｐｏ Ｎ，Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｅｓｈｈａｒ Ｚ，Ｓｈａｉ Ｙ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｙｔｏＬｙｔｉｃ Ｄ−，Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ：ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｙｓｉｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：５７７９−８６）。ジアステレオマーペプチドは、血清中で不活性化を比較的逃れ、腫瘍内投与または静脈内投与のいずれかにより投与された溶解性のジアステレオマーペプチドは、血中でペプチドが迅速に分解することなく、ヒトの前立腺がんの動物モデルの腫瘍増殖を減少させることが示されている（Ｐａｐｏ Ｎ，Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｅｓｈｈａｒ Ｚ，Ｓｈａｉ Ｙ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｙｔｏＬｙｔｉｃ Ｄ−，Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ：ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｙｓｉｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：５７７９−８６）。最近報告されている、がん細胞のＨｓｐ９０に結合してそのクライアントタンパク質を不安定にする他のタイプのペプチドベースの薬物もまた、５０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内注射されると、マウスにおけるヒト乳がん細胞の増殖を阻害する（Ｐｌｅｓｃｉａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７，４５７−４６８（２００５））。本研究において、本発明者らが新たに設計したＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドの静脈内投与が、他のペプチド薬物候補と比較してより低い濃度において腫瘍の増殖を低減させたことが見出され、この新規キメラペプチドの、がん治療のための新規かつ有用なツールとしての可能性の高さが示唆された。ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドは、血流における不活性化に対して抵抗性を示す可能性もあるが、インビボ使用でのこのペプチドの有効性をより高めるための方法としては、他の物質と組み合わせるか、あるいは局所投与が有効ではないかと考えられる。例えば、ペプシン処理により高度に精製されたウシの真皮のＩ型コラーゲンであるアテロコラーゲンは、タンパク質およびｓｉＲＮＡ薬剤のための魅力的な薬物送達システム（ＤＤＳ）であることが示されている（Ｆｕｊｉｏｋａ Ｋ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｈｏｊｏ Ｔ，Ｓａｎｏ Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １９９８；３１：２４７−６６；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｆ，Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ Ｙ，Ｎａｇａｈａｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｔｏ ｂｏｎｅ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００５；１０２：１２１７７−８２）。アテロコラーゲンと共に局所投与されたタンパク質薬剤は、長時間にわたり注入部位から徐放され続けることが報告されている（Ｆｕｊｉｏｋａ Ｋ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｈｏｊｏ Ｔ，Ｓａｎｏ Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １９９８；３１：２４７−６６）。したがってヒトのがんのインビボモデルにおいて、アテロコラーゲンは本発明者らのペプチドトキシンと共に組み合わせた試験する価値が十分にあると思われる。現在、これらの可能性について本発明者らの研究室において研究中である。
イムノトキシンは、殺傷性部分を有するタンパク質毒素と、これに連結された、がん細胞に対する選択性のためのリガンドまたは抗体のようなターゲティング部分とから構成される。イムノトキシンは、第一世代のイムノトキシンとしての化学結合体、および、第二世代のイムノトキシンとしての組換えタンパク質という２つの分類に分けられ得る（Ｒｅｉｔｅｒ Ｙ，Ｐａｓｔａｎ Ｉ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆｖ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｔｒｅｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８；１６：５１３−５２０）。従来のイムノトキシンは、通常、臨床上の使用において障害（例えば、免疫原性、望ましくない毒性、生産の困難さ、体内での限られた半減期および中和抗体産生）を呈する（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．ＡＡＰＳ Ｊ ２００６；８：Ｅ５３２−５１；Ｌｉ Ｚ，Ｙｕ Ｔ，Ｚｈａｏ Ｐ，Ｍａ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；２：１０６−１１２；Ｐｏｓｅｙ ＪＡ，Ｋｈａｚａｅｌｉ ＭＢ，Ｂｏｏｋｍａｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ＳＧＮ−１０（ＢＲ９６ ｓＦｖ−ＰＥ４０） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；８：３０９２−３０２９）。しかし、ペプチドは化学的に合成され得るので、ペプチドの生産は、タンパク質薬物と比べ手ごろな費用で行われ得る。さらに、ターゲティングのための候補ペプチドと毒素部分との種々の組み合わせは、一般的に前臨床の環境で容易に試験され得る。例えば、ミトコンドリア毒素（Ｅｌｌｅｒｂｙ ＨＭ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｅｌｌｅｒｂｙ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９；５：１０３２−８）または抗生物質様誘導体ペプチド（Ｋｉｍ Ｓ，Ｋｉｍ ＳＳ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｋｉｍ ＳＪ，Ｌｅｅ ＢＪ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００３；２４：９４５−９５３）のような、腫瘍殺傷活性を有する毒素部分が利用され得る。ターゲティング部分として、インターロイキン−１１（Ｚｕｒｉｔａ ＡＪ，Ｔｒｏｎｃｏｓｏ Ｐ，Ｃａｒｄｏ−Ｖｉｌａ Ｍ，Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ ＣＪ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ Ｒ，Ａｒａｐ Ｗ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｃｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：４３５−４３９）および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ；Ｒｅｇｅ Ｋ，Ｐａｔｅｌ ＳＪ，Ｍｅｇｅｅｄ Ｚ，Ｙａｒｍｕｓｈ ＭＬ．Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７：６３６８−６３７５）が、ＥＧＦＲに加えて標的となり得る。しかし、爆薬ペプチドは、植物毒素または細菌毒素のようなより強力な殺細胞活性を必要とし、さらにがん細胞をターゲティングするための弾頭ペプチドと共に広範に探索されなければならない。
まとめると、本発明において提供されるがん細胞上の特有のタンパク質を標的とするペプチドトキシンは、抗がん標的療法のための可能性のある新規ツールである。本発明者らはこのキメラペプチドであるペプチドトキシンについての概念を、次世代イムノトキシンという概念として提唱する。ペプチドトキシンの研究および開発は、将来的には個々のプロファイルに応じたがんの個別化治療、つまり患者からの切除腫瘍に対して特異的に標的化された、キメラペプチドによる治療を可能にする。結局のところ、この戦略は、がんだけでなく他の疾患の処置にも有用であり得る。
（実施例２：ＥＧＦ受容体結合ペプチドの網羅的解析）
本実施例では、ＥＧＦ受容体結合ペプチドのアナログ（アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号８）を有するものであって、ここでＸ１は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｈまたはそれに類似するＲもしくはＫであるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｗまたはそれに類似するＹ、ＦもしくはＨであるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｇまたはそれに類似するＡ、Ｖ、ＩもしくはＬであるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｙまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｔまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｐまたはそれに類似するヒドロキシルプロリンであるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｑまたはそれに類似するＮであるアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｎまたはそれに類似するＳ、ＨもしくはＦであるアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｖまたはそれに類似するＧ、Ａ、ＬもしくはＩであるアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｉまたはそれに類似するＧ、Ａ、ＶもしくはＬであるアミノ酸であるものが使用可能であるかどうかを決定するための実験を行う。ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例１に準じる。
（プロトコール）
上記変異体ペプチドのうち、まず電荷を有する２番目のＨに着目しＫとＲの変異体を化学合成し、実施例１に記載されるように、ＢＩＡＣＯＲＥにてリコンビナントヒトＥＧＦＲとの結合親和性を野生型ＥＧＦＲ結合ペプチドとの比較により評価した。その結果においてより効果が高いもののみがん細胞膜溶解配列とのキメラペプチドを合成し、ヒト肺がん細胞株Ｈ３２２に対する殺細胞効果を野生型ＥＧＦＲ結合キメラペプチドとがん細胞膜溶解単独との比較をした。
（結果）
結果を図７に示した。野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ペプチドに比べＫ置換ペプチドは若干バイオセンサー応答の増強がみられ、Ｒ置換体はｗｉｌｄ−ｔｙｐｅの２倍の応答がみられた（図７Ａ）。Ｈ３２２に対する殺細胞効果は野生型ＥＧＦＲ結合キメラペプチド（三角）よりもＲ置換体キメラペプチド（黒丸）の方が増強された（図７Ｂ）。
（実施例３：がん細胞膜溶解性配列（Ｌ体アミノ酸のみ）とがん細胞標的化配列としてＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）標的化配列との組み合わせ）
本実施例ではＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（すべてＬ体アミノ酸のみ；ＬｙｔｉｃＬ；配列番号２７）のがん細胞膜溶解性配列とＩＬ４Ｒ標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例１と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
ＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ：ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１８）。
（プロトコール）
ＩＬ４ＲおよびＩＬ−４との結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列（ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮ（配列番号２６））を設計し化学合成し、ＢＩＡＣＯＲＥ解析によりヒトリコンビナントＩＬ４Ｒタンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を評価した。
（結果）
結果を図８に示した。ＩＬ４Ｒ結合ペプチド配列（ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮ（配列番号２６））はＢＩＡＣＯＲＥ解析によりヒトリコンビナントＩＬ４Ｒタンパク質との結合親和性が認められた（図８Ａ）。ＩＬ４Ｒ標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド（ＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ）は２種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独（ＬｙｔｉｃＬ）よりも殺細胞効果が増強された（図８Ｂ）。キメラ化することにより、１０分間の接触でがん細胞（ＢｘＰＣ−３）を十分に細胞死へ誘導することが示された（図８Ｃ）。
（実施例４：がん細胞膜溶解性配列（Ｌ体アミノ酸のみ）とがん細胞標的化配列としてＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）標的化配列との組み合わせ）
本実施例ではＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（すべてＬ体アミノ酸のみ；ＬｙｔｉｃＬ；配列番号２７）のがん細胞膜溶解性配列とＩＬ１３Ｒ標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例１と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ：ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１９）。
（プロトコール）
ＩＬ１３ＲとＩＬ−１３との結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列（ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮ（配列番号２８））を設計し化学合成し、ＢＩＡＣＯＲＥ解析によりヒトリコンビナントＩＬ１３Ｒタンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト脳腫瘍細胞株Ｕ２５１およびヒト頭頚部がん細胞株ＨＮ−１２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を評価した。
（結果）
結果を図９に示した。ＩＬ１３Ｒ結合ペプチド配列（ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮ（配列番号２８））はＢＩＡＣＯＲＥ解析によりヒトリコンビナントＩＬ１３Ｒタンパク質との結合親和性が認められた（図９Ａ）。ＩＬ１３Ｒ標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド（ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ）は２種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独（ＬｙｔｉｃＬ）よりも殺細胞効果が増強された（図９Ｂ）。キメラ化することにより、１０分間の接触でがん細胞（Ｕ２５１）を十分に細胞死へ誘導することが示された（図９Ｃ）。
（実施例５：がん細胞膜溶解性配列（Ｌ体アミノ酸のみ）とがん細胞標的化配列としてニューロピリン−１（ＮＲＰ１）標的化配列との組み合わせ）
本実施例ではＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（すべてＬ体アミノ酸のみ；ＬｙｔｉｃＬ；配列番号２７）のがん細胞膜溶解性配列とＮＲＰ１標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例１と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
Ｓｅｍａ３Ａ−ＬｙｔｉｃＬ：ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号２０）
（プロトコール）
ＮＲＰ１とそのリガンドＳｅｍａ３Ａとの結合立体構造解析結果から結合に重要な部分ペプチド配列（ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲ（配列番号２９））を設計し化学合成し、ＢＩＡＣＯＲＥ解析によりヒトリコンビナントＮＲＰ１タンパク質との結合親和性を評価した。上記キメラペプチドを合成しヒト膵臓がん細胞株ＳＵ８６．８６およびヒト乳がん細胞株ＳＫＢＲ３に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を評価した。
（結果）
結果を図１０に示した。ＮＲＰ１結合ペプチド配列（ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲ（配列番号２９））はＢＩＡＣＯＲＥ解析によりヒトリコンビナントＮＲＰ１タンパク質との結合親和性が認められた（図１０Ａ）。ＮＲＰ１標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチド（Ｓｅｍａ３Ａ−ＬｙｔｉｃＬ）は２種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独（ＬｙｔｉｃＬ）よりも殺細胞効果が増強された（図１０Ｂ）。
（実施例６：細胞膜溶解・核酸結合配列とがん細胞標的化配列としてＥＧＦＲ標的化配列との組み合わせ）
本実施例では細胞膜溶解・核酸結合配列（ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ（配列番号１３）、以下ｂｕｆと略）とＥＧＦＲ標的化配列とを組み合わせたキメラペプチドで実施例１と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである。
ＥＧＦｂｕｆ：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＧＧＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ（配列番号２１）。
（プロトコール）
上記キメラペプチド（ＥＧＦｂｕｆ）および爆薬部ペプチド単独（ｂｕｆ）を合成しヒト肺がん細胞株Ｈ３２２、ヒト前立腺がん細胞株ＤＵ１４５およびヒト肺正常細胞株ＭＲＣ５に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を評価した。
（結果）
結果を図１１に示した。ＥＧＦＲ標的化キメラペプチド（ＥＧＦｂｕｆ）は２種類のがん細胞株いずれにおいても、がん細胞膜溶解性ペプチド単独（ｂｕｆ）よりも殺細胞効果が増強された（図１１Ａ）。またＥＧＦｂｕｆを肺がん細胞株Ｈ３２２と肺正常細胞株ＭＲＣ−５で殺細胞効果を比較したところ、がん細胞に殺細胞感受性が高かった（図１１Ｂ）。
（実施例７：がん細胞膜溶解性配列（Ｌ体Ｄ体混合アミノ酸構成）と３種類のがん細胞高発現受容体結合配列との組み合わせ）
本実施例ではＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸；配列番号１）のがん細胞膜溶解性配列と３種類のがん細胞高発現受容体結合配列（ｈｅｒ２、ＶＥＧＦ受容体、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ受容体）とを組み合わせたキメラペプチドで実施例１と同様な殺細胞効果増強等の効果がみられるかどうかを調べた。そのキメラペプチド配列は以下の通りである（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸である。）。
ＨＥＲ２−Ｌｙｔｉｃ：ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１５）
ＶＥＧＦＲ１−Ｌｙｔｉｃ：ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬＧＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１６）
ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃ：ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１７）。
（プロトコール）
文献検索により上記３つの受容体結合ペプチド配列を見出し、がん細胞膜溶解性配列（ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ、下線Ｄ体、以下Ｌｙｔｉｃと略；配列番号１）とのキメラペプチドを設計し化学合成した。上記キメラペプチドを合成しヒト肺がん細胞株Ｈ３２２およびヒト肺正常細胞株ＭＲＣ−５に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を評価した。
（結果）
結果を図１２に示した。３種類の抗がん標的化がん細胞膜溶解性キメラペプチドはいずれもヒト肺がん細胞株Ｈ３２２において、Ｌｙｔｉｃペプチド単独よりも殺細胞効果が増強された（図１２Ａ）。またヒト肺正常細胞株ＭＲＣ−５に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞効果は２種類のがん細胞に比べマイルドであった（図１２Ｂ）。
（実施例８：他のがん細胞高発現受容体ペプチドの試験）
本実施例では、他のがん細胞高発現受容体ペプチドが使用可能かを調べる。
使用するペプチドは以下のとおりである。ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例１に準じる。
（がん細胞増殖系受容体）
繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）：ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号５）またはＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号６）
（血管新生系受容体）
ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）：ＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ（配列番号５２）、ＡＬＶＲＹＫＤＰＬＦＶＷＧＦＬ（配列番号５３）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号５４）、ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ（配列番号５５）またはＤＴＤＭＣＷＷＷＳＲＥＦＧＷＥＣＡＧＡＧ（配列番号５６）
ニューロピリン１（ＮＲＰ１）／血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）：ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号３６）
血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ１）：ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−ＮＨ２（配列番号３２）またはＧＧＮＥＣＤＡＩＲＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ（配列番号３３）
エフリンＢ１（ＥｐｈＢ１）：ＥＷＬＳ（配列番号３７）
エフリンＢ２（ＥｐｈＢ２）：ＳＮＥＷ（配列番号３８）
（サイトカイン／ケモカイン系受容体）
インターロイキン１１受容体（ＩＬ１１Ｒ）：ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（環状）（配列番号２２）
（その他がん細胞高発現受容体）
グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）：ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ（配列番号３９）、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（環状）（配列番号４０）またはＹＰＨＩＤＳＬＧＨＷＲＲ（配列番号５８）
（がん抗原表面タンパク質）
前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ；ＰＳＭＡ）：ＣＱＫＨＨＮＹＬＣ（配列番号３５）。
（結果）
ＥＧＦＲを使用した場合と同様、ＢＩＡＣＯＲＥ解析によりそれぞれの受容体特異的に結合親和性を確認でき、それぞれの結合配列とがん細胞膜溶解性配列とのキメラペプチドはがん細胞膜溶解性ペプチド単独に比べ殺細胞効果が増強されることが期待できる。
（実施例９：抗がん標的化キメラペプチド（ペプチドトキシン）を用いた治療）
実施例１において製造したキメラペプチドを用いて治療効果を確認した。がん細胞に高発現している受容体等の分子に結合する弾頭部ペプチドと、がん細胞に対して強力な殺細胞効果を示す爆薬部ペプチドを結合させた抗がん標的化キメラペプチド（ペプチドトキシン）を設計し、担がん動物モデルでの抗腫瘍効果を研究したものである。
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３、５×１０６ ｃｅｌｌｓ／１５０μｌ リン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回３週間でＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５０μｌ リン酸緩衝液／マウスで腫瘍内投与した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出した。
（結果）
結果を図１３に示す。
リン酸緩衝液投与群では腫瘍の経時的な増大がみられたが、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド投与群では０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ投与群とも腫瘍肥大化が大きく抑制された。０．３ｍｇ／ｋｇという投与量としてはかなり少ない量であり、ヒトにおいても十分な抗腫瘍効果が期待される。この結果は、従来技術に比べると、ペプチドはこれまで体内ですぐに分解され効果も弱いと思われていたが、かなり強力に効くことが判明した。ペプチド化学修飾等による安定化、ＤＤＳ等との組み合わせ等によりさらに体内安定性が増し薬効増強も期待できる。
本実施例の結果を検討すると、実際のヒトに対する抗がん剤であることを実証するデータであることの理論的説明を提示することができる。すなわち、図13に記載のデータを用いれば、ヒトのデータと「同一視」できることが当業者には理解される。これは、移植したがん細胞株はヒト由来であり、多くの臨床で用いられている抗がん剤も同様な研究経過を経ていることから、当該分野において確立した理論であるといえる。したがって、本実施例の結果から、本発明のキメラペプチドは、ヒトに対する「抗がん剤」であると言い切ることができることが理解される。
（実施例１０：ＥＢ−Ｌｙｔｉｃの静脈内投与による抗腫瘍効果）
前項と同様に、実施例１において製造したキメラペプチドを用いて治療効果を確認した。本実施例では全身投与による抗腫瘍効果を調べた。
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３、５×１０６ ｃｅｌｌｓ／１５０μｌリン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回３週間でＥＢ−溶解性（ＥＢ−Ｌｙｔｉｃ）キメラペプチドを０（コントロール）、１および５ｍｇ／ｋｇ、または、これとは別の実験系として０、２、５および１０ｍｇ／ｋｇ、５０μｌリン酸緩衝液／マウスで静脈内投与した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出した。
（結果）
結果を図１４および図１５Ａの上側に示す。上述の記載から明らかなように、図１４および図１５Ａは、それぞれ独立した実験系の結果を示す。
リン酸緩衝液投与群では腫瘍の経時的な増大がみられたが、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド投与群では１および５ｍｇ／ｋｇ投与群とも腫瘍肥大化が大きく抑制された。１ｍｇ／ｋｇという投与量は全身投与法においては非常に少ない量であり、ヒトにおいても十分な抗腫瘍効果が期待される。また、２、５および１０ｍｇ／ｋｇ投与群における５５日目の腫瘍容積は、生理食塩水処理を行ったコントロール群の腫瘍容積（１３１０ｍｍ３）と比較して、それぞれ、３４％（４４０ｍｍ３、Ｐ＜０．０５）、３０％（３９９ｍｍ３、Ｐ＜０．０５）および１９％（２４４ｍｍ３、Ｐ＜０．０１）であった。この結果は、従来技術に比べると、ペプチドはこれまで体内ですぐに分解され効果も弱く、全身投与は非常に困難であろうと思われていたが、かなり強力に効くことが判明した。ペプチド化学修飾等による安定化、ＤＤＳ等との組み合わせ等によりさらに体内安定性が増し薬効増強も期待できる。
（実施例１１：治療法）
本実施例では、実際の治療への応用を調べる。
ここでは、ＤＤＳ（薬物送達系；Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いた体内動態安定化および徐放化等の検討とともに担がん動物モデルでの抗腫瘍効果を研究する。
（ＤＤＳ）
ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドをアテロコラーゲンと混合させ、局所投与用のゲル化製剤により分解抑制および徐放効果を検討する。また、全身投与用にゲル化せずにペプチド分解抑制効果を示す製剤化を検討する。そのためにｉｎ ｖｉｔｒｏでのペプチドのアテロコラーゲン混合体からの遊離プロファイル解析を行い、最適なアテロコラーゲン含有率を決定する。
（担がん動物モデルでの抗腫瘍効果）
実施例９と同様にヌードマウス担がんモデルに局所投与用のゲル化混合物（ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドとアテロコラーゲン）を腫瘍内投与し、抗腫瘍効果を評価する。また全身投与用の混合物を静脈内投与し、同様に抗腫瘍効果を評価する。両投与方法とも用法・用量設定試験を行う。
このような実験を行うことで、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドとアテロコラーゲンとの混合ゲル化した製剤を腫瘍内投与するとペプチド分解抑制および徐放効果から投与回数を減らしても十分な抗腫瘍効果が期待できる。ゲル化しない全身投与用の混合物を静脈内投与すると、ペプチド単独に比べより高い抗腫瘍効果が期待される。
（実施例１２：インビボでの用量設定試験）
実施例１において製造したキメラペプチドを用いて用量設定について検討する。
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３、５×１０６ ｃｅｌｌｓ／１５０μｌリン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回３週間でＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５０μｌ リン酸緩衝液／マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出する。
（実施例１３：インビボでの用法設定試験）
実施例１において製造したキメラペプチドを用いて用法設定について検討する。
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３、５×１０６ ｃｅｌｌｓ／１５０μｌ リン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回３週間、週５回１週間でＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを１ｍｇ／ｋｇ、５０μｌリン酸緩衝液／マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出する。
（実施例１４：他のがん細胞での試験）
実施例１において製造したキメラペプチドを用いてがん種を変えて抗腫瘍効果を検討した。
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはヒト前立腺がん細胞株ＤＵ１４５、５×１０６ ｃｅｌｌｓ／１５０μｌ リン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回３週間でＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを０．５ｍｇ／ｋｇ、５０μｌ リン酸緩衝液／マウスで静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出する。
（乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）
ヒトのがんの異種移植モデルにおいてＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍効果を評価するために、インビボでの腫瘍異種移植片におけるＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍活性。乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（５×１０６細胞／１５０μｌ リン酸緩衝液）を、ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌７〜９週齢（体重１７〜２１ｇ）の側腹部領域の皮下に注入した。腫瘍が２０〜６０ｍｍ３の体積に達した時点で、動物を無作為に３群に分け、そして、生理食塩水（コントロール）またはＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（２ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を、週３回３週間（合計９回の投薬）で静脈内投与（５０μｌ／注射）した。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出した。処置の終了時に、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出し、ヘマトキシリン染色の後に光学顕微鏡を用いて組織学検査を行った。全ての値は、平均±ＳＤとして表し、統計的解析は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔ検定により行った。差はＰ＜０．０５で有意とみなした。
コントロール群は、４８日目に１８８５ｍｍ３に達する段階的な腫瘍増殖を示した。一方、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドの投与（２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、１週間に３回の静脈内投与）は、顕著に腫瘍の増殖を抑制した（図１５Ａ（下側）、Ｂ）。４８日目に、平均腫瘍容積は、２ｍｇ／ｋｇ投薬群において９３３ｍｍ３、そして、５ｍｇ／ｋｇ投薬群において４１９ｍｍ３であった（コントロール群のマウスと比較してＰ＜０．０１）。図１５Ｃに示されるように、腫瘍細胞の数は、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドで処置したマウスにおいて劇的に減少した（図１５Ｃの右パネル）。これらの結果は、新たに設計したＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、インビボにおいて、腫瘍の死を首尾よく誘導することを示唆する。
（実施例１５：ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド）
本実施例では、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの活性を調べた。
野生型のＥＢ−Ｌｙｔｉｃ（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；配列番号２、下線はＤ体アミノ酸）および変異型のＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ（ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；配列番号４３、下線はＤ体アミノ酸）について、ＢＩＡＣＯＲＥシステムにより結合親和性の比較を行った。結果を図１６Ａに示す。また、ＣＤスペクトルを用いて、ＥＢ−ＬｙｔｉｃペプチドおよびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドの二次構造解析を行った。結果を図１６Ｂに示す。ペプチド濃度は５０μＭであった。ペプチド配列が異なること以外は、プロトコールは実施例１に準じる。
（細胞生存性アッセイ）
溶解性ペプチド、野生型ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド、およびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドを用いて、ＢＴ２０細胞に対する細胞傷害性の比較を行った。１ウェルあたり合計３×１０３細胞を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度のペプチドと共に、３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。結果を図１６Ｃに示す。
（ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃは、がん細胞に対する細胞傷害活性を高める）
がん細胞株Ｈ３２２、ＢＴ−２０、Ｕ２５１、ＢｘＰＣ−３、ＳＵ．８６．８６およびＬＮＣａＰを、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドまたはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドと共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図１７Ａに示す。また、正常細胞株ＭＲＣ−５およびＨＥＫ２９３を、種々の濃度（０〜２０μＭ）の上記ペプチドと共に７２時間培養し、細胞傷害活性を評価し、そして、上記のように細胞傷害性アッセイを行った。結果を図１７Ｂに示す。以上の結果から、新たに設計した溶解性ペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることが示された。
（ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃは、がん細胞の迅速な殺傷を誘導する）
Ｈ３２２細胞を、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（白色の柱）またはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒色の柱）で、２分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間または２４時間処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに２４時間細胞を培養した。ＷＳＴ−８を用いて、細胞生存率を解析した。結果を図１８に示す。以上の結果から、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが、原形質膜に透過して、がん細胞の迅速な殺傷を誘導することが示された。
結果を表２にまとめる。
（ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃは、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃよりも効率よくがん細胞膜を破壊する）
ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ＬｙｔｉｃとＥＢ−Ｌｙｔｉｃのがん細胞膜を破壊する能力について検討した。
可溶性蛍光分子であるカルセインを、ガラス底のディッシュ内のＨ３２２肺がん細胞に２μＭの最終濃度で加えた。少量のＬｙｔｉｃペプチド単独、ＥＢ−ＬｙｔｉｃまたはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ（１５μｌ）を、１０μＭの最終濃度でディッシュに直接加えた。ペプチド添加から０分、２分、５分、１０分、２０分後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて共焦点像を撮影した。その撮影像を図１９Ａに示す。
図１９Ａに示す像から、Ｌｙｔｉｃペプチド単独（上段）では緑色になった細胞（膜が破壊された細胞）の数が時間が経過しても変化していないのに対し、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（中断）およびＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチド（下段）では、緑色になった細胞の数が時間と共に増加しており、さらに、その数は、ＥＢ−ＬｙｔｉｃペプチドよりもＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドのほうが短時間で多くなることがわかる。
また、図１９Ｂに、細胞に培地の流入量の割合を図１９Ａの結果から計算した時間経過後との割合を示したグラフを示す。この図からも、細胞に培地が流入した割合が、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃペプチドのほうが、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチドよりも効率的にいいことがわかる。
カルセイン溶液による細胞膜透過の結果、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃのほうが、ＥＢ−ｌｙｔｉｃよりも効率的にいいことが判明したといえる。図１９ＡおよびＢについて、ネガティブコントロールとしては、図１９Ａの顕微鏡のデータでｌｙｔｉｃペプチドのみのものを採用することができる。すなわち、このｌｙｔｉｃペプチドは、単独では、膜溶解能力を発揮しにくいものである。そして、図１９Ｂがカルセイン含有培地の流入率をグラフ化したものである。これで、明らかに、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃの方が早く、膜が抜けていることがわかる。
（がん細胞においてＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ＬｙｔｉｃはＥＢ−Ｌｙｔｉｃよりも強くアポトーシス性の機構による細胞死を誘導する）
ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ＬｙｔｉｃとＥＢ−Ｌｙｔｉｃのがん細胞においてアネキシンＶ陽性化を誘導する能力について検討した。
実施例１の方法に準じて、アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼアッセイを行った。具体的には、ＢＴ２０細胞を、５μＭのＥＢ−ＬｙｔｉｃもしくはＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを用いて、または、これを用いずに、３７℃にて２時間処理した。カスパーゼの活性化またはアネキシンＶ陽性化を評価するために、ペプチドで処理した培養物を、カルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡカスパーゼ３＆７アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）を用いてカスパーゼ活性およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色について、あるいは、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンＶ標識およびＰＩ染色について、同時に解析した。その結果を図２０Ａ（アネキシンＶ）および図２０Ｂ（カスパーゼ活性）に示す。
図２０Ａについて、アネキシンＶ陽性化誘導がＥＢ−ｌｙｔｉｃよりＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃが優れているといえる。それぞれのペプチドで処理したＢＴ−２０細胞では、アネキシンＶ陽性細胞を示すパネル右半分の割合が増え、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃの方がより強くアネキシンＶ陽性化を誘導した。
また、図２０Ｂについて、カスパーゼ活性誘導がＥＢ−ｌｙｔｉｃよりＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃが優れているといえる。それぞれのペプチドで処理したＢＴ−２０細胞では、カスパーゼ３，７活性化細胞を示すパネル右半分の割合が増え、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃの方がより強くカスパーゼ３、７活性化を誘導した。
すぐれた抗がん剤という観点では、殺すより、自殺させて周りにまき散らさない方が生体内での副作用やその他の影響を考えた場合、はるかに利点があるとされている。本発明のキメラペプチドは、がん細胞に特異的な作用かつアポトーシス誘導の可能性が示唆されたという点で、殺すメカニズムが腫瘍の周りの細胞に障害等影響を与えにくく、医薬として優れているということができる。また、上記のようにアポトーシスの重要な指標であるアネキシンＶ陽性化とカスパーゼ３，７活性化を正確に計算する上でも重要であることから、この評価系を採用した。
また、本実施例では、本発明のペプチドを投与した場合、生細胞が顕著に減少していることも判明した。したがって、アポトーシス性の機構を介するか否かにかかわらず、本発明のペプチドは、選択的によりがん細胞を殺しているという証明にもなるといえる。
そして、ＥＢ−ｌｙｔｉｃやＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃは、従来の抗がん剤では達成できない程度およびその選択性でその殺細胞効果が優れているかが、本実施例によって証明されたといえる。
（ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担がんマウスモデルにおける、ＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドとＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍効果）
ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担がんマウスモデルにおいて、ＥＢ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドとＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍効果について検討した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を無胸腺ヌードマウスの皮下に移植し、移植から５日後に、動物を３群に分け（ｎ＝６／群）、生理食塩水（コントロール）、ＥＢ−Ｌｙｔｉｃペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）または、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静脈内注射した。経時的に腫瘍径を測定した結果を図２１に示す。
図から明らかなように、ＥＢペプチドの２番目のＨをＨからＲに変えたキメラペプチド（ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ）の方がｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果がＥＢ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（ＥＢ−Ｌｙｔｉｃ）に比べて高いことがわかる。
図４の結果では、１ｍｇ／ｋｇのペプチドの濃度で比べた結果であり、この結果から、１ｍｇ／ｋｇの全身投与でもＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃが十分に抗腫瘍効果を発揮できる点に留意すべきである。他の結果からも明らかなように、５ｍｇ／ｋｇを投与すれば、抗がん作用はかなりの治療レベルに達することが理解される。そして、１ｍｇ／ｋｇでの投与については、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃとすれば、依然として十分な効果を奏したことは、従来の技術水準からすると正に驚くべき数値であるというべきである。
すなわち、ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃは１ｍｇ／ｋｇの濃度でも十分な抗腫瘍効果を示しており、非常に有望な抗がん治療薬であることがわかる。
（実施例１６：ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド）
本実施例では、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの活性を調べた。
（ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃは、がん細胞に対する細胞傷害活性を高める）
ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；配列番号１７、下線はＤ体アミノ酸）を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３細胞のがん細胞株Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫＢＲ−３を、種々の濃度（０〜３０μＭ）のＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドまたは溶解性ペプチドと共に７２時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図２２Ａに示す。また、正常細胞株ＭＲＣ−５、ＰＥおよびＨＣを、種々の濃度（０〜１００μＭ）の上記ペプチドと共に７２時間培養し、そして、細胞傷害活性を評価した。未処理の細胞から得た絶対値を１００％とした。結果を図２２Ｂに示す。さらに、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを加えることによる細胞傷害性の増強について、ＴｆＲ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＩＣ５０および溶解性ペプチドのＩＣ５０、または溶解性ペプチド／ＴｆＲ−ＬｙｔｉｃキメラペプチドのＩＣ５０比を検討した。ＩＣ５０値間に相関性が認められた。これらの結果から、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチドが、がん細胞に対する細胞傷害活性を高めるためのキメラペプチドに適していることが示された。結果を表３にまとめる。
（ＴｆＲ−ＬｙｔｉｃはＴｆＲ発現がん細胞特異的に迅速な殺傷を誘導する）
ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチドが、原形質膜に透過して、Ｔ４７Ｄがん細胞を迅速に殺傷することを示す。Ｔ４７Ｄ細胞を、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（黒色の柱）または溶解性ペプチド（白色の柱）で、種々の時間（１〜１８０分）にわたり処理し、その後、ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、そして、さらに７２時間細胞を培養し、ＷＳＴ−８を用いて細胞生存率を解析した。結果を図２４Ａに示す。
また、１０μＭの濃度でＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドを加えてから、０分後、５分後、１０分後および１５分後の、カルセイン溶液中の細胞を観察した。Ｔ４７Ｄ乳がん細胞において膜を透過したＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドが認められた（図２４Ｂ）。
さらに、ペプチド（５μＭ）処理前に、Ｔ４７Ｄ細胞を、増大する濃度の抗ＴｆＲモノクローナル抗体または非特異的なマウスＩｇＧ１（アイソタイプコントロール）と共に３時間インキュベートしたところ、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの細胞生存性の阻害が示された（図２５Ａ）。
（がん細胞株に対するｓｉＲＮＡまたはスクランブルの配列（ｓｃ）ＲＮＡの細胞傷害性）
Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ｓｉＲＮＡまたはｓｃＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションから４日後に、フローサイトメトリー解析により細胞における標的遺伝子のレベルを解析した（データ示さず）。ＷＳＴ−８試薬を用いて阻害率を評価した。アッセイは３回繰り返し、結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。結果を図２５Ｂに示す。
（ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドががん細胞でのアポトーシス性の機構を介した細胞死を誘導する可能性）
Ｔ４７Ｄ細胞およびＰＥ細胞を、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１０μＭ）および溶解性ペプチド（１０μＭ）と共に２時間インキュベートした。アネキシンＶ（図２６Ａ）及びカスパーゼ３＆７活性（図２６B）を緑色チャネルで、ヨウ化プロピジウム染色を赤色チャネルで検出し、フローサイトメトリーで解析した。ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド処理したＴ４７Ｄ細胞では、アネキシンＶ陽性及びカスパーゼ３＆７活性細胞を示すパネル右半分の割合が増えていた。一方で、正常細胞ＰＥでは、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド処理を行ってもアネキシンＶ陽性及びカスパーゼ３＆７活性細胞の割合が増えておらず、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドががん細胞選択的にアポトーシス性の機構によりがん細胞の死を誘導することが示唆された。
（がん細胞株におけるアポトーシス性の機構による細胞死の誘導に対する、種々の溶解性ペプチドの作用の比較）
ミトコンドリア膜貫通型電位依存性蛍光色素ＪＣ−１で標識したＴ４７Ｄ細胞を、未処理のまま（処理なし：上左パネル）か、スタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）（コントロールミトコンドリア膜電位：上右パネル）もしくは、溶解性ペプチド（下左パネル）、もしくはＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（下右パネル）で処理し、その２時間後に、フローサイトメトリーにより、膜貫通電位を示す赤色蛍光または緑色蛍光の変化における差示的な割合を解析した。結果を図２６Ｃに示す。
また、Ｔ４７Ｄ細胞を、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド（１０μＭ）および溶解性ペプチド（１０μＭ）と共にインキュベートし、２時間後に細胞質抽出物を単離し、そして、チトクロムｃに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析により、チトクロムｃの放出を調べた。ウェスタンブロット解析の結果を図２６Ｄに示す。
（インビボでのＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍活性）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール）またはＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチド（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを腫瘍内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図２７Ａに示す。
また、同様にしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を皮下移植した無胸腺ヌードマウスに、矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール）またはＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃペプチド（０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静脈内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図２７Ｂに示す。
インビボでのＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの抗腫瘍活性が認められた。
（実施例１７：ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃキメラペプチド）
本実施例では、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃキメラペプチドの活性を調べた。
（ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）はがん細胞に選択的な毒性を示す）
Ｌ体のみのＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ（ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；配列番号１８）およびＤＬ混合ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｄ，Ｌ）（ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；配列番号４４、下線はＤ体アミノ酸）を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３細胞の正常細胞株ＷＩ−３８（Ａ，Ｂ）およびがん細胞株ＫＣＣＴ８７３（Ｃ，Ｄ）を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度（０〜３０μＭ）のＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ）キメラペプチド、溶解性（Ｌ）ペプチド、ＩＬ−４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチド、または、溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチドと共に、３７℃にて７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。結果を、図２９および表４に示す。
以上の結果から、Ｄ，Ｌ体の混合配列を用いるほうが、そうでないＬ体のみのものに比べて、治療上好ましいものが得られたといえる。そして、がん細胞と正常細胞との選択性も保持されたことが確認された。
（がん細胞株の細胞表面におけるＩＬ−４Ｒα発現の検出）
Ａ１７２、ＢｘＰＣ−３および正常細胞株ＨＥＫ２９３からの総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで、ＩＬ−４Ｒα特異的プライマーを用いた定量的ＰＣＲにより検出した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として用いた。結果を図３０に示す。
（ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドは、がん細胞を迅速に殺傷する）
ＰＥ細胞（Ａ）、ＫＣＣＴ８７３細胞、ＢｘＰＣ−３細胞（Ｂ）を、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチド（黒色の柱）または溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチド（白色の柱）で、２分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、または２時間処理した。ペプチドを含む培地を新しい培地と交換し、さらに７２時間細胞を培養した。ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞生存率を決定した。結果を図３１に示す。
（ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドによるがんの細胞死がアポトーシス性機構を介する可能性）
正常細胞であるＰＥ細胞、およびがん細胞であるＫＣＣＴ８７３細胞を、ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドまたは溶解性（Ｌ，Ｄ）ペプチド（１０μＭ）と共に２時間インキュベートし、次いで、緑色チャネルにおいてアネキシンＶ標識について、そして、赤色チャネルにおけるＰＩ染色について、二色フローサイトメトリーで解析した。結果を図３２に示す。数値は各四分区画における細胞の割合％を示している。
（インビボでのＩＲ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）キメラペプチドの抗腫瘍活性）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール）またはＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）ペプチド（０．５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを腫瘍内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図３３Ａに示す。
また、同様にしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を皮下移植した無胸腺ヌードマウスに、矢印で示すように、５日目から、生理食塩水（コントロール）またはＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｌ，Ｄ）ペプチド（２ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静脈内注射した。各群は３匹の動物（ｎ＝３）から構成された。経時的に腫瘍径を測定した結果を図３３Ｂに示す。
（実施例１８：Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃキメラペプチド）
本実施例では、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃキメラペプチドの活性を調べた。
（種々の細胞株に対するＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃの細胞傷害活性）
新たに設計したｎＬｙｔｉｃペプチド（ＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ；配列番号４５、下線はＤ体アミノ酸）、Ｓｅｍａ３Ａ（ａａ３６３−３７７）−ｎＬｙｔｉｃペプチド（ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ；配列番号４６、下線はＤ体アミノ酸）およびＳｅｍａ３Ａ（ａａ３７１−３７７）−ｎＬｙｔｉｃペプチド（Ｄ，Ｌ）（ＧＲＶＰＹＰＲＧＧＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ；配列番号４７、下線はＤ体アミノ酸）を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３細胞の膵臓細胞株を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度（０〜５０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃペプチドまたはｎＬｙｔｉｃペプチドのみと共に、３７℃にて４８時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。結果を図３４Ａおよび表５に示す。
（乳がん細胞株に対するＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃの細胞傷害活性）
乳がん細胞を、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ（３７１−３７７）−ｎＬｙｔｉｃまたはＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｎＬｙｔｉｃと共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を図３４Ｂおよび表６に示す。
正常細胞では、表５にあるように、ＩＣ５０が＞５０程度の数値であることから、表６に示されるがん細胞の方が低濃度で効果が出ていることを考慮すると、正常細胞とがん細胞との選択性があると考えられる。
（種々の細胞株に対するＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃの細胞傷害活性）
種々の細胞を、種々の濃度（０〜２０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３６３−３７７）またはＳｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ（３７１−３７７）と共に４８時間培養し、そして、ＷＳＴ−８試薬を用いて細胞傷害活性を評価した。アッセイは３回繰り返し、結果は、三連の測定の平均±ＳＤ（バー）として表した。結果を図３４Ｃおよび表７に示す。
また、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて、Ｓｅｍａ３Ａの野生型ペプチドおよびいくつかの変異ペプチドの、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）との相互作用を解析した。結果を図３５に示す。（Ａ）Ｓｅｍａ３Ａ野生型ペプチドのＮＲＰ−１タンパク質への結合。段階希釈した種々の濃度（１．６μＭ、１３μＭ、２６μＭ）のＳｅｍａ３Ａ野生型ペプチドのサンプルを、パラレルセンサ表面上で解析した。（Ｂ）Ｓｅｍａ３Ａの野生型ペプチドおよび変異ペプチド（Ｒ３７２ＫおよびＲ３７２Ｋ／Ｒ３７７Ｋ）のＮＲＰ−１タンパク質への結合。段階希釈した種々のＳｅｍａ３Ａペプチド（２６μＭ）のサンプルを、パラレルセンサ表面上で解析した。（Ｃ）種々のＳｅｍａ３ＡペプチドのＮＲＰ−１タンパク質への結合能のまとめ。（Ｄ）Ｓｅｍａ３Ａの野生型ペプチドおよび変異ペプチドのペプチド配列。
（膵臓がん細胞株および乳がん細胞株におけるニューロピリン−１の発現）
いくつかの膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ−３、ＣＦＰＡＣ−１、Ｐａｎｃ−１およびＳＵ８６８６）および膵臓上皮細胞、ならびに乳がん細胞株（ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ−３、およびＴ４７Ｄ）におけるニューロピリン−１の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ解析により見積もった。全てのＲＴ−ＰＣＲ解析において、β−アクチンをポジティブコントロールとして用いた。結果を図３６に示す。
（Ｓｅｍａ３Ａ−Ｌｙｔｉｃによるがんの細胞死がアポトーシス性機構を介する可能性）
ＰＥ細胞（上パネル）およびＢｘＰＣ−３細胞（下パネル）を、Ｓｅｍａ３Ａ−Ｌｙｔｉｃペプチド（５μＭ）と共に３７℃で３時間インキュベートし、６時間後に、アネキシンＶ標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。結果を図３７に示す。図から明らかなように、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ処理したＢｘＰＣ−３細胞では、アネキシンＶ陽性細胞を示すパネル右半分の割合が増えていた。一方で、正常細胞ＰＥでは、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃ処理を行ってもアネキシンＶ陽性細胞の割合が増えておらず、Ｓｅｍａ３Ａ−ｎＬｙｔｉｃががん細胞選択的にアポトーシス性の機構によりがん細胞の死を誘導することが示唆された。
（実施例１９：Ｓｅｍａ３Ａ−ｋＬｙｔｉｃキメラペプチド）
本実施例では、新たに設計したｋＬｙｔｉｃペプチド（ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；下線はＤ体アミノ酸、配列番号４９）と、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチド（ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ；下線はＤ体アミノ酸、配列番号５０）とを用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３細胞の膵臓細胞株を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度（０〜５０μＭ）のＳｅｍａ３Ａ(ａａ３６３−３７７)−ｋＬｙｔｉｃペプチドまたはｋＬｙｔｉｃペプチド単独と共に、３７℃にて４８時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。結果を図３８および表８に示す。
表８に示されるように、がん細胞の方が低濃度で効果が出ていることを考慮すると、正常細胞とがん細胞との選択性があると考えられる。
（膵臓がん細胞株におけるニューロピリン−１の発現）
いくつかの膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ−１、ＳＵ８６８６およびＣＦＰＡＣ−１）および膵臓上皮細胞におけるニューロピリン−１の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ解析により見積もった。全てのＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＧＡＰＤＨをポジティブコントロールとして用いた。結果を図３９Ａに示す。
また、それぞれの細胞に対して、リアルタイムＰＣＲを用いて、ニューロピリン−１の発現の定量を行った。すべてのコントロールには、ＧＡＰＤＨを用いて解析を行った。結果を図３９Ｂに示す。
図３９Ａおよび図３９Ｂから明らかなように、ＳＵ８６８６およびＣＦＰＡＣ−１では、ＮＲＰ−１の発現量が高かった。これらの細胞株では、Ｓｅｍａ３Ａ(３６３−３７７)−ｋＬｙｔｉｃペプチドによる殺傷効果が良かったことから、ＮＲＰ−１を標的としたキメラペプチドでの抗がん効果が期待できる。
（Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃによるがんの細胞死がアポトーシス性機構を介する可能性）
ＮＲＰ−１を高発現するヒト膵臓がん細胞株ＳＵ８６８６細胞において、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチドがアネキシンＶ陽性化を誘導するかどうか検討した。
ＳＵ８６８６細胞をＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチド（１０μＭ）と共に３７℃で３時間インキュベートし、アネキシンＶ標識について二色フローサイトメトリーにより解析した。結果を図４０に示す。図から明らかなように、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃで処理したＳＵ８６８６細胞では、アネキシンＶ陽性細胞を示す右半分パネルの割合が増えており、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃも同様に、がん細胞に対してアポトーシス性の機構による細胞死を誘導することが示唆された。
すなわち、これらの結果から、Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチドについても、インビボでＥＢ（Ｈ２Ｒ）−ｌｙｔｉｃと同程度の抗がん効果が期待できる。
（Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん作用）
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３、５×１０６細胞／１５０μｌ リン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回、３週間にわたりＳｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチドをマウス１匹あたり０、０．５、１、２、５ｍｇ／ｋｇ／５０μｌ リン酸緩衝液で静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出する。
（実施例２０：ＶＥＧＦＲ２−Ｌｙｔｉｃペプチド）
ＶＥＧＦＲ２−ｌｙｔｉｃペプチド：ＡＴＷＬＰＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体アミノ酸、配列番号５１）を用いて、がん細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
１ウェルあたり合計３×１０３細胞の５種類のがん細胞株（ＯＥ１９、Ｔ４７Ｄ、ＢｘＰＣ-３、Ｕ９３７およびＬＮＣａＰ）および２種類の正常細胞株（ＨＥＫ２９３およびＭＲＣ−５）を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度（０〜２０μＭ）のＶＥＧＦＲ２−ｌｙｔｉｃペプチドと共に７２時間培養し、ＷＳＴ−８試薬（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて細胞傷害活性を評価した。結果を表９および図４１に示す。
表に示されるように、がん細胞の方が低濃度で効果が出ていることを考慮すると、正常細胞とがん細胞との選択性があると考えられる。
（ＶＥＧＦＲ２−Ｌｙｔｉｃペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん作用）
（プロトコール）
ヌードマウスｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、雌５週齢の皮下にヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３， ５×１０６細胞／１５０μｌ リン酸緩衝液を注入し、移植から５日後より週３回で、３週間にわたりＶＥＧＦＲ２−Ｌｙｔｉｃペプチドをマウス１匹あたり０、０．５、１、２、５ｍｇ／ｋｇ／５０μｌ リン酸緩衝液で静脈内投与する。腫瘍径を経時的に電子ノギスで計測し、長径×短径×短径×０．５として腫瘍容積（ｍｍ３）を算出する。
（実施例２１：ペプチド安定性試験）
実施例１において製造したキメラペプチドの安定性を検討する。
（プロトコール）
−２０℃、４℃、２５℃で、生理食塩中、もしくは血清中にペプチドトキシンを短期あるいは長期保存し、ＨＰＬＣによる定量解析および培養がん細胞への殺細胞効果等によって、化学的、生物学的活性を評価する。
（実施例２２：ＥＧＦＲ高発現がん細胞におけるＥＧＦＲとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬／抗がん剤のスクリーニング方法）
本実施例では、ＥＧＦＲ高発現がん細胞におけるＥＧＦＲとそのがん細胞膜の両方をターゲットとするアミノ酸配列を用いる、医薬／抗がん剤のスクリーニング方法を実証する。
（プロトコール）
ＥＧＦＲ高発現がん細胞（ヒト肺がん細胞株Ｈ３２２等）の細胞膜標品を調製し、以下のようにＢＩＡＣＯＲＥ解析を行う。スクリーニングされる被験薬物はビオチン化しておく必要がある。
ＢＩＡＣＯＲＥバイオセンサーシステム３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行う。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド活性化化学により約５０００ＲＵのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）をＣＭ５センサーチップの表面に固定し、次いで、ビオチンを結合した２０００〜３０００ＲＵのペプチド等被験薬物を、このストレプトアビジンを固定したセンサーチップの上に注入する。非特異的な結合のコントロールとして、ストレプトアビジンを固定していないセンサーチップの反応していないカルボキシメチル基を、エタノールアミンでブロックする。分析物として、Ｍｅｍ−ＰＥＲ真核生物膜タンパク質抽出試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて調製した細胞表面タンパク質を、２５℃にて２０μｌ／分の流速のフローセルに注入する。アッセイの間に非特異的な結合を防ぐために、ＨＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、３ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ７．４］）を泳動緩衝液として用いる。これらの実験において用いた全てのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭＭ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７６；７２：２４８−５４）により決定する。データの解析は、ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒ．３．２ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて行う。
（結果）
被験薬物を固定化したセンサーチップへＥＧＦＲ高発現がん細胞の膜標品を反応させる。
ＥＧＦＲ及びがん細胞膜の両方へ結合する被験薬物の場合にはより高い応答を示し、被験薬物をスクリーニングできる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明により、副作用が軽減された抗がん剤が提供される。
配列番号１：がん細胞膜溶解性ペプチドのアミノ酸配列である。
ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線は、Ｄ体を示す）
配列番号２：ＥＢ（ＥＧＦＲ結合）−がん細胞膜溶解性キメラペプチドのアミノ酸配列である。
ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線は、Ｄ体を示す）
配列番号３：組換えヒトＥＧＦレセプター（ｒｈＥＧＦＲ）のアミノ酸配列である。ＮＰ＿００５２１９（１２１０ＡＡのうちのＮ末側２４ＡＡ下線部を除いた部分の残り１１８６ＡＡ）
配列番号４：ミトコンドリア毒性ペプチドおよびアポトーシス促進性ペプチドに含まれるポリカチオン性のアミノ酸配列である。ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ
配列番号５：繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の受容体結合ペプチドのアミノ酸配列：ＭＱＬＰＬＡＴ
配列番号６：繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の受容体結合ペプチドのアミノ酸配列：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ
配列番号７：ＥＧＦ受容体結合ペプチドであるアミノ酸配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ
配列番号８：ＥＧＦ受容体結合ペプチドであるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２
配列番号９：ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ
配列番号１０：ＹＫＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ
配列番号１１：ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ
配列番号１２：ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ
配列番号１３：ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ
配列番号１４：ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ：ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ
配列番号１５：ＨＥＲ２−Ｌｙｔｉｃ：ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号１６：ＶＥＧＦＲ１−Ｌｙｔｉｃ：ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬＧＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号１７：ＴｆＲ−Ｌｙｔｉｃ：ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号１８：ＩＬ４−ＬｙｔｉｃＬ：ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ
配列番号１９：ＩＬ１３−ＬｙｔｉｃＬ：ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ
配列番号２０：Ｓｅｍａ３Ａ−ＬｙｔｉｃＬ＜ヒトニューロピリン−１への結合＞：ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ
配列番号２１：ＥＧＦｂｕｆ：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＧＧＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＫ
配列番号２２：インターロイキン１１受容体（ＩＬ１１Ｒ）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（環状）
配列番号２３：細胞透過性ペプチドＴＡＴ配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
配列番号２４：細胞透過性ペプチドＲ１１配列：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ
配列番号２５：細胞障害性ペプチド：ＲＱＩＫＩＱＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ
配列番号２６：ＩＬ４Ｒ結合ペプチド配列：ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮ
配列番号２７：ＬｙｔｉｃＬ：ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（すべてＬ体アミノ酸のみ）
配列番号２８：ＩＬ１３Ｒ結合ペプチド配列：ＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＱＦＮ
配列番号２９：ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）受容体結合ペプチドとの結合に必要な配列（リガンドＳｅｍａ３Ａとの結合に重要な配列）：ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲ
配列番号３０：ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド配列：ＹＣＤＧＦＹＡＣＹＭＤＶ
配列番号３１：血管上皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）結合ペプチドのアミノ酸配列：ＷＨＳＤＭＥＷＷＹＬＬＧ
配列番号３２：血管上皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）結合ペプチドのアミノ酸配列：ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ
配列番号３３：血管上皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）結合ペプチドのアミノ酸配列：ＧＧＮＥＣＤＡＩＲＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ
配列番号３４：トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴｆＲ）結合ペプチドのアミノ酸配列：ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ
配列番号３５：前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＣＱＫＨＨＮＹＬＣ
配列番号３６：ニューロピリン１（ＮＲＰ１）／血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＡＴＷＬＰＰＲ
配列番号３７：エフリンＢ１（ＥｐｈＢ１）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＥＷＬＳ
配列番号３８：エフリンＢ２（ＥｐｈＢ２）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＳＮＥＷ
配列番号３９：グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ
配列番号４０：グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）の結合ペプチドのアミノ酸配列：ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（環状）
配列番号４１：オリジナルＬｙｔｉｃペプチド：ＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬ−ＮＨ２（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４２：ＥＢ−オリジナルＬｙｔｉｃ：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧ ＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬ−ＮＨ２（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４３：ＥＢ（Ｈ２Ｒ）−Ｌｙｔｉｃ：ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧ ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４４：ＩＬ４−Ｌｙｔｉｃ（Ｄ，Ｌ）：ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＧＧＧ ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４５：ｎＬｙｔｉｃ：ＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４６：Ｓｅｍａ３Ａ（ａａ３６３−３７７）−ｎＬｙｔｉｃ：ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４７：Ｓｅｍａ３Ａ（ａａ３７１−３７７）−ｎＬｙｔｉｃ：ＧＲＶＰＹＰＲＧＧ ＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＫＬＬＫＬ（下線はＤ体、他はＬ体アミノ酸）
配列番号４８：ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ、ここで各アミノ酸は、独立してＬ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合である。
配列番号４９：ｋＬｙｔｉｃペプチド：ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体アミノ酸、他はＬ体アミノ酸）
配列番号５０：Ｓｅｍａ３Ａ（３６３−３７７）−ｋＬｙｔｉｃペプチド：ＮＹＱＷＶＰＹＱＧＲＶＰＹＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体アミノ酸、他はＬ体アミノ酸）
配列番号５１：ＶＥＧＦＲ２−ｌｙｔｉｃペプチド：ＡＴＷＬＰＰＲＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（下線はＤ体アミノ酸、他はＬ体アミノ酸）
配列番号５２：ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド配列：ＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ
配列番号５３：ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド配列：ＡＬＶＲＹＫＤＰＬＦＶＷＧＦＬ
配列番号５４：ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド配列：ＫＣＣＹＳＬ
配列番号５５：ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド配列：ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ
配列番号５６：ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）結合ペプチド配列：ＤＴＤＭＣＷＷＷＳＲＥＦＧＷＥＣＡＧＡＧ
配列番号５７：Ｔａｔ［ヒト免疫不全ウイルス１］のアミノ酸配列（ＮＰ＿０５７８５３）：ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰ ＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴ ＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣ ＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴ ＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ ＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱ ＮＳＱＴＨＱＡＳＬＳ ＫＱＰＴＳＱＰＲＧＤ ＰＴＧＰＫＥ

Claims (12)

  1. 上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体結合ペプチドと、細胞殺傷性ペプチドとを含むキメラペプチドであって、該ＥＧＦ受容体結合ペプチドは、ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号９）またはＹＫＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号１０）を有し、該細胞殺傷性ペプチドは、ＫおよびＬのみからなる１０〜２０個連なったアミノ酸配列を有し、該アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合である細胞膜溶解性ペプチドである、キメラペプチド。
  2. 前記細胞膜溶解性ペプチドは、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４８）であり、該アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体もしくはＤＬ混合である、請求項１に記載のキメラペプチド。
  3. 前記細胞殺傷性ペプチドは、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号１）であり、ここで、各アミノ酸はＬ体またはＤ体であり、下線は、Ｄ体を示す、請求項１または２に記載のキメラペプチド。
  4. スペーサーペプチドをさらに有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
  5. 前記スペーサーペプチドはグリシンまたはプロリンまたはその混合物が０〜５個連なった配列である、請求項４に記載のキメラペプチド。
  6. 前記スペーサーペプチドはＧＧＧである、請求項４または５に記載のキメラペプチド。
  7. ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩＧＧＧＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４３）の配列を有するものであり、下線は、Ｄ体を示す、請求項１に記載のキメラペプチド。
  8. 請求項１、２または４〜６のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸であって、前記アミノ酸はＬ体である核酸。
  9. 請求項１、２または４〜６のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸を含むベクターであって、前記アミノ酸はＬ体であるベクター。
  10. 請求項１、２または４〜６のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸を含む細胞であって、前記アミノ酸はＬ体である細胞。
  11. 請求項１〜７のいずれかに記載のキメラペプチドを含む医薬組成物。
  12. 請求項１〜７のいずれかに記載のキメラペプチドを含む抗がん剤。
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