JP2009533030A - リアルタイムマルチプレックス増幅によるhpv検出および定量化 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
−ウイルス複製および腫瘍性の形質転換に関与する遺伝子E1、E2、E4、E5、E6およびE7を含む早期コード領域、
−ウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子L1およびL2を含む後期コード領域、
−LRC(Long Control Region)と呼ばれ、E遺伝子とL遺伝子の間に位置する非コード制御領域。
HPVは、扁平上皮内の病変(SILs)の発生における主要なリスクファクターであり、重篤度により低いグレード(LSIL)または高いグレード(HSIL)に分類される。
さらに、いくつかのHPVの型を含むHPV多感染は、一般的な状況である:多感染は、約20%のHPV感染のケースを説明すると考えられる。HPV多感染の場合は、全てが発癌性のHPVである、または少なくとも1の発癌性のHPVおよび少なくとも1の発癌性でないHPVを含んでなるHPVの型が含まれてよい。HPV多感染の場合は、全てが粘膜のHPV型であるか、または少なくとも1の粘膜型および少なくとも1の皮膚型を含むHPV型が含まれてよい。
そのような多感染および/または共感染の場合は、正確なHPV検出がずっと難しくなる。
さらに、Amplicor HPV試験は定量的な分析ではない。
これらのリアルタイムPCRは、FRET(ライトサイクラー)に基づくか、またはTaqManプローブ(アプライドバイオシステムズ)を使用する。
−A6またはA5またはA9またはA7の群に属する少なくとも1のHPVの検出、または
−A6HPV群またはA5HPV群またはA9HPV群またはA7HPV群のサブセットに属する少なくとも1のHPVの検出、または
−少なくとも1の特定のHPV型の検出。
そのような達成は、先行技術のHPV検出系と比較して技術的な進歩を表すと信じる。
−プライマーに関して:開始点および終結点は、プライマーの配列が対応する参照HPV断片の開始点および終結点(フォワードプライマーの場合)、またはプライマーがアニールする参照HPV標的断片の開始点および終結点(リバースプライマーの場合)である;
−プローブに関して:プローブおよびその相補的な配列は、少なくともシンプレックス増幅において、均等な機能を有し、開始点および終結点は、プローブの配列が対応する参照HPV断片の配列、またはプローブがアニールする参照HPV標的断片の配列である。
それに対して、本発明のプライマーはHPV群(=HPV属)により設計される。
本発明者は、粘膜上皮の発癌に関与する1つのHPVサブファミリー、すなわちサブファミリーAを選択した。彼らはさらに、HPVサブファミリーAの代表であるHPV型の組を選択した。この代表的な組は、35の異なるHPV型で構成され、そのうちの18の型は少なくとも潜在的に発癌性のHPVである粘膜HPVであり(すなわち、13のHRとして既知の13のHPV;2つの潜在的なHR HPVであるHPV53およびHPV66;および発癌の可能性を有すると考えられている3つの他のHPVであるHPV82、HPV67およびHPV85)、残りの17の他のHPV型は、これまでに非発癌性HPVとして既知である(図1を参照されたい)。
−A6群(HPV66、HPV56、HPV53);
−A5群(HPV51、HPV82);
−A9群(HPV58、HPV33、HPV67、HPV52、HPV35、HPV31、HPV16);
−A7群(HPV68、HPV39、HPV85、HPV59、HPV45、HPV18)。
少なくとも5の最も一般的なHR HPV型、好ましくは少なくとも7のHR HPV、さらに好ましくは5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5の群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、より好ましくは少なくとも13のHR HPV型をシングルチューブ実験で網羅することに加えて、本発明により与えられる手段は、患者が有し得る特定の変種を検出する可能性がある。それ故、本発明の方法は、いずれの先行技術の方法よりもずっと安全である。
−いくつかのA6を標的とする増幅および検出系
−いくつかのA5を標的とする増幅および検出系
−いくつかのA9を標的とする増幅および検出系
−いくつかのA7を標的とする増幅および検出系。
少なくとも5の最も一般的なHR HPV(すなわち、HPV16、18、45、31、33)、
好ましくは、少なくとも7のHR HPV、
さらに好ましくは、5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5の群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、
さらに好ましくは、HR HPVとして既知の少なくとも13のHPV(HPV56、51、58、33、52、35、31、16、68、39、59、45および18)、
より好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85および53の中の少なくとも1、
さらに好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85および53の中の少なくとも2、
さらに好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85および53の中の少なくとも3、
最も好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85および53の中の少なくとも4、特に前記13のHR HPVおよびHPV型66、82、67、85からなる少なくとも17の粘膜HPV、
さらに最も好ましくは、少なくとも13のHPVならびに少なくとも5のHPV型66、82、67、85、および53
のシングルチューブアッセイにおける検出を可能にする。
上述したように、本発明の増幅系および検出系は、真に新しい群に基づくアプローチに基づく。
本発明の検出プローブ系は、少なくとも1のプローブを含んでなる。
本発明の増幅プライマー系は、好ましくは、A6またはA5またはA9またはA7の群に属するHPV、すなわち発癌性HPVを増幅する。
いずれの場合にも、本発明のリアルタイム増幅系はヒト核酸であり得る核酸を検出する。
−表12〜35:これらの表は、参照アンプリコンの配列番号および位置(これらの参照鋳型アンプリコンの配列は、最後の表の後、すなわち「特許請求の範囲」の前にも示されている)、本発明の実例となる群を標的とする系のフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブ、ビーコンプローブを与える;
−表35〜50:これらの表は、本発明のプライマーおよびプローブにより示されるヌクレオチドのミスマッチの数を示し(50のHPV型のアラインメント);空のボックスは、整合する配列アラインメントがないことを意味する;
−表51〜68:本発明の検出系の特異性;
−表69〜82:系の反応性;
−表83〜88:「メガプレックス」の特異性および反応性;
−表89:HPVゲノム配列の一覧。
−A5群:参照ゲノムは、受付番号NC_001533.1で入手可能なHPV51のゲノム配列である、
−A6群:参照ゲノムは、受付番号NC_001594.1で入手可能なHPV56のゲノム配列である、
−A7群:参照ゲノムは、受付番号NC_001357.1で入手可能なHPV18のゲノム配列である、
−A9群:参照ゲノムは、受付番号NC_001526.1で入手可能なHPV16のゲノム配列である。
−アドレスXを有するフォワードプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Xから開始する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形である配列を有する(以下の表のミスマッチ数を参照されたい);
−アドレスXを有するリバースプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Xで終結する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形に相補的な配列を有する(以下のミスマッチ数の表を参照されたい);
−アドレスXを有するプローブは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、その配列は、前記参照ゲノムにおける位置Xから開始する参照ゲノムの断片の配列であるか、そのような断片の配列の相補的な配列であるか(この断片の配列の全長に渡って)、またはそのような断片の配列もしくはそのような相補的な断片の配列の変形(以下のミスマッチ数の表を参照されたい)。
−アドレスXfおよび長さLfを有するフォワードプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Xfから開始し、前記参照ゲノムにおけるXf+Lf−1の位置で終結する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形の配列である配列を有する(以下に示すアラインメントを参照されたい);
−アドレスXrおよび長さLrを有するリバースプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Xr−Lr−1から開始し、位置Xrで終結する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形に相補的である配列を有する(以下に示すアラインメントを参照されたい);
−アドレスXpおよび長さLpを有するプローブは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、その配列は、前記参照ゲノムにおける位置Xpから開始し、位置Xp+Lp−1で終結する参照ゲノムの断片の配列か、またはそのような断片の配列に相補的な配列であるか、またはそのような断片の配列もしくはそのような相補的な断片の配列の変形である(以下に示すアラインメントを参照されたい)。
−前記サンプルまたはその核酸物質を、前記プライマーによる少なくとも1のアンプリコンの産生に適した条件下(すなわち、検出されるべき前記少なくとも1のHPVが前記サンプル中に存在する場合、前記HPVから少なくとも1のアンプリコンを前記プライマーを用いて作ることができる条件下)で、少なくとも2の本発明の増幅プライマーおよび/または少なくとも1の本発明のプライマー系と接触させることと、
−少なくとも1のアンプリコンが前記プライマーにより作られたかどうかを決定することと(例えば、少なくとも1の検出プローブを用いて、好ましくは本発明の少なくとも1のプローブおよび/または本発明の少なくとも1の検出プローブ系を含むリアルタイム増幅で)、
少なくとも1のアンプリコンの産生は、粘膜上皮に対して向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性HPVであり、好ましくは少なくとも1の発癌性肛門性器HPVであり、最も好ましくは少なくとも1の発癌性子宮頸HPVである少なくとも1のHPVが前記サンプル中に存在することを示す。
少なくとも5の最も一般的なHR HPV(すなわち、HPV16、18、45、31、33)、
好ましくは、少なくとも7のHR HPV、
さらに好ましくは、5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合には、A6および/またはA5の群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、
さらに好ましくは、HR HPVとして既知の少なくとも13のHPV(HPV56、51、58、33、52、35、31、16、68、39、59、45および18)、
より好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも1、
さらにより好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも2、
さらにより好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも3、
最も好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも4、特に前記13HR HPVおよびHPV型66、82、67、85からなる少なくとも17の粘膜HPV、
さらに最も好ましくは、少なくとも13のHPVならびに少なくとも5のHPV型66、82、67、85、および53、
のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出をシングルチューブアッセイで可能にする。
−少なくとも1の抗HPV候補薬物を提供することと、
−前記少なくとも1の候補抗HPV薬を細胞培養または非ヒト動物に投与することと(前記細胞培養または動物は少なくとも1の子宮頸部の新形成または癌であるか、含んでなる)、
−前記候補抗HPV薬が前記少なくとも1の新形成または癌の退行または消滅を引き起こすかどうかを本発明のHPV検出方法により決定することと
を含んでなり;
それによる陽性の決定は、前記候補薬物が効果的な抗HPV薬であることを示す。
−A6群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー(前記少なくとも2のA6を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、14〜30のヌクレオチド、好ましくは15〜29、より好ましくは16〜28、最も好ましくは17〜25のヌクレオチドからなり、その配列は、HPV56のE6およびE7遺伝子からなるA6を標的とする領域からの少なくとも1の90〜390ヌクレオチドの核酸、好ましくは95〜385ヌクレオチド、より好ましくは100〜379ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している)、および/または
−A5群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー(前記少なくとも2のA5を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、14〜30のヌクレオチド、好ましくは15〜29、より好ましくは16〜28、最も好ましくは17〜25のヌクレオチドからなり、その配列は、HPV51のE7およびE1遺伝子からなるA5を標的とする領域からの少なくとも1の少なくとも90〜240ヌクレオチドの核酸、好ましくは100〜230ヌクレオチド、より好ましくは106〜225ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している)、および/または
−A9群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー(前記少なくとも2のA9を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、14〜30のヌクレオチド、好ましくは15〜29、より好ましくは16〜28、最も好ましくは17〜25のヌクレオチドからなり、その配列は、以下のA9群のHPVのそれぞれのE1およびE2遺伝子:HPV58、HPV33、HPV52、HPV35、HPV31およびHPV16、好ましくは前記A9群のHPVのそれぞれのE2遺伝子からなるA9を標的とする領域からの少なくとも1の少なくとも80〜260ヌクレオチドの核酸、好ましくは85〜250ヌクレオチド、より好ましくは88〜241ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している)、および/または
−A7群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー(前記少なくとも2のA7を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、14〜30のヌクレオチド、好ましくは15〜29、より好ましくは16〜28、最も好ましくは17〜25のヌクレオチドからなり、その配列は、以下のA7群のHPV:HPV68、HPV39、HPV59、HPV45、およびHPV18のそれぞれのE1遺伝子からなるA7を標的とする領域からの少なくとも1の少なくとも100〜220ヌクレオチドの核酸、好ましくは120〜215ヌクレオチド、より好ましくは125〜209ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している。
好ましくは、1つのHPV群を標的とすることが意図された少なくとも2のプライマーは、3の他の群を標的とすることが意図された少なくとも2のプライマーとは異なる。
本願に列挙されているいずれの範囲にも同じことが準用される。
プライマーのヌクレオチド長は、相互に独立して選択されてよい。
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー。
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。
好ましくは、本発明のプローブは、個体の支持体上に固定化されない。
最も好ましくは、本発明のプローブはリアルタイム増幅において使用される。
本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも1のプローブはリアルタイム増幅において使用され、すなわち前記少なくとも2のプライマーおよび前記少なくとも2のプローブは、共に増幅反応混合物中に存在してよく、それにより前記少なくとも1のプローブは、前記少なくとも2のプライマーにより産生されるアンプリコンにリアルタイムでアニールする。言い換えると、増幅および検出は単一のステップで行われる、すなわちリアルタイム増幅である。
これらのプローブは、リアルタイムマルチプレックス増幅において使用するのに適するという特別な技術的特徴を有する。
本発明のより有利な実施形態によると、前記増幅は、定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅として行われてよい。実際に、本発明のプライマーおよびプローブは、それらがリアルタイムマルチプレックス増幅において行われた場合であっても、特異性における損失なく且つ定量的な正確さにおいて損失のない配列を有する。
本発明は、HPVモニタリングの分野において、技術的な大きな進歩を提供する。
少なくとも5の最も一般的なHPV(HPV16、18、45、31、33)、
好ましくは、少なくとも7のHR HPV、
さらに好ましくは、5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合には、A6および/またはA5の群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、
さらに好ましくは、HR HPVとして既知の少なくとも13のHPV(HPV56、51、58,33、52、35、31、16、68、39、59、45および18)、
より好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも1、
さらにより好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも2、
さらにより好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも3、
最も好ましくは、少なくとも前記13のHPVならびにHPV型66、82、67、85、および53の中の少なくとも4、特に前記13HR HPVおよびHPV型66、82、67、85からなる少なくとも17の粘膜HPV、
さらに最も好ましくは、少なくとも13のHPVならびに少なくとも5のHPV型66、82、67、85、および53
のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出をシングルチューブアッセイで可能にする。
−配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の2707〜2794位からなる断片(配列番号122);または粘膜上皮に対して発癌性であってよいHPV、好ましくは少なくとも5の最も一般的なHPV(HPV16、18、45、31、33)、さらに好ましくは少なくとも7のHR HPV、さらに好ましくは5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、より好ましくは少なくとも13のHR HPV、最も好ましくは少なくとも13のHR HPVおよびHPV66、53、82、67、85の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または5のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA5を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片(sub-fragment);または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的である配列、あるいは
−配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の3600〜3840位からなる断片(配列番号377);または粘膜上皮に対して発癌性であってよいHPV、好ましくは少なくとも5の最も一般的なHPV(HPV16、18、45、31、33)、さらに好ましくは少なくとも7のHR HPV、さらに好ましくは5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、より好ましくは少なくとも13のHR HPV、最も好ましくは少なくとも13のHR HPVおよびHPV66、53、82、67、85の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または5のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA5を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片(sub-fragment);または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的である配列である。
−A9増幅系C:配列番号211〜217の少なくとも1および配列番号240〜241の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号211〜217の少なくとも3、例えば、212、214および216、および配列番号240〜241の両方;
−A9増幅系E1:配列番号218〜220の少なくとも1および配列番号242〜247の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号218〜220の少なくとも3および配列番号242〜247の少なくとも5(例えば、配列番号242〜243、245〜247);
−A9増幅系E2:配列番号221〜223の少なくとも1および配列番号242〜247の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号221〜223の少なくとも3および配列番号242〜247の少なくとも5(例えば、配列番号242〜243、245〜247);
−A9増幅系E3:配列番号221〜223の少なくとも1および配列番号248〜255の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号221〜223の少なくとも3および配列番号248〜255の少なくとも5(例えば、配列番号248〜252);
−A9増幅系E4:配列番号224〜226の少なくとも1および配列番号248〜255の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号224〜226の少なくとも3および配列番号248〜255の少なくとも5(例えば、配列番号248〜252);
−A9増幅系E5:配列番号224〜226の少なくとも1および配列番号242〜247の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号224〜226の少なくとも3および配列番号242〜247の少なくとも5(例えば、配列番号242〜243、245〜247);
−A9増幅系E6:配列番号218〜220の少なくとも1および配列番号248〜255の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号218〜220の少なくとも3および配列番号248〜255の少なくとも5(例えば、配列番号248〜252);
−A9増幅系E1H Z7:配列番号218〜220の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号218〜220の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系E1H Z8:配列番号218〜220の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号218〜220の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系E2H Z7:配列番号221〜223の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号221〜223の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系E2H Z8:A9増幅系E2H Z7と同じ、すなわち、配列番号221〜223の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号221〜223の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系E4H Z7:配列番号224〜226の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号224〜226の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系E4H Z8:配列番号224〜226の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号224〜226の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系F:配列番号227〜230の少なくとも1および配列番号248〜255の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号227〜230の少なくとも4および配列番号248〜255の少なくとも5(例えば、配列番号248〜252);
−A9増幅系FE:配列番号227〜230の少なくとも1および配列番号242〜247の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号227〜230の少なくとも4および配列番号242〜247の少なくとも5(例えば、配列番号242〜243;245〜247);
−A9増幅系FH Z7:配列番号227〜230の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号227〜230の少なくとも4および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系FH Z8:A9増幅系FH Z7と同一、すなわち、配列番号227〜230の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号227〜230の少なくとも3および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265);
−A9増幅系G Z7:配列番号227〜230の少なくとも1および配列番号256〜261の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号227〜230の少なくとも3および配列番号256〜261の少なくとも5(例えば、配列番号257〜261);
−A9増幅系G Z8:A9増幅系G Z7と同じ、すなわち、配列番号227〜230の少なくとも1および配列番号256〜261の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号227〜230の少なくとも3および配列番号256〜261の少なくとも5(例えば、配列番号257〜261);
−A9増幅系H:配列番号231〜239の少なくとも1および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも1;好ましくは、A9群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、配列番号231〜239の少なくとも3(例えば、配列番号232;234;235)および配列番号256〜259;261〜265の少なくとも4(例えば、配列番号258;261;264;265)。
例えば、配列番号285のプローブA9E1S11は、HPV31およびHPV35を検出し、他のHPVを検出しない。
当業者が適切であることを見出せるいずれの組み合わせが、ここでは明確に包含される。
−配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の1895〜2103位からなる断片(配列番号48);または粘膜上皮に対して発癌性であってよいHPV、好ましくは少なくとも5の最も一般的なHPV(HPV16、18、45、31、33)、さらに好ましくは少なくとも7のHR HPV、さらに好ましくは5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、より好ましくは少なくとも13のHR HPV、最も好ましくは少なくとも13のHR HPVおよびHPV66、53、82、67、85の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または5のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA7を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片(sub-fragment);または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的である配列、あるいは
−配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の916〜1044位からなる断片(配列番号65);または粘膜上皮に対して発癌性であってよいHPV、好ましくは少なくとも5の最も一般的なHPV(HPV16、18、45、31、33)、さらに好ましくは少なくとも7のHR HPV、さらに好ましくは5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、より好ましくは少なくとも13のHR HPV、最も好ましくは少なくとも13のHR HPVおよび少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または5のHPV66、53、82、67、85のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA5を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片(sub-fragment);または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的な配列である。
−A7増幅系A:配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系A1:A7増幅系Aと同じ、すなわち、配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系A2:A7増幅系AまたはA1と同じ、すなわち、配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系AB:配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号82〜83の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系AC1:配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系AC2:A7増幅系AC1と同じ、すなわち、配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系AC3:A7増幅系AC1またはAc2と同じ、すなわち、配列番号68〜70の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系B:配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号82〜83の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系BA1:配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系BA2:A7増幅系BA1と同じ、すなわち、配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系BA3:A7増幅系BA1またはBA2と同じ、すなわち、配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系BC1:配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系BC2:A7増幅系BC1と同じ、すなわち、配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系BC3:A7増幅系BC1またはBC2と同じ、すなわち、配列番号71〜73の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系C:配列番号74〜76の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系C1:A7増幅系Cと同じ、すなわち、配列番号74〜76の少なくとも1および配列番号84〜85の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系CA1:A7増幅系C1と同じ、すなわち、配列番号74〜76の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系CA2:A7増幅系C1またはCA1と同じ、すなわち、配列番号74〜76の少なくとも1および配列番号79〜81の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て;
−A7増幅系D:配列番号77〜78の少なくとも1および配列番号86〜87の少なくとも1;好ましくは、A7群の全ての発癌性HPVの増幅が望まれる場合、それらの全て。
表84および87(「メガプレックスEAAH」)から、そのようなメガプレックスは、発癌性HPV、すなわち13のHR HPVおよび5の他の発癌性HPV(HPV66、53、82、67、85)の効率的な検出を可能にし、このメガプレックスは、結果として少なくとも13のHR HPVおよび4の他の発癌性HPV(HPV66、53、82、85)に対して定量的になるように、十分に均質な反応性および特異性(Ct)を有する。
−A5を標的とする系E、およびA6を標的とする系B、およびA7を標的とする系C、およびA9を標的とする系Cの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス(「メガプレックスEBCC」)を形成する;
−A5を標的とする系E、およびA6を標的とする系B、およびA7を標的とする系B、およびA9を標的とする系Cの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス(「メガプレックスEBBC」)を形成する;
−A5を標的とする系E、およびA6を標的とする系B、およびA7を標的とする系D、およびA9を標的とする系Cの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス(「メガプレックスEBDC」)を形成する;
−A5を標的とする系E、およびA6を標的とする系B、およびA7を標的とする系A、およびA9を標的とする系Hの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス(「メガプレックスEBAH」)を形成する。
少なくとも5の最も一般的なHR HPV(HPV16、18、45、31、33)、
好ましくは、少なくとも7のHR HPV、
さらに好ましくは、5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合には、A6および/またはA5群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、
さらに好ましくは少なくとも13のHR HPVとして既知のHPV(HPV型56、51、58、33、52、35、31、16、68、39、59、45および18)、
より好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85、および53の中の少なくとも1、
さらにより好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85、および53の中の少なくとも2、
さらにより好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85、および53の中の少なくとも3、
最も好ましくは、少なくとも13のHPVならびにHPV66、82、67、85、および53の中の少なくとも4、特に、前記13HR HPVおよびHPV型66、82、67、85からなる少なくとも17の粘膜HPV、
さらに最も好ましくは、少なくとも13のHPVならびに少なくとも5のHPV型66、82、67、85、および53
を網羅し、単一の増幅において、リアルタイムの定量的なそれらの増幅を提供する。
−A6群:配列番号420(受付番号NC_001594.1)のHPV56配列の413〜791位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列;
−A5群:配列番号421(受付番号NC_001533.1)のHPV51配列の678〜902位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列;
−A9群:配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列2707〜2794位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列;あるいは配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の3600〜3840位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列;
−A7群:配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の1895〜2103位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列;あるいは配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の916〜1044位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列;
前記保存的な断片は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする群を標的とするプライマーを構築および産生するための適切な参照鋳型配列であるという特性を保持している。
−配列番号30〜34および配列番号35〜37のいずれか1からなるA6を標的とするプライマー;または
−配列番号6〜10および配列番号11〜15のいずれか1からなるA5を標的とするプライマー;または
−配列番号211〜239および配列番号240〜265のいずれか1からなるA9を標的とするプライマー;または
−配列番号68〜78および配列番号79〜87のいずれか1からなるA7を標的とするプライマーであってよい。
−配列番号30〜34の1からなる少なくとも1のA6を標的とするプライマーおよび配列番号35〜37の1からなる少なくとも1のA6を標的とするプライマー;および/または
−配列番号6〜10の1からなる少なくとも1のA5を標的とするプライマーおよび配列番号11〜15の1からなる少なくとも1のA5を標的とするプライマー;および/または
−配列番号211〜239の1からなる少なくとも1のA9を標的とするプライマーおよび配列番号240〜265の1からなる少なくとも1のA9を標的とするプライマー;および/または
−配列番号68〜78の1からなる少なくとも1のA7を標的とするプライマーおよび配列番号79〜87の1からなる少なくとも1のA7を標的とするプライマーであってよい。
−配列番号38〜40のいずれか1からなるA6を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列;または
−配列番号16〜19のいずれか1からなるA5を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列;または
−配列番号266〜282のいずれか1からなるA9を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列;または
−配列番号88〜101のいずれか1からなるA7を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列であってよい。
−配列番号41〜45のいずれか1つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、A6を標的とするプローブ;または
−配列番号20〜24のいずれか1つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、A5を標的とするプローブ;または
−配列番号283〜319のいずれか1つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、A9を標的とするプローブ;または
−配列番号102〜121のいずれか1つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、A7を標的とするプローブであってよい。
前記プライマーおよびプローブ系は、少なくとも1の本発明によるプライマー系および少なくとも1の本発明によるプローブを含んでなる。
本発明は、少なくとも1の本発明のプライマーまたはプローブを含んでなる増幅組成物、医薬組成物、生物学的組成物にも関する。
−本発明による少なくとも1のプライマー系、および/または
−本発明による少なくとも1のプローブ、
−任意に、それらおよび/またはヌクレオチドの使用についての説明書。
前記オリゴヌクレオチドは、乾燥形態で、または当業者が判断した場合に適切な溶媒に可溶化して提供されてよい。適切な溶媒には、TE、PCRグレードの水等が含まれる。
そのような試薬は、当業者に既知であり、ヌクレアーゼを含まない水、RNaseを含まない水、DNAseを含まない水、PCRグレードの水のような水;マグネシウム、カリウムのような塩;Trisのような緩衝剤;Taq(登録商標)、Vent(登録商標)、Pfu(登録商標)、活性化可能なポリメラーゼのようなポリメラーゼが含まれる酵素;デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、dNTPs、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTPのようなヌクレオチド;DTTおよび/またはRNase阻害剤;ならびにpolyT、polydTのようなポリヌクレオチド、およびプライマーのような他のオリゴヌクレオチドが含まれる。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、HPVの群、型、サブタイプまたは株の診断のために使用され得る。特に、本発明によるプライマーおよびプローブは、インビトロタイピング、サブタイピング、およびインビトロサンプル中、例えば患者の子宮頸部のサンプル中、または細胞培養上清中に存在するHPV核酸の定量化に対して使用され得る。
本願において使用される用語および名称は、一般的に、HPV検出の分野および特に分子生物学の分野における通常の意味を有する。
5’フルオロフォア-(アーム1)-プローブ-(アーム2)-クエンチャー3’
5’クエンチャー-(アーム1)-プローブ-(アーム2)-フルオロフォア3’
ここで、アーム1およびアーム2は、例えば、3〜10ヌクレオチド、好ましくは5、6、7ヌクレオチドのいずれかの短いヌクレオチド配列であってよく、適切な厳密性の条件下でヘアピン構造形成を可能にする、すなわち、アーム1およびアーム2は、望ましい厳密性の条件下で、アニールに対して完全に相補的である(標準的なPCRの厳密性の条件には、例えば、55〜65℃のアニーリング温度および4〜8mMのMg濃度が含まれる)。しかしながら、アーム1およびアーム2は、プローブの標的配列とは無関係である、すなわち、アーム1とアーム2の間のアニーリングの結果として生じるヘアピン構造は、本質的に、ハイブリダイズしない場合にのみ可能なプローブに対する二次構造である。当業者は、与えられたプローブについてそのようなアームをどのように選択するかを知っている。
TGCGC-(プローブ配列)-GCGCA
GCGCA-(プローブ配列)-TGCGC
AGCGC-(プローブ配列)-GCGCT
GCGCT-(プローブ配列)-AGCGC
CGCGA-(プローブ配列)-TCGCG
CGCGC-(プローブ配列)-GCGCG。
表13:A5を標的とする系のフォワードプライマー
表14:A5を標的とする系のリバースプライマー
表15:A5を標的とする系のプローブ
表16:A5を標的とする系のビーコンプローブ
表17:A5を標的とする系
表18:A6を標的とする系の参照アンプリコン(HPV56ゲノムに由来する)
表19:A6を標的とする系のフォワードプライマー
表20:A6を標的とする系のリバースプライマー
表21:A6を標的とする系のプローブ
表22:A6を標的とする系のビーコンプローブ
表23:A6を標的とする系
表24:A7を標的とする系の参照アンプリコン(HPV18ゲノムに由来する)
表25:A7を標的とする系のフォワードプライマー
表26:A7を標的とする系のリバースプライマー
表27:A7を標的とする系のプローブ
表28:A7を標的とする系のビーコンプローブ
表29:A7を標的とする系
表30:A9を標的とする系の参照アンプリコン(HPV16ゲノムに由来する)
表31:A9を標的とする系のフォワードプライマー
表32:A9を標的とする系のリバースプライマー
表33:A9を標的とする系のプローブ
表34:A9を標的とする系のビーコンプローブ
表35:A9を標的とする系
表36〜50:これらの表は、本発明のプライマーおよびプローブにより示されるヌクレオチドミスマッチの数を示す(50HPV型の配列のアラインメント);空のボックスは、整合のとれた配列アラインメントがないことを示し;グレーのボックスは、ミスマッチの数が0、1、2または3であることを示す。
表37:本発明のA5を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系D〜E)
表38:本発明のA6を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系A〜C)
表39:本発明のA6を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系D〜E)
表40:本発明のA7を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系A〜B)
表41:本発明のA7を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系C〜D)
表42:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系C)
表43:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系E1)
表44:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系E2)
表45:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系E3)
表46:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系E4)
表47:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系F)
表48:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系GZ7)
表49:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系GZ8)
表50:本発明のA9を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数(系H)
表51〜68:本発明の検出系の特異性
表36〜50に記載された増幅系は、本発明のプローブの特異性を試験するために使用された。
表52:本発明のA5およびA6を標的とする検出の特異性を試験するために使用することができる実例のPCR材料および方法条件
表53:A5を標的とするプローブの特異性の結果(ボックス「他のHPV」=表51に与えられたリストのHPV以外の全て)
表54:A6を標的とするプローブの特異性の結果(ボックス「他のHPV」=表51に与えられたリストのHPV以外の全て)
表55:本発明のA7を標的とする検出の特異性を試験するために使用することができる実例のPCR材料および方法条件
表56〜59:A7を標的とするプローブの特異性の結果(ボックス「他のHPV」=表51に与えられたリストのHPV以外の全て)
表56:A7を標的とする増幅系A、およびA7を標的とする増幅系Aのプローブ(PCR当り1のプローブ)
表57:A7を標的とする増幅系B、およびA7を標的とする増幅系Bのプローブ(PCR当り1のプローブ)
表58:A7を標的とする増幅系C、およびA7を標的とする増幅系Cのプローブ(PCR当り1のプローブ)
表59:A7を標的とする増幅系D、およびA7を標的とする増幅系Dのプローブ(PCR当り1のプローブ)
表60:本発明のA9を標的とする検出系の特異性を試験するために使用することができる実例のPCR物質および方法条件
表61〜68:A9を標的とするプローブの特異性の結果(ボックス「他のHPV」=表51に与えられたリストのHPV以外の全て)
表61:A9を標的とする増幅系C、およびA9を標的とする増幅系Cのプローブ(PCR当り1のプローブ)
表62:A9を標的とする増幅系E2、およびA9を標的とする増幅系E2のプローブ(PCR当り1のプローブ)
表63:A9を標的とする増幅系E3、およびA9を標的とする増幅系E3のプローブ(PCR当り1のプローブ)
表64:A9を標的とする増幅系E4、およびA9を標的とする増幅系E4のプローブ(PCR当り1のプローブ)
表65:A9を標的とする増幅系F、およびA9を標的とする増幅系Fのプローブ(PCR当り1のプローブ)
表66:A9を標的とする増幅系GZ7、およびA9を標的とする増幅系GZ7のプローブ(PCR当り1のプローブ)
表67:A9を標的とする増幅系GZ8、およびA9を標的とする増幅系GZ8のプローブ(PCR当り1のプローブ)
表68:A9を標的とする増幅系H、およびA9を標的とする増幅系Hのプローブ(PCR当り1のプローブ)
特異性の試験に対して使用された増幅および検出系は、表17(A5を標的とする系);表23(A6を標的とする系);表29(A7を標的とする系);表35(A9を標的とする系)に示されている。
本発明の系の反応性は、特異性の試験と同じ実験条件下で試験された(表52、55、60を参照されたい)。
表70:A6を標的とする系の反応性(系A、B、C、DおよびE)
表71〜74:A7を標的とする系の反応性
表71:A7を標的とする系Aの反応性
表72:A7を標的とする系Bの反応性
表73:A7を標的とする系Cの反応性
表74:A7を標的とする系Dの反応性
表75〜82:A9を標的とする系の反応性
表75:A9を標的とする系Cの反応性
表76:A9を標的とする系E2の反応性
表77:A9を標的とする系E3の反応性
表78:A9を標的とする系E4の反応性
表79:A9を標的とする系Fの反応性
表80:A9を標的とする系GZ7の反応性
表81:A9を標的とする系GZ8の反応性
表82:A9を標的とする系Hの反応性
表83〜88:「メガプレックス」特異性および反応性
PCRは、1のA5を標的とする系、1のA6を標的とする系、1のA7を標的とする系、1のA9を標的とする系を用いて、シングルチューブアッセイで行われる。
表83〜84:メガプレックスEAAHの特異性
表83:A5を標的とする系E、A6を標的とする系A、A7を標的とする系AおよびA9を標的とする系Hの混合(すなわち、メガプレックスEAAH)について使用することができる、実例のメガプレックス材料および方法条件;これらの実験条件は、表84に示された結果に対して使用された
表84:EAAHメガプレックスの特異性の結果
表85〜86:メガプレックスEBACの特異性
表85:A5を標的とする系E、A6を標的とする系B、A7を標的とする系AおよびA9を標的とする系Cの混合(すなわち、メガプレックスEBAC)について使用することができる、実例のメガプレックス材料および方法条件;これらの実験条件は、表86に示された結果に対して使用された
表86:EBACメガプレックスの特異性の結果
表87〜88:メガプレックスEAAHおよびEBACの反応性の結果
表87:メガプレックスEAAHの反応性の結果
表88:メガプレックスEBACの反応性の結果
表89:HPVゲノム配列のリスト
これらの表の後に、参照鋳型の配列が示される。
CNCMは、Collection Nationale de Cultures de Microorganisme; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 Paris Cedex 15; France;
ATCCは、American Type Culture Collection; 10801 University Blvd; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.
全てのHPV株は、DKFZから入手可能である。
<SEQ25;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tggaccgggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgt
<SEQ334;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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cagctcagag gatgaggatg aggatgaagt agaccatttg caggagcggc cacagcaagc
tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
tgtggtgcag t
<SEQ26;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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cgt
<SEQ335;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
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tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
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<SEQ27;DNA;ヒトパピローマウイルス>
aaggtgctacagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac agaaaaagac
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<SEQ336;DNA;ヒトパピローマウイルス>
aaggtgctacagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac agaaaaagac
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<SEQ337;DNA;ヒトパピローマウイルス>
aaggtgctacagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac agaaaaagac
gatttcatct aatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
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cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
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<SEQ28;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gttggaccgggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
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<SEQ338;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
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<SEQ29;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
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<SEQ1;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggcagtggaaagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ320;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggcagtggaaagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ321;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggcagtggaaagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
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<SEQ2;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agctccgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ322;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agctccgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ323;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agctccgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ3;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gaca
<SEQ324;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ325;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ326;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ327;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcga
<SEQ4;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctacgtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ328;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ329;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ330;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcga
<SEQ5;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcga
<SEQ331;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ332;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ333;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
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gg
<SEQ122;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggacgtggtccaga ttaagtttgc acgaggacga ggacaaggaa aacgatggag
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<SEQ123;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ124;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ125;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ126;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ127;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ128;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ129;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ130;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ131;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ132;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ133;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ134;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ135;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ136;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ137;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ138;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ140;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ141;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ142;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ143;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
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<SEQ144;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ145;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ146;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ147;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ359;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ360;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ361;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ362;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ364;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ365;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ366;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ369;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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<SEQ373;DNA;ヒトパピローマウイルス>
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Claims (49)
- 粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも1のHPVをサンプル中において検出する方法であって、前記検出は、少なくとも1のアンプリコンが、増幅プライマーを用いた増幅により、前記サンプルまたはそれらの核酸物質から作られたかどうかを決定することを含んでなり、少なくとも1のアンプリコンの生成は、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも1のHPVが前記サンプル中に存在することを示し、前記増幅プライマーは、
−A6群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー;
ここで、前記少なくとも2のA6を標的とするプライマーは、14〜30ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも1のA6参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも1のA6参照鋳型配列は、配列番号420(受付番号NC_001594.1)のHPV56配列の413〜791位からなる断片(配列番号337)であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA6を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および/または
−A5群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー;
ここで、前記少なくとも2のA5を標的とするプライマーは、14〜30ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも1のA5参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも1のA5参照鋳型配列は、配列番号421(受付番号NC_001533.1)のHPV51配列の678〜902位からなる断片(配列番号326)であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA5を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および/または
−A9群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー;
ここで、前記少なくとも2のA9を標的とするプライマーは、14〜30ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも1のA9参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも1のA9参照鋳型配列は、配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の2707〜2794位からなる断片(配列番号122)であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA9を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の3600〜3840位からなる断片(配列番号377)であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA9を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および/または
−A7群の発癌性HPVを標的とすることが意図された少なくとも2のプライマー;
ここで、前記少なくとも2のA7を標的とするプライマーは、14〜30ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも1のA7参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも1のA7参照鋳型配列は、配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の1895〜2103位からなる断片(配列番号48)であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA7を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の916〜1044位からなる断片(配列番号65)であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするA7を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
を含んでなることを特徴とする方法:
ここで、前記A6、A5、A9およびA7参照鋳型配列は、少なくとも5の最も一般的なHPV(HPV16、18、45、31、33)、好ましくは少なくとも7のHR HPV、さらに好ましくは5の最も一般的なHR HPVならびに少なくとも2の他のHR HPV、好都合にはA6および/またはA5の群に属する少なくとも2の他のHR HPV(例えば、HPV56、51、33、31、16、45、18)、より好ましくは少なくとも13のHR HPV(HPV56、51、58、33、52、35、31、16、68、39、59、45および18)のリアルタイムマルチプレックス増幅、特にそのようなHPVのリアルタイムの定量的なマルチプレックス増幅を可能にするプライマーおよびアンプリコンアニーリングプローブを構築および産生するのに適した、群に基づく参照鋳型配列であるという特別な技術的特徴を有する。 - 請求項1に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA6参照鋳型配列は、配列番号25〜29および334〜338の1つであり、前記A6参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするA6を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA5参照鋳型配列は、配列番号1〜5および320〜333の1つであり、前記A5参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするA5を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA9参照鋳型配列は、配列番号122〜210および359〜419の1つであり、前記A9参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするA9を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA7参照鋳型配列は、配列番号46〜67および339〜358の1つであり、前記A7参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするA7を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマーは、14〜30ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のA9群のHPV;HPV58、HPV33、HPV52、HPV35、HPV31のそれぞれに由来するE1およびE2遺伝子からなるA9標的領域に由来する少なくとも80〜260ヌクレオチド、好ましくは85〜250ヌクレオチド、より好ましくは88〜241ヌクレオチドの少なくとも1の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマーは、14〜30ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のA7群のHPV;HPV68、HPV39、HPV59、HPV45のそれぞれに由来するE1遺伝子からなるA7標的領域に由来する少なくとも100〜220ヌクレオチド、好ましくは120〜215ヌクレオチド、より好ましくは125〜209ヌクレオチドの少なくとも1の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること
を特徴とする方法。 - 請求項6に記載のHPV検出方法であって、
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマーは、さらに、HPV66および/またはHPV53のE6およびE7遺伝子からなるA6標的領域に由来する少なくとも90〜390ヌクレオチド、好ましくは95〜385ヌクレオチド、より好ましくは100〜379ヌクレオチドの少なくとも1の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および/または
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマーは、さらに、HPV82のE7およびE1遺伝子からなるA5標的領域に由来する少なくとも90〜240ヌクレオチド、好ましくは100〜230ヌクレオチド、より好ましくは106〜225ヌクレオチドの少なくとも1の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および/または
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマーは、さらに、HPV67のE1およびE2遺伝子からなるA9標的領域に由来する少なくとも80〜260ヌクレオチド、好ましくは85〜250ヌクレオチド、より好ましくは88〜241ヌクレオチドの少なくとも1の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマーは、さらに、HPV85のE1およびE2遺伝子からなるA7標的領域に由来する少なくとも100〜220ヌクレオチド、好ましくは120〜215ヌクレオチド、より好ましくは125〜209ヌクレオチドの少なくとも1の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること
を特徴とする方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも2のプライマーは17〜25ヌクレオチドからなることを特徴とする方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1の粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVは、発癌性の肛門性器HPVであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1の粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVは、発癌性の子宮頸部HPVであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも2のプライマーは、A6群またはA5群またはA9群またはA7群に特異的であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅はシングルチューブマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも2のA6を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも2のプライマーを含んでなることを特徴とする方法:
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも2のA5を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも2のプライマーを含んでなることを特徴とする方法:
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも2のA9を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも2のプライマーを含んでなることを特徴とする方法:
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー。 - 請求項1〜15のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも2のA7を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも2のプライマーを含んでなることを特徴とする方法:
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および/または
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー。 - 請求項1〜16のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅プライマーは、
−前記少なくとも2のA6を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA5を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA9を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも2のA7を標的とするプライマー
を含んでなることを特徴とする方法。 - 請求項1〜17のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、前記少なくとも1のアンプリコンにアニールすることが意図された少なくとも1のプローブを用いて行われることを特徴とする方法。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅はリアルタイム増幅であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、少なくとも1のA6および/またはA5および/またはA9および/またはA7を標的とするプローブを使用することにより行われ、その配列は、前記少なくとも2のA6および/またはA5および/またはA9および/またはA7を標的とするプライマーによりそれぞれ産生される少なくとも1のアンプリコンの検出のためのプローブとして使用するのに適していることを特徴とする方法。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅はリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅は定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも2のA6を標的とするプライマーは、配列番号30〜34の少なくとも1(フォワードプライマー)および配列番号35〜37の少なくとも1(リバースプライマー)であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号38〜40の1つもしくはそれらに相補的な配列の1つからなる少なくとも1のA6を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも1の5’および/または3’検出標識および/またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも1のHPVとは無関係なアームを用いて行われることを特徴とする方法。
- 請求項24に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA6を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号41〜45の1つまたはそれらに相補的な配列の1つであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜25のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも2のA5を標的とするプライマーは、配列番号6〜10の少なくとも1(フォワードプライマー)および配列番号11〜15の少なくとも1(リバースプライマー)であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号16〜19の1つもしくはそれらに相補的な配列の1つからなる少なくとも1のA5を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも1の検出標識および/またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも1のHPVとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
- 請求項27に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA5を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号20〜24の1つまたはそれらに相補的な配列の1つであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜28のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも2のA9を標的とするプライマーは、配列番号211〜239の少なくとも1(フォワードプライマー)および配列番号240〜265の少なくとも1(リバースプライマー)であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号266〜282の1つまたはそれらに相補的な配列の1つからなる少なくとも1のA9を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも1の検出標識および/またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも1のHPVとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
- 請求項30に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA9を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号283〜319の1つまたはそれらに相補的な配列の1つであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも2のA7を標的とするプライマーは、配列番号68〜78の少なくとも1(フォワードプライマー)および配列番号79〜87の少なくとも1(リバースプライマー)であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜32のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号88〜101の1つまたはそれらに相補的な配列の1つからなる少なくとも1のA7を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも1の検出標識および/またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも1のHPVとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
- 請求項33に記載のHPV検出方法であって、前記少なくとも1のA7を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号102〜121の1つまたはそれらに相補的な配列の1つであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載のHPV検出方法であって、前記増幅はPCRであることを特徴とする方法。
- A6、A5、A9またはA7群の少なくとも1のHPVを含有するHPV含有サンプルにおいて、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法の実行により得られるアンプリコン。
- A6、A5、A9およびA7群のHPVを増幅するためにシングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプライマーの設計において、ならびに前記増幅されたHPVのリアルタイム検出のための前記シングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプローブの設計において、参照鋳型配列として使用するのに適したポリヌクレオチドであって、前記参照鋳型ポリヌクレオチドは、
−A6群について:配列番号420(受付番号NC_001594.1)のHPV56配列の413〜791位からなる断片(配列番号337)、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列;
−A5群について:配列番号421(受付番号NC_001533.1)のHPV51配列の678〜902位からなる断片(配列番号326)、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列;
−A9群について:配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の2707〜2794位からなる断片(配列番号122)、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列;あるいは、配列番号422(受付番号NC_001526.1)のHPV16配列の3600〜3840位からなる断片(配列番号377)、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列;
−A7群について:配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の1895〜2103位からなる断片(配列番号48)、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列;あるいは、配列番号423(受付番号NC_001357.1)のHPV18配列の916〜1044位からなる断片(配列番号65)、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列
から選択され、前記保存的な断片は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るHPVのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする群を標的とするプライマーを構築し、産生するための適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているヌクレオチド。 - 請求項37に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、A6を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号25〜29および334〜338の1つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
- 請求項37に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、A5を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号1〜5および320〜333の1つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
- 請求項37に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、A9を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号122〜210および359〜419の1つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
- 請求項37に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、A7を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号46〜67および339〜358の1つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
- 特にHPVのA6およびA5およびA9およびA7群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、HPV増幅に適した以下に示すプライマー:
−配列番号30〜34および配列番号35〜37のいずれか1からなる、A6を標的とするプライマー;または
−配列番号6〜10および配列番号11〜15のいずれか1からなる、A5を標的とするプライマー;または
−配列番号211〜239および配列番号240〜265のいずれか1からなる、A9を標的とするプライマー;または
−配列番号68〜78および配列番号79〜87のいずれか1からなる、A7を標的とするプライマー。 - 特にHPVのA6およびA5およびA9およびA7群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、HPV増幅に適したプライマー系であって、
−配列番号30〜34の1つからなる少なくとも1のA6を標的とするプライマーおよび配列番号35〜37の1つからなる少なくとも1のA6を標的とするプライマー;および/または
−配列番号6〜10の1つからなる少なくとも1のA5を標的とするプライマーおよび配列番号11〜15の1つからなる少なくとも1のA5を標的とするプライマー;および/または
−配列番号211〜239の1つからなる少なくとも1のA9を標的とするプライマーおよび配列番号240〜265の1つからなる少なくとも1のA9を標的とするプライマー;および/または
−配列番号68〜78の1つからなる少なくとも1のA7を標的とするプライマーおよび配列番号79〜87の1つからなる少なくとも1のA7を標的とするプライマー
を含んでなるプライマー系。 - 特にHPVのA6およびA5およびA9およびA7群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、HPV検出に適した以下に示すプローブ:
−配列番号38〜40のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A6を標的とするプローブ;または
−配列番号16〜19のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A5を標的とするプローブ;または
−配列番号266〜282のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A9を標的とするプローブ;または
−配列番号88〜101のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A7を標的とするプローブ。 - 特にHPVのA6およびA5およびA9およびA7群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、HPV検出に適した以下に示すビーコンプローブ:
−配列番号41〜45のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A6を標的とするプローブ;または
−配列番号20〜24のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A5を標的とするプローブ;または
−配列番号283〜319のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A9を標的とするプローブ;または
−配列番号102〜121のいずれか1もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、A7を標的とするプローブ。 - 特にHPVのA6およびA5およびA9およびA7群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、HPV増幅に適したプライマーおよびプローブ系であって、請求項53に記載の少なくとも1のプライマーおよび請求項54または55に記載の少なくとも1のプローブを含んでなるプライマーおよびプローブ系。
- 請求項43に記載の少なくとも1のプライマー系を用いて、HPVのA6、A5、A9またはA7群に由来する少なくとも1の核酸を増幅することにより得られるアンプリコン。
- 請求項36または47に記載の少なくとも1のアンプリコンを含んでなる増幅組成物。
- 以下を含んでなる、子宮頸部新形成または子宮頸癌の診断または予後のためのキット:
−請求項43に記載の少なくとも1のプライマー系、および/または
−請求項44または45に記載の少なくとも1のプローブ、
−任意に、それらの使用および/またはヌクレオチドについての説明書。
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