CN117904106A - 用于检测人***瘤病毒的crRNA、引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测HPV16和HPV18的方法。所述方法包括:采用crRNA对待测样本进行检测;其中所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。该crRNA可同时检测HPV16和HPV18的L1和E6/E7区域,且该crRNA具有特异性高、效率高等优点。因此,采用本发明的方法可高效检出不同阶段的HPV病毒感染,可确保检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及病原检测技术领域。具体地,本发明涉及用于检测人***瘤病毒的crRNA、引物、试剂盒及方法,更具体地,本发明涉及crRNA及其用途、用于HPV16和/或HPV18检测的试剂盒及其用途、以及检测HPV16和/或HPV18的方法。
背景技术
***是女性生殖***中最常见的恶性肿瘤之一,主要起源于宫颈上皮组织。***通常与高危型人***瘤病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)感染相关。HPV感染在大多数情况下会自行清除,但在一部分感染持续存在的情况下,可能会导致宫颈上皮细胞发生异常,最终发展为***。
***通常具有潜隐性发展过程,早期往往没有明显的症状,因此常常被忽视,直到进展到晚期才会出现症状,如异常***出血、***疼痛等。由于***早期发现和治疗的成功率较高,***筛查和早期诊断非常重要。目前,***的筛查方法主要包括:宫颈细胞学检查和HPV病毒检测等。
2020年,世卫组织发布了《加速消除***全球战略》,致力于在全球范围消除***。为了实现这一目标,各地区需要充分结合疫苗接种和HPV病毒检测筛查,进一步提升HPV病毒的筛查率。
因此,亟需开发一种高特异性或高灵敏性的检测HPV病毒的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明提供了一种检测HPV16和HPV18的方法,该方法中的crRNA可检测HPV16和/或HPV18的L1或E6/E7区域,且该crRNA具有特异性高、效率高等优点。尤其是采用同时含有检测HPV16和HPV18的L1和E6/E7区域的crRNA进行检测,可高效检出不同阶段的HPV病毒,进一步提高检测的准确性。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
HPV病毒种类繁多,目前已发现200余种亚型,根据导致***的风险高低可分为高危型、中危型和低危型,其中HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68这13种基因型为高危型。在世界范围内,大约70%的***中检测到致癌HPV16/18型。目前的检测方法主要针对HPV病毒L1区域的基因组DNA(简称L1 DNA)、E6/E7区域的基因组DNA(简称E6/E7DNA)或者E6/E7区域的mRNA。
然而L1 DNA在基因组整合发生之后通常会丢失,而E6/E7基因会在基因组发生整合之后大量表达。由此可见,以L1基因作检测靶点,会导致部分因HPV基因组整合而造成的漏检;而以E6/E7 mRNA作检测靶点,会使得检测窗口延后,不利于HPV感染的早期监控。此外,尽管E6/E7区域在整合前后都存在,但单独将HPV E6检测用于子***初筛,其灵敏度较低仅为44.4%,从而影响检测结果。
基于此,在本发明的第一方面,本发明提出了一种crRNA。根据本发明的实施例,所述crRNA包括:核心序列,所述核心序列包括如SEQ ID NO:5~8、SEQ ID NO:15~20和SEQID NO:50~51任一项所示的核苷酸序列中的至少之一。本发明的crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合,在CRISPR/Cas12a编辑***中,该crRNA在激活Cas12a酶的特异切割活性的同时,也可激发了该Cas12a酶的非特异性单链DNA切割活性,从而实现了对目的核酸片段的检测。
在本发明的第二方面,本发明提出了第一方面所述的crRNA在制备试剂中的用途,所述试剂用于检测HPV16和/或HPV18。由前可知,上述crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合。由此,采用上述试剂可激活Cas12a酶的特异切割活性的同时,也激发了该Cas12a酶的非特异性单链DNA切割活性,从而实现了对目的核酸片段的检测。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括第一方面所述的crRNA。由前可知,上述crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合。由此,采用本发明的试剂盒能高效检出HPV16和/或HPV18。
在本发明的第四方面,本发明提出了第三方面所述的试剂盒在制备产品中的用途,所述产品用于检测HPV16和/或HPV18。由前可知,上述试剂盒中的crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合。由此,采用含有上述试剂盒的产品能高效检出HPV16和/或HPV18。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种检测HPV16和/或HPV18的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括第一方面所述的crRNA或第三方面所述的试剂盒对待测样本进行检测。本发明的方法可有效检测出HPV16和/或HPV18,且具有准确性高、特异性强或灵敏度高等优点。
本发明所涉及的序列说明详见下表:
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为实施例1中采用不同crRNA(16L1crRNA-1、16L1crRNA-2)对HPV16亚型L1基因区进行CRISPR/Cas12a检测的结果图。
图2为实施例1中采用不同crRNA(18L1crRNA-1、18L1crRNA-2)对HPV18亚型L1基因区进行CRISPR/Cas12a检测的结果图。
图3为实施例1中采用16L1crRNA-1对HPV16亚型L1基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光特异性结果图。
图4为实施例1中采用18L1crRNA-2对HPV18亚型L1基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光特异性结果图。
图5为实施例1中采用16L1crRNA-1对HPV16亚型L1基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光灵敏度结果图。
图6为实施例1中采用18L1crRNA-2对HPV18亚型L1基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光灵敏度结果图。
图7为实施例1中采用不同crRNA(16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2、16E6/E7crRNA-3)对HPV16亚型E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的结果图。
图8为实施例1中采用不同crRNA(18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2、18E6/E7crRNA-3)对HPV18亚型E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的结果图。
图9为实施例1中采用16E6/E7crRNA-1对HPV16亚型E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光法特异性的结果图。
图10为实施例1中采用18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光法特异性的结果图。
图11为实施例1中采用16E6/E7crRNA-1对HPV16亚型E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光法灵敏度的结果图。
图12为实施例1中采用18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光法灵敏度的结果图。
图13为实施例2中在不同临床样本中采用16L1crRNA-1、16E6/E7crRNA-1、18L1crRNA-2、18E6/E7crRNA-3对HPV16亚型L1基因区与E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光强度对比图。
图14为实施例2中在不同临床样本中采用16L1crRNA-1、16E6/E7crRNA-1、18L1crRNA-2、18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型L1基因区与E6/E7基因区进行CRISPR/Cas12a检测的荧光强度对比图。
图15为实施例3中采用16L1crRNA-1、16E6/E7crRNA-1对HPV16亚型进行CRISPR/Cas12a检测的双靶点荧光法特异性的结果图。
图16为实施例3中采用18L1crRNA-2、18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型进行CRISPR/Cas12a检测的双靶点荧光法特异性的结果图。
图17为实施例3中采用16L1crRNA-1、16E6/E7crRNA-1对HPV16亚型进行CRISPR/Cas12a检测的双靶点荧光法灵敏度的结果图。
图18为实施例3中采用18L1crRNA-2、18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型进行CRISPR/Cas12a检测的双靶点荧光法灵敏度的结果图。
图19为实施例3中针对不同核酸保存液临床样本进行CRISPR/Cas12a检测HPV16亚型双靶点的结果图,纵坐标为荧光值(从10000~130000)。
图20为实施例3中针对不同DNA临床样本进行CRISPR/Cas12a检测HPV16亚型双靶点的结果图,纵坐标为荧光值(从10000~130000)。
图21为实施例3中针对不同核酸保存液临床样本进行CRISPR/Cas12a检测HPV18亚型双靶点的结果图,纵坐标为荧光值(从10000~130000)。
图22为实施例3中针对不同DNA临床样本进行CRISPR/Cas12a检测HPV18亚型双靶点的结果图,纵坐标为荧光值(从10000~130000)。
图23为本发明中crRNA的构成示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中,术语“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明提出了一种crRNA、crRNA在制备试剂中的用途、试剂盒、试剂盒在制备产品中的用途、检测HPV16和/或HPV18的方法,下面将分别对其进行详细描述。
crRNA
在本发明的第一方面,本发明提出了一种crRNA。根据本发明的实施例,所述crRNA包括:核心序列,所述核心序列包括如SEQ ID NO:5~8、SEQ ID NO:15~20和SEQ ID NO:50~51任一项所示的核苷酸序列中的至少之一。本发明的crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合,在CRISPR/Cas12a编辑***中,该crRNA在激活Cas12a酶的特异切割活性的同时,也可激发了该Cas12a酶的非特异性单链DNA切割活性,从而实现了对目的核酸片段的检测。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列;
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列;
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列;以及
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;
任选地,所述crRNA包括:
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA进一步包括发夹结构,所述发夹结构的3'端和核心序列的5'端相连,所述发夹结构具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:如SEQ ID NO:25~34和SEQ ID NO:48~49任一项所示的核苷酸序列中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中,本发明中crRNA均由5'端下游发夹结构和3'端上游的核心序列构成,具体构成可参见图23。例如,本实施例中的SEQ ID NO:25(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUAUCUACUUCAGAAACUACAUA)所示的crRNA由如SEQ ID NO:5(AUAUCUACUUCAGAAACUACAUA)所示的核心序列(3'端)和如SEQ ID NO:10(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU)所示的发夹结构(5'端)构成。
需要解释说明的是,本发明中的“5'端下游”指的是crRNA5'端起始向3'端延续的部分序列,“3'端上游”指的是crRNA3'端起始向5'端延续的部分序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:48所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:49所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ IDNO:31所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:34所示的核苷酸序列。
在本发明的一些可选实施例中,所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列;SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列;SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列;以及SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。该crRNA可高特异性高灵敏度地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合,在CRISPR/Cas12a编辑***中,该crRNA在激活Cas12a酶的特异切割活性的同时,也可激发了该Cas12a酶的非特异性单链DNA切割活性,从而实现了对目的核酸片段的检测。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例,所述crRNA包括:SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
crRNA在制备试剂中的用途
在本发明的第二方面,本发明提出了第一方面所述的crRNA在制备试剂中的用途,所述试剂用于检测HPV16和/或HPV18。由前可知,上述crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合。由此,采用上述试剂可激活Cas12a酶的特异切割活性的同时,也激发了该Cas12a酶的非特异性单链DNA切割活性,从而实现了对目的核酸片段的检测。
试剂盒
在本发明的第三方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括第一方面所述的crRNA。由前可知,上述crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合。由此,采用本发明的试剂盒能高效检出HPV16和/或HPV18。
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括如下组分中的至少之一:扩增引物、Cas12a蛋白和报告因子。
根据本发明的实施例,所述扩增引物为MIRA扩增引物。MIRA扩增为恒温扩增,该扩增可在35℃~42℃实现扩增与检测,快速缩短检测时间,该扩增和本发明第一方面所述的crRNA结合后避免了依赖仪器和PCR的实验室环境,实现了在基层医院机构完成HPV16和/或HPV18DNA的快速检测。
根据本发明的实施例,所述扩增引物包括如下组合中的至少之一:
如SEQ ID NO:11核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:12核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:13核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:14核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:21核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:22核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:23核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:24核苷酸序列所示的下游引物。
根据本发明的实施例,所述扩增引物包括:如SEQ ID NO:11核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:12核苷酸序列所示的下游引物;如SEQ ID NO:21核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:22核苷酸序列所示的下游引物。
根据本发明的实施例,所述扩增引物包括:如SEQ ID NO:13核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:14核苷酸序列所示的下游引物;如SEQ ID NO:23核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:24核苷酸序列所示的下游引物。
根据本发明的实施例,所述扩增引物包括:如SEQ ID NO:11核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:12核苷酸序列所示的下游引物;如SEQ ID NO:13核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:14核苷酸序列所示的下游引物;如SEQ ID NO:21核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:22核苷酸序列所示的下游引物;如SEQ ID NO:23核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:24核苷酸序列所示的下游引物。该扩增引物为MIRA恒温扩增引物,该恒温扩增可在35℃~42℃实现扩增与检测,快速缩短检测时间。该扩增引物和本发明第一方面所述的crRNA结合后避免了依赖仪器和PCR的实验室环境,实现了在基层医院机构完成HPV16和/或HPV18DNA的快速检测。
根据本发明的实施例,所述Cas12a蛋白选自FnCas12a蛋白、AsCas12a蛋白、LbCas12a蛋白、Lb5Cas12a蛋白、HkCas12a蛋白、OsCas12a蛋白、TsCas12a蛋白、BbCas12a蛋白、BoCas12a蛋白和Lb4Cas12a蛋白中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述报告因子用于荧光检测。
根据本发明的实施例,所述报告因子选自ssDNA和可形成发夹结构的DNA中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述报告因子具有荧光基团和淬灭基团修饰。
根据本发明的实施例,所述报告因子的5'端具有荧光基团修饰,所述报告因子的3'端具有淬灭基团修饰。
根据本发明的实施例,所述荧光基团选自FAM、HEX和ROX中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述淬灭基团选自BHQ1、lowa Black FQ和Cy5中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中,所述荧光基团为FAM,所述淬灭基团为BHQ1;所述荧光基团为HEX,所述淬灭基团为lowa Black FQ;所述荧光基团为ROX,所述淬灭基团为Cy5。
根据本发明的实施例,所述ssDNA选自TTATTATT和TAGTGATGGCCTGGCTCA/+C/C/+T/中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述ssDNA为TTATTATT。
根据本发明的实施例,所述报告因子选自FAM-TTATTATT-BHQ1和FAM-TAGTGATGGCCTGGCTCA/+C/C/+T/-BHQ1中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述报告因子为FAM-TTATTATT-BHQ1。
试剂盒在制备产品中的用途
在本发明的第四方面,本发明提出了第三方面所述的试剂盒在制备产品中的用途,所述产品用于检测HPV16和/或HPV18。由前可知,上述试剂盒中的crRNA可高特异性地与HPV16和/或HPV18的目的片段结合。由此,采用含有上述试剂盒的产品能高效检出HPV16和/或HPV18。
检测HPV16和/或HPV18的方法
在本发明的第五方面,本发明提出了一种检测HPV16和/或HPV18的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括第一方面所述的crRNA或第三方面所述的试剂盒对待测样本进行检测。本发明的方法可有效检测出HPV16和/或HPV18,且具有准确性高、特异性强或灵敏度高等优点。
根据本发明的实施例,所述方法包括:第一采用扩增引物待测样本进行扩增处理;第二采用crRNA、Cas12a蛋白和报告分子对扩增处理产物进行检测;基于检测结果,确定所述待测样本是否含有所述HPV16和/或HPV18。
根据本发明的实施例,所述HPV16具有L1和E6/E7基因片段区域。
根据本发明的实施例,所述HPV18具有L1和E6/E7基因片段区域。
根据本发明的实施例,所述扩增处理是在35~42℃条件下反应10-60min,例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃以及它们任意两个点值之间的范围值,如35~42℃、35~41℃、35~40℃、35~39℃、35~38℃、37~42℃;例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min以及它们任意两个点值之间的范围值,如10min-55min、15min-55min、15min-50min、20min-50min、25min-50min、25min-45min、25min-40min、25min-35min。
根据本发明的实施例,所述检测是在35~42℃条件下进行10-60min,例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃以及它们任意两个点值之间的范围值,如35~42℃、35~41℃、35~40℃、35~39℃、35~38℃、37~42℃;例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min以及它们任意两个点值之间的范围值,如10min-55min、15min-55min、15min-50min、20min-50min、25min-50min、25min-45min、25min-40min、25min-35min。
根据本发明的实施例,所述检测结果为荧光值。
根据本发明的实施例,所述方法进一步包括:产生所述荧光值,是所述待测样本含有所述HPV16和/或HPV18的指示;或者不产生所述荧光值,是所述待测样本不含所述HPV16和/或HPV18的指示。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:人***瘤病毒HPV16、HPV18亚型基因区域单靶点快速灵敏检测
1分别设计与制备HPV16、HPV18亚型特异性L1基因和E6/E7基因区域crRNAs
1.1分别设计HPV16、HPV18亚型特异性L1基因和E6/E7基因区域crRNAs:
1)本实施例利用NCBI数据库BLAST工具下载人***瘤病毒L1区、E6/E7区基因片段序列,序列包括HPV16亚型、HPV18亚型、HPV31亚型、HPV33亚型、HPV35亚型、HPV39亚型、HPV45亚型、HPV51亚型、HPV52亚型、HPV56亚型、HPV58亚型、HPV59亚型、HPV66亚型、HPV68亚型;
2)对下载的片段序列利用CLUSTALO(1.2.4)软件进行多序列分析,然后根据多序列比对结果选取变异区段进行cRNA设计。
3)针对HPV16、HPV18的L1区、E6/E7区基因片段,寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列,设计20-23nt长度的crRNA。
①针对L1基因片段区域的crRNAs:针对HPV16、HPV18亚型,分别选择三条核苷酸序列作为crRNA的核心序列部分,该crRNA的核心序列用于与靶DNA杂交,对应将其最终得到的完整crRNA分别命名为16L1crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示)、16L1crRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示)、16L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示)、18L1crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示)、18L1crRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示)、18L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示),该片段的具体序列如表1所示。
表1:HPV16、HPV18亚型L1基因区特异性crRNA对应的可与靶DNA杂交的片段
crRNA名称 | crRNA中的核心序列(5'-3') |
16L1crRNA-1 | AUAUCUACUUCAGAAACUACAUA(SEQ ID NO:5) |
16L1crRNA-2 | GUGCUGCCAUAUCUACUUCA(SEQ ID NO:6) |
16L1crRNA-3 | UUCUGAAGUAGAUAUGGCAGCAC(SEQ ID NO:50) |
18L1crRNA-1 | GACUGUGUAGAAGCACAUAUUGU(SEQ ID NO:7) |
18L1crRNA-2 | GUACCUGGGCAAUAUGAUGCUAC(SEQ ID NO:8) |
18L1crRNA-3 | UACCACUCGCAGUACCAAUUUAA(SEQ ID NO:51) |
②针对E6/E7基因片段区域的crRNAs:针对HPV16、HPV18的E6/E7区基因片段,寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列,设计20-23nt长度的crRNA。本例中针对HPV16、HPV18亚型,分别选择了理论上较为优选的三条核苷酸序列作为crRNA中用于与靶DNA杂交的片段,该片段是crRNA的核心部分,对应将其最终得到的完整crRNA分别命名为16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示)、16E6/E7crRNA-2(核苷酸序列如SEQID NO:30所示)、16E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示)、18E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示)、18E6/E7crRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示),具体信息如表2所示。
表2:HPV16、HPV18亚型E6/E7基因区特异性crRNA对应的可与靶DNA杂交的片段
crRNA名称 | crRNA中的核心序列(5'-3') |
16E6/E7crRNA-1 | UUCCCAUCUCUAUAUACUAUGCA(SEQ ID NO:15) |
16E6/E7crRNA-2 | GUCUAUACUCACUAAUUUUAGAA(SEQ ID NO:16) |
16E6/E7crRNA-3 | UGCUGUUCUAAUGUUGUUCCAUA(SEQ ID NO:17) |
18E6/E7crRNA-1 | AGCAAUUAAGCGACUCAGAGGAA(SEQ ID NO:18) |
18E6/E7crRNA-2 | GCGACUCAGAGGAAGAAAACGAU(SEQ ID NO:19) |
18E6/E7crRNA-3 | UGUGGUUCGGCUCGUCGGGCUGG(SEQ ID NO:20) |
1.2分别制备HPV16、HPV18亚型特异性L1基因和E6/E7基因区域crRNAs:
1)根据上述表1和表2中的序列信息,先设计对应的DNA序列,DNA序列的连接方式从5'到3'端为T7启动子序列-发夹序列-crRNA的核心序列(DNA序列)。其中,T7启动子序列如SEQ ID NO:9所示,发夹序列如SEQ ID NO:35所示,crRNA的核心序列(DNA序列)选自SEQID NO:36~46或者SEQ ID NO:20中的任意一项,由北京六合华大基因科技有限公司合成上述DNA片段。
2)T7启动子介导的体外转录:
①退火获得T7启动子部分复性的单链DNA:采用TranscriptAid T7 High YieldTranscription Kit试剂盒进行体外转录,将1μL 10×PCR Buffer,4μL T7启动子DNA,4μLT7-crRNA,1μL ddH2O,混合均匀,于95℃退火5min,室温放置1h,获得T7启动子部分复性的单链DNA。
②进一步体外转录:以①中获得的单链DNA为模版,采用如表3所示的体系进行进一步的体外转录。将表3所示的各组分混合均匀后,37℃过夜,分别制备得到针对L1区和E6/E7区基因片段的crRNA,具体为针对L1区的crRNA(16L1crRNA-1、16L1crRNA-2、16L1crRNA-3、18L1crRNA-1、18L1crRNA-2和18L1crRNA-3)和针对E6/E区的crRNA(16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2、16E6/E7crRNA-3、18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2和18E6/E7crRNA-3)。
表3:体外转录体系
成分 | 用量 |
5×TranscriptAid Reaction Buffer | 2μL |
TranscriptAid Enzyme Mix | 1μL |
dATP | 1μL |
dCTP | 1μL |
dUTP | 1μL |
dGTP | 1μL |
DNA | 3μL |
3)RNA纯化:使用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒分别对上述获得的crRNA(16L1crRNA-1、16L1crRNA-2、16L1crRNA-3、18L1crRNA-1、18L1crRNA-2、18L1crRNA-3、16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2、16E6/E7crRNA-3、18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2和18E6/E7crRNA-3)进行纯化和浓缩,获得纯化的针对L1区和E6/E7区的目标crRNAs,并利用Nanodrop 2000进行RNA浓度测定,结果crRNA浓度应大于100ng/μL。将获得的crRNA置于-20℃或-80℃条件下保存。
2目标DNA区域核酸扩增及荧光检测
2.1制备DNA样本:分别从HPV16亚型、HPV18亚型中各取3例50μL核酸保存液样本(由深圳华大基因股份有限公司提供),各加入50μL样本释放剂,于85℃反应10min,得到可用于扩增的DNA样本。
2.2扩增并荧光检测DNA样本:
1)①扩增L1区序列:加入29.4μL A buffer(安普未来DNA恒温快速扩增试剂盒(基础型))(已加入干粉管中混合溶剂)、2μL上游引物【HPV16L1F(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、HPV18L1F(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示),具体序列参见表4】、2μL下游引物【HPV16L1R(核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)、HPV18L1R(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示),具体序列参见表4】、2.5μLB buffer、9.1μL ddH2O后分别加入本实施例步骤2.1中制备得到的6例DNA样本,混合均匀,于37℃反应30min,获得样品进行荧光检测。
表4:L1区MIRA扩增引物序列
引物名称 | 引物序列(5'-3') |
HPV16L1F | TTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTT(SEQ ID NO:11) |
HPV16L1R | CCTCCCCATGTCTGAGGTACTCCTTAAAG(SEQ ID NO:12) |
HPV18L1F | GCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACT(SEQ ID NO:13) |
HPV18L1R | GCAAATCATATTCCTCAACATGTCTGCTATACT(SEQ ID NO:14) |
②荧光检测:
按照表5所示的CRISPR/Cas12a检测体系,在荧光检测体系中依次加入本实施例步骤1.2中制备得到的crRNAs(16L1crRNA-1、16L1crRNA-2、16L1crRNA-3、18L1crRNA-1、18L1crRNA-2和18L1crRNA-3中的其中之一)、本实施例步骤2.2制备得到的待测样品、NEBuffer r2.1、CRISPR/Cas12a、ssDNA FQ reporter和ddH2O,将上述各组分混合均匀后于荧光定量PCR仪中37℃反应30min,检测最终荧光数值。
表5:HPV16、HPV18亚型CRISPR/Cas12a检测体系
成分 | 用量 |
NEBuffer r2.1(10X) | 1μL |
CRISPR/Cas12a(1μM) | 0.5μL |
crRNA(1μM) | 0.5μL |
DNA | 1μL |
ssDNA FQ reporter(10μM) | 0.5μL |
ddH2O | 6.5μL |
结果显示,使用16L1crRNA-1、16L1crRNA-2、16L1crRNA-3均可对3例不同HPV16亚型临床样本进行检测,且荧光信号强度相差不大,本实施例示例性地展示16L1crRNA-1、16L1crRNA-2的荧光信号强度结果,具体参见图1;使用18L1crRNA-1、18L1crRNA-2、18L1crRNA-3均可对3例不同HPV18亚型临床样本进行检测,18L1crRNA-2和18L1crRNA-3的荧光信号强度明显强于18L1crRNA-1,本实施例示例性展示18L1crRNA-1、18L1crRNA-2的荧光信号强度结果,具体参见图2。
2)①扩增E6/E7区:加入29.4μL A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)、2μL上游引物【HPV16E6/E7F(核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示)、HPV18E6/E7F(核苷酸序列如SEQ IDNO:23所示),具体序列参见表6】,2μL下游引物【HPV16E6/E7R(核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)、HPV18E6/E7R(核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示),具体序列参见表6】,2.5μL Bbuffer,9.1μL ddH2O后分别加入本实施例步骤2.1中制备得到的6例DNA样本,混合均匀,于37℃反应30min,获得样品进行下一步荧光检测。
表6:E6/E7区MIRA扩增引物序列
引物名称 | 引物序列(5'-3') |
HPV16 E6/E7F | TGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTAT(SEQ ID NO:21) |
HPV16 E6/E7R | CACACAACGGTTTGTTGTATTGCTGTTCTAATG(SEQ ID NO:22) |
HPV18 E6/E7F | CAATTAAGCGACTCAGAGGAAGAAAACGATG(SEQ ID NO:23) |
HPV18 E6/E7R | TTCTGGCTTCACACTTACAACACATACACAAC(SEQ ID NO:24) |
②荧光检测:
按照表5所示的CRISPR/Cas12a检测体系,在荧光检测体系中依次加入1.2中制备得到的crRNAs(16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2、16E6/E7crRNA-3、18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2、18E6/E7crRNA-3中的其中之一)、本实施例步骤2.2制备得到的待测样品、NEBuffer r2.1、CRISPR/Cas12a、ssDNAFQ reporter和ddH2O,将上述各组分混合均匀后于荧光定量PCR仪中37℃反应30min,检测最终荧光数值。
结果如图7所示,使用16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2、16E6/E7crRNA-3均可对3种不同HPV16亚型临床样本进行检测,16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2荧光信号强度相差不大,16E6/E7crRNA-3荧光信号强度较弱;结果如图8所示,使用18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2、18E6/E7crRNA-3均可对3种不同HPV18亚型临床样本进行检测,18E6/E7crRNA-3的荧光信号强度明显强于18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2。
3基于CRISPR/Cas12a的HPV16、HPV18亚型L1或者E6/E7基因区核酸检测特异性
3.1制备DNA样本:分别从HPV16亚型、HPV18亚型、HPV31亚型、HPV33亚型、HPV35亚型、HPV39亚型、HPV45亚型、HPV51亚型、HPV52亚型、HPV56亚型、HPV58亚型、HPV59亚型、HPV66亚型、HPV68亚型各取50μL HPV阴性核酸保存液样本(深圳华大基因股份有限公司提供),采用步骤2.2中的方法,分别得到可用于扩增的DNA样本。
3.2制备待检测样品:采用步骤1.3中的方法,对步骤3.1中的DNA样本进行快速恒温扩增,分别获得各待检测样品的L1区和E6/E7区,分别记作HPV16-16L1、HPV18-16L1、HPV31-16L1、HPV33-16L1、HPV35-16L1、HPV39-16L1、HPV45-16L1、HPV51-16L1、HPV52-16L1、HPV56-16L1、HPV58-16L1、HPV59-16L1、HPV66-16L1、HPV68-16L1、HBB-16L1、H2O-16L1、HPV16-18L1、HPV18-18L1、HPV31-18L1、HPV33-18L1、HPV35-18L1、HPV39-18L1、HPV45-18L1、HPV51-18L1、HPV52-18L1、HPV56-18L1、HPV58-18L1、HPV59-18L1、HPV66-18L1、HPV68-18L1、HBB-18L1、H2O-18L1、HPV16-16E6/E7、HPV18-16E6/E7、HPV31-16E6/E7、HPV33-16E6/E7、HPV35-16E6/E7、HPV39-16E6/E7、HPV45-16E6/E7、HPV51-16E6/E7、HPV52-16E6/E7、HPV56-16E6/E7、HPV58-16E6/E7、HPV59-16E6/E7、HPV66-16E6/E7、HPV68-16E6/E7、HBB-16E6/E7、H2O-16E6/E7、HPV16-18E6/E7、HPV18-18E6/E7、HPV31-18E6/E7、HPV33-18E6/E7、HPV35-18E6/E7、HPV39-18E6/E7、HPV45-18E6/E7、HPV51-18E6/E7、HPV52-18E6/E7、HPV56-18E6/E7、HPV58-18E6/E7、HPV59-18E6/E7、HPV66-18E6/E7、HPV68-18E6/E7、HBB-18E6/E7、H2O-18E6/E7。
3.3荧光检测:采用步骤2.2中的方法对步骤3.2中各待检测样品的L1区和E6/E7区进行荧光检测。
其中,对HPV16亚型L1区基因片段进行检测采用的crRNA分别采用的16L1crRNA-1、16L1crRNA-2和16L1crRNA-3,结果发现,16L1crRNA-1、16L1crRNA-2和16L1crRNA-3对HPV16亚型L1区基因片段均具有较高的特异性。其中,本实施例示例性地展示16L1crRNA-1对HPV16亚型L1区基因片段的检测结果,具体参见图3;
对HPV18亚型L1区基因片段进行检测采用的crRNA分别采用的18L1crRNA-1、18L1crRNA-2和18L1crRNA-3,结果发现,18L1crRNA-2和18L1crRNA-3对HPV18亚型L1区基因片段均具有较高的特异性。其中,本实施例示例性地展示18L1crRNA-2对不同HPV18亚型L1区基因片段的检测结果,具体参见图4;
对HPV16亚型E6/E7区基因片段进行检测采用的crRNA分别采用的16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2和16E6/E7crRNA-3,结果发现,16E6/E7crRNA-1和16E6/E7crRNA-2对HPV16亚型L1区基因片段均具有较高的特异性。其中,本实施例示例性地展示16E6/E7crRNA-1对HPV16亚型E6/E7区基因片段的检测结果,具体参见图9;
对HPV18亚型E6/E7区基因片段进行检测采用的crRNA分别采用的18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2和16E6/E7crRNA-3,结果发现,18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型E6/E7区基因片段均具有较高的特异性,具体参见图10。
4基于CRISPR/Cas12a的HPV16、HPV18亚型L1或者E6/E7基因区核酸检测灵敏度
4.1合成HPV16、HPV18的L1和E6/E7区的基因片段:参考NCBI数据库中HPV16、HPV18的L1和E6/E7区的基因片段,由北京六合华大基因科技有限公司分别合成如SEQ ID NO:1所示的HPV16 L1基因片段序列、如SEQ ID NO:2所示的HPV18 L1基因片段序列、如SEQ ID NO:3所示的HPV16 E6/E7基因片段序列、如SEQ ID NO:4所示的HPV16 E6/E7基因片段序列,并将HPV16 L1片段、HPV18 L1片段、HPV16 E6/E7片段和HPV18 E6/E7片段构建到PMV载体,分别命名为PMV-HPV16L1、PMV-HPV18L1、PMV-HPV16 E6/E7、PMV-HPV18 E6/E7。
4.2灵敏度检测:
1)10倍梯度稀释:将PMV-HPV16L1、PMV-HPV18L1、PMV-HPV16E6/E7、PMV-HPV18E6/E7质粒根据分子量转换为拷贝数,进行10倍梯度稀释,分别获得每微升含有1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝数(copy/μL)的梯度稀释样品。
2)MIRA扩增:将5μL梯度稀释样品,分别进行MIRA扩增反应:29.4μL Abuffer(已加入干粉管中混合溶剂),2μL上游引物(HPV16L1F、HPV18L1F或者HPV16E6/E7F、HPV18E6/E7F),2μL下游引物(HPV16L1R、HPV18L1R或者HPV16E6/E7R、HPV18E6/E7R),2.5μL B buffer和9.1μL ddH2O,混合均匀,于37℃反应30min,获得样品进行下一步荧光检测。
3)荧光检测:①采用如表6所示的10μL体系对上述样品进行荧光检测,其中,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNAFQ reporter浓度为10μM,crRNA(16L1crRNA-1、16L1crRNA-2或16L1crRNA-3)浓度为1μM。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
结果显示,应用CRISPR/Cas12a荧光法检测HPV16亚型L1基因区核酸,16L1crRNA-1、16L1crRNA-2和16L1crRNA-3对HPV16亚型L1区基因片段均具有较高的灵敏度。其中,本实施例示例性地展示16L1crRNA-1针对HPV16亚型L1基因区能够实现100拷贝的高灵敏度检出(结果参见图5)。
②采用如表6所示的10μL体系对上述样品进行荧光检测,其中,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNAFQ reporter浓度为10μM,crRNA(18L1crRNA-1、18L1crRNA-2和18L1crRNA-3)浓度为1μM。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
结果显示,应用CRISPR/Cas12a荧光法检测HPV18亚型L1基因区核酸,18L1crRNA-1、18L1crRNA-2和18L1crRNA-3对HPV16亚型L1区基因片段均具有较高的灵敏度。其中,本实施例示例性地展示18L1crRNA-2对HPV18亚型L1基因区能够实现100拷贝的高灵敏度检出(结果参见图6)。
③采用如表6所示的10μL体系对上述样品进行荧光检测,其中,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNAFQ reporter浓度为10μM,crRNA(16E6/E7crRNA-1、16E6/E7crRNA-2和16E6/E7crRNA-3)浓度为1μM。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
结果显示,应用CRISPR/Cas12a荧光法检测HPV16亚型E6/E7基因区核酸,16E6/E7crRNA-1和16E6/E7crRNA-2对HPV16亚型E6/E7区基因片段均具有较高的灵敏度。其中,本实施例示例性地展示16E6/E7crRNA-1对HPV16亚型E6/E7基因区能够实现102拷贝的高灵敏度检出(结果参见图11)。
④采用如表6所示的10μL体系对上述样品进行荧光检测,其中,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNA FQ reporter浓度为10μM,crRNA(18E6/E7crRNA-1、18E6/E7crRNA-2和18E6/E7crRNA-3)浓度为1μM。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
结果显示,应用CRISPR/Cas12a荧光法检测HPV18亚型E6/E7基因区核酸,18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型E6/E7区基因片段均具有较高的灵敏度。18E6/E7crRNA-3对HPV18亚型E6/E7基因区能够实现102拷贝的高灵敏度检出(结果参见图12)。
实施例2:基于CRISPR/Cas12a的人***瘤病毒HPV16、HPV18亚型不同靶点检测效果比较
1.制备DNA样本:分别从HPV16亚型、HPV18亚型中各取9例50μL核酸保存液样本(由深圳华大基因股份有限公司提供),各加入50μL样本释放剂(由深圳华大智造有限公司提供),于85℃反应10min,得到可用于扩增的DNA样本。将上述9例DNA样本分成两份,一份用于检测HPV16、HPV18亚型E6/E7基因区、另一份用于检测HPV16、HPV18亚型L1基因区。
2.扩增与检测:
首先,对上述9例DNA样本的HPV16、HPV18亚型L1基因区进行检测,具体步骤为:
利用引物对1(HPV16L1F、HPV16E6/E7F、HPV16L1R、HPV16E6/E7R)对HPV16、HPV18亚型DNA样本进行扩增,扩增方法参考实施例1步骤2.2中MIRA扩增反应,获得样品进行下一步CRISPR/Cas12a检测。
分别利用16L1crRNA-1、16E6/E7crRNA-1、18L1crRNA-2、18E6/E7crRNA-3与LbCas12a蛋白混合物对前述扩增产物HPV16L1、HPV16 E6/E7、HPV18L1、HPV18 E6/E7进行检测,本检测采用如表7所示的10μL体系。其中,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNAFQ reporter浓度为10μM,crRNA浓度为1μM。
表7:HPV16、HPV18亚型CRISPR/Cas12a检测体系
成分 | 用量 |
NEBuffer r2.1(10X) | 1μL |
CRISPR/Cas12a(1μM) | 0.5μL |
crRNA(1μM) | 0.5μL |
DNA | 1μL |
ssDNA FQ reporter(10μM) | 0.5μL |
ddH2O | 6.5μL |
利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
其次,对上述9例DNA样本的HPV16、HPV18亚型E6/E7基因区进行检测,具体步骤为:
利用引物对2(HPV18L1F、HPV18E6/E7F、HPV18L1R、HPV18E6/E7R)对HPV16、HPV18亚型DNA样本进行扩增,扩增方法参考实施例1步骤2.2中MIRA扩增反应,获得样品进行下一步CRISPR/Cas12a检测。
分别利用16L1crRNA-1、16E6/E7crRNA-1、18L1crRNA-2、18E6/E7crRNA-3与LbCas12a蛋白混合物对前述扩增产物HPV16L1、HPV16 E6/E7、HPV18L1、HPV18 E6/E7进行检测,本检测采用如表7所示的10μL体系。其中,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNAFQ reporter浓度为10μM,crRNA浓度为1μM。
利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
结果显示,应用CRISPR/Cas12a荧光法检测不同阳性临床样本中HPV16亚型L1基因区与E6/E7基因区核酸,在样本3、4、6、9中检测L1基因核酸的荧光值明显大于E6/E7基因,样本1、7中检测E6/E7基因的荧光值明显大于L1基因,在样本2、5、8中检测L1基因核酸的荧光值与E6/E7基因相差无几(结果参见图13);应用CRISPR/Cas12a荧光法检测不同阳性临床样本中HPV18亚型L1基因区与E6/E7基因区核酸,样本1、4、7、9中检测L1基因核酸的荧光值明显大于E6/E7基因,样本3、5、6中检测E6/E7基因的荧光值明显大于L1基因,在样本2、8中检测L1基因核酸的荧光值与E6/E7基因相差无几(结果参见图14)。这些结果说明,在同一样本中,检测L1基因与E6/E7基因的检测效率是不同的,因此进行仅仅检测单靶点会存在漏检的可能。
实施例3:人***瘤病毒HPV16、HPV18亚型双靶点快速检测
1基于Crispr/Cas12a的HPV16、HPV18亚型双靶点特异性检测
1.1制备DNA样本:分别从HPV16亚型、HPV18亚型、HPV31亚型、HPV33亚型、HPV35亚型、HPV39亚型、HPV45亚型、HPV51亚型、HPV52亚型、HPV56亚型、HPV58亚型、HPV59亚型、HPV66亚型、HPV68亚型各取50μL HPV阴性核酸保存液样本(深圳华大基因股份有限公司提供),采用实施例1中步骤2.1中的方法,分别得到可用于扩增的DNA样本。
1.2制备待检测样品:具体操作如下:采用如表8所示的50μL体系对本实施例步骤1.1中的DNA样本进行快速恒温扩增,根据表8体系依次加入各种成分,混合均匀,于37℃反应30min,获得样品以备后续的核酸检测。
获得的针对HPV16亚型扩增的待检测样品分别记作:HPV16-16L1+E6/E7、HPV18-16L1+E6/E7、HPV31-16L1+E6/E7、HPV33-16L1+E6/E7、HPV35-16L1+E6/E7、HPV39-16L1+E6/E7、HPV45-16L1+E6/E7、HPV51-16L1+E6/E7、HPV52-16L1+E6/E7、HPV56-16L1+E6/E7、HPV58-16L1+E6/E7、HPV59-16L1+E6/E7、HPV66-16L1+E6/E7、HPV68-16L1+E6/E7、HBB-16L1+E6/E7、H2O-16L1+E6/E7;
获得的针对HPV18亚型扩增的待检测样品分别记作:HPV16-18L1+E6/E7、HPV18-18L1+E6/E7、HPV31-18L1+E6/E7、HPV33-18L1+E6/E7、HPV35-18L1+E6/E7、HPV39-18L1+E6/E7、HPV45-18L1+E6/E7、HPV51-18L1+E6/E7、HPV52-18L1+E6/E7、HPV56-18L1+E6/E7、HPV58-18L1+E6/E7、HPV59-18L1+E6/E7、HPV66-18L1+E6/E7、HPV68-18L1+E6/E7、HBB-18L1+E6/E7、H2O-18L1+E6/E7)。
表8:MIRA扩增体系
成分 | 用量 |
A buffer(已加入干粉管中混合溶剂) | 29.4μL |
Primer A(10μM) | 2μL |
Primer B(10μM) | 2μL |
Primer C(10μM) | 2μL |
Primer D(10μM) | 2μL |
DNA | 5μL |
B buffer | 2.5μL |
ddH2O | 5.1μL |
备注:Primer A为HPV16L1F(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、HPV18L1F(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示);Primer B:HPV16L1R(核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)、HPV18L1R(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示);Primer C:HPV16E6/E7F(核苷酸序列如SEQID NO:21所示)、HPV18E6/E7F(核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示);Primer D:HPV16 E6/E7R(核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)、HPV18 E6/E7R(核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示)。
1.3荧光检测:利用实施例1中步骤1.1得到的crRNA分为A、B两组(A组为16L1crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示)、18L1crRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示)、16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示);B组为16L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示)、18L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示)、16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ IDNO:29所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)以及制备得到的待测样品,采用实施例1中步骤2.2中的方法进行荧光检测。其中,A组中针对HPV16亚型的crRNA为16L1crRNA-1+16E6/E7crRNA-1、针对HPV18亚型的crRNA为18L1crRNA-2+18E6/E7crRNA-3,B组中针对HPV16亚型的crRNA为16L1crRNA-3+16E6/E7crRNA-1、针对HPV18亚型的crRNA为18L1crRNA-3+18E6/E7crRNA-3。结果发现,A组可实现对HPV16、HPV18亚型的双靶点特异性检测,但B组中的检测结果无法实现对HPV16、HPV18亚型的双靶点的特异性检测。
本实施例中示例性展示A组的针对HPV16、HPV18亚型双靶点的特异性检测结果,其中针对HPV16亚型的CRISPR/Cas12a检测如图15所示,HPV18亚型的CRISPR/Cas12a检测如图16所示。
表9:HPV16、HPV18亚型双靶点CRISPR/Cas12a检测体系
成分 | 用量 |
NEBuffer r2.1(10X) | 1μL |
CRISPR/Cas12a(1μM) | 0.5μL |
L1crRNA(1μM) | 0.5μL |
E6/E7crRNA(1μM) | 0.5μL |
DNA | 1μL |
ssDNA FQ reporter(10μM) | 0.5μL |
ddH2O | 6μL |
2基于crispr/Cas12a的HPV16、HPV18亚型双靶点核酸检测灵敏性
2.1制备样品:将实施例1中步骤4.1所制备的PMV-HPV16L1和PMV-HPV16E6/E7等浓度等体积混合,并命名为HPV16s;将实施例1中步骤4.1所制备的PMV-HPV18L1和PMV-HPV18E6/E7等浓度等体积混合,并命名为HPV18s。
将上述制备的HPV16s、HPV18s质粒根据分子量转换为拷贝数,进行10倍梯度稀释,获得每微升含有1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝数(copy/μL)。将5μL梯度稀释样品,分别进行MIRA扩增反应,MIRA扩增反应体系如表8所示,于37℃反应30min,获得样品进行下一步核酸检测。
2.2荧光检测:利用实施例1中步骤1.1得到的crRNA分为A、B两组(A组为16L1crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示)、18L1crRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示)、16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示);B组为16L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示)、18L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示)、16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ IDNO:29所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)以及制备得到的待测样品,采用实施例1中步骤2.2中的方法进行荧光检测。其中,A组中针对HPV16亚型的crRNA为16L1crRNA-1+16E6/E7crRNA-1、针对HPV18亚型的crRNA为18L1crRNA-2+18E6/E7crRNA-3,B组中针对HPV16亚型的crRNA为16L1crRNA-3+16E6/E7crRNA-1、针对HPV18亚型的crRNA为18L1crRNA-3+18E6/E7crRNA-3。
采用如表9所示的10μL检测体系对本实施例步骤2.1获得的样品进行荧光检测。上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNA FQ reporter浓度为10μM,crRNA浓度为1μM。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值。
结果显示,A组可实现对HPV16、HPV18亚型的双靶点的灵敏度检测,但B组中的检测结果无法实现对HPV16、HPV18亚型的双靶点的灵敏度检测。本实施例中示例性地展示A组应用CRISPR/Cas12a荧光法检测HPV16、HPV18亚型双靶点的灵敏度检测实验结果,A组针对HPV16亚型能够实现100拷贝的高灵敏度检出(结果参见图17);A组针对HPV18亚型能够实现100拷贝的高灵敏度检出(结果参见图18)。
3基于crispr/Cas12a的HPV16、HPV18亚型双靶点检测方法在临床样本中的效果分析
3.1MIRA扩增DNA样本:对本实施例中由深圳华大基因股份有限公司提供的HPV临床样本(DNA、样本裂解液),包括HPV16亚型(样本裂解液样本13例、DNA样本15例)、HPV18亚型(样本裂解液样本10例、DNA样本16例)、HPV阴性(样本裂解液样本7例、DNA样本9例),采用如表8所示的50μL扩增体系对上述临床样本进行MIRA扩增,获得的样品进行下一步荧光检测。
3.2荧光检测:利用实施例1中步骤1.1得到的crRNA分为A、B两组(A组为16L1crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示)、18L1crRNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示)、16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示);B组为16L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示)、18L1crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示)、16E6/E7crRNA-1(核苷酸序列如SEQ IDNO:29所示)、18E6/E7crRNA-3(核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)以及制备得到的待测样品,采用实施例1中步骤2.2中的方法进行荧光检测。其中,A组中针对HPV16亚型的crRNA为16L1crRNA-1+16E6/E7crRNA-1、针对HPV18亚型的crRNA为18L1crRNA-2+18E6/E7crRNA-3,B组中针对HPV16亚型的crRNA为16L1crRNA-3+16E6/E7crRNA-1、针对HPV18亚型的crRNA为18L1crRNA-3+18E6/E7crRNA-3。
采用如表9所示的10μL检测体系对本实施例中步骤3.1获得样品进行CRISPR/Cas12a检测,上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM,ssDNA FQ reporter浓度为10μM,crRNA浓度为1μM。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性,可使用实时荧光定量PCR仪与凝胶成像仪进行检测。使用实时荧光定量PCR仪,37℃反应30min,检测荧光数值;使用凝胶成像仪,在37℃反应30min,观察是否有荧光产生。
结果显示,A组可检测到较强的荧光信号,B组可检测到微弱的荧光信号。本实施例中示例性地展示A组针对HPV16、18亚型的核酸检测结果,针对HPV16亚型的检测结果如图19、图20所示,对于样本裂解液样本,检出率可达95%,对于DNA样本,检出率可达95.8%;针对HPV18亚型的检测结果如图21、图22所示,对于样本裂解液样本,检出率可达94.1%,对于DNA样本,检出率可达92%。通过以上结果可以说明,本发明设计的A组crRNA可实现人***瘤病毒HPV16、HPV18亚型双靶点快速灵敏检测。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种crRNA,其特征在于,包括核心序列;
所述核心序列包括如SEQ ID NO:5~8、SEQ ID NO:15~20和SEQ ID NO:50~51任一项所示的核苷酸序列中的至少之一。
2.根据权利要求1所述的crRNA,其特征在于,所述crRNA包括:
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列;
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列;
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列;以及
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;
任选地,所述crRNA包括:
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1和2所述的crRNA,其特征在于,进一步包括发夹结构,
所述发夹结构的3'端和核心序列的5'端相连,所述发夹结构具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列;
任选地,所述crRNA包括:
如SEQ ID NO:25~34和SEQ ID NO:48~49任一项所示的核苷酸序列中的至少之一;
任选地,所述crRNA包括:
SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列;
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列;
SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列;以及
SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;
任选地,所述crRNA包括:
SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列;或
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
4.权利要求1~3任一项所述的crRNA在制备试剂中的用途,所述试剂用于检测HPV16和/或HPV18。
5.一种试剂盒,其特征在于,包括:
权利要求1~3任一项所述的crRNA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括如下组分中的至少之一:
扩增引物、Cas12a蛋白和报告因子。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述扩增引物为MIRA扩增引物;
任选地,所述扩增引物包括如下组合中的至少之一:
如SEQ ID NO:11核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:12核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:13核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:14核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:21核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:22核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:23核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:24核苷酸序列所示的下游引物;
任选地,所述扩增引物包括:
如SEQ ID NO:11核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:12核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:13核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:14核苷酸序列所示的下游引物;
如SEQ ID NO:21核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:22核苷酸序列所示的下游引物;以及
如SEQ ID NO:23核苷酸序列所示的上游引物、如SEQ ID NO:24核苷酸序列所示的下游引物。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述Cas12a蛋白选自FnCas12a蛋白、AsCas12a蛋白、LbCas12a蛋白、Lb5Cas12a蛋白、HkCas12a蛋白、OsCas12a蛋白、TsCas12a蛋白、BbCas12a蛋白、BoCas12a蛋白和Lb4Cas12a蛋白中的至少之一;
任选地,所述报告因子用于荧光检测;
任选地,所述报告因子选自ssDNA和可形成发夹结构的DNA中的至少之一;
任选地,所述报告因子具有荧光基团和淬灭基团修饰;
任选地,所述报告因子的5'端具有荧光基团修饰,所述报告因子的3'端具有淬灭基团修饰;
任选地,所述荧光基团选自FAM、HEX和ROX中的至少之一;
任选地,所述淬灭基团选自BHQ1、lowa Black FQ和Cy5中的至少之一;
任选地,所述ssDNA选自TTATTATT和TAGTGATGGCCTGGCTCA/+C/C/+T/中的至少之一;
任选地,所述报告因子选自FAM-TTATTATT-BHQ1和FAM-TAGTGATGGCCTGGCTCA/+C/C/+T/-BHQ1中的至少之一。
9.权利要求5~8任一项所述的试剂盒在制备产品中的用途,所述产品用于检测HPV16和/或HPV18。
10.一种检测HPV16和/或HPV18的方法,其特征在于,包括:
采用权利要求1~3任一项所述的crRNA或权利要求5~8任一项所述的试剂盒对待测样本进行检测。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,包括:
采用扩增引物待测样本进行扩增处理;
采用crRNA、Cas12a蛋白和报告分子对扩增处理产物进行检测;
基于检测结果,确定所述待测样本是否含有所述HPV16和/或HPV18;
任选地,所述HPV16具有L1和E6/E7基因片段区域;
任选地,所述HPV18具有L1和E6/E7基因片段区域;
任选地,所述扩增处理是在35~42℃条件下反应10-60min;
任选地,所述检测是在35~42℃条件下进行10-60min;
任选地,所述检测结果为荧光值;
任选地,进一步包括:
产生所述荧光值,是所述待测样本含有所述HPV16和/或HPV18的指示;或者
不产生所述荧光值,是所述待测样本不含所述HPV16和/或HPV18的指示。
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