CN107429299A - 判定胎儿的基因状态的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定基因状态的目的区域；从母血试样分离单细胞的工序；从单细胞提取基因组DNA的工序；将从单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以对目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对目的区域进行PCR扩增的工序；及DNA测序工序，解读目的区域的PCR扩增产物的DNA碱基序列，以对目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具有基于局部比对评分的第1阶段选拔工序及基于全局比对评分的第2阶段选拔工序。

Description

判定胎儿的基因状态的方法
技术领域
本发明涉及一种判定胎儿的基因状态的方法。
背景技术
作为产前诊断，以往一直进行通过羊膜穿刺检查羊水中的胎儿细胞的染色体的羊水检查。但是，该方法中，存在流产的可能性，作为较大的问题而被指出。
作为安全的产前诊断，最近通过分析母体血液中与母亲的无细胞DNA(Deoxyribonucleic acid：脱氧核糖核酸)混合存在的来源于胎儿的无细胞DNA的方法进行产前诊断。该方法为无创性，作为能够以较高概率获取胎儿的遗传信息的方法而受到关注。专利文献1中，记载有用于利用根据来源于胎儿母亲的DNA与来源于胎儿的DNA的混合试样测定出的基因型数据及根据需要利用来自母亲及父亲的基因型数据来确定妊娠中的胎儿的染色体的倍数性状态的方法。
另一方面，得知胎儿细胞在母体的血液中移动，该胎儿细胞与血液一同在母体中循环。如果能够再现性良好且可靠地分析这种胎儿细胞中的基因组DNA，则能够实现无流产可能性的安全而且直接分析来源于胎儿的DNA的产前诊断。
但是，理解到存在于母体的血液中的胎儿细胞(例如，胎儿有核红细胞)在母血数mL中仅存在1个左右，由此研究有各种可靠地获取胎儿细胞的方法。利用这种公知的技术可靠地分选稀少的胎儿细胞时可获得的胎儿细胞的数量至多为数个，或者有时仅限于1个。
关于扩增细胞中的DNA的扩增技术，专利文献1中记载有利用多个引物组合，通过多重PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶连锁反应)扩增多个感兴趣的基因位点，检测突变及染色体异常等基因疾病的方法。并且，专利文献2中公开有使用高度多重目标化聚合酶连锁反应扩增来源于胎儿的基因组DNA的特定序列，通过序定器确定各目标基因座上的等位基因频率的方法。
作为通过1个反应***同时扩增2个以上的扩增对象区域的反应，已知有多重PCR。已知多重PCR为对根据自微量血液提取的少量DNA有效地对扩增对象区域进行扩增来分型多个SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms：单核苷酸多态性)有用的技术。专利文献3中公开有能够有效地扩增多个扩增部位(目标)的多重PCR用的引物设计方法。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/074723
专利文献2：国际公开第2012/108920
专利文献3：国际公开第2008/004691
发明内容
发明要解决的技术课题
为了分离来源于胎儿的有核红细胞，利用公知的技术分析所获取的细胞中的DNA来判定胎儿的基因状态，需从单细胞提取DNA并进行扩增至分析所需的量，进行全基因组扩增的情况较多。
但是，全基因组扩增虽然具有使从一个细胞提取的微量的基因组DNA飞跃性地增加的优点，但也有根据扩增区域，难以将扩增倍率保持为恒定，通过扩增PCR产物被偏置这样的缺点。
因此，要求即使进行全基因组扩增，也可将从单细胞提取的基因组DNA作为模板均匀且高精度地进行目的区域的PCR扩增的判定胎儿的基因状态的方法。
因此，本发明的课题在于，提供一种可均匀且高精度地进行目的区域的基于聚合酶连锁反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)的扩增的判定胎儿的基因状态的方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而反复进行深入研究，其结果，发现如下内容并完成了本发明：对引物二聚体形成性进行评价，对引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分，根据所求出的局部比对评分进行第1阶段的选拔，对包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分，根据所求出的全局比对评分进行第2阶段的选拔，若采用在第1阶段及第2段階的任一阶段中均被选拔的引物，则能够获得选择性且有效地扩增目标基因区域的供聚合酶连锁反应的引物组合。
即，本发明为以下(1)至(6)。
(1)一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：
目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定上述基因状态的目的区域；
单细胞分离工序，从母血试样分离单细胞；
基因组DNA提取工序，从上述单细胞提取基因组DNA；
基于聚合酶连锁反应的扩增工序，将从上述单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以通过聚合酶连锁反应对上述目标区域进行扩增的方式设计的引物组合，通过聚合酶连锁反应对上述目标区域进行扩增；及
DNA测序工序，解读上述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物的DNA碱基序列，
其中，上述目的区域选择工序在上述单细胞分离工序及上述基因组DNA提取工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述单细胞分离工序及上述基因组DNA提取工序这两个工序同时进行，
以通过聚合酶连锁反应对上述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：
目标区域选择工序，从上述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域；
引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述目标区域的引物候选的碱基序列；
局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第1阶段选拔工序，根据在上述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第2阶段选拔工序，根据在上述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
引物采用工序，采用在上述第1阶段选拔工序及上述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列，
其中，上述局部比对工序及上述第1阶段选拔工序这两个工序在上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
(2)根据上述(1)所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
以通过聚合酶连锁反应对上述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：
第1目标区域选择工序，从上述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第1目标区域；
第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第1目标区域的引物候选的碱基序列；
第1局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第一第1阶段选拔工序，根据在上述第1局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第1全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第一第2阶段选拔工序，根据在上述第1全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；
第1引物采用工序，采用在上述第一第1阶段选拔工序及上述第一第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第1目标区域的引物的碱基序列；
第2目标区域选择工序，从上述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第2目标区域；
第2引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第2目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列；
第2局部比对工序，对用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列及上述已采用的引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第二第1阶段选拔工序，根据在上述第2局部比对工序中求出的局部比对评分，进行用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第2全局比对工序，对包含用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第二第2阶段选拔工序，根据在上述第2全局比对工序中求出的全局比对评分，进行用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
第2引物采用工序，采用在上述第二第1阶段选拔工序及上述第二第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第2目标区域的引物的碱基序列，
其中，上述第1局部比对工序及上述第一第1阶段选拔工序这两个工序在上述第1全局比对工序及上述第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述第1全局比对工序及上述第一第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，且
上述第2局部比对工序及上述第二第1阶段选拔工序这两个工序在上述第2全局比对工序及上述第二第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述第2全局比对工序及上述第二第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，
上述目标区域存在3处以上时，对所有目标区域，反复进行上述第2目标区域选择工序至上述第2引物采用工序的各工序，直至采用用于扩增该目标区域的引物的碱基序列。
(3)根据上述(1)或(2)所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，至少反复进行上述基因组DNA提取工序至上述DNA测序工序，直至能够在上述单细胞分离工序中分离来源于胎儿的单细胞。
(4)根据上述(1)至(3)中任一项所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，上述基因状态为染色体的数量异常。
(5)根据上述(1)至(4)中任一项所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
在基于上述聚合酶连锁反应的扩增工序与上述DNA测序工序之间还具备磁珠纯化工序，所述磁珠纯化工序中，利用磁珠对上述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物进行纯化。
(6)根据上述(1)至(5)中任一项所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，上述DNA测序工序中，进一步测定序列读段数。
发明效果
根据本发明，能够提供一种可均匀且高精度地进行目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增的判定胎儿的基因状态的方法。
并且，根据本发明，能够以较短的工序可靠且有效地进行目的区域中的基因序列确定。
附图说明
图1是表示本发明中的引物及引物组合的设计方法的框图。
具体实施方式
总体来说，本发明涉及一种剥离固定于基板上的细胞来提取基因组DNA，进行扩增对象区域的DNA扩增来判定来源于胎儿的有核红细胞的基因状态的技术。更详细而言，本发明涉及一种通过聚合酶连锁反应进行扩增对象区域的DNA扩增时，通过利用以使引物之间的互补性下降的方式设计的引物来进行DNA扩增，由此缩短操作工序，解决PCR扩增产物的量在多个细胞之间偏差的课题的技术。
以往的无创产前诊断为分析在母体血液中与母亲的无细胞DNA混合存在的来源于胎儿的无细胞DNA的方法。该方法作为检测胎儿染色体的数量异常的方法而有用，但由于在母亲的无细胞DNA与来源于胎儿的无细胞DNA混合的状态下进行分析，因此具有难以判定数量异常以外的基因状态这样的缺点。相对于此，本发明为分析来源于胎儿的单细胞的技术，检测区域中能够包含已公知的遗传多态性部位和/或体细胞突变部位，因此能够判定不限于数量异常的基因状态。
扩增产物的序列分析中，为了有效地分析扩增产物，需减少混入到序列库的如引物二聚体的非特性产物来高精度地进行扩增。本发明中，改良聚合酶连锁反应中使用的引物及引物组合的设计方法，根据单细胞的非常少的DNA也能够均匀且高精度地扩增各种基因区域，可靠地检测有无胎儿的基因异常。
以下，对本发明的判定胎儿的基因状态的方法进行说明。
本发明的判定胎儿的基因状态的方法具备：目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定上述基因状态的目的区域；单细胞分离工序，从母血试样分离单细胞；基因组DNA提取工序，从上述单细胞提取基因组DNA；PCR扩增工序，将从上述单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以对上述目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对上述目的区域进行PCR扩增；及DNA测序工序，解读上述目的区域的PCR扩增产物的DNA碱基序列，其中，所述目的区域选择工序在所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序同时进行，以对上述目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合通过在后述的“＜引物及引物组合的设计方法＞”中说明的引物及引物组合的设计方法设计。
＜目的区域选择工序＞
目的区域选择工序中，从人类基因组上的区域选择用于判定所述基因状态的目的区域。
(人类基因组上的区域)
本发明中，“人类基因组上的区域”是指存在与基因多态性、单基因疾病、多因子疾病和/或癌症等相关的部位的基因组DNA上的区域。其中，区域的长度并无特别限定，1个碱基以上即可。
选择目的区域的人类基因组上的区域可存在于基因区域及非基因区域中的任一区域。其中，基因区域包含存在对蛋白质进行编码的基因、核糖体RNA(Ribonucleic acid：核糖核酸)基因及转移RNA基因等的编码区域、以及分断基因的基因的内含子、转印调节区域、存在5’-前导序列及3’-尾随序列等的非编码区域。并且，非基因区域包含假基因、间隔物、响应元件及复制起点等非重复序列、以及串联重复序列及分散重复序列等重复序列。
基因多态性例如为SNP(Single Nucleotide Polymorphism：单核苷酸多态性)、SNV(Single Nucleotide Variant：单核苷酸变异)、STRP(Short Tandem RepeatPolymorphism：短串联重复序列多态性)、变异、以及***和/或缺失(INDEL)等。
单基因疾病为单一基因的异常成为原因而发病的疾病。作为异常，可举出基因本身的缺失或者重复和/或基因内的碱基的取代、***和/或缺失等。将成为单基因疾病的原因的单基因称作“疾病基因”。
多因子疾病为多个基因干预发病的疾病，有时与SNP的特定组合等相关。从对疾病具有易感性的含义考虑，将这些基因称作“易感性基因”。
癌症为由于基因发生变异而产生的疾病。与其他疾病相同，癌症中也存在遗传性(家族性)癌症，被称作遗传性肿瘤(家族性肿瘤)等。
人类基因组上的区域的数量并无特别限定。这是因为，人类基因组上的区域为选择目的区域时的候选目录，即使有数量庞大的目录，也并非必需对其所有进行分析。
(目的区域)
目的区域为从上述人类基因组上的区域作为判定基因状态的对象来选择的区域。其中，选择的目的并不限定于检测与各区域相关的基因多态性、疾病或癌症等，也可为了检测染色体的非整倍性等而选择。并且，选择的目的并不限定于1个，可具有2个以上的目的。
作为目的区域而选择的人类基因组上的区域的数量根据作为目的的基因状态而不同，但只要为1处以上，则并无特别限定，优选为3处以上，更优选为5处以上，进一步优选为10处以上。
(基因状态的判定)
对于单一基因的异常成为疾病的原因的孟德尔遗传性疾病，从OMIM(OnlineMendelian Inheritance in Man：人类孟德尔遗传学)数据库选择希望检测的原因基因，设计欲检查的变异部位的数量的引物。利用所设计的引物组合，扩增从胎儿有核红细胞提取的基因组DNA的目标基因区域，通过序定器求出扩增产物的碱基序列。将所解读的碱基序列与健康的参考基因组进行比较时，确认到基因的缺失、重复、倒位和/或易位时，预测胎儿具有基因疾病。
＜单细胞分离工序＞
单细胞分离工序中从母血试样分离单细胞。
母血试样只要是从母体(孕妇)采集的血液试样，则并无特别限定，但优选母体的外周血。母体的外周血中除了来源于母体的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞等白细胞、以及无核的成熟的红细胞以外，还包含来源于母体的有核红细胞及来源于胎儿的有核红细胞。来源于胎儿的有核红细胞从妊娠后6周左右就存在于母血中。因此，本发明中，优选检查妊娠后6周左右以后的孕妇的外周血。
单细胞只要是来源于胎儿的单细胞，则并无特别限定，优选来源于胎儿的有核红细胞。来源于胎儿的有核红细胞为通过胎盘存在于母亲的血液中的红细胞前体。母亲妊娠期间，胎儿的红细胞有可能是有核。该红细胞中存在染色体，因此能够通过侵入性较低的方法获得来源于胎儿的染色体及胎儿基因。该来源于胎儿的有核红细胞以母血中的106个细胞中1个左右的比例存在，孕妇的外周血中的存在概率非常小。
(胎儿有核红细胞的浓缩)
国际公开第2012/023298号中记载有包含来源于胎儿的有核红细胞的母体的血球的密度。根据该记载，所设想的来源于胎儿的有核红细胞的密度为1.065～1.095g/mL左右。另一方面，关于母体的血球的密度，红细胞为1.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒细胞为1.090～1.110g/mL左右，中性粒细胞为1.075～1.100g/mL左右，嗜碱性粒细胞为1.070～1.080g/mL左右，淋巴细胞为1.060～1.080g/mL左右，单核细胞为1.060～1.070g/mL左右。
作为分离单细胞时的优选实施方式，能够利用密度梯度离心来浓缩来源于胎儿的有核红细胞。作为该方式中使用的第1介质及第2介质，能够使用通过聚乙烯基吡咯烷酮涂布的直径15～30nm的硅酸胶体粒子分散液即Percoll(GE HEALTHCARE Biosciences Inc.制造)、由蔗糖制作的富含于侧链的中性的亲水性聚合物即Ficoll－Paque(GE HEALTHCAREBIOSCIENCES INC.制造)和/或基于多聚蔗糖与泛影酸钠的溶液即Histopaque(Sigma-Aldrich Co.LLC.制造)等介质。
本发明中，优选使用Percoll及Ficoll－Paque。关于Percoll，市售有密度1.130g/cm3(比重1.130)的产品，通过稀释，能够制备目标密度(比重)的介质。并且，关于Ficoll－Paque，市售有密度1.077g/cm3(比重1.077)的介质及密度1.119g/cm3(比重1.119)的介质，通过混合它们，能够制备目标密度(比重)的介质。通过使用Percoll及Ficoll－Paque，能够制备第1介质及第2介质。
为了分离密度为1.065～1.095g/mL左右的来源于胎儿的有核红细胞与母体中的其他血球成分，设定所层叠的介质的密度。来源于胎儿的有核红细胞的中心密度为1.080g/mL左右，因此若制作夹着该中心密度的2个不同密度的介质(第1介质及第2介质)并相邻重叠，则能够收集在其界面具有所希望的来源于胎儿的有核红细胞的组分。优选将第1介质的密度设定为1.080g/mL以上且1.100g/mL以下，将第2介质的密度设定为1.060g/mL以上且1.080g/mL以下。更优选将第1介质的密度设定为1.080g/mL以上且1.090g/mL以下，将第2介质的密度设定为1.065g/mL以上、1.080g/mL以下。作为具体的一实施方式，优选将第1介质的密度设定为1.085g/mL，并将第2介质的密度设定为1.075g/mL，从所回收的所希望的组分分离血浆成分、嗜酸性粒细胞及单核细胞。并且，通过如此设定，还能够分离红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞的一部分。本发明中，第1介质及第2介质可以是相同种类的介质，也可以是不同种类的介质，但优选为相同种类的介质。
(有核红细胞候选的分离)
为了从母体的血液提取有核红细胞候选，能够在基板上涂布血液并使其干燥，制作涂抹有血球细胞的基板(血球细胞标本)。作为该基板，优选使用透明介质，更优选使用载玻片。
能够根据从血球细胞标本获得的血球细胞的形态信息，分选来源于胎儿的有核红细胞候选。作为优选实施方式，能够利用细胞的核区域的面积相对于细胞质的面积的比例、核的圆形程度和/或核区域的面积等，分选来源于胎儿的有核红细胞候选。尤其，优选将核区域的面积相对于细胞质的面积的比例或核的圆形程度满足条件的细胞分选为来源于胎儿的有核红细胞候选。
作为一例，本发明中，优选分选核区域的面积相对于细胞质的面积的比例“N/C”满足下述式(1)的细胞。
0.25＜N/C＜1.0……(1)
其中，式(1)中，“N”为进行图像分析的细胞的核区域的面积，“C”为进行图像分析的细胞的细胞质的面积。
作为另一例，本发明中，优选分选核区域的面积相对于核的长径长度的平方的比例“N/L2”满足下述式(2)的细胞。
0.65＜N/L2＜0.785……(2)
其中，式(2)中，“N”为进行图像分析的细胞的核区域的面积，“L”为进行图像分析的细胞的核的长径长度即与呈复杂形状的细胞核外切的椭圆的长径长度。
利用细胞的形态信息分选来源于胎儿的有核红细胞候选的***装备有光学显微镜、数码相机、载玻片用载物台、光学传送***、图像处理PC、控制PC及显示器。光学传送***具备物镜及CCD相机。图像处理PC具备进行数据分析及数据存储的处理***。控制PC具备载玻片用载物台的位置控制及控制整个处理的控制***。
包括人类在内的所有脊椎动物的血液中的红细胞中存在的蛋白为血红蛋白。有核红细胞与作为血液中的有核细胞的一种的白细胞的不同点在于，有无血红蛋白。关于血红蛋白，与氧结合时为呈鲜明的红色的氧合血红蛋白，未与氧结合时为呈暗红色的还原血红蛋白，动脉中及静脉中，流着氧结合量不同的血红蛋白。血红蛋白在380nm～650nm中具有吸收，因此能够通过由该波长区域的吸光度的不同引起的至少一个单色光的信息检测血红蛋白。确认血红蛋白的存在时，优选使用单色光，能够选择血红蛋白的吸收较大的400nm～500nm的波长区域的单波长的光或525nm～580nm的波长区域的单色光。关于这些波长区域的吸收系数，通过血红蛋白的存在而示出较高值，因此与白细胞的细胞质的吸收系数的比成为1以上。
作为实施方式，能够将存在接近圆形的细胞核的细胞而且具有血红蛋白的细胞识别为有核红细胞的候选。而且，来源于胎儿的有核红细胞及来源于成人的有核红细胞中，胎儿的血红蛋白为血红蛋白F(HbF)，成人的血红蛋白为血红蛋白A(HbA)，因此能够利用通过不同氧结合能力而产生的分光特性的差异分选来源于胎儿的有核红细胞。
测定细胞质的吸收系数时，能够利用显微分光光度计。显微分光光度计为将与通常的分光光度计相同的原理利用于显微镜的光学***的光度计，能够使用市售的装置。
本发明的优选实施方式中，能够通过显微操纵器从透明基板剥离单细胞来获取细胞。
仅根据细胞的形态信息和/或吸光度，有时无法确定所分离的有核红细胞是来源于胎儿还是来源于母体(孕妇)。但是，本发明中，通过基于SNP和/或STR(ShortTandemRepeat：短串联重复序列)等的多态性分析以及确认Y染色体的存在等DNA分析，能够辨别所分离的有核红细胞的来源。DNA分析如在后述的DNA测序工序的“(胎儿有核红细胞的鉴定)”中说明，能够与基因状态的判定同时进行。
＜基因组DNA提取工序＞
基因组DNA提取工序中，从在上述“＜单细胞分离工序＞”中分离的单细胞提取基因组DNA。
＜PCR扩增工序＞
PCR扩增工序中，将在上述“＜基因组DNA提取工序＞”中提取的基因组DNA作为模板，利用以对目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合，对所述目的区域进行PCR扩增。另外，对于“以对目的区域进行PCR扩增的方式设计的引物组合”的设计方法，在后述的“＜引物及引物组合的设计方法＞”中进行详细说明。
(聚合酶连锁反应)
聚合酶连锁反应使用DNA聚合酶反复复制模板DNA。在使其扩增的DNA碱基序列的开始与结束的部分加以与模板DNA进行杂交的较短的DNA引物，并通过聚合酶开始复制。每次重复进行复制时，模板双链DNA的2条链解离并分别被复制。
多重PCR能够使用通常的PCR中使用的耐热性DNA聚合酶、反应缓冲液，各引物对向模板DNA进行退火的温度不同，因此有时需要研究反应条件。因此，优选使用最适合于多重PCR的耐热性DNA聚合酶、反应缓冲液，本发明中，更优选使用多重PCR检测试剂盒(TAKARABIO INC.制造)进行反应。
关于引物及引物组合的设计方法的详细内容将进行后述，因此在此作为例示，叙述检测13号、18号和/或21号染色体的非整倍性时的概略。
关于目的区域的数量，检测13号、18号和/或21号染色体的非整倍性时，从上述染色体中特异的DNA序列区域，选择根据检查而所需的部位的目标区域，制作用于扩增各目标区域的引物候选的碱基序列，并选拔引物碱基序列之间的互补性较低的区域，由此对于如单细胞那样的微量的基因组DNA，目的区域的扩增性也得到显著改善。
下一代序定器技术虽然获得了飞跃性的进化，但用于序列分析的样品的制备需要非常复杂的工序。关于样品的预处理，在最广泛使用的基因组分析的情况下，在从样品提取核酸之后，需要(1)DNA的片段化、(2)DNA尺寸选择、(3)DNA末端的平滑化处理、(4)向DNA末端附加接头序列、(5)DNA的纯化及(6)DNA的扩增等工艺。
复杂的样品制备工序需要时间及劳力，必需确认工序是否适当进行。并且，各工序中逐渐产生偏差，在用作尤其以高水准要求结果的精度及准确度的医疗现场中的诊断工具时，需要减少该偏差。
为了解决这些问题，本发明中，利用使用后述的特定方法设计的引物来进行多重PCR，由此能够实现为了辨别基因状态而选择的目的区域的更均匀的扩增。而且，通过磁珠对PCR产物进行纯化，由此能够进行更有效的扩增产物的回收。PCR反应溶液中残留有剩余引物、dNTPs(Deoxynucleotides：脱氧核苷酸)及酶等掺杂物，因此有时会成为获得高精度的序列数据时的障碍。但是，通过利用磁珠对PCR扩增产物进行纯化，能够在显著抑制PCR扩增产物的损失的同时进行充分的纯化。此时，优选使用如下方法，即，从单细胞的非常少的DNA，仅通过(1)DNA的扩增及(2)DNA的纯化这样的简单的样品制备工序，也均匀且高精度地扩增各种基因区域，可靠地检测有无胎儿的基因异常。
被扩增的DNA的量的测定例如能够利用测定260nm的波长的吸收度的超微量分光光度计Nano Drop(Thermo Fisher Scientific制造)、利用激光荧光检测法的Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies Japan,Ltd.制造)或通过荧光法对双链DNA进行定量的Quantus荧光计(Promega Corporation制造)等来进行。
＜PCR扩增产物的纯化工序＞
包含PCR扩增产物的反应液中混有酶、核苷酸、盐类及其他杂质，因此优选去除它们。
作为核酸的纯化方法，例如，已知有利用苯酚/氯仿/乙醇的方法、在离液盐的存在下选择性地吸附于硅滤膜等硅载体的方法及利用在PEG(Polyethylene glycol：聚乙二醇)存在下核酸选择性地与通过羧基修饰的磁珠结合的现象的方法等。
作为本发明的优选实施方式，多重PCR扩增产物能够选择利用磁珠的纯化法。
(磁珠纯化工序)
对PCR扩增产物进行利用了作为顺磁珠的磁珠的纯化，由此能够更有效地仅进行目的区域的分析。利用磁珠的纯化方法中，使核酸可逆性地结合于磁珠的粒子表面，用磁铁吸附磁珠，分离已扩增的DNA断片与液体，由此能够有效地去除酶、dNTPs、PCR引物、引物二聚体及盐等掺杂物。利用磁珠的方法与其他纯化方法相比，样品损失较少且掺杂物的去除效率较高。作为其结果，DNA测序工序中，能够有效地仅进行目的区域的分析。
市售有磁珠，例如，能够使用AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter,Inc.制造)、NucleoMag(TAKARA BIO INC.制造)或EpiNext DNA Purification HT System(EPIQENTEKGROUP INC.制造)等。其中，优选利用AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter,Inc.制造)进行纯化。
＜DNA测序工序＞
PCR扩增产物的序列分析中优选利用下一代序定器，尤其MiSeq(Illumina,Inc.制造)。利用下一代序定器“MiSeq”对多个多重PCR产物进行测序时，需要对各多重PCR产物附加由6～8个碱基构成的样品识别序列(索引序列)以及用于与对MiSeq流动池上的寡核苷酸序列杂交的P5序列及P7序列。通过这些序列的附加，能够一次测定最多96种多重PCR产物。
作为对多重PCR产物的两个末端附加索引序列、P5序列及P7序列的方法，能够利用接头连接法(adapter ligation)或PCR法等。
并且，混合多个多重PCR产物来通过MiSeq进行测定时，优选准确地定量各PCR产物。作为PCR产物的定量方法，还能够利用Agilent 2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies Japan,Ltd.制造)或Quantus荧光计(Promega Corporation)，但进一步优选通过定量PCR法测定多重PCR产物的方法。作为本发明中的定量方法，优选利用KAPALibrary Quantification试剂盒(Nippon Genetics Co.,Ltd.制造)进行定量。
作为分析通过MiSeq获得的序列数据的方法，优选利用BWA(Burrows-WheelerAligner；伯罗斯惠勒比对工具：Li,H.、外1名、“Fast and accurate short readalignment with Burrows-Wheeler transform”、Bioinformatics、2009年、第25卷、第14号、p.1754-1760.；Li,H.、外1名、“Fast and accurate long-read alignment withBurrows-Wheeler transform”、Bioinformatics、2010年、第26卷、第5号、p.589-595)，对已知的人类基因组序列映射，作为分析基因异常的方法，优选通过利用SAMtools(Li,Heng、外、“The Sequence Alignment/Map format and SAMtools”、Bioinformatics、2009年、第25卷、第16号、p.2078-2079；SAM来源于“Sequence Alignment/Map”。)和/或BEDtools(Quinlan,A.R.、外1名、“BEDTools：a flexible suite of utilities forcomparinggenomic features”、Bioinformatics、2010年、第26卷、第6号、p.841-842)，分析基因的变异或染色体数量的定量。
(序列读段数的确定)
DNA测序工序中，优选还测定序列读段数。
例如，对鉴定胎儿有核红细胞的细胞，并对目标区域进行PCR扩增来获得的DNA断片，能够通过序定器求出具有预先确定的140bp以上且180bp以下的区域的序列的扩增产物的扩增量(序列读段数)。作为基准(或者参考)，通过序定器求出鉴定为来源于母亲的有核红细胞的细胞的细胞中，具有预先确定的140bp以上且180bp以下的区域的序列的扩增产物的扩增量(序列读段数)。若胎儿为正常状态，则预测来源于胎儿的扩增产物的扩增量(序列读段数)与来源于母亲的扩增产物的扩增量(序列读段数)大致成为1:1的量比。胎儿具有作为来源于已扩增的染色体的三体性的疾病时，预测其比成为1:1.5(或2:3)。
本发明中，求出多个预先从多名妊娠母体采集的、来源于胎儿的PCR扩增产物的量(序列读段数)相对于妊娠有正常胎儿时的来源于母亲的PCR扩增产物的量(序列读段数)的比，并求出其分布。并且，求出多个来源于胎儿的扩增产物的量(序列读段数)相对于妊娠有三体性胎儿时的来源于母亲的扩增产物的量(序列读段数)的比，并求出其分布。还能够在该2个分布不重叠的区域设定截止值。还能够如下解释检查结果，即，对该预先确定的截止值与求出扩增产物的比的结果进行比较，若该比为截止值以下，则胎儿为正常，若为截止值以上，则为三体性。
无法获得结果时，可返回到从母血试样分离单细胞的单细胞分离工序，再次实施本发明的方法。
(确认所分离的有核红细胞细胞是否来源于胎儿)
可确认所分离的有核红细胞细胞是否来源于胎儿，由此确定已进行来源于胎儿的单细胞的基因状态的判定。
已知从妊娠母体采集的外周血的有核红细胞中，混有来源于母亲的有核红细胞与来源于胎儿的有核红细胞，本发明的方法能够在判定胎儿的基因状态的同时鉴定来源于胎儿的有核红细胞。作为识别基因序列的个人差异的方法，通常通过检测等位基因中存在的基因多态性的方法进行。作为一例，父子辨别中，作为基因多态性的一种，还能够使用STR。并且，作为识别个人差异的方法，还能够使用基因组碱基序列中的一个碱基变异，以1％以上的频率被观察的SNPs。本发明中，还能够利用下一代序定器，通过有核红细胞中有无具有不同STR或SNPs的细胞，识别胎儿细胞与母亲细胞。并且，另外使用辅助判定基因状态的信息来判定是否为来源于胎儿的有核红细胞时，例如，能够通过获取来源于母亲的白细胞，并同样地分析STR或SNPs来进行。
并且，若在采集有核红细胞之前已通过超声波检查确认到胎儿为男婴时，能够通过检测所采集的有核红细胞有无Y染色体来判定有核红细胞是否来源于胎儿。通常，作为检测所采集的细胞有无Y染色体的方法，已知有利用Y染色体特性荧光探测器的FISH(Fluorescent in situ hybridization：荧光原位杂交)法。作为一例，使用CEP X/Y DNAprobe试剂盒(ABBOTT公司制造)。本发明中，优选制作在Y染色体具有特性碱基序列的引物并利用PCR来确认其有无扩增，由此鉴定其为来源于男婴胎儿的有核红细胞。
＜引物及引物组合的设计方法＞
总的来说，作为本发明的特征点之一的引物及引物组合的设计方法中，选择多个特定目标区域，检索附近的碱基序列，确认与已提取的各个引物组合的互补性，选择互补性较少的碱基序列，由此获得扩增对象中包含目标区域且不会相互互补的引物组。引物序列的互补性的确认的特征点在于，以如下方式制作引物组，即，利用局部比对降低整个序列的互补性，且对引物序列的端部，利用全局比对来降低互补性。以下进行详细说明。
本发明中的引物及引物组合的设计方法的第1方式具备以下工序。
具备：
(a)目标区域选择工序，从目的区域选择工序中选择的用于判定基因状态的目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域；
(b)引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述目标区域的引物候选的碱基序列；
(c)局部比对工序，对于上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，由此求出局部比对评分；
(d)第1阶段选拔工序，根据在上述(c)局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
(e)全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
(f)第2阶段选拔工序，根据在上述(e)全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
(g)引物采用工序，采用在上述(d)第1阶段选拔工序及上述(f)第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列，
其中，上述(c)局部比对工序及上述(d)第1阶段选拔工序这两个工序在上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
对本发明的引物及引物组合的设计方法的第1方式的各工序进行详细说明。
(a)目标区域选择工序
图1的框图中示为“(第1)目标区域选择工序”。
目标区域选择工序为从在目的区域选择工序中从人类基因组上的区域选择的用于判定胎儿的基因状态的目的区域，选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域的工序。
(目标区域)
目标区域为从上述目的区域作为设计供聚合酶连锁反应的引物组合的对象而被选择的区域。
(聚合酶连锁反应)
本发明中，聚合酶连锁反应(PCR)为利用DNA聚合酶，从模板DNA合成DNA的反应。与细胞内的DNA合成不同，PCR中，为了合成DNA，需要1种以上的被称作引物的寡核苷酸，通常需要2种以上。有时将在1个PCR反应***中同时使用的引物的组合称作引物组合。
PCR能够轻松地从利用1对引物组合扩增1个区域的简单的***扩展至利用多对引物组合同时扩增多个区域的复杂的***(多重PCR)。
PCR的优点在于，能够从如人类的基因组(30亿碱基对)那样的非常庞大的DNA分子中选择性地仅扩增所希望的区域。而且，能够使用极微量的基因组DNA作为模板来获得充分量的所希望的区域的扩增产物。
并且，作为PCR的优点，虽然根据程序而有所不同，但可举出扩增所需的时间大致为2小时左右，较短这一点。
而且，作为PCR的优点，还可举出工艺简单且能够以全自动的桌面设备进行扩增这一点。
(b)引物候选碱基序列制作工序
图1的框图中示为“(第1)引物候选碱基序列制作工序”。
引物候选碱基序列制作工序为根据基因组上的目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增目标区域的引物候选的碱基序列的工序。
目标区域的附近区域是从目标区域的5’端靠外侧的区域及从目标区域的3’端靠外侧的区域的总称。目标区域的内侧不包含在附近区域中。
附近区域的长度并无特别限定，但优选为能够通过PCR扩展的长度以下，更优选为希望扩增的DNA片段长度的上限以下。尤其，优选为易实施集中选择和/或序列读段的长度。可根据PCR中使用的酶(DNA聚合酶)的种类等适当变更。具体的附近区域的长度优选为20～500个碱基左右，更优选为20～300个碱基左右，进一步优选为20～200个碱基左右，更进一步优选为50～200个碱基左右。
并且，制作引物候选的碱基序列时，与在通常的引物的设计方法中注意的方面相同，如引物的长度、GC含量(指所有核酸碱基中的鸟嘌呤(G)及胞嘧啶(C)的合计摩尔百分比。)、Tm值(是双链DNA的50％解离而成为单链DNA的温度。Tm来源于meltingtemperature。)及序列的偏移等。
引物的长度(核苷酸数量)并无特别限定，但优选为15mer～45mer，更优选为20mer～45mer，进一步优选为20mer～30mer。若引物的长度在该范围内，则易设计特性及扩增效率优异的引物。
GC含量并无特别限定，但优选为40摩尔％～60摩尔％，更优选为45摩尔％～55摩尔％。若GC含量在该范围内，则不易产生由高级结构引起的特性及扩增效率的下降的问题。
Tm值并无特别限定，但优选在50℃～65℃的范围内，更优选在55℃～65℃的范围内。
Tm值能够利用OLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights公司制造)或Primer3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等软件计算。
并且，还能够由引物的碱基序列中的A、T、G及C的数量(分别设为nA、nT、nG及nC)，根据下述式通过计算来求出。
Tm值(℃)＝2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm值的计算方法并不限定于此，能够通过以往公知的各种方法计算Tm值。
引物候选的碱基序列优选设为整体上碱基无偏移的序列。例如，优选避免局部富GC的序列及局部富AT的序列。
并且，优选还避免T和/或C的连续(聚嘧啶)以及A和/或G的连续(聚嘌呤)。
而且，优选3’末端碱基序列避免富GC的序列或富AT的序列。优选3’末端碱基为G或C，但并不限定于此。
(特性检查工序)
可根据需要，实施特性检查工序，其根据在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的各引物候选的碱基序列相对于各基因组DNA的序列互补性，评价引物候选的碱基序列的特性。
特性的检查中，进行基因组DNA的碱基序列与引物候选的碱基序列的局部比对，局部比对评分小于预先设定的值时，能够评价为该引物候选的碱基序列相对于基因组DNA的互补性较低，特性较高。其中，优选对基因组DNA的互补链也进行局部比对。这是因为引物为单链DNA，而基因组DNA为双链。并且，可代替引物候选的碱基序列，利用与此互补的碱基序列。能够认为互补性是相对于互补链的同源性。
并且，也可将引物候选的碱基序列作为查询序列，对基因组DNA碱基序列数据库进行同源性搜索。作为同源性搜索工具，例如可举出BLAST(Basic Local Alignment SearchTool：基本局部比对搜索工具)(Altschul,S.A.、外4名、“Basic Local Alignment SearchTool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215卷、p.403-410)及FASTA(Pearson,W.R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、美国科学院纪要、美国科学院、1988年、4月、第85卷、p.2444-2448)等。作为进行同源性搜索而得的结果，能够获得局部比对。
评分***及局部比对评分的阈值均无特别限定，能够根据引物候选的碱基序列的长度和/或PCR条件等适当设定。使用同源性搜索工具时，可使用该同源性搜索工具的默认值。
例如，可考虑作为评分***，采用互补碱基(匹配)＝+1、非互补碱基(不匹配)＝-1、***和/或缺失(间隙罚分)＝-3，将阈值设定为+15。
引物候选的碱基序列与基因组DNA上的预想外的位置的碱基序列具有互补性，且特性较低的情况下，利用该碱基序列的引物进行PCR时，有时扩增伪影而非目标区域，因此排除。
(c)局部比对工序
图1的框图中示为“(第1)局部比对工序”。
局部比对工序为如下工序：对包含从在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增目标区域的引物候选的碱基序列提取的2个碱基序列的所有对，在所比较的一部分序列包含所述碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分。
进行局部比对的碱基序列的对的组合可以是允许重复而选择的组合，也可以是不允许重复而选择的组合，但还未评价同一碱基序列的引物之间的引物二聚体形成性时，优选为允许重复而选择的组合。
关于组合的总数量，将在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的碱基序列的数量设为m个，允许重复而选择时，为“mH2＝m+1C2＝(m+1)！/2(m-1)！”，不允许重复而选择时，为“mC2＝m(m-1)/2”。
另外，先进行后述的(e)全局比对工序及(f)第2阶段选拔工序这两个工序时，可对在(f)第2阶段选拔工序中选拔的引物候选进行本工序及后述的(d)第1阶段选拔工序。
局部比对为对一部分序列进行的比对，能够局部性地检查互补性较高的部分。
但是，本发明中，与通常对碱基序列进行的局部比对不同，在“所比较的一部分序列包含碱基序列的3’末端”这样的条件下，进行局部比对，以使所比较的一部分序列包含双方的碱基序列的3’末端。而且，本发明中优选如下方式：在“所比较的一部分序列包含碱基序列的3’末端”这样的条件即“仅考虑所比较的一部分序列从其中一个序列的3’末端开始并在另一个序列的3’末端结束的比对”这样的条件下，进行局部比对，以使所比较的一部分序列包含双方的碱基序列的3’末端。
另外，局部比对可***间隙。间隙表示碱基的***和/或缺失(indel)。
并且，局部比对中，将在碱基序列对之间碱基为互补性的情况作为一致(匹配)，将非互补性的情况作为不一致(不匹配)。
比对以对匹配、不匹配及***和/或缺失分别赋予评分，并使合计评分成为最大的方式进行。评分适当设定即可。例如，可如下述表1那样设定评分***。另外，表1中“-”表示间隙(***和/或缺失(indel))。
[表1]
表1
例如，考虑对以下的表2所示的序列编号1及2的碱基序列进行局部比对。其中，评分***如表1所示。
[表2]
表2
根据序列编号1及2的碱基序列制作表3所示的点阵(Dot matrix)。具体而言，将序列编号1的碱基序列从左至右以从5’至3’的方向排列，将序列编号2的碱基序列从下至上以从5’至3’的方向排列，对碱基为互补性的栅格记入“·”，由此获得表3所示的点阵。
[表3]
表3
根据从表3所示的点阵获得以下的表4所示的一部分序列的比对(双序列比对)(参考表3的斜线部分)。
[表4]
表4
由于匹配(+1)×9、不匹配(-1)×9、***和/或缺失(-3)×0，因此局部比对评分为“±0”。
另外，比对(双序列比对)并不仅限于在此例示的点阵法，能够通过动态规划法、词法或其他各种方法获得。
(d)第1阶段选拔工序
在图1的框图中示为“(第一)第1阶段选拔工序”。
第1阶段选拔工序为根据在上述(c)局部比对工序中求出的局部比对评分，进行在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔的工序。
预先设定局部比对评分的阈值(第1阈值)。
若局部比对评分小于第1阈值，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较低，进行之后的工序。另一方面，若局部比对评分为第1阈值以上，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较高，对该对不进行之后的工序。
第1阈值并无特别限定，能够适当设定。例如，可根据成为聚合酶连锁反应的模板的基因组DNA的量等PCR条件设定第1阈值。
在此，考虑在上述(c)局部比对工序中示出的例子中将第1阈值设定为“3”的情况。
上面的例子中，局部比对评分为“±0”，小于作为第1阈值的“3”，因此能够判断序列编号1及2的碱基序列的对的二聚体形成性较低。
另外，对在上述(c)局部比对工序中计算出评分的所有对进行本工序。
(e)全局比对工序
在图1的框图中示为“(第1)全局比对工序”。
全局比对工序为如下工序，即，对包含从在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增目标区域的引物候选的碱基序列中提取的2个碱基序列的所有对，对包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分。
进行全局比对的碱基序列的对的组合可以是允许重复而选择的组合，也可以是不允许重复而选择的组合，但还未评价在同一碱基序列的引物之间的引物二聚体形成性时，优选为允许重复而选择的组合。
关于组合的总数量，将在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的碱基序列的数量设为m个，允许重复而选择时，为“mH2＝m+1C2＝(m+1)！/2(m-1)！”，不允许重复而选择时，为“mC2＝m(m-1)/2”。
另外，先进行上述的(c)局部比对工序及(d)第1阶段选拔工序这两个工序时，可对在(d)第1阶段选拔工序中选拔的引物候选进行本工序及后述的(f)第2阶段选拔工序。
全局比对为对“整个序列”进行的比对，能够检查整个序列的互补性。
但是，在此，“整个序列”为包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的整个碱基序列。
另外，全局比对可***间隙。间隙表示碱基的***和/或缺失(indel)。
并且，全局比对中，将在碱基序列对之间碱基为互补性的情况作为一致(匹配)，将非互补性的情况作为不一致(不匹配)。
比对以对匹配、不匹配及***和/或缺失分别赋予评分，并使合计评分成为最大的方式进行。评分适当设定即可。例如，可如上述表1那样设定评分***。另外，表1中，“-”表示间隙(***和/或缺失(indel))。
例如，考虑对以下的表5所示的序列编号1及2的碱基序列，对各3’末端的3碱基(大写字母部分。相当于“包含3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列”。)进行全局比对。其中，评分***如表1所示。
[表5]
表5
若以评分成为最大的方式，对序列编号1的碱基序列的3’末端的3个碱基(大写字母部位)及序列编号2的3’末端的3个碱基(大写字母部位)的碱基序列进行全局比对，则能够获得以下的表6所示的比对(双序列比对)。
[表6]
表6
由于匹配(+1)×0、不匹配(-1)×3、***和/或缺失(-3)×0，因此全局比对评分为“-3”。
另外，比对(双序列比对)能够通过点阵法、动态规划法、词法或其他各种方法获得。
(f)第2阶段选拔工序
图1的框图中示为“(第一)第2阶段选拔工序”。
第2阶段选拔工序为根据在上述(e)全局比对工序中求出的全局比对评分，进行在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔的工序。
预先设定全局比对评分的阈值(第2阈值)。
若全局比对评分小于第2阈值，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较低，进行之后的工序。另一方面，若全局比对评分为第2阈值以上，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较高，对该对不进行之后的工序。
第2阈值并无特别限定，能够适当设定。例如，可根据成为聚合酶连锁反应的模板的基因组DNA的量等PCR条件设定第2阈值。
另外，能够通过将引物的3’末端至数个碱基的碱基序列设为同一碱基序列，将对包含各引物的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对来求出的全局比对评分设为小于第2阈值。
在此，考虑在上述(e)全局比对工序中示出的例子中将第2阈值设定为“3”的情况。
上面的例子中，全局比对评分为“-3”，小于作为第2阈值的“3”，因此能够判断为序列编号1及2的碱基序列的对的二聚体形成性较低。
另外，对在上述(e)全局比对工序中计算出评分的所有对进行本工序。
上述(c)局部比对工序及上述(d)第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后实施，或与上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
并且，为了减少计算量，优选先实施上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序，对通过上述(f)第2阶段选拔工序的组合实施上述(c)局部比对工序及上述(d)第1阶段选拔工序这两个工序。尤其，目标区域的数量越增加，引物候选的碱基序列数量越增加，减少计算量的效果越大，能够实现整个处理的快速化。
这是因为，在上述(e)全局比对工序中对“预先设定的序列长度”这样的较短长度的碱基序列进行全局比对，因此计算量少于在包含3’末端这样的条件下从整个碱基序列发现互补性较高的一部分序列的局部比对评分，能够快速进行处理。另外，通常已知的算法中，已知若为针对相同长度的序列的比对，则全局比对的速度比局部比对快。
(扩增序列长度检查工序)
可根据需要，实施扩增序列长度检查工序，其对在上述(d)第1阶段选拔工序及上述(f)第2阶段选拔工序中判断为引物二聚体形成性较低的引物候选的碱基序列的对，计算基因组DNA或染色体DNA上的引物候选的碱基序列的端部之间的距离，并判断该距离是否在预先设定的范围内。
若碱基序列的端部之间的距离在预先设定的范围内，则能够判断为该引物候选的碱基序列的对能够适当扩增目标区域的可能性较高。引物候选的碱基序列的端部之间的距离并无特别限定，能够根据酶(DNA聚合酶)的种类等PCR条件适当设定。例如，能够设定为100～200个碱基(对)的范围内、120～180个碱基(对)的范围内、140～180个碱基(对)的范围内、140～160个碱基(对)的范围内、160～180个碱基(对)的范围内等各种范围。
(g)引物采用工序
图1的框图中示为“(第1)引物采用工序”。
引物采用工序为采用在上述(d)第1阶段选拔工序及上述(f)第2阶段选拔工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列的工序。
即，本工序中，采用如下引物候选的碱基序列作为用于扩增目标区域的引物的碱基序列，即，对各引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含该碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对来求出的局部比对评分小于第1阈值，且对包含各引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对来求出的全局比对评分小于第2阈值。
例如，考虑采用表7所示的序列编号1及2的碱基序列作为用于扩增目标区域的引物的碱基序列。
[表7]
表7
如已记载，局部比对评分为“±0”，小于作为第1阈值的“3”。并且，全局比对评分为“-3”，小于作为第2阈值的“3”。
因此，能够采用以序列编号1表示的引物候选的碱基序列及以序列编号2表示的引物候选的碱基序列作为用于扩增目标区域的引物的碱基序列。
本发明的引物及引物组合的设计方法的第2方式具备以下工序。
(a1)第1目标区域选择工序，从目的区域选择工序中选择的用于判定基因状态的目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第1目标区域；
(b1)第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第1目标区域的引物候选的碱基序列；
(c1)第1局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
(d1)第一第1阶段选拔工序，根据在上述(c1)第1局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
(e1)第1全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
(f1)第一第2阶段选拔工序，根据在上述(e1)第1全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；
(g1)第1引物采用工序，采用在上述(d1)第一第1阶段选拔工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第1目标区域的引物的碱基序列，
且还具备：
(an)第n目标区域选择工序，从在目的区域选择工序中选择的用于判定基因状态的目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第n目标区域；
(bn)第n引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第n目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列；
(cn)第n局部比对工序，对用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列及上述已采用的引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
(dn)第n第1阶段选拔工序，根据在上述(cn)第n局部比对工序中求出的局部比对评分，进行用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
(en)第n全局比对工序，对包含用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
(fn)第n第2阶段选拔工序，根据在上述(en)第n全局比对工序中求出的全局比对评分，进行用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
(gn)第n引物采用工序，采用在上述(dn)第n第1阶段选拔工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第n目标区域的引物的碱基序列。
其中，n为2以上的整数，直至n达到在目的区域选择工序中选择的目的区域的数量，对所有目标区域，反复进行上述(an)第n目标区域选择工序至上述(gn)第n引物采用工序的各工序，直至采用用于扩增其目标区域的引物的碱基序列。
其中，上述(c1)第1局部比对工序及上述(d1)第一第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，且上述(cn)第n局部比对工序及上述(dn)第n第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
对本发明的引物及引物组合的设计方法的第2方式的各工序进行详细说明。
(a1)第1目标区域选择工序
图1的框图中示为“(第1)目标区域选择工序”。
将目的区域中的1个选作第1目标区域，除此以外，与第1方式的“(a)目标区域选择工序”相同。
(b1)第1引物候选碱基序列制作工序
图1的框图中示为“(第1)引物候选碱基序列制作工序”。
制作用于扩增在上述(a1)第1目标区域选择工序中选择的第1目标区域的引物候选的碱基序列，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(b)引物候选碱基序列制作工序”相同。
(特性检查工序)
与本发明的设计方法的第1方式的“特性检查工序”相同。本工序为任意工序，可实施，也可不实施。
(c1)第1局部比对工序
图1的框图中示为“(第1)局部比对工序”。
对在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列进行局部比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(c)局部比对工序”相同。
(d1)第一第1阶段选拔工序
图1的框图中示为“(第一)第1阶段选拔工序”。
根据在上述(c1)第1局部比对工序中求出的局部比对评分，以在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(d)第1阶段选拔工序”相同。
(e1)第1全局比对工序
图1的框图中示为“(第1)全局比对工序”。
对在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列进行全局比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式“(e)全局比对工序”相同。
(f1)第一第2阶段选拔工序
图1的框图中示为“(第一)第2阶段选拔工序”。
根据在上述(e1)第1全局比对工序中求出的全局比对评分，以在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(f)第2阶段选拔工序”相同。
与本发明的设计方法的第1方式相同，上述(c1)第1局部比对工序及上述(d1)第一第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或之后实施，也可与上述(e1)第1全局比对工序及(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序同时实施。
并且，为了减少计算量，优选先实施上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序，对通过上述(f1)第一第2阶段选拔工序的组合，实施上述(c1)第1局部比对工序及上述(d1)第一第1阶段选拔工序这两个工序。尤其，目标区域的数量越增加，引物候选的碱基序列数量越增加，减少计算量的效果越大，能够实现整个处理的快速化。
(扩增序列长度检查工序)
与第1方式中的“扩增序列长度检查工序”相同。本工序为任意工序，可实施，也可不实施。
(g1)第1引物采用工序
图1的框图中示为“(第1)引物采用工序”。
从在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列中进行采用，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(g)引物采用工序”相同。
本发明的第2方式中，在设计用于扩增第1目标区域的引物之后，设计用于扩增第n(n为2以上的整数)目标区域的引物。
(an)第n目标区域选择工序
图1的框图中示为“第n目标区域选择工序”。
从目的区域中直到第(n-1)目标区域选择工序还未被选择的区域选择1个目的区域作为第n目标区域，除此以外与前述的第1方式的“(a)目标区域选择工序”相同。
另外，第n目标区域的选择能够与第(n-1)的目标区域的选择同时进行或在之后进行。其中，n为2以上的整数。
(bn)第n引物候选碱基序列制作工序
图1的框图中示为“第n引物候选碱基序列制作工序”。
制作用于扩增在上述(an)第n目标区域选择工序中选择的第n目标区域的引物候选的碱基序列，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(b)引物候选碱基序列制作工序”相同。
(特性检查工序)
与本发明的设计方法的第1方式的“特性检查工序”相同。本工序为任意工序，可实施，也可不实施。
(cn)第n局部比对工序
图1的框图中示为“第n局部比对工序”。
对在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列进行局部比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(c)局部比对工序”相同。
其中，已采用的引物的碱基序列为作为用于扩增第1目标区域至第(n-1)目标区域的各目标区域的引物的碱基序列而采用的所有碱基序列(以下相同)。
(dn)第n第1阶段选拔工序
图1的框图中示为“第n第1阶段选拔工序”。
根据在上述(cn)第n局部比对工序中求出的局部比对评分，以在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(d)第1阶段选拔工序”相同。
(en)第n全局比对工序
图1的框图中示为“第n全局比对工序”。
对在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列进行全局比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(e)全局比对工序”相同。
(fn)第n第2阶段选拔工序
图1的框图中示为“第n第2阶段选拔工序”。
根据在上述(en)第n全局比对工序中求出的全局比对评分，以在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(f)第2阶段选拔工序”相同。
另外，与本发明的设计方法的第1方式相同，上述(cn)第n局部比对工序及上述(dn)第n第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序之前或之后实施，也可与上述(en)第n全局比对工序及(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
并且，为了减少计算量，优选先实施上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序，对通过上述(fn)第n第2阶段选拔工序的组合实施上述(cn)第n局部比对工序及上述(dn)第n第1阶段选拔工序这两个工序。尤其，目标区域的数量越增加，引物候选的碱基序列数量越增加，减少计算量的效果越大，能够实现整个处理的快速化。
(扩增序列长度检查工序)
与本发明的设计方法的第1方式的“扩增序列长度检查工序”相同。本工序为任意的工序，可实施，也可不实施。
(gn)第n引物采用工序
图1的框图中示为“第n引物采用工序”。
从在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列中进行采用，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(g)引物采用工序”相同。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
[实施例1]
<目的区域选择>
将13号染色体、18号染色体、21号染色体及X染色体上的SNP示于表8，将Y染色体上的特性区域示于表9。
[表8]
表8
SNP ID 染色体 位置 烯丙基
rs7981616 13 chr13：25265103 A/G
rs1408184 13 chr13：46946157 C/T
rs1801244 13 chr13：52544805 C/G
rs2296984 13 chr13：99457431 T/G
rs946837 13 chr13：101287340 C/G，T
rs2230233 18 chr18：29104698 C/T
rs7233515 18 chr18：44585955 G/A，T
rs4940019 18 chr18：48333203 C/G
rs3809971 18 chr18：56204977 C/T
rs3744877 18 chr18：77894844 G/A
rs2073370 21 chr21：35260481 T/C
rs1041439 21 chr21：40571246 A/G
rs3746887 21 chr21：41032740 T/C
rs220312 21 chr21：43519032 G/A
rs4148973 21 chr21：44323590 T/G
rs2379206 X chrX：6995315 C/T
rs5934730 X chrX：9935526 G/T
rs2071311 X chrX：30261002 A/G
rs1801187 X chrX：32380996 C/T
rs2293948 X chrX：48418126 A/G
[表9]
表9
染色体 开始位置 结束位置
Y 3609387 3609547
Y 7697094 7697262
Y 6792987 6793128
Y 14640461 14640619
Y 22902850 22903029
＜单细胞分离＞
(获取外周血液试样)
在7mL采血管中，作为抗凝血剂，添加10.5mg的EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid：乙二胺四乙酸)的钠盐之后，在进行知情同意之后，从孕妇志愿者，作为志愿者血，在采血管内获得了外周血7mL。之后，利用生理盐水稀释血液。
(有核红细胞的浓缩)
使用Percoll液(GE HEALTHCARE BIOSCIENCES INC.制造)，制备密度1.070(g/cm3)的液及密度1.095(g/cm3)的液，对离心管，向离心管的底部添加密度1.095的液2mL，并在冰箱中在4℃下冷却了30分钟。
之后，从冰箱取出离心管，在密度1.095(g/cm3)的液上，以不干扰界面的方式缓慢地叠置了密度1.070(g/cm3)的液2mL。
之后，在密度1.070(g/cm3)的介质上，向离心管缓慢添加在上述中采集的血液的稀释液11mL。
之后，以2000rpm进行了20分钟的离心分离。
取出离心管，利用吸液管采集沉积在密度1.070(g/cm3)与密度1.095(g/cm3)的液之间的组分。
对如此采集的血液的组分，用一只手保持载玻片基板1，在其一端点加1滴所采集的血液的组分。用另一只手拿另一载玻片基板2，使载玻片基板2的一端以30°的角度与载玻片基板1接触，使载玻片基板2的接触的面与血液的组分接触，由此通过毛细管现象，血液在被2张玻璃包围的空间扩散。
接着，在保持角度的状态下，使载玻片基板2向载玻片基板1的放置有血液的区域的相反区域的方向滑动，从而在载玻片基板1上均匀地涂布了血液。涂布结束之后，通过送风1小时以上来使其充分干燥。将该玻璃基板在迈格林华染色液中浸渍3分钟，并浸渍于磷酸缓冲液中清洗之后，在用磷酸缓冲液稀释而作成浓度3％的姬姆萨染色液中浸渍10分钟。
之后，用纯水清洗并使其干燥，由此制作了已染色的多张玻璃基板。
(根据细胞的形态信息识别有核红细胞)
为了从涂布于载玻片基板上的细胞分选有核红细胞候选，准备了以下：电动XY载物台；具备物镜、CCD相机的光学显微镜的测定***；具备XY载物台控制部、Z方向控制部的控制部；具备图像输入部与图像处理部及XY位置记录部的控制单元部。将如上述那样准备的、涂布于载玻片基板上的血液细胞搭载于XY载物台，对焦于载玻片上并进行扫描，读入通过光学显微镜获得的图像，通过图像分析搜索作为目标细胞的有核红细胞。
图像分析中，检测满足以下2个条件的细胞，并记录XY位置。
0.25＜N/C＜1.0……(1)
0.65＜N/L2＜0.785……(2)
其中，“N”为进行图像分析的细胞的核区域的面积，“C”为进行图像分析的细胞的细胞质的面积，“L”为进行图像分析的细胞的核的长径长度。另外，细胞的核的长径长度定义为与呈复杂的形状的细胞核外切的椭圆形的长径的长度。
从存在于载玻片基板上有核红的细胞选择满足上述式(1)及(2)的有核红细胞来作为下一工序的有核红细胞候选。
(胎儿有核红细胞的分选)
对在根据细胞的形态信息识别有核红细胞的工序中识别的有核红细胞的候选，利用显微分光装置进行了分光信息的分析。
确定载玻片基板上的有核红细胞候选，对其中1个细胞照射415nm附近的单色光，测定该细胞的吸收系数。
接着，对位于该细胞的附近的核的形状不满足上述(2)式的白细胞，从最靠近有核红细胞的候选的细胞选择3个，以相同方式，对每一个白细胞，计算吸收系数，并计算出了平均的吸收系数2。
对载玻片基板上的有核红细胞候选的剩余细胞，也以与上述相同的方法，测定吸收系数，对各细胞附近的3个白细胞，计算出了吸收系数的平均值。从这些结果，提取了有核红细胞候选的吸收系数相对于白细胞的平均吸收系数的比成为1以上的细胞，其结果，明确检测出8个1以上的细胞。
(细胞回收)
使用显微操纵器回收了如上述那样确定的8个细胞。
＜基因组DNA提取＞
对所采集的单细胞，利用Single Cell WGA试剂盒(New England Biolabs JapanInc.制造)进行了细胞溶解。具体而言，根据试剂盒附带的说明书的“Sample PreparationMethods”及“Pre-Amplification Protocol”的记载，将各单细胞混合于5μL的Cellextraction buffer之后，混合4.8μL的Extraction Enzyme Dilution Buffer及0.2μL的CellExtraction Enzyme来将总液量设为10μL，在75℃下进行10分钟的恒温培养之后，进一步在95℃下进行4分钟的恒温培养。
由此制备了基因组DNA。
＜供聚合酶连锁反应的引物组合的设计＞
(引物的制作)
为了分析胎儿细胞的来源及染色体的数量异常，从13号染色体、18号染色体、21号染色体、X染色体及Y染色体上的区域选择了25处目标区域。对各目标区域，以序列长度为20bp，Tm值在56～64℃的范围内，且PCR扩增产物的尺寸为140～180个碱基对的范围内的方式，设计用于扩增该目标区域的引物组合，从这些引物组合中，选出25组各引物之间的3’末端固定的局部比对评分小于3且各引物的3’末端3个碱基的全局比对评分成为0的引物组合(表10)。
[表10]
表10
(基于单重PCR的扩增的确认)
为了确认所制作的各引物组合能够扩增目标区域，通过单重PCR进行了扩增的确认。
具体而言，混合2μL的所制备的基因组DNA(0.5ng/μL)、2μL的引物混合物、12.5μL的多重PCR混合物2、0.125μL的多重PCR混合物1及适量的水，制备了最终液量25μL的反应溶液。另外，上述引物混合物为将构成1个引物组合的各引物以其引物的最终浓度成为50nM的方式混合的混合物，上述多重PCR混合物1及上述多重PCR混合物2为多重PCR检测试剂盒(TAKARA BIO INC.制造)中包含的试剂。
利用所制备的反应溶液，在94℃下进行60秒的初始热变性之后，将在94℃下进行30秒的热变性、在60℃下进行90秒的退火及在72℃下进行30秒的延伸反应的热循环反复进行30个循环，由此进行了单重PCR。
将已进行单重PCR的反应溶液的一部分施加于琼脂糖凝胶电泳，确认了有无扩增。
＜基于聚合酶连锁反应的扩增＞
利用已确认到基于单重PCR的扩增的25种引物组合进行了多重PCR。
具体而言，混合2μL的所制备的基因组DNA(0.5ng/μL)、2μL的25组引物混合物、12.5μL的多重PCR混合物2、0.125μL的多重PCR混合物1及适量的水，制备了最终液量为25μL的反应溶液。另外，上述25组引物混合物为将构成已确认到基于单重PCR的扩增的25种引物组合的各引物以其最终浓度成为50nM的方式混合的混合物，上述多重PCR混合物1及上述多重PCR混合物2为多重PCR检测试剂盒(TAKARA BIO INC.制造)中包含的试剂。
利用所制备的反应溶液，在94℃下进行60秒的初始热变性之后，将在94℃下进行30秒的热变性、在60℃下进行90秒的退火及在72℃下进行30秒的延伸反应的热循环反复进行30个循环，由此进行了多重PCR。
(PCR产物的纯化)
利用AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter,Inc.制造)，对所获得的多重PCR产物进行了纯化。向25μL的反应溶液添加45μL的AMPure XP，使PCR反应产物结合于磁珠。利用Magna Stand(Nippon Genetics Co.,Ltd.制造)的磁力分离磁珠，去除了掺杂物。用70％乙醇清洗之后，通过TE(Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane)-EDTA：三－乙二胺四乙酸)缓冲液溶出了结合于磁珠的核酸。
(索引序列及流动池结合用序列的附加)
为了利用MiSeq(Illumina,Inc.制造)进行测序，将样品识别用索引序列以及流动池结合用P5序列及P7序列附加于多重PCR产物的两个末端。作为引物，使用各1.25μM的P5_F(D501)及P7_R(D701～D705)(示于表11。)，混合多重PCR产物、多重PCR混合物1、多重PCR混合物2及水来制备反应溶液，在94℃下进行3分钟的初始热变性之后，将在94℃下进行30秒的热变性、在50℃下进行60秒的退火及在72℃下进行30秒的延伸反应的热循环进行5个循环，进一步将在94℃下进行45秒的热变性、在55℃下进行60秒的退火及在72℃下进行30秒的延伸反应的热循环进行11个循环。另外，上述多重PCR混合物1及上述多重PCR混合物2为多重PCR检测试剂盒(TAKARA BIO INC.制造)中包含的试剂。
[表11]
表11
利用AMPure XP试剂盒对所获得的PCR产物进行纯化，作为准确的扩增产物的定量，利用KAPA Library Quantification试剂盒S(Nippon Genetics Co.,Ltd.制造)进行了定量。
＜DNA测序＞
利用MiSeq Reagent试剂盒v2 300 Cycle(Illumina,Inc.制造)，对来源于单细胞的多重PCR产物进行测序，利用BWA(Burrows-Wheeler Aligner：伯罗斯惠勒比对工具)，对人类基因组序列(hg19)映射所获得的FastQ文件，通过SAMtools提取基因多态性信息，根据BEDtools计算各检测区域的序列读段数，由此进行了分析。
(所分离的有核红细胞细胞是否来源于胎儿的确认)
通过比较由各细胞扩增的PCR扩增产物的13号、18号及21号染色体的SNP，确认到8个细胞中，1个细胞具有不同的SNP信息。另外，利用显微操纵器，从涂布有血液的载玻片上回收根据核的形状预测为白细胞的细胞，使用扩增8个细胞时使用的引物，以相同方法扩增DNA，并检查了SNP，其结果，确认到与7个细胞的SNP一致。通过以上，确定1个细胞为来源于胎儿的有核红细胞细胞，确认到7个细胞为来源于母亲的有核细胞。并且，未获得Y染色体的信息，由此确认到胎儿为女婴。
(扩增产物的量(序列读段数)的测定)
关于通过多重PCR扩增产物的序列分析辨别的鉴定为来源于胎儿的有核红细胞的21号染色体的检测区域的扩增产物的量，利用下一代测序器MiSeq(注册商标；Illumina,Inc.制造)进行扩增产物的测序并确定。另外，关于鉴定为来源于母亲的有核细胞的21号染色体的检测区域的扩增产物的量(序列读段数)，利用MiSeq进行扩增产物的测序来进行了测定。对这些扩增产物的量(序列读段数)进行了比较，其结果，细胞之间的偏差较小，且计算了这两个的量比，其结果，成为接近1:1.5的值，推断胎儿为三体性。
[比较例1]
多重PCR扩增工序中，代替在实施例1中使用的以减少引物之间的互补性的方式设计的引物对，作为用于确认计算互补性的效果的比较，设计了不考虑引物之间的互补性的引物对。引物的设计中，对与实施例1相同的染色***置或基因，使用引物3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)，分别制作了Tm值为56℃～64℃，且作为PCR扩增碱基长度，成为140～180个碱基对的20bp的引物。
使用这些引物对进行了多重PCR，除此以外，以与实施例1相同的方法进行了扩增产物的序列确定。其结果，映射率显著下降，且细胞之间的扩增产物量的分散较大，偏差大至无法明确判断数量异常的程度。
产业上的可利用性
本发明为分析来源于胎儿的单细胞的技术，检测区域中能够包含已公知的遗传多态性部位、体细胞突变部位，因此并不限定于基因异常的检测，能够判定基因状态。
序列表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 判定胎儿的基因状态的方法
<130> W-5618PCT
<150> 2015-074318
<151> 2015-03-31
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs7981616, chr13: 25264999
<400> 1
cgctcttccg atctctggct tggccttggg aatgtgg 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs7981616, chr13: 25265178
<400> 2
cgctcttccg atctgacggc aatatggcca atgatgg 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1408184, chr13: 46946120
<400> 3
cgctcttccg atctctgctg tcagtctcag gatatgg 37
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1408184, chr13: 46946292
<400> 4
cgctcttccg atctgacgat accacagact ccgttgg 37
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1801244, chr13: 52544717
<400> 5
cgctcttccg atctctgact gctctggttg attgtgg 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1801244, chr13: 52544880
<400> 6
cgctcttccg atctgactgt tctactaacc ctcttgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2296984, chr13: 99457303
<400> 7
cgctcttccg atctctgttc ccggtctgcg taaatgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2296984, chr13: 99457464
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cgctcttccg atctgacggt caaccctaag gatctgg 37
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<212> DNA
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cgctcttccg atctctgtca ttctgttcat cagctgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs946837, chr13: 101287398
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cgctcttccg atctgactaa cctgttcttc cgagtgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgctcttccg atctctgttt gcagcttgaa gggatgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2230233, chr18: 29104819
<400> 12
cgctcttccg atctgacgag catctgtttc tatgtgg 37
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cgctcttccg atctctgcat cggactttgc ttgatgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cgctcttccg atctgactat atgtaggccg aagttgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs4940019, chr18: 48333122
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cgctcttccg atctctggtg acgcttttta gcactgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs4940019, chr18: 48333301
<400> 16
cgctcttccg atctgactct ttagagggag agattgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 17
cgctcttccg atctctgccc aacaagagaa tctatgg 37
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cgctcttccg atctgactga cttcagggag cctgtgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs3744877, chr18: 77894713
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cgctcttccg atctctgtct ggggttcttc ctactgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs3744877, chr18: 77894884
<400> 20
cgctcttccg atctgacctg aggaggagac tgtctgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cgctcttccg atctctggcc tcgaagagag ggaatgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2073370, chr21: 35260571
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cgctcttccg atctgacgac cacaatctct cccgtgg 37
<210> 23
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<212> DNA
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<400> 23
cgctcttccg atctctgctg ggcagtgtga gaactgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1041439, chr21: 40571388
<400> 24
cgctcttccg atctgactct gaaagtgtct gttctgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs3746887, chr21: 41032678
<400> 25
cgctcttccg atctctgctc atcccacaaa cagttgg 37
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs3746887, chr21: 41032844
<400> 26
cgctcttccg atctgactaa tgtccccgtg tcgctgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs220312, chr21: 43518893
<400> 27
cgctcttccg atctctgaat agccagtgct gttctgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs220312, chr21: 43519063
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cgctcttccg atctgacacc acgtagtcac tgactgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs4148973, chr21: 44323536
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cgctcttccg atctctgttc agaagctcgt caggtgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgctcttccg atctgacaag gaatgagagg cctctgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2379206, chrX: 6995304
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cgctcttccg atctctgagg aagatgtccg ggtctgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2379206, chrX: 6995473
<400> 32
cgctcttccg atctgacatc cacctgcgga aacatgg 37
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs5934730, chrX: 9935444
<400> 33
cgctcttccg atctctgccc ttaccaccat aggatgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs5934730, chrX: 9935607
<400> 34
cgctcttccg atctgacttt ggttgtggtg ctgttgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2071311, chrX: 30260896
<400> 35
cgctcttccg atctctgccc gtgaagagga aatctgg 37
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2071311, chrX: 30261067
<400> 36
cgctcttccg atctgaccac aggaattgat agcgtgg 37
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1801187, chrX: 32380928
<400> 37
cgctcttccg atctctgaaa tggctgcaaa tcgatgg 37
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs1801187, chrX: 32381102
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cgctcttccg atctgacgtc ctatctcttg ctcatgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2293948, chrX: 48418093
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cgctcttccg atctctgagc agctcaagag cgagtgg 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2293948, chrX: 48418271
<400> 40
cgctcttccg atctgacgtg ggtaacggca taggtgg 37
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY:3609387
<400> 41
cgctcttccg atctctgata ccagttactg gcaatgg 37
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 3609547
<400> 42
cgctcttccg atctgacaca cagacagcga aagatgg 37
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 7697094
<400> 43
cgctcttccg atctctgggc aggtgtcagg cttatgg 37
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 7697262
<400> 44
cgctcttccg atctgactgg tggcctggta aaagtgg 37
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 6792987
<400> 45
cgctcttccg atctctgtca gtcacacatc agtctgg 37
<210> 46
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 6793128
<400> 46
cgctcttccg atctgacata cagatcactg gaagtgg 37
<210> 47
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 14640461
<400> 47
cgctcttccg atctctgcga gttcttaatg agcttgg 37
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 14640619
<400> 48
cgctcttccg atctgacgct cattgtgttc catgtgg 37
<210> 49
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 22902850
<400> 49
cgctcttccg atctctggac attgaaggta gcgttgg 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chrY: 22903029
<400> 50
cgctcttccg atctgacgag aaatcggagt tcattgg 37
<210> 51
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO: 51
<400> 51
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atagccttct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatctctg 69
<210> 52
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO:52
<400> 52
caagcagaag acggcatacg agatcgagta atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 53
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO: 53
<400> 53
caagcagaag acggcatacg agattctccg gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 54
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO: 54
<400> 54
caagcagaag acggcatacg agataatgag cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 55
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO: 55
<400> 55
caagcagaag acggcatacg agatggaatc tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO: 56
<400> 56
caagcagaag acggcatacg agatttctga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 57
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq ID NO: 57
<400> 57
caagcagaag acggcatacg agatacgaat tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69

Claims (6)

1.一种判定胎儿的基因状态的方法，其具备：
目的区域选择工序，从人类基因组上的区域选择用于判定所述基因状态的目的区域；
单细胞分离工序，从母血试样分离单细胞；
基因组DNA提取工序，从所述单细胞提取基因组DNA；
基于聚合酶连锁反应的扩增工序，将从所述单细胞提取的基因组DNA作为模板，利用以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合，通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增；及
DNA测序工序，解读所述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物的DNA碱基序列，
其中，所述目的区域选择工序在所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述单细胞分离工序及所述基因组DNA提取工序这两个工序同时进行，
以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：
目标区域选择工序，从所述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的目标区域；
引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述目标区域的引物候选的碱基序列；
局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第1阶段选拔工序，根据在所述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
全局比对工序，对包含所述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第2阶段选拔工序，根据在所述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
引物采用工序，采用在所述第1阶段选拔工序及所述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述目标区域的引物的碱基序列，
其中，所述局部比对工序及所述第1阶段选拔工序这两个工序在所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
2.根据权利要求1所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
以通过聚合酶连锁反应对所述目的区域进行扩增的方式设计的引物组合通过供聚合酶连锁反应的引物组合的设计方法设计，该设计方法具备：
第1目标区域选择工序，从所述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第1目标区域；
第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述第1目标区域的引物候选的碱基序列；
第1局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第一第1阶段选拔工序，根据在所述第1局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第1全局比对工序，对包含所述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第一第2阶段选拔工序，根据在所述第1全局比对工序中求出的全局比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；
第1引物采用工序，采用在所述第一第1阶段选拔工序及所述第一第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述第1目标区域的引物的碱基序列；
第2目标区域选择工序，从所述目的区域选择设计供聚合酶连锁反应的引物组合的第2目标区域；
第2引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述第2目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列；
第2局部比对工序，对用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列及所述已采用的引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第二第1阶段选拔工序，根据在所述第2局部比对工序中求出的局部比对评分，进行用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第2全局比对工序，对包含用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第二第2阶段选拔工序，根据在所述第2全局比对工序中求出的全局比对评分，进行用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
第2引物采用工序，采用在所述第二第1阶段选拔工序及所述第二第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述第2目标区域的引物的碱基序列，
其中，所述第1局部比对工序及所述第一第1阶段选拔工序这两个工序在所述第1全局比对工序及所述第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述第1全局比对工序及所述第一第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，且
所述第2局部比对工序及所述第二第1阶段选拔工序这两个工序在所述第2全局比对工序及所述第二第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与所述第2全局比对工序及所述第二第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，
所述目标区域存在3处以上时，对所有目标区域，反复进行所述第2目标区域选择工序至所述第2引物采用工序的各工序，直至采用用于扩增该目标区域的引物的碱基序列。
3.根据权利要求1或2所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
至少反复进行所述基因组DNA提取工序至所述DNA测序工序，直至能够在所述单细胞分离工序中分离来源于胎儿的单细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
所述基因状态为染色体的数量异常。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
在所述基于聚合酶连锁反应的扩增工序与所述DNA测序工序之间还具备磁珠纯化工序，所述磁珠纯化工序中，利用磁珠对所述目的区域的基于聚合酶连锁反应的扩增产物进行纯化。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的判定胎儿的基因状态的方法，其中，
所述DNA测序工序中，进一步测定序列读段数。
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