JPWO2016159111A1 - 胎児の遺伝子状態を判定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、全ゲノム増幅は、一細胞から抽出した微量のゲノムDNAを飛躍的に増加させるという利点を有するものの、増幅領域により増幅倍率を一定に保つことが難しく、増幅によりPCR産物にバイアスがかかるという欠点があった。
そのため、全ゲノム増幅を行わなかったとしても、単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として目的領域のPCR増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態の判定をする方法が求められている。
(1)胎児の遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、上記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムDNAを抽出するゲノムDNA抽出工程と、
上記単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、上記目的領域選択工程は、上記単一細胞単離工程および上記ゲノムDNA抽出工程の両工程の前もしくは後に、または上記単一細胞単離工程および上記ゲノムDNA抽出工程の両工程と並行して行われ、
上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
上記第1段階選抜工程および上記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第1段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(2)上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
上記第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
上記第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
上記第1の第1段階選抜工程および上記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
上記第2のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
上記第2のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
上記第2の第1段階選抜工程および上記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記第1のローカルアラインメント工程および上記第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第2のローカルアラインメント工程および上記第2の第1段階選抜工程の両工程は、上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記標的領域が3箇所以上である場合は、上記第2の標的領域選択工程から上記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、上記(1)に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(3)上記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも上記ゲノムDNA抽出工程から上記DNAシークエンシング工程までを繰り返す、上記(1)または(2)に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(4)上記遺伝子状態が染色体の数的異常である、上記(1)〜(3)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(5)上記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と上記DNAシークエンシング工程との間に、さらに、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、上記(1)〜(4)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(6)上記DNAシークエンシング工程において、さらに、配列リード数を測定する、上記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
目的領域選択工程では、ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する。
本発明において「ヒトゲノム上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患および/またはがん等に関係する部位が存在するゲノムDNA上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、1塩基以上であればよい。
目的領域が選択されるヒトゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームRNA(Ribonucleic acid:リボ核酸)遺伝子およびトランスファーRNA遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、5’−リーダー配列および3’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに/または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および/もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。
多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、SNPの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。
がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性(家族性)のがんが存在し、遺伝子腫瘍(家族性腫瘍)などと称される。
目的領域は、上記ヒトゲノム上の領域から、遺伝子状態を判定する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、またはがん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は1つに限定されず、2つ以上の目的を有していてもよい。
単一遺伝子の異常が疾患の原因となるメンデル遺伝性疾患について、検出を所望する原因遺伝子をOMIM(Online Mendelian Inheritance in Man:オンライン・ヒトメンデル遺伝形質)データベースから選択し、検査したい変異箇所の数のプライマーを設計する。設計したプライマーセットを用いて、胎児有核赤血球から抽出したゲノムDNAの標的遺伝子領域を増幅し、増幅産物の塩基配列をシークエンサーで求める。解読した塩基配列を健常なリファレンスゲノムと比較したとき、遺伝子の欠失、重複、逆位および/または転座を認めた場合、胎児が遺伝子疾患を有すると予想される。
単一細胞単離工程では、母体血試料から単一細胞を単離する。
国際公開第2012/023298号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、1.065〜1.095g/mL程度である。一方、母体の血球の密度は、赤血球が1.070〜1.120g/mL程度であり、好酸球は1.090〜1.110g/mL程度であり、好中球は1.075〜1.100g/mL程度であり、好塩基球は1.070〜1.080g/mL程度であり、リンパ球は1.060〜1.080g/mL程度であり、単核球は1.060〜1.070g/mL程度である。
本発明では、パーコールおよびヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度1.130g/cm3(比重1.130)の製品が市販されており、希釈することによって、目的とする密度(比重)の媒体を調製することができる。また、ヒストパックは、密度1.077g/cm3(比重1.077)の媒体および密度1.119g/cm3(比重1.119)の媒体が市販されており、これらを混合することによって、目的とする密度(比重)の媒体を調製することができる。パーコールおよびヒストパックを使用することによって、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
母体の血液から有核赤血球候補を取得するために、血液を基板上に塗布して乾燥させ、血球細胞を塗抹した基板(血球細胞標本)を作製することが可能である。この基板としては、透明媒体を用いることが好ましく、スライドガラスを用いることがより好ましい。
0.25<N/C<1.0 ・・・(1)
ただし、式(1)中、「N」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「C」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積である。
0.65<N/L2<0.785 ・・・(2)
ただし、式(2)中、「N」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「L」は画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円の長径の長さである。
ゲノムDNA抽出工程では、上記「〈単一細胞単離工程〉」において単離した単一細胞からゲノムDNAを抽出する。
PCR増幅工程では、上記「〈ゲノムDNA抽出工程〉」において抽出したゲノムDNAを鋳型として、目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をPCR増幅する。なお、「目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセット」の設計方法については、後述する「〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉」において、詳細に説明する。
ポリメラーゼ連鎖反応は、DNAポリメラーゼを使用して鋳型DNAを繰り返し複製させる。増幅させるDNA塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型DNAとハイブリダイズする短いDNAプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型2本鎖DNAの2本の鎖が解離し別々に複製される。
目的領域の数は、13番、18番および/または21番染色体の異数性を検出する場合では、上記染色体に特異的なDNA配列領域から、検査に応じて必要とする箇所の標的領域を選択して、各標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成し、プライマー塩基配列間の相補性が低いものを選抜することによって、単一細胞のような微量のゲノムDNAに対しても目的領域の増幅性が非常に改良される。
PCR増幅産物を含む反応液には、酵素、ヌクレオチド、塩類、およびその他不純物が混在するため、それらを除去することが好ましい。
核酸の精製方法としては、例えば、フェノール/クロロホルム/エタノールを用いた方法、カオトロピック塩の存在下でシリカメンブレンフィルタなどのシリカ担体に選択的に吸着させる方法、およびPEG(Polyethylene glycol:ポリエチレングリコール)存在下においてカルボキシル基で修飾された磁性ビーズに核酸が選択的に結合する現象を利用した方法などが知られている。
本発明の好ましい実施態様として、マルチプレックスPCR増幅産物は、磁性ビーズを利用した精製法を選択することができる。
PCR増幅産物を、常磁性微小ビーズである磁性ビーズを利用した精製を行うことによって、さらに効率的に目的領域のみの解析を可能とすることができる。磁性ビーズを利用した精製方法は、磁性ビーズの粒子表面に核酸を可逆的に結合させ、磁性ビーズをマグネットで吸着し、増幅したDNA断片と液体とを分離することによって、効率よく酵素、dNTPs、PCRプライマー、プライマーダイマー、および塩などの夾雑物を除去することができる。磁性ビーズを利用した方法は、他の精製方法と比較して、サンプルロスが少なく、かつ、夾雑物の除去効率が高い。その結果として、DNAシーケンス工程において、効率的に目的領域のみの解析を行うことが可能となる。
磁性ビーズは市販されており、例えば、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)、NucleoMag(タカラバイオ社製)、またはEpiNext DNA Purification HT System(エピジェンテック社製)等を用いることができる。なかでも、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)を用いて精製することが好ましい。
PCR増幅産物の配列解析には、次世代シークエンサー、特に、MiSeq(イルミナ社製)を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスPCR産物を次世代シークエンサー「MiSeq」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスPCR産物に6〜8塩基で構成されるサンプル識別配列(インデックス配列)ならびにMiSeqフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのP5配列およびP7配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大96種類のマルチプレックスPCR産物を1回で測定することが可能である。
インデックス配列、P5配列およびP7配列をマルチプレックスPCR産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはPCR法などを用いることが可能である。
MiSeqで得られたシーケンスデータを解析する方法としては、BWA(Burrows-Wheeler Aligner;バーロウズ−ホィーラー・アライナー:Li, H.、外1名、「Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第14号、p.1754-1760.;Li, H.、外1名、「Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第5号、p.589-595)を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、SAMtools(Li, Heng、外、「The Sequence Alignment/Map format and SAMtools」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第16号、p.2078-2079;SAMは“Sequence Alignment/Map”に由来する。)、および/またはBEDtools(Quinlan, A. R.、外1名、「BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第6号、p.841-842)を用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
DNAシークエンシング工程においては、さらに、配列リード数を測定することが望ましい。
例えば、胎児有核赤血球の細胞が同定され、標的領域をPCR増幅して得たDNA断片に対して、あらかじめ決定された140bp以上180bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量(配列リード数)をシークエンサーで求めることができる。基準(あるいは参照)として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された140bp以上180bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量(配列リード数)をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量(配列リード数)と、母親由来の増幅産物の増幅量(配列リード数)とは、ほぼ、1:1の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、1:1.5(または2:3)となることが予想される。
単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認を行って、胎児由来の単一細胞の遺伝子状態の判定を行ったことを確定させてもよい。
妊娠母体から採取した抹消血の有核赤血球には、母親由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球が混在していることが知られており、本発明の方法は胎児の遺伝子状態を判定しながら、胎児由来の有核赤血球を同定することができる。遺伝子配列の個人差を識別する方法としては、一般的に、対立遺伝子に存在する遺伝子多型を検出する方法で行われている。一例として、父子判別には、遺伝子多型の一種にSTRも使用することができる。また、個人差を識別する方法として、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異し、1%以上の頻度で観察されるSNPsも使用することができる。本発明では、次世代シークエンサーを用いて、有核赤血球の中に、異なるSTRまたはSNPsを有する細胞の有無により、胎児細胞と、母親細胞を識別することもできる。また、別に遺伝子状態の判定に補助的な情報を使って、胎児由来の有核赤血球か否かを判定するには、例えば、母親由来の白血球を取得して、同様にSTRまたはSNPsを分析することによって、行うことができる。
本発明の特徴的な点の一つである、プライマーおよびプライマーセットの設計方法は、概していえば、複数の特定の標的領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、標的領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得る。プライマー配列の相補性の確認は、ローカルアライメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマー配列の端部に対して、グローバルアライメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点に特徴がある。以下に詳細に説明する。
(a)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
(b)上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
(d)上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
(e)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
(f)上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
(g)上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記(c)ローカルアラインメント工程および上記(d)第1段階選抜工程の両工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
標的領域選択工程は、目的領域選択工程において、ヒトゲノム上の領域から選択された胎児の遺伝子状態を判定するための目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する工程である。
標的領域は、上記目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する対象として選択された領域である。
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAポリメラーゼを用いて、鋳型DNAからDNAを合成する反応である。細胞内でのDNA合成とは異なり、PCRでは、DNAを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが1種類以上、通常は2種類以上、必要となる。1つのPCR反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
PCRは、1ペアのプライマーセットを用いて1つの領域を増幅する単純な系から、複数ペアのプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系(マルチプレックスPCR)まで、容易に拡張することができる。
PCRの利点は、ヒトのゲノム(30億塩基対)のような非常に長大なDNA分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムDNAを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、PCRの利点としては、プログラムにもよるが、概ね、増幅に要する時間が2時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、PCRの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程である。
近傍領域の長さは特に限定されないが、PCRによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するDNAフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および/またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。PCRにおいて用いる酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは20〜500塩基程度、より好ましくは20〜300塩基程度、さらに好ましくは20〜200塩基程度、いっそう好ましくは50〜200塩基程度である。
Tm値は、OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights社製)、または Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のA、T、GおよびCの数(それぞれ、nA、nT、nGおよびnCとする)から、下記式によって計算により求めることもできる。
Tm値(℃)=2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってTm値を算出することができる。
また、Tおよび/またはCの連続(ポリピリミジン)、ならびにAおよび/またはGの連続(ポリプリン)も避けることが望ましい。
所望により、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムDNAに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、ゲノムDNAの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムDNAに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムDNAの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが1本鎖DNAであるのに対して、ゲノムDNAは2本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基(マッチ)=+1、非相補塩基(ミスマッチ)=−1、挿入および/または欠失(ギャップペナルティ)=−3を採用し、閾値を+15に設定することが考えられる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、比較する部分配列が前記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m−1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m−1)/2」通りである。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の3’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の3’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の3’末端から始まり他方の配列の3’末端で終わるアライメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「−」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
第1段階選抜工程は、上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う工程である。
ローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第1の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第1の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第1の閾値を設定してもよい。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「±0」であり、第1の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m−1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m−1)/2」通りである。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「−」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
第2段階選抜工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う工程である。
グローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第2の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第2の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第2の閾値を設定してもよい。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「−3」であり、第2の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
所望により、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムDNAまたは染色体DNA上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等のPCR条件によって、適宜設定することができる。例えば、100〜200塩基(対)の範囲内、120〜180塩基(対)の範囲内、140〜180塩基(対)の範囲内、140〜160塩基(対)の範囲内、160〜180塩基(対)の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
したがって、配列番号1で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号2で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
(a1)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
(b1)上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c1)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
(d1)上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
(e1)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
(f1)上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
(g1)上記(d1)第1の第1段階選抜工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
さらに、
(an)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第nの標的領域を選択する、第nの標的領域選択工程と、
(bn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第nの標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第nのプライマー候補塩基配列作成工程と、
(cn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第nのローカルアラインメント工程と、
(dn)上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第nの第1段階選抜工程と、
(en)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第nのグローバルアラインメント工程と、
(fn)上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第nの第2段階選抜工程と、
(gn)上記(dn)第nの第1段階選抜工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第nのプライマー採用工程。
ただし、nは2以上の整数であり、nが目的領域選択工程で選択した目的領域の数に到達するまで、上記(an)第nの標的領域選択工程から上記(gn)第nのプライマー採用工程までの各工程をすべての標的領域について、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す。
ここで、上記(c1)第1のローカルアラインメント工程および上記(d1)第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、上記(cn)第nのローカルアラインメント工程および上記(dn)第nの第1段階選抜工程の両工程は、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
目的領域の1つを第1の標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(a1)第1の標的領域選択工程において選択した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
第1の態様における「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの標的領域選択工程」として示す。
目的領域のうち第(n−1)標的領域選択工程までに選択されていないものから1つの目的領域を第nの標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
なお、第nの標的領域の選択は、第(n−1)の標的領域の選択と同時に、またはその後に、することができる。ここで、nは2以上の整数である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(an)第nの標的領域選択工程において選択した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「第nのローカルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第1の標的領域から第(n−1)の標的領域までのそれぞれの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である(以下同じ)。
図1のブロックダイアグラムに「第nの第1段階選抜工程」として示す。
上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの第2段階選抜工程」として示す。
上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー採用工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
〈目的領域選択〉
13番染色体、18番染色体、21番染色体およびX染色体上のSNPを表8に、Y染色体に特異的な領域を表9に示す。
(末梢血液試料取得)
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid:エチレンジアミン四酢酸)のナトリウム塩を10.5mg添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
パーコール液(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を使用して、密度1.070(g/cm3)の液および密度1.095(g/cm3)の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095の液2mLを添加し、冷蔵庫で4℃に30分冷却した。
その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度1.095(g/cm3)の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070(g/cm3)の液2mLを重層した。
その後、密度1.070(g/cm3)の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。
その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。
遠沈管を取り出し、密度1.070(g/cm3)と密度1.095(g/cm3)の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板1を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板2を持ち、1端をスライドガラス基板1に30°の角度で接触させ、スライドガラス基板2の接触した面を血液の画分に触れることで、毛管現象により2枚のガラスに囲まれた空間に血液が広がった。
次に、角度を保ったまま、スライドガラス基板2をスライドガラス基板1の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板1上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風により、1時間以上、十分に乾燥させた。このガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、リン酸緩衝液で希釈して濃度3%としたギムザ染色液に10分浸漬した。
その後、純水で洗浄し、乾燥させて、染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、電動XYステージと、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、XYステージ制御部、Z方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上述したとおり準備した、スライドガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により目的の細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の2つの条件を満たす細胞を検出し、XY位置を記録した。
0.25<N/C<1.0 ・・・(1)
0.65<N/L2<0.785 ・・・(2)
ここで、「N」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「C」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「L」は画像解析する細胞の核の長径の長さである。なお、細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さと定義した。
スライドガラス基板上に存在する有核赤血球から、上記式(1)および(2)を満たすものを選択し、次の工程の有核赤血球候補とした。
細胞の形態情報により有核赤血球を識別する工程で識別した有核赤血球の候補について、顕微分光装置を用いて、分光情報の解析を行った。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補を特定し、そのうちの1つの細胞に対して、415nm近傍の単色光を照射し、その細胞の吸収係数を測定した。
次に、その細胞の近傍にある核の形状が上記(2)式を満たさない白血球について、有核赤血球の候補に最も近い細胞から3個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、吸収係数を計算し、平均の吸収係数2を計算した。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補の残りの細胞に対しても上記と同様に、吸収係数を測定し、それぞれの細胞の近傍の白血球3個に対して、吸収係数の平均値を算出した。これらの結果から、白血球の平均の吸収係数に対する有核赤血球候補の吸収係数の比が1以上となる細胞を抽出した結果、明らかに1以上である細胞が8個検出された。
上述したとおり決定された8個の細胞を、マイクロマニュピュレーターを使用して回収した。
採取した単一細胞に対して、Single Cell WGA kit(New England Biolabs社製)を用いて細胞溶解を行った。具体的には、キット付属の説明書の「Sample Preparation Methods」および「Pre-Amplification Protocol」の記載に従って、各単一細胞を5μLの Cell extraction buffer に混合した後、4.8μLの Extraction Enzyme Dilution Buffer および0.2μLの Cell Extraction Enzyme を混合して総液量を10μLとし、75℃で10分間インキュベートした後、さらに95℃で4分間のインキュベートを行った。
これにより、ゲノムDNAを調製した。
(プライマーの作製)
胎児細胞の由来および染色体の数的異常を分析する目的で、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体およびY染色体上の領域から25個所の標的領域を選択した。各標的領域について、当該標的領域を増幅するためのプライマーセットを、配列長20bpであり、Tm値が56〜64℃の範囲内であり、かつ、PCR増幅産物のサイズが140〜180塩基対の範囲内となるように設計し、これらの中から、各プライマー間の3’末端固定のローカルアラインメントスコアが3未満、かつ、各プライマーの3’末端3塩基のグローバルアラインメントスコアが0となるプライマーセットを25セット選抜した(表10)。
作製した各プライマーセットが標的領域を増幅できることを確認するため、シングルプレックスPCRにより増幅の確認を行った。
具体的には、調製したゲノムDNA(0.5ng/μL) 2μL、プライマーミックス 2μL、マルチプレックスPCRミックス2 12.5μL、マルチプレックスPCRミックス1 0.125μL、および水 適量を混合して、最終液量 25μLの反応溶液を調製した。なお、上記プライマーミックスは1つのプライマーセットを構成する各プライマーをそのプライマーの終濃度が50nMとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性94℃ 60秒を行った後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 90秒、および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを30サイクル繰り返して、シングルプレックスPCRを行った。
シングルプレックスPCRを行った反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅の有無を確認した。
シングルプレックスPCRによる増幅が確認できた25種類のプライマーセットを用いて、マルチプレックスPCRを行った。
具体的には、調製したゲノムDNA(0.5ng/μL) 2μL、25セットプライマーミックス 2μL、マルチプレックスPCRミックス2 12.5μL、マルチプレックスPCRミックス1 0.125μL、および水 適量を混合して、最終液量 25μLの反応溶液を調製した。なお、上記25セットプライマーミックスは、シングルプレックスPCRによる増幅が確認できた25種類のプライマーセットを構成する各プライマーをその終濃度が50nMとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性94℃ 60秒を行った後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 90秒、および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを30サイクル繰り返して、マルチプレックスPCRを行った。
得られたマルチプレックスPCR産物は、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)を用いて精製された。反応溶液 25μLに、AMPure XP 45μLを加え、磁性ビーズにPCR反応産物を結合させた。磁性ビーズをマグナスタンド(Magna Stand)(日本ジェネティクス社製)の磁力で分離し、夾雑物を除いた。70%エタノールで洗浄後、磁性ビーズに結合した核酸をTE(Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane ) - EDTA:トリス−エチレンジアミン四酢酸)緩衝液で溶出した。
MiSeq(イルミナ社製)を用いてシーケンス反応を行うため、サンプル識別用のインデックス配列、ならびにフローセル結合用のP5配列およびP7配列を、マルチプレックスPCR産物の両末端に付加した。プライマーとして、各1.25μMのP5_F(D501)およびP7_R(D701〜D705)(表11に示す。)を用い、マルチプレックスPCR産物、マルチプレックスPCRミックス1、マルチプレックスPCRミックス2および水と混合して反応溶液を調製し、初期熱変性94℃ 3分の後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング50℃ 60秒および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを5サイクル、さらに、熱変性94℃ 45秒、アニーリング 55℃ 60秒および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを11サイクル行った。なお、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
単一細胞由来のマルチプレックスPCR産物を、MiSeq Reagent Kit v2 300 Cycle(イルミナ社製)を用いてシーケンスを行い、得られたFastQファイルを、BWA(Burrows-Wheeler Aligner:バーロウズ−ホィーラー・アライナー)を用いてヒトゲノム配列(hg19)へマッピングを行い、SAMtoolsにより遺伝子多型情報を抽出し、BEDtoolsにより各検出領域のシーケンスリード数を算出することで解析を行った。
各細胞から増幅したPCR増幅産物の、13番、18番および21番染色体のSNPを比較することによって、8個の細胞のうち、1個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認出来た。別途、核の形状より白血球と予想される細胞を、マイクロマニュピュレーターを用いて、血液を塗布したスライドガラス上から回収し、8個の細胞の増幅時に使用したプライマーを用いて、同様にしてDNAを増幅し、SNPを調べたところ、7個の細胞のSNPと一致することが確認された。以上より、1個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞と確定し、7個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。また、Y染色体の情報が得られなかったことから胎児は女児であることが確認された。
マルチプレックスPCR増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の21番染色体の検出領域の増幅産物の量を、次世代シーケンサーMiSeq(登録商標;イルミナ社製)を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、確定させた。別途、母親由来と同定された有核細胞の21番染色体の検出領域の増幅産物の量(配列リード数)を、MiSeqを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。これらの増幅産物の量(配列リード数)を比較したところ、細胞間でのばらつきは小さく、かつ、この2つの量比を計算したところ、1:1.5に近い値となり、胎児はトリソミーであることが推定された。
マルチプレックスPCR増幅工程では、実施例1で使用した、プライマー間の相補性が低くなるよう設計したプライマー対に代えて、相補性を計算した効果を確認するための比較として、プライマー間の相補性を考慮しないプライマー対を設計した。プライマーの設計は実施例1と同じ染色***置ないしは遺伝子に対し、Primer3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)を使用して、Tm値が56℃〜64℃、かつPCR増幅塩基長としては、140〜180塩基対となる20bpのプライマーを各々作製した。
これらのプライマー対を使用してマルチプレックスPCRを行ったことを除き、他は実施例1と同様にして、増幅産物の配列決定を行った。その結果、マッピング率が著しく低下し、かつ細胞間の増幅産物量の分散が大きく、数的異常を明確に判断できないほど、ばらつきが大きかった。
Claims (6)
- 胎児の遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
前記単一細胞からゲノムDNAを抽出するゲノムDNA抽出工程と、
前記単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
前記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、前記目的領域選択工程は、前記単一細胞単離工程および前記ゲノムDNA抽出工程の両工程の前もしくは後に、または前記単一細胞単離工程および前記ゲノムDNA抽出工程の両工程と並行して行われ、
前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
前記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
前記第1段階選抜工程および前記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記ローカルアラインメント工程および前記第1段階選抜工程の両工程は、前記グローバルアラインメント工程および前記第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記グローバルアラインメント工程および前記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。 - 前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
前記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
前記第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
前記第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
前記第1の第1段階選抜工程および前記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列および前記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
前記第2のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
前記第2のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
前記第2の第1段階選抜工程および前記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記第1のローカルアラインメント工程および前記第1の第1段階選抜工程の両工程は、前記第1のグローバルアラインメント工程および前記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第1のグローバルアラインメント工程および前記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
前記第2のローカルアラインメント工程および前記第2の第1段階選抜工程の両工程は、前記第2のグローバルアラインメント工程および前記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第2のグローバルアラインメント工程および前記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
前記標的領域が3箇所以上である場合は、前記第2の標的領域選択工程から前記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、請求項1に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。 - 前記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも前記ゲノムDNA抽出工程から前記DNAシークエンシング工程までを繰り返す、請求項1または2に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
- 前記遺伝子状態が染色体の数的異常である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と前記DNAシークエンシング工程との間に、さらに、
前記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、請求項1〜4のいずれか1項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。 - 前記DNAシークエンシング工程において、さらに、配列リード数を測定する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
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CLINICAL CHEMISTRY, vol. 48(12), JPN6018026346, 2002, pages 115 - 2123 * |
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