MXPA04008955A - Metodo de amplificacion-hibridacion para detectar y tipificar virus del papiloma humano. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee un metodo de amplificacion e hibridacion para detectar y tipificar el virus del papiloma humano (HPV), y los sensibilizadores y las sondas de hibridacion usados en el metodo. La invencion se refiere a una parte concreta del genoma del HPV, que es adecuada para disenar sondas de oligonucleotido para la hibridacion, especifica para el genero HPV y especifica para el genotipo HPV.

Description

METODO DE AMPLIFICACION-HIBRIDACION PARA DETECTAR Y TIPIFICAR VIRUS DE PAPILOMA HUMANO CAMPO DE LA INVENCION En el método de la presente invención se proporciona detección y genotipificación mejoradas del virus de papiloma humano (HPV). Un aspecto de la invención define regiones genómicas de HPV, las cuales son adecuadas para diseñar sondas de ofigonucleótidos de hibridación específica para género de HPV y específica para genotipo de HPV, ventajosamente están cerca una de otra y en un amp/ícon. Otro aspecto de la invención se refiere a las secuencias de las sondas específica de genero y específica de genotipo. O^ro aspecto de la invención se refiere a la formulación optimizada de reactivos y método, la cual es adecuada para amplificar y detectar un conjunto de genotipos de HPV ("paquete").

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se determinaron numerosas secuencias del virus del papiloma, ver las publicaciones incorporadas a la presente por referencia: HPV-6: de Villiers y colaboradores, J. Virology, 40 (1981); HPV-1 : Dartman y colaboradores, Virology 151. 124-130 (1986); HPV-16: Seedorf y colaboradores, Virology 145, 181-185 (1985); HPV-18: Colé y Danos, Journal of Molecular Biology 93, 599-608 (1987); HPV-31: Goldsborough y colaboradores, Vírology 171 , 306-311 (1989); HPV-33: Colé y Streeck, J. Virology, 58, 991-995 (1986); HPV-54: Favre y colaboradores, J. Cáncer 45, 40-46 (1990); HPV-56: Lórincz, J. Gen. Virol. 70, 3099 (1989). La detección y tipificación de HPV se reporta en un número de publicaciones, además de manchón Southern y otras técnicas de hibridción, las técnicas más ampliamente usadas son los métodos con base en PCR, puesto que estos métodos proporcionan simultáneamente alta sensibilidad, especificidad y la flexibilidad del ensayo da más control para satisfacer los requerimientos analíticos. El virus del papiloma humano, un miembro de la familia de PapUloma viridae, es un virus tumoral de ADN, con un genoma circular de 8000 bp. El virus muestra fuerte tropismo epitelial, y prolifera solamente en células epiteliales diferenciadas. El virus del papiloma tiene un papel etiológico que se sospecha en muchas enfermedades humanas diferentes, por ejemplo en muchas enfermedades diferentes de la piel, es decir, en las formas diferentes de verruga, condiloma acuminatum y tumores de la piel y en otras condiciones tales como carcinoma cervical, carcinomas ano-genitales, carcinoma laríngeo. Esta bien establecido que el virus del papiloma humano muestra una fuerte correlación con la incidencia de estos tumores, y esto es cierto aún para las lesiones pre-cancerosas (CIN, VIN, VAIN, PIN, PAIN). El HPV puede ser detectado en el 99% de los pacientes con carcinoma cervical. Esta estrecha refación estadística es causada posiblemente por el papel causal del HPV en la formación del carcinoma cervical.

Sobre la base de la información epidemiológica, los pacientes que se van a infectar por diferentes genotipos de HPV no tienen el mismo nivel de riesgo para desarrollar carcinoma cervical. De acuerdo con estos hallazgos, los genotipos se clasifican en clases de riesgo bajo, en riesgo medio y riesgo alto, y además de éstos hay genotipos no clasificados también. Puesto que los riesgos son ampliamente diferentes y la incidencia de la infección con HPV es muy alta, la determinación de genotipos es de gran importancia. El virus de HPV no puede ser cultivado. La diagnosis serológica de infección con HPV se limita a detectar la exposición al virus (infección pasada o presente), pero no puede identificar exactamente el genotipo, el papel está limitado principalmente a investigaciones epidemiológicas. Para los virus del papiloma, no existe una clasificación serológica exacta (serotipificación), genotipificacióñ es el método de clasificación aceptado ampliamente. Estos pueden ser divididos en dos grupos, de acuerdo de si la detección es precedida por amplificación o no. En una modalidad del último métodOj se usan sondas de ARN de genoma de longitud completa para detectar los genomas de ADN de HPV desnaturalizados, y el heteroduplex es detectado con anticuerpos específicos (Captura-Digeno Híbrido). De acuerdo con otro método, se usa la técnica de manchón de Southern para detección y genotipificacióñ de genotipos HPV. La desventaja de estos métodos es la insensibilidad relativa y carencia parcial de especificidad. En el caso del método de Captura de Híbrido muchas publicaciones reportan diferentes reacciones cruzadas, que causan reacciones positivas falsas en condiciones clínicas. Los autores reportaron que las reacciones cruzadas eran aceptables solamente con un control de corte de alta (1 ng/ml) concentración de ADN, lo cual subraya el acoplamiento no deseable entre sensibilidad y especificidad. Mediante los métodos de amplificación este problema no aparece, puesto que la reacción responsable de la sensibilidad (amplificación) se lleva a cabo separadamente. Generalmente las técnicas de amplificación difieren en el segmento de genoma amplificado seleccionado, número de primarios y la técnica de detección aplicada. Los primarios usados más frecuentemente son los GP5+ - GP6 + , MY9-MY11 y las reacciones de PCR específicas de tipo diferente. Las técnicas de detección más frecuentemente usadas son la hibridación específica de secuencia, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y el ensayo de sonda de línea (LiPA) Además de estos, se usa el secuenciado de amplicones y patrón de timidina generados mediante la incorporación de dUTP, pero menos frecuentemente. Las características analíticas de las técnicas de amplificación varían en rangos amplios. Los métodos se pueden caracterizar por los genotipos amplificables, la sensibilidad analítica de la amplificación de los genotipos y ía especificidad y confiabilidad de la detección. En este campo, el sistema de primario degenerado MY9-MY1 se considera que es la reacción de referencia. En el caso del sistema de MY9-MY11 existe el sistema de detección de hibridación de LiPA (inmunogenética). La mayor desventaja del sistema MY9-MY11 es difícil para controlar la síntesis degenerada de los primarios, esta es la razón por la cual la proporción relativa de las especies de primarios producidas en la síntesis es variable de síntesis a síntesis, lo cual puede resultar en los cambios impredecibles del comportamiento analítico de la reacción de PCR; segundo, esta reacción puede amplificar los menos tipos, en comparación con las otras reacciones usadas ampliamente. Es bien sabido a partir de la literatura, que el sistema puede amplificar el genotipo 51 solamente en ese caso, si se agregan a la reacción los primarios específicos de tipo de genotipo 51 de HPV. Usando síntesis de primario degenerado la proporción relativa de las especies de primarios no puede ser cambiada, y es imposible hacer a la medida las proporciones de primarios para lograr mejor rendimiento analítico y una amplificación balanceada de genotipos. La reacción de GP5+ - GP6+ resuelve el problema solamente mediante el uso de dos pares de primarios seleccionados cuidadosamente - optimizados para las secuencias de HPV genital — los dos sistemas de primario son fáciles de manejar, sin embargo (a flexibilidad es menor. El sistema de GP5+ - GP6 + , puede amplificar muchos de los genotipos de HPV conocidos, pero las características analíticas del sistema no son óptimas (la sensibilidad no está equilibrada con genotipos diferentes), y el enfoque de dos primarios es restringido en la optimización, por ejemplo, equilibrar las sensibi/fdades de detección para los genotipos individuales es altamente problemático (excepto la optimización limitada de la temperatura de fusión y concentración del MgCI2). Es difícil adaptar el sistema de GP5+ - GP6+ a la amplificación de otros genotipos, que en cualquier caso influencian su aplicación futura, puesto que la necesidad para detectar nuevos genotipos ocurre permanentemente. La identificación de los genotipos no está resuelta adecuadamente. Otro método de amplificación específica para genotipo amplio bien conocido es el método de L1C: sistema de dos primarios, con dos versiones, una es usando (con el primario de LC1) el primario L1C2 o L1C2 nuevo, para amplificar genotipos adicionales. La descripción detallada del amplicón de L1C se puede encontrar en la literatura [Jpn. J. Cáncer Research 82, 524-531 (1991)]. Básicamente se deben cumplir dos criterios mediante los métodos de post-amplificación de detección: aplicabilidad de diagnóstico de rutina (simplicidad, costos, tiempo), y el requerimiento de poder de nivel adecuado de discriminación de poder de discriminación. Un grupo significativo de métodos no son adecuados en términos de poder de discriminación de poder de discriminación. Por lo tanto, la aplicación del RFLP es limitada, debido a las cortas regiones amplificadas, no hay suficientes sitios de restricción de diagnóstico, de manera que con frecuencia los genotipos pueden ser clasificados solamente en grupos. Otro ejemplo de técnica de SSCP es difícil de referir de los patrones complejos del SSCP para genotipos, y también, la robustez de estas reacciones no es satisfactoria, tampoco. El poder de discriminación es especialmente importante desde el punto de vista de diagnóstico para satisfacer los requisitos de las autoridades reglamentarias. A partir de los aspectos de la simplicidad y el poder de discriminación, el secuenciado es el enfoque ideal, puesto que su automatización se resuelve y es capaz de detectar cada genotipo (o aún subtipos del mismo), si la muestra no es una mezcla de genotipos. Pero en la práctica, no se usa ampliamente, debido a su alto costo y consumo de tiempo, y su aplicación en laboratorios de diagnóstico rutinario no es aceptable, y en el caso de muestras mezcladas ninguno de los genotipos puede ser determinado. La ventaja de los métodos de hibridación es que su poder de discriminación o astringencia puede ser cambiado fácilmente, puesto que varios parámetros de la reacción pueden ser variados en amplios rangos, y algunas formas son fácilmente automatizadas, la reacción es menos costosa, y en el caso de implementación en paralelo (con algunas formas) aún el tiempo necesario es insignificante. Por lo tanto, existe una necesidad de un nuevo método de amplificación/detección de HPV, que elimine las desventajas de los métodos en uso, y que sea barato, fácil de reproducir y automatizar. La invención describe un ensayo de amplificación e hibridación, en el cual los primarios son molécuías sintetizadas independientemente, por lo tanto, sus proporciones relativas pueden controlarse y optimizarse fácífmente, y la ampfificación tiene una sensibilidad equilibrada. Las reacciones de hibridación llevadas a cabo de manera altamente parafela satisfacen fos criterios de reacción de bajo costo, rápida, flexible y que se puede automatizar.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto la presente invención proporciona/define unas regiones genómicas de virus deí papiloma humano, que están dentro de un amplicón de consenso (es decir, una región, que se puede ampíifícar con primarios que se unen a secuencias conservadas que flanquean al amplicón), en donde estas regiones genómicas están caracterizadas por tener secuencia de ADN específica de genotipo, lo cual es adecuado para diseñar sondas de hibridación específica de genotipo. En otro aspecto, la invención proporciona/define otra región genómica de HPV en este amplicón de consenso, en donde estas regiones genómicas están caracterizadas por tener secuencia de ADN conservada, específica de género deHPV, lo cual es adecuado para diseñar sondas de hibridación específica de género. Un elemento esencial de la invención es la presencia de dos segmentos genómicos dentro de un amplicón de consenso, los cuales son adecuados para diseñar sondas de hibridación específica de género y genotipo. En otro aspecto, Ja invención proporciona el uso de primarios en la reacción de amplificación, las secuencias de ADN y concentraciones de las mismas, y las condiciones del ciclo de reacción a ser optimizadas para la amplificación de sensibilidad equilibrada de los genotipos de virus del papiloma humano.

La presente invención proporciona métodos para detectar y tipificar los genotipos del virus del papiloma humano (HPV), en donde los métodos comprenden los pasos de: a) Moléculas de ácido nucleico aisladas a partir de muestras biológicas, son amplificadas con la mezcla de primarios de la invención y como resultado se producen productos de doble hebra, amplificados, los cuales b1) son ya sea hibridizados en condiciones astringentes con la sonda de hibridación específica de género, o con una mezcla de la misma, y se detecta la presencia de amplicón de consenso de HPV presente en un caso dado; y/o b2) son hibridizados en condiciones astringentes con una mezcla de las sondas de hibridación específica de genotipo provistas por la invención, y se detectan los grupos de genotipo de HPV correspondientes; y/o b3) son ya sea hibridizadas en condiciones astringentes con una sonda de hibridación específica de tipo de la invención o una mezcla de la misma, y se detecta y determina el genotipo de HPV presente en un caso dado. En resumen el método provisto en la presente invención puede ser usado para la amplificación/detección de un grupo dado de los genotipos de HPV, que resulta en la detección de ADN genómico de HPV de los mismos con sondas específicas de género, y la genotipificación colectiva (agrupada) o individual de los genomas de HPV. El método puede usarse para acceder el riesgo o para determinar aquellos individuos que están en riesgo de condiciones y enfermedades posteriores, causadas o asociadas por los virus de HPV encontrados en los pacientes, en un momento dado, y especialmente con la detección específica de tipo de los mismos. El método provisto por la invención es adecuado también para detectar la presencia de HPV en una población dada y también para aumentar, soportar o confirmar la diagnosis citológica en un individuo dado (clasificación).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Para ayudar al entendimiento de la invención, se definen varios términos a continuación. Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se refieren a sondas, bases o primarios y otros ADN, ARN, APN cortos (ácido péptido nucleico) y otros oligómeros de tipo químico, los cuales son capaces de unión específica de secuencia en plantilla de ADN, ARN o APN (molécula objetivo). El término "hibridación" se refiere a ía unión específica de secuencia de dos secuencias de ácido nucleico. Las condiciones usadas determinan significativamente la astringencia de la hibridación, por lo tanto, la hibridación puede ocurrir bajo condiciones menos astringentes, aún si los ácidos nucleicos no son exactamente complementarios. En algunos casos podría ser necesario que la sonda de ácido nucleico se uniera a un grupo de secuencias, las cuales están más cerca o más lejos con relación entre ellas. Aquellos expertos en la técnica de la tecnología de ácido nucleico pueden determinar las condiciones, que si se cumplen, entonces la unión es adecuadamente específica o no específica. El término "sonda" se refiere a un conjunto de oligonucleótidos, que muestran hibridación específica de secuencia en la presencia de ácidos nucleicos complementarios y parcialmente complementarios. La estructura de los oligonucleótidos puede ser modificada, para ejecutar los pasos que siguen a la hibridación posible, o para cambiar sus propiedades de hibridación. El término "sonda específica de tipo" se refiere a un conjunto de oligonucleótidos, los cuales bajo condiciones astringentes se unen solamente a la región objetivo que es exactamente complementaria con ellos. Las condiciones de hibridación adecuadas para este requerimiento son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y Colaboradores, 1985, Molecular Cloning Laborator Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. EUA). Generalmente, las condiciones astringentes se seleccionan para ser de aproximadamente 5°C más abajo que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) a la cual se asocia el 50% de la sonda en la presencia de la molécula objetivo complementaria adecuada. Relajando la astringencia de las condiciones de hibridación (por ejemplo, elevando la concentración de sal o bajando la temperatura) se permitirán uniones de secuencias no exactamente complementarias. En el caso de plantilla no exactamente complementaria, los nucleótidos, que no se pueden unir al ácido nucleico de plantilla, en la plantilla son los "nucleótidos desiguales". El término "primario o base" se refiere a nucleótidos, capaces de actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN (emprimado) bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión de base complementario a una hebra de ácido nucleico en una plantilla de ácido nucleico, es decir, en la presencia de cuatro trifosfatos de nucleosido diferentes y un agente para la polimerización (es decir, polimerasa de ADN o transcriptasa inversa) en un amortiguador (buffer) apropiado y a una temperatura adecuada. Un primario o base es de preferencia una molécula de ADN de una sola hebra. La longitud apropiada de un primario o base fluctúa típicamente desde 15 hasta 40 nucleótidos. Una base no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla, por lo tanto, cambiar la temperatura del grupo de unión (reacción) de moléculas objetivo similares, puede servir como plantilla para la síntesis (amplicón de consenso). Se pueden usar grupos químicos con ciertas características ventajosas para etiquetar el olígonucleótido de base, para hacerlo capaz de unirse a fase sólida y para otros propósitos. El término "primario o base" - en la presente invención - se refiere también a un grupo de oligonucleótidos relacionados en secuencia, en donde el grupo de oligonucleótidos es capaz de emprimar (como se describió antes), en un cierto grupo de secuencias de plantilla. Adicronalmente, miembros del grupo pueden consistir de oligonucleótidos que pueden formar desigualdades con algunos o todos los miembros de un conjunto dado de ácidos nucleicos de plantilla. Pero bajo condiciones apropiadas estas bases pueden participar también en el emprimado. El término "primarios o bases de consenso" se refiere a una base o grupo de bases, las cuales pueden usarse para el emprimado de ciertas regiones de ácidos nucleicos de plantilla relativos. La característica de estas regiones es que sus variabilidades son significativamente menores que la variabilidad del ácido nucleico entero, es decir, se conservan, por lo tanto, en estas secuencias seleccionadas de bases de consenso se puede hacer el emprimado incluyendo el grupo total de secuencias de ácido nucleico de plantilla. La base de consenso no es necesariamente una sola base, puede ser un grupo de bases. El término "enzima de polimerasa termoestable" se. refiere a una enzima que es relativamente estable al calor de alrededor de 95°C y cataliza la polimerización de trifosfatos de nucleósido para formar productos de extensión de base que son complementarios para una de las hebras del ácido nucleico de la secuencia objetivo. Una enzima de polimerasa termoestable purificada se describe en la Patente de E.U. No. 4,889,818, incorporada a la presente por referencia, y está disponible comercialmente por ejemplo de Applera. En la presente invención, la amplificación de ADN se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) descrita en las Patentes de E.U. Nos.4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188. En la presente invención las condiciones de PCR optimizadas se han desarrollado para los propósitos de la amplificación de gran número de genotipos de HPV diferentes con optimización de concentraciones de bases, secuencias de bases y condiciones de ciclado. La primera parte de la amplificación, amplifica con astringencia constantemente creciente, con la meta de que la amplificación de los genotipos, para lo cual las bases contienen más nucleótidos desiguales, podría iniciar la amplificación con la misma eficacia que los otros genotipos, pero más tarde la temperatura de unión creciente cambia la reacción hacia el uso de las bases, las cuales están en cantidades mayores. Con una mezcla optimizada de bases este proceso - en teoría - cambiará las secuencias de unión de bases hacia una secuencia de consenso, creando así la posibilidad para la amplificación de sensibilidad equilibrada de los genotipos. Aunque la reacción en cadena de polimerasa es el método de amplificación preferido, las regiones genómicas y oligonucleótidos mencionados pueden usarse en cualquier método conocido. Por ejemplo, la reacción en cadena de ligasa (Wu y Wallace 1989, Genomics 4:560-569), el sistema de amplificación TAS (Kwoh y Colaboradores, 1989, Proc.Natl. Acad. Sci. EUA 86:1173-1177) y la duplicación de secuencia autosostenida (Guatelli y colaboradores, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:1874-1878) pueden ser adecuados también para la amplificación correcta de la secuencia objetivo. De manera similar, en el sistema de Q-beta-replicasa ( ramer y Lizardi, 1989. Nature 339:401-402) se pueden amplificar sondas específicas de secuencia.

En la presente invención las bases se seleccionan de un grupo de secuencias más o menos complementarias adecuadas para amplificar amplicones de consenso de HPV. El emprimado efectivo se logra en la presencia de nucleótid desigual usando temperatura de recocido y concentraciones relativas diseñadas cuidadosamente de las bases. En una modalidad preferida de la presente invención, las bases de la invención (SEC. ID. NO: 1-40, 70-72) se usan con bases conocidas (SEC. ID. NO: 73-75) en la forma de reactivos adecuados. Esto permite la detección de un conjunto extendido de genotipos de HPV, por lo menos 47 genotipos conocidos. Se puede ver en el Ejemplo 4, que la amplificación del genotipo HPV-35 de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo incluyendo la base SEC. ID. NO: 37 en la reacción. Sin esta base que incluye solamente las bases conocidas en la reacción, el genotipo HPV-35 no se amplifica. Otro aspecto de la invención se refiere a bases específica de tipo para el gen L1 de HPV, el cual incluye una de las secuencias de nucleótidos descrita en SEC. ID. NO: secuencias 1-36. Otro aspecto de la invención se refiere a la mezcla de bases que incluyen las bases L1C1, L1C2 ó L1C2 nueva y bases que se seleccionan de SEC. ID. NO 1-40,70-72. Además, la invención se refiere a la aplicación de tal mezcla de bases para la amplificación de genotipos 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 o 77 de HPV.

Otro aspecto de la invención se refiere a los amplicones producidos mediante la amplificación usando la mezcla de bases de la invención, antes mencionada, con la excepción de los amplicones de HPV-6, -11, -16, -18, -31, -33, -42, -52 y -58. Un elemento esencial de la presente invención es la presencia de los segmentos genómicos, genérico y específico para tipo en los amplicones. Estos segmentos genómicos permiten la realización de la hibridación y detección altamente específicas. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un segmento genómico de los amplicones, caracterizado por un genotipo segmento genómico diverso, específico de genotipo que se estira desde el extremo 3' del amplicón (en dirección 3' - 5') desde el bp -80 hasta el bp -30. Estos segmentos genómicos son secuencias de ADN de doble hebra, de aproximadamente 40 bp de largo, dadas en las secuencias SEC. ID. NO 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111. Otro aspecto de la presente invención se refiere a otro segmento genómico de los amplicones, estirando de 3' - 5' desde el extremo 3' del amplicón desde el bp -150 hasta el bp -105, y caracterizado por secuencias de baja complejidad altamente conservadas entre genotipos, que muestra especificidad de género de HPV genérica. Estos segmentos genómicos son ADN de doble hebra, contienen usualmente 23 bp, y su hebra superior tiene una de las siguientes secuencias: SEC. ID. NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.

Durante la detección de hibridación de los amplicones, se usan sondas de hibridación genérica o específica de tipo, diseñadas para los segmentos genómicos antes mencionados. Las sondas de oligonucleótido genéricas son aplicables generalmente para detectar el amplicón de HPV, que es el ADN de HPV amplificado, mientras que las sondas especificas de tipo se pueden usar para tipificar además el mismo, que es para detectar los genotipos individuales. Ambas sondas de hibridación pueden ser de naturaleza de ADN, ARN o APN. Las sondas genéricas usadas en el método de la invención tienen propiedades similares a las bases de consenso, con la diferencia de que el extremo 5' no es preferido para la posición de pares de nucleótidos desiguales. En la presente invención se pueden usar como sondas, éstas sondas genéricas pueden usarse como sondas y bases de hibridación. Por lo tanto, la invención se refiere a las sondas o bases de hibridación genérica (consenso), que incluyen una de las secuencias listada en SEC. ID. NO: secuencias 41 a 49. En un método preferido de la invención, se usan las siguientes sondas como sondas genéricas: SEC. ID. NO: 41 a 49. En caso de sondas específicas de tipo las sondas son 100% complementarias para la secuencia del genotipo correspondiente. Durante su diseño es importante excluir fa posibilidad, de si otros genotipos muestran alto nivel de complementaridad con la sonda o parte de esa, o no. Puesto que el segmento específico de tipo es de aproximadamente 40 bp de largo en los amplicones de la invención, es posible seleccionar secuencias de sonda aún traslapantes, que son las más adecuadas tanto teórica como experimentalmente. Se demuestra en el Ejemplo 5 que se podrían diseñar y usar sondas adecuadas, las cuales tienen alta especificidad (en comparación con los 70 genotipos investigados), y mantienen su especificidad aún a temperatura ambiente con las condiciones usadas de hibridación. Puesto que la hibridación de sondas es adecuadamente específica en condiciones de hibridación idénticas, se puede usar también la mezcla de las sondas. Por lo tanto, desde el punto de vista práctico se pueden usar condiciones de reacción más uniformes. Por lo tanto, la invención se refiere a las secuencias de las sondas específicas de tipo, las cuales se pueden usar en la amplificación y detección de HPV, y pruebas de genotipificación, e incluyen una de las secuencias listadas en SEC. ID. NO: 50 a 67. Aunque la invención se refiere a cualquier modalidad de la hibridación, se prefiere comercialmente la hibridación de fase sólida. La llamada hibridación de fase (hacia delante) sólida une las sondas a ácido nucleico objetivo inmovilizado (amplicón), mientras que la hibridación inversa une el ácido nucleico (amplicón) objetivo a sondas ínmoviíizadas. Los productos de reacción no unidos se remueven con diferentes soluciones de lavado en el proceso. En el primer caso, la sonda debe ser etiquetada adecuadamente para desarrollo posterior, mientras que a la inversa forma el amplicón etiquetado. Ambos sistemas pueden ser realizados en placas de microtitulación. Puesto que la capacidad de inmovilización es limitada, en la presente invención el sistema de hibridación hacia delante es preferida debido al gran número de sondas individuales que constituyen la mezcla de sondas usada. El método descrito en la Patente de E.U. No. 6,214,979 puede ser aplicable de manera similar, donde las sondas se agregan a la reacción durante la amplificación. Durante el proceso la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq descompone las sondas, y detectar los productos de descomposición producidos se puede usar para detectar la presencia del ácido nucleico objetivo. Pero, se conocen también otros sistemas, principalmente con base en hibridación, llamados sistemas de detección de tiempo real, pero estos difieren solamente en su implementacion y método de detección, y no en una realización teóricamente diferente de la unión de sonda-amplicón específica de secuencia. Para la inmovilización, los amplicones pueden ser etiquetados.

De las varias posibilidades en la presente invención, se prefiere el etiquetado de biotina de las bases y el uso de base etiquetada en reacciones de amplificación. En la presencia de avidín, o estreptavidin absorbido a biotina de fase sólida resulta en la inmovilización del amplicón, como una consecuencia de la unión de avidín-biotina altamente específica y muy estable. En una reacción dada solamente bases de hibridación con una o la otra hebra son biotiniladas, así la otra hebra puede ser removida antes de hibridación. Para propósitos de detección las sondas pueden ser etiquetadas, dichas etiquetas se pueden detectar mediante varios métodos, por ejemplo, mediante métodos de detección que están basados en fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción de rayos X, absorción, magnetismo, actividad enzimática, etc. Por lo tanto, los etiquetados adecuados pueden incluir y no están limitados a, los siguientes: fluoróforos, cromóforos, isótopos, sustancias electrodensas, enzimas o ligandos capaces de formar enlaces específicos. Se puede usar también la combinación de los sistemas antes mencionados. En la presente invención, se prefiere la unión específica de fluoresceína con anticuerpo de anti— fluoresceína-HRPO lo cual se detecta por la reacción de oxidación de peroxidasa de rábano en la presencia de substrato de HPPA y H202 (ver Ejemplo 2). En la presente invención se usan bases bioestañados hacia delante o hacia atrás. Tanto el etiquetado de las sondas como la anti-fluoresceína-HRPO están disponibles comercialmente. Los productos químicos necesarios para lavados y las varias soluciones generalmente están disponibles también. El sistema que usa fosfatasa alcalina, o cualquier otra enzima, cuya actividad puede ser detectada, se puede construir también o usar. Además de la lumínometría y colorimetría de detección fluorescente son también métodos de detección aceptables para aplicación de diagnóstico médico del sistema. La inclusión de control interno durante la aplicación de diagnóstico del método de la invención da la posibilidad para reconocer reacciones negativas falsas y desde un punto de vista de diagnóstico es preferido. Se pueden usar varias fuentes de ADN artificial o natural para control interno. Estos sistemas se prefieren, lo cual no incrementa el número de las bases usadas en la reacción, y la cantidad y propiedades analíticas del ácido nucleico objetivo para control interno se normalizan adecuadamente. En la presente invención se agrega una secuencia de ácido nucleico artificial (SEQ. ID. NO: 68) a la muestra en la forma de plásmido recombinante (Ejemplo 6). En la presente invención la detección del control interno se lleva a cabo en paralelo con la detección de hibridación de ADN de HPV, y solamente el desarrollo de los substratos es por separado. La sonda es digitoxigenina etiquetada (SEQ. ID. NO: 69), y se puede detectar con anticuerpo de anti-digitoxigenina conjugada de fosfatasa alcalina. Sin embargo, también son adecuadas otras técnicas de detección para la detección de sonda interna. Pero la detección del control interno se puede llevar a cabo también sobre la base de diferencias de movilidad, usando electroforesis en gel de agarosa u otra técnica adecuada. Para la amplificación y la detección del ADN de HPV el método de la presente invención es adecuado para producir una unidad armonizada de los reactivos (paquete). En esta forma el paquete puede contener todos los siguientes reactivos, o cualquier combinación de ellos, y otros reactivos: bases, mezcla de bases, amortiguadores, polimerasa termoestable, ADN de HPV de control positivo, ADN de no HPV, ADN de control interno, sondas o mezcla de sondas, conjugado de anticuerpo-enzima. La descripción de secuencias de las bases y sondas de la invención es solamente ilustrativa. Muchas variantes de ambas de las sondas genérica y específica de tipo pueden diseñarse usando la región genómica de HPV genérica o específica de tipo, para aquellos expertos en la técnica, por lo tanto las variaciones hasta donde pueden ser seleccionadas forman la región genómica de la invención, están cubiertas por el alcance de la presente invención. La invención se presenta con más detalle en los siguientes ejemplos. Aunque el método, que es la base de la invención es aplicable a la amplificación de cualquier genoma de HPV, en los siguientes ejemplos solamente se usan los genomas de HPV genital, los cuales son de la mayor importancia médica. Se debe notar que los ejemplos son ilustrativos solamente y no se deben construir como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Síntesis de Bases de Oliqonucleótidos Las bases de oligonucleótidos usadas en el método de la invención fueron de fuentes comerciales (IDT, EUA). Las bases se sintetizaron con un grupo 5' amino. Se usó NHS-éster para etiquetado de biotina, fluoresceína y digitoxigenina. Los nucleótidos etiquetados fueron purificados con HPLC. EJEMPLO 2 Procesamiento de los Especímenes, Preparación de ADN Se tomaron muestras por ginecólogos usando citobrocha, las muestras se transportan en solución de PBS (salina amortiguada con fosfato 10 mM, pH=7.4, Sigma, NaCI 138 mM, KCI 2.7 mM). El pretratamiento de las muestras se hizo en tubos de muestreo: antes de lisado, las muestras se centrifugaron (2000 g, 10 minutos) se desecharon los sobrenadantes y se agregó 1 mi de solución de PBS, se agitaron, se centrifugaron otra vez, se desechó el sobrenadante. Al final del proceso, se agregaron 250 µ? de solución de lisado a las muestras (0.5 mg/ml de proteinasa K, TRIS-HCI 0.01 M pH = 8, EDTA 0.001 M pH = 8, en agua destilada), dicha solución contiene el control interno de la prueba de HPV (SEQ. ID. NO: 68), y se agitó e incubó durante 30 minutos a 56°C. A partir de este punto todas las tareas de manejo de líquidos se llevaron a cabo en un robot TECAN RSP150.,:. se agregaron 200 µ? de solución de aglutinamiento (GUSCN, 5.5 M, EDTA 20 mM, TRIS-HCI 10 m pH = 6.5, ditiotreitol 65 mM, sílice 40 g/l, SIGMA Cat. No.: 28.851-3, agua destilada), y la sílice se separó mediante filtración al vacío de los componentes solubles. Se usó otra vez la filtración para lavar la sílice dos veces con 200 µ? de solución de aglutinante sin sílice (GUSCN, 5.5 M, EDTA 20 mM, TRIS-HCI 10 mM pH=6.5, ditiotreitol 65 mM, agua destilada), y se usó solución de lavado 200 µ? dos veces (25% de alcohol isopropílico, 25% de etanol al 96%, 50% de agua destilada, NaCI 0.1 M), finalmente se aplicó etanol al 96% 200 µ?. Después de secar al aire la sílice, el ADN se eluyó en 200 µ? de solución de TRIS 10 mM pH = 8.0. El ADN eluido se almacenó congelado a -20°C hasta uso posterior.

EJEMPLO 3 Descripción General de la Detección del HPV Amplificación El volumen total de reacción fue de 25 µ?, incluyendo los siguientes componentes: 10 µ? de ADN, 2.5. µ? de amortiguador de polimerasa 10X (concentración final: TRIS-HCI 10 mM (pH=9.0), KCI 50 mM, 0.1% Tritón X-100 (Promega)), MgCI2 2 mM, 250 µ? de cada dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP), 4 µ? de una mezcla de bases: SEQ. ID. NO: 35, 37-40, 73-75, y 1U de polimerasa de ADN Taq (Promega). La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico de PCR GeneAmp 9700, con los siguientes parámetros: Ciclo 1: 4 minutos a 95°C; Ciclos 2-40: 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 48°C y 45 segundos a 72°C; Ciclo 41: 3 minutos a 72°C Hibridación y Detección La hibridación se llevó a cabo en fase sólida. 24 horas antes se recubrieron las placas (Costar) de poliestireno de 96 pozos, negras con estreptavirina (0.02 mg/ml de estreptavirina en solución de PBS). Las placas se incubaron a temperatura ambiente y 24 horas más tarde las placas se lavaron dos veces con 250 µ? de solución de lavado [TRIS 25 mM pH = 7.5, NaCI 125 mM, MgCI2 20 mM, 3% Tween-20]. 20 µ? del producto de la reacción de PCR se diluyeron con 140 µ? de agua destilada, y 5 µ? de esta solución se mezclaron con 45 µ? de amortiguador de aglutinante [TRIS 25 mM pH = 7.5, NaCI 125 mM, EDTA-Na2 5 mM, solución de Denhardt 5X, 0.1% Tween-20] y se vertió en los pozos de la placa recubierta de estreptavidina. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación constante. Después se agregaron 50 µ? de amortiguador de elución [NaOH 100 mM, NaCI 300 mM] a la mezcla, se incubó por 3 minutos a temperatura ambiente y las placas se lavaron 3 veces con solución de lavado 250 µ? [TRIS 25 mM pH = 7.5, NaCI 125 mM, MgCI2 20 mM, 3% Tween-20]. Después del lavado se agregaron 50 µ? de amortiguador de hibridación (5xSSC (citrato de Na 0.3 M pH = 7, NaCI 3 M) en solución de Denhardt 1x, 0.1% SDS], sondas etiquetadas que contienen fluoresceína (5 nM por sonda) a los pozos. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 50°C con agitación constante y se lavó 6 veces con 250 µ? de solución de lavado de alta astringencia [0.05 x SSC, 0.3% Tween-20]. Después de esto se agregaron 50 µ? de amortiguador de conjugación [TRIS 25 mM pH = 7.5, NaCI 125 mM MgCI2 2 mM, 0.3% Tween-20, 1% BSA], que contiene anticuerpo anti-fluorescencia-POD (Roche) (0.0015 E/reacción) a la reacción. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación y se lavaron 6 veces con 250 µ? de solución de lavado de alta astringencia [TRIS 25 mM pH = 7.5, NaCI 125 mM MgCI2 20 mM, 0.3% Tween-20]. Para desarrollo, se agregaron 135 µ? de solución de substrato (5 volúmenes [ácido hidroxifenil-propionico (HPPA) 45 mM, .disuelto en amortiguador TRIS-HCI 0.1 M pH = 9.0], + 1 volumen [H202 0.6 g/l en amortiguador de citrato-fosfato 20mM]). Para detener la reacción se agregaron 55 µ? de solución de alto [0.75 M glicina pH = 10.3] a la mezcla de reacción después de 20 minutos. Se midió la señal fluorescente con placa-fluorómetro SpectraMax a 324/410 nm. Las muestras se consideraron positivas si su valor fue mayor que 3 veces el promedio de 3 valores de muestra de control negativo paralelos.

EJEMPLO 4 Estudio Comparativo de Amplificación Las muestras fueron pinchadas a 10 ng/reacción por plásmidos que contienen región HPV L1 clonada de diferentes genotipos y usada para amplificar y detectar ADN de HPV por el método de la invención. La reacción e hibridación de PCR se llevó a cabo de acuerdo con la descripción del Ejemplo 3, con la diferencia de que la composición de las bases se cambió. La reacción sin L1F2 (SEQ. ID. NO: 37) no resultó en amplificación con el genotipo HPV 35, mientras que usando la base L1F2 resultó en la detección efectiva del genotipo HPV 35.

EJEMPLO 5 Detección de Varios Genotipos de HPV Se pincharon muestras en 10 ng/reacción por plásmidos que contienen región HPV L1 clonada de diferentes genotipos y se usaron para amplificar y detectar ADN de HPV mediante el método de la invención. La reacción e hibridación de PCR se llevó a cabo de acuerdo con la descripción del ejemplo 3. Se intentaron la amplificación y tipificación de los siguientes genotipos de HPV: 1-24, 26-42, 45, 47-68, 72-74, 76-77, 86. La amplificación de los siguientes genotipos se demostró con electroforesis en gel de agarosa: 3, 6-7, 10-11, 13-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-36, 39-40, 42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72. Usando la mezcla de las sondas de hibridación específica de género SEQ. ID. NO: 41-49 (usando las condiciones descritas en el Ejemplo 3) fueron detectables los siguientes genotipos: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Los datos muestran que una porción de los genotipos puede ser detectada solamente mediante hibridación, lo cual no es sorprendente, puesto que la hibridación es aproximadamente de 10 a 100 veces más sensible que la electroforesis en gel de agarosa. Se puede ver también de los datos, que la hibridación específica de género detectó todos los genotipos positivos de electroforesis en gel de agarosa indicando su verdadera naturaleza específica de género.

EJEMPLO 6 Detección del Tipo HPV-35 Se pincharon muestras en 10 ng/reacción por plásmidos que contienen región HPV L1 clonada de diferentes genotipos y se usaron para amplificar y detectar ADN de HPV mediante el método de la invención. La reacción e hibridación de PCR se llevó a cabo de acuerdo con la descripción del ejemplo 3. La sonda de hibridación fue el oligonucleótido diseñado para el genotipo de HPV: 35 (SEQ. ID. NO: 58) se intentó la detección de amplicones de los siguientes genotipos: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. La sonda detectó solamente el amplicón de genotipo HPV 35 correspondiente.

EJEMPLO 7 Detección de HPV con Control Interno La detección de las muestras, preparadas de acuerdo con el Ejemplo 2 se llevó a cabo de acuerdo con el Ejemplo 3, con la diferencia de que se usó la sonda del control interno etiquetado con digitoxigenina (su cantidad fue la misma que en las sondas específicas de tipo) con la sondas específicas de tipo y los anticuerpos anti-fluoresceína-POD y anti-alp-ALP [1:2000, Jackson Immuno Research] estuvieron presentes simultáneamente en el paso de conjugación. Después del desarrollo de la reacción de POD (ver Ejemplo 2), se llevó a cabo el desarrollo de ALP de acuerdo con lo siguiente: la solución de sustrato fue 6.25 mg/100 mi de fosfato de 4-metil-umbeliferil en amortiguador de TRIS 100 mM pH = 9.0, MgCI2 0.5 mM. Después del desarrollo del HPPA, se lavó la placa de microtitulación una vez con [TRIS 25 mM pH = 7.5, NaCI 125 mM MgCI2 20 mM, 0.3% Tween-20], y se agregaron 150 µ? de solución de sustrato a cada uno de los pozos de reacción. Después de 30 minutos de incubación, se midió la señal fluorescente con placa-fluorómetro SpectraMax a 355/460 nm. Las muestras se consideraron positivas si su valor fue mayor que tres veces el promedio de 3 valores de muestra de control negativo paralelas. Las sondas específicas de tipo detectaron los tipos adecuados solamente. La detección del control interno fue positivo en cada reacción, excepto en aquellas reacciones donde ocurrió fuerte competencia entre la amplificación de HPV y el control interno. No hubo reacción inhibida (ADN de HPV o ADN de control interno amplificado en todas las muestras). El control interno excluyó adecuadamente la posibilidad de resultados negativos falsos.

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Bases de consenso para el gen L1 del virus del papiloma humano (HPV), en donde dichas bases consisten de una de las siguientes secuencias de nucleótidos: SEQ. ID. NO: 37 a 40 o SEQ. ID. NO: 70 a 72.

2. Bases específicas de tipo para el gen L1 del virus del papiloma humano (HPV), en donde dichas bases consisten de una de las siguientes secuencias de nucleótidos: SEQ. ID. NO: 1 a 36.

3. Mezcla de bases de amplificación, en donde dicha mezcla consiste de las bases L1C1, L1C2, L1D2 nueva (SEQ. ID. NOS: 73 a 75), SEQ. ID. NOS: 37 A 40 Y SEQ. ID. NO: 35, y opcionalmente una o más bases seleccionadas del grupo que consiste de SEQ. ID. NOS: 70 A 72, SEQ. ID. NOS: 1 A 34 y 36.

4. Uso de la mezcla de bases de la reivindicación 3 para la amplificación de los genotipos 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 y 77 del virus del papiloma humano.

5. Amplicon que puede ser preparado mediante amplificación usando la mezcla de bases de la reivindicación 3, excepto los amplicones de tipos de HPV-6-, -11, -16, -18, -31, -33, -42, -52, y -58.

6. Amplicon de acuerdo con la reivindicación 5, cuya secuencia de nucleótidos incluye una de las secuencias de las secuencias SEQ. ID. NO: 112 a 120.

7. Región genómica de los amplicones de genotipos 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 y 77 que es un segmento característico de los amplicones que se pueden preparar mediante amplificación usando la mezcla de bases de la reivindicación 3, estirando el extremo 3' del amplicon desde el bp -80 hasta el bp -30, y una característica de segmento diverso de los genotipos individuales de HPV.

8. La región genómica de la reivindicación 7, la cual tiene una de las secuencias listadas a continuación: SEQ. ID. NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111.

9. Segmento genómico del amplicon que puede ser preparado mediante amplificación usando la mezcla de bases de la reivindicación 3, estirando desde el extremo 3' del amplicon desde el bp -150 hasta el bp -105, segmento de consenso para HPV.

10. Segmento genómico de la reivindicación 9, el cual tiene una de las secuencias listadas a continuación: SEC. ID. NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.

11. Una sonda de hibridación, la cual específica de genotipo de HPV, y se hibridiza con una de las secuencias de la reivindicación 8.

12. Una sonda de hibridación como se reivindicó en la reivindicación 11, en donde dicha sonda es complementaria para una de las secuencias de la reivindicación 8.

13. Una sonda de hibridación de la reivindicación 11 o reivindicación 12, la cual tiene una de las secuencias listadas a continuación: SEQ. ID. NO: 50 a 67.

14. Una sonda o base de hibridación, la cual es sonda o base de consenso de HPV, y se hibridiza con una de las secuencias de la reivindicación 10.

15. Una sonda de hibridación como se reivindicó en la reivindicación 14, en donde dicha sonda es complementaria para una de las secuencias de la reivindicación 10.

16. Una sonda de hibridación de la reivindicación 14 o reivindicación 15, la cual tiene una de las secuencias listadas a continuación: SEQ. ID. NO: 41 a 49.

17. Una sonda de hibridación como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, la cual es ADN, ARN o APN.

18. Método para detectar uno o más genotipos de HPV en una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) Preparar uno o más amplicones que se pueden obtener usando la mezcla de bases de la reivindicación 3 a partir de moléculas de ácido nucleico extraído de la muestra biológica; y b1) Hibridizar el amplicon obtenido en (a) bajo condiciones astringentes con una sonda específica de género de HPV; y/o b2) Hibridizar el amplicon obtenido en (a) bajo condiciones astringentes con una sonda de hibridación especifica de genotipo.

19. El método como se reivindicó en la reivindicación 18, en donde dicha sonda específica de género es una sonda como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

20. El método como se reivindicó en la reivindicación 18, en donde dicha sonda de hibridación específica de genotipo es una sonda como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde se detectan los grupos de genotipo de HPV de bajo y alto riesgo.

22. El método como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, que comprende además la detección de un oligonucleótido sintético como un control interno.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la secuencia SEQ. ID. NO: 68 se usa como el control interno, y para detectar ésta, se usa SEQ. ID. NO: 69 como sonda de hibridación.

24. Un paquete para detectar y tipificar HPV, la cual incluye: i) bases de la reivindicación 1 o reivindicación 2; y/o la mezcla de bases de la reivindicación 3; ii) opcionalmente base de control interno; iii) sondas de hibridación de la reivindicación 11 o 14; y iv) opcionalmente sondas de hibridación para detectar el control interno.