JP2009524600A - 固液組成物 - Google Patents

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Abstract

整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含むナノ構造が開示される。コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。液体およびナノ構造を含む液体組成物もまた開示される。

Description

本発明は固液組成物に関連し、より具体的には、ナノ構造、ならびに、このナノ構造を有し、かつ、多数の特徴的な物理的特性、化学的特性および生物学的特性によって特徴づけられる液体組成物に関連する。
ナノサイエンスは、物質の小さい粒子の科学であり、現代科学における最も重要な先端研究領域の１つである。このような小さい粒子は、材料を構成する粒子がナノスケールになるとき、材料のすべての性質（例えば、その融点ならびにその電気的性質および光学的性質など）が変化するので、基礎的な観点から注目されている。新しい性質とともに、技術的開発および商業的開発のための新しい機会が到来し、ナノ粒子の様々な応用が、ミクロエレクトロニクスおよびナノエレクトロニクス、ナノ流体素子力学、被覆および塗料、ならびに生物工学のように多様な分野で示されているか、または、提案されている。
例えば、産業および学術での多くの試みが現在、マイクロ電子機械システム（ＭＥＭＳ）として一般に知られている、電気的、機械的および／または光学的／電気光学的な構成成分を組み合わせる一体化されたマイクロデバイスまたはシステムの開発に向けられている。ＭＥＭＳは、集積回路バッチ加工技術を使用して加工され、サイズがマイクロメートルからミリメートルにまで及び得る。このようなシステムは、ミクロスケールでの検知、制御および作動が可能であり、また、マクロスケールでの効果を生じさせるために、個々に、またはアレイで機能させることができる。
生物工学の領域では、ナノ粒子は、生物学的分子の実空間での構造および機能をプローブするためのナノメートルスケールの装置においてしばしば使用される。補助的なナノ粒子（例えば、アルギン酸カルシウムのナノ球体など）もまた、遺伝子トランスフェクションプロトコルを改善することを助けるために使用されている。
金属ナノ粒子では、伝導電子の共鳴した集団的振動（これはまた、粒子プラズモンとして知られている）が様々な光学的な場によって励起される。粒子プラズモンの共鳴振動数は、主に、金属の誘電関数、周りの媒体、および、粒子の形状によって決定される、共鳴は、金属粒子の表面および金属粒子の表面の近くにおいて限定された局所的な場の狭い分光的に選択的な吸収および強化を生じさせる。レーザー波長が粒子のプラズモン共鳴振動数に合わせられるとき、ナノ粒子近傍での局所的な電場が数桁ほど強化され得る。
従って、様々なナノ粒子が、例えば、生物学的組織サンプルにおける個々の分子を従来の蛍光標識化と類似する様式で同定するために、電磁放射線を細胞または分子の近傍において吸収または再収束させるために使用される。
ナノ粒子の特別な放射線吸収特性はまた、太陽エネルギー変換の領域でも利用されている。この場合、セレン化ガリウムのナノ粒子が、可視領域において電磁放射線を選択的に吸収し、その一方で、スペクトルの赤方端での電磁放射線を反射し、それにより、変換効率を著しく増大させるために使用されている。
ナノ科学が役割を果たし得るさらなる領域は熱移動に関連する。産業での熱移動要求に集中するかなりの以前の研究開発にもかかわらず、冷却能力における大きな改善は、従来の流体の熱移動特性における基本的な限界のために妨げられている。固体形態における材料は、流体の熱伝導性よりも数桁大きい熱伝導性を有することが広く知られている。従って、懸濁された固体粒子を含有する流体は、従来の熱移動流体と比較して、著しく高まった熱伝導性を示すことが期待される。
低い熱伝導性は、多くの産業的適用において要求されるエネルギー効率的な熱移動流体の開発における大きな制限である。この制限を克服するために、ナノ流体と呼ばれる新しい種類の熱移動流体が開発されている。このようなナノ流体は、典型的には、相当量のナノ粒子が液体（例えば、水、オイルまたはエチレングリコールなど）に懸濁される液体組成物である。得られるナノ流体は、分散されたナノ粒子を含まない液体と比較して、極めて大きい熱伝導性を有する。
粒子を含有する分散物の効果的な熱伝導性の数多くの理論的研究および実験的研究が、マックスウエルの理論的成果が１００年以上前に発表されてからこれまで行われてきている。しかしながら、懸濁物の熱伝導性の以前の研究はすべて、ミリメートルサイズの粒子またはミクロンサイズの粒子を含有する懸濁物に限られている。マックスウエルのモデルは、球状粒子を含有する懸濁物の効果的な熱伝導性が固体粒子の体積割合とともに増大することを示している。懸濁物の熱伝導性が粒子の表面積対体積の比率とともに増大することもまた知られている。表面積対体積の比率は、１０ｎｍの直径を有する粒子については、１０ｍｍの直径を有する粒子の場合よりも１０００倍大きいので、大きい粒子の粒子形状を変化させることによって得ることができるよりもはるかにより大きい、効果的な熱伝導性での劇的な改善が、溶液中の粒子サイズを小さくすることの結果として期待される。
従来、ナノ粒子は、アーク放電、レーザーエバポレーション、熱分解プロセス、プラズマの使用、ゾル・ゲルの使用などを適用することによって分子レベルから合成される。広く使用されているナノ粒子はフラーレンカーボンナノチューブであり、これは、約１μｍ未満の直径を有する物体として広く定義される。そのような用語のより狭い意味では、軸と実質的に平行する炭素の炭素六角形の網状シートを有する物質がカーボンナノチューブと呼ばれ、また、非晶質炭素がカーボンナノチューブを取り囲んでいる物質もまた、カーボンナノチューブのカテゴリーに含まれる。
誘電性コアと、導電性シェル層とを有するナノ粒子であるナノシェルもまた、この分野では知られている。カーボンナノチューブと同様に、ナノシェルもまた、例えば、金属の原子を誘電性基板上に結合することによって、分子レベルから製造される。ナノシェルは、上述の光学場強化現象を利用することが所望される適用において特に有用である。しかしながら、ナノシェルは、近赤外波長の適用の場合にだけ有用であることが知られている。
分子レベルから製造されたナノ粒子は、さらなる処理が製造プロセスにおいて伴わない限り、全体を特徴づける物理的特性を失い易いことが認められている。ナノ粒子が既に要求されている潜在的な適用の上記の非網羅的列挙から理解され得るように、ナノ粒子を製造するときに考慮しなければならない物理的特性は非常に多様である。特に、より大きいミクロサイズの粒子の物理的性質を保持するナノ粒子はこの上なく重要である。
本発明が使用される多様な分野には、分子生物学に基づく研究および診断の分野が含まれる。
この１０年以上にわたって、生物学的研究および遺伝学的研究は、生命の分子的基礎を理解することに大変革をもたらしているので、遺伝子の時間的および空間的な発現が生命プロセスのすべてを担っていることがますます明らかになっている。科学は、１つの遺伝的欠陥が、従来から認識されている遺伝性障害をどのように引き起こしているかを理解することから、多数の遺伝的欠陥の相互作用の重要性をより複雑な障害の環境的要因とともに認識することに進歩している。
この理解は、核酸増幅技術の助けをかりて可能になっている。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、遺伝的障害の診断、臨床サンプルにおける病原性生物の核酸配列の検出、法廷サンプルの遺伝子同定、活性化されたガン遺伝子および他の遺伝子における変異の分析などをはじめとする様々な分野で広範囲にわたる適用が見出されている。加えて、ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの分子クローニングおよび分析における様々な課題を行うために使用されている。これらの課題には、クローニングまたはプローブとして使用するための特定のＤＮＡ配列の作製、遺伝子マッピングのためのＤＮＡセグメントの検出、ｃＤＮＡの特定のセグメントを増幅することによる発現配列の検出および分析、少量のｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製、配列決定のための多量のＤＮＡの作製、変異の分析、ならびに、染色体クローリングのためであることが含まれる。ＰＣＲは、他の核酸増幅技術と同様に、分子生物学の多くの他の局面でのますます増大する適用が見出されることが予想される。
広く知られているように、ＤＮＡ鎖は、それらの塩基（アデニン、チミン、シトシンおよびグアニン、これらはそれぞれ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇとして表される）によって決定されるように、４つの異なるヌクレオチドから構成される。ＤＮＡ鎖のそれぞれは、ＡがＴと対形成し、かつ、ＣがＧと対形成する相同的な鎖と一致する。タンパク質をコードする特定の塩基配列が遺伝子と呼ばれる。ＤＮＡは、多くの場合、タンパク質組成を担う領域（エキソン）と、タンパク質組成に直接には寄与しない領域（イントロン）とにセグメント化されている。
ＰＣＲ（これは米国特許第４６８３１９５号に一般的に記載される）は、既知配列の２つの領域の間に存在する標的ＤＮＡフラグメントのインビトロ増幅を可能にする。二本鎖の標的ＤＮＡは、ＤＮＡ鎖を引き離すために最初に融解され、その後、オリゴヌクレオチドがテンプレートＤＮＡにアニーリングさせられる。プライマーは、相補的であり、従って、所望の標的フラグメントの５’境界および３’境界において所望される、事前に選択された位置に特異的に結合するような方法で選ばれる。
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素をプライマー伸張として知られているプロセスにおいて使用して新しい相補的なＤＮＡ鎖を合成するためのプライマーとして役立つ。プライマーの相互に対する向きは、各プライマーからの、５’から３’への伸張生成物が、十分に遠方にまで伸張したとき、もう一方のオリゴヌクレオチドに対して相補的である配列を含有するようにされる。従って、それぞれの新しく合成されたＤＮＡ鎖が、もう一方のオリゴヌクレオチドをそのプライマーとして用いて始まる別のＤＮＡ鎖を合成するためのテンプレートになる。（ｉ）融解、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、および（ｉｉｉ）プライマー伸張からなるサイクルを多数回繰り返すことができ、これにより、プライマー間の標的フラグメントの指数的増幅がもたらされる。
先行技術のＰＣＲ技術では、反応を、ＤＮＡポリメラーゼの補因子を含有する反応緩衝液において行わなければならない。ＤＮＡポリメラーゼの補因子は、酵素が活性のために依存する非タンパク質性の化合物である。補因子が存在しない場合、酵素は触媒的に不活性である。知られている補因子には、マンガンまたはマグネシウムを、二価カチオンが水溶液中に放出されるような形態で含有する化合物が含まれる。典型的には、これらの補因子はマンガン塩またはマグネシウム塩（例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩など）の形態である。
低濃度の補因子を伴う緩衝液の使用は、誤ったプライマー化作用および非標的配列の増幅をもたらす。逆に、高すぎる濃度はプライマーのアニーリングを低下させ、非効率的なＤＮＡ増幅をもたらす。加えて、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼなど）はマグネシウム依存性である。従って、マグネシウムイオンの精密な濃度が、ポリメラーゼの効率および反応の特異性をともに最大にするために必要である。
長年にわたって、多くの試みが、ＰＣＲを、とりわけ、プライマーの長さおよび配列、アニーリング温度、増幅物の長さ、緩衝液の組成、反応補充物などを適正に選択することによって最適化するために行われている。ＰＣＲの効率を決定する変数の数は極めて大きいので、プロセスに関係する成分のすべてについて最適な１組のパラメーターを見つけることは極めて困難である。
下記の節でさらに詳述されるように、核酸増幅技術の効率を、ナノ構造をその中に取り込む液体組成物の助けを借りて著しく改善することができる。
本発明の１つの態様によれば、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含むナノ構造が提供され、この場合、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
本発明の別の態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物が提供される。液体組成物は、好ましくは、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられる。
本発明の別の態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、水と比較して、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる液体組成物が提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
本発明の別の態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、ナノ構造がヒドロキシアパタイトから配合され、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある液体組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、水と比較して高まった緩衝能力によって特徴づけられる液体組成物が提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
本発明の別の態様によれば、物質を溶解または分散する方法であって、物質を、該物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む方法が提供され、ナノ構造は、該液体の整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、物質は、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物からなる群から選択される。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、物質は医薬用薬剤である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、医薬用薬剤は、治療剤、化粧剤または診断剤である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、組成物は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、接触の前に、溶媒に薬剤を溶解または分散することを含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、接触の後で、溶媒に薬剤を溶解または分散することを含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は極性溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は非極性溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は有機溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、有機溶媒はエタノールまたはアセトンである。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は非有機溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、溶解または分散の後で溶媒を蒸発させることを含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、蒸発を熱または圧力によって行う。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、液体組成物が最初に表面と接触し、その後、所定の洗浄プロトコルによって洗浄されるとき、組成物の電気化学的形跡が表面に保たれるように設計される。
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、細菌コロニー拡大速度の増大を容易にする液体組成物が提供される。
本発明のなお別の態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ファージ−細菌またはウイルス−細胞の相互作用の増大を容易にする液体組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、液体自体のゼータ電位よりも実質的に大きいゼータ電位によって特徴づけられる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ナノ構造のそれぞれが、液体の比重よりも小さい比重、または、液体の比重と等しい比重を有する液体組成物が提供される。
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ナノ構造は、液体組成物が着色溶液と混合されたとき、着色溶液のスペクトル特性が実質的に変化するように設計される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、液体組成物が着色溶液と混合されたとき、着色溶液のスペクトル特性が実質的に変化するようにナノ構造が設計される液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、高分子が固相マトリックスに結合することを高める液体組成物が提供される。
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、固相マトリックスは親水性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固相マトリックスは疎水性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固相マトリックスは疎水性領域および親水性領域を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子は抗体である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子は少なくとも１つの炭水化物親水性領域を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子は少なくとも１つの炭水化物疎水性領域を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子はレクチンである。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子はＤＮＡ分子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子はＲＮＡ分子である。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ＤＮＡ分子を少なくとも部分的に解きほぐすことができる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、それにより、それぞれのナノ構造が、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープが定常的な物理的状態にある、生体材料への細菌接着を変化させることができる液体組成物が提供される。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の組成物は生体材料に対するその付着を低下させる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生体材料は、プラスチック、ポリエステルおよびセメントからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生体材料は、手術により対象に埋め込むために好適である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細菌の付着は表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の付着である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、表皮ブドウ球菌の付着は、表皮ブドウ球菌ＲＰ６２Ａの付着、表皮ブドウ球菌Ｍ７の付着、および、表皮ブドウ球菌（ＡＰＩ−６７０６１１２）の付着からなる群から選択される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、酵素活性を安定化させることができる液体組成物が提供される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、酵素活性は非結合型酵素の活性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素活性は結合型酵素の活性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素活性は、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素の活性である。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、樹脂に対する核酸の親和性結合を改善することができ、また、ゲル電気泳動分離を改善することができる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、カラムの容量を増大させることができる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、核酸増幅プロセスの効率を改善することができる液体組成物が提供される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、核酸増幅プロセスはポリメラーゼ連鎖反応である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はリアルタイプポリメラーゼ連鎖反応である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は、前記ポリメラーゼ連鎖反応のＤＮＡポリメラーゼの触媒活性を高めることができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はマグネシウムを含まない。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はマンガンを含まない。
本発明のなおさらなる態様によれば、ポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供され、このキットは、別個の包装において、（ａ）熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ、および（ｂ）本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含む液体組成物を含む。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも１つのｄＮＴＰを含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも１つのコントロールテンプレートＤＮＡを含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも１つのコントロールプライマーを含む。
本発明のなおさらなる態様によれば、（ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、（ｂ）二本鎖ＤＮＡ検出分子と、（ｃ）本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含む、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供される。
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、二本鎖ＤＮＡ検出分子は、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、二本鎖ＤＮＡ検出分子は、臭化エチジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−１、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＢＲ ＧｏｌｄおよびＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、二本鎖ＤＮＡ検出分子は、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子は、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ローダミンおよびＢＯＤＩＰＹ−ＦＩからなる群から選択される。
本発明のなおさらなる態様によれば、ＤＮＡ配列を増幅する方法であって、（ａ）本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を有する液体組成物を提供すること、および（ｂ）液体組成物の存在下、ＤＮＡ配列に対する複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行し、それにより、ＤＮＡ配列を増幅することを含む方法が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を有する液体組成物であって、少なくとも１つの高分子の操作を固体支持体の存在下で可能にすることができる液体組成物が提供される。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、高分子はポリヌクレオチドである。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、固体支持体はガラスビーズを含む。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ガラスビーズは直径が約８０ミクロン〜１５０ミクロンの間である。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、操作は化学反応によって達成される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化学反応は、増幅反応、連結反応、形質転換反応、転写反応、逆転写反応、制限消化およびトランスフェクション反応からなる群から選択される。
本発明のさらに別の態様によれば、液体と、ビーズと、ナノ構造とを含み、ビーズの存在下での少なくとも１つの高分子の操作を可能にすることができる液体組成物が提供され、それにより、それぞれのナノ構造が、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、この場合、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部はガス状状態にある。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は少なくとも１つのさらなるナノ構造とクラスター形成することができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、少なくとも１つのさらなるナノ構造との遠距離の相互作用を維持することができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部は液体の分子と同一である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造の濃度は１リットルあたり１０２０個未満のナノ構造であり、より好ましくは、１リットルあたり１０１５個未満のナノ構造である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はその間での遠距離の相互作用を維持することができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コア材料は、強誘電性コア材料、強磁性コア材料および圧電性コア材料からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コア材料は結晶性コア材料である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、液体は水である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、組成物と固体表面との間での接触角が、液体と固体表面との間での接触角よりも小さいように設計される。
本発明のさらなる態様によれば、液体組成物を固体粉末から製造する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）固体粉末を加熱し、それにより、加熱された固体粉末を提供すること、（ｂ）加熱された固体粉末を冷液体に浸すこと、および（ｃ）工程（ｂ）と実質的には同時に、冷液体および加熱された固体粉末を電磁放射線によって照射することを含み、電磁放射線が、ナノ構造が固体粉末の粒子から形成されるように選択された振動数によって特徴づけられる。
本発明のさらなる態様によれば、液体組成物をヒドロキシアパタイトから製造する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）ヒドロキシアパタイトを加熱し、それにより、加熱されたヒドロキシアパタイトを提供すること、（ｂ）加熱されたヒドロキシアパタイトを冷液体に浸すこと、および（ｃ）工程（ｂ）と実質的には同時に、冷液体および加熱されたヒドロキシアパタイトを電磁放射線によって照射することを含み、電磁放射線が、ナノ構造がヒドロキシアパタイトの粒子から形成されるように選択された振動数によって特徴づけられる。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ナノ構造はヒドロキシアパタイトから配合される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ヒドロキシアパタイトはミクロサイズの粒子を含む。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、固体粉末はミクロサイズの粒子を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ミクロサイズの粒子は結晶性粒子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は結晶性のナノ構造である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固体粉末は、強誘電性物質および強磁性物質からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固体粉末は、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固体粉末は、鉱物、セラミック物質、ガラス、金属および合成ポリマーからなる群から選択される物質を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電磁放射線は高周波範囲である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電磁放射線は連続波の電磁放射線である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電磁放射線は変調電磁放射線である。
本発明は、数多くの特徴的な物理的特性、化学的特性および生物学的特性によって特徴づけられるナノ構造、および、そのようなナノ構造を有する液体組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１は本発明の好ましい実施形態によるナノ構造の概略図である。
図２ａは本発明の好ましい実施形態による、液体組成物を製造する方法の流れ図である。
図２ｂは本発明の好ましい実施形態による、ＤＮＡ配列を増幅する方法の流れ図である。
図３は本発明のナノ構造のＴＥＭ画像である（図３ａ〜図３ｅ）。
図４は本発明の液体組成物に対する色素の影響を示す。
図５ａ〜図５ｂは液体組成物に対する高ｇ遠心分離の影響を示し、図５はチューブの下部部分の記録されたシグナルを示し、図５ｂはチューブの上部部分の記録されたシグナルを示す。
図６は本発明の液体組成物について行われたｐＨ試験の結果を示す（図６ａ〜図６ｃ）。
図７は本発明の液体組成物の吸収スペクトルを示す。
図８は本発明の液体組成物のζ電位測定の結果を示す。
図９は本発明の液体組成物の存在下（左側）およびコントロール媒体の存在下（右側）でのバクテリオファージ反応を示す（図９ａ〜図９ｂ）。
図１０はコントロール液体および本発明の液体組成物の溶菌表面積の比較を示す。
図１１は本発明の液体組成物の存在下（左側）およびコントロール媒体の存在下（右側）での１００の日常的試験希釈でのファージ型決定濃度を示す。
図１２は発明の液体組成物およびコントロール媒体の、時間を関数とする光学的濃度を示す。
図１３はマイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられた実験における粘着物産生性の表皮ブドウ球菌の光学的濃度を示す（図１３ａ〜図１３ｃ）。
図１４は異なるマイクロタイタープレートに対する粘着物付着の１５回の反復実験を表すヒストグラムである。
図１５は同じマイクロタイタープレートにおける本発明の液体組成物およびコントロールに対する粘着物付着の違いを示す。
図１６は電気化学的析出実験設定を示す（図１６ａ〜図１６ｃ）。
図１７は本発明の液体組成物（図１７ａ）およびコントロール（図１７ｂ）の電気化学的析出を示す。
図１８は本発明の液体組成物と３０分の期間にわたって接触していたセルにおける逆浸透（ＲＯ）水の電気化学的析出を示す。
図１９は本発明の液体組成物（図１９ａ）およびコントロール媒体（図１９ｂ）についての枯草菌コロニー成長の結果を示す。
図２０は原料粉末を伴う水（図２０ａ）、逆浸透水（図２０ｂ）および本発明の液体組成物（図２０ｃ）についての枯草菌コロニー成長の結果を示す。
図２１は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２１ａ）、ｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２１ｂ）、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２１ｃ）およびｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２１ｄ）に対する標識抗体および非標識抗体の結合を示す。
図２２は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２２ａ）、ｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２２ｂ）、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２２ｃ）およびｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２２ｄ）に対する標識抗体の結合を示す。
図２３は本発明の液体組成物を使用し、また、緩衝液を使用したときの、ｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２３ａ）、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２３ｂ）、ｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２３ｃ）およびｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２３ｄ）に対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体の結合を示す。
図２４は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２４ａ）、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２４ｂ）、ｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２４ｃ）およびｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２４ｄ）に対する、３７℃で２時間のポストインキュベーションでの標識抗体の結合を示す。
図２５は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２５ａ）、ｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２５ｂ）、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２５ｃ）およびｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２５ｄ）に対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。
図２６は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２６ａ）、ｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２６ｂ）、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２６ｃ）およびｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２６ｄ）に対する、室温で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。
図２７ａ〜図２７ｂは、本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液について、リン酸塩洗浄緩衝液を使用したときの、標識抗体および非標識抗体の結合結果（図２７ａ）と、標識抗体のみの結合結果（図２７ｂ）とを示す。
図２７ｃ〜図２７ｄは、本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液について、ＰＢＳ洗浄緩衝液を使用したときの、標識抗体および非標識抗体の結合結果（図２７ｃ）と、標識抗体のみの結合結果（図２７ｄ）とを示す。
図２８は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレートに対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合結果（図２８ａ）と、標識抗体のみの結合結果（図２８ｂ）とを示す。
図２９は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、酢酸塩緩衝液（図２９ａ）、炭酸塩緩衝液（図２９ｂ）およびリン酸塩緩衝液（図２９ｃ）についてのｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示す。
図３０は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、炭酸塩緩衝液（図３０ａ〜図３０ｂ）、酢酸塩緩衝液（図３０ｃ）およびリン酸塩緩衝液（図３０ｄ）についてのｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示し、図３０ｂに示されるグラフは、図３０ａに示されるグラフの直線部分である。
図３１ａ〜図３１ｂは核酸について本発明の液体組成物の平均結合強化能を示す。
図３２〜図３５ｂは異なる緩衝液組合せおよび異なる溶出工程について精製前および精製後のＰＣＲ生成物サンプルの画像である。
図３６〜図３７は異なる量、濃度および溶出工程でカラムを通過したＰＣＲ生成物の画像（図３６）および定量分析（図３７）である。
図３８ａ〜図３８ｃは３つの溶出工程で、図３６に示されるカラム５〜１７を通過したＰＣＲ生成物カラムの画像である。
図３９ａは、図３８ａ〜図３８ｃの３つの溶出工程のそれぞれについて、負荷体積を関数とするコントロール緩衝液（ＣＯとして表される）および本発明の液体組成物（ＬＣとして表される）の面積を示す。
図３９ｂは、図３８ａ〜図３８ｃの３つの溶出工程のそれぞれについて、負荷体積を関数とする比率（ＬＣ／ＣＯ）を示す。
図４０ａ〜図４２ｂはＲＯ水の存在下（図４０ａ、図４１ａおよび図４２ａ）および本発明の液体組成物の存在下（図４０ｂ、図４１ｂ、図４２ｂ）でのゲル電気泳動実験におけるＤＮＡの移動速度を比較するレーン画像である。
図４３ａ〜図４５ｄは泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である。
図４６ａ〜図４８ｄはゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である。
図４９はアルカリホスファターゼの非結合型形態の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、希釈を関数とする安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。
図５０はアルカリホスファターゼの結合型形態の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における希釈を関数とする、ＲＯ水および本発明の液体組成物において希釈されたストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼの酵素活性を示す。
図５１はβ−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、２４時間後（図５１ａ）、４８時間後（図５１ｂ）、７２時間後（図５１ｃ）および１２０時間後（図５１ｄ）でのβ−ガラクトシダーゼの安定性を示す。
図５２はβ−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、２４時間後（図５２ａ）、４８時間後（図５２ｂ）、７２時間後（図５２ｃ）および１２０時間後（図５２ｄ）での安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。
図５３ａは乾燥および熱処理の後でのアルカリホスファターゼの残存活性を示す。
図５３ｂは乾燥および熱処理の後でのアルカリホスファターゼの安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。
図５４はＰＣＲ反応時においてＤＮＡに影響を及ぼすガラスビーズの能力に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像を示す。
図５５ａは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である。
図５５ｂは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの解離曲線である。
図５６ａは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である。
図５６ｂは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの解離曲線である。
図５７ａは０．２の手動バックグラウンドカットオフを伴う、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である。
図５７ｂは０．２の手動バックグラウンドカットオフを伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である。
図５８ａは外れ値をそれぞれのセットから一致して除いた後での、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である（手動バックグラウンドカットオフ＝０．２）。
図５８ｂは外れ値をそれぞれのセットから一致して除いた後での、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である（手動バックグラウンドカットオフ＝０．２）。
図５９ａは外れ値をそれぞれのセットから個々に除いた後での、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である（手動バックグラウンドカットオフ＝０．２）。
図５９ｂは外れ値をそれぞれのセットから一致して個々に除いた後での、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの増幅プロットである（手動バックグラウンドカットオフ＝０．２）。
図６０ａは反応がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で行われるときのバックグラウンドノイズを明らかにするリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの増幅プロットである（反応変化＝特定の生成物の蛍光放出−ベースライン読み取り）。
図６０ｂは反応が水の存在下で行われるときのバックグラウンドノイズを明らかにするリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの反応変化対サイクルの曲線である。
図６１ａはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。
図６１ｂはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での１０μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。
図６１ｃはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での１５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。
図６２ａは水の存在下での５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。
図６２ｂは水の存在下での１０μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。
図６２ｃは水の存在下での１５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。
図６３は観測時間の関数としての、本発明の液体組成物における絶対値の超音波速度の等温測定の結果を示す。
図６４ａ〜ｄは本発明の液体組成物の存在下におけるＤＮＡチップに対するＲＮＡの増強されたハイブリダイゼーションを示す写真である。図６４ａおよび図６４ｂは、１０秒間の暴露の後におけるＤＮＡチップに対するハイブリダイゼーションを示す。図６４ｃおよび図６４ｄは、２秒間の暴露の後におけるＤＮＡチップに対するハイブリダイゼーションを示す。図６４ａおよび図６４ｃは、本発明の液体組成物の不在下におけるＤＮＡチップに対するハイブリダイゼーションを示す。図６４ｂおよび図６４ｄは、本発明の液体組成物の存在下におけるＤＮＡチップに対するハイブリダイゼーションを示す。
図６５は５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
図６６Ａ〜ＣはｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
図６７Ａ〜ＣはｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
図６８Ａ〜ＣはｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
図６９はｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
図７０Ａ〜Ｃは５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定（図７０Ａ）および水酸化ナトリウム滴定（図７０Ｂ〜図７０Ｃ）を例示するグラフである。
図７１Ａ〜ＢはＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図７１Ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図７１Ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。
図７２Ａ〜ＣはＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図７２Ａ）、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフ（図７２Ｂ）、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図７２Ｃ）である。矢印は２回目の照射を示す。
図７３はＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。
図７４Ａ〜Ｊは粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図７４Ａ〜図７４Ｅは、実施例２４のパートＣからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図７４Ｇ〜図７４Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
図７５Ａ〜Ｃはナノドロップで測定されたときの、３つの異なる溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。図７５Ａは、一晩の粉砕の後での赤色粉末＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒの溶液を表す。図７５Ｂは、１００％の脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた後での赤色粉末の溶液を表し、図７５Ｃは、ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）を加えた後での赤色粉末の溶液を表す。
図７６はバイアル＃１（ＣＤ−Ｄａｕ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、バイアル＃４（ＣＤ−Ｄａｕ＋１０％ＰＥＧ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））およびバイアル＃５（ＣＤ−Ｄａｕ＋５０％アセトン＋５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））の分光光度計測定のグラフである。
図７７はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）、および、微量の溶媒（アセトン）を伴う溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。
図７８はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）および、アセトンにおける溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。淡青色および黄色の線はアセトン蒸発の異なる割合を表し、紫色線はアセトン非含有溶液である。
図７９はＣＤ−Ｄａｕの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
図８０はｔ−ｂｏｃの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
図８１Ａ〜Ｄは２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。図８１Ａは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール不在下でのＡＧ−１４Ｂのグラフである。図８１Ｂは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後２４時間のエタノール不在下でのＡＧ−１４Ｂのグラフである。図８１Ｃは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール不在下でのＡＧ−１４Ａのグラフである。図８１Ｄは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後２４時間のエタノール不在下でのＡＧ−１４Ａのグラフである。
図８２はエタノール蒸発後２４時間でのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ１４Ｂの懸濁物の写真である。
図８３Ａ〜ＧはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの分光光度計測定のグラフである。図８３Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸのグラフである。図８３Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵのグラフである。図８３Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅのグラフである。図８３Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）のグラフである。図８３Ｅは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２のグラフである。図８３Ｆは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨのグラフである。図８３Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫのグラフである。
図８４Ａ〜Ｇはクリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。図８４Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸの細胞傷害作用のグラフである。図８４Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵの細胞傷害作用のグラフである。図８４Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅの細胞傷害作用のグラフである。図８４Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）の細胞傷害作用のグラフである。図８４Ｅは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２の細胞傷害作用のグラフである。図８４Ｆは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨの細胞傷害作用のグラフである。図８４Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫの細胞傷害作用のグラフである
図８５はエタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
図８６はろ過後の、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
図８７Ａ〜Ｂは試験チューブ（左側はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および物質「Ｘ」を含有し、右側はＤＭＳＯおよび物質「Ｘ」を含有する）の写真である。図８７Ａは、２４時間放置された試験チューブを例示し、図８７Ｂは、４８時間放置された試験チューブを例示する。
図８８Ａ〜Ｃは加熱および振とう処置を行った直後における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図８８Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図８８Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図８８Ｃ）の写真である。
図８９Ａ〜Ｃは加熱および振とう処置を行った後６０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図８９Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図８９Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図８９Ｃ）の写真である。
図９０Ａ〜Ｃは加熱および振とう処置を行った後１２０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図９０Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図９０Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図９０Ｃ）の写真である。
図９１Ａ〜Ｃは加熱および振とう処置を行った後２４時間における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図９１Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図９１Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図９１Ｃ）の写真である。
図９２Ａ〜ＤはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および低下した濃度のＤＭＳＯを含む溶媒に物質「Ｘ」を含むガラス製ボトルの振とう直後の写真（図９２Ａ）、振とう後３０分の写真（図９２Ｂ）、振とう後６０分の写真（図９２Ｃ）および振とう後１２０分の写真（図９２Ｄ）である。
図９３は分光光度計によって測定されたときの、ボルテックス後６時間のＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における物質「Ｘ」の吸収特徴を例示するグラフである。
図９４Ａ〜Ｂは分光光度計によって測定されたときの、エタノールにおけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図９４Ａ）、および、アセトンにおけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図９４Ｂ）である。
図９５Ａ〜Ｂは分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図９５Ａ）、および、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図９５Ｂ）である。
図９６Ａ〜Ｂは分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図９６Ａ）、および、ＤＭＳＯにおけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図９６Ｂ）である。
図９７は２９３Ｔ細胞に対する異なる溶剤におけるタキソールの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。コントロールＲＯ＝ＲＯ水により構成される培地；コントロールＮｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；コントロールＤＭＳＯ ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＤＭＳＯにより構成される培地；コントロールＮｅｏ ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；タキソールＤＭＳＯ ＲＯ＝ＲＯ水と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＤＭＳＯ Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ ＲＯ＝ＲＯ水と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地。
図９８Ａ〜Ｂは２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例３２に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
図９９は２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例３３に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
図１００は熱脱水されたＰＣＲミックスにおけるＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の多重能を例示する写真である。図１００Ａは、ヒトインスリン遺伝子に対するテンプレートおよびプライマーを伴う脱水されたミックスを例示する。図１００Ｂは、ＰＢＦＤＶのセグメントに対するテンプレートおよびプライマーを伴う脱水されたミックスを例示する。Ｍ−１ｋｂマーカー、１−スクロース １５０ｍＭ Ｄｅｈ＿ＲＯ；Ｒｅｈｙ＿ＲＯ、２−スクロース ２００ｍＭ Ｄｅｈ＿ＲＯ；Ｒｅｈｙ＿ＲＯ、３−スクロース １５０ｍＭ Ｄｅｈ＿ＲＯ；Ｒｅｈｙ＿ＮＷ、４−スクロース ２００ｍＭ Ｄｅｈ＿ＲＯ；Ｒｅｈｙ＿ＮＷ、５−スクロース １５０ｍＭ Ｄｅｈ＿ＮＷ；Ｒｅｈｙ＿ＲＯ、６−スクロース ２００ｍＭ Ｄｅｈ＿ＮＷ；Ｒｅｈｙ＿ＲＯ、７−スクロース １５０ｍＭ Ｄｅｈ＿ＮＷ；Ｒｅｈｙ＿ＲＯ、８−スクロース ２００ｍＭ Ｄｅｈ＿ＮＷ；Ｒｅｈｙ＿ＮＷ。
図１０１はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）が微小体積ＰＣＲ（ＭＶＰ）に関与することができることを例示する写真である。ＭＶＰをＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方の塩基ミックスに対して行った。ミックスを１０個のチューブに等分し、ＰＣＲを行った。
図１０２Ａ〜Ｃはｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるβ−アクチン増幅の増幅プロット（図１０２Ａ）、解離プロット（図１０２Ｂ）および標準プロット（図１０２Ｃ）である。青色：５０ｎｇのゲノムＤＮＡ；赤色：５ｎｇのゲノムＤＮＡ；緑色：０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ、黒色：ＮＴＣ。
図１０３Ａ〜Ｃはｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＰＤ−Ｘ増幅の増幅プロット（図１０３Ａ）、解離プロット（図１０３Ｂ）および標準プロット（図１０３Ｃ）である。青色：５０ｎｇのゲノムＤＮＡ；赤色：５ｎｇのゲノムＤＮＡ；緑色：０．５ｎｇのゲノムＤＮＡ、黒色：ＮＴＣ。
図１０４はヒドロキシアパタイト（ＨＡ）型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。
図１０５Ａ〜ＨはＨＡ（ＨＡ−１８）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１０６Ａ〜ＨはＳｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１０７Ａ〜Ｈは銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
図１０８はＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。
図１０９Ａ〜ＨはＨＡ（ＡＢ１−２２−１）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１１０Ａ〜ＨはＳｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１１１Ａ〜Ｈは銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
図１１２はＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。
図１１３Ａ〜ＨはＨＡ（ＡＡ９９−Ｘ）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１１４Ａ〜ＨはＳｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１１５Ａ〜Ｈは銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
図１１６はＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。
図１１７Ａ〜ＨはＨＡ（ＡＢ１−２−３）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１１８Ａ〜ＨはＳｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１１９Ａ〜Ｈは銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
図１２０はＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。
図１２１Ａ〜ＨはＨＡ（ＨＡＰ）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１２２Ａ〜ＨはＳｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１２３Ａ〜Ｈは、銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
図１２４はＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。
図１２５Ａ〜ＪはＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１２６Ａ〜ＨはＳｉウエハ上に存在するＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。
図１２７Ａ〜Ｆは銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
本発明は、ナノ構造、ならびに、このナノ構造を有し、かつ、多数の特徴的な物理的特性、化学的特性および生物学的特性によって特徴づけられる液体組成物に関連する。本発明の液体組成物は、多くの生物学的適用および化学的適用のために使用することができ、例えば、限定されないが、細菌コロニー成長、電気化学的析出、核酸増幅、および溶媒などのために使用することができる。
本発明によるナノ構造および液体組成物の原理は、図面および付随する記載を参照してより良く理解することができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、図面において例示される構築の細部および構成成分の配置に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
次に図面を参照して、図１は、整列した流体分子のエンベロープ１４によって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料１２を含むナノ構造１０を例示する。コア材料１２およびエンベロープ１４は定常的な物理的状態にある。
本明細書中で使用される表現「定常的な物理的状態」は、物体または分子が、少なくとも局所的な最小値を有する何らかのポテンシャルによって結びついている状況を示す。そのようなポテンシャルについての代表的な例には、限定されないが、ファンデルワールスポテンシャル、湯川ポテンシャルおよびレナード・ジョーンズポテンシャルなどが含まれる。他の形態のポテンシャルもまた意図される。
本明細書中で使用される表現「整列した流体分子」は、流体分子間の相関を有する流体分子の組織化された配置を示す。
本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。
本発明の好ましい実施形態によれば、エンベロープ１４の流体分子は液体状態またはガス状状態のいずれかであり得る。下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように（実施例３を参照のこと）、エンベロープ１４がガス状物質を含むとき、ナノ構造は、十分なｇ力にさらされたとき、浮遊することができる。
コア材料１２は特定のタイプまたはファミリーの物質に限定されず、ナノ構造が設計される適用に従って選択することができる。代表的な例には、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質が含まれる。下記の実施例の節において明らかにされるように（実施例１を参照のこと）、コア材料１２はまた、結晶性構造を有することができる。
強誘電性物質は、電場を加えることによって逆転または再配向させることができる永続的な電気的分極をある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって可逆的である永続的な磁化を維持する物質である。本発明の好ましい実施形態によれば、コア材料１２が強誘電性または強磁性であるとき、ナノ構造１０はその強誘電性または強磁性の性質を保持する。従って、ナノ構造１０は、マクロスケールでの物理的性質がナノスケールの環境に持ち込まれる際立った特徴を有する。
本発明の好ましい実施形態によれば、ナノ構造１０は、少なくとも１つのナノ構造とクラスター形成することができる。より具体的には、ある濃度のナノ構造１０が液体（例えば、水）において混合されたとき、数個のナノ構造の間における引き合う静電気力により、それらの間での付着が、ナノ構造のクラスターを形成するように生じ得る。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成を妨げるときでさえ、ナノ構造１０は、そのような他のナノ構造との長距離の相互作用（約０．５μｍ〜１０μｍ）を維持することができる。液体において存在するナノ構造間の遠距離の相互作用は液体に対して特異な特性を誘導し、そのような特性は、多くの適用において、例えば、限定されないが、生物学的アッセイおよび化学的アッセイにおいて利用することができる。
ナノ構造１０の特異な性質は、例えば、「トップダウン」プロセスを使用してナノ構造１０を製造することによって達成することができる。より具体的には、ナノ構造１０を、ナノメートルサイズの粒子をもたらすために制御された様式で破砕されるミクロサイズの粒子（例えば、直径が約１μｍを超えるか、または約１０μｍを超える）の原料粉末から製造することができる。典型的には、そのようなプロセスは、高温の原料粉末が電磁高周波（ＲＦ）放射線の条件のもとで入れられる冷液体（好ましくは、絶対的ではないが、水）において行われる。
製造プロセスをより詳しく記載する前に、言及されたように好ましい液体である水の物理的性質が下記に概説される。
従って、水は、注目すべき物質の１つであり、そのため、これまで非常によく研究されている。水は、１個の酸素原子に結合した２個の水素原子からなる非常に単純な分子であると考えられるが、複雑な性質を有する。水は、水素結合に起因する特別な性質を数多く有している（例えば、大きい表面張力、大きい粘度、および、六角形、五角形または十二面体の整列した水配列を自身で、または他の物質のまわりで形成することができることなど）。
水の融点は、類似する分子量を有する他の分子を検討したとき、予想されるよりも１００Ｋ以上も高い。水の六角形型の氷相（氷および雪の通常的な形態）において、すべての水分子が４つの水素結合（ドナーとしての２つおよびアクセプターとしての２つ）に関係しており、比較的静的に保持される。液体の水では、一部の水素結合が、分子が動き回ることを可能にするために破壊されるにちがいない。これらの結合を破壊するために要求される大きなエネルギーが融解プロセス時に供給されなければならず、比較的小さい量のエネルギーのみが体積の変化から取り戻されるだけである。自由エネルギーの変化は融点においてゼロでなければならない。温度が上昇すると、液体の水における水素結合の量が減少し、そのエントロピーが増大する。融解は、結合の破壊のために要求されるエネルギーを提供するための十分なエントロピー変化が存在するときに生じるだけである。液体の水の低いエントロピー（大きい組織化）はこの融点を高くさせる。
水の性質のほとんどは、水素の原子が（１つの酸素原子とは対照的に）２つの酸素原子にかなり強い力によって引き寄せられるときに生じる上記の水素結合のためであり、その結果、そのような水素結合は、これら２つの原子の間での束縛として作用していると見なすことができる。
水は大きい密度を有しており、その密度は、３．９８４℃の温度で存在する局所的な最大値にまで温度とともに増大する。この現象は水の密度異常性として知られている。液体の水の大きい密度は主に、水素結合した網目構造の結合性に起因する。これは自由体積を減少させ、比較的大きい密度を確実にし、これにより、水素結合した網目構造の部分的な空所性が補われる。水の異常な温度−密度挙動は、種々の程度の十二面体型のしわ形成を伴う全体的または部分的に形成されたクラスターの内部における様々な環境の範囲を利用して説明することができる。
密度最大値（およびモル体積最小値）が、密度を増大させる構造的崩壊と、密度を低下させる熱膨張との両方を引き起こす、上昇する温度の対抗する作用によってもたらされる。より低い温度では、膨張した構造の濃度がより大きくなり、これに対して、より高い温度では、崩壊した構造およびフラグメントの濃度がより大きくなり、しかし、それらが占める体積が温度ともに大きくなる。温度が上昇するときの、膨張した構造から崩壊した構造への変化には、あまり整列していない構造およびより大きい水素結合屈曲にそれぞれ起因するエントロピーおよびエンタルピーにおいて正の変化が伴う。
一般に、水の水素結合は広範囲にわたる網目構造をもたらし、これにより、無数の六角形型、五角形型または十二面体型の水配列を形成することができる。水素結合した網目構造は大きな程度の秩序を有する。加えて、温度依存的な競合が、水素結合の秩序化作用と、無秩序化する速度論的作用との間に存在する。
知られているように、水分子は、整列した構造および超構造を形成することができる。例えば、整列した水の殻が様々な生体分子（例えば、タンパク質および炭水化物など）の周りに形成される。これらの生体分子の周りにおけるこのような整列した水の環境は、例えば、受容体から細胞核へのシグナル伝達をはじめとする細胞内機能に関して生物学的機能に強く関与している。加えて、このような水構造は安定であり、分子の表面を保護することができる。
液状化した水の整列した構造のほとんどが短距離のスケールである（典型的には約１ｎｍ）。長距離の秩序が、水がその液相で存在するときには原理的に存在し得るが、液体状態における水は絶えず熱運動しているので、そのような長距離の秩序は、自然に生じる確率が極めて低い。水素結合による相互作用および水素結合によらない相互作用のために、水分子は、特定かつ構造化されたクラスター形成を伴う無限の水素結合した網目構造を形成することができる。従って、水分子の小さいクラスターは、他のより小さいクラスターとさらにクラスター形成して、数百の水分子からなる二十面体の水クラスターを形成することができる水の八量体を形成することができる。従って、水分子は様々な整列した構造を形成することができる。
水の他の性質には、高い沸点、高い臨界点、圧力による融点の低下（圧力異常性）、および、温度の上昇とともに低下し、約４６℃で最小値にまで低下する圧縮率などが含まれる。
水のこのような様々な特異な性質が、ナノ構造１０を製造するために本発明の発明者によって利用されている。従って、本発明の別の態様によれば、液体組成物を製造する方法が提供される。
次に図２ａを参照する。図２ａは、本発明の好ましい実施形態による方法の流れ図である。この方法は下記の方法工程を含み、方法において、第１の工程で、固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末、合成ポリマーなど）が、十分に高い温度に、好ましくは約５００℃を超える温度に、より好ましくは約６００℃を超える温度に、さらにより好ましくは約７００℃を超える温度に加熱される。意図される固体粉末の代表例には、限定されないが、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２が含まれる。本発明者らは予想外にも、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）もまた組成物の配合において使用され得ることを見出した。ヒドロキシアパタイトは非毒性によって特徴づけられ、また、一般には、ヒト治療のためにＦＤＡ承認されるので、ヒドロキシアパタイトは特に好ましい。
実施例３４において例示されるように、本発明の液体組成物を５つの異なるヒドロキシアパタイト粉末（ＨＡ−１８、ＡＢ１−２２−１、ＡＡ９９−Ｘ、ＡＢ１−２−３およびＨＡＰ）から作製した（これらのヒドロキシアパタイトのすべてがＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）。多くの他のヒドロキシアパタイト粉末が様々な製造者から入手可能であることが理解されよう（例えば、Ｃｌａｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（例えば、カタログＮｏ．１３０６−０６−５）など）。本発明のＨＡ型液体組成物はすべてが、ＢａＴｉＯ３に基づく液体組成物に非常に類似していることが電子顕微鏡観察によって示された（図１０４〜図１２７のＡ〜Ｆ）。さらに、表３６に示されるように、ＨＡに基づく液体組成物はすべてが、水と比較したとき、高まった緩衝能力を含んでいた。
第２の工程で、加熱された粉末が、その密度異常性温度よりも低い温度（例えば、３℃または２℃）の冷たい液体（好ましくは、水）に浸される。この方法の第３の工程で、この工程は、好ましくは、第２の工程と実質的には同時に実行されるが、冷液体および粉末に、連続波ＲＦ放射線または変調されたＲＦ放射線のいずれかであり得る電磁ＲＦ放射線（好ましくは、５００ＭＨｚを超える電磁ＲＦ放射線）が照射される。
液体におけるナノ構造の形成は下記のように説明することができる。冷液体およびＲＦ放射線（すなわち、非常に振動する電磁場）の組合せは粒子と液体との間の境界に影響を及ぼし、それにより、液体分子および粒子をばらばらにする。ばらばらにされた液体分子はフリーラジカルの形態であり、このフリーラジカルにより、粒子の（ナノサイズの）破片が包まれる。低い温度であるので、フリーラジカルおよび破片は定常的な物理的状態に入る。フリーラジカルがナノ構造に引き寄せられることが、液体分子の相関の長さと比較してナノ構造の比較的小さいサイズから理解され得る。小さいサイズの摂動が、長距離の相互作用により現れる純粋なカシミール効果に寄与し得ることが議論されている［Ｄ．Ｂａｒｔｏｌｏ他、Ｅｕｒｏｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、２０００、４９（６）；７２９〜７３４］。
上記の方法を本発明に従って行うことにより、本発明のナノ構造が問題なく製造される。具体的には、上記の方法は、本明細書中下記でさらに詳述されるようにエンベロープ１４の形成を可能にする。従って、本明細書中の別の態様によれば、液体およびナノ構造１０を有する液体組成物が提供される。液体組成物が上記の方法によって製造されるとき、さらなる工程を用いることなく、ナノ構造１０のエンベロープ１４が、好ましくは、液体の分子と同一である分子から作製される。あるいは、ナノ構造はさらに、異なる液体と（ＲＦ照射とともに、または、ＲＦ照射を伴うことなく）混合することができ、その結果、最終的な組成物において、エンベロープ１４の少なくとも一部が、液体の分子とは異なる分子から作製される。エンベロープ１４が形成されるために、ナノ構造は、好ましくは、液体の比重よりも低い比重、または、液体の比重と等しい比重を有する。
ナノ構造の濃度は限定されない。好ましい濃度は１リットルあたり１０２０個未満のナノ構造であり、より好ましくは、１リットルあたり１０１５個未満のナノ構造である。当業者は、そのような濃度に関して、組成物中のナノ構造間の平均距離がかなり大きく、ミクロン程度であることを理解する。本明細書中下記においてさらに詳述され、また、下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は多くの特異な特性を有する。これらの特性は、例えば、ナノ構造間の遠距離の相互作用によって促進され得る。具体的には、遠距離の相互作用により、上記の比較的低い濃度をそのように用いることが可能になる。
ナノ構造間の相互作用（遠距離の相互作用および近距離の相互作用の両方）は、細菌コロニーの自己組織化と同様に、液体組成物の自己組織化能を容易にする。細菌コロニーが成長するとき、自己組織化は、細菌コロニーが、不都合な外部条件に対処し、かつ、成長速度を改善するためにその環境から「集団的に学習する」ことを可能にする。同様に、遠距離の相互作用、および、従って、液体組成物の遠距離の秩序は、液体組成物が、種々の環境的条件（例えば、限定されないが、異なる温度、電流および放射線など）に順応するように自己組織化を行うことを可能にする。
本発明の液体組成物の遠距離の秩序は、液体組成物が電気化学的析出（ＥＣＤ）実験に供されるときに最もよく認められる（下記の実施例の節における実施例９もまた参照のこと）。
ＥＣＤは、物質が（例えば、２つの電極を使用して）ある電位差に供され、その結果、電気化学的プロセスが開始されるプロセスである。ＥＣＤプロセスの特有の性質の１つが、それによって得られる物質分布である。電気化学的プロセスの期間中、所与の電流において電極間で測定される電位は、その物質における数タイプの過電圧および抵抗降下の和である。抵抗降下の大きさは物質の電気伝導率および電極間の距離に依存する。電極の特定の局所的領域の電流密度は反対側の電極までの距離の関数である。この効果は一次電流分布と呼ばれ、電極の幾何形状および物質の電気伝導率に依存する。
電極間の電位差が、平衡電圧と比較して大きいとき、物質は非平衡状態への転移を受け、結果として、様々な異なる形態学の構造が形成される。非平衡状態における系は特定の形態学を選択し、かつ／または、２つの形態学（密集した枝分かれの形態学および樹枝状の形態学）の間で転移し得ることが見出されている［Ｅ．Ｂｅｎ−Ｊａｃｏｂ、「雪片形成から細菌コロニーの成長まで」、Ｃｏｎｔ．Ｐｈｙｓ．、１９９３、３４（５）］。
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の液体組成物が電気化学的析出セルに置かれたとき、所定の形態学（例えば、密集した枝分かれおよび／または樹枝状）が形成される。好ましくは、本発明の液体組成物は、異なる液体（例えば、水）によって置き換えられたときでさえ、電気化学的形跡をセルの表面に保つことができる。より具体的には、本発明の好ましい実施形態によれば、液体組成物が最初に電気化学的析出セルの表面と接触させられ、次いで、所定の洗浄プロトコルによって洗浄されるとき、組成物の電気化学的形跡がセルの表面に保たれる。
ナノ構造の長距離相互作用もまた、本発明の液体組成物を新しい環境条件（例えば、温度変化）に供し、組成物におけるナノ構造間の相互作用に関係する１つまたは複数の物理量に対するその新しい環境条件の影響を調べることによって明らかにすることができる。１つのそのような物理量が超音波速度である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられる。
本発明のさらなる特徴は、液体組成物と固体表面との間での小さい接触角である。好ましくは、液体組成物と表面との間での接触角は、液体（ナノ構造を含まない）と表面との間での接触角よりも小さい。当業者は、小さい接触角は、液体組成物がより大きな程度で表面を「濡らす」ことを可能にすることを理解する。本発明のこの特徴は、液体におけるナノ構造の大きな濃度に限定されず、反対に、ナノ構造間の上記の遠距離の相互作用の助けをかりて、低い濃度にも限定されないことを理解しなければならない。
さらに、本発明の液体組成物のさらなる特徴は溶解性である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較したとき、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる（図７４〜図９７）。
本明細書中で使用される用語「溶解する」は、本発明の液体組成物が水性環境において可溶性またはより可溶性にすることができることを示す。
本明細書中で使用される用語「分散する」は、物質の溶解性の程度に従った懸濁物にする操作を示す。
従って、本発明のさらなる態様によれば、物質を、該物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む、物質を溶解または分散する方法が提供される。
本発明のナノ構造および液体は、医薬用薬剤（例えば、治療剤、化粧剤および診断剤など）を含めて、任意の物質（例えば、活性な薬剤）（例えば、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物など）を溶解／分散するために使用することができる。
治療剤は任意の生物学的な活性因子であってよく、例えば、薬物、核酸構築物、ワクチン、ホルモン、酵素、小分子（例えば、ヨウ素など）または抗体などであってよい。治療剤の例には、抗生物剤、フリーラジカル生成剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、非ステロイド系抗炎症性薬物、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、レチノイド剤、ｔａｒ剤、止痒剤、ホルモン、ソラレンおよび殺疥癬虫剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって送達可能である核酸構築物は、ポリペプチド（例えば、酵素、リガンドまたはペプチド薬物など）、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードすることができる。
本発明の化粧剤は、例えば、しわ取り剤、ニキビ防止剤、ビタミン剤、表皮剥離剤、毛包刺激剤または毛包抑制剤が可能である。化粧剤の例には、レチノイン酸およびその誘導体、サリチル酸およびその誘導体、含硫Ｄ−アミノ酸および含硫Ｌ−アミノ酸およびそれらの誘導体およびそれらの塩、特に、Ｎ−アセチル誘導体、α−ヒドロキシ酸（例えば、グリコール酸および乳酸など）、フィチン酸、リポ酸、ならびに、この分野で知られている多くの他の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の診断剤は、疾患状態を示す分子について特異的な抗体、化学物質または色素であり得る。
このような物質は、本発明の液体組成物を加える前に、または、可溶化プロセスを助けるために本発明の液体組成物を加えた後で溶媒に溶解することができる。本発明では、物質の溶解性をさらに増大させるために、極性溶媒、非極性溶媒、有機溶媒（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機溶媒を含めて、任意の溶媒の使用が意図されることが理解されよう。
溶媒は、物質が本発明の液体組成物に溶解／分散されたままであるように、可溶化プロセスの期間中の任意の時に（完全に、または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの分野では知られている（例えば、蒸発（すなわち、加熱するか、または、圧力を加えることによる蒸発）または任意の他の方法など）。
本発明の液体組成物のさらなる特徴は緩衝能力である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較したとき、高まった緩衝能力によって特徴づけられる（図７４〜図９７）。
さらに、本発明の液体組成物のさらなる特徴はタンパク質安定性である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較したとき、タンパク質を安定化する高まった能力（例えば、タンパク質を熱の影響から保護する能力）によって特徴づけられる（図９８Ａ／図９８Ｂ〜図９９）。
本発明をさらに実施に移しているとき、本発明の液体組成物は、液体組成物を調製するために使用された固体粉末が細菌にとって毒性であるときでさえ、細菌コロニー拡大速度およびファージ−細菌相互作用またはウイルス−細胞相互作用の増大を促進することができることが予想外にも認められている（下記の実施例の節における実施例６、実施例７および実施例１０を参照のこと）。液体組成物が製造されるこの特異なプロセスでは、言及されているように、コア材料１２を取り囲むエンベロープ１４の形成が可能であるので、細菌またはファージに対する液体組成物の何らかの毒性的影響が著しく抑制される。
本発明の液体組成物のさらなる特徴は、いわゆるゼータ（ζ）電位に関連する。ζ電位は、粒子が、その中に存在する電場の影響のもとで液体中を移動することができる電気泳動および誘電泳動と呼ばれる物理的現象に関連する。ζ電位は、異なる挙動を有する液体の２つの領域の間での境界において定義される剪断平面での電気電位である。粒子の電気泳動移動度（電場強度に対する粒子の速度の比率）はζ電位に比例する。
表面に関連づけられる量であるので、ζ電位は、粒子サイズが小さい系では特に重要である。そのような系では、粒子の総表面積が粒子の総体積に対して大きく、その結果、表面に関連づけられる現象により、粒子の挙動が決定されるからである。
本発明の好ましい実施形態によれば、液体組成物は、液体自体のζ電位よりも実質的に大きいζ電位によって特徴づけられる。大きいζ電位は、液体におけるナノ構造の高まった移動度に対応し、従って、例えば、電気化学的析出プロセスにおける特別な形態学の形成に寄与し得る。
液体組成物のζ電位を測定する多くの方法が存在し、これらには、限定されないが、マイクロ電気泳動、光散乱、光回折、音響学、電気音響学などが含まれる。例えば、ζ電位を測定する１つの方法が米国特許第６４４９５６３号に開示される（その内容は参考として本明細書により組み込まれる）。
本明細書中上記において背景の節で言及されたように、本発明はまた、分子生物学研究および診断の分野に関連し、具体的には、核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および自動継続（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（ＳＳＳＲ）など、これらに限定されない）に関連する。
本発明の液体組成物は、核酸増幅プロセスの効率を改善できることが本発明の発明者によって見出されている。本明細書中で使用される、表現「核酸増幅プロセスの効率を改善すること」は、ＰＣＲ手法におけるＤＮＡポリメラーゼの触媒活性を高めること、反応に必要とされるタンパク質の安定性を増大すること、増幅プロセスの感度および／または信頼度を増大すること、および／または増幅反応の反応容積を低減することを意味する。本発明のこの態様によると、触媒活性の強化は、好ましくは、さらなる補因子（例えば、マグネシウムまたはマンガンなど、これらに限定されない）の使用を伴うことなく達成される。当業者によって理解されるように、マグネシウム非存在またはマンガン非存在のＰＣＲを用いることができることは非常に好都合である。これは、ＰＣＲ手法の効率が、反応に存在する補因子の濃度に対して非常に敏感であることが知られているからである。熟練した科学者は、多くの場合、補因子の濃度を事前に計算すること、または、所望する増幅効率を達成する前に、補因子の濃度を変えながら多くの試験を行うことが要求される。
従って、本発明の液体組成物の使用は、使用者が、ＰＣＲミックスにおける補因子の濃度を計算するか、または変化させる必要なく、簡便かつ非常に効率的な多サイクルＰＣＲ手法を実行することを可能にする。
加えて、ポリメラーゼ連鎖反応が、何らかのさらなる緩衝液または液体を伴うことなく行われ得ることが本発明者によって見出されている。ＰＣＲを臨床診断に適用することに伴う大きな問題の１つは、持ち越し汚染に対するＰＣＲの感受性である。これらは、以前のＰＣＲにおいて増幅された分子がサンプルに混入することに起因する偽陽性である。本発明の液体組成物が唯一のＰＣＲミックスとして使用されることは、全手順を、何らかのさらなる緩衝液または液体を必要とすることなく行うことができ、従って、汚染の危険性を回避することができるので、持ち越し汚染の可能性を著しく低下させる。
実施例１７に記載されるように、また、図５５〜図６２および図１０２Ａ〜図１０２Ｃおよび図１０３Ａ〜図１０３Ｃに例示されるように、本発明の液体組成物は、リアルタイムＰＣＲ反応の感度を高めること、および、リアルタイムＰＣＲ反応の反応体積を低下させることが示された。本明細書中で使用されるように、リアルタイムＰＣＲ反応は、それぞれのＰＣＲサイクルの期間中において二本鎖ＤＮＡ検出分子（例えば、色素）の存在下で行われるＰＣＲ反応を示す。
さらに、本発明者らは、本発明の液体組成物が非常に少ない体積でのＰＣＲ反応（例えば、２μｌ）において使用され得ることを示している。加えて、本発明者らは、本発明の液体組成物が、熱脱水された多重ＰＣＲ反応において使用され得ることを示している。
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、ポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供される。本発明のＰＣＲキットは、所望されるならば、本発明のキットの１つまたは複数の単位物を含有することができるパックで提供され得る。パックには、キットを使用するために説明書が伴い得る。パックはまた、研究室補助品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に関連する通知によって供給され得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態の当局による承認を反映する。
１つの態様によれば、キットは、好ましくは別個のパッケージングで、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ（これに限定されない）など）と、本発明の液体組成物とを含む。
本発明の別の態様によれば、キットはリアルタイムＰＣＲキットのために使用され、少なくとも１つのリアルタイムＰＣＲ試薬（例えば、二本鎖ＤＮＡ検出分子など）をさらに含む。キットの構成成分は、別々に、または、任意の組合せで包装することができる。
本明細書中で使用される表現「二本鎖ＤＮＡ検出分子」は、定量可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）をもたらす二本鎖ＤＮＡ相互作用分子を示す。例えば、そのような二本鎖ＤＮＡ検出分子は、（１）ＤＮＡのフラグメントまたはアンプリコンと相互作用し、（２）二重鎖形成しているアンプリコンの存在下では、分離状態にあるアンプリコンの存在下とは異なる波長で発光する蛍光色素であってよい。二本鎖ＤＮＡ検出分子は、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子、または、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子が可能である。
二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子は、プライマー、アンプリコンまたは核酸テンプレートに共有結合的に連結されない。このような検出分子は、二本鎖ＤＮＡの存在下でその発光を増大させ、二重鎖ＤＮＡが解きほぐれたときにはその発光を低下させる。例には、臭化エチジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−１、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＢＲ ＧｏｌｄおよびＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩが含まれるが、これらに限定されない。臭化エチジウムは、二本鎖ＤＮＡフラグメントにおいて塩基対間にインターカレーションし、ＤＮＡをゲル電気泳動後に検出するために一般に使用される蛍光化学物質である。２５４ｎｍ〜３６６ｎｍの間の紫外光によって励起されたとき、臭化エチジウムは５９０ｎｍにおける蛍光の光を放出する。このＤＮＡ−臭化エチジウム複合体は、一本鎖ＤＮＡの存在下での臭化エチジウムよりも約５０倍の蛍光をもたらす。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩは４９７ｎｍで励起され、５２０ｎｍで発光する。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩの蛍光強度は、一本鎖ＤＮＡに対して、二本鎖ＤＮＡに結合したとき、１００倍以上に増大する。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩの代わりになるものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．によって導入されたＳＹＢＲ Ｇｏｌｄである。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩと同様に、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄの蛍光放出は二重鎖状態のＤＮＡの存在下で高まり、二本鎖ＤＮＡが解きほぐれたときには低下する。しかしながら、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄの励起ピークは４９５ｎｍにあり、発光ピークが５３７ｎｍにある。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄは、報告によれば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩよりも安定であるようである。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は、二重鎖状態のＤＮＡのＡＴ富領域に結合する既知のビスベンズイミド系の二本鎖ＤＮＡ検出分子である。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は３５０ｎｍで励起し、４５０ｎｍで発光する。ＹＯ−ＰＲＯ−１は４５０ｎｍで励起し、５５０ｎｍで発光し、二重鎖ＤＮＡ特異的な検出分子であることが報告されている。本発明の好ましい実施形態において、二本鎖ＤＮＡ検出分子はＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩである。
プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子はプライマーに共有結合的に連結され、アンプリコンが二重鎖構造を形成するとき、蛍光放出の増大または低下のいずれかをもたらす。プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子がプライマーの３’末端の近くに結合し、プライマーの末端塩基がｄＧまたはｄＣのいずれかであるとき、増大した蛍光放出が観測される。この検出分子は、末端のｄＣ−ｄＧ塩基対およびｄＧ−ｄＣ塩基対の近傍では消光され、また、検出分子がプライマーの末端から少なくとも６ヌクレオチド離れて内部に存在するときにはアンプリコンの二重鎖形成の結果として脱消光される。脱消光は、蛍光放出における実質的な増大をもたらす。このタイプの検出分子の例には、フルオレセイン（４８８ｎｍで励起し、５３０ｎｍで発光する）、ＦＡＭ（４９４ｎｍで励起し、５１８ｎｍで発光する）、ＪＯＥ（５２７で励起し、５４８で発光する）、ＨＥＸ（５３５ｎｍで励起し、５５６ｎｍで発光する）、ＴＥＴ（５２１で励起され、５３６ｎｍで発光する）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（５９０ｎｍで励起し、６１５ｎｍで発光する）、ＲＯＸ（５７５ｎｍで励起し、６０２ｎｍで発光する）およびＴＡＭＲＡ（５５５ｎｍで励起し、５８０ｎｍで発光する）が含まれるが、これらに限定されない。対照的に、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子のいくつかは、一本鎖ＤＮＡに対して二本鎖ＤＮＡの存在下でその発光を低下させる。例には、ローダミンおよびＢＯＤＩＰＹ−ＦＩ（５０４ｎｍで励起し、５１３ｎｍで発光する）が含まれるが、これらに限定されない。これらの検出分子は、通常、５’末端のｄＣまたはｄＧにおいてプライマーに共有結合によりコンジュゲート化され、アンプリコンが二重鎖であるときにはより小さい蛍光を発光する。二重鎖を形成したときの蛍光の低下は、検出分子の極近傍での相補鎖におけるグアノシンが消光するためであるか、または、末端のｄＣ−ｄＧ塩基対が消光するためであると考えられる。
加えて、ＰＣＲキットおよびリアルタイムＰＣＲキットは、少なくとも１つのｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなど、これらに限定されない）を含むことができる。ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰなどのアナログもまた意図される。
本発明の好ましい実施形態によれば、キットはさらに、使用者が少なくとも１つのコントロール試験を行って、ＰＣＲ成績を確保することを可能にするために、少なくとも１つのコントロールテンプレートＤＮＡおよび／または少なくとも１つのコントロールプライマーを含むことができる。
本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡ配列を増幅する方法が提供され、この場合、この方法は、図２ｂの流れ図に例示される下記の方法工程を含む。この方法の第１の工程において、本発明の液体組成物が提供され、第２の工程において、多数のＰＣＲサイクルが、液体組成物の存在下、ＤＮＡ配列に対して実行される。
ＰＣＲサイクルを、この分野で知られている任意の方法で行うことができ、例えば、米国特許第４６８３１９５号、同第４６８３２０２号、同第４８００１５９号、同第４９６５１８８号、同第５５１２４６２号、同第６００７２３１号、同第６１５００９４号、同第６２１４５５７号、同第６２３１８１２号、同第６３９１５５９号、同第６７４０５１０号および国際特許出願公開ＷＯ／９９１１８２３に開示されるＰＣＲサイクル（これらに限定されない）を行うことができる。
好ましくは、それぞれのＰＣＲサイクルにおいて、ＤＮＡ配列は最初に、一本鎖の相補的な鎖を形成するために処理される。続いて、ＤＮＡ配列に対して特異的である対になったオリゴヌクレオチドプライマーが液体組成物に加えられる。その後、プライマー対は、一本鎖の相補的な鎖における相補的な配列にアニーリングさせられる。適正な条件のもとで、アニーリングされたプライマーが伸張して、一本鎖のそれぞれに対して相補的である伸張生成物を合成する。
ポリヌクレオチドを固体支持体（例えば、ガラスビーズなど）に固定することは、分子生物学研究および医学の分野ではこの上なく有益であり得る。
本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、任意のサイズの鎖を形成するためにつながったＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子として定義される。
ポリヌクレオチドは、研究および医学的適用の過程において多くの方法で操作することができ、これには、例えば、増幅、転写、逆転写、連結、制限消化、トランスフェクションおよび形質転換（これらに限定されない）が含まれる。
本明細書中で使用される「連結」は、１つの核酸鎖の３’末端を別の核酸鎖の５’末端とつなぎ、これにより、連続した鎖を形成することとして定義される。「転写」は、ＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの合成として定義される。「逆転写」は、ＲＮＡからのＤＮＡの合成として定義される。「制限消化」は、ＤＮＡ分子を、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれる特別な酵素でより小さい小片に切断するプロセスとして定義される。「形質転換」は、細菌細胞が裸のＤＮＡ分子を取り込むプロセスである。「トランスフェクション」は、細胞がＤＮＡ分子を取り込むプロセスである。
典型的には、ＤＮＡ操作は一連の反応を次々に含む。従って、典型的な一例として、ＤＮＡを最初に制限消化し、増幅し、次いで細菌に形質転換することができる。それぞれの反応が、好ましくは、それ自身の特有の緩衝液を必要とするそれ自身の好適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応の間で、ＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルを沈殿させ、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成しなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間がかかり、また、より重要なことに、出発物質の喪失をもたらし、このことは、出発物質が希少であるときには最大の関心事であり得る。ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することによって、これが回避される。
従って、本発明のさらなる態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物が提供され、この場合、液体組成物は、固体支持体の存在下での少なくとも１つの高分子の操作を可能にすることができ、それにより、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
固体支持体は、ＤＮＡおよびＲＮＡと結合することができ、その一方で、他の分子が接近して結合し、また、上記で議論されたように、その後の反応においてそのＤＮＡおよびＲＮＡと相互作用することを可能にする任意の固体支持体であり得る。
本発明の発明者は、ガラスビーズが、ポリヌクレオチドを固定することができる一方で、ポリヌクレオチドが無傷であり続けるために本発明の液体組成物を要求することを見出した。従って、実施例１６において記載されるように、ガラスビーズの存在下でＰＣＲ増幅を受けているＤＮＡは、ＰＣＲ生成物が可視化されるために、本発明の液体組成物の存在を要求する。
核酸増幅のほかに、本発明の液体組成物は、多くの化学的および生物学的なアッセイおよび反応を改善するために、緩衝液として、または既存の緩衝液への追加物として使用することができる。
従って、１つの実施形態において、本発明の液体組成物は、ＤＮＡ分子を少なくとも部分的に解きほぐすために使用することができる。
別の実施形態において、本発明の液体組成物は、ＤＮＡの単離および精製を容易にするために使用することができる。
さらに別の実施形態において、本発明の液体組成物は、実施例１９において明らかにされるように、核酸のハイブリダイゼーションを高めるために使用することができる。核酸はＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子（すなわち、核酸配列またはその１個だけの塩基）であり得る。
核酸の一方を固体支持体（例えば、ＤＮＡチップ）に結合することができる。ＤＮＡチップの例には、フォーカスアレイチップ、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップおよびＩｌｌｕｍｉｎａビーズアレイチップが含まれるが、これらに限定されない。
液体組成物は、ハイブリダイゼーションを高めることが示されたので、本発明は、低い発現レベルを有する遺伝子を検出することにおいて特に有用であり得る。
さらなる実施形態において、本発明の液体組成物は、結合型酵素または非結合型酵素のいずれかであっても、多くの酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど、これらに限定されない）の酵素活性を安定化させるために使用することができる。
さらに別の実施形態において、本発明の液体組成物は、高分子が固相マトリックスに結合することを高めるために使用することができる。下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように（実施例１１を参照のこと）、本発明の液体組成物は、親水性物質および疎水性物質の両方に対する結合を高めることができる。加えて、本発明の液体組成物は、疎水性領域および親水性領域を有する物質に対する結合を高めることができる。上記物質に対する多くの高分子の結合を高めることができ、それらには、限定されないが、１つまたは複数の炭水化物親水性領域または炭水化物疎水性領域を有する高分子、抗体、ポリクローナル抗体、レクチン、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子などが含まれる。
加えて、下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように（実施例１２〜実施例１４を参照のこと）、本発明の液体組成物は、カラムの容量（樹脂に対する核酸の結合）を増大させるために、また、ゲル電気泳動分離を改善するために使用できることが本発明者によって見出されている。
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
下記の実施例は、本発明のナノ構造および液体組成物を使用して行われている様々な特徴づけ実験に向けられている。下記の実験において使用されたナノ構造および液体組成物は、本明細書中上記でさらに詳述されるように、本発明に従って製造された。より具体的には、ナノ構造および液体組成物を提供するために用いられた製造方法において、下記のプロトコルが使用された：
最初に、ミクロサイズのＢａＴｉＯ３の粉末を８８０℃の温度に加熱した。次いで、９１５ＭＨｚの周波数での連続波ＲＦ放射線の条件のもとで、上記の加熱された粉末を２℃の温度で水に浸した。放射線および突然の冷却により、粉末のミクロサイズの粒子がばらばらにされ、ナノ構造になった。続いて、液体組成物（ナノ構造および水）を室温に加熱した。
下記の実施例のうちのいくつかでは、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造された様々な液体組成物が、ＬＣ１、ＬＣ２、ＬＣ３、ＬＣ４、ＬＣ５、ＬＣ６、ＬＣ７、ＬＣ８およびＬＣ９として示される。本発明の様々な例示的実施形態に従って製造された様々な液体組成物の他の例のいくつかは、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．の商標である商標名ＮｅｏｗａｔｅｒＴＭによって示される。
実施例１
固液カップリングおよびナノ構造のクラスター形成
本実施例では、コア材料に対する取り囲んでいる流体分子のカップリングを、構造的流体システムの現代技術の１つである極低温透過電子顕微鏡観察（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）によって調べた。分析は下記の工程を伴い、第１の工程において、本発明の液体組成物（ＬＣ１）を、ガラス質サンプルが得られるように超急速で冷却し、次いで、第２の工程において、ガラス質サンプルを極低温でＴＥＭによって調べた。
図３ａ〜図３ｅは本発明のナノ構造のＴＥＭ画像を示す。図３ａは、４つのナノ構造によって占められる領域（約２００ｎｍの長さおよび約１５０ｎｍの幅）の画像である。図３ａに示されるように、ナノ構造は、流体分子の中間領域を介してクラスターを形成している。１つのそのような領域が黒矢印によって示される。ナノ構造を取り囲む条線（図３ａにおいて白矢印によって示される）はその結晶性構造を示唆している。
図３ｂは１つのナノ構造（約２０ｎｍの直径）の画像である。明るいコロナ（白矢印によって示される）は、フレスネル効果として一般に知られている光学的干渉作用の結果であり得る。より暗いさらなるコロナ（図３ｂにおいて黒矢印によって示される）が、明るいコロナと比較して、ナノ構造の中心からさらに遠い距離で観測された。この暗いコロナは、コアを取り囲む流体分子の整列した構造、その結果、ナノ構造全体が定常的な物理的状態にあることを示している。
図３ｃ〜図３ｅは等しい倍率であり、倍率が、図３ｃに示されるスケールバーにより例示される。図３ｃは、図３ａよりも大きい倍率で、本発明のナノ構造がクラスター形成することができることをさらに明らかにしている。図３ｄは、結晶性の小平面によって特徴づけられる１つのナノ構造を示し、図３ｅは、一方が結晶性の小平面によって特徴づけられ、もう一方が、その結晶性構造にこれもまた起因すると考えられる十分に規定された暗い領域を有する２個のナノ構造からなるクラスターを示す。
実施例２
液体組成物に対する色素の影響
本発明の液体組成物と色素との相互作用を調べた。上記でさらに詳述されるように製造された液体組成物を、エタノールに溶解されたＲｕ系色素（Ｎ３）により着色した。
本発明の液体組成物（ＬＣ１）を含有する１つのキュベットを色素溶液に２４時間さらした。液体組成物を含有する別のキュベットを下記のプロトコルにさらした：（ｉ）撹拌、（ｉｉ）空気流による乾燥、および（ｉｉｉ）乾燥。純水を含有する２つのさらなるキュベットをコントロール群として上記試験に供した。
図４はこれら４つの試験の結果を示す。図４に示されるように、色素の添加は、色が維持された純水の場合（図４における下段の曲線を参照のこと）とは対照的に、色素の色の消失をもたらしている（図４における下段の曲線を参照のこと）。従って、ナノ構造との相互作用は、電子構造を変化させるか、または、色素の酸化のいずれかによって色素のスペクトルに影響を及ぼしている。
色の消失はキュベットの写真で最もよく明らかである。本発明の液体組成物を含有する図４に示されたすべてのサンプルは撹拌された。「乾燥Ｓ−Ｒ」と表されるサンプルは２４時間にわたって乾燥状態で保たれ、湿潤「Ｓ−Ｒ」と表されるサンプルはエタノールとともに維持され、「色素Ｓ−Ｒ」と表されるサンプルは着色され（エタノール中の色素）、「色素Ｓ−乾燥Ｒ」と表されるサンプルは乾燥および再測定された。
実施例３
液体組成物に対する高ｇ遠心分離の影響
本発明の液体組成物を含有するチューブを高ｇ値（約３０ｇ）で遠心分離した。
図５ａ〜図５ｂは遠心分離後の本発明の液体組成物（ＬＣ１）の５回の積分光散乱（ＩＬＳ）測定の結果を示す。図５ａはチューブの下部部分で記録されたシグナルを示す。示されるように、１μｍ未満の構造体からのシグナルは下部部分からは記録されなかった。図５ｂはチューブの上部部分で記録されたシグナルを示す。１μｍ未満の構造体の明確な存在が示される。すべての測定において、ピークの位置は約２００ｎｍ〜３００ｎｍのナノ構造と一致している。
この実験では、ナノ構造が、ホストの液体（水）の比重よりも小さい比重を有することが明らかにされた。
実施例４
ｐＨ試験
本発明の液体組成物を２つのｐＨ試験に供した。最初の試験では、カルミン酸指示薬が、変化するｐＨの目安を提供するように本発明の液体組成物（ＬＣ１）に添加された。
図６ａは滴定期間中におけるカルミン酸指示薬のスペクトル変化を示す。これらのスペクトルが、液体組成物のｐＨを調べるために使用される。図６ｂは、液体組成物のスペクトルがｐＨ７．５における水のスペクトルに近いことを示している。図６ｃは、この処理で使用された最初の水とは異なり、いくつかの液体組成物サンプルがｐＨ７．５のスペクトルを有することを示している。
最初の試験の結果は、液体組成物が、純水のｐＨ値よりも大きい７．５のｐＨを有することを示す。
第２の試験では、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）が本発明の液体組成物（ＬＣ１）に添加された。この指示薬はｐＨ自体に影響を及ぼさず、しかし、目的とするｐＨ範囲において色を変化させる。
サンプルＮｏ．１およびサンプルＮｏ．４についての吸収スペクトルを図７に示す。図７において、「ＨＷ」は液体組成物のスペクトルを表し、「＋」は正の特性結果を表し、「−」は負の特性結果を表す。ＢＴＢの２つの吸収ピークが図７に示される。これらのピークは、より酸性の場合について黄色の色をもたらし、より塩基性のときには緑青色をもたらす。液体組成物に添加されたとき、色と液体組成物の性状との間での相関が見出された。液体組成物の緑色の色（塩基性）は、特性がより大きいことを示す。
実施例５
ゼータ電位測定
ゼータ（ζ）電位測定を本発明の液体組成物に対して行った。図８は６個のサンプルのζ電位を示す（超純水、ｐＨ８に変化させた超純水、ｐＨ１０に変化させた超純水、正の特性を有する液体組成物の２つのサンプル、および、負の特性を有する液体組成物の１つのサンプル）。ζ電位の測定を、Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒを使用して行った。
示されるように、本発明の液体組成物のζ電位は著しくより大きい。このことは、液体中におけるナノ構造の移動度が大きいことを示している。
実施例６
バクテリオファージ反応
バクテリオファージの型決定に対する本発明の液体組成物（ＬＣ９）の影響を調べた。
材料および方法
１）Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ（英国）（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｐｈｌｓ．ｃｏ．ｕｋ）から得られる、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）のファージ型決定のための標準的な国際キットのバクテリオファージ（Ｎｏ．６およびＮｏ．８３Ａ）を調べた。
２）寒天平板用の培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天Ｏｘｏｉｄ Ｎｏ．２（カタログ番号ＣＭ６７、Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．）＋ＣａＣｌ２。オートクレーブ滅菌後、２０ｍｌのＣａＣｌ２を各１リットルの培地について加えた。
３）液体培養用の培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ２ Ｏｘｏｉｄ：２８ｇｒ／リットル。
４）ファージ型決定のための濃度：各バクテリオファージを１ＲＴＤおよび１０ＲＴＤ（日常的試験希釈度）で試験した。
５）ファージの増殖：各ファージを、コントロール培地、および、本発明の液体組成物に基づく被試験培地において平行して増殖させた。
６）溶菌表面積を表面積測定のためのコンピューター処理「Ｓｋｅｔｃｈ」ソフトウエアを使用して測定した。
７）統計学的分析：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳ（商標）ソフトウエアを使用して、反復測定による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を光学的濃度分析について使用し、２元配置ＡＮＯＶＡを溶解表面積の測定値について使用した。
結果
バクテリオファージ反応の促進
図９ａ〜図９ｂは、下記のように、被試験培地におけるバクテリオファージ反応を例示する。図９ａはコントロール培地（右側）および本発明の液体培地（左側）におけるバクテリオファージＮｏ．６を示し、図９ｂはコントロール培地（右側）および本発明の液体培地（左側）におけるバクテリオファージＮｏ．８３Ａを示す。本発明の液体培地におけるバクテリオファージ反応は、細菌の溶解が促進されたことを明らかにした（液体組成物では１時間以内であり、コントロール培地では３時間以内であった）。
被試験平板における優れた溶解面積が直ちに観測され、２４時間のインキュベーションで、より大きいままであった。コントロール平板と被試験平板との間での鮮明な違いが、ＲＴＤ濃度を測定することによって明らかにされた。
面積測定
図１０は、コントロールおよび液体組成物の溶菌表面積の比較を示すヒストグラムである。統計学的有意性を、ファージ型決定についての２元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。対応する数字が下記の表１および表２に示される。
ファージ反応面積における著しい増大が液体組成物に関して見出された（ｐ＝０．０１４）。著しい違いが、ファージとの間（ｐ＝０．１１３）および培地相互作用との間（ｐ＝０．３９７）では認められなかった。このことから、本発明の液体組成物は両方の被試験ファージに対して同一の影響傾向を有することが明らかにされる。
ＲＴＤ測定
図１１は、それぞれの増大において１０倍ずつ増大する希釈度を示す。本発明の液体培地におけるファージの増大した濃度が、ウエル１よりも１００倍大きいウエル３において観測された。
溶菌−光学的濃度の読み取り
図１２は、時間を関数とするファージＮｏ．６における光学的濃度（ＯＤ）のグラフである。開始からの平均変化およびファージ反応のＯＤについての対応する数字が表３および表４にそれぞれ示される。反復測定についてのＡＮＯＶＡが表５に示される。
図１２および表３〜表５において明らかにされるように、著しい相関が培地および時間との間に存在する。より具体的には、時間における著しい異なる傾向が、ファージＮｏ．６およびファージＮｏ．８３Ａの両方において、コントロールおよび本発明の液体組成物との間に存在する（ｐ＝０．００１）。本発明の液体組成物におけるファージ反応は、逆方向による著しく異なる傾向を有する。
２２時間で、溶解の増加「反発」が認められた。これは、ファージの増大した能力のためであると考えられる。
コントロールのＯＤのすべて（培地単独、ファージ単独、細菌単独、異なるファージを伴うコントロールおよび組成物において）は、コントロール間で差がないことを明らかにし、また、試験された反応とは著しく異なっていた。
結論
本発明の液体組成物はファージ反応時間を促進し（３倍）、かつ、溶菌表面積を増大させ、また、ＲＴＤを増大させている（１００倍以上）。
本発明の液体組成物におけるバクテリオファージ反応は、ＯＤ測定においてコントロールに匹敵する逆の傾向、および、時間とともに増大する能力を明らかにしている。
考察
ファージ−宿主相互作用の速度論が、液体組成物を含有する培地では高まっている。このことは、反復実験において、また、測定された「成長曲線速度論」において観測された。速度論に影響するパラメーターは、測定された因子（例えば、ｐＨ、温度など）には依存していない。２２時間の反応の後で観測されたように、ファージ濃度だけでなく、その能力もまた増大している。本発明の液体組成物におけるファージが依然として効果的であるとき、コントロール培地におけるファージは効果的でない。加えて、液体組成物により前処理された増殖中の株ははるかにより効果的である。
実施例７
ファージ−細菌相互作用に対する液体組成物の影響
ラムダ（λ）ファージに対する本発明の液体組成物の影響を調べた。λファージは、生物のゲノムＤＮＡを提示するために分子生物学において使用されている。下記の実験は標準的なλファージ相互作用適用に依る。すべての実験において、試験群における材料は、液体組成物を溶媒として用いて調製された。コントロール群における材料は本明細書中下記に記載されるように調製された。コントロール群のｐＨを、７．２〜７．４の間である液体組成物溶液のｐＨに調節した。
材料および方法
１）ＬＢ培地
１０ｇのＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、オートクレーブ（１２１℃、１．５ａｔｍ、４５分間）によって滅菌する。
２）ＬＢ平板
１５ｇのＢａｃｔｏ Ａｇａｒを１０００ｍｌのＬＢ培地に加え、混合し、上記のようにオートクレーブ処理した。５０℃に冷却した後、培地を滅菌プラスチックプレートに注いだ。平板を使用前に２日間プレインキュベーションした。
３）上層アガロース、０．７％
１００ｍｌのＬＢ培地を０．７ｇの化学的に純粋な電気泳動規格のアガロース（Ｄｉｆｃｏまたは他の供給者から得られる）と混合し、オートクレーブ（１２１℃、１．５ａｔｍ、４５分間）によって滅菌した。
４）ＭｇＳＯ４−１０ｍＭ
１．２ｇのＭｇＳＯ４を１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、オートクレーブによって滅菌した。
５）マルトース、２０％（ｗ／ｖ）
２００ｇのマルトースを１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、２０μｍのフィルターによるろ過によって滅菌した。
６）ＭｇＳＯ４−１Ｍ
１２０．３７ｇのＭｇＳＯ４を１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、オートクレーブによって滅菌した。
７）１０ｍＭのＭｇＳＯ４および０．２％のマルトースを含むＬＢ
１００μｌのＭｇＳＯ４（１Ｍ）および１００μｌのマルトース（２０％）を９９．８ｍｌのＬＢ培地に加えた。
８）ＳＭ緩衝液（ファージ貯蔵緩衝液）
５．８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ４、５０ｍＭの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｌの２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを蒸留水に溶解して、１０００ｍｌの最終体積にし、その後、オートクレーブによって滅菌した。
９）細菌株（宿主）
大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
１０）ファージ：
λＧＥＭ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
１１）ＬＢ平板での細菌培養
ＸＬ１細胞を、細菌接種の一般的な手順に従って微生物学的白金耳によりＬＢ平板上に分散させた。平板を３７℃で１６時間インキュベーションした。
１２）ＬＢ液体培地での細菌培養
単一コロニーのＸＬ１細胞をＬＢ平板から取り、ＬＢ液体培地に接種し、続いて、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間（一晩）インキュベーションした。
１３）ファージによる宿主細菌株への感染
ＸＬ１細胞を、１０ｍＭのＭｇＳＯ４および０．２％のマルトースが補充されたＬＢ培地に接種した。２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃でのインキュベーションを、６００ｎｍの波長における０．６の濁度が達成されるまで（４時間〜５時間）続けた。成長した培養物を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細菌を、６００ｎｍの波長における０．６の濁度が達成されるまで１０ｍＭのＭｇＳＯ４に再懸濁した。ファージを含有するＳＭ緩衝液の必要量を２００ｍｌの再懸濁された細菌に加えた。３７℃で１５分間インキュベーションした後、２つの代替的手順を行った：
（ｉ）溶解物を調製するために、適量のＬＢ培地を宿主−ファージ混合物に加え、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間（一晩）インキュベーションした。
（ｉｉ）固体培地におけるファージ出現（プラーク）のために、溶融した上層アガロース（５０℃）を宿主−ファージ混合物に注ぎ、素早く混合し、事前に暖めたＬＢ平板に広げた。アガロースが固化した後、インキュベーションを３７℃で１６時間（一晩）行った。
１４）ファージＤＮＡの抽出
細菌溶解物を、細菌破片を沈降させるために６０００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心分離した。上清を集め、ファージ粒子を沈降させるために１４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を捨て、ファージペレットをゼラチン非含有のＳＭ緩衝液に再懸濁した。ヌクレアーゼの混合物（任意の供給者から得られるＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ）を、１μｌのファージ懸濁物あたり５Ｗｅｉｓｓ単位〜１０Ｗｅｉｓｓ単位の最終的濃度にするために、再懸濁されたファージに加えた。何らかの残留する細菌核酸の完全な消化のために要求されるように３７℃で３０分間インキュベーションした後、ファージのＤＮＡを下記の手順によって抽出した：
（ｉ）フェノール：クロロホルム：ｉｓｏ−アミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）による抽出；
（ｉｉ）クロロホルムによるフェノール混入物の除去；
（ｉｉｉ）０．３Ｍ酢酸カリウムの最終的な濃度および１体積のイソプロパノールによる沈殿化；
（ｉｖ）７０％エタノールによる洗浄；および
（ｖ）乾燥、および、さらなる分析のための蒸留水での再懸濁。
結果
プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）力価実験
ファージ懸濁物を一連の１／１０希釈でＳＭ緩衝液におけるファージストックから調製した：１つを、発明の液体組成物に基づくＳＭ緩衝液で調製し、１つを、ｄｄＨ２Ｏに基づくＳＭ緩衝液で調製した。
１μｌの各希釈物を２００μｌのコンピテント細菌宿主とインキュベーションした（方法の項目１３を参照のこと）。懸濁物を３７℃で１５分間インキュベーションして、バクテリオファージがそのＤＮＡを宿主細菌内に注入することを可能にした。インキュベーション後、熱い（４５℃〜５０℃）上層アガロースを加え、ＬＢ平板上に分散させた。それぞれの希釈物および処理の９個の複製物を調製した。
下記の表６は、一晩のインキュベーションの後で計数されたＰＦＵレベルを示す。
数字を、パラメトリック検定を行うために必要とされるようにデータを正規化するために平方根変換によって修正した。下記の表７には、要因ＡＮＯＶＡによるデータ分析の結果が示される。
ＰＦＵ力価における著しい影響が、濃度間（０．０００１に対して０．００１）、処理間（コントロールに対して試験）、および、相互作用間（処理および濃度の任意の組合せ）で検出された。濃度間の著しい差が実験構造の結果として予想された。しかしながら、本発明の液体組成物の処理により引き起こされるようなＰＦＵ力価における著しい増大は、本明細書中下記において本実施例の考察の節で示される特別な説明を必要とする。
ＬＢにおける大腸菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅの細菌成長
２μｌの細菌懸濁物を、コントロールと、本発明の液体組成物に基づく培地との両方で２つのＬＢ平板の各１／８領域に接種した（合計で１６個の接種）。３７℃で３日間インキュベーションした後、コロニーの形状およびサイズを観察した。著しい差がコントロールと液体組成物処理との間で観察されなかった。
ＬＢ細菌培養物（溶解物）におけるファージ成長
溶解物を方法（項目１３）に記載されるように調製し、６０００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心分離して、細菌破片を沈降させ、濁度を６００ｎｍで測定した。その後、ＤＮＡを、本明細書中上記において方法（項目１４）で記載されたように溶解物から抽出した。著しい差が、濁度および抽出ＤＮＡ濃度（コントロールにおいて０．７２６μｇ／μｌ；液体組成物において０．７１８μｇ／μｌ）の両方においてコントロールと液体組成物処理との間で観察されなかった。
考察
３つのうちの２つの独立した実験において、本発明の液体組成物がコントロールと比較して使用されたとき、低いファージ希釈度（１０−３および１０−４）でのＰＦＵにおける著しい増大が観測された。
上記観察結果の考えられる説明は、プラーク形成が２つの別個のプロセス（その宿主に感染するファージの能力（感染性）およびファージに対する宿主適合性）に依存するという点にある。
宿主適合性は、ファージが繁殖するために細菌の機構を採用するファージの能力に依存する。宿主適合性に対する本発明の液体組成物との間における相関は何ら見出されなかった。増大した適合性は、コントロールのプラークよりも大きいプラーク（最初の感染部位からより大きい距離）、または、コントロールのファージ粒子の数よりも大きい数のファージ粒子のいずれかが観察されることによって明らかにすることができる。
本発明の液体組成物がＤＮＡファージのレベルに影響しなかったという事実は以前の発見を裏付けている。
感染性は本質的なファージ粒子に依存し、かつ／または、ファージが感染するための細菌細胞の能力に依存する。本発明の液体組成物が使用されたときのＰＦＵにおける著しい増大（コントロールよりも約２倍大きい）は、本発明の液体組成物が感染性に影響を及ぼすことを示している。予備感染処理（方法（項目１３）を参照こと）が、非処理の細菌よりも容易にファージが感染するコンピテント細菌を調製することによって感染の確率を増大させるために要求される。
低いファージ希釈度では、ＰＦＵ形成の制限因子は、ファージが感染するための宿主細胞の能力である。
本発明の液体組成物により処理され、かつ、本発明の液体組成物とともに成長した細菌は、ファージによる感染の増大した能力を有していたようである。従って、液体組成物は細菌の受容体とファージ粒子との間での親和性を増大させていることが推測される。
実施例８
マイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する液体組成物の影響
粘着物多糖の産生はバイオフィルムの生成および維持にとって非常に重要であり、また、細菌における毒性因子として主要な役割を果たしている［Ｇｏｔｚ Ｆ．「ブドウ球菌およびバイオフィルム」、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００２、４３（６）：１３６７〜７８］。粘着物は表面への細菌の付着および細菌の蓄積を容易にして、層状のクラスターを形成する。粘着物はまた、宿主の免疫防御および抗体処理から保護する［Ｋｏｌａｒｉ Ｍ．他、「抄紙機バイオフィルムにおける着色した中程度好熱性細菌」、Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）に出版される予定］。細菌によって産生されるバイオフィルムは産業界においても様々な問題を生じさせ得る。
粘着物を防止するための現在の概念のほとんどは、バイオフィルムにおいて活性である新しい感染防止剤、および、バイオフィルムを絡ませる新しい生体適合性材料についての探索に関連している。
シリコーン表面へのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着がＭＩＣ以下の抗菌剤によって変化し得ることが明らかにされている［Ｂｅｓｎｉｅｒ ＪＭ他、「コアグラーゼ陰性ブドウ球菌のシリコーンへの付着および疎水性に対する抗菌剤の亜阻害濃度の影響」、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃ、１９９６、１（４）：２４４〜２４８］。この作用は粘着物産生株および粘着物非産生株では異なり、また、このような抗菌剤の阻害作用の機構、または、疎水性の修飾と相関していなかった。このことは、疎水性に関与していない一部の表面成分がインビトロ付着において役割を果たし得ることを示唆している。
抗生物質に対する表皮ブドウ球菌（インプラントに関連した感染症の重大な病原体）の細菌抵抗性が、抗生物質の接近および宿主防御機構による殺傷を損なう糖衣粘膜の産生に関連づけられている［Ｋｏｎｉｇ ＤＰ他、「４つの異なる骨セメントにおける表皮ブドウ球菌ＲＰ６２Ａおよび表皮ブドウ球菌Ｍ７のインビトロ付着および蓄積」、Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ、２００１、３８６（５）：３２８〜３２］。生体材料に関連した感染を防止するために開発された、抗生物質を含有する種々の骨セメントのインビトロ研究では、生体材料付着性細菌の完全な根絶を必ずしも常に明らかにすることができなかった。さらなる努力が、粘着物付着からのより良好な保護を見つけ出すために行われている。
加えて、表面の相互作用は粘着物付着を変えることができる。例えば、Ｆａｒｏｏｑ他［Ｆａｒｏｏｑ Ｍ他、「ゼラチンによりシールされたポリエステルは表皮ブドウ球菌バイオフィルム感染を阻止する」、Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ、１９９９、８７（１）：５７〜６１］は、ゼラチン含浸ポリエステル移植片が表皮ブドウ球菌バイオフィルム感染を大動脈移植片間置のイヌモデルにおいて阻害することを明らかにした。ゼラチン含浸ポリエステル移植片は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌バイオフィルム感染に対するインビボ抵抗性を明らかにした。
本実施例における実験の目的は、粘着物を産生する表皮ブドウ球菌（ＡＰＩ−６７０６１１２）のプラスチックへの付着に対する本発明の液体組成物の影響を調べることであった。
方法
使用された細菌は、Ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ ｓａ Ｍａｒｃｙ ｌ’ Ｅｏｉｌｅ（フランス）（ＡＰＩ）を使用して同定され、表皮ブドウ球菌６７０６１１２について９８．４％の信頼度であった。下記の表８には、使用された３つの細菌株がまとめられる。
粘着物付着を下記のように分光光度計による光学的濃度（ＯＤ）技術によって定量的に調べた。本発明の液体組成物および通常の水を用いたＴＳＢにおける一晩培養物を、対応する培地により１：２．５で希釈し、滅菌のマイクロタイター組織培養プレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ、Ｇｒｅｎｉｎｅｒ ｌｏｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ＬＩＤを伴う組織培養プレート（９６Ｗ平底）、滅菌Ｎｏ．６５５１８０）にそれぞれ２５０μｌの総体積で入れ、３７℃でインキュベーションした。プレートを水道水により３回すすぎ、クリスタルバイオレットで染色し、水道水によりさらに３回すすいだ。乾燥後、染色された付着性細菌フィルムのＯＤを、５５０ｎｍの波長を使用することによってＭｉｃｒｏＥｌｉｓａ Ａｕｔｏリーダー（ＭＲ５０００；Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ．）により測定した。細菌培養物のＯＤを、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍｍの二重フィルターを使用してそれぞれの染色の前に測定した。それぞれの細菌株の試験を四連で行った。
実験を、様々な間隔で粘着物付着を評価するために設計した。速度論的評価のための時間表は、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間および４３時間であった。３つの菌株のすべてを同じプレートで評価した。液体組成物を標準的な培地調製のために使用し、液体組成物は標準的なオートクレーブ滅菌を受けた。
付着の値を、同じプレート試験について、反復測定によるＡＮＯＶＡを使用して比較した。グループ化因子はプレートおよび菌株であった。３元配置ＡＮＯＶＡを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳ（商標）１１．０を使用して異なるプレート試験について使用した。
結果
図１３ａ〜図１３ｃは粘着物産生の表皮ブドウ球菌（上記の表８を参照のこと）のすべてにおけるＯＤを示す。付着が本発明の液体組成物では著しく異なっていた（ｐ＜０．００１）。
菌株２４および菌株４４の速度論は、増大した粘着物付着を明らかにし（それぞれ図１３ａ〜図１３ｂ）、菌株５４は、低下した付着を明らかにした（図１３ｃ）。時間が、付着を低下させることにおける重要な因子であることが見出され、この場合、最後の１時間で、最も低い付着が観測された。著しい差が菌株間で見出され（ｐ＜０．００１）、それぞれの菌株がそれ自身の付着特性を有していた。著しい相互作用が、異なる菌株および時間との間で見出され（ｐ＜０．００１）、菌株間の差は時間依存的であった。回帰分析により、時間および使用された水のタイプとの間での相互作用は何ら見出されなかった（ｐ＝０．７８７）。液体組成物およびコントロールにおける付着の差はすべての時間で維持され、１８時間目から始まり、４３時間目でピークに達した。
菌株および水との間での著しい相互作用（ｐ＜０．００１）が見出された。液体組成物およびコントロールとの間での違いは菌株依存的であった。それぞれの菌株がそれ自身の付着特性を有していた。菌株、時間および水との間には相互作用は何ら見出されなかった（ｐ＝０．５３９）。
下記の表９には、粘着物付着速度論の結果がまとめられる（３元配置ＡＮＯＶＡ）。
反復粘着物付着実験を同じタイプの異なるプレートでのインキュベーション後２４時間で行った。この場合、それぞれの菌株を別個のマイクロタイタープレートでインキュベーションした。
図１４は、異なるマイクロタイタープレートでの粘着物付着の１５回の反復実験を表すヒストグラムである。示されるように、液体組成物の存在下での付着はコントロールにおける付着よりも大きい。
マイクロタイタープレート間および菌株間での液体組成物およびコントロールにおける付着の著しい違いが見出された（ｐ＜０．００１）。著しい相互作用が、プレート、菌株および使用された水のタイプとの間で見出された。付着の程度は、菌株、プレートおよび使用された水に依存している。
下記の表１０には、別個のマイクロタイタープレートでの粘着物付着の結果がまとめられる（３元配置ＡＮＯＶＡ）。
プレート対プレートの変動の可能性を調べるために、多数回の分析を同じプレートで行った（すべての菌株）。
図１５は、同じマイクロタイタープレートでの本発明の液体組成物とコントロールにおける粘着物付着の違いを示す。下記の表１１〜表１２には、同じマイクロタイタープレートでの粘着物付着の結果がまとめられる（反復測定によるＡＮＯＶＡ）。
表１１〜表１２に示されるように、液体組成物およびコントロールによる粘着物付着の間での著しい差がもう一度認められた。しかしながら、新たな著しい相互作用が、プレートとの間（ｐ＜０．００１）、菌株との間（ｐ＜０．００１）および水との間（ｐ＜０．００１）で存在することもまた見出された。このことから、液体組成物における付着の差が、プレート、菌株、および、それとの相互作用に依存することが確認される。
菌株およびプレートとの間での付着における著しい差はプレート毎の変動の可能性を指摘している。液体組成物によるプレート毎の変動は、液体組成物と相互作用し得る他の因子がプレート表面に存在し得るか、または、プレート調製時に存在し得ることを示している。
考察
その変化した表面付着性により細菌付着を変化させる本発明の液体組成物の能力を調べた。液体組成物による培地は、何らかの有機物またはＰＨ改変を除外して、コントロール培地と比較したとき、同一の緩衝液を含有し、かつ、同一のオートクレーブ滅菌を受けた。液体組成物における疎水性修飾は、粘着物がより付着性になるための、または、粘着物がより付着性にならないための環境的選択を生じさせることができる。表面特性の変化は、ナノ構造によって持ち込まれ、これにより、水の疎水的能力における変化を生じさせる新しい秩序によって説明されるかもしれない。
実施例９
電気化学的析出試験
本発明の液体組成物は擬二次元セルにおいて一連の電気化学的析出試験に供されている。
実験構成
実験構成が図１６ａ〜図１６ｃに示される。擬二次元セル２０は、直径が１２５ｍｍであり、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓのベース部２２およびＰｌｅｘｉｇｌａｓｓのカバー部２４を含んでいた。カバー部２４がベース部２２に置かれたとき、擬二次元の空洞（高さが約１ｍｍである）が形成された。２つの同心状の電極２６がセル２０に配置され、１２．４Ｖ±０．１Ｖの電源２８に接続された。外側電極がリング（直径が９０ｍｍである）として形状化され、０．５ｍｍの銅ワイヤから作製された。内側電極が、０．１ｍｍの厚さおよび２８ｍｍの直径を有するディスクとして形状化された。外側電極を電源の正極に接続し、内側電極をその負極に接続した。
最初に、この実験構成を使用して、電気化学的析出プロセスを、本発明の液体組成物に対して直接、また、比較のために、逆浸透（ＲＯ）水から構成されるコントロール溶液に対して行った。
次に、この実験構成を使用して、電気化学的析出の形跡を残す液体組成物の能力を下記のように調べた。液体組成物をセル２０に入れた。べース部２２と３０分間にわたって接触させた後、液体組成物をＲＯ水で置き換え、電気化学的析出プロセスをＲＯ水に対して行った。
結果
図１７ａ〜図１７ｂは本発明の液体組成物（図１７ａ）およびコントロール（図１７ｂ）の電気化学的析出を示す。密集した枝分かれ形態と、樹枝状成長との間での移行が液体組成物において観測された。密集した枝分かれ形態は負極の表面から数ミリメートルの距離にわたって広がった。コントロールでは、密集した枝分かれ形態が、負極の近い近傍でのみ観測されただけであり、形態の移行は全く観測されなかった。
図１８は、本発明の液体組成物と３０分間にわたって接触していたセルにおけるＲＯ水の電気化学的析出を示す。図１８および図１７ｂを比較すると、液体組成物はセルの表面に明確な形跡を残しており、従って、セルの表面における枝分かれ形態および樹枝状形態の形成を可能にすることを認めることができる。そのような形成は、ＲＯ水が清浄なセルに置かれた図１７ｂには存在しない。
電気化学的析出の形跡をセル上に保つ液体組成物の能力は、液体組成物とのインキュベーションの後でセル表面によってＲＯ水に誘導される遠距離の秩序として説明することができる。
実施例１０
細菌コロニーの成長
枯草菌のコロニー成長を本発明の液体組成物の存在下で調べた。コントロール群はＲＯ水の存在下での同じ細菌を含んだ。
図１９ａ〜図１９ｂは液体組成物（図１９ａ）およびコントロール（図１９ｂ）について２４時間後の枯草菌のコロニー成長の結果を示す。示されるように、本発明の液体組成物はコロニー成長を著しく促進させている。
本発明の液体組成物の特異な特徴をさらに明らかにするために、さらなる実験を、液体組成物のナノ構造が形成される原料粉末と、ＲＯ水との混合物を、上記でさらに詳述されるような製造プロセスを用いることなく使用して行った。この混合物は以降、原料源粉末（ＳＰ）水として示される。
図２０ａ〜図２０ｃは、ＳＰ水（図２０ａ）、ＲＯ水（図２０ｂ）および液体組成物（図２０ｃ）について枯草菌のコロニー成長の結果を示す。示されるように、ＳＰ水の存在下でのコロニー成長は、ＲＯ水におけるコロニー成長よりも一層遅く、このことは、原料自体が細菌に対して負の影響を有することを示している。他方で、本発明の液体組成物はコロニー成長を著しく促進させている。だが、原理上、液体組成物は同じ物質から構成されている。
実施例１１
固相マトリックスに対する高分子の結合
無数の生物学的な処理および反応が固相マトリックス（例えば、マイクロ滴定プレート、メンブラン、ビーズおよびチップなど）において行われる。固相マトリックスは、例えば、疎水的性質、親水的性質、電気的性質（例えば、荷電、極性）および親和性性質をはじめとする種々の物理的性質および化学的性質を有し得る。
本実施例において記載される実験の目的は、異なる物理的性質および化学的性質を有するマイクロ滴定プレートおよびメンブランへの生物学的物質の結合に対する本発明の液体組成物の影響を調べることであった。
方法
下記のマイクロ滴定プレート（すべてがＮＵＮＣ（商標）によって製造される）を使用した：（ｉ）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）（これは親水性／疎水性の混合領域を含有し、ＩｇＧおよび他の分子の大きい結合容量およびそれらに対する大きい結合親和性によって特徴づけられる（ＩｇＧの結合容量は６５０ｎｇ／ｃｍ２に等しい））；（ｉｉ）ＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）（これは疎水性表面を有し、脂質の大きい結合容量および脂質に対する大きい結合親和性によって特徴づけられる）；（ｉｉｉ）ＭｅｄｉｕｍＳｏｒｐ（商標）（これはＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）とＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）との間の表面化学を有し、タンパク質の大きい結合容量およびタンパク質に対する大きい結合親和性によって特徴づけられる）；（ｉｖ）Ｎｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）（これは、生体分子の低い結合容量および生体分子の低い結合親和性によって特徴づけられる非処理のマイクロ滴定プレートである）；および（ｖ）ＭｕｌｔｉＳｏｒ（商標）（これは親水性表面を有し、グリカンの大きい結合容量およびグリカンに対する大きい結合親和性によって特徴づけられる）。
ＣＯＲＮＩＮＧ（商標）（Ｃｏｓｔａｒ）の下記のマイクロ滴定プレートを使用した：（ｉ）中程度の結合性のマイクロ滴定プレート（これは親水性表面を有し、ＩｇＧに対する結合容量が２５０ｎｇ／ｃｍ２である）；（ｉｉ）炭素結合性のマイクロ滴定プレート（これは炭水化物に共有結合的にカップリングする）；（ｉｉｉ）高結合性のマイクロ滴定プレート（これは大きい吸着容量を有する）；および（ｉｖ）高結合性の黒色のマイクロ滴定プレート（これもまた大きい吸着容量を有する）。
上記マイクロ滴定プレートに対する生体分子の結合効率を、イオン強度、緩衝液ｐＨ、温度および時間の４つのカテゴリーにおいて試験した。
結合実験を、蛍光標識された生体分子、または、同じタイプの標識された生体分子および標識されていない生体分子の混合物でマイクロ滴定プレートをコーティングし、非結合分子を洗浄によって除き、プレート上に残留する蛍光シグナルを測定することによって行った。
下記のプロトコルを用いた：
１）蛍光性の標識された生体分子を結合緩衝液で種々の濃度（典型的には０．４μｇ／ｍｌ〜０．０２μｇ／ｍｌ）に予備希釈する。各１組の希釈を２つの結合緩衝液で行った：（ｉ）本発明の液体組成物および（ｉｉ）コントロールのＲＯ水。
２）各濃度からの１００μｌのサンプルをマイクロ滴定プレートに（三連で）分注し、最初の蛍光レベルを測定する。
３）プレートを４℃で一晩または３７℃で２時間インキュベーションする。
４）コーティング溶液を捨てる。
５）１５０μｌの洗浄液を各ウエルに加え、室温で５分間振とうする。この洗浄工程を３回繰り返した。典型的な洗浄液は、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、および０．０６Ｍ ＮａＣｌを含む。
６）０．０１Ｍの水酸化ナトリウムを含む２００μｌの蛍光読み取り溶液を加え、室温で１８０分または一晩インキュベーションする。
７）４８５ｎｍの励起波長、５３５ｎｍの放射波長および１０フラッシュの最適なゲインを用いて、蛍光底部モードを使用して蛍光を読み取る。
上記プレートへの糖タンパク質（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＸ）により標識されているか、また標識されていない１５００００ＤのＩｇＧ）の結合効率に対する本発明の組成物の影響を調べた。ＩｇＧは、主に親水性分子の混合物から構成されるポリクローナル抗体である。この分子は、共通領域において炭水化物の親水性領域を有し、かつ、可変領域においてわずかに疎水性である。そのようなタイプの分子は、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートに非常に大きい効率（６５０ｎｇ／ｃｍ２）で結合することが知られている。
下記のタイプの本発明の液体組成物を使用した：ＬＣ１、ＬＣ２、ＬＣ３、ＬＣ４、ＬＣ５およびＬＣ６（これらは本明細書中上記においてさらに詳述される通りである）。
下記の表１３には、ＩｇＧについて行われた６回のアッセイがまとめられる。表１３において、標識抗体のみが使用されたアッセイがＡｂ＊として表され、標識抗体および非標識抗体の混合物が使用されたアッセイがＡｂ＊／Ａｂとして表される。
ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）アグルチニン（ＰＮＡ）の結合効率に対する本発明の液体組成物の影響をＭａｘＳｏｒｐ（商標）プレートおよびＮｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）プレートに関して調べた。ＰＮＡは１１００００ダルトンのレクチンであり、それぞれが約２７０００ダルトンである４つの同一の糖タンパク質サブユニットから構成される。ＰＮＡレクチンは、親水性領域を介して、特定の立体配座の糖残基を有する糖タンパク質および糖脂質と結合する。ＰＮＡはまた、疎水性領域を有する。ＰＮＡ＊として表されるアッセイは３つのコーティング緩衝液の使用を含んでいた：（ｉ）炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）、（ｉｉ）酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．６）、および（ｉｉｉ）リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）。下記の表１４には、実験がまとめられる。
核酸の結合効率に対する本発明の液体組成物の影響を、ＭａｘＳｏｒｐ（商標）プレート、Ｐｏｌｙｓｏｒｐ（商標）プレートおよびＮｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）プレートに関して調べた。一般に、ＤＮＡ分子はポリスチレンプレートには良好に結合しない。より一層問題的であるのは、数千ダルトンの分子量を有する小さい一本鎖ＤＮＡ分子であるオリゴヌクレオチドの結合である。下記の表１５には、標識されたオリゴヌクレオチドの結合について行われた実験がまとめられる。このアッセイはＯｌｉｇｏ＊として表される。
ＩｇＧの結果および考察
図２１ａ〜図２２ｄは、中程度Ｃｏｓｔａｒ（商標）プレート（ａ）、Ｎｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）プレート（ｂ）、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（ｃ）およびＰｏｌｙｓｏｒｐ（商標）プレート（ｄ）に対するＡｂ＊／Ａｂアッセイの結果（図２１ａ〜図２１ｄ）およびＡｂ＊アッセイの結果（図２２ａ〜図２２ｄ）を示す。本発明の液体組成物を使用して得られた結果が中塗り記号（三角、四角など）により表され、コントロールの結果が白記号により表される。直線は線形回帰近似に対応する。結合効率を直線の勾配によって推定することができ、それにより、より大きい勾配はより良好な結合効率に対応する。
図２１ａ〜図２２ｄに示されるように、本発明の液体組成物を使用して得られた勾配は、コントロール実験で得られた勾配よりも急である。従って、本発明の液体組成物は結合効率を高めることができる。本発明の液体組成物の増強結合能がＳｒとして表され、これは、それぞれの図における２つの勾配の比率として定義され、その結果、Ｓｒ＞１は結合増強に対応し、Ｓｒ＜１は結合抑制に対応する。図２１ａ〜図２１ｄで得られた勾配について計算されたＳｒパラメーターの値はそれぞれ、１．３２、２．３５、１．６２および２．９６であり、図２２ａ〜図２２ｄで得られた勾配について計算されたＳｒパラメーターの値はそれぞれ、１．４２、１．２９、１．１０および１．７１であった。
図２３ａ〜図２４ｄは、ＮｏｎＳｏｒｐ（商標）プレート（ａ）、中程度Ｃｏｓｔａｒ（商標）プレート（ｂ）、ＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）プレート（ｃ）およびＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（ｄ）における４℃での一晩のインキュベーションについてのＡｂ＊アッセイの結果（図２３ａ〜図２３ｄ）および３７℃での２時間のインキュベーションについてのＡｂ＊アッセイの結果（図２４ａ〜図２４ｄ）を示す。図２１ａ〜図２２ｄと同様に、本発明の液体組成物およびコントロールを使用して得られた結果が中塗り記号および白記号によりそれぞれ表される。図２３ａ〜図２４ｄに示されるように、２つの発生事例（ＮｏｎＳｏｒｐ（商標）プレートにおける一晩のインキュベーション、および、ＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）プレートにおける２時間のインキュベーション）を除いて、本発明の液体組成物を使用して得られた勾配は、コントロール実験で得られた勾配よりも急である。具体的には、図２３ａ〜図２３ｄについて得られたＳｒパラメーターの計算値はそれぞれ、０．９４、１．１０、１．２０および１．２７であり、一方、図２４ａ〜図２４ｄについて得られたＳｒパラメーターの計算値はそれぞれ、１．１６、１．３５、０．９４および１．１１であった。
図２５ａ〜図２６ｄは、中程度Ｃｏｓｔａｒ（商標）プレート（ａ）、ＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）プレート（ｂ）、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（ｃ）およびＮｏｎＳｏｒｐ（商標）プレート（ｄ）における４℃での一晩のインキュベーションについてのＡｂ＊／Ａｂアッセイの結果（図２５ａ〜図２５ｄ）および室温での一晩のインキュベーションについてのＡｂ＊／Ａｂアッセイの結果（図２６ａ〜図２６ｄ）を示す。図２５ａ〜図２６ｄに示されるように、１つの発生事例（ｎｏｎ−ｓｏｒｐプレートにおける室温でのインキュベーション）を除いて、本発明の液体組成物を使用して得られた勾配は、コントロール実験で得られた勾配よりも急である。具体的には、図２５ａ〜図２５ｄについて得られたＳｒパラメーターの計算値はそれぞれ、１．１５、１．２５、１．０７および２．１０であり、図２６ａ〜図２６ｄについて得られたＳｒパラメーターの計算値はそれぞれ、１．３０、１．４８、１．３８および０．８４であった。
種々の洗浄プロトコルが、中程度Ｃｏｓｔａｒ（商標）プレートを使用して図２７ａ〜図２７ｄにおいて比較される。図２７ａ〜図２７ｂは、リン酸塩緩衝液が洗浄緩衝液として使用されたときのＡｂ＊／Ａｂアッセイの結果（図２７ａ）およびＡｂ＊アッセイの結果（図２７ｂ）を示し、図２７ｃ〜図２７ｄは、ＰＢＳを使用するＡｂ＊／Ａｂアッセイの結果（図２７ｃ）およびＡｂ＊アッセイの結果（図２７ｄ）を示す。Ａｂ＊／ＡｂアッセイおよびＡｂ＊アッセイについてのＳｒパラメーターの計算値（図２７ａ〜図２７ｄ）はそれぞれ、１．０３、０．９７、１．０４および０．７６であった。
図２８ａ〜図２８ｂは、中程度Ｃｏｓｔａｒ（商標）プレートが４℃での一晩のインキュベーションのために使用された１回の実験の結果を示す（表１３における最初の実験を参照のこと）。この実験で示されるように、Ｓｒパラメーターの計算値は、Ａｂ＊／Ａｂアッセイについては０．３７であり（図２８ａ）、Ａｂ＊アッセイについては０．６７であった（図２８ｂ）。
下記の表１７には、図２１ａ〜図２８ｂの結果が上記プレートのそれぞれについて結合増強（Ｓｒ＞１）および結合抑制（Ｓｒ＜１）に関してまとめられる。
表１７および図２１ａ〜図２８ｂにおいて明らかにされるように、本発明の液体組成物はＩｇＧ結合を高め、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートおよびＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）プレートにおいてより顕著な効果を有する。
レクチンの結果および考察
図２９ａ〜図２９ｃは、酢酸塩緩衝液（図２９ａ）、炭酸塩緩衝液（図２９ｂ）およびリン酸塩緩衝液（図２９ｃ）についてのＮｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）プレートに対するＰＮＡ吸収アッセイの結果を示す。図２９ａ〜図２９ｃにおいて、本発明の液体組成物を使用して得られた結果が白記号により表され、コントロールの結果が中塗り記号により表される。
酢酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液およびリン酸塩緩衝液についてのＳｒパラメーターの計算値はそれぞれ、０．６５、０．７５および０．７８であった。従って、３つの緩衝液のすべてにおいて、本発明の液体組成物はＰＮＡの結合を著しく阻害している。
図３０ａ〜図３０ｄは、炭酸塩コーティング緩衝液（図３０ａ〜図３０ｂ）、酢酸塩コーティング緩衝液（図３０ｃ）およびリン酸塩コーティング緩衝液（図３０ｄ）においてＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートが使用されたＰＮＡ吸収アッセイの結果を示す。図２９ａ〜図２９ｃの場合と同様な記号が表示のために使用された。図３０ａを参照すると、炭酸塩緩衝液に関して、２相性の曲線が得られ、この場合、影響が観測されなかった低いタンパク質濃度における直線部分と、本発明の液体組成物がＰＮＡの結合を著しく阻害する（約０．７２を超える）高いタンパク質濃度における非直線部分とが存在した。図３０ｂはグラフの直線部分を表し、Ｓｒパラメーターの計算値は炭酸塩緩衝液については１．０１である。酢酸塩緩衝液およびリン酸塩緩衝液についてのＳｒパラメーターの計算値はそれぞれ、０．９１および０．８３であった。このことは、本発明の液体組成物がＰＮＡの結合を阻害する類似した傾向を示している。
ＰＮＡ＊アッセイの結果が、結合増強（Ｓｒ＞１）および結合抑制（Ｓｒ＜１）に関して下記の表１８にまとめられる。
従って、Ｎｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）プレートでは、阻害はこれらの異なる緩衝液（ｐＨ）によって影響されなかった。他方で、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートでは、顕著な影響が、曲線が飽和した炭酸塩緩衝液において観測された。このことは、４つのサブユニットの解離、これにより、競合する分子の数が効果的に増大することによって説明することができる。
２つのタンパク質（ＩｇＧおよびＰＮＡ）がＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートに関しては逆の様式で挙動することに留意すること。このことは、本発明の液体組成物がタンパク質の分子構造に影響を及ぼしていることを示している。
オリゴヌクレオチドの結果および考察
オリゴヌクレオチドは酢酸塩コーティング緩衝液においてＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートにだけ結合した。
下記の表１９には、酢酸塩コーティング緩衝液においてＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートが使用されたアッセイに関して平均された、オリゴヌクレオチドの９つの異なる濃度および４つの異なる実験条件についてＳｒパラメーターの得られた値がまとめられる。
図３１ａ〜図３１ｂは、表１９に示されたＳｒパラメーターの平均値を示し、図３１ａには、それぞれの実験条件についての平均値が示され、図３１ｂには、すべての実験条件について等しい重さによる全平均が示される。
図３１ａ〜図３１ｂに示されるように、Ｓｒパラメーターの平均値は１よりも著しく大きく、より高濃度のオリゴヌクレオチドについては結合効率がより大きかった。従って、本発明の液体組成物は、コーティング緩衝液への塩の添加により、また、コーティング緩衝液に塩を添加することなく、結合効率を高めることができると結論することができる。
酢酸塩緩衝液が、水溶液中のＤＮＡを沈殿させるために使用されることは一般に知られていることである。そのような条件のもとで、ＤＮＡ分子は相互作用して、プレートの底で沈殿する「塊」を形成し、これは高濃度の領域をもたらし、それにより、結合する確率を増大させ、かつ、より大きいシグナルを結合事象あたり生じさせる。分子間相互作用が塊形成機構と競合する。コントロールの水とは対照的に、本発明の液体組成物は、より高濃度については塊形成の強化を抑制することができる。
本発明の液体組成物から構成される酢酸塩緩衝液を使用したときのＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートにおけるＤＮＡのより大きい結合効率は、ＤＮＡ分子を少なくとも部分的に解きほぐすことができる本発明の液体組成物の能力を明らかにしている。本発明のこの特徴はまた、下記の実施例１４においてさらに詳述されるように、ＤＮＡ電気泳動実験において観測された。
実施例１２
ＤＮＡの単離および精製
核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、生命科学における研究者によって使用される基本的かつ最も重要な物質である。遺伝子機能、生体分子産生および薬物開発（ファルマコゲノミクス）はすべてが、核酸技術を日常的に応用する分野である。典型的には、ＰＣＲ技術が、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列を増大させるために必要とされる。抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは最初に精製される。研究中の特定の領域を増幅した後、配列が、オリゴヌクレオチドプライマー、プライマーダイマー、デオキシヌクレオチド塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）および塩から精製され、続いて確認される。
材料および方法
ＰＣＲ生成物の増幅に対する本発明の液体組成物の影響を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット「Ｗｉｚａｒｄ−ＰＣＲ ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム」（Ａ７１７０）の再構築によって調べた。
Ｐｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄ（商標）キットの使用は下記の工程を伴う：
１）精製緩衝液をＰＣＲサンプルと混合して、ＤＮＡを樹脂に結合させるための条件を作る。
２）ＤＮＡを樹脂に結合させるために樹脂懸濁物をＰＣＲ混合物と混合し、樹脂サンプルをシリンジに加え、真空を生じさせる。
３）イソプロパノールを加え、溶液を真空によって吸引し、非結合のＤＮＡを除く。
４）結合したＤＮＡを水により溶出する。
５）ゲル電気泳動を本明細書中下記でさらに詳述されるように行う。
キットの再構成を、キットとともに供給された本来の水（以降、コントロール）を用いて、あるいは、工程１、工程２および工程３について、キットの水溶液をＲＯ水または本発明の液体組成物のいずれかで置き換えることによって行った。工程３では、キットに見出されるのと同一の８０％イソプロパノール溶液をすべての実験において使用した。
下記のプロトコルをゲル電気泳動のために使用した：
（ａ）ゲル溶液：８％ＰＡＧＥ（＋尿素）を下記の表２０に従ってＲＯ水または本発明の液体組成物のいずれかにより調製した。
（ｂ）４０５μｌの１０％ＡＰＳおよび５５μｌのＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−７０２４）を含有する重合試薬を５０ｍｌのゲル溶液に加える。
（ｃ）ゲル溶液をゲルカセット（Ｒｈｅｎｉｕｍ Ｌｔｄ、Ｎｏｖｅｘ ＮＣ２０１５、０９−０１５０５−Ｃ２）に注ぎ、プラスチックコームを置き、室温で３０分間重合させる。
（ｄ）コームを除き、テープを剥がして、１つのデバイスの２つの向き合う側での２つのゲルの組み立てを可能にする。
（ｅ）内側チャンバーをゲルの上端まで、外側チャンバーをゲルの高さの約１／５まで泳動緩衝液（ＲＯ水または本発明の液体組成物のいずれかでの１ｘＴＢＥ）で満たす。
（ｆ）サンプルを、ＴＢＥ、フィコール、ブロモフェノールブルーおよび尿素を含有するサンプル緩衝液（ＳＢＵ）で希釈することによってサンプルを調製し、ＤＮＡサンプルと１：１で混合する。
（ｇ）ミックスの８μｌ〜１０μｌを各ウエルに負荷する。
（ｈ）電源を１００Ｖに設定し、着色色素（ブロモフェノールブルー）が底部から１ｃｍに達するまでＤＮＡを移動させ続ける。
下記のプロトコルを、ゲル染色、可視化、写真撮影および分析のために使用した：
（ａ）ゲルを、１Ｕ／μｌのＧｅｌＳｔａｒ（商標）を１ｘＴＢＥに含有する染色液に５分間入れる。この間、振とうする。
（ｂ）ゲルを、３０分間、１ｘＴＢＥ緩衝液において脱染色する。
（ｃ）ゲルをＵ．Ｖ．台に置く；ＤＮＡを見るために３６５ｎｍの光を使用する。
（ｄ）ＤＣ１２０（商標）デジタルカメラを使用して、ゲルを写真撮影し、さらなる分析のためにデジタル情報を保存する。
ＰＣＲを、下記のプロトコル（１００回分の反応について）に従って、ＡｐｏＥ遺伝子特異的プライマー（フラグメントサイズ、２６５ｂｐ）を使用してヒトＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ３０４１）から調製した：
（ａ）適切なシリアル番号に従って０．２μｌのＰＣＲ用チューブに印を付ける。
（ｂ）２．５μｌの４０μｇ／ｍｌ ヒトＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３０４１）または水を関連チューブに加える。
（ｃ）１４．５μｌのＤＤＷにより１７μｌに調節する。
（ｄ）３６３０μｌのＰＣＲミックスを表２１（下記参照）に従って調製する。
（ｅ）３３μｌのＰＣＲミックスを各チューブに加える。
（ｆ）サンプルをＰＣＲ装置に入れる。
（ｇ）ＰＣＲプログラムを表２２（下記参照）に従って作動させる。
（ｈ）５μｌの各生成物を８％ＰＡＧＥゲルで分析する。
（ｉ）反応液を−２０℃で保存する。
結果
明確にするために、本実施例および下記の実施例では、コントロールは「ＣＯ」と略記され、逆浸透水は「ＲＯ」と略記され、本発明の液体組成物は「ＬＣ」と略記される。
図３２は、本実施例では実験３として示される実験における５０μｌのＰＣＲ生成物サンプルの画像である。図３２には１１個のレーンがあり、レーン１は精製前のＰＣＲ生成物に対応し、レーン７はラダーマーカーであり、レーン２〜６および８〜１１は、上記の工程１、工程２および工程４の下記の組合せに対応する：ＣＯ／ＣＯ／ＣＯ溶出１（レーン２）、ＲＯ／ＲＯ／ＲＯ溶出１（レーン３）、ＬＣ／ＬＣ／ＬＣ溶出１（レーン４）、ＣＯ／ＣＯ／ＣＯ溶出２（レーン５）、ＲＯ／ＲＯ／ＲＯ溶出２（レーン６）、ＬＣ／ＬＣ／ＬＣ溶出２（レーン８）、ＣＯ／ＣＯ／ＣＯ溶出３（レーン９）、ＲＯ／ＲＯ／ＲＯ溶出３（レーン１０）、およびＬＣ／ＬＣ／ＬＣ溶出３（レーン１１）。
３つのアッセイ系はすべてが、類似する精製特徴を示している。低Ｍ．Ｗ．分子（１００ｂｐ未満）の効率的な除去が明らかにされる。望まれない分子には、プライマーおよびそのダイマー、ならびに、ヌクレオチド塩基が含まれる。
図３３ａ〜図３３ｂは、溶出１（図３３ａ）および溶出２（図３３ｂ）について、本実施例では実験４として示される実験における５０μｌのＰＣＲ生成物サンプルの画像である。図３３ａ〜図３３ｂには１１個のレーンがあり、レーン６はラダーマーカーであり、レーン１〜５および７〜１３は下記の組合せに対応する：ＣＯ／ＣＯ／ＣＯ（レーン１）、ＲＯ／ＲＯ／ＲＯ（レーン２）、ＬＣ／ＬＣ／ＬＣ（レーン３）、ＣＯ／ＬＣ／ＬＣ（レーン４）、ＣＯ／ＲＯ／ＲＯ（レーン５）、ＣＯ／ＣＯ／ＬＣ（レーン７）、ＣＯ／ＣＯ／ＲＯ（レーン８）、ＣＯ／ＬＣ／ＣＯ（レーン９）、ＣＯ／ＲＯ／ＣＯ（レーン１０）、ＬＣ／ＬＣ／ＣＯ（レーン１１）、ＲＯ／ＲＯ／ＣＯ（レーン１２）、ＬＣ／ＬＣ／ＬＣ（レーン１３）、この場合、レーン１３では、異なる濃度が本発明の液体組成物について使用された。
図３４ａ〜図３４ｂは、溶出１（図３４ａ）および溶出２（図３４ｂ）について、本実施例では実験５として示される実験における５０μｌのＰＣＲ生成物サンプルの画像である。図３４ａ〜図３４ｂにおいて、レーン４はラダーマーカーであり、レーン１〜３および５〜１３は下記の組合せに対応する：ＣＯ／ＣＯ／ＣＯ（レーン１）、ＲＯ／ＲＯ／ＲＯ（レーン２）、ＬＣ／ＬＣ／ＬＣ（レーン３）、ＣＯ／ＬＣ／ＬＣ（レーン５）、ＣＯ／ＲＯ／ＲＯ（レーン６）、ＣＯ／ＣＯ／ＬＣ（レーン７）、ＣＯ／ＣＯ／ＲＯ（レーン８）、ＣＯ／ＬＣ／ＣＯ（レーン９）、ＣＯ／ＲＯ／ＣＯ（レーン１０）、ＬＣ／ＬＣ／ＣＯ（レーン１１）、ＲＯ／ＲＯ／ＣＯ（レーン１２）、およびＬＣ／ＣＯ／ＣＯ（レーン１３）。図３４ａにおけるレーン１４はＲＯ／ＣＯ／ＣＯの組合せに対応する。
図３５ａ〜図３５ｂは、溶出１（図３５ａ）および溶出２（図３５ｂ）について、本実施例では実験６として示される実験における５０μｌのＰＣＲ生成物サンプルの画像である。図３５ａ〜図３５ｂにおいて、レーン１〜１３は、図３４ａの場合と同じ組合せに対応し、レーン１５は精製前のＰＣＲ生成物に対応する。
実施例１３
カラム容量
本実施例では、カラム容量に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた。１００個のＰＣＲ反応液（それぞれが実施例１２のプロトコルに従って調製された）を調製し、一緒にして、５ｍｌのストック溶液を作製した。実験（本実施例では実験７として示される）は２つの工程を含んでいた：予備的な工程（以降、工程Ａ）が、結合および溶出のときにカラムに加えられる体積の影響を調べることに向けられ、最初の工程（以降、工程Ｂ）が、カラム容量に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられた。
工程Ａにおいて、４個のカラム（カラム１〜４）に、５０μｌ、１５０μｌ、３００μｌまたは６００μｌのストックＰＣＲ生成物溶液が加えられ、また、１３個のカラム（５〜１７）に、３００μｌのストックＰＣＲ溶液が加えられた。すべてのカラムを５０μｌの水により溶出した。溶出された溶液を下記の順でレーン７〜１０に負荷した：レーン７（ＰＣＲ原液、濃度係数、ｘ１）、レーン８（原液、ｘ３）、レーン９（ｘ６）およびレーン１０（ｘ１２）。カラム５〜１７（ｘ６）からのすべての溶出液の「ミックス」をレーン１１に負荷した。レーン１〜５には、カラム１〜４からの溶出液、および、カラムの５〜１７の「ミックス」が、元の濃度（ｘ１）に事前に希釈されて負荷された。レーン６はラダーマーカーであった。
下記のプロトコルを工程Ａでは用いた：
１）各サンプルについてＷｉｚａｒ（商標）ミニカラムおよびシリンジに印を付け、真空マニホールドに入れる。
２）１００μｌのそれぞれの直接のＰＣＲ精製緩衝液溶液をミクロチューブに分注する。
３）軽くボルテックス撹拌する。
４）１ｍｌのそれぞれの樹脂溶液を加え、１分間、３回軽くボルテックス撹拌する。
５）樹脂／ＤＮＡミックスをシリンジに加え、真空を加える。
６）２ｍｌの８０％イソプロパノール溶液を各シリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する。
７）真空を３０秒間維持することによって樹脂を乾燥する。
８）ミニカラムを１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに移す。
９）１００００ｇで２分間遠心分離する。
１０）ミニカラムを清浄な１．５ｍｌチューブに移す。
１１）５０μｌの関連する水（ヌクレアーゼ非含有または本発明の液体組成物）を加える。
１２）１００００ｇで２０秒間遠心分離する。
１３）５０μｌの保存用ミクロチューブに移し、−２０℃で保存する。
１４）工程１１〜１３を第２の溶出サイクルについて繰り返す。
可視化工程：
１５）６μｌの各サンプルを６μｌの負荷用緩衝液と混合する。
１６）１０μｌの各ミックスをアクリルアミド尿素ゲル（ＡＡＵ）に負荷し、ゲルを７０Ｖ、１０ｍＡｍｐで泳動する。
１７）ゲルをＧｅｌＳｔａｒ（商標）溶液（５０ｍｌのＴＢＥにおける１００００ｕ溶液の５μｌ）により染色し、室温で１５分間振とうする。
１８）室温で３０分間にわたってＴＢＥ中で振とうして、ゲルを脱染色する。
１９）ゲルを写真撮影する。
工程Ｂでは、工程Ａの「混合された」溶出液を「濃縮されたＰＣＲ溶液」として使用し、１２個のカラムに加えた。カラム１〜５に、キットの試薬を使用して、８．３μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌおよび１００μｌをそれぞれ加えた。カラムを５０μｌのキットの水によって溶出し、各溶出液の５μｌをゲル上の対応するレーンに加えた。カラム７〜１１を、本発明の液体組成物を結合緩衝液および溶出緩衝液として用いたことを除いて、カラム１〜５のように処理した。サンプルを対応するゲルレーンに加えた。カラム１３は、工程Ａのカラム５〜１７の「ミックス」を伴うコントロールとして役立った。
下記のプロトコルを工程Ｂでは用いた：
１）各サンプルのために使用されるＷｉｚａｒ（商標）ミニカラムおよびシリンジに印を付け、真空マニホールドに入れる。
２）１００μｌのそれぞれの直接のＰＣＲ精製緩衝液溶液をミクロチューブに分注する。
３）軽くボルテックス撹拌する。
４）１ｍｌのそれぞれの樹脂溶液を加え、１分間、３回軽くボルテックス撹拌する。
５）樹脂／ＤＮＡミックスをシリンジに加え、真空を加える。
６）２ｍｌの８０％イソプロパノール溶液を各シリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する。
７）真空を３０秒間加え続けることによって樹脂を乾燥する。
８）ミニカラムを１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに移す。
９）１００００ｇで２分間遠心分離する。
１０）ミニカラムを清浄な１．５ｍｌチューブに移す。
１１）５０μｌのヌクレアーゼ非含有または本発明の液体組成物を加える。
１２）１００００ｇで２０秒間遠心分離する。
１３）５０μｌの保存用ミクロチューブに移し、−２０℃で保存する。
１４）工程１１〜１３を第２の溶出サイクルについて繰り返す。
可視化工程は工程Ａの場合と同じであった。
結果：
図３６〜図３７は、工程Ａのレーン１〜１１の画像（図３６）およびＳｉｏｎＩｍａｇｅ（商標）ソフトウエアを使用する定量分析（図３７）を示す。図３６に示されるように、レーン８〜１１は過負荷である。レーン３およびレーン４は、カラム３およびカラム４が過負荷であり、その結果として、より少ないＤＮＡが溶出サンプルの希釈後に回収されたので、より少ないＤＮＡを含有する。図３７に示されるように、ＤＮＡ負荷体積がより大きいとき、ＤＮＡ損失が大きくなっている。
図３８ａ〜図３８ｃは、溶出１（図３８ａ）、溶出２（図３８ｂ）および溶出３（図３８ｃ）について工程Ｂのレーン１〜１２の画像を示す。最初の溶出図は、カラムが同じように過負荷であったことを示している。結合容量の違いが第２の溶出において明確に認められる。バンド強度が、レーンの番号と一致して増大している。
対応するレーン１〜５およびレーン７〜１１の強度を比較することにより、本発明の液体組成物はキットの試薬よりも多くのＤＮＡと結合できることが示される。
図３９ａ〜図３９ｂは、ＳｉｏｎＩｍａｇｅ（商標）ソフトウエアを使用する定量分析を示し、図３９ａには、コントロール（図３９ａ〜図３９ｂにおいてＣＯとして表される）および本発明の液体組成物（図３９ａ〜図３９ｂにおいてＬＣとして表される）の面積が、３回の溶出のそれぞれについて負荷体積を関数として表され、図３９ｂには、ＬＣ／ＣＯの比率が示される。溶出３において図３９ａ〜図３９ｂに示されるように、面積は、本発明の液体組成物についてはより大きい。
実施例１４
ゲル電気泳動によるＤＮＡの単離
ゲル電気泳動は、サイズおよび形状に基づくＤＮＡ分子の決定および単離のための日常的に使用されている方法である。ＤＮＡサンプルが、ＤＮＡ分子を取り囲む泳動緩衝液として役立つゲルの上部部分に加えられる。ゲルは正に荷電しており、電流が加えられたとき、負に荷電したＤＮＡフラグメントをゲルの下流側に移動させる。移動速度は、より小さい分子およびコイル状または折り畳まれた分子についてはより速く、大きい分子および解きほぐされた分子についてはより遅い。移動が完了すると、ＤＮＡは蛍光性標識によって標識することができ、ＵＶ照明下で可視化される。ＤＮＡはまた、メンブランに転写し、酵素による着色によって高感度で可視化することができる。ＤＮＡはゲル上のその位置およびバンド強度に従って評価される。
下記は、ゲル電気泳動によるＤＮＡ移動に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験の記載である。
材料および方法：
２つのタイプのＤＮＡを使用した：（ｉ）ＰＣＲ生成物（２８０塩基対）および（ｉｉ）下記のサイズを有する１１個のＤＮＡフラグメントから構成されるラダーＤＮＡ（８０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００および１０３０ｂｐ）。ゲルを実施例１２のプロトコルに従って調製した。
３つの実験を行った。実験１では、ＰＣＲバッチ番号１８１１０３をレーン２〜１０に負荷し、ラダーＤＮＡをレーン１に負荷した。実験２では、ＰＣＲバッチ番号３１２０３をレーン２〜１１に負荷し、ラダーＤＮＡをレーン１に負荷した。実験３では、ＰＣＲバッチ番号３１２０３をレーン１〜５およびレーン７〜１１に負荷し、ラダーＤＮＡをレーン６に負荷した。
結果：
図４０ａ〜図４２ｂは、実験１、実験２および実験３についてそれぞれ、ＲＯ水の存在下（図４０ａ、図４１ａおよび図４２ａ）および本発明の液体組成物の存在下（図４０ｂ、図４１ｂおよび図４２ｂ）における移動速度を比較するＤＮＡ画像である。図４０ａ〜図４２ｂの画像において、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともに、同じタイプの液体から構成された。すなわち、図４０ａ、図４１ａおよび図４２ａでは、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともにＲＯ水から構成され、一方、図４０ｂ、図４１ｂおよび図４２ｂでは、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともに本発明の液体組成物から構成された。
図４０ａ〜図４２ｂに示されるように、両タイプのＤＮＡ（ＰＣＲ生成物およびラダーＤＮＡ）は、本発明の液体組成物との比較で、ＲＯ水において著しく速く移動した。
ゲル含有量に対する本発明の液体組成物の影響、および、泳動緩衝液に対するその影響を分ける試みにおいて、上記の実験を、泳動緩衝液およびゲル緩衝液のすべての可能な組合せで繰り返した。
従って、図４３ａ〜図４５ｄは、泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられる実験１（図４３ａ〜図４３ｄ）、実験２（図４４ａ〜図４４ｄ）および実験３（図４５ａ〜図４５ｄ）の画像である。各対の図（すなわち、ａ〜ｂおよびｃ〜ｄの対）において、ゲルが同じ液体から構成され、泳動緩衝液が異なる。実施例１２で導入された略号を使用して、ゲル緩衝液／泳動緩衝液の下記の組合せが図４３ａ〜図４５ｄに示される：図４３ａ〜図４３ｂはそれぞれＲＯ／ＲＯおよびＲＯ／ＬＣの画像であり、図４３ｃ〜図４３ｄはそれぞれＬＣ／ＬＣおよびＬＣ／ＲＯの画像であり、図４４ａ〜図４４ｂはそれぞれＲＯ／ＲＯおよびＲＯ／ＬＣの画像であり、図４４ｃ〜図４４ｄはそれぞれＬＣ／ＲＯおよびＬＣ／ＬＣの画像であり、図４５ａ〜図４５ｂはそれぞれＲＯ／ＬＣおよびＲＯ／ＲＯの画像であり、図４５ｃ〜図４５ｄはそれぞれＬＣ／ＬＣおよびＬＣ／ＲＯの画像である。
図４６ａ〜図４８ｄは、ゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられる実験１（図４６ａ〜図４６ｄ）、実験２（図４７ａ〜図４７ｄ）および実験３（図４８ａ〜図４８ｄ）の画像である。各対の図（ａ〜ｂおよびｃ〜ｄ）において、泳動緩衝液が同じ液体から構成され、しかし、ゲル緩衝液が異なる。具体的には、図４６ａ〜図４６ｂはそれぞれＲＯ／ＲＯおよびＬＣ／ＲＯの画像であり、図４６ｃ〜図４６ｄはそれぞれＬＣ／ＬＣおよびＲＯ／ＬＣの画像であり、図４７ａ〜図４７ｂはそれぞれＲＯ／ＲＯおよびＬＣ／ＲＯの画像であり、図４７ｃ〜図４７ｄはそれぞれＲＯ／ＬＣおよびＬＣ／ＬＣの画像であり、図４８ａ〜図４８ｂはそれぞれＲＯ／ＲＯおよびＬＣ／ＲＯの画像であり、図４８ｃ〜図４８ｄはそれぞれＲＯ／ＬＣおよびＬＣ／ＬＣの画像である。
図４３ａ〜図４８ｄに示されるように、本発明の液体組成物は、ＲＯ水と比較したとき、ＤＮＡ移動の遅れを引き起こしている。電場における著しい変化は観測されなかったことに留意すること。ゲル緩衝液が本発明の液体組成物から構成され、泳動緩衝液がＲＯ水から構成されるとき、この影響はより顕著である。
従って、上記の実験は、本発明の液体組成物の影響のもとでは、ＤＮＡの形態が、ＤＮＡの折り畳みが低下する（解きほぐされる）様式で変化することを明らかにしている。ＤＮＡが本発明の液体組成物において解きほぐされることは、ＲＯ水との比較で、より強い水素結合した相互作用がＤＮＡ分子と本発明の液体組成物との間に存在することを示しているかもしれない。
実施例１５
酵素活性および安定性
酵素活性および安定性の両方を増大させることは、酵素を利用する任意のプロセスの効率を高め、かつ、そのコストを低下させるために重要である。長期間にわたる貯蔵の間、働きが長期にわたる間、そしてまた、過度に希釈されたとき、酵素は典型的には、安定性の喪失、従って、最終的には、活性の喪失の一因になり得るストレスにさらされる。
本実施例では、酵素の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が明らかにされる。この研究は、生物工学業界における２つの一般に使用されている酵素（アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびβ−ガラクトシダーゼ）に関連する。２つの形態のＡＰを使用した：非結合型形態、および、ＡＰがストレプトアビジンに結合した結合型形態（ＳＴ−ＡＰ）。
下記は、希釈された酵素に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験の記載である。希釈を、添加剤を伴うことなく、また、中性ｐＨ（７．４）において、ＲＯ水または本発明の液体組成物のいずれかで行った。
非結合型形態のアルカリホスファターゼ
材料および方法：
アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＮＣ）をＲＯ水または本発明の液体組成物のいずれかで連続希釈した。希釈されたサンプル（１：１０００および１：１００００）を室温でチューブにおいてインキュベーションした。
種々の時間間隔で、酵素活性を、１０μｌの酵素を９０μｌのｐＮＰＰ溶液（ＡＰ特異的な比色測定用基質）と混合することによって求めた。アッセイをマイクロ滴定プレートにおいて行った（それぞれの試験点について少なくとも４回の繰り返し）。色の強度を４０５ｎｍの波長でＥＬＩＳＡ読み取り装置によって求めた。
酵素活性を、本明細書中下記でさらに詳述されるように、ＲＯ水と、３つの異なる濃度の本発明の液体組成物（ＬＣ３、ＬＣ７およびＬＣ８）との両方で、各希釈について時間ｔ＝０において求めた。安定性を、ｔ＝０における活性によって除される２２時間後（ｔ＝２２）の活性および４８時間後（ｔ＝４８）の活性として求めた。
結果＆考察：
下記の表２３〜表２５には、ｔ＝０（表２３）、ｔ＝２２（表２４）およびｔ＝４８（表２５）について、１〜６と番号が付けられた６つの実験の平均活性値がまとめられる。実験１〜５のすべてが室温で行われた。
表２３〜表２５に示されるように、ＬＣ７、ＬＣ８およびＬＣ３の存在下での活性は、ＲＯ水の存在下での活性を一貫して上回っている。安定性に対する本発明の液体組成物の影響を定量化するために、安定性強化パラメーターＳｅを、ＲＯ水における安定性によって除された本発明の液体組成物の存在下での安定性として定義した。
図４９は、２２時間（中塗り三角）および４８時間（中塗り四角）についてＳｅの値を希釈の関数として示す。ＬＣ７、ＬＣ８およびＬＣ３についてのＳｅの値が、図４９において、青色、赤色および緑色でそれぞれ示される。図４９に示されるように、測定された安定化作用は、１：１００００の酵素希釈については約２〜３．６の範囲であり、１：１０００の希釈については約１．５〜３の範囲である。同じ現象が、少しより小さい程度ではあったが、低い温度で観測された。
結合型形態のアルカリホスファターゼ
酵素を別の分子に結合することにより、典型的には、その安定性が増大する。酵素は、典型的には、高濃度で貯蔵され、所望の希釈度に使用前に希釈されるだけである。下記の実験は、酵素が長期間にわたって高濃度で貯蔵される本発明の液体組成物の安定化作用を調べることに向けられている。
材料および方法：
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）をＲＯ水および上記の本発明の液体組成物（ＬＣ７、ＬＣ７およびＬＣ３）において１：１０および１：１００００で希釈した。希釈されたサンプルを室温で５日間チューブにおいてインキュベーションした。
すべてのサンプルを１：１００００の最終酵素濃度に希釈し、活性を本明細書中上記でさらに詳述されるように求めた。酵素活性を時間ｔ＝０および５日後において測定した。
結果および考察：
図５０は、ＲＯ水および本発明の液体組成物について、１：１０の希釈（青色）および１：１００００の希釈（赤色）における５日間の貯蔵の後でのコンジュゲート化酵素の活性を示す図である。ＲＯ水において、酵素活性は両方の希釈について約０．１５０のＯＤである。対照的に、本発明の液体組成物の存在下では、活性は、１：１０の希釈では、１：１００００の希釈の場合よりも約３．５倍高い。しかしながら、両方の希釈について、酵素は、本発明の液体組成物において、ＲＯ水の場合よりも実質的に大きい活性である。
β−ガラクトシダーゼ
材料および方法：
β−ガラクトシダーゼを用いた実験を、酵素タイプ、濃度およびインキュベーション時間を除いて、上記のアルカリホスファターゼ実験のために使用された同じプロトコルに従って行った。β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をＲＯ水および本発明の液体組成物で連続希釈した。サンプルを１：３３０および１：１０００に希釈し、室温でインキュベーションした。
酵素活性を、１０μｌの酵素を１００μｌのＯＮＰＧ溶液（β−Ｇａｌ特異的な比色測定用基質）と３７℃で１５分間混合し、５０μｌの停止溶液（１Ｍの Ｎａ２ＣＯ３）を加えることによって、０、２４時間、４８時間、７２時間および１２０時間の時間間隔で求めた。アッセイをマイクロ滴定プレートで行った（各試験点から８回の反復）。４０５ｎｍの波長でのＥＬＩＳＡ読み取り装置を使用して、色の強度を求めた。
酵素活性を、ＲＯ水について、また、本発明の上記液体組成物（ＬＣ７、ＬＣ８およびＬＣ３）について、各希釈について時間ｔ＝０において求めた。５つの実験を同一条件のもとで行った。酵素安定性および安定性強化パラメーターＳｅを本明細書中上記でさらに詳述されるように計算した。
結果および考察：
図５１ａ〜図５１ｄは、ｔ＝２４時間（図５１ａ）、ｔ＝４８時間（図５１ｂ）、ｔ＝７２時間（図５１ｃ）およびｔ＝１２０時間（図５１ｄ）における安定性（ｔ＝０における活性によって除されるｔ≠０での活性）を示す。ＲＯ、ＬＣ７、ＬＣ８、ＬＣ３およびＬＣ４の液体が、図５１ａ〜図５１ｄにおいて、青色、赤色、緑色および紫色でそれぞれ示され、安定性の平均値が丸として示される。図５１ａ〜図５１ｄに示されるように、ＬＣ７、ＬＣ８およびＬＣ３の存在下での活性は、ＲＯ水の存在下での活性を一貫して上回っている。
図５２ａ〜図５２ｄは、ｔ＝２４時間（図５２ａ）、ｔ＝４８時間（図５２ｂ）、ｔ＝７２時間（図５２ｃ）およびｔ＝１２０時間（図５２ｄ）における安定性強化パラメーターＳｅを、図５１ａ〜図５１ｄの場合と同じような色表記法を用いて示す。図５２ａ〜図５２ｄに示されるように、測定された安定化作用は、１：１０００の酵素希釈については約１．３〜２．２１の範囲であり、１：３３０の希釈については約０．８３〜１．３の範囲である。
従って、β−ガラクトシダーゼに対する本発明の液体組成物の安定化作用は、ＡＰについて見出された安定化作用と類似している。安定化の程度は少し低くなっている。これは、高いタンパク質濃度をアッセイにおいて有する比較的低い比活性（４６４ｕ／ｍｇ）、これにより、弱化した活性が時間の経過により失われることによって説明することができる。
乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性
多くの酵素は貯蔵前に乾燥される。乾燥プロセス、および、長期間にわたる乾燥状態でのその後の貯蔵は、酵素活性をもたらすことが知られている。下記の実験は、乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられている。
材料および方法：
アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＮＣ）を、本明細書中上記でさらに詳述されるように、ＲＯ水および本発明の上記液体組成物（ＬＣ７、ＬＣ８およびＬＣ３）において１：５０００で希釈した。
９枚のマイクロ滴定プレートを５μｌの溶液のアリコートで満たした。１枚のプレートを、本明細書中上記でさらに詳述されるように時間ｔ＝０における酵素活性について試験し、残る８枚のプレートを３７℃で一晩乾燥した。乾燥プロセスを、乾燥した環境において１６時間行った。
２枚のプレートを、最初、室温に冷却し、続いて、１００μｌのｐＮＰＰ溶液を室温で加えることによって酵素活性について試験した。色の強度を４０５ｎｍの波長でＥＬＩＳＡ読み取り装置によって求め、安定性を本明細書中上記でさらに詳述されるように計算した。６枚のプレートを６０℃に３０分間移し、その後、酵素活性を求めた。
結果：
図５３ａは乾燥後の酵素の活性（２つの反復物）および６０℃での３０分間の熱処理の後での酵素の活性（６つの反復物）を示す。平均値が「＋」記号によって図５３ａに示される。両方の処理は酵素を実質的に傷つけ、それらの作用は付加的であった。
図５３ｂは安定性強化パラメーターＳｅを示す。比較的小さいデータベース、および、酵素がさらされた極端な条件にもかかわらず、本発明の液体組成物は酵素の活性を明らかに安定化させている。例えば、ＬＣ７については、安定性強化パラメーターの平均値が１．１６から１．２２に増大した。
実施例１６
ＤＮＡの固定
本実施例では、ＤＮＡを本発明の液体組成物の存在下または非存在下でガラスビーズに固定することの影響が調べられた。ポリヌクレオチドを固体支持体（例えば、ガラスビーズなど）に固定することは、分子生物学研究および医学の分野ではこの上なく有益であり得る。典型的には、ＤＮＡ操作は、ＰＣＲ、連結、制限および形質転換をはじめとする一連の反応を次々に含む。それぞれの反応が、好ましくは、それ自身の特有の緩衝液を必要とするそれ自身の好適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応の間で、ＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルを沈殿させ、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成しなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間がかかり、そして、より重要なことに、出発物質の喪失をもたらし、このことは、出発物質が希少であるときには最大の関心事であり得る。一例として、本発明者らは、本発明の液体組成物がＰＣＲ反応時におけるガラスビーズの存在下でＤＮＡに対してどのような影響を有するかを調べることを選んでいる。
材料および方法：
ＰＣＲを、得られるフラグメントサイズが７５０ｂｐであるようにＴ７フォワードプライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）配列番号５およびＭ１３リバースプライマー（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）配列番号６を使用して、７５０塩基対の遺伝子がクローン化されているｐＢＳプラスミドから調製した。これらのプライマーを２００μＭ（２００ｐｍｏｌ／μｌ）の濃度でＰＣＲ規格の水において構成した。これらは続いて、組み合わされたミックスを作製するためにそれぞれ１０μＭの作業用濃度にＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において１：２０で希釈された。例えば、１μｌの各プライマー（２００μＭのストックから）を一緒にし、１８μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）により希釈し、混合し、遠心器により集めた。高濃度のＤＮＡをＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）により１：５００で希釈して２ｐｇ／μｌの作業用濃度にした。ＰＣＲをＢｉｏｍｅｔｒａ Ｔ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＰＣＲ装置において行った。使用された酵素は、緩衝液ＹにおけるＳＡＷＡＤＹ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｑＬａｂ０１−１０２０）であった。
ＰＣＲミックスを下記のように調製した：
サンプルを、ボルテックス撹拌することなく混合した。サンプルをＰＣＲ装置に入れ、正確に１分間９４℃で置き、その後、取り出した。その後、４．５μｌのＰＣＲミックスを清浄なチューブに分注し、これに０．５μｌのプライマーミックスおよび５μｌの希釈ＤＮＡをその順番で加えた。ボルテックス撹拌することなく混合し、または遠心分離した後、サンプルをＰＣＲ装置に入れ、下記のＰＣＲプログラムを使用した：
ＰＣＲ反応の生成物を、本明細書中上記に記載されるように分析のために８％ＰＡＧＥゲルで泳動した。
ゲルに負荷されたＰＣＲ生成物は下記の通りであった：
レーン１：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈されたＤＮＡ、Ｈ２Ｏで希釈されたプライマー（ミックス）、（ガラスビーズを含む）Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により所定の体積（１０μｌに）。
レーン２：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈されたＤＮＡ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈されたプライマー（ミックス）、（ガラスビーズを含む）Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により所定の体積（１０μｌに）。
レーン３：すべてＨ２Ｏで（陽性コントロール）（ガラスビーズあり）。
レーン４：陰性コントロール。ＤＮＡなし、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるプライマーを（ガラスビーズを含む）Ｈ２Ｏにより（１０μｌに）。
レーン５：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈されたＤＮＡ、Ｈ２Ｏで希釈されたプライマー（ミックス）、（ガラスビーズを含まない）Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により所定の体積（１０μｌに）。
レーン６：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈されたＤＮＡ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈されたプライマー（ミックス）、（ガラスビーズを含まない）Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により所定の体積（１０μｌに）。
レーン７：すべてＨ２Ｏで（陽性コントロール）（ガラスビーズなし）。
レーン８：陰性コントロール。ＤＮＡなし、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるプライマーを（ガラスビーズを含まない）Ｈ２Ｏにより（１０μｌに）。
結果および結論
図５４はＤＮＡ画像である。認められ得るように、ＰＣＲがガラスビーズの存在下で行われるとき、ｎｅｏｗａｔｅｒが、反応が生じるために要求される。ｎｅｏｗａｔｅｒが反応に含まれないとき、ＰＣＲ生成物が観測されない（レーン３を参照のこと）。
まとめると、本発明の液体組成物は、ガラスビーズの存在下でのＰＣＲ時において要求される。
実施例１７
リアルタイムＰＣＲ
ＤＮＡ核酸配列およびｃＤＮＡ核酸配列の検出および定量化は、法医科学、医療、薬物開発および分子生物学研究をはじめとする広範囲の様々な適用のために重要である。リアルタイムＰＣＲでは、アガロースゲルにおける臭化エチジウムの可視化に頼る常套のＰＣＲの終点検出とは対照的に、ＰＣＲ反応の期間中に発光される蛍光が、それぞれのＰＣＲサイクルの期間中におけるアンプリコン生成の指標として（すなわち、リアルタイムで）モニタリングされる。
その高感度のために、リアルタイムＰＣＲは、非常に少量のＤＮＡまたはｃＤＮＡを検出および定量するために特に適切である。感度および再現性を改善すること、ならびに、リアルタイムＰＣＲのために要求される反応体積を低下させることは、貴重なサンプルを保存することを助ける。
本実施例では、本発明の液体組成物の存在下または不在下におけるリアルタイムＰＣＲ反応の感度および反応体積を調べた。
Ａ．感度試験
材料および方法：
リアルタイムＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７３００ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍでのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を使用して行った。反応を９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で行った。プライマーの配列は下記の通りであった：
フォワードプライマー：ＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＡＴＴ 配列番号７
リバースプライマー：ＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣ 配列番号８
それぞれが１２個のサンプルからなる２つのセットを下記の表２８に詳述されるように調製した。一方がヌクレアーゼ非含有の水に関し、他方がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に関するものであった。それぞれのセットについて、１３Ｘミックスを調製した：
ｃＤＮＡサンプルを、１：５から始まり、１：２５６０で終わる連続希釈物（合計で１０個の希釈物）で、水またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈した。１：５の希釈物を、３μｌの最初のｃＤＮＡ＋１２μｌのＨ２ＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して調製した。その後の希釈物を、７．５μｌのサンプルと、７．５μｌのＨ２ＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）とを取ることによって調製した。
１７μｌのミックスを３μｌのｃＤＮＡサンプルに加えた。それぞれのセットにおける最初の反応液は非希釈のｃＤＮＡサンプルであった。
蛍光が所定の選ばれたレベルを超えるために必要とされたＰＣＲサイクルの数（閾値サイクル（Ｃｔ））の、それらの対応Ｌｏｇ（ｃＤＮＡ濃度）に対する標準曲線を水希釈サンプルおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）希釈サンプルの両方についてプロットした。この標準曲線はプロセスの直線性（すなわち、反応効率）の尺度である。
解離曲線を水希釈サンプルおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）希釈サンプルの両方についてのそれぞれの標準曲線の反応についてプロットした。
標準曲線および解離曲線はともに、自動ベースライン決定を使用してプロットされた。標準曲線だけは、０．２の手動バックグラウンドカットオフで、かつ、同一又は非同一の外れ値をそれぞれのセットから除いた後でプロットされた。
結果
自動ベースライン決定による未処理データが下記において表２９に示される：
自動ベースライン決定による標準曲線および解離曲線がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）については図５５ａ〜図５５ｂに例示され、水については図５６ａ〜図５６ｂに例示される。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）については、解離曲線の傾き値が−２．９６９であり、回帰値が０．９８７であった。水については、解離曲線の傾き値が−４．０４８であり、回帰値が０．８７５であった
０．２のベースラインカットオフによる未処理データが下記において表３０に示される：
０．２のベースラインカットオフによる標準曲線がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）については図５７ａに例示され、水については図５７ｂに例示される。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）については、解離曲線の傾き値が−２．９６５であり、回帰値が０．９８６であった。水については、解離曲線の傾き値が−４．０９４であり、回帰値が０．８８５であった。
それぞれのセットからの同一外れ値の除去および０．２のベースラインカットオフの後での未処理データが下記において表３１に示される：
それぞれのセットからの同一外れ値の除去および０．２のベースラインカットオフの後での標準曲線がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）については図５８ａに例示され、水については図５８ｂに例示される。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）については、解離曲線の傾き値が−３．３３８であり、回帰値が０．９９４であった。水については、解離曲線の傾き値が−２．９１８であり、回帰値が０．８５３であった。
それぞれのセットからの異なった外れ値の除去および０．２のベースラインカットオフの後での未処理データが下記において表３２に示される：
それぞれのセットからの異なった外れ値の除去および０．２のベースラインカットオフの後での標準曲線がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）については図５９ａに例示され、水については図５９ｂに例示される。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）については、解離曲線の傾き値が−３．３３８であり、回帰値が０．９９４であった。水については、解離曲線の傾き値が−３．３９９であり、回帰値が０．９９９であった。
結論
図５５ａおよび図５６ａにおける標準曲線の傾きの値は、増幅効率がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下にはより大きいことを反映しているが、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での標準曲線の大きい傾き値（−２．９６９）はまた、いくつかのバックグラウンドノイズの存在を反映する場合もある。両方の解離曲線を調べることにより、非特異的な生成物が何ら存在しないことが明らかにされる。このことは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下では、バックグラウンド（ＢＧ）読み取りが上昇することを示している（水における０．０９とは対照的に０．７）。この高いＢＧカットオフの結果が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での標準曲線が、水での標準曲線（−２３．０２のＣｔ値から始まる）よりも大きい２６．２４のＣｔ値から始まることである。高いＢＧのこの現象はおそらくは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下における高まった感度の１つの態様を反映している。この高まった感度の別の態様が、まれな標的アンプリコンを確実に検出することができることを反映する、高いＤＮＡ希釈度におけるＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）での標準曲線の直線性である。
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）についてのより大きい回帰値は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下では、量のより正確な評価が濃度のより広いダイナミックレンジにわたってもたらされることを示している。
これら２つの反応セットを等しいＢＧカットオフ値で比較するために、バックグラウンドノイズを調べ、０．２のＢＧ値を両方のセットについて手動で選択した。この値は、両方のセット（図６０ａおよび図６０ｂ）について、また、直線範囲においてバックグラウンド読み取りを上回っていることが見出された。
図５７ａおよび図５７ｂは、０．２の等しいＢＧカットオフでプロットされた標準曲線を例示する。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での標準曲線はより低いＲ２値を有するが、水での標準曲線の場合のように、等しいＣｔ値を高いｃＤＮＡ濃度では有する（Ｃｔ−１：１のｃＤＮＡ希釈物において２４．２４）。増幅のダイナミックレンジおよび効率は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での方が依然として大きい。
より最適な曲線に到達するために、１：５、１：６４０、１：１２８０、１：２５６０のｃＤＮＡ濃度に対応する外れ値を除き、標準曲線を、図５８ａおよび図５８ｂに例示されるように引き直した。
それぞれのセットについて可能である最適な曲線に到達するために、外れ値をそれぞれのセットから個々に除いた。標準曲線を、図５９ａおよび図５９ｂに例示されるように引き直した。これらの図は、より大きいダイナミックレンジ（より多数の点）、より大きい正確性（より少ない外れ値）、および、より大きい感度が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で達成されたことを明らかにする。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）でのセットの最適な標準曲線（−３．３の傾き値）には、水でのセットの標準曲線よりも多くの測定点（これらのうちの２つはより大きいテンプレート希釈度を表す）が含まれる。
Ｂ．体積試験
リアルタイムＰＣＲ反応を、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を水の代わりに使用して実行することにより、より少ない反応体積が、感度を保持しながら可能になるという可能性を調べた。
材料および方法
すべての材料は、感度を求めるために上記で使用された材料と同一であった。ｃＤＮＡサンプルを１：８０で希釈した。これは、この希釈度が、図５９ａおよび図５９ｂに例示されるように、正確な結果が両方のセット（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水）において達成された最大の希釈度であったからであった。
試験された反応体積は、５μｌ、１０μｌおよび１５μｌであった。これら３つの体積セットのそれぞれには、８つの反応からなる一組が含まれた（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を伴う反応およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を伴わない反応の三連、ならびに、１つの陰性コントロール（テンプレートを除く））。低下した反応体積に加えて、ＳＹＢＲグリーン溶液と、溶媒（水またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれか）との間での比率を（下記の表３３に詳述されるように）変化させた。比率の変化により、結果を、感度試験から得られた結果と比較することが避けられた。
それぞれの体積試験のためのプールを、示されるように、水またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれかにおいて調製し、その後、所望の体積で反応ウエルに等分した。すべての結果を０．２のバックグラウンドカットオフ値で読み取った。
結果
これら３つの反応三連物（すなわち、５μｌ、１０μｌおよび１５μｌ）の増幅曲線を、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）については図６１ａ〜ｃに例示されるようにプロットし、水については図６２ａ〜ｃに例示されるようにプロットした。
図６１ａ〜ｃおよび図６２ａ〜ｃに対応する未処理データが下記において表３４に示される。
結論
結果を調べることにより、一般には、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で行われた反応は再現性がより大きいことが示される。それぞれの三連内での類似性は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）でのセットでの方が大きく、これに対して、水でのセットでは、読み取り値の間における変動がすべてのセットにおいて非常に大きく、また、未決定の読み取りがより多く存在する。このことは、これらの反応が、低下した体積において正確に行われ得ることを示し得る。
実施例１８
超音波試験
本発明の液体組成物を超音波共振器における一連の超音波試験に供す。
方法
本発明の液体組成物（本実施例ではＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）として示される）および２回蒸留水における超音波速度の測定を、ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して行った。
校正
ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムの両方のセルを、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０が補充された標準水（脱塩水、Ｒｏｔｈ．Ａｒｔ．３１７５．２、Ｃｈａｒｇｅ：０３５６９０３６）で満たし、２０℃での等温測定の期間中に測定した。両方のセルの間における超音波速度の差を、本明細書中下記でさらに詳述されるような等温測定におけるゼロ値として使用した。
等温測定
ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムのセル１を参照として使用し、蒸留水（Ｒｏｔｈ Ａｒｔ．３４７８１、ロット＃４８３６２０７７）で満たした。セル２を本発明の液体組成物で満たした。絶対値の超音波速度を２０℃で測定した。実験値の比較を可能にするために、超音波速度を２０．０００℃に補正した。
結果
図６３は、２０．０５１℃で測定されたときの、観測時間の関数としての絶対値の超音波速度Ｕを本発明の液体組成物（Ｕ２）および蒸留水（Ｕ１）について示す。両方のサンプルが観測の時間枠（３５分）において安定な等温速度を示した。
下記の表３５には、測定された超音波速度（Ｕ１、Ｕ２）および２０℃へのそれらの補正をまとめる。補正を、蒸留水については１℃あたり３ｍ／ｓの温度−速度補正を使用して計算した。
図６３および表３５に示されるように、蒸留水と、本発明の液体組成物との間における差が等温測定によって認められた。差ΔＵ＝Ｕ２−Ｕ１が、２０．０５１℃の温度では１５．６８ｃｍ／ｓであり、２０℃の温度では１３．６１ｃｍ／ｓであった。ΔＵの値は、ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）システムのどのノイズシグナルよりも著しく大きい。結果が第２のＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムで１回繰り返された。
実施例１９
チップへのＲＮＡのハイブリダイゼーション
ＤＮＡチップに対するＲＮＡサンプルの間でのハイブリダイゼーションの強さを本発明の液体組成物の存在下および不在下で調べた。
材料および方法
ＧＥＡｒｒａｙ Ｑ Ｓｅｒｉｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ＰａｔｈｗａｙＦｉｎｄｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ：ＨＳ−００８を使用した。
ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してヒトリンパ球から抽出した。ＲＮＡを、ＧＥＡｒｒａｙ ＡｍｐｏＬａｂｅｌｉｎｇ−ＬＰＲキット（カタログ番号Ｌ−０３）を製造者のプロトコルに従って使用して標識した。
アレイに対するＲＮＡサンプルのハイブリダイゼーションを製造者のプロトコルに従って行った。本質的には、膜を脱イオン水で５分間事前に湿らせ、その後、事前に加温されたＧＥＡｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥＡｒｒａｙ）において６０℃で２時間インキュベーションした。標識されたＲＮＡをハイブリダイゼーション溶液に加え、メンブランと６０℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、膜をオートラジオグラフィのためにＸ線フィルムに２秒または１０秒の露光時間にわたって暴露させた。
結果
図６４Ａ〜図６４Ｄに例示されるように、ＲＮＡハイブリダイゼーションが、同一の露光期間の後でのシグナル強度によって証明されるように、ＤＮＡチップに対して、本発明の液体組成物の存在下では増大する。
実施例２０
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。２９０μｌを、１３ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始ｐＨを有したことが認められた。２．５ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
結果
表３６には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の５５７ｎｍにおける吸光度がまとめられる。
図６５および表３６に例示されるように、ＲＯ水は、水酸化ナトリウムを加えたとき、ｐＨにおけるより大きい変化を示す。ＲＯ水はわずかな緩衝作用を有するが、吸光度が０．０９Ａに達したとき、緩衝作用が「破れ」、ｐＨ変化が、より多くの水酸化ナトリウムを加えた後ではより大きくなる。ＨＡ−９９水はＲＯと類似している。ＮＭ（＃１５０９０５−１０６）（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、ＡＢ水Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＡＢ１−２２−１ ＨＡ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）は若干の緩衝作用を有する。ＨＡＰおよびＨＡ−１８はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも一層大きい緩衝作用を示す。
まとめると、この実験から、ＨＡ−９９−Ｘを除いて、試験されたナノ構造を含むすべての新しい水タイプ（ＨＡＰ、ＡＢ１−２−３、ＨＡ−１８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と類似した特性を示す。
実施例２１
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
材料および方法
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、５０ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加え、ｐＨを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、３回の実験を行った。
水酸化ナトリウム滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを加えた。
塩酸滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ塩酸を加えた。
結果
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図６６Ａ〜Ｃおよび図６７Ａ〜Ｃに示す。塩酸滴定についての結果を図６８Ａ〜Ｃおよび図６９に示す。
ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の水酸化ナトリウムを要求するので、ナノ構造を含む水は緩衝能力を有する。この特徴は７．６〜１０．５のｐＨ範囲においてより著しい。加えて、ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の塩酸を必要とする。この作用は、アルカリ範囲よりも、酸性ｐＨ範囲での方が大きい。例えば、１０μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５６から１０．３に増大した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．６２から９．３３に増大した。１０μｌの塩酸（０．５Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５２から４．３１に低下し、これに対して、ナノ構造を含む水のｐＨは７．７１から６．６５に低下した。この特徴は７．７〜３のｐＨ範囲においてより著しい。
実施例２２
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。１ｍｌを、４５ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加えた。ｐＨを測定し、必要ならば、滴定した。３ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
塩酸滴定：
ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．８５
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０９０５−１０６）：４５ｍｌ ｐＨ６．３
１ｍｌのフェノールレッドおよび４μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．１９
水酸化ナトリウム滴定：
Ｉ．ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッド、６μｌの塩酸（０．２５Ｍ）および４μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０６０４−１０９）：４５ｍｌ ｐＨ８．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび４５μｌの塩酸（０．２５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
ＩＩ．ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．４６
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１２０１０４−１０７）：４５ｍｌ ｐＨ８．６８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの塩酸（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．９１
結果
図７０Ａ〜Ｃおよび図７１Ａ〜Ｂに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はＲＯ水の緩衝能力よりも大きかった。
実施例２３
ｒｆ水の緩衝能力
緩衝能力に対するＲＦ水の影響を調べた。
材料および方法
水酸化ナトリウム（１Ｍ）の数μｌの液滴を加えて、１５０ｍｌのＲＯ水のｐＨ（ｐＨ＝５．８）を上げた。この水の５０ｍｌを３つのボトルに等分した。３つの処理を行った：
ボトル１：非処理（ＲＯ水）
ボトル２：３０Ｗにより３０分間照射されたＲＯ水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された（ＲＦ水）。
ボトル３：ｐＨが５に達したとき、２回目の照射に供されたＲＦ水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された。
１μｌの０．５Ｍ塩酸を５０ｍｌの水に加えることによって滴定を行った。ｐＨ値が４．２未満に達したときに滴定を終えた。
実験を三連で行った。
結果
図７２Ａ〜Ｃおよび図７３から理解され得るように、ＲＦ水およびＲＦ２水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
実施例２４
ナノ構造を含む液体組成物の溶媒能力
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことがともに知られている２つの材料を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
Ａ．エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
５回の試みを、粉末を様々な組成で溶解することを目指して行った。
組成は下記の通りであった：
Ａ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｂ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）。
Ｃ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋４９５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋４９５μｌのＥｔＯＨ（５０％−５０％）。
Ｄ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋９０μｌのＥｔＯＨ（９０％−１０％）。
Ｅ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋８２０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋１７０μｌのＥｔＯＨ（８０％−２０％）。
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
結果
１．白色粉末は５個すべての試験チューブにおいて溶解しなかった。
２．赤色粉末は溶解したが、しばらくして沈降した。
色がわずかに黄色に変化したので、試験チューブＣは粉末をより良好に溶解したかのようであった。
Ｂ．粉砕後の、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
粉砕後、赤色粉末を４つの組成で溶解した：
Ａ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＲＯ。
Ｂ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｃ．１／２ｍｇの赤色粉末＋９．９μｌのＥｔＯＨ→３９．６５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２０％−８０％）。
Ｄ．１／２ｍｇの赤色粉末＋２４．７５μｌのＥｔＯＨ→２４．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）。
総反応体積：５０μｌ。
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
結果
粉砕後、赤色粉末を溶解するために、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）との組合せにおいて、わずかに２０％のエタノールだけが必要であった。
Ｃ．徹底的な粉砕の後における、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
２つの粉砕プロトコルを行った。第１は粉末単独に対してであり（バイアル１）、第２は、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１％）に分散された粉末に対してあった（バイアル２）。
これら２つの組成物を２つのバイアルに入れ、攪拌機上に置いて、材料を一晩粉砕した：
１５時間後、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を数分毎に１０μｌの滴定によって１ｍｇの赤色粉末（バイアル１）に加えた。
変化を、試験チューブの写真を０時間〜２４時間の間で撮影することによってモニタリングした（図７４Ｆ〜Ｊ）。
比較として、２つのチューブを観察した。２つのうちの一方が、９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）に分散された赤色粉末（１％溶液）を含み、他方が、５０％エタノール／５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散された赤色粉末（１％溶液）を含んだ。チューブを６０℃で１時間加熱した。これらのチューブが図７４Ａ〜Ｅに例示される。２４時間の期間の後、それぞれの溶液からの２μｌを採取し、その吸光度をｎａｎｏｄｒｏｐで測定した（図７５Ａ〜Ｃ）。
結果
図７４Ａ〜Ｊは、徹底的な粉砕の後では、赤色材料が２４時間にわたって安定であり続け、沈下しないように、赤色材料を溶解することが可能であることを例示する。しかしながら、図７４Ａ〜Ｅは、時間が経過するとき、該材料は色が変化すること（安定でないこと）を示す。
バイアル１はほとんど吸収しなかった（図７５Ａ）；溶液Ｂの吸光度ピークは、左側（２２０ｎｍ）への変化を伴って２２０ｎｍ〜２７０ｎｍの間にあり（図７５Ｂ）、溶液Ｃの吸光度ピークは２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間にあった（図７５Ｃ）。
結論
赤色材料を粉砕することにより、該材料をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散させることがもたらされた。この分散物は２４時間にわたって持続した。該材料をガラス製バイアルにおいて維持することにより、溶液は、１００％の脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＥｔＯＨ−Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方において、その後７２時間安定に保たれた。
実施例２５
ダイゼイン、ダウノルビシンおよびｔ−ｂｏｃ誘導体を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が３つの材料（ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート（ＣＤ−Ｄａｕ）；ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）；ダイゼインのｔ−ｂｏｃ誘導体（ｔｂｏｃ−Ｄａｉｄ）、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
Ａ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート１：
要求濃度：３ｍｇ／ｍｌ（Ｎｅｏｗａｔｅｒ）
属性：この材料を、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリルに溶解した。
属性：この材料をＥｔＯＨに溶解した。
５個の異なるガラス製バイアルを調製した：
１．５ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１．２ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
２．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン。
３．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１５０μｌのアセトン＋４５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％アセトン）。
４．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌの１０％＊ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）。
５．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン＋６００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
これらのサンプルをボルテックスし、分光光度計での測定を、バイアル＃１、バイアル＃４およびバイアル＃５に対して行った。
バイアルを、アセトンを蒸発させるために開けたままにした（バイアル＃２、バイアル＃３およびバイアル＃５）。
結果
バイアル＃１（１００％のＮｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが数時間後に沈降した。
バイアル＃２（１００％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがアセトン内に懸濁されたが、４８時間後には、アセトンが材料を溶解したので、材料が部分的に沈降した。
バイアル＃３（２５％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがあまり良好に溶解せず、材料が溶液内部でに漂った（溶液は濁っているようであった）。
バイアル＃４（１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが、バイアル＃１におけるＣＤ−Ｄａｕよりも良好に溶解したが、ＣＤ−Ｄａｕは、１００％アセトンとの混合物の場合ほど良好に溶解しなかった。
バイアル＃５：ＣＤ−Ｄａｕが最初、アセトン内に懸濁され、ＣＤ−Ｄａｕが完全に溶解した後で、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを交換するために加えた。最初、アセトンは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在にもかかわらず、この材料を溶解した。しかしながら、アセトンが蒸発するにつれ、材料は一部がバイアルの底に沈降した。しかしながら、材料は懸濁されたままであった。
分光光度計での測定（図７６）は、アセトンの存在下および不在下の両方における材料の挙動を例示する。アセトンがある場合、水または１０％ＰＥＧにより懸濁される材料（両方の場合に、これらは１つだけのピークを示すだけである）との比較において、２つのピークが存在する。
Ｂ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート２：
アセトンが、溶液＃２、溶液＃４および溶液＃５から蒸発するとすぐに、材料はわずかに沈降した。さらなる量のアセトンをこれらのバイアルに加えた。このプロトコルは、材料をアセトンおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で溶解することを可能にし、一方で、同時に、その後の、溶液からのアセトンの蒸発を可能にする（この処置を２回行った）。２回目のサイクルの後で、液相をバイアルから取り出し、さらなる量のアセトンを沈降した材料に加えた。沈降した材料が溶解すると、それを以前に取り出された液相と一緒にした。一緒にした溶液を再び蒸発させた。材料が全く溶解しなかったので、バイアル＃１からの溶液を取り出し、代わりに、１．２ｍｌのアセトンを沈降物に加えて、材料を溶解した。その後、１．２ｍｌの１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）もまた加え、しばらくした後で、アセトンを溶液から蒸発させた。これらの処置を終了したとき、これらのバイアルを一緒にして１つのバイアルにした（３ｍｌの総体積）。この最終的な体積の上に、３ｍｌのアセトンを、材料を溶解し且つ透明な液化溶液を収容するために加え、その後、この溶液を５０℃で再び蒸発させた。溶液は平衡に達しなかった。これは、そのような状態に一旦達すると、溶液は分離してしまうであろうという事実のためである。平衡を避けることによって、材料の水和状態が維持され、液体として保たれた。溶媒を蒸発させた後、材料を清浄なバイアルに移し、真空条件下で閉じた。
Ｃ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート３：
別の３ｍｌの材料（６ｍｌの総体積）を、２ｍｌのアセトン溶解材料と、以前の実験から残った１ｍｌの残留材料とを加えることにより作製した。
１．９ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを含有するバイアルに加えた。
１００μｌのアセトン＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を残留材料に加えた。
蒸発を、５０℃に調節されたホットプレート上で行った。
この処置を、溶液が安定になるまで３回繰り返した（アセトンの添加およびその蒸発）。
これら２つのバイアルをまとめて一緒にした。
これら２つの溶液を一緒にした後、材料がわずかに沈降した。アセトンを加え、溶媒の蒸発を繰り返した。
バイアル（３ｍｌ＋２ｍｌ）を混合する前に、本明細書中上記のパート２に記載されるような実験で調製された第１の溶液を９℃で一晩インキュベーションして、その結果、溶液が平衡に達し、平衡を維持することを確実にした。そうすることによって、既に溶解している材料は沈降しないはずである。翌朝、溶液の吸収を明らかにし、差グラフを得た（図７７）。これら２つのバイアルを一緒にした後、材料がわずかに沈降するので、吸収測定を再び行った。一部の沈降の結果として、溶液をアセトン（５ｍｌ）の添加によって１：１で希釈し、続いて、溶液の蒸発をホットプレートにて５０℃で行った。蒸発処置を行いながらでの溶液の分光光度計での読み取りはアセトンの存在のために変化した（図７８）。これらの実験から、微量のアセトンが存在するとき、アセトンは、もたらされる吸収読み取りに影響を及ぼし得ることが暗示される。
Ｂ．ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）の可溶化
要求濃度：２ｍｇ／ｍｌ
材料および方法
２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１つのバイアルにおいて調製し、２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＲＯを第２のバイアルにおいて調製した。
結果
この材料は、分光光度計での測定（図７９）によって例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水の両方において容易に溶解した。
結論
ダウノルビシンは難なくＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水に溶解する。
Ｃ．ｔ−ｂｏｃの可溶化
要求濃度：４ｍｇ／ｍｌ
材料および方法
１．１４ｍｌのＥｔＯＨを、１８．５ｍｇのｔ−ｂｏｃ（油状材料）を含有する１つのガラス製バイアルに加えた。その後、これを２つのバイアルに分け、１．７４ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＲＯ水を、溶液が２５％のＥｔＯＨを含むようにバイアルに加えた。分光光度計での測定の後、溶媒を溶液から蒸発させ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を両方のバイアルに加えてそれぞれのバイアルにおいて２．３１ｍｌの最終体積にした。これら２つのバイアルにおける溶液を１つの清浄なバイアルに一緒にし、真空条件下での輸送のためにパッケージングした。
結果
分光光度計での測定が図８０に例示される。この材料はエタノールに溶解した。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加え、その後、溶媒を熱（５０℃）により蒸発させた後、この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解することができた。
結論
材料を溶解するための最適な方法は、最初、材料を溶媒（アセトン、酢酸またはエタノール）とともに溶解し、その後、親水性流体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））を加え、続いて、その溶媒を、溶液を加熱し、溶媒を蒸発させることによって除くことである。
実施例２６
ＡＧ−１４ａおよびＡＧ−１４ｂを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む担体組成物が２つの薬草材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ、これらはともに、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
パート１
材料および方法
２．５ｍｇのそれぞれの材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ）を、４つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌであるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）単独、または、７５％のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および２５％のエタノールを含む溶液のいずれかで希釈した。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
結果
エタノールの存在下および不在下でのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における２つの薬草材料の分光光学的測定を図８１Ａ〜Ｄに示す。
結論
ＲＯにおける懸濁はＡＧ−１４Ｂを溶解しなかった。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＡＧ−１４Ｂの懸濁は凝集せず、これに対して、ＲＯでは、ＡＧ−１４Ｂが凝集した。
ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４ＢはＮｅｏｗａｔｅｒ／ＲＯに溶解しなかった。
パート２
材料および方法
５ｍｇのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂを６２．５μｌのＥｔＯＨ＋１８７．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈した。さらに６２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加える前でのＥｔＯＨにおける溶解、その後、ＥｔＯＨの蒸発により、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂが溶解した。
図８２に示されるように、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂは、４８時間を超えて懸濁状態で安定なままであった。
実施例２７
ペプチドを溶解する、ナノ構造を含む担体の能力
ナノ構造を含む担体組成物が７つの細胞傷害性ペプチド（これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。加えて、Ｓｋｏｖ−３細胞に対するこれらのペプチドの影響を、ナノ構造を含む担体組成物がペプチドの細胞傷害活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために測定した。
材料および方法
可溶化：７個すべてのペプチド（ペプチドＸ、Ｘ−５ＦＵ、ＮＬＳ−Ｅ、Ｐａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）、ＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２、ＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨおよびＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫ）を０．５ｍＭでＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。分光光学的測定を行った。
インビトロ実験：Ｓｋｏｖ−３細胞を９６ウエルプレートにおいてマッコイ５Ａ培地で成長させ、１５００細胞／ウエルの濃度に希釈した。２４時間後、２μｌ（０．５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭ）のペプチド溶液を、１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍの最終濃度のために１ｍｌのマッコイ５Ａ培地でそれぞれ希釈した。９個の反復物をそれぞれの処理のために作製した。それぞれのプレートは、３つの濃度での２つのペプチド、および、コントロール処理の６つのウエルを含有した。９０μｌのマッコイ５Ａ培地＋ペプチドを細胞に加えた。１時間後、１０μｌのＦＢＳを（競合を防止するために）加えた。細胞を、クリスタルバイオレットに基づく生存性アッセイで２４時間後および４８時間後に定量した。このアッセイにおける色素はＤＮＡを染色する。可溶化したとき、単層により取り込まれた色素の量をプレート読取り機で定量した。
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈された７個のペプチドの分光光学的測定を図８３Ａ〜Ｇに示す。図８４Ａ〜Ｇに示されるように、溶解されたペプチドのすべてが細胞傷害活性を含んでいた。
実施例２８
レチノールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物がレチノールを溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
レチノール（ビタミンＡ）をＳｉｇｍａ（Ｆｌｕｋａ、９９％ＨＰＬＣ）から購入した。レチノールを下記の条件下でＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において可溶化した。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における１％レチノール（１ｍｌに０．０１ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（１ｍｌに０．００５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（２５ｍｌに０．１２５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％レチノール（２５ｍｌに０．０６２５ｇｒ）。最終的なＥｔＯＨ濃度：１．５％
ＥｔＯＨにおけるレチノールの吸光度スペクトル：レチノール溶液を、校正用グラフを作製するために、種々のレチノール濃度とともに無水ＥｔＯＨにおいて作製した。吸光度スペクトルを分光光度計で検出した。
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％および０．５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの濃度が不明である２つの溶液を分光光度計で検出した。数滴の油滴が水に溶解されないので、レチノールの実際の濃度もまた不明である。
ろ過：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの最終濃度が１．５％である２つの溶液を調製した。これらの溶液を０．４４μｌおよび０．２μｌのフィルターでろ過した。
結果
レチノールは、アルカリ性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において、酸性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも容易に可溶化した。溶液の色は黄色であり、この色は時間とともに退色した。吸光度実験において、０．５％のレチノールは、０．１２５％のレチノールと類似するパターンを示し、０．２５％のレチノールは、０．０３１２５％のレチノールと類似するパターンを示した（図８５を参照のこと）。レチノールは熱において不安定であるので、（その融点は６３℃であり）、レチノールはオートクレーブ処理することができない。ろ過は、レチノールが（ＥｔＯＨに）完全に溶解されたときに可能であった。図８６に示されるように、ろ過後の溶液におけるレチノールは０．０３１２５％未満である。両方のろ液は、類似した結果を与えた。
実施例２９
材料Ｘを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料Ｘを４０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
パート１−水およびＤＭＳＯにおける溶解性
材料および方法
第１の試験チューブにおいて、２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。第２の試験チューブにおいて、２５μｌのＤＭＳＯを１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。両方の試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、振とう機で１時間振とうした。
結果
この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に全く溶解しなかった（試験チューブ１）。この材料はＤＭＳＯに溶解し、黄褐色の色を与えた。これらの溶液を２４時間〜４８時間放置し、それらの安定性を経時的に分析した（図８７Ａ〜Ｂ）。
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を溶解せず、材料が沈降し、これに対して、ＤＭＳＯは材料「Ｘ」をほぼ完全に溶解した。
パート２−ＤＭＳＯの削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
それぞれが２５μｌの総反応体積を含有する６個の異なる試験チューブを分析した：
１．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１００％）。
２．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ→１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
３．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
４．１ｍｇの「Ｘ」＋６．２５μｌのＤＭＳＯ＋１８．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％）。
５．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース＊（１０％）。
６．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌの脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＊＊（５０％）。
＊０．１ｇのスクロース＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＝１０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース
＊＊脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を６０℃で９０分間脱水することによって得た。
すべての試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、１時間振とうした。
結果
６つの溶媒および材料Ｘを含む、時間０での試験チューブを図８８Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後６０分での試験チューブを図８９Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後１２０分での試験チューブを図９０Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後２４時間での試験チューブを図９１Ａ〜Ｃに示す。
結論
すべての試験チューブにおいて、材料が２４時間後に沈降したので、材料「Ｘ」は期間中を通して安定なままではなかった。
試験チューブ２の溶媒と、試験チューブ６の溶媒との間には、同じ割合の溶媒を含有するにしても、違いが認められる。これは、試験チューブ６が、非脱水のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）より疎水性である脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有するためである。
パート３ ＤＭＳＯのさらなる削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯをガラス製チューブに入れた。５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）をチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））５００μｌを加えた。
第２のガラス製チューブにおいて、１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯを加えた。５０μｌのＲＯをチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、ＲＯの溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％ＲＯ）５００μｌを加えた。
結果
図９２Ａ〜Ｄに例示されるように、材料「Ｘ」は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散されたままであったが、ＲＯ水を含む溶液では、チューブの底に沈降した。図９３は、ボルテックス後６時間での、ＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびアセトンに分散された材料の吸収特徴を示す。
結論
材料「Ｘ」が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と比較したとき、ＲＯに異なって溶解すること、および、材料「Ｘ」は、ＲＯと比較したとき、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）においてより安定であることが明らかである。分光光度計での測定（図９３）からは、グラフ下面積がＲＯの場合よりも大きいので、材料「Ｘ」が、５時間後でさえ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）にはより良好に溶解していたことが明らかである。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を水和することが明らかである。ＤＭＳＯの量を２０％〜８０％減らすことができ、また、材料「Ｘ」を水和し、材料「Ｘ」をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散する、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく溶液を得ることができる。
実施例３０
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
ＳＰＬ２１０１をその最適な溶媒（エタノール）に溶解し（図９４Ａ）、ＳＰＬ５２１７をその最適な溶媒（アセトン）に溶解した（図９４Ｂ）。これら２つの化合物をガラス製バイアルに入れ、冷暗所環境で保った。微量の溶媒が全く認められなくなるまで、溶媒の蒸発をデシケータにおいて長時間行い、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を溶液に加えた。
結果
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７は、図９５Ａ〜Ｂにおける分光光度計データによって示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。
実施例３１
タキソールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む担体組成物が材料タキソール（パクリタキセル）を０．５ｍＭの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を、ＤＭＳＯ、または、１７％のＥｔＯＨを伴うＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれかで調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。吸光度を分光光度計により検出した。
細胞生存性アッセイ：１５００００個の２９３Ｔ細胞を３ｍｌのＤＭＥＭ培地とともに６ウエルプレートに播種した。それぞれの処理物を、ＲＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づくＤＭＥＭ培地で成長させた。タキソール（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＤＭＳＯに溶解されたもの）を１．６６６μＭの最終濃度に加えた（３ｍｌの培地中１０μｌの０．５ｍＭタキソール）。細胞をタキソールによる２４時間処理の後で集め、死細胞を検出するためのトリパンブルー溶液を使用して計数した。
結果
タキソールは、図９６Ａ〜Ｂに示されるように、ＤＭＳＯおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方に溶解した。タキソールの様々な溶液の後での２９３Ｔ細胞の生存性を図９７に示す。
結論
タキソールは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶液の後で細胞傷害作用を含んでいた。
実施例３２
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）を、ｄｄＨ２Ｏ（ＲＯ）におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）におけるそれらの活性を求めるために、ＰＣＲ反応において調べた。酵素を１時間〜２．５時間までの種々の期間にわたって９５℃に加熱した。２つのタイプの反応液を作製した：
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した（酵素、水、緩衝液、ｄＮＴＰ類、ゲノムＤＮＡおよびプライマー）。
煮沸後、必要とされる任意のさらなる反応成分をＰＣＲチューブに加え、通常のＰＣＲプログラムを３０サイクルに設定した。
結果
図９８Ａ〜Ｂに示されるように、ナノ構造を含む担体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、ＲＯ水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
実施例３３
ナノ構造を含む担体の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む担体組成物が２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
ＰＣＲ反応を下記のように設定した：
Ｐｅｑ−ｌａｂサンプル：ナノ構造を含む担体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか２０．４μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｑ−ｌａｂ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
３つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分および９０分であった。
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌの１０Ｘ反応緩衝液Ｙ（Ｐｅｑ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー ＧＡＰＤＨミックス １０ｐｍｏｌ／μｌ
０．５μｌのゲノムＤＮＡ ３５μｇ／μｌ
Ｂｉｏｌａｂサンプル
ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか１８．９μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
５つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分、９０分、１２０分および１５０分であった。
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌのＴＡＱ １０Ｘ緩衝液（Ｍｇ非含有）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー ＧＡＰＤＨミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌのゲノムＤＮＡ（３５μｇ／μｌ）
それぞれの処理（ＮｅｏｗａｔｅｒまたはＲＯ）のために、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製した。陽性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わないものであった。陰性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わず、かつ、ＤＮＡを反応において伴わないものであった。ＰＣＲミックスを、煮沸ｔａｑアッセイ、ならびに、コントロール反応のために作製した。
サンプルをＰＣＲ装置に入れ、下記のように操作した：
ＰＣＲプログラム：
１．９４℃で２分間の変性
２．９４℃で３０秒間の変性
３．６０℃で３０秒間のアニーリング
４．７２℃で３０秒間の伸長
工程２〜４を３０回繰り返す
５．７２℃で１０分間の伸長
結果
図９９に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、１．５時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
実施例３４
液体組成物およびナノ構造における熱脱水された多重ＰＣＲミックス
液体組成物およびナノ構造が多重ＰＣＲシステムにおいて使用することができたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
下記の成分も含む標準的なＰＣＲ混合物を調製した（ＫＣｌ緩衝液、ｄＮＴＰ類、、Ｔａｑ、ＢＰＢ）：
添加物（最終濃度）：スクロース（１５０ｍＭ、２００ｍＭ）
Ｔａｑ酵素：Ｂｉｏｌａｂ
ヒトインスリン遺伝子に対するプライマー（内部コントロール）
ヒトゲノムＤＮＡ（内部コントロール）
サンプルを、水が蒸発するまでオーブンにおいて熱脱水した（ＲＯ／ＮＷベース）。
再水和を、（Ａ）ＤＤＷのみ（ＥＯ／ＮＷ）および（Ｂ）ＰＢＦＤＶのＤＮＡセグメントのＥＧＤプライマーミックス（ＲＯおよびＮＷに基づく）（多重）により行った。
結果
図１００において理解され得るように、反応の忠実性を維持しながら、完全なＰＣＲミックスを熱脱水し、それを、ＮｅｏｗａｔｅｒまたはＲＯ水を使用して再水和することが可能である。さらに、熱脱水されたＰＣＲミックスの多重能を、Ｎｅｏｗａｔｅｒの再水和ミックスを使用して観測することができる。主な標的遺伝子（ＰＢＦＤＶセグメント）が、ヒトゲノムのインスリン遺伝子およびその増幅用プライマーセットを増幅することなく成功裏に増幅されたことを認めることができる。従って、この方法は、多目的ＰＣＲ反応のための内部コントロールとして使用することができ、これは、ＰＣＲ反応が、サンプルに基づいて正確に行われたことを保証する特性（これにより、偽陰性の結果が排除される）である。
実施例３５
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における微小体積ＰＣＲ
液体組成物およびナノ構造が微小体積ＰＣＲ反応において使用することができたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
ＭＶＰを２μｌの最終体積で行った。標的ＤＮＡは、ＰＤＸ遺伝子を含むプラスミドであった。ミックスを調製し、２μｌの完全ミックス（両方のＤＮＡ、プライマーおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有する）をチューブに等分し、ＰＣＲを行った。
結果
図１０１から理解され得るように、反応のすべてが正しく行われた。このことは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）がＰＣＲにおける微量反応体積に関与することができることを明らかにする。
実施例３６
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を用いたＱＰＣＲ
液体組成物およびナノ構造がＱＰＣＲ反応（定量ＰＣＲ）において使用することができるかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
ＱＰＣＲを、いくつかのＤＮＡ標的（プラスミドおよびゲノム）および遺伝子標的（β−アクチン、ＰＤＸ、ＰＣＴなど）に対してＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎとともに行った。
結果
図１０２Ａ〜Ｃにおいて理解され得るように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を用いたβ−アクチンのＱＰＣＲは優れており、プライマー二量体の形成を何ら伴うことなく、増幅を指数様式（１０３％の効率、指数的傾き）で利用する。図１０３Ａ〜Ｃにおいて理解され得るように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を用いたＰＤＸプラスミドのＱＰＣＲは優れており、プライマー二量体の形成を何ら伴うことなく、増幅を指数様式（１０１％の効率、指数的傾き）で利用する。
実施例３７
ヒドロキシアパタイトを使用するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の製造
５つの異なるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粒子（１〜５と印が付けられる）を使用して、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を下記のように作製した。
異常点未満（すなわち、４℃未満）で維持されたＲＯ水を１５ワットの出力で９１５ＭＨｚでのＲＦシグナルによって照射した。１０分のＲＦ照射の後、約９００℃に加熱されたヒドロキシアパタイトのサブミクロン粉末を炉から水中に落とした。ＲＦ照射をさらに５分間続け、その後、水を室温で２日間置いた。供給源粉末のほとんど（より大きい粒子／凝集物を含有する）が底に沈み、水の透明な部分を分離した。
供給源粉末を、４ｋＶで操作される高分解能走査電子顕微鏡（ＨＲＳＥＭ、Ｚｉｅｓｓ、Ｌｅｏ９８２）によって特徴づけた。粉末を炭素接着テープに広げることによってサンプルを調製した。
作製されたＮｅｏｗａｔｅｒもまた特徴づけられた。最初に、ＮｅｏｗａｔｅｒのＱＣ試験を行い、５個すべての溶液が陽性であることが見出された。次に、ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および供給源粉末を、ＨＲＳＥＭ（Ｌｅｏ９８２）と、２００ｋＶで操作され、Ｇａｔａｎ ＣＣＤを備える透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｅｃｎａｉ Ｔ２０、ＦＥＩ）との両方によって特徴づけた。ＨＲＳＥＭ用のサンプルを、３滴のＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒを（良好なコントラストを有するために）Ｓｉウエハに置くことによって調製し、ＴＥＭ用のサンプルを、１滴を銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッドに置くことによって調製した。すべてのサンプルを、基体の何らかの考えられる分解を防止するために、真空デシケータにおいて乾燥した。
結果
５個すべてのスラリーが、１０ｎｍ〜１００ｎｍの直径範囲を有する個々の丸い粒子を含有することが見出された。図１０４〜図１２７のＡ〜Ｆに示されるように、電子顕微鏡観察により、ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）がＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）のものと非常に類似していたことが明らかにされた。図１０４は、１〜１０の範囲の数字によりＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の性質を調べるＱＣ試験のデジタル顕微鏡写真を示す。この場合、これは陽性で、１０であった。このことは高品質のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を意味する。図１０５Ａ〜Ｈは、供給源粉末から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真を示す。供給源粉末が球体の大きい凝集物を含有し、一方で、それぞれの球体が、約５０ｎｍの程度の直径を有するより小さい粒子から組み立てられることを認めることができる。図１０６Ａ〜Ｈは、ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真を示す。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）製造プロセス後に残るものが、ほとんどの場合、直径が１０ｎｍ〜１００ｎｍである細かい個々の粒子を含有することを認めることができる。図１０７はＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。ＴＥＭのより大きい分解能を使用して、粒子の形状およびサイズをより容易に見ることができる。
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許及び特許願はすべて、個々の刊行物、特許及び特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
本発明の好ましい実施形態によるナノ構造の概略図である。 図２ａは本発明の好ましい実施形態による、液体組成物を製造する方法の流れ図である。図２ｂは本発明の好ましい実施形態による、ＤＮＡ配列を増幅する方法の流れ図である。 本発明のナノ構造のＴＥＭ画像である（図３ａ〜図３ｅ）。 本発明の液体組成物に対する色素の影響を示す。 図５ａ〜図５ｂは液体組成物に対する高ｇ遠心分離の影響を示し、図５はチューブの下部部分の記録されたシグナルを示し、図５ｂはチューブの上部部分の記録されたシグナルを示す。 本発明の液体組成物について行われたｐＨ試験の結果を示す（図６ａ〜図６ｃ）。 本発明の液体組成物の吸収スペクトルを示す。 本発明の液体組成物のζ電位測定の結果を示す。 本発明の液体組成物の存在下（左側）およびコントロール媒体の存在下（右側）でのバクテリオファージ反応を示す（図９ａ〜図９ｂ）。 コントロール液体および本発明の液体組成物の溶菌表面積の比較を示す。 本発明の液体組成物の存在下（左側）およびコントロール媒体の存在下（右側）での１００の日常的試験希釈でのファージ型決定濃度を示す。 発明の液体組成物およびコントロール媒体の、時間を関数とする光学的濃度を示す。 マイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられた実験における粘着物産生性の表皮ブドウ球菌の光学的濃度を示す（図１３ａ〜図１３ｃ）。 異なるマイクロタイタープレートに対する粘着物付着の１５回の反復実験を表すヒストグラムである。 同じマイクロタイタープレートにおける本発明の液体組成物およびコントロールに対する粘着物付着の違いを示す。 電気化学的析出実験設定を示す（図１６ａ〜図１６ｃ）。 本発明の液体組成物（図１７ａ）およびコントロール（図１７ｂ）の電気化学的析出を示す。 本発明の液体組成物と３０分の期間にわたって接触していたセルにおける逆浸透（ＲＯ）水の電気化学的析出を示す。 本発明の液体組成物（図１９ａ）およびコントロール媒体（図１９ｂ）についての枯草菌コロニー成長の結果を示す。 原料粉末を伴う水（図２０ａ）、逆浸透水（図２０ｂ）および本発明の液体組成物（図２０ｃ）についての枯草菌コロニー成長の結果を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２１ａ）およびｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２１ｂ）に対する標識抗体および非標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２１ｃ）およびｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２１ｄ）に対する標識抗体および非標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２２ａ）およびｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２２ｂ）に対する標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２２ｃ）およびｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２２ｄ）に対する標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物を使用し、また、緩衝液を使用したときの、ｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２３ａ）および中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２３ｂ）に対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物を使用し、また、緩衝液を使用したときの、ｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２３ｃ）およびｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２３ｄ）に対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２４ａ）および中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２４ｂ）に対する、３７℃で２時間のポストインキュベーションでの標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２４ｃ）およびｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２４ｄ）に対する、３７℃で２時間のポストインキュベーションでの標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２５ａ）およびｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２５ｂ）に対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２５ｃ）およびｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２５ｄ）に対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレート（図２６ａ）およびｐｏｌｙｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２６ｂ）に対する、室温で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２６ｃ）およびｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレート（図２６ｄ）に対する、室温で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液について、リン酸塩洗浄緩衝液を使用したときの、標識抗体および非標識抗体の結合結果（図２７ａ）と、標識抗体のみの結合結果（図２７ｂ）とを示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液について、ＰＢＳ洗浄緩衝液を使用したときの、標識抗体および非標識抗体の結合結果（図２７ｃ）と、標識抗体のみの結合結果（図２７ｄ）とを示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のｃｏｓｔａｒマイクロ滴定プレートに対する、４℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合結果（図２８ａ）と、標識抗体のみの結合結果（図２８ｂ）とを示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、酢酸塩緩衝液（図２９ａ）および炭酸塩緩衝液（図２９ｂ）についてのｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、リン酸塩緩衝液（図２９ｃ）についてのｎｏｎ−ｓｏｒｐマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示す。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、炭酸塩緩衝液（図３０ａ〜図３０ｂ）についてのｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示し、図３０ｂに示されるグラフは、図３０ａに示されるグラフの直線部分である。 本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、酢酸塩緩衝液（図３０ｃ）およびリン酸塩緩衝液（図３０ｄ）についてのｍａｘｉｓｏｒｐマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示す。 核酸について本発明の液体組成物の平均結合強化能を示す。 核酸について本発明の液体組成物の平均結合強化能を示す。 異なる緩衝液組合せおよび異なる溶出工程について精製前および精製後のＰＣＲ生成物サンプルの画像である。 異なる緩衝液組合せおよび異なる溶出工程について精製前および精製後のＰＣＲ生成物サンプルの画像である（図３３ａ〜図３３ｂ）。 異なる緩衝液組合せおよび異なる溶出工程について精製前および精製後のＰＣＲ生成物サンプルの画像である（図３４ａ〜図３４ｂ）。 異なる緩衝液組合せおよび異なる溶出工程について精製前および精製後のＰＣＲ生成物サンプルの画像である（図３５ａ〜図３５ｂ）。 異なる量、濃度および溶出工程でカラムを通過したＰＣＲ生成物の画像である 異なる量、濃度および溶出工程でカラムを通過したＰＣＲ生成物の定量分析である。 ３つの溶出工程で、図３６に示されるカラム５〜１７を通過したＰＣＲ生成物カラムの画像である（図３８ａ〜図３８ｃ）。 図３９ａは、図３８ａ〜図３８ｃの３つの溶出工程のそれぞれについて、負荷体積を関数とするコントロール緩衝液（ＣＯとして表される）および本発明の液体組成物（ＬＣとして表される）の面積を示す。図３９ｂは、図３８ａ〜図３８ｃの３つの溶出工程のそれぞれについて、負荷体積を関数とする比率（ＬＣ／ＣＯ）を示す。 ＲＯ水の存在下（図４０ａ）および本発明の液体組成物の存在下（図４０ｂ）でのゲル電気泳動実験におけるＤＮＡの移動速度を比較するレーン画像である。 ＲＯ水の存在下（図４１ａ）および本発明の液体組成物の存在下（図４１ｂ）でのゲル電気泳動実験におけるＤＮＡの移動速度を比較するレーン画像である。 ＲＯ水の存在下（図４２ａ）および本発明の液体組成物の存在下（図４２ｂ）でのゲル電気泳動実験におけるＤＮＡの移動速度を比較するレーン画像である。 泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である（図４３ａ〜図４３ｄ）。 泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である（図４４ａ〜図４４ｄ）。 泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である（図４５ａ〜図４５ｄ）。 ゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である（図４６ａ〜図４６ｄ）。 ゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である（図４７ａ〜図４７ｄ）。 ゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である（図４８ａ〜図４８ｄ）。 アルカリホスファターゼの非結合型形態の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、希釈を関数とする安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。 アルカリホスファターゼの結合型形態の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における希釈を関数とする、ＲＯ水および本発明の液体組成物において希釈されたストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼの酵素活性を示す。 β−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、２４時間後（図５１ａ）および４８時間後（図５１ｂ）でのβ−ガラクトシダーゼの安定性を示す。 β−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、７２時間後（図５１ｃ）および１２０時間後（図５１ｄ）でのβ−ガラクトシダーゼの安定性を示す。 β−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、２４時間後（図５２ａ）および４８時間後（図５２ｂ）での安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。 β−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、７２時間後（図５２ｃ）および１２０時間後（図５２ｄ）での安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。 乾燥および熱処理の後でのアルカリホスファターゼの残存活性を示す。 乾燥および熱処理の後でのアルカリホスファターゼの安定性強化パラメーターＳｅの値を示す。 ＰＣＲ反応時においてＤＮＡに影響を及ぼすガラスビーズの能力に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像を示す。 自動ベースライン決定を伴う、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線（図５５ａ）および解離曲線（図５５ｂ）である。 自動ベースライン決定を伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線（図５６ａ）および解離曲線（図５６ｂ）である。 ０．２の手動バックグラウンドカットオフを伴う、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（図５７ａ）または水（図５７ｂ）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である。 外れ値をそれぞれのセットから一致して除いた後での、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（図５８ａ）または水（図５８ｂ）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線である（手動バックグラウンドカットオフ＝０．２）。 外れ値をそれぞれのセットから個々に除いた後での、希釈が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの標準曲線（図５９ａ）および外れ値をそれぞれのセットから一致して個々に除いた後での、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの増幅プロット（図５９ｂ）である（手動バックグラウンドカットオフ＝０．２）。 反応がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で行われるときのバックグラウンドノイズを明らかにするリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの増幅プロットである（反応変化＝特定の生成物の蛍光放出−ベースライン読み取り）。 反応が水の存在下で行われるときのバックグラウンドノイズを明らかにするリアルタイムＰＣＲ分析を受けるｃＤＮＡサンプルの反応変化対サイクルの曲線である。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での１０μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下での１５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。 水の存在下での５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。 水の存在下での１０μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。 水の存在下での１５μｌの反応体積で行われた３回のリアルタイムＰＣＲ反応の増幅プロットである。 観測時間の関数としての、本発明の液体組成物における絶対値の超音波速度の等温測定の結果を示す。 本発明の液体組成物の存在下におけるＤＮＡチップに対するＲＮＡの増強されたハイブリダイゼーションを示す写真である（図６４ａ〜図６４ｄ）。 ５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。 ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである（図６６a〜図６６ｃ）。 ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる（図６７a〜図６７ｃ）。 ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである（図６８a〜図６８ｃ）。 ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。 ５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定（図７０ａ）および水酸化ナトリウム滴定（図７０ｂ〜図７０ｃ）を例示するグラフである。 ＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図７１ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図７１ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。 ＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図７２ａ）、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフ（図７２ｂ）、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図７２ｃ）である。矢印は２回目の照射を示す。 ＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。 粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。 粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。 粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。 ナノドロップで測定されたときの、一晩の粉砕の後での赤色粉末＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒの溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。 ナノドロップで測定されたときの、１００％の脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた後での赤色粉末の溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。 ナノドロップで測定されたときの、ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）を加えた後での赤色粉末の溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。 バイアル＃１（ＣＤ−Ｄａｕ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、バイアル＃４（ＣＤ−Ｄａｕ＋１０％ＰＥＧ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））およびバイアル＃５（ＣＤ−Ｄａｕ＋５０％アセトン＋５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））の分光光度計測定のグラフである。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）、および、微量の溶媒（アセトン）を伴う溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）および、アセトンにおける溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。淡青色および黄色の線はアセトン蒸発の異なる割合を表し、紫色線はアセトン非含有溶液である。 ＣＤ−Ｄａｕの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。 ｔ−ｂｏｃの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。 ２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。 ２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。 エタノール蒸発後２４時間でのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ１４Ｂの懸濁物の写真である。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの分光光度計測定のグラフである。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの分光光度計測定のグラフである。 クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。 クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。 クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。 クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。 エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。 ろ過後の、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。 試験チューブ（左側はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および物質「Ｘ」を含有し、右側はＤＭＳＯおよび物質「Ｘ」を含有する）の写真である（図８７ａ〜図８７ｂ）。 加熱および振とう処置を行った直後における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図８８ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図８８ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図８８ｃ）の写真である。 加熱および振とう処置を行った後６０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図８９ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図８９ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図８９ｃ）の写真である。 加熱および振とう処置を行った後１２０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図９０ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図９０ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図９０ｃ）の写真である。 加熱および振とう処置を行った後２４時間における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図９１ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図９１ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図９１ｃ）の写真である。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および低下した濃度のＤＭＳＯを含む溶媒に物質「Ｘ」を含むガラス製ボトルの振とう直後の写真（図９２ａ）、振とう後３０分の写真（図９２ｂ）、振とう後６０分の写真（図９２ｃ）および振とう後１２０分の写真（図９２ｄ）である。 分光光度計によって測定されたときの、ボルテックス後６時間のＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における物質「Ｘ」の吸収特徴を例示するグラフである。 分光光度計によって測定されたときの、エタノールにおけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図９４ａ）、および、アセトンにおけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図９４ｂ）である。 分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図９５ａ）、および、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図９５ｂ）である。 分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図９６ａ）、および、ＤＭＳＯにおけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図９６ｂ）である。 ２９３Ｔ細胞に対する異なる溶剤におけるタキソールの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。 ２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例３２に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である（図９８ａ〜図９８ｂ）。 ２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例３３に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。 熱脱水されたＰＣＲミックスにおけるＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の多重能を例示する写真である。 Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）が微小体積ＰＣＲ（ＭＶＰ）に関与することができることを例示する写真である。 ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるβ−アクチン増幅の増幅プロット（図１０２ａ）、および解離プロット（図１０２ｂ）である。 ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるβ−アクチン増幅の標準プロットである。 ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＰＤ−Ｘ増幅の増幅プロットである。 ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＰＤ−Ｘ増幅の解離プロットである。 ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）により検出される、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＰＤ−Ｘ増幅の標準プロットである。 ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。 ＨＡ（ＨＡ−１８）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ（ＨＡ−１８）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡ−１８）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。 ＨＡ（ＡＢ１−２２−１）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ（ＡＢ１−２２−１）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２２−１）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。 ＨＡ（ＡＡ９９−Ｘ）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ（ＡＡ９９−Ｘ）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＡ９９−Ｘ）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。 ＨＡ（ＡＢ１−２−３）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ（ＡＢ１−２−３）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＡＢ１−２−３）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。 ＨＡ（ＨＡＰ）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＨＡ（ＨＡＰ）供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＨＡ型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＨＡＰ）スラリー内の溶質としてのＺｎＳＯ４からのＺｎの電気化学的析出ＥＣＤのデジタル顕微鏡写真である。これはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のＱＣである。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 ＢａＴｉＯ３供給源粉末から得られた高倍率によるＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 Ｓｉウエハ上に存在するＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＨＲＳＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。 銅の４００メッシュの炭素薄膜ＴＥＭグリッド上に存在するＢａＴｉＯ３型Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）から得られたＴＥＭ顕微鏡写真である。
配列番号１〜８は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。

Claims (60)

  1. 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
  2. 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、ナノ構造がヒドロキシアパタイトから配合され、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
  3. 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、水と比較して、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
  4. 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、水と比較して高まった緩衝能力によって特徴づけられ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
  5. 物質を、物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む、物質を溶解または分散する方法であって、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、方法。
  6. 物質は、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 物質は医薬用薬剤である、請求項３または５に記載の液体組成物または方法。
  8. 医薬用薬剤は、治療剤、化粧剤または診断剤である、請求項７に記載の液体組成物または方法。
  9. 前記流体分子の少なくとも一部は前記液体の分子と同一である、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  10. 前記流体分子の前記少なくとも一部はガス状状態にある、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  11. 前記ナノ構造の濃度は１リットルあたり１０２０個未満である、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  12. 前記ナノ構造は、前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  13. 前記ナノ構造は、ナノ構造間で遠距離の相互作用を維持することができる、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  14. 前記ナノ構造のそれぞれが、前記液体の比重よりも小さい比重、または、前記液体の比重と等しい比重を有する、請求項１、３、４または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  15. 前記組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項１、３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  16. 前記組成物は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む、請求項１、４または５に記載の組成物または方法。
  17. 前記接触の前に、溶媒に前記薬剤を溶解または分散することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  18. 前記接触の後で、溶媒に前記薬剤を溶解または分散することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  19. 前記溶媒は極性溶媒である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記溶媒は非極性溶媒である、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. 前記溶媒は有機溶媒である、請求項１７または１８に記載の方法。
  22. 前記有機溶媒はエタノールまたはアセトンである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記溶媒は非有機溶媒である、請求項１７または１８に記載の方法。
  24. 前記溶解または分散の後で前記溶媒を蒸発させることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  25. 前記蒸発は、熱または圧力によって行われる、請求項２４に記載の方法。
  26. 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の効率を改善することができ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
  27. 前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のＤＮＡポリメラーゼの触媒活性を高めることができる、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応はマグネシウムを含まない、請求項２６に記載の組成物。
  29. 前記流体分子の少なくとも一部は前記液体の分子と同一である、請求項２６に記載の組成物。
  30. 前記流体分子の前記少なくとも一部はガス状状態にある、請求項２６に記載の組成物。
  31. 前記ナノ構造の濃度は１リットルあたり１０２０個未満である、請求項２６に記載の組成物。
  32. 前記ナノ構造は、前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項２６に記載の組成物。
  33. 前記ナノ構造は、ナノ構造間で遠距離の相互作用を維持することができる、請求項２６に記載の組成物。
  34. 前記ナノ構造は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項２６に記載の組成物。
  35. 前記ナノ構造は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む、請求項２６に記載の組成物。
  36. （ａ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
    （ｂ）二本鎖ＤＮＡ検出分子と、
    （ｃ）液体およびナノ構造を有する液体組成物であって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物と
    を含む、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のためのキット。
  37. 少なくとも１つのｄＮＴＰをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
  38. 少なくとも１つのコントロールテンプレートＤＮＡをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
  39. 少なくとも１つのコントロールプライマーをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
  40. 前記二本鎖ＤＮＡ検出分子は、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子である、請求項３６に記載のキット。
  41. 前記二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子は、臭化エチジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−１、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＢＲ ＧｏｌｄおよびＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩからなる群から選択される、請求項４０に記載のキット。
  42. 前記二本鎖ＤＮＡ検出分子は、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子である、請求項４０に記載のキット。
  43. 前記プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子は、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ローダミンおよびＢＯＤＩＰＹ−ＦＩからなる群から選択される、請求項４２に記載のキット。
  44. 前記流体分子の少なくとも一部は前記液体の分子と同一である、請求項３６に記載のキット。
  45. 前記流体分子の前記少なくとも一部はガス状状態にある、請求項３６に記載のキット。
  46. 前記ナノ構造の濃度は１リットルあたり１０２０個未満である、請求項３６に記載のキット。
  47. 前記ナノ構造は、前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項３６に記載のキット。
  48. 前記ナノ構造は、ナノ構造間で遠距離の相互作用を維持することができる、請求項３６に記載のキット。
  49. 前記ナノ構造は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項３６に記載のキット。
  50. 前記ナノ構造は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む、請求項３６に記載のキット。
  51. 前記ナノ構造は、ヒドロキシアパタイトから配合される、請求項１、３、４、５、２６または３６のいずれかに記載の組成物、方法、またはキット。
  52. 液体組成物を製造する方法であって、この方法は、
    （ａ）ヒドロキシアパタイトを液体に浸すこと、ただし、前記ヒドロキシアパタイトは前記液体より少なくとも５００℃温かい；および
    （ｂ）前記液体および前記ヒドロキシアパタイトを電磁放射線によって照射すること、ただし、前記電磁放射線は、ナノ構造がヒドロキシアパタイトの粒子から形成されるように選択された振動数によって特徴づけられる
    を含む、方法。
  53. ヒドロキシアパタイトはミクロサイズの粒子を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ミクロサイズの粒子は結晶性粒子である、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記ナノ構造は結晶性のナノ構造である、請求項５２に記載の方法。
  56. 前記液体は水を含む、請求項５２に記載の方法。
  57. 前記電磁放射線は高周波範囲にある、請求項５２に記載の方法。
  58. 前記電磁放射線は連続波の電磁放射線である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記電磁放射線は変調電磁放射線である、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記浸すことと前記照射することは同時に行なわれる、請求項５７に記載の方法。
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