JP2009524600A - 固液組成物 - Google Patents
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Abstract
整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含むナノ構造が開示される。コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。液体およびナノ構造を含む液体組成物もまた開示される。
Description
本発明は固液組成物に関連し、より具体的には、ナノ構造、ならびに、このナノ構造を有し、かつ、多数の特徴的な物理的特性、化学的特性および生物学的特性によって特徴づけられる液体組成物に関連する。
ナノサイエンスは、物質の小さい粒子の科学であり、現代科学における最も重要な先端研究領域の1つである。このような小さい粒子は、材料を構成する粒子がナノスケールになるとき、材料のすべての性質(例えば、その融点ならびにその電気的性質および光学的性質など)が変化するので、基礎的な観点から注目されている。新しい性質とともに、技術的開発および商業的開発のための新しい機会が到来し、ナノ粒子の様々な応用が、ミクロエレクトロニクスおよびナノエレクトロニクス、ナノ流体素子力学、被覆および塗料、ならびに生物工学のように多様な分野で示されているか、または、提案されている。
例えば、産業および学術での多くの試みが現在、マイクロ電子機械システム(MEMS)として一般に知られている、電気的、機械的および/または光学的/電気光学的な構成成分を組み合わせる一体化されたマイクロデバイスまたはシステムの開発に向けられている。MEMSは、集積回路バッチ加工技術を使用して加工され、サイズがマイクロメートルからミリメートルにまで及び得る。このようなシステムは、ミクロスケールでの検知、制御および作動が可能であり、また、マクロスケールでの効果を生じさせるために、個々に、またはアレイで機能させることができる。
生物工学の領域では、ナノ粒子は、生物学的分子の実空間での構造および機能をプローブするためのナノメートルスケールの装置においてしばしば使用される。補助的なナノ粒子(例えば、アルギン酸カルシウムのナノ球体など)もまた、遺伝子トランスフェクションプロトコルを改善することを助けるために使用されている。
金属ナノ粒子では、伝導電子の共鳴した集団的振動(これはまた、粒子プラズモンとして知られている)が様々な光学的な場によって励起される。粒子プラズモンの共鳴振動数は、主に、金属の誘電関数、周りの媒体、および、粒子の形状によって決定される、共鳴は、金属粒子の表面および金属粒子の表面の近くにおいて限定された局所的な場の狭い分光的に選択的な吸収および強化を生じさせる。レーザー波長が粒子のプラズモン共鳴振動数に合わせられるとき、ナノ粒子近傍での局所的な電場が数桁ほど強化され得る。
従って、様々なナノ粒子が、例えば、生物学的組織サンプルにおける個々の分子を従来の蛍光標識化と類似する様式で同定するために、電磁放射線を細胞または分子の近傍において吸収または再収束させるために使用される。
ナノ粒子の特別な放射線吸収特性はまた、太陽エネルギー変換の領域でも利用されている。この場合、セレン化ガリウムのナノ粒子が、可視領域において電磁放射線を選択的に吸収し、その一方で、スペクトルの赤方端での電磁放射線を反射し、それにより、変換効率を著しく増大させるために使用されている。
ナノ科学が役割を果たし得るさらなる領域は熱移動に関連する。産業での熱移動要求に集中するかなりの以前の研究開発にもかかわらず、冷却能力における大きな改善は、従来の流体の熱移動特性における基本的な限界のために妨げられている。固体形態における材料は、流体の熱伝導性よりも数桁大きい熱伝導性を有することが広く知られている。従って、懸濁された固体粒子を含有する流体は、従来の熱移動流体と比較して、著しく高まった熱伝導性を示すことが期待される。
低い熱伝導性は、多くの産業的適用において要求されるエネルギー効率的な熱移動流体の開発における大きな制限である。この制限を克服するために、ナノ流体と呼ばれる新しい種類の熱移動流体が開発されている。このようなナノ流体は、典型的には、相当量のナノ粒子が液体(例えば、水、オイルまたはエチレングリコールなど)に懸濁される液体組成物である。得られるナノ流体は、分散されたナノ粒子を含まない液体と比較して、極めて大きい熱伝導性を有する。
粒子を含有する分散物の効果的な熱伝導性の数多くの理論的研究および実験的研究が、マックスウエルの理論的成果が100年以上前に発表されてからこれまで行われてきている。しかしながら、懸濁物の熱伝導性の以前の研究はすべて、ミリメートルサイズの粒子またはミクロンサイズの粒子を含有する懸濁物に限られている。マックスウエルのモデルは、球状粒子を含有する懸濁物の効果的な熱伝導性が固体粒子の体積割合とともに増大することを示している。懸濁物の熱伝導性が粒子の表面積対体積の比率とともに増大することもまた知られている。表面積対体積の比率は、10nmの直径を有する粒子については、10mmの直径を有する粒子の場合よりも1000倍大きいので、大きい粒子の粒子形状を変化させることによって得ることができるよりもはるかにより大きい、効果的な熱伝導性での劇的な改善が、溶液中の粒子サイズを小さくすることの結果として期待される。
従来、ナノ粒子は、アーク放電、レーザーエバポレーション、熱分解プロセス、プラズマの使用、ゾル・ゲルの使用などを適用することによって分子レベルから合成される。広く使用されているナノ粒子はフラーレンカーボンナノチューブであり、これは、約1μm未満の直径を有する物体として広く定義される。そのような用語のより狭い意味では、軸と実質的に平行する炭素の炭素六角形の網状シートを有する物質がカーボンナノチューブと呼ばれ、また、非晶質炭素がカーボンナノチューブを取り囲んでいる物質もまた、カーボンナノチューブのカテゴリーに含まれる。
誘電性コアと、導電性シェル層とを有するナノ粒子であるナノシェルもまた、この分野では知られている。カーボンナノチューブと同様に、ナノシェルもまた、例えば、金属の原子を誘電性基板上に結合することによって、分子レベルから製造される。ナノシェルは、上述の光学場強化現象を利用することが所望される適用において特に有用である。しかしながら、ナノシェルは、近赤外波長の適用の場合にだけ有用であることが知られている。
分子レベルから製造されたナノ粒子は、さらなる処理が製造プロセスにおいて伴わない限り、全体を特徴づける物理的特性を失い易いことが認められている。ナノ粒子が既に要求されている潜在的な適用の上記の非網羅的列挙から理解され得るように、ナノ粒子を製造するときに考慮しなければならない物理的特性は非常に多様である。特に、より大きいミクロサイズの粒子の物理的性質を保持するナノ粒子はこの上なく重要である。
本発明が使用される多様な分野には、分子生物学に基づく研究および診断の分野が含まれる。
この10年以上にわたって、生物学的研究および遺伝学的研究は、生命の分子的基礎を理解することに大変革をもたらしているので、遺伝子の時間的および空間的な発現が生命プロセスのすべてを担っていることがますます明らかになっている。科学は、1つの遺伝的欠陥が、従来から認識されている遺伝性障害をどのように引き起こしているかを理解することから、多数の遺伝的欠陥の相互作用の重要性をより複雑な障害の環境的要因とともに認識することに進歩している。
この理解は、核酸増幅技術の助けをかりて可能になっている。特に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、遺伝的障害の診断、臨床サンプルにおける病原性生物の核酸配列の検出、法廷サンプルの遺伝子同定、活性化されたガン遺伝子および他の遺伝子における変異の分析などをはじめとする様々な分野で広範囲にわたる適用が見出されている。加えて、PCR増幅は、DNAの分子クローニングおよび分析における様々な課題を行うために使用されている。これらの課題には、クローニングまたはプローブとして使用するための特定のDNA配列の作製、遺伝子マッピングのためのDNAセグメントの検出、cDNAの特定のセグメントを増幅することによる発現配列の検出および分析、少量のmRNAからのcDNAライブラリーの作製、配列決定のための多量のDNAの作製、変異の分析、ならびに、染色体クローリングのためであることが含まれる。PCRは、他の核酸増幅技術と同様に、分子生物学の多くの他の局面でのますます増大する適用が見出されることが予想される。
広く知られているように、DNA鎖は、それらの塩基(アデニン、チミン、シトシンおよびグアニン、これらはそれぞれ、A、T、C、Gとして表される)によって決定されるように、4つの異なるヌクレオチドから構成される。DNA鎖のそれぞれは、AがTと対形成し、かつ、CがGと対形成する相同的な鎖と一致する。タンパク質をコードする特定の塩基配列が遺伝子と呼ばれる。DNAは、多くの場合、タンパク質組成を担う領域(エキソン)と、タンパク質組成に直接には寄与しない領域(イントロン)とにセグメント化されている。
PCR(これは米国特許第4683195号に一般的に記載される)は、既知配列の2つの領域の間に存在する標的DNAフラグメントのインビトロ増幅を可能にする。二本鎖の標的DNAは、DNA鎖を引き離すために最初に融解され、その後、オリゴヌクレオチドがテンプレートDNAにアニーリングさせられる。プライマーは、相補的であり、従って、所望の標的フラグメントの5’境界および3’境界において所望される、事前に選択された位置に特異的に結合するような方法で選ばれる。
オリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼ酵素をプライマー伸張として知られているプロセスにおいて使用して新しい相補的なDNA鎖を合成するためのプライマーとして役立つ。プライマーの相互に対する向きは、各プライマーからの、5’から3’への伸張生成物が、十分に遠方にまで伸張したとき、もう一方のオリゴヌクレオチドに対して相補的である配列を含有するようにされる。従って、それぞれの新しく合成されたDNA鎖が、もう一方のオリゴヌクレオチドをそのプライマーとして用いて始まる別のDNA鎖を合成するためのテンプレートになる。(i)融解、(ii)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、および(iii)プライマー伸張からなるサイクルを多数回繰り返すことができ、これにより、プライマー間の標的フラグメントの指数的増幅がもたらされる。
先行技術のPCR技術では、反応を、DNAポリメラーゼの補因子を含有する反応緩衝液において行わなければならない。DNAポリメラーゼの補因子は、酵素が活性のために依存する非タンパク質性の化合物である。補因子が存在しない場合、酵素は触媒的に不活性である。知られている補因子には、マンガンまたはマグネシウムを、二価カチオンが水溶液中に放出されるような形態で含有する化合物が含まれる。典型的には、これらの補因子はマンガン塩またはマグネシウム塩(例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩など)の形態である。
低濃度の補因子を伴う緩衝液の使用は、誤ったプライマー化作用および非標的配列の増幅をもたらす。逆に、高すぎる濃度はプライマーのアニーリングを低下させ、非効率的なDNA増幅をもたらす。加えて、熱に安定なDNAポリメラーゼ(例えば、Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼなど)はマグネシウム依存性である。従って、マグネシウムイオンの精密な濃度が、ポリメラーゼの効率および反応の特異性をともに最大にするために必要である。
長年にわたって、多くの試みが、PCRを、とりわけ、プライマーの長さおよび配列、アニーリング温度、増幅物の長さ、緩衝液の組成、反応補充物などを適正に選択することによって最適化するために行われている。PCRの効率を決定する変数の数は極めて大きいので、プロセスに関係する成分のすべてについて最適な1組のパラメーターを見つけることは極めて困難である。
下記の節でさらに詳述されるように、核酸増幅技術の効率を、ナノ構造をその中に取り込む液体組成物の助けを借りて著しく改善することができる。
本発明の1つの態様によれば、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含むナノ構造が提供され、この場合、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
本発明の別の態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物が提供される。液体組成物は、好ましくは、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられる。
本発明の別の態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、水と比較して、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる液体組成物が提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
本発明の別の態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、ナノ構造がヒドロキシアパタイトから配合され、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある液体組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、水と比較して高まった緩衝能力によって特徴づけられる液体組成物が提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
本発明の別の態様によれば、物質を溶解または分散する方法であって、物質を、該物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む方法が提供され、ナノ構造は、該液体の整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、物質は、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物からなる群から選択される。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、物質は医薬用薬剤である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、医薬用薬剤は、治療剤、化粧剤または診断剤である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、組成物は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、接触の前に、溶媒に薬剤を溶解または分散することを含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、接触の後で、溶媒に薬剤を溶解または分散することを含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は極性溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は非極性溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は有機溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、有機溶媒はエタノールまたはアセトンである。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、溶媒は非有機溶媒である。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法はさらに、溶解または分散の後で溶媒を蒸発させることを含む。
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、蒸発を熱または圧力によって行う。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、液体組成物が最初に表面と接触し、その後、所定の洗浄プロトコルによって洗浄されるとき、組成物の電気化学的形跡が表面に保たれるように設計される。
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、細菌コロニー拡大速度の増大を容易にする液体組成物が提供される。
本発明のなお別の態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ファージ−細菌またはウイルス−細胞の相互作用の増大を容易にする液体組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、液体自体のゼータ電位よりも実質的に大きいゼータ電位によって特徴づけられる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、ナノ構造のそれぞれが、液体の比重よりも小さい比重、または、液体の比重と等しい比重を有する液体組成物が提供される。
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ナノ構造は、液体組成物が着色溶液と混合されたとき、着色溶液のスペクトル特性が実質的に変化するように設計される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、液体組成物が着色溶液と混合されたとき、着色溶液のスペクトル特性が実質的に変化するようにナノ構造が設計される液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、高分子が固相マトリックスに結合することを高める液体組成物が提供される。
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、固相マトリックスは親水性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固相マトリックスは疎水性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固相マトリックスは疎水性領域および親水性領域を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子は抗体である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子は少なくとも1つの炭水化物親水性領域を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子は少なくとも1つの炭水化物疎水性領域を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子はレクチンである。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子はDNA分子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、高分子はRNA分子である。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、DNA分子を少なくとも部分的に解きほぐすことができる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、それにより、それぞれのナノ構造が、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および、整列した流体分子のエンベロープが定常的な物理的状態にある、生体材料への細菌接着を変化させることができる液体組成物が提供される。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の組成物は生体材料に対するその付着を低下させる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生体材料は、プラスチック、ポリエステルおよびセメントからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生体材料は、手術により対象に埋め込むために好適である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細菌の付着は表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)の付着である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、表皮ブドウ球菌の付着は、表皮ブドウ球菌RP62Aの付着、表皮ブドウ球菌M7の付着、および、表皮ブドウ球菌(API−6706112)の付着からなる群から選択される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、酵素活性を安定化させることができる液体組成物が提供される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、酵素活性は非結合型酵素の活性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素活性は結合型酵素の活性である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素活性は、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素の活性である。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、樹脂に対する核酸の親和性結合を改善することができ、また、ゲル電気泳動分離を改善することができる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、カラムの容量を増大させることができる液体組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含み、核酸増幅プロセスの効率を改善することができる液体組成物が提供される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、核酸増幅プロセスはポリメラーゼ連鎖反応である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はリアルタイプポリメラーゼ連鎖反応である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は、前記ポリメラーゼ連鎖反応のDNAポリメラーゼの触媒活性を高めることができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はマグネシウムを含まない。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はマンガンを含まない。
本発明のなおさらなる態様によれば、ポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供され、このキットは、別個の包装において、(a)熱に安定なDNAポリメラーゼ、および(b)本明細書中に記載されるような液体と、ナノ構造とを含む液体組成物を含む。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも1つのdNTPを含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも1つのコントロールテンプレートDNAを含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも1つのコントロールプライマーを含む。
本発明のなおさらなる態様によれば、(a)熱安定性DNAポリメラーゼと、(b)二本鎖DNA検出分子と、(c)本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含む、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供される。
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、二本鎖DNA検出分子は、二本鎖DNAにインターカレーションする検出分子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、二本鎖DNA検出分子は、臭化エチジウム、YO−PRO−1、Hoechst33258、SYBR GoldおよびSYBR GreenIからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、二本鎖DNA検出分子は、プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子は、フルオレセイン、FAM、JOE、HEX、TET、Alexa Fluor594、ROX、TAMRA、ローダミンおよびBODIPY−FIからなる群から選択される。
本発明のなおさらなる態様によれば、DNA配列を増幅する方法であって、(a)本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を有する液体組成物を提供すること、および(b)液体組成物の存在下、DNA配列に対する複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行し、それにより、DNA配列を増幅することを含む方法が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書中に記載されるような液体およびナノ構造を有する液体組成物であって、少なくとも1つの高分子の操作を固体支持体の存在下で可能にすることができる液体組成物が提供される。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、高分子はポリヌクレオチドである。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、固体支持体はガラスビーズを含む。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ガラスビーズは直径が約80ミクロン〜150ミクロンの間である。
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、操作は化学反応によって達成される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化学反応は、増幅反応、連結反応、形質転換反応、転写反応、逆転写反応、制限消化およびトランスフェクション反応からなる群から選択される。
本発明のさらに別の態様によれば、液体と、ビーズと、ナノ構造とを含み、ビーズの存在下での少なくとも1つの高分子の操作を可能にすることができる液体組成物が提供され、それにより、それぞれのナノ構造が、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、この場合、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部はガス状状態にある。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は少なくとも1つのさらなるナノ構造とクラスター形成することができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、少なくとも1つのさらなるナノ構造との遠距離の相互作用を維持することができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部は液体の分子と同一である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造の濃度は1リットルあたり1020個未満のナノ構造であり、より好ましくは、1リットルあたり1015個未満のナノ構造である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はその間での遠距離の相互作用を維持することができる。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コア材料は、強誘電性コア材料、強磁性コア材料および圧電性コア材料からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、コア材料は結晶性コア材料である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、液体は水である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は、組成物と固体表面との間での接触角が、液体と固体表面との間での接触角よりも小さいように設計される。
本発明のさらなる態様によれば、液体組成物を固体粉末から製造する方法が提供され、この場合、この方法は、(a)固体粉末を加熱し、それにより、加熱された固体粉末を提供すること、(b)加熱された固体粉末を冷液体に浸すこと、および(c)工程(b)と実質的には同時に、冷液体および加熱された固体粉末を電磁放射線によって照射することを含み、電磁放射線が、ナノ構造が固体粉末の粒子から形成されるように選択された振動数によって特徴づけられる。
本発明のさらなる態様によれば、液体組成物をヒドロキシアパタイトから製造する方法が提供され、この場合、この方法は、(a)ヒドロキシアパタイトを加熱し、それにより、加熱されたヒドロキシアパタイトを提供すること、(b)加熱されたヒドロキシアパタイトを冷液体に浸すこと、および(c)工程(b)と実質的には同時に、冷液体および加熱されたヒドロキシアパタイトを電磁放射線によって照射することを含み、電磁放射線が、ナノ構造がヒドロキシアパタイトの粒子から形成されるように選択された振動数によって特徴づけられる。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ナノ構造はヒドロキシアパタイトから配合される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ヒドロキシアパタイトはミクロサイズの粒子を含む。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、固体粉末はミクロサイズの粒子を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ミクロサイズの粒子は結晶性粒子である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造は結晶性のナノ構造である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固体粉末は、強誘電性物質および強磁性物質からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固体粉末は、BaTiO3、WO3およびBa2F9O12からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、固体粉末は、鉱物、セラミック物質、ガラス、金属および合成ポリマーからなる群から選択される物質を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電磁放射線は高周波範囲である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電磁放射線は連続波の電磁放射線である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電磁放射線は変調電磁放射線である。
本発明は、数多くの特徴的な物理的特性、化学的特性および生物学的特性によって特徴づけられるナノ構造、および、そのようなナノ構造を有する液体組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図1は本発明の好ましい実施形態によるナノ構造の概略図である。
図2aは本発明の好ましい実施形態による、液体組成物を製造する方法の流れ図である。
図2bは本発明の好ましい実施形態による、DNA配列を増幅する方法の流れ図である。
図3は本発明のナノ構造のTEM画像である(図3a〜図3e)。
図4は本発明の液体組成物に対する色素の影響を示す。
図5a〜図5bは液体組成物に対する高g遠心分離の影響を示し、図5はチューブの下部部分の記録されたシグナルを示し、図5bはチューブの上部部分の記録されたシグナルを示す。
図6は本発明の液体組成物について行われたpH試験の結果を示す(図6a〜図6c)。
図7は本発明の液体組成物の吸収スペクトルを示す。
図8は本発明の液体組成物のζ電位測定の結果を示す。
図9は本発明の液体組成物の存在下(左側)およびコントロール媒体の存在下(右側)でのバクテリオファージ反応を示す(図9a〜図9b)。
図10はコントロール液体および本発明の液体組成物の溶菌表面積の比較を示す。
図11は本発明の液体組成物の存在下(左側)およびコントロール媒体の存在下(右側)での100の日常的試験希釈でのファージ型決定濃度を示す。
図12は発明の液体組成物およびコントロール媒体の、時間を関数とする光学的濃度を示す。
図13はマイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられた実験における粘着物産生性の表皮ブドウ球菌の光学的濃度を示す(図13a〜図13c)。
図14は異なるマイクロタイタープレートに対する粘着物付着の15回の反復実験を表すヒストグラムである。
図15は同じマイクロタイタープレートにおける本発明の液体組成物およびコントロールに対する粘着物付着の違いを示す。
図16は電気化学的析出実験設定を示す(図16a〜図16c)。
図17は本発明の液体組成物(図17a)およびコントロール(図17b)の電気化学的析出を示す。
図18は本発明の液体組成物と30分の期間にわたって接触していたセルにおける逆浸透(RO)水の電気化学的析出を示す。
図19は本発明の液体組成物(図19a)およびコントロール媒体(図19b)についての枯草菌コロニー成長の結果を示す。
図20は原料粉末を伴う水(図20a)、逆浸透水(図20b)および本発明の液体組成物(図20c)についての枯草菌コロニー成長の結果を示す。
図21は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のcostarマイクロ滴定プレート(図21a)、non−sorpマイクロ滴定プレート(図21b)、maxisorpマイクロ滴定プレート(図21c)およびpolysorpマイクロ滴定プレート(図21d)に対する標識抗体および非標識抗体の結合を示す。
図22は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のcostarマイクロ滴定プレート(図22a)、non−sorpマイクロ滴定プレート(図22b)、maxisorpマイクロ滴定プレート(図22c)およびpolysorpマイクロ滴定プレート(図22d)に対する標識抗体の結合を示す。
図23は本発明の液体組成物を使用し、また、緩衝液を使用したときの、non−sorpマイクロ滴定プレート(図23a)、中程度のcostarマイクロ滴定プレート(図23b)、polysorpマイクロ滴定プレート(図23c)およびmaxisorpマイクロ滴定プレート(図23d)に対する、4℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体の結合を示す。
図24は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、non−sorpマイクロ滴定プレート(図24a)、中程度のcostarマイクロ滴定プレート(図24b)、polysorpマイクロ滴定プレート(図24c)およびmaxisorpマイクロ滴定プレート(図24d)に対する、37℃で2時間のポストインキュベーションでの標識抗体の結合を示す。
図25は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のcostarマイクロ滴定プレート(図25a)、polysorpマイクロ滴定プレート(図25b)、maxisorpマイクロ滴定プレート(図25c)およびnon−sorpマイクロ滴定プレート(図25d)に対する、4℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。
図26は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のcostarマイクロ滴定プレート(図26a)、polysorpマイクロ滴定プレート(図26b)、maxisorpマイクロ滴定プレート(図26c)およびnon−sorpマイクロ滴定プレート(図26d)に対する、室温で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合を示す。
図27a〜図27bは、本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液について、リン酸塩洗浄緩衝液を使用したときの、標識抗体および非標識抗体の結合結果(図27a)と、標識抗体のみの結合結果(図27b)とを示す。
図27c〜図27dは、本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液について、PBS洗浄緩衝液を使用したときの、標識抗体および非標識抗体の結合結果(図27c)と、標識抗体のみの結合結果(図27d)とを示す。
図28は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、中程度のcostarマイクロ滴定プレートに対する、4℃で一晩のインキュベーションの後での標識抗体および非標識抗体の結合結果(図28a)と、標識抗体のみの結合結果(図28b)とを示す。
図29は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、酢酸塩緩衝液(図29a)、炭酸塩緩衝液(図29b)およびリン酸塩緩衝液(図29c)についてのnon−sorpマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示す。
図30は本発明の液体組成物またはコントロール緩衝液を使用したときの、炭酸塩緩衝液(図30a〜図30b)、酢酸塩緩衝液(図30c)およびリン酸塩緩衝液(図30d)についてのmaxisorpマイクロ滴定プレートに対する標識レクチンの結合を示し、図30bに示されるグラフは、図30aに示されるグラフの直線部分である。
図31a〜図31bは核酸について本発明の液体組成物の平均結合強化能を示す。
図32〜図35bは異なる緩衝液組合せおよび異なる溶出工程について精製前および精製後のPCR生成物サンプルの画像である。
図36〜図37は異なる量、濃度および溶出工程でカラムを通過したPCR生成物の画像(図36)および定量分析(図37)である。
図38a〜図38cは3つの溶出工程で、図36に示されるカラム5〜17を通過したPCR生成物カラムの画像である。
図39aは、図38a〜図38cの3つの溶出工程のそれぞれについて、負荷体積を関数とするコントロール緩衝液(COとして表される)および本発明の液体組成物(LCとして表される)の面積を示す。
図39bは、図38a〜図38cの3つの溶出工程のそれぞれについて、負荷体積を関数とする比率(LC/CO)を示す。
図40a〜図42bはRO水の存在下(図40a、図41aおよび図42a)および本発明の液体組成物の存在下(図40b、図41b、図42b)でのゲル電気泳動実験におけるDNAの移動速度を比較するレーン画像である。
図43a〜図45dは泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である。
図46a〜図48dはゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像である。
図49はアルカリホスファターゼの非結合型形態の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、希釈を関数とする安定性強化パラメーターSeの値を示す。
図50はアルカリホスファターゼの結合型形態の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における希釈を関数とする、RO水および本発明の液体組成物において希釈されたストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼの酵素活性を示す。
図51はβ−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、24時間後(図51a)、48時間後(図51b)、72時間後(図51c)および120時間後(図51d)でのβ−ガラクトシダーゼの安定性を示す。
図52はβ−ガラクトシダーゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験における、24時間後(図52a)、48時間後(図52b)、72時間後(図52c)および120時間後(図52d)での安定性強化パラメーターSeの値を示す。
図53aは乾燥および熱処理の後でのアルカリホスファターゼの残存活性を示す。
図53bは乾燥および熱処理の後でのアルカリホスファターゼの安定性強化パラメーターSeの値を示す。
図54はPCR反応時においてDNAに影響を及ぼすガラスビーズの能力に対する本発明の液体組成物の影響が調べられたゲル電気泳動実験で得られたレーン画像を示す。
図55aは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、Neowater(商標)を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である。
図55bは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、Neowater(商標)を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの解離曲線である。
図56aは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である。
図56bは自動ベースライン決定を伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの解離曲線である。
図57aは0.2の手動バックグラウンドカットオフを伴う、希釈が、Neowater(商標)を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である。
図57bは0.2の手動バックグラウンドカットオフを伴う、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である。
図58aは外れ値をそれぞれのセットから一致して除いた後での、希釈が、Neowater(商標)を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である(手動バックグラウンドカットオフ=0.2)。
図58bは外れ値をそれぞれのセットから一致して除いた後での、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である(手動バックグラウンドカットオフ=0.2)。
図59aは外れ値をそれぞれのセットから個々に除いた後での、希釈が、Neowater(商標)を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの標準曲線である(手動バックグラウンドカットオフ=0.2)。
図59bは外れ値をそれぞれのセットから一致して個々に除いた後での、希釈が、水を使用して行われたリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの増幅プロットである(手動バックグラウンドカットオフ=0.2)。
図60aは反応がNeowater(商標)の存在下で行われるときのバックグラウンドノイズを明らかにするリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの増幅プロットである(反応変化=特定の生成物の蛍光放出−ベースライン読み取り)。
図60bは反応が水の存在下で行われるときのバックグラウンドノイズを明らかにするリアルタイムPCR分析を受けるcDNAサンプルの反応変化対サイクルの曲線である。
図61aはNeowater(商標)の存在下での5μlの反応体積で行われた3回のリアルタイムPCR反応の増幅プロットである。
図61bはNeowater(商標)の存在下での10μlの反応体積で行われた3回のリアルタイムPCR反応の増幅プロットである。
図61cはNeowater(商標)の存在下での15μlの反応体積で行われた3回のリアルタイムPCR反応の増幅プロットである。
図62aは水の存在下での5μlの反応体積で行われた3回のリアルタイムPCR反応の増幅プロットである。
図62bは水の存在下での10μlの反応体積で行われた3回のリアルタイムPCR反応の増幅プロットである。
図62cは水の存在下での15μlの反応体積で行われた3回のリアルタイムPCR反応の増幅プロットである。
図63は観測時間の関数としての、本発明の液体組成物における絶対値の超音波速度の等温測定の結果を示す。
図64a〜dは本発明の液体組成物の存在下におけるDNAチップに対するRNAの増強されたハイブリダイゼーションを示す写真である。図64aおよび図64bは、10秒間の暴露の後におけるDNAチップに対するハイブリダイゼーションを示す。図64cおよび図64dは、2秒間の暴露の後におけるDNAチップに対するハイブリダイゼーションを示す。図64aおよび図64cは、本発明の液体組成物の不在下におけるDNAチップに対するハイブリダイゼーションを示す。図64bおよび図64dは、本発明の液体組成物の存在下におけるDNAチップに対するハイブリダイゼーションを示す。
図65は557nmでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
図66A〜CはpHによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、RO水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
図67A〜CはpHによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、RO水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは3つの三連での実験をまとめる。
図68A〜CはpHによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、RO水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
図69はpHによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、RO水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは3つの三連での実験をまとめる。
図70A〜Cは557nmでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、RO水の塩酸滴定(図70A)および水酸化ナトリウム滴定(図70B〜図70C)を例示するグラフである。
図71A〜BはROの塩酸滴定の後でのキュベットの写真(図71A)、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真(図71B)である。それぞれのキュベットは1μlの塩酸の添加を例示する。
図72A〜CはRF水の塩酸滴定を例示するグラフ(図72A)、RF2水の塩酸滴定を例示するグラフ(図72B)、および、RO水の塩酸滴定を例示するグラフ(図72C)である。矢印は2回目の照射を示す。
図73はRO水と比較したときの、FR2水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を3回繰り返した。3回の実験のすべてについての平均値がRO水についてプロットされた。
図74A〜Jは粉末の分散を3回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびNeowater(商標)を含む溶液の写真である。図74A〜図74Eは、実施例24のパートCからの、右側:試験チューブC(50%EtOH+Neowater(商標))、および、左側:試験チューブB(脱水されたNeowater(商標))を例示する。図74G〜図74Jは、赤色粉末の一晩の破砕、および、100μlのNeowater(商標)の滴定の後での溶液を例示する。
図75A〜Cはナノドロップで測定されたときの、3つの異なる溶液からの2μlの吸光度の読み取りである。図75Aは、一晩の粉砕の後での赤色粉末+100μlのNeowaterの溶液を表す。図75Bは、100%の脱水されたNeowater(商標)を加えた後での赤色粉末の溶液を表し、図75Cは、EtOH+Neowater(商標)(50%−50%)を加えた後での赤色粉末の溶液を表す。
図76はバイアル#1(CD−Dau+Neowater(商標))、バイアル#4(CD−Dau+10%PEG/Neowater(商標))およびバイアル#5(CD−Dau+50%アセトン+50%Neowater(商標))の分光光度計測定のグラフである。
図77はNeowater(商標)における溶解物(青色線)、および、微量の溶媒(アセトン)を伴う溶解物(ピンク色線)の分光光度計測定のグラフである。
図78はNeowater(商標)における溶解物(青色線)および、アセトンにおける溶解物(ピンク色線)の分光光度計測定のグラフである。淡青色および黄色の線はアセトン蒸発の異なる割合を表し、紫色線はアセトン非含有溶液である。
図79はCD−Dauの200nm〜800nmにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はROにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はNeowater(商標)における溶解物を表す。
図80はt−bocの200nm〜800nmにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はROにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はNeowater(商標)における溶解物を表す。
図81A〜Dは200nm〜800nmにおける分光光度計測定のグラフである。図81Aは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール不在下でのAG−14Bのグラフである。図81Bは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後24時間のエタノール不在下でのAG−14Bのグラフである。図81Cは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール不在下でのAG−14Aのグラフである。図81Dは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後24時間のエタノール不在下でのAG−14Aのグラフである。
図82はエタノール蒸発後24時間でのAG−14AおよびAG14Bの懸濁物の写真である。
図83A〜GはNeowater(商標)に溶解されたペプチドの分光光度計測定のグラフである。図83Aは、Neowater(商標)に溶解されたペプチドXのグラフである。図83Bは、Neowater(商標)に溶解されたX−5FUのグラフである。図83Cは、Neowater(商標)に溶解されたNLS−Eのグラフである。図83Dは、Neowater(商標)に溶解されたPalm−PFPSYK(CMFU)のグラフである。図83Eは、Neowater(商標)に溶解されたPFPSYKLRPG−NH2のグラフである。図83Fは、Neowater(商標)に溶解されたNLS−p2−LHRHのグラフである。図83Gは、Neowater(商標)に溶解されたF−LH−RH−palm kGFPSKのグラフである。
図84A〜Gはクリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Neowater(商標)に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。図84Aは、Neowater(商標)に溶解されたペプチドXの細胞傷害作用のグラフである。図84Bは、Neowater(商標)に溶解されたX−5FUの細胞傷害作用のグラフである。図84Cは、Neowater(商標)に溶解されたNLS−Eの細胞傷害作用のグラフである。図84Dは、Neowater(商標)に溶解されたPalm−PFPSYK(CMFU)の細胞傷害作用のグラフである。図84Eは、Neowater(商標)に溶解されたPFPSYKLRPG−NH2の細胞傷害作用のグラフである。図84Fは、Neowater(商標)に溶解されたNLS−p2−LHRHの細胞傷害作用のグラフである。図84Gは、Neowater(商標)に溶解されたF−LH−RH−palm kGFPSKの細胞傷害作用のグラフである
図85はエタノールおよびNeowater(商標)におけるレチノールの吸光度のグラフである。
図86はろ過後の、エタノールおよびNeowater(商標)におけるレチノールの吸光度のグラフである。
図87A〜Bは試験チューブ(左側はNeowater(商標)および物質「X」を含有し、右側はDMSOおよび物質「X」を含有する)の写真である。図87Aは、24時間放置された試験チューブを例示し、図87Bは、48時間放置された試験チューブを例示する。
図88A〜Cは加熱および振とう処置を行った直後における、物質「X」を溶媒1および溶媒2とともに含有する試験チューブ(図88A)、物質「X」を溶媒3および溶媒4とともに含有する試験チューブ(図88B)、ならびに、物質「X」を溶媒5および溶媒6とともに含有する試験チューブ(図88C)の写真である。
図89A〜Cは加熱および振とう処置を行った後60分における、物質「X」を溶媒1および溶媒2とともに含有する試験チューブ(図89A)、物質「X」を溶媒3および溶媒4とともに含有する試験チューブ(図89B)、ならびに、物質「X」を溶媒5および溶媒6とともに含有する試験チューブ(図89C)の写真である。
図90A〜Cは加熱および振とう処置を行った後120分における、物質「X」を溶媒1および溶媒2とともに含有する試験チューブ(図90A)、物質「X」を溶媒3および溶媒4とともに含有する試験チューブ(図90B)、ならびに、物質「X」を溶媒5および溶媒6とともに含有する試験チューブ(図90C)の写真である。
図91A〜Cは加熱および振とう処置を行った後24時間における、物質「X」を溶媒1および溶媒2とともに含有する試験チューブ(図91A)、物質「X」を溶媒3および溶媒4とともに含有する試験チューブ(図91B)、ならびに、物質「X」を溶媒5および溶媒6とともに含有する試験チューブ(図91C)の写真である。
図92A〜DはNeowater(商標)および低下した濃度のDMSOを含む溶媒に物質「X」を含むガラス製ボトルの振とう直後の写真(図92A)、振とう後30分の写真(図92B)、振とう後60分の写真(図92C)および振とう後120分の写真(図92D)である。
図93は分光光度計によって測定されたときの、ボルテックス後6時間のRO/Neowater(商標)における物質「X」の吸収特徴を例示するグラフである。
図94A〜Bは分光光度計によって測定されたときの、エタノールにおけるSPL2101の吸収特徴を例示するグラフ(図94A)、および、アセトンにおけるSPL5217の吸収特徴を例示するグラフ(図94B)である。
図95A〜Bは分光光度計によって測定されたときの、Neowater(商標)におけるSPL2101の吸収特徴を例示するグラフ(図95A)、および、Neowater(商標)におけるSPL5217の吸収特徴を例示するグラフ(図95B)である。
図96A〜Bは分光光度計によって測定されたときの、Neowater(商標)におけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ(図96A)、および、DMSOにおけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ(図96B)である。
図97は293T細胞に対する異なる溶剤におけるタキソールの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。コントロールRO=RO水により構成される培地;コントロールNeo=Neowater(商標)により構成される培地;コントロールDMSO RO=RO水+10μlのDMSOにより構成される培地;コントロールNeo RO=RO水+10μlのNeowater(商標)により構成される培地;タキソールDMSO RO=RO水と、DMSOに溶解されたタキソールとにより構成される培地;タキソールDMSO Neo=Neowater(商標)と、DMSOに溶解されたタキソールとにより構成される培地;タキソールNW RO=RO水と、Neowater(商標)に溶解されたタキソールとにより構成される培地;タキソールNW Neo=Neowater(商標)と、Neowater(商標)に溶解されたタキソールとにより構成される培地。
図98A〜Bは2つの異なるTaqポリメラーゼを使用する実施例32に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたPCR生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたDNAゲルの写真である。
図99は2つの異なるTaqポリメラーゼを使用する実施例33に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および不在下で得られたPCR生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたDNAゲルの写真である。
図100は熱脱水されたPCRミックスにおけるNeowater(商標)の多重能を例示する写真である。図100Aは、ヒトインスリン遺伝子に対するテンプレートおよびプライマーを伴う脱水されたミックスを例示する。図100Bは、PBFDVのセグメントに対するテンプレートおよびプライマーを伴う脱水されたミックスを例示する。M−1kbマーカー、1−スクロース 150mM Deh_RO;Rehy_RO、2−スクロース 200mM Deh_RO;Rehy_RO、3−スクロース 150mM Deh_RO;Rehy_NW、4−スクロース 200mM Deh_RO;Rehy_NW、5−スクロース 150mM Deh_NW;Rehy_RO、6−スクロース 200mM Deh_NW;Rehy_RO、7−スクロース 150mM Deh_NW;Rehy_RO、8−スクロース 200mM Deh_NW;Rehy_NW。
図101はNeowater(商標)が微小体積PCR(MVP)に関与することができることを例示する写真である。MVPをRO/Neowater(商標)の両方の塩基ミックスに対して行った。ミックスを10個のチューブに等分し、PCRを行った。
図102A〜Cはsyber green(SG)により検出される、Neowater(商標)におけるβ−アクチン増幅の増幅プロット(図102A)、解離プロット(図102B)および標準プロット(図102C)である。青色:50ngのゲノムDNA;赤色:5ngのゲノムDNA;緑色:0.5ngのゲノムDNA、黒色:NTC。
図103A〜Cはsyber green(SG)により検出される、Neowater(商標)におけるPD−X増幅の増幅プロット(図103A)、解離プロット(図103B)および標準プロット(図103C)である。青色:50ngのゲノムDNA;赤色:5ngのゲノムDNA;緑色:0.5ngのゲノムDNA、黒色:NTC。
図104はヒドロキシアパタイト(HA)型Neowater(商標)(HA−18)スラリー内の溶質としてのZnSO4からのZnの電気化学的析出ECDのデジタル顕微鏡写真である。
図105A〜HはHA(HA−18)供給源粉末から得られた高倍率によるHRSEM顕微鏡写真である。
図106A〜HはSiウエハ上に存在するHA型Neowater(商標)(HA−18)から得られたHRSEM顕微鏡写真である。
図107A〜Hは銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッド上に存在するHA型Neowater(商標)(HA−18)から得られたTEM顕微鏡写真である。
図108はHA型Neowater(商標)(AB1−22−1)スラリー内の溶質としてのZnSO4からのZnの電気化学的析出ECDのデジタル顕微鏡写真である。これはNeowater(商標)のQCである。
図109A〜HはHA(AB1−22−1)供給源粉末から得られた高倍率によるHRSEM顕微鏡写真である。
図110A〜HはSiウエハ上に存在するHA型Neowater(商標)(AB1−22−1)から得られたHRSEM顕微鏡写真である。
図111A〜Hは銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッド上に存在するHA型Neowater(商標)(AB1−22−1)から得られたTEM顕微鏡写真である。
図112はHA型Neowater(商標)(AA99−X)スラリー内の溶質としてのZnSO4からのZnの電気化学的析出ECDのデジタル顕微鏡写真である。これはNeowater(商標)のQCである。
図113A〜HはHA(AA99−X)供給源粉末から得られた高倍率によるHRSEM顕微鏡写真である。
図114A〜HはSiウエハ上に存在するHA型Neowater(商標)(AA99−X)から得られたHRSEM顕微鏡写真である。
図115A〜Hは銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッド上に存在するHA型Neowater(商標)(AA99−X)から得られたTEM顕微鏡写真である。
図116はHA型Neowater(商標)(AB1−2−3)スラリー内の溶質としてのZnSO4からのZnの電気化学的析出ECDのデジタル顕微鏡写真である。これはNeowater(商標)のQCである。
図117A〜HはHA(AB1−2−3)供給源粉末から得られた高倍率によるHRSEM顕微鏡写真である。
図118A〜HはSiウエハ上に存在するHA型Neowater(商標)(AB1−2−3)から得られたHRSEM顕微鏡写真である。
図119A〜Hは銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッド上に存在するHA型Neowater(商標)(AB1−2−3)から得られたTEM顕微鏡写真である。
図120はHA型Neowater(商標)(HAP)スラリー内の溶質としてのZnSO4からのZnの電気化学的析出ECDのデジタル顕微鏡写真である。これはNeowater(商標)のQCである。
図121A〜HはHA(HAP)供給源粉末から得られた高倍率によるHRSEM顕微鏡写真である。
図122A〜HはSiウエハ上に存在するHA型Neowater(商標)(HAP)から得られたHRSEM顕微鏡写真である。
図123A〜Hは、銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッド上に存在するHA型Neowater(商標)(HAP)から得られたTEM顕微鏡写真である。
図124はBaTiO3型Neowater(商標)(HAP)スラリー内の溶質としてのZnSO4からのZnの電気化学的析出ECDのデジタル顕微鏡写真である。これはNeowater(商標)のQCである。
図125A〜JはBaTiO3供給源粉末から得られた高倍率によるHRSEM顕微鏡写真である。
図126A〜HはSiウエハ上に存在するBaTiO3型Neowater(商標)から得られたHRSEM顕微鏡写真である。
図127A〜Fは銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッド上に存在するBaTiO3型Neowater(商標)から得られたTEM顕微鏡写真である。
本発明は、ナノ構造、ならびに、このナノ構造を有し、かつ、多数の特徴的な物理的特性、化学的特性および生物学的特性によって特徴づけられる液体組成物に関連する。本発明の液体組成物は、多くの生物学的適用および化学的適用のために使用することができ、例えば、限定されないが、細菌コロニー成長、電気化学的析出、核酸増幅、および溶媒などのために使用することができる。
本発明によるナノ構造および液体組成物の原理は、図面および付随する記載を参照してより良く理解することができる。
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、図面において例示される構築の細部および構成成分の配置に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
次に図面を参照して、図1は、整列した流体分子のエンベロープ14によって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料12を含むナノ構造10を例示する。コア材料12およびエンベロープ14は定常的な物理的状態にある。
本明細書中で使用される表現「定常的な物理的状態」は、物体または分子が、少なくとも局所的な最小値を有する何らかのポテンシャルによって結びついている状況を示す。そのようなポテンシャルについての代表的な例には、限定されないが、ファンデルワールスポテンシャル、湯川ポテンシャルおよびレナード・ジョーンズポテンシャルなどが含まれる。他の形態のポテンシャルもまた意図される。
本明細書中で使用される表現「整列した流体分子」は、流体分子間の相関を有する流体分子の組織化された配置を示す。
本明細書中で使用される用語「約」は±10%を示す。
本発明の好ましい実施形態によれば、エンベロープ14の流体分子は液体状態またはガス状状態のいずれかであり得る。下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように(実施例3を参照のこと)、エンベロープ14がガス状物質を含むとき、ナノ構造は、十分なg力にさらされたとき、浮遊することができる。
コア材料12は特定のタイプまたはファミリーの物質に限定されず、ナノ構造が設計される適用に従って選択することができる。代表的な例には、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質が含まれる。下記の実施例の節において明らかにされるように(実施例1を参照のこと)、コア材料12はまた、結晶性構造を有することができる。
強誘電性物質は、電場を加えることによって逆転または再配向させることができる永続的な電気的分極をある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって可逆的である永続的な磁化を維持する物質である。本発明の好ましい実施形態によれば、コア材料12が強誘電性または強磁性であるとき、ナノ構造10はその強誘電性または強磁性の性質を保持する。従って、ナノ構造10は、マクロスケールでの物理的性質がナノスケールの環境に持ち込まれる際立った特徴を有する。
本発明の好ましい実施形態によれば、ナノ構造10は、少なくとも1つのナノ構造とクラスター形成することができる。より具体的には、ある濃度のナノ構造10が液体(例えば、水)において混合されたとき、数個のナノ構造の間における引き合う静電気力により、それらの間での付着が、ナノ構造のクラスターを形成するように生じ得る。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成を妨げるときでさえ、ナノ構造10は、そのような他のナノ構造との長距離の相互作用(約0.5μm〜10μm)を維持することができる。液体において存在するナノ構造間の遠距離の相互作用は液体に対して特異な特性を誘導し、そのような特性は、多くの適用において、例えば、限定されないが、生物学的アッセイおよび化学的アッセイにおいて利用することができる。
ナノ構造10の特異な性質は、例えば、「トップダウン」プロセスを使用してナノ構造10を製造することによって達成することができる。より具体的には、ナノ構造10を、ナノメートルサイズの粒子をもたらすために制御された様式で破砕されるミクロサイズの粒子(例えば、直径が約1μmを超えるか、または約10μmを超える)の原料粉末から製造することができる。典型的には、そのようなプロセスは、高温の原料粉末が電磁高周波(RF)放射線の条件のもとで入れられる冷液体(好ましくは、絶対的ではないが、水)において行われる。
製造プロセスをより詳しく記載する前に、言及されたように好ましい液体である水の物理的性質が下記に概説される。
従って、水は、注目すべき物質の1つであり、そのため、これまで非常によく研究されている。水は、1個の酸素原子に結合した2個の水素原子からなる非常に単純な分子であると考えられるが、複雑な性質を有する。水は、水素結合に起因する特別な性質を数多く有している(例えば、大きい表面張力、大きい粘度、および、六角形、五角形または十二面体の整列した水配列を自身で、または他の物質のまわりで形成することができることなど)。
水の融点は、類似する分子量を有する他の分子を検討したとき、予想されるよりも100K以上も高い。水の六角形型の氷相(氷および雪の通常的な形態)において、すべての水分子が4つの水素結合(ドナーとしての2つおよびアクセプターとしての2つ)に関係しており、比較的静的に保持される。液体の水では、一部の水素結合が、分子が動き回ることを可能にするために破壊されるにちがいない。これらの結合を破壊するために要求される大きなエネルギーが融解プロセス時に供給されなければならず、比較的小さい量のエネルギーのみが体積の変化から取り戻されるだけである。自由エネルギーの変化は融点においてゼロでなければならない。温度が上昇すると、液体の水における水素結合の量が減少し、そのエントロピーが増大する。融解は、結合の破壊のために要求されるエネルギーを提供するための十分なエントロピー変化が存在するときに生じるだけである。液体の水の低いエントロピー(大きい組織化)はこの融点を高くさせる。
水の性質のほとんどは、水素の原子が(1つの酸素原子とは対照的に)2つの酸素原子にかなり強い力によって引き寄せられるときに生じる上記の水素結合のためであり、その結果、そのような水素結合は、これら2つの原子の間での束縛として作用していると見なすことができる。
水は大きい密度を有しており、その密度は、3.984℃の温度で存在する局所的な最大値にまで温度とともに増大する。この現象は水の密度異常性として知られている。液体の水の大きい密度は主に、水素結合した網目構造の結合性に起因する。これは自由体積を減少させ、比較的大きい密度を確実にし、これにより、水素結合した網目構造の部分的な空所性が補われる。水の異常な温度−密度挙動は、種々の程度の十二面体型のしわ形成を伴う全体的または部分的に形成されたクラスターの内部における様々な環境の範囲を利用して説明することができる。
密度最大値(およびモル体積最小値)が、密度を増大させる構造的崩壊と、密度を低下させる熱膨張との両方を引き起こす、上昇する温度の対抗する作用によってもたらされる。より低い温度では、膨張した構造の濃度がより大きくなり、これに対して、より高い温度では、崩壊した構造およびフラグメントの濃度がより大きくなり、しかし、それらが占める体積が温度ともに大きくなる。温度が上昇するときの、膨張した構造から崩壊した構造への変化には、あまり整列していない構造およびより大きい水素結合屈曲にそれぞれ起因するエントロピーおよびエンタルピーにおいて正の変化が伴う。
一般に、水の水素結合は広範囲にわたる網目構造をもたらし、これにより、無数の六角形型、五角形型または十二面体型の水配列を形成することができる。水素結合した網目構造は大きな程度の秩序を有する。加えて、温度依存的な競合が、水素結合の秩序化作用と、無秩序化する速度論的作用との間に存在する。
知られているように、水分子は、整列した構造および超構造を形成することができる。例えば、整列した水の殻が様々な生体分子(例えば、タンパク質および炭水化物など)の周りに形成される。これらの生体分子の周りにおけるこのような整列した水の環境は、例えば、受容体から細胞核へのシグナル伝達をはじめとする細胞内機能に関して生物学的機能に強く関与している。加えて、このような水構造は安定であり、分子の表面を保護することができる。
液状化した水の整列した構造のほとんどが短距離のスケールである(典型的には約1nm)。長距離の秩序が、水がその液相で存在するときには原理的に存在し得るが、液体状態における水は絶えず熱運動しているので、そのような長距離の秩序は、自然に生じる確率が極めて低い。水素結合による相互作用および水素結合によらない相互作用のために、水分子は、特定かつ構造化されたクラスター形成を伴う無限の水素結合した網目構造を形成することができる。従って、水分子の小さいクラスターは、他のより小さいクラスターとさらにクラスター形成して、数百の水分子からなる二十面体の水クラスターを形成することができる水の八量体を形成することができる。従って、水分子は様々な整列した構造を形成することができる。
水の他の性質には、高い沸点、高い臨界点、圧力による融点の低下(圧力異常性)、および、温度の上昇とともに低下し、約46℃で最小値にまで低下する圧縮率などが含まれる。
水のこのような様々な特異な性質が、ナノ構造10を製造するために本発明の発明者によって利用されている。従って、本発明の別の態様によれば、液体組成物を製造する方法が提供される。
次に図2aを参照する。図2aは、本発明の好ましい実施形態による方法の流れ図である。この方法は下記の方法工程を含み、方法において、第1の工程で、固体粉末(例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末、合成ポリマーなど)が、十分に高い温度に、好ましくは約500℃を超える温度に、より好ましくは約600℃を超える温度に、さらにより好ましくは約700℃を超える温度に加熱される。意図される固体粉末の代表例には、限定されないが、BaTiO3、WO3およびBa2F9O12が含まれる。本発明者らは予想外にも、ヒドロキシアパタイト(HA)もまた組成物の配合において使用され得ることを見出した。ヒドロキシアパタイトは非毒性によって特徴づけられ、また、一般には、ヒト治療のためにFDA承認されるので、ヒドロキシアパタイトは特に好ましい。
実施例34において例示されるように、本発明の液体組成物を5つの異なるヒドロキシアパタイト粉末(HA−18、AB1−22−1、AA99−X、AB1−2−3およびHAP)から作製した(これらのヒドロキシアパタイトのすべてがSigma Aldrichから市販されている)。多くの他のヒドロキシアパタイト粉末が様々な製造者から入手可能であることが理解されよう(例えば、Clarion Pharmaceuticals(例えば、カタログNo.1306−06−5)など)。本発明のHA型液体組成物はすべてが、BaTiO3に基づく液体組成物に非常に類似していることが電子顕微鏡観察によって示された(図104〜図127のA〜F)。さらに、表36に示されるように、HAに基づく液体組成物はすべてが、水と比較したとき、高まった緩衝能力を含んでいた。
第2の工程で、加熱された粉末が、その密度異常性温度よりも低い温度(例えば、3℃または2℃)の冷たい液体(好ましくは、水)に浸される。この方法の第3の工程で、この工程は、好ましくは、第2の工程と実質的には同時に実行されるが、冷液体および粉末に、連続波RF放射線または変調されたRF放射線のいずれかであり得る電磁RF放射線(好ましくは、500MHzを超える電磁RF放射線)が照射される。
液体におけるナノ構造の形成は下記のように説明することができる。冷液体およびRF放射線(すなわち、非常に振動する電磁場)の組合せは粒子と液体との間の境界に影響を及ぼし、それにより、液体分子および粒子をばらばらにする。ばらばらにされた液体分子はフリーラジカルの形態であり、このフリーラジカルにより、粒子の(ナノサイズの)破片が包まれる。低い温度であるので、フリーラジカルおよび破片は定常的な物理的状態に入る。フリーラジカルがナノ構造に引き寄せられることが、液体分子の相関の長さと比較してナノ構造の比較的小さいサイズから理解され得る。小さいサイズの摂動が、長距離の相互作用により現れる純粋なカシミール効果に寄与し得ることが議論されている[D.Bartolo他、Europhys.Lett.、2000、49(6);729〜734]。
上記の方法を本発明に従って行うことにより、本発明のナノ構造が問題なく製造される。具体的には、上記の方法は、本明細書中下記でさらに詳述されるようにエンベロープ14の形成を可能にする。従って、本明細書中の別の態様によれば、液体およびナノ構造10を有する液体組成物が提供される。液体組成物が上記の方法によって製造されるとき、さらなる工程を用いることなく、ナノ構造10のエンベロープ14が、好ましくは、液体の分子と同一である分子から作製される。あるいは、ナノ構造はさらに、異なる液体と(RF照射とともに、または、RF照射を伴うことなく)混合することができ、その結果、最終的な組成物において、エンベロープ14の少なくとも一部が、液体の分子とは異なる分子から作製される。エンベロープ14が形成されるために、ナノ構造は、好ましくは、液体の比重よりも低い比重、または、液体の比重と等しい比重を有する。
ナノ構造の濃度は限定されない。好ましい濃度は1リットルあたり1020個未満のナノ構造であり、より好ましくは、1リットルあたり1015個未満のナノ構造である。当業者は、そのような濃度に関して、組成物中のナノ構造間の平均距離がかなり大きく、ミクロン程度であることを理解する。本明細書中下記においてさらに詳述され、また、下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は多くの特異な特性を有する。これらの特性は、例えば、ナノ構造間の遠距離の相互作用によって促進され得る。具体的には、遠距離の相互作用により、上記の比較的低い濃度をそのように用いることが可能になる。
ナノ構造間の相互作用(遠距離の相互作用および近距離の相互作用の両方)は、細菌コロニーの自己組織化と同様に、液体組成物の自己組織化能を容易にする。細菌コロニーが成長するとき、自己組織化は、細菌コロニーが、不都合な外部条件に対処し、かつ、成長速度を改善するためにその環境から「集団的に学習する」ことを可能にする。同様に、遠距離の相互作用、および、従って、液体組成物の遠距離の秩序は、液体組成物が、種々の環境的条件(例えば、限定されないが、異なる温度、電流および放射線など)に順応するように自己組織化を行うことを可能にする。
本発明の液体組成物の遠距離の秩序は、液体組成物が電気化学的析出(ECD)実験に供されるときに最もよく認められる(下記の実施例の節における実施例9もまた参照のこと)。
ECDは、物質が(例えば、2つの電極を使用して)ある電位差に供され、その結果、電気化学的プロセスが開始されるプロセスである。ECDプロセスの特有の性質の1つが、それによって得られる物質分布である。電気化学的プロセスの期間中、所与の電流において電極間で測定される電位は、その物質における数タイプの過電圧および抵抗降下の和である。抵抗降下の大きさは物質の電気伝導率および電極間の距離に依存する。電極の特定の局所的領域の電流密度は反対側の電極までの距離の関数である。この効果は一次電流分布と呼ばれ、電極の幾何形状および物質の電気伝導率に依存する。
電極間の電位差が、平衡電圧と比較して大きいとき、物質は非平衡状態への転移を受け、結果として、様々な異なる形態学の構造が形成される。非平衡状態における系は特定の形態学を選択し、かつ/または、2つの形態学(密集した枝分かれの形態学および樹枝状の形態学)の間で転移し得ることが見出されている[E.Ben−Jacob、「雪片形成から細菌コロニーの成長まで」、Cont.Phys.、1993、34(5)]。
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の液体組成物が電気化学的析出セルに置かれたとき、所定の形態学(例えば、密集した枝分かれおよび/または樹枝状)が形成される。好ましくは、本発明の液体組成物は、異なる液体(例えば、水)によって置き換えられたときでさえ、電気化学的形跡をセルの表面に保つことができる。より具体的には、本発明の好ましい実施形態によれば、液体組成物が最初に電気化学的析出セルの表面と接触させられ、次いで、所定の洗浄プロトコルによって洗浄されるとき、組成物の電気化学的形跡がセルの表面に保たれる。
ナノ構造の長距離相互作用もまた、本発明の液体組成物を新しい環境条件(例えば、温度変化)に供し、組成物におけるナノ構造間の相互作用に関係する1つまたは複数の物理量に対するその新しい環境条件の影響を調べることによって明らかにすることができる。1つのそのような物理量が超音波速度である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられる。
本発明のさらなる特徴は、液体組成物と固体表面との間での小さい接触角である。好ましくは、液体組成物と表面との間での接触角は、液体(ナノ構造を含まない)と表面との間での接触角よりも小さい。当業者は、小さい接触角は、液体組成物がより大きな程度で表面を「濡らす」ことを可能にすることを理解する。本発明のこの特徴は、液体におけるナノ構造の大きな濃度に限定されず、反対に、ナノ構造間の上記の遠距離の相互作用の助けをかりて、低い濃度にも限定されないことを理解しなければならない。
さらに、本発明の液体組成物のさらなる特徴は溶解性である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較したとき、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる(図74〜図97)。
本明細書中で使用される用語「溶解する」は、本発明の液体組成物が水性環境において可溶性またはより可溶性にすることができることを示す。
本明細書中で使用される用語「分散する」は、物質の溶解性の程度に従った懸濁物にする操作を示す。
従って、本発明のさらなる態様によれば、物質を、該物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む、物質を溶解または分散する方法が提供される。
本発明のナノ構造および液体は、医薬用薬剤(例えば、治療剤、化粧剤および診断剤など)を含めて、任意の物質(例えば、活性な薬剤)(例えば、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物など)を溶解/分散するために使用することができる。
治療剤は任意の生物学的な活性因子であってよく、例えば、薬物、核酸構築物、ワクチン、ホルモン、酵素、小分子(例えば、ヨウ素など)または抗体などであってよい。治療剤の例には、抗生物剤、フリーラジカル生成剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、非ステロイド系抗炎症性薬物、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、レチノイド剤、tar剤、止痒剤、ホルモン、ソラレンおよび殺疥癬虫剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって送達可能である核酸構築物は、ポリペプチド(例えば、酵素、リガンドまたはペプチド薬物など)、アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードすることができる。
本発明の化粧剤は、例えば、しわ取り剤、ニキビ防止剤、ビタミン剤、表皮剥離剤、毛包刺激剤または毛包抑制剤が可能である。化粧剤の例には、レチノイン酸およびその誘導体、サリチル酸およびその誘導体、含硫D−アミノ酸および含硫L−アミノ酸およびそれらの誘導体およびそれらの塩、特に、N−アセチル誘導体、α−ヒドロキシ酸(例えば、グリコール酸および乳酸など)、フィチン酸、リポ酸、ならびに、この分野で知られている多くの他の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の診断剤は、疾患状態を示す分子について特異的な抗体、化学物質または色素であり得る。
このような物質は、本発明の液体組成物を加える前に、または、可溶化プロセスを助けるために本発明の液体組成物を加えた後で溶媒に溶解することができる。本発明では、物質の溶解性をさらに増大させるために、極性溶媒、非極性溶媒、有機溶媒(例えば、エタノールまたはアセトンなど)または非有機溶媒を含めて、任意の溶媒の使用が意図されることが理解されよう。
溶媒は、物質が本発明の液体組成物に溶解/分散されたままであるように、可溶化プロセスの期間中の任意の時に(完全に、または部分的に)除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの分野では知られている(例えば、蒸発(すなわち、加熱するか、または、圧力を加えることによる蒸発)または任意の他の方法など)。
本発明の液体組成物のさらなる特徴は緩衝能力である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較したとき、高まった緩衝能力によって特徴づけられる(図74〜図97)。
さらに、本発明の液体組成物のさらなる特徴はタンパク質安定性である。下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の液体組成物は、水と比較したとき、タンパク質を安定化する高まった能力(例えば、タンパク質を熱の影響から保護する能力)によって特徴づけられる(図98A/図98B〜図99)。
本発明をさらに実施に移しているとき、本発明の液体組成物は、液体組成物を調製するために使用された固体粉末が細菌にとって毒性であるときでさえ、細菌コロニー拡大速度およびファージ−細菌相互作用またはウイルス−細胞相互作用の増大を促進することができることが予想外にも認められている(下記の実施例の節における実施例6、実施例7および実施例10を参照のこと)。液体組成物が製造されるこの特異なプロセスでは、言及されているように、コア材料12を取り囲むエンベロープ14の形成が可能であるので、細菌またはファージに対する液体組成物の何らかの毒性的影響が著しく抑制される。
本発明の液体組成物のさらなる特徴は、いわゆるゼータ(ζ)電位に関連する。ζ電位は、粒子が、その中に存在する電場の影響のもとで液体中を移動することができる電気泳動および誘電泳動と呼ばれる物理的現象に関連する。ζ電位は、異なる挙動を有する液体の2つの領域の間での境界において定義される剪断平面での電気電位である。粒子の電気泳動移動度(電場強度に対する粒子の速度の比率)はζ電位に比例する。
表面に関連づけられる量であるので、ζ電位は、粒子サイズが小さい系では特に重要である。そのような系では、粒子の総表面積が粒子の総体積に対して大きく、その結果、表面に関連づけられる現象により、粒子の挙動が決定されるからである。
本発明の好ましい実施形態によれば、液体組成物は、液体自体のζ電位よりも実質的に大きいζ電位によって特徴づけられる。大きいζ電位は、液体におけるナノ構造の高まった移動度に対応し、従って、例えば、電気化学的析出プロセスにおける特別な形態学の形成に寄与し得る。
液体組成物のζ電位を測定する多くの方法が存在し、これらには、限定されないが、マイクロ電気泳動、光散乱、光回折、音響学、電気音響学などが含まれる。例えば、ζ電位を測定する1つの方法が米国特許第6449563号に開示される(その内容は参考として本明細書により組み込まれる)。
本明細書中上記において背景の節で言及されたように、本発明はまた、分子生物学研究および診断の分野に関連し、具体的には、核酸増幅技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)および自動継続(self−sustained)配列複製(SSSR)など、これらに限定されない)に関連する。
本発明の液体組成物は、核酸増幅プロセスの効率を改善できることが本発明の発明者によって見出されている。本明細書中で使用される、表現「核酸増幅プロセスの効率を改善すること」は、PCR手法におけるDNAポリメラーゼの触媒活性を高めること、反応に必要とされるタンパク質の安定性を増大すること、増幅プロセスの感度および/または信頼度を増大すること、および/または増幅反応の反応容積を低減することを意味する。本発明のこの態様によると、触媒活性の強化は、好ましくは、さらなる補因子(例えば、マグネシウムまたはマンガンなど、これらに限定されない)の使用を伴うことなく達成される。当業者によって理解されるように、マグネシウム非存在またはマンガン非存在のPCRを用いることができることは非常に好都合である。これは、PCR手法の効率が、反応に存在する補因子の濃度に対して非常に敏感であることが知られているからである。熟練した科学者は、多くの場合、補因子の濃度を事前に計算すること、または、所望する増幅効率を達成する前に、補因子の濃度を変えながら多くの試験を行うことが要求される。
従って、本発明の液体組成物の使用は、使用者が、PCRミックスにおける補因子の濃度を計算するか、または変化させる必要なく、簡便かつ非常に効率的な多サイクルPCR手法を実行することを可能にする。
加えて、ポリメラーゼ連鎖反応が、何らかのさらなる緩衝液または液体を伴うことなく行われ得ることが本発明者によって見出されている。PCRを臨床診断に適用することに伴う大きな問題の1つは、持ち越し汚染に対するPCRの感受性である。これらは、以前のPCRにおいて増幅された分子がサンプルに混入することに起因する偽陽性である。本発明の液体組成物が唯一のPCRミックスとして使用されることは、全手順を、何らかのさらなる緩衝液または液体を必要とすることなく行うことができ、従って、汚染の危険性を回避することができるので、持ち越し汚染の可能性を著しく低下させる。
実施例17に記載されるように、また、図55〜図62および図102A〜図102Cおよび図103A〜図103Cに例示されるように、本発明の液体組成物は、リアルタイムPCR反応の感度を高めること、および、リアルタイムPCR反応の反応体積を低下させることが示された。本明細書中で使用されるように、リアルタイムPCR反応は、それぞれのPCRサイクルの期間中において二本鎖DNA検出分子(例えば、色素)の存在下で行われるPCR反応を示す。
さらに、本発明者らは、本発明の液体組成物が非常に少ない体積でのPCR反応(例えば、2μl)において使用され得ることを示している。加えて、本発明者らは、本発明の液体組成物が、熱脱水された多重PCR反応において使用され得ることを示している。
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、ポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供される。本発明のPCRキットは、所望されるならば、本発明のキットの1つまたは複数の単位物を含有することができるパックで提供され得る。パックには、キットを使用するために説明書が伴い得る。パックはまた、研究室補助品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に関連する通知によって供給され得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態の当局による承認を反映する。
1つの態様によれば、キットは、好ましくは別個のパッケージングで、熱安定性DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ(これに限定されない)など)と、本発明の液体組成物とを含む。
本発明の別の態様によれば、キットはリアルタイムPCRキットのために使用され、少なくとも1つのリアルタイムPCR試薬(例えば、二本鎖DNA検出分子など)をさらに含む。キットの構成成分は、別々に、または、任意の組合せで包装することができる。
本明細書中で使用される表現「二本鎖DNA検出分子」は、定量可能なシグナル(例えば、蛍光シグナル)をもたらす二本鎖DNA相互作用分子を示す。例えば、そのような二本鎖DNA検出分子は、(1)DNAのフラグメントまたはアンプリコンと相互作用し、(2)二重鎖形成しているアンプリコンの存在下では、分離状態にあるアンプリコンの存在下とは異なる波長で発光する蛍光色素であってよい。二本鎖DNA検出分子は、二本鎖DNAにインターカレーションする検出分子、または、プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子が可能である。
二本鎖DNAにインターカレーションする検出分子は、プライマー、アンプリコンまたは核酸テンプレートに共有結合的に連結されない。このような検出分子は、二本鎖DNAの存在下でその発光を増大させ、二重鎖DNAが解きほぐれたときにはその発光を低下させる。例には、臭化エチジウム、YO−PRO−1、Hoechst33258、SYBR GoldおよびSYBR GreenIが含まれるが、これらに限定されない。臭化エチジウムは、二本鎖DNAフラグメントにおいて塩基対間にインターカレーションし、DNAをゲル電気泳動後に検出するために一般に使用される蛍光化学物質である。254nm〜366nmの間の紫外光によって励起されたとき、臭化エチジウムは590nmにおける蛍光の光を放出する。このDNA−臭化エチジウム複合体は、一本鎖DNAの存在下での臭化エチジウムよりも約50倍の蛍光をもたらす。SYBR GreenIは497nmで励起され、520nmで発光する。SYBR GreenIの蛍光強度は、一本鎖DNAに対して、二本鎖DNAに結合したとき、100倍以上に増大する。SYBR GreenIの代わりになるものが、Molecular Probes Inc.によって導入されたSYBR Goldである。SYBR GreenIと同様に、SYBR Goldの蛍光放出は二重鎖状態のDNAの存在下で高まり、二本鎖DNAが解きほぐれたときには低下する。しかしながら、SYBR Goldの励起ピークは495nmにあり、発光ピークが537nmにある。SYBR Goldは、報告によれば、SYBR GreenIよりも安定であるようである。Hoechst33258は、二重鎖状態のDNAのAT富領域に結合する既知のビスベンズイミド系の二本鎖DNA検出分子である。Hoechst33258は350nmで励起し、450nmで発光する。YO−PRO−1は450nmで励起し、550nmで発光し、二重鎖DNA特異的な検出分子であることが報告されている。本発明の好ましい実施形態において、二本鎖DNA検出分子はSYBR GreenIである。
プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子はプライマーに共有結合的に連結され、アンプリコンが二重鎖構造を形成するとき、蛍光放出の増大または低下のいずれかをもたらす。プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子がプライマーの3’末端の近くに結合し、プライマーの末端塩基がdGまたはdCのいずれかであるとき、増大した蛍光放出が観測される。この検出分子は、末端のdC−dG塩基対およびdG−dC塩基対の近傍では消光され、また、検出分子がプライマーの末端から少なくとも6ヌクレオチド離れて内部に存在するときにはアンプリコンの二重鎖形成の結果として脱消光される。脱消光は、蛍光放出における実質的な増大をもたらす。このタイプの検出分子の例には、フルオレセイン(488nmで励起し、530nmで発光する)、FAM(494nmで励起し、518nmで発光する)、JOE(527で励起し、548で発光する)、HEX(535nmで励起し、556nmで発光する)、TET(521で励起され、536nmで発光する)、Alexa Fluor594(590nmで励起し、615nmで発光する)、ROX(575nmで励起し、602nmで発光する)およびTAMRA(555nmで励起し、580nmで発光する)が含まれるが、これらに限定されない。対照的に、プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子のいくつかは、一本鎖DNAに対して二本鎖DNAの存在下でその発光を低下させる。例には、ローダミンおよびBODIPY−FI(504nmで励起し、513nmで発光する)が含まれるが、これらに限定されない。これらの検出分子は、通常、5’末端のdCまたはdGにおいてプライマーに共有結合によりコンジュゲート化され、アンプリコンが二重鎖であるときにはより小さい蛍光を発光する。二重鎖を形成したときの蛍光の低下は、検出分子の極近傍での相補鎖におけるグアノシンが消光するためであるか、または、末端のdC−dG塩基対が消光するためであると考えられる。
加えて、PCRキットおよびリアルタイムPCRキットは、少なくとも1つのdNTP(例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTPなど、これらに限定されない)を含むことができる。dITPおよび7−デアザ−dGTPなどのアナログもまた意図される。
本発明の好ましい実施形態によれば、キットはさらに、使用者が少なくとも1つのコントロール試験を行って、PCR成績を確保することを可能にするために、少なくとも1つのコントロールテンプレートDNAおよび/または少なくとも1つのコントロールプライマーを含むことができる。
本発明のさらなる態様によれば、DNA配列を増幅する方法が提供され、この場合、この方法は、図2bの流れ図に例示される下記の方法工程を含む。この方法の第1の工程において、本発明の液体組成物が提供され、第2の工程において、多数のPCRサイクルが、液体組成物の存在下、DNA配列に対して実行される。
PCRサイクルを、この分野で知られている任意の方法で行うことができ、例えば、米国特許第4683195号、同第4683202号、同第4800159号、同第4965188号、同第5512462号、同第6007231号、同第6150094号、同第6214557号、同第6231812号、同第6391559号、同第6740510号および国際特許出願公開WO/9911823に開示されるPCRサイクル(これらに限定されない)を行うことができる。
好ましくは、それぞれのPCRサイクルにおいて、DNA配列は最初に、一本鎖の相補的な鎖を形成するために処理される。続いて、DNA配列に対して特異的である対になったオリゴヌクレオチドプライマーが液体組成物に加えられる。その後、プライマー対は、一本鎖の相補的な鎖における相補的な配列にアニーリングさせられる。適正な条件のもとで、アニーリングされたプライマーが伸張して、一本鎖のそれぞれに対して相補的である伸張生成物を合成する。
ポリヌクレオチドを固体支持体(例えば、ガラスビーズなど)に固定することは、分子生物学研究および医学の分野ではこの上なく有益であり得る。
本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、任意のサイズの鎖を形成するためにつながったDNA分子またはRNA分子として定義される。
ポリヌクレオチドは、研究および医学的適用の過程において多くの方法で操作することができ、これには、例えば、増幅、転写、逆転写、連結、制限消化、トランスフェクションおよび形質転換(これらに限定されない)が含まれる。
本明細書中で使用される「連結」は、1つの核酸鎖の3’末端を別の核酸鎖の5’末端とつなぎ、これにより、連続した鎖を形成することとして定義される。「転写」は、DNAからのメッセンジャーRNAの合成として定義される。「逆転写」は、RNAからのDNAの合成として定義される。「制限消化」は、DNA分子を、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれる特別な酵素でより小さい小片に切断するプロセスとして定義される。「形質転換」は、細菌細胞が裸のDNA分子を取り込むプロセスである。「トランスフェクション」は、細胞がDNA分子を取り込むプロセスである。
典型的には、DNA操作は一連の反応を次々に含む。従って、典型的な一例として、DNAを最初に制限消化し、増幅し、次いで細菌に形質転換することができる。それぞれの反応が、好ましくは、それ自身の特有の緩衝液を必要とするそれ自身の好適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応の間で、DNAサンプルまたはRNAサンプルを沈殿させ、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成しなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間がかかり、また、より重要なことに、出発物質の喪失をもたらし、このことは、出発物質が希少であるときには最大の関心事であり得る。ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することによって、これが回避される。
従って、本発明のさらなる態様によれば、液体およびナノ構造を含む液体組成物が提供され、この場合、液体組成物は、固体支持体の存在下での少なくとも1つの高分子の操作を可能にすることができ、それにより、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
固体支持体は、DNAおよびRNAと結合することができ、その一方で、他の分子が接近して結合し、また、上記で議論されたように、その後の反応においてそのDNAおよびRNAと相互作用することを可能にする任意の固体支持体であり得る。
本発明の発明者は、ガラスビーズが、ポリヌクレオチドを固定することができる一方で、ポリヌクレオチドが無傷であり続けるために本発明の液体組成物を要求することを見出した。従って、実施例16において記載されるように、ガラスビーズの存在下でPCR増幅を受けているDNAは、PCR生成物が可視化されるために、本発明の液体組成物の存在を要求する。
核酸増幅のほかに、本発明の液体組成物は、多くの化学的および生物学的なアッセイおよび反応を改善するために、緩衝液として、または既存の緩衝液への追加物として使用することができる。
従って、1つの実施形態において、本発明の液体組成物は、DNA分子を少なくとも部分的に解きほぐすために使用することができる。
別の実施形態において、本発明の液体組成物は、DNAの単離および精製を容易にするために使用することができる。
さらに別の実施形態において、本発明の液体組成物は、実施例19において明らかにされるように、核酸のハイブリダイゼーションを高めるために使用することができる。核酸はDNA分子および/またはRNA分子(すなわち、核酸配列またはその1個だけの塩基)であり得る。
核酸の一方を固体支持体(例えば、DNAチップ)に結合することができる。DNAチップの例には、フォーカスアレイチップ、AffymetrixチップおよびIlluminaビーズアレイチップが含まれるが、これらに限定されない。
液体組成物は、ハイブリダイゼーションを高めることが示されたので、本発明は、低い発現レベルを有する遺伝子を検出することにおいて特に有用であり得る。
さらなる実施形態において、本発明の液体組成物は、結合型酵素または非結合型酵素のいずれかであっても、多くの酵素(例えば、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど、これらに限定されない)の酵素活性を安定化させるために使用することができる。
さらに別の実施形態において、本発明の液体組成物は、高分子が固相マトリックスに結合することを高めるために使用することができる。下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように(実施例11を参照のこと)、本発明の液体組成物は、親水性物質および疎水性物質の両方に対する結合を高めることができる。加えて、本発明の液体組成物は、疎水性領域および親水性領域を有する物質に対する結合を高めることができる。上記物質に対する多くの高分子の結合を高めることができ、それらには、限定されないが、1つまたは複数の炭水化物親水性領域または炭水化物疎水性領域を有する高分子、抗体、ポリクローナル抗体、レクチン、DNA分子およびRNA分子などが含まれる。
加えて、下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように(実施例12〜実施例14を参照のこと)、本発明の液体組成物は、カラムの容量(樹脂に対する核酸の結合)を増大させるために、また、ゲル電気泳動分離を改善するために使用できることが本発明者によって見出されている。
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
下記の実施例は、本発明のナノ構造および液体組成物を使用して行われている様々な特徴づけ実験に向けられている。下記の実験において使用されたナノ構造および液体組成物は、本明細書中上記でさらに詳述されるように、本発明に従って製造された。より具体的には、ナノ構造および液体組成物を提供するために用いられた製造方法において、下記のプロトコルが使用された:
最初に、ミクロサイズのBaTiO3の粉末を880℃の温度に加熱した。次いで、915MHzの周波数での連続波RF放射線の条件のもとで、上記の加熱された粉末を2℃の温度で水に浸した。放射線および突然の冷却により、粉末のミクロサイズの粒子がばらばらにされ、ナノ構造になった。続いて、液体組成物(ナノ構造および水)を室温に加熱した。
下記の実施例のうちのいくつかでは、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造された様々な液体組成物が、LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6、LC7、LC8およびLC9として示される。本発明の様々な例示的実施形態に従って製造された様々な液体組成物の他の例のいくつかは、Do−Coop Technologies Ltd.の商標である商標名NeowaterTMによって示される。
実施例1
固液カップリングおよびナノ構造のクラスター形成
本実施例では、コア材料に対する取り囲んでいる流体分子のカップリングを、構造的流体システムの現代技術の1つである極低温透過電子顕微鏡観察(cryo−TEM)によって調べた。分析は下記の工程を伴い、第1の工程において、本発明の液体組成物(LC1)を、ガラス質サンプルが得られるように超急速で冷却し、次いで、第2の工程において、ガラス質サンプルを極低温でTEMによって調べた。
固液カップリングおよびナノ構造のクラスター形成
本実施例では、コア材料に対する取り囲んでいる流体分子のカップリングを、構造的流体システムの現代技術の1つである極低温透過電子顕微鏡観察(cryo−TEM)によって調べた。分析は下記の工程を伴い、第1の工程において、本発明の液体組成物(LC1)を、ガラス質サンプルが得られるように超急速で冷却し、次いで、第2の工程において、ガラス質サンプルを極低温でTEMによって調べた。
図3a〜図3eは本発明のナノ構造のTEM画像を示す。図3aは、4つのナノ構造によって占められる領域(約200nmの長さおよび約150nmの幅)の画像である。図3aに示されるように、ナノ構造は、流体分子の中間領域を介してクラスターを形成している。1つのそのような領域が黒矢印によって示される。ナノ構造を取り囲む条線(図3aにおいて白矢印によって示される)はその結晶性構造を示唆している。
図3bは1つのナノ構造(約20nmの直径)の画像である。明るいコロナ(白矢印によって示される)は、フレスネル効果として一般に知られている光学的干渉作用の結果であり得る。より暗いさらなるコロナ(図3bにおいて黒矢印によって示される)が、明るいコロナと比較して、ナノ構造の中心からさらに遠い距離で観測された。この暗いコロナは、コアを取り囲む流体分子の整列した構造、その結果、ナノ構造全体が定常的な物理的状態にあることを示している。
図3c〜図3eは等しい倍率であり、倍率が、図3cに示されるスケールバーにより例示される。図3cは、図3aよりも大きい倍率で、本発明のナノ構造がクラスター形成することができることをさらに明らかにしている。図3dは、結晶性の小平面によって特徴づけられる1つのナノ構造を示し、図3eは、一方が結晶性の小平面によって特徴づけられ、もう一方が、その結晶性構造にこれもまた起因すると考えられる十分に規定された暗い領域を有する2個のナノ構造からなるクラスターを示す。
実施例2
液体組成物に対する色素の影響
本発明の液体組成物と色素との相互作用を調べた。上記でさらに詳述されるように製造された液体組成物を、エタノールに溶解されたRu系色素(N3)により着色した。
液体組成物に対する色素の影響
本発明の液体組成物と色素との相互作用を調べた。上記でさらに詳述されるように製造された液体組成物を、エタノールに溶解されたRu系色素(N3)により着色した。
本発明の液体組成物(LC1)を含有する1つのキュベットを色素溶液に24時間さらした。液体組成物を含有する別のキュベットを下記のプロトコルにさらした:(i)撹拌、(ii)空気流による乾燥、および(iii)乾燥。純水を含有する2つのさらなるキュベットをコントロール群として上記試験に供した。
図4はこれら4つの試験の結果を示す。図4に示されるように、色素の添加は、色が維持された純水の場合(図4における下段の曲線を参照のこと)とは対照的に、色素の色の消失をもたらしている(図4における下段の曲線を参照のこと)。従って、ナノ構造との相互作用は、電子構造を変化させるか、または、色素の酸化のいずれかによって色素のスペクトルに影響を及ぼしている。
色の消失はキュベットの写真で最もよく明らかである。本発明の液体組成物を含有する図4に示されたすべてのサンプルは撹拌された。「乾燥S−R」と表されるサンプルは24時間にわたって乾燥状態で保たれ、湿潤「S−R」と表されるサンプルはエタノールとともに維持され、「色素S−R」と表されるサンプルは着色され(エタノール中の色素)、「色素S−乾燥R」と表されるサンプルは乾燥および再測定された。
実施例3
液体組成物に対する高g遠心分離の影響
本発明の液体組成物を含有するチューブを高g値(約30g)で遠心分離した。
液体組成物に対する高g遠心分離の影響
本発明の液体組成物を含有するチューブを高g値(約30g)で遠心分離した。
図5a〜図5bは遠心分離後の本発明の液体組成物(LC1)の5回の積分光散乱(ILS)測定の結果を示す。図5aはチューブの下部部分で記録されたシグナルを示す。示されるように、1μm未満の構造体からのシグナルは下部部分からは記録されなかった。図5bはチューブの上部部分で記録されたシグナルを示す。1μm未満の構造体の明確な存在が示される。すべての測定において、ピークの位置は約200nm〜300nmのナノ構造と一致している。
この実験では、ナノ構造が、ホストの液体(水)の比重よりも小さい比重を有することが明らかにされた。
実施例4
pH試験
本発明の液体組成物を2つのpH試験に供した。最初の試験では、カルミン酸指示薬が、変化するpHの目安を提供するように本発明の液体組成物(LC1)に添加された。
pH試験
本発明の液体組成物を2つのpH試験に供した。最初の試験では、カルミン酸指示薬が、変化するpHの目安を提供するように本発明の液体組成物(LC1)に添加された。
図6aは滴定期間中におけるカルミン酸指示薬のスペクトル変化を示す。これらのスペクトルが、液体組成物のpHを調べるために使用される。図6bは、液体組成物のスペクトルがpH7.5における水のスペクトルに近いことを示している。図6cは、この処理で使用された最初の水とは異なり、いくつかの液体組成物サンプルがpH7.5のスペクトルを有することを示している。
最初の試験の結果は、液体組成物が、純水のpH値よりも大きい7.5のpHを有することを示す。
第2の試験では、ブロモチモールブルー(BTB)が本発明の液体組成物(LC1)に添加された。この指示薬はpH自体に影響を及ぼさず、しかし、目的とするpH範囲において色を変化させる。
サンプルNo.1およびサンプルNo.4についての吸収スペクトルを図7に示す。図7において、「HW」は液体組成物のスペクトルを表し、「+」は正の特性結果を表し、「−」は負の特性結果を表す。BTBの2つの吸収ピークが図7に示される。これらのピークは、より酸性の場合について黄色の色をもたらし、より塩基性のときには緑青色をもたらす。液体組成物に添加されたとき、色と液体組成物の性状との間での相関が見出された。液体組成物の緑色の色(塩基性)は、特性がより大きいことを示す。
実施例5
ゼータ電位測定
ゼータ(ζ)電位測定を本発明の液体組成物に対して行った。図8は6個のサンプルのζ電位を示す(超純水、pH8に変化させた超純水、pH10に変化させた超純水、正の特性を有する液体組成物の2つのサンプル、および、負の特性を有する液体組成物の1つのサンプル)。ζ電位の測定を、Zeta Sizerを使用して行った。
ゼータ電位測定
ゼータ(ζ)電位測定を本発明の液体組成物に対して行った。図8は6個のサンプルのζ電位を示す(超純水、pH8に変化させた超純水、pH10に変化させた超純水、正の特性を有する液体組成物の2つのサンプル、および、負の特性を有する液体組成物の1つのサンプル)。ζ電位の測定を、Zeta Sizerを使用して行った。
示されるように、本発明の液体組成物のζ電位は著しくより大きい。このことは、液体中におけるナノ構造の移動度が大きいことを示している。
実施例6
バクテリオファージ反応
バクテリオファージの型決定に対する本発明の液体組成物(LC9)の影響を調べた。
バクテリオファージ反応
バクテリオファージの型決定に対する本発明の液体組成物(LC9)の影響を調べた。
材料および方法
1)Public Health Laboratory In Colindale(英国)(The International Reference Laboratory)(URL:www.phls.co.uk)から得られる、黄色ブドウ球菌(SA)のファージ型決定のための標準的な国際キットのバクテリオファージ(No.6およびNo.83A)を調べた。
2)寒天平板用の培地:Nutrient寒天Oxoid No.2(カタログ番号CM67、Oxoid Ltd.)+CaCl2。オートクレーブ滅菌後、20mlのCaCl2を各1リットルの培地について加えた。
3)液体培養用の培地:Nutrient Broth No2 Oxoid:28gr/リットル。
4)ファージ型決定のための濃度:各バクテリオファージを1RTDおよび10RTD(日常的試験希釈度)で試験した。
5)ファージの増殖:各ファージを、コントロール培地、および、本発明の液体組成物に基づく被試験培地において平行して増殖させた。
6)溶菌表面積を表面積測定のためのコンピューター処理「Sketch」ソフトウエアを使用して測定した。
7)統計学的分析:Microsoft Windows(登録商標)用のSPSS(商標)ソフトウエアを使用して、反復測定による分散分析(ANOVA)を光学的濃度分析について使用し、2元配置ANOVAを溶解表面積の測定値について使用した。
1)Public Health Laboratory In Colindale(英国)(The International Reference Laboratory)(URL:www.phls.co.uk)から得られる、黄色ブドウ球菌(SA)のファージ型決定のための標準的な国際キットのバクテリオファージ(No.6およびNo.83A)を調べた。
2)寒天平板用の培地:Nutrient寒天Oxoid No.2(カタログ番号CM67、Oxoid Ltd.)+CaCl2。オートクレーブ滅菌後、20mlのCaCl2を各1リットルの培地について加えた。
3)液体培養用の培地:Nutrient Broth No2 Oxoid:28gr/リットル。
4)ファージ型決定のための濃度:各バクテリオファージを1RTDおよび10RTD(日常的試験希釈度)で試験した。
5)ファージの増殖:各ファージを、コントロール培地、および、本発明の液体組成物に基づく被試験培地において平行して増殖させた。
6)溶菌表面積を表面積測定のためのコンピューター処理「Sketch」ソフトウエアを使用して測定した。
7)統計学的分析:Microsoft Windows(登録商標)用のSPSS(商標)ソフトウエアを使用して、反復測定による分散分析(ANOVA)を光学的濃度分析について使用し、2元配置ANOVAを溶解表面積の測定値について使用した。
結果
バクテリオファージ反応の促進
図9a〜図9bは、下記のように、被試験培地におけるバクテリオファージ反応を例示する。図9aはコントロール培地(右側)および本発明の液体培地(左側)におけるバクテリオファージNo.6を示し、図9bはコントロール培地(右側)および本発明の液体培地(左側)におけるバクテリオファージNo.83Aを示す。本発明の液体培地におけるバクテリオファージ反応は、細菌の溶解が促進されたことを明らかにした(液体組成物では1時間以内であり、コントロール培地では3時間以内であった)。
バクテリオファージ反応の促進
図9a〜図9bは、下記のように、被試験培地におけるバクテリオファージ反応を例示する。図9aはコントロール培地(右側)および本発明の液体培地(左側)におけるバクテリオファージNo.6を示し、図9bはコントロール培地(右側)および本発明の液体培地(左側)におけるバクテリオファージNo.83Aを示す。本発明の液体培地におけるバクテリオファージ反応は、細菌の溶解が促進されたことを明らかにした(液体組成物では1時間以内であり、コントロール培地では3時間以内であった)。
被試験平板における優れた溶解面積が直ちに観測され、24時間のインキュベーションで、より大きいままであった。コントロール平板と被試験平板との間での鮮明な違いが、RTD濃度を測定することによって明らかにされた。
面積測定
図10は、コントロールおよび液体組成物の溶菌表面積の比較を示すヒストグラムである。統計学的有意性を、ファージ型決定についての2元配置ANOVAを使用して決定した。対応する数字が下記の表1および表2に示される。
図10は、コントロールおよび液体組成物の溶菌表面積の比較を示すヒストグラムである。統計学的有意性を、ファージ型決定についての2元配置ANOVAを使用して決定した。対応する数字が下記の表1および表2に示される。
ファージ反応面積における著しい増大が液体組成物に関して見出された(p=0.014)。著しい違いが、ファージとの間(p=0.113)および培地相互作用との間(p=0.397)では認められなかった。このことから、本発明の液体組成物は両方の被試験ファージに対して同一の影響傾向を有することが明らかにされる。
RTD測定
図11は、それぞれの増大において10倍ずつ増大する希釈度を示す。本発明の液体培地におけるファージの増大した濃度が、ウエル1よりも100倍大きいウエル3において観測された。
図11は、それぞれの増大において10倍ずつ増大する希釈度を示す。本発明の液体培地におけるファージの増大した濃度が、ウエル1よりも100倍大きいウエル3において観測された。
溶菌−光学的濃度の読み取り
図12は、時間を関数とするファージNo.6における光学的濃度(OD)のグラフである。開始からの平均変化およびファージ反応のODについての対応する数字が表3および表4にそれぞれ示される。反復測定についてのANOVAが表5に示される。
図12は、時間を関数とするファージNo.6における光学的濃度(OD)のグラフである。開始からの平均変化およびファージ反応のODについての対応する数字が表3および表4にそれぞれ示される。反復測定についてのANOVAが表5に示される。
図12および表3〜表5において明らかにされるように、著しい相関が培地および時間との間に存在する。より具体的には、時間における著しい異なる傾向が、ファージNo.6およびファージNo.83Aの両方において、コントロールおよび本発明の液体組成物との間に存在する(p=0.001)。本発明の液体組成物におけるファージ反応は、逆方向による著しく異なる傾向を有する。
22時間で、溶解の増加「反発」が認められた。これは、ファージの増大した能力のためであると考えられる。
コントロールのODのすべて(培地単独、ファージ単独、細菌単独、異なるファージを伴うコントロールおよび組成物において)は、コントロール間で差がないことを明らかにし、また、試験された反応とは著しく異なっていた。
結論
本発明の液体組成物はファージ反応時間を促進し(3倍)、かつ、溶菌表面積を増大させ、また、RTDを増大させている(100倍以上)。
本発明の液体組成物はファージ反応時間を促進し(3倍)、かつ、溶菌表面積を増大させ、また、RTDを増大させている(100倍以上)。
本発明の液体組成物におけるバクテリオファージ反応は、OD測定においてコントロールに匹敵する逆の傾向、および、時間とともに増大する能力を明らかにしている。
考察
ファージ−宿主相互作用の速度論が、液体組成物を含有する培地では高まっている。このことは、反復実験において、また、測定された「成長曲線速度論」において観測された。速度論に影響するパラメーターは、測定された因子(例えば、pH、温度など)には依存していない。22時間の反応の後で観測されたように、ファージ濃度だけでなく、その能力もまた増大している。本発明の液体組成物におけるファージが依然として効果的であるとき、コントロール培地におけるファージは効果的でない。加えて、液体組成物により前処理された増殖中の株ははるかにより効果的である。
ファージ−宿主相互作用の速度論が、液体組成物を含有する培地では高まっている。このことは、反復実験において、また、測定された「成長曲線速度論」において観測された。速度論に影響するパラメーターは、測定された因子(例えば、pH、温度など)には依存していない。22時間の反応の後で観測されたように、ファージ濃度だけでなく、その能力もまた増大している。本発明の液体組成物におけるファージが依然として効果的であるとき、コントロール培地におけるファージは効果的でない。加えて、液体組成物により前処理された増殖中の株ははるかにより効果的である。
実施例7
ファージ−細菌相互作用に対する液体組成物の影響
ラムダ(λ)ファージに対する本発明の液体組成物の影響を調べた。λファージは、生物のゲノムDNAを提示するために分子生物学において使用されている。下記の実験は標準的なλファージ相互作用適用に依る。すべての実験において、試験群における材料は、液体組成物を溶媒として用いて調製された。コントロール群における材料は本明細書中下記に記載されるように調製された。コントロール群のpHを、7.2〜7.4の間である液体組成物溶液のpHに調節した。
ファージ−細菌相互作用に対する液体組成物の影響
ラムダ(λ)ファージに対する本発明の液体組成物の影響を調べた。λファージは、生物のゲノムDNAを提示するために分子生物学において使用されている。下記の実験は標準的なλファージ相互作用適用に依る。すべての実験において、試験群における材料は、液体組成物を溶媒として用いて調製された。コントロール群における材料は本明細書中下記に記載されるように調製された。コントロール群のpHを、7.2〜7.4の間である液体組成物溶液のpHに調節した。
材料および方法
1)LB培地
10gのBacto Tryptone、5gの酵母抽出物、10gのNaClを1000mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブ(121℃、1.5atm、45分間)によって滅菌する。
2)LB平板
15gのBacto Agarを1000mlのLB培地に加え、混合し、上記のようにオートクレーブ処理した。50℃に冷却した後、培地を滅菌プラスチックプレートに注いだ。平板を使用前に2日間プレインキュベーションした。
3)上層アガロース、0.7%
100mlのLB培地を0.7gの化学的に純粋な電気泳動規格のアガロース(Difcoまたは他の供給者から得られる)と混合し、オートクレーブ(121℃、1.5atm、45分間)によって滅菌した。
4)MgSO4−10mM
1.2gのMgSO4を1000mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブによって滅菌した。
5)マルトース、20%(w/v)
200gのマルトースを1000mlの蒸留水に溶解し、20μmのフィルターによるろ過によって滅菌した。
6)MgSO4−1M
120.37gのMgSO4を1000mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブによって滅菌した。
7)10mMのMgSO4および0.2%のマルトースを含むLB
100μlのMgSO4(1M)および100μlのマルトース(20%)を99.8mlのLB培地に加えた。
8)SM緩衝液(ファージ貯蔵緩衝液)
5.8gのNaCl、2gのMgSO4、50mMの1M TrisHCl(pH7.5)、5mlの2%(w/v)ゼラチンを蒸留水に溶解して、1000mlの最終体積にし、その後、オートクレーブによって滅菌した。
9)細菌株(宿主)
大腸菌XL1Blue MRA(Stratagene)。
10)ファージ:
λGEM11(Promega)。
11)LB平板での細菌培養
XL1細胞を、細菌接種の一般的な手順に従って微生物学的白金耳によりLB平板上に分散させた。平板を37℃で16時間インキュベーションした。
12)LB液体培地での細菌培養
単一コロニーのXL1細胞をLB平板から取り、LB液体培地に接種し、続いて、200rpmで振とうしながら37℃で16時間(一晩)インキュベーションした。
13)ファージによる宿主細菌株への感染
XL1細胞を、10mMのMgSO4および0.2%のマルトースが補充されたLB培地に接種した。200rpmで振とうしながら37℃でのインキュベーションを、600nmの波長における0.6の濁度が達成されるまで(4時間〜5時間)続けた。成長した培養物を4000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、細菌を、600nmの波長における0.6の濁度が達成されるまで10mMのMgSO4に再懸濁した。ファージを含有するSM緩衝液の必要量を200mlの再懸濁された細菌に加えた。37℃で15分間インキュベーションした後、2つの代替的手順を行った:
(i)溶解物を調製するために、適量のLB培地を宿主−ファージ混合物に加え、200rpmで振とうしながら37℃で16時間(一晩)インキュベーションした。
(ii)固体培地におけるファージ出現(プラーク)のために、溶融した上層アガロース(50℃)を宿主−ファージ混合物に注ぎ、素早く混合し、事前に暖めたLB平板に広げた。アガロースが固化した後、インキュベーションを37℃で16時間(一晩)行った。
14)ファージDNAの抽出
細菌溶解物を、細菌破片を沈降させるために6000rpmで5分間〜10分間遠心分離した。上清を集め、ファージ粒子を沈降させるために14000rpmで30分間遠心分離した。上清を捨て、ファージペレットをゼラチン非含有のSM緩衝液に再懸濁した。ヌクレアーゼの混合物(任意の供給者から得られるRNaseおよびDNase)を、1μlのファージ懸濁物あたり5Weiss単位〜10Weiss単位の最終的濃度にするために、再懸濁されたファージに加えた。何らかの残留する細菌核酸の完全な消化のために要求されるように37℃で30分間インキュベーションした後、ファージのDNAを下記の手順によって抽出した:
(i)フェノール:クロロホルム:iso−アミルアルコール(25:24:1、v/v)による抽出;
(ii)クロロホルムによるフェノール混入物の除去;
(iii)0.3M酢酸カリウムの最終的な濃度および1体積のイソプロパノールによる沈殿化;
(iv)70%エタノールによる洗浄;および
(v)乾燥、および、さらなる分析のための蒸留水での再懸濁。
1)LB培地
10gのBacto Tryptone、5gの酵母抽出物、10gのNaClを1000mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブ(121℃、1.5atm、45分間)によって滅菌する。
2)LB平板
15gのBacto Agarを1000mlのLB培地に加え、混合し、上記のようにオートクレーブ処理した。50℃に冷却した後、培地を滅菌プラスチックプレートに注いだ。平板を使用前に2日間プレインキュベーションした。
3)上層アガロース、0.7%
100mlのLB培地を0.7gの化学的に純粋な電気泳動規格のアガロース(Difcoまたは他の供給者から得られる)と混合し、オートクレーブ(121℃、1.5atm、45分間)によって滅菌した。
4)MgSO4−10mM
1.2gのMgSO4を1000mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブによって滅菌した。
5)マルトース、20%(w/v)
200gのマルトースを1000mlの蒸留水に溶解し、20μmのフィルターによるろ過によって滅菌した。
6)MgSO4−1M
120.37gのMgSO4を1000mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブによって滅菌した。
7)10mMのMgSO4および0.2%のマルトースを含むLB
100μlのMgSO4(1M)および100μlのマルトース(20%)を99.8mlのLB培地に加えた。
8)SM緩衝液(ファージ貯蔵緩衝液)
5.8gのNaCl、2gのMgSO4、50mMの1M TrisHCl(pH7.5)、5mlの2%(w/v)ゼラチンを蒸留水に溶解して、1000mlの最終体積にし、その後、オートクレーブによって滅菌した。
9)細菌株(宿主)
大腸菌XL1Blue MRA(Stratagene)。
10)ファージ:
λGEM11(Promega)。
11)LB平板での細菌培養
XL1細胞を、細菌接種の一般的な手順に従って微生物学的白金耳によりLB平板上に分散させた。平板を37℃で16時間インキュベーションした。
12)LB液体培地での細菌培養
単一コロニーのXL1細胞をLB平板から取り、LB液体培地に接種し、続いて、200rpmで振とうしながら37℃で16時間(一晩)インキュベーションした。
13)ファージによる宿主細菌株への感染
XL1細胞を、10mMのMgSO4および0.2%のマルトースが補充されたLB培地に接種した。200rpmで振とうしながら37℃でのインキュベーションを、600nmの波長における0.6の濁度が達成されるまで(4時間〜5時間)続けた。成長した培養物を4000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、細菌を、600nmの波長における0.6の濁度が達成されるまで10mMのMgSO4に再懸濁した。ファージを含有するSM緩衝液の必要量を200mlの再懸濁された細菌に加えた。37℃で15分間インキュベーションした後、2つの代替的手順を行った:
(i)溶解物を調製するために、適量のLB培地を宿主−ファージ混合物に加え、200rpmで振とうしながら37℃で16時間(一晩)インキュベーションした。
(ii)固体培地におけるファージ出現(プラーク)のために、溶融した上層アガロース(50℃)を宿主−ファージ混合物に注ぎ、素早く混合し、事前に暖めたLB平板に広げた。アガロースが固化した後、インキュベーションを37℃で16時間(一晩)行った。
14)ファージDNAの抽出
細菌溶解物を、細菌破片を沈降させるために6000rpmで5分間〜10分間遠心分離した。上清を集め、ファージ粒子を沈降させるために14000rpmで30分間遠心分離した。上清を捨て、ファージペレットをゼラチン非含有のSM緩衝液に再懸濁した。ヌクレアーゼの混合物(任意の供給者から得られるRNaseおよびDNase)を、1μlのファージ懸濁物あたり5Weiss単位〜10Weiss単位の最終的濃度にするために、再懸濁されたファージに加えた。何らかの残留する細菌核酸の完全な消化のために要求されるように37℃で30分間インキュベーションした後、ファージのDNAを下記の手順によって抽出した:
(i)フェノール:クロロホルム:iso−アミルアルコール(25:24:1、v/v)による抽出;
(ii)クロロホルムによるフェノール混入物の除去;
(iii)0.3M酢酸カリウムの最終的な濃度および1体積のイソプロパノールによる沈殿化;
(iv)70%エタノールによる洗浄;および
(v)乾燥、および、さらなる分析のための蒸留水での再懸濁。
結果
プラーク形成ユニット(PFU)力価実験
ファージ懸濁物を一連の1/10希釈でSM緩衝液におけるファージストックから調製した:1つを、発明の液体組成物に基づくSM緩衝液で調製し、1つを、ddH2Oに基づくSM緩衝液で調製した。
プラーク形成ユニット(PFU)力価実験
ファージ懸濁物を一連の1/10希釈でSM緩衝液におけるファージストックから調製した:1つを、発明の液体組成物に基づくSM緩衝液で調製し、1つを、ddH2Oに基づくSM緩衝液で調製した。
1μlの各希釈物を200μlのコンピテント細菌宿主とインキュベーションした(方法の項目13を参照のこと)。懸濁物を37℃で15分間インキュベーションして、バクテリオファージがそのDNAを宿主細菌内に注入することを可能にした。インキュベーション後、熱い(45℃〜50℃)上層アガロースを加え、LB平板上に分散させた。それぞれの希釈物および処理の9個の複製物を調製した。
下記の表6は、一晩のインキュベーションの後で計数されたPFUレベルを示す。
数字を、パラメトリック検定を行うために必要とされるようにデータを正規化するために平方根変換によって修正した。下記の表7には、要因ANOVAによるデータ分析の結果が示される。
PFU力価における著しい影響が、濃度間(0.0001に対して0.001)、処理間(コントロールに対して試験)、および、相互作用間(処理および濃度の任意の組合せ)で検出された。濃度間の著しい差が実験構造の結果として予想された。しかしながら、本発明の液体組成物の処理により引き起こされるようなPFU力価における著しい増大は、本明細書中下記において本実施例の考察の節で示される特別な説明を必要とする。
LBにおける大腸菌株XLI−Blueの細菌成長
2μlの細菌懸濁物を、コントロールと、本発明の液体組成物に基づく培地との両方で2つのLB平板の各1/8領域に接種した(合計で16個の接種)。37℃で3日間インキュベーションした後、コロニーの形状およびサイズを観察した。著しい差がコントロールと液体組成物処理との間で観察されなかった。
2μlの細菌懸濁物を、コントロールと、本発明の液体組成物に基づく培地との両方で2つのLB平板の各1/8領域に接種した(合計で16個の接種)。37℃で3日間インキュベーションした後、コロニーの形状およびサイズを観察した。著しい差がコントロールと液体組成物処理との間で観察されなかった。
LB細菌培養物(溶解物)におけるファージ成長
溶解物を方法(項目13)に記載されるように調製し、6000rpmで5分間〜10分間遠心分離して、細菌破片を沈降させ、濁度を600nmで測定した。その後、DNAを、本明細書中上記において方法(項目14)で記載されたように溶解物から抽出した。著しい差が、濁度および抽出DNA濃度(コントロールにおいて0.726μg/μl;液体組成物において0.718μg/μl)の両方においてコントロールと液体組成物処理との間で観察されなかった。
溶解物を方法(項目13)に記載されるように調製し、6000rpmで5分間〜10分間遠心分離して、細菌破片を沈降させ、濁度を600nmで測定した。その後、DNAを、本明細書中上記において方法(項目14)で記載されたように溶解物から抽出した。著しい差が、濁度および抽出DNA濃度(コントロールにおいて0.726μg/μl;液体組成物において0.718μg/μl)の両方においてコントロールと液体組成物処理との間で観察されなかった。
考察
3つのうちの2つの独立した実験において、本発明の液体組成物がコントロールと比較して使用されたとき、低いファージ希釈度(10−3および10−4)でのPFUにおける著しい増大が観測された。
3つのうちの2つの独立した実験において、本発明の液体組成物がコントロールと比較して使用されたとき、低いファージ希釈度(10−3および10−4)でのPFUにおける著しい増大が観測された。
上記観察結果の考えられる説明は、プラーク形成が2つの別個のプロセス(その宿主に感染するファージの能力(感染性)およびファージに対する宿主適合性)に依存するという点にある。
宿主適合性は、ファージが繁殖するために細菌の機構を採用するファージの能力に依存する。宿主適合性に対する本発明の液体組成物との間における相関は何ら見出されなかった。増大した適合性は、コントロールのプラークよりも大きいプラーク(最初の感染部位からより大きい距離)、または、コントロールのファージ粒子の数よりも大きい数のファージ粒子のいずれかが観察されることによって明らかにすることができる。
本発明の液体組成物がDNAファージのレベルに影響しなかったという事実は以前の発見を裏付けている。
感染性は本質的なファージ粒子に依存し、かつ/または、ファージが感染するための細菌細胞の能力に依存する。本発明の液体組成物が使用されたときのPFUにおける著しい増大(コントロールよりも約2倍大きい)は、本発明の液体組成物が感染性に影響を及ぼすことを示している。予備感染処理(方法(項目13)を参照こと)が、非処理の細菌よりも容易にファージが感染するコンピテント細菌を調製することによって感染の確率を増大させるために要求される。
低いファージ希釈度では、PFU形成の制限因子は、ファージが感染するための宿主細胞の能力である。
本発明の液体組成物により処理され、かつ、本発明の液体組成物とともに成長した細菌は、ファージによる感染の増大した能力を有していたようである。従って、液体組成物は細菌の受容体とファージ粒子との間での親和性を増大させていることが推測される。
実施例8
マイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する液体組成物の影響
粘着物多糖の産生はバイオフィルムの生成および維持にとって非常に重要であり、また、細菌における毒性因子として主要な役割を果たしている[Gotz F.「ブドウ球菌およびバイオフィルム」、Mol Microbiol、2002、43(6):1367〜78]。粘着物は表面への細菌の付着および細菌の蓄積を容易にして、層状のクラスターを形成する。粘着物はまた、宿主の免疫防御および抗体処理から保護する[Kolari M.他、「抄紙機バイオフィルムにおける着色した中程度好熱性細菌」、J Ind Microbiol Biotechnol(2003)に出版される予定]。細菌によって産生されるバイオフィルムは産業界においても様々な問題を生じさせ得る。
マイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する液体組成物の影響
粘着物多糖の産生はバイオフィルムの生成および維持にとって非常に重要であり、また、細菌における毒性因子として主要な役割を果たしている[Gotz F.「ブドウ球菌およびバイオフィルム」、Mol Microbiol、2002、43(6):1367〜78]。粘着物は表面への細菌の付着および細菌の蓄積を容易にして、層状のクラスターを形成する。粘着物はまた、宿主の免疫防御および抗体処理から保護する[Kolari M.他、「抄紙機バイオフィルムにおける着色した中程度好熱性細菌」、J Ind Microbiol Biotechnol(2003)に出版される予定]。細菌によって産生されるバイオフィルムは産業界においても様々な問題を生じさせ得る。
粘着物を防止するための現在の概念のほとんどは、バイオフィルムにおいて活性である新しい感染防止剤、および、バイオフィルムを絡ませる新しい生体適合性材料についての探索に関連している。
シリコーン表面へのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着がMIC以下の抗菌剤によって変化し得ることが明らかにされている[Besnier JM他、「コアグラーゼ陰性ブドウ球菌のシリコーンへの付着および疎水性に対する抗菌剤の亜阻害濃度の影響」、Clin Microbiol Infec、1996、1(4):244〜248]。この作用は粘着物産生株および粘着物非産生株では異なり、また、このような抗菌剤の阻害作用の機構、または、疎水性の修飾と相関していなかった。このことは、疎水性に関与していない一部の表面成分がインビトロ付着において役割を果たし得ることを示唆している。
抗生物質に対する表皮ブドウ球菌(インプラントに関連した感染症の重大な病原体)の細菌抵抗性が、抗生物質の接近および宿主防御機構による殺傷を損なう糖衣粘膜の産生に関連づけられている[Konig DP他、「4つの異なる骨セメントにおける表皮ブドウ球菌RP62Aおよび表皮ブドウ球菌M7のインビトロ付着および蓄積」、Langenbecks Arch Surg、2001、386(5):328〜32]。生体材料に関連した感染を防止するために開発された、抗生物質を含有する種々の骨セメントのインビトロ研究では、生体材料付着性細菌の完全な根絶を必ずしも常に明らかにすることができなかった。さらなる努力が、粘着物付着からのより良好な保護を見つけ出すために行われている。
加えて、表面の相互作用は粘着物付着を変えることができる。例えば、Farooq他[Farooq M他、「ゼラチンによりシールされたポリエステルは表皮ブドウ球菌バイオフィルム感染を阻止する」、J Surg Res、1999、87(1):57〜61]は、ゼラチン含浸ポリエステル移植片が表皮ブドウ球菌バイオフィルム感染を大動脈移植片間置のイヌモデルにおいて阻害することを明らかにした。ゼラチン含浸ポリエステル移植片は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌バイオフィルム感染に対するインビボ抵抗性を明らかにした。
本実施例における実験の目的は、粘着物を産生する表皮ブドウ球菌(API−6706112)のプラスチックへの付着に対する本発明の液体組成物の影響を調べることであった。
方法
使用された細菌は、Bio Merieux sa Marcy l’ Eoile(フランス)(API)を使用して同定され、表皮ブドウ球菌6706112について98.4%の信頼度であった。下記の表8には、使用された3つの細菌株がまとめられる。
使用された細菌は、Bio Merieux sa Marcy l’ Eoile(フランス)(API)を使用して同定され、表皮ブドウ球菌6706112について98.4%の信頼度であった。下記の表8には、使用された3つの細菌株がまとめられる。
粘着物付着を下記のように分光光度計による光学的濃度(OD)技術によって定量的に調べた。本発明の液体組成物および通常の水を用いたTSBにおける一晩培養物を、対応する培地により1:2.5で希釈し、滅菌のマイクロタイター組織培養プレート(Cellstar、Greniner lobortechnik、LIDを伴う組織培養プレート(96W平底)、滅菌No.655180)にそれぞれ250μlの総体積で入れ、37℃でインキュベーションした。プレートを水道水により3回すすぎ、クリスタルバイオレットで染色し、水道水によりさらに3回すすいだ。乾燥後、染色された付着性細菌フィルムのODを、550nmの波長を使用することによってMicroElisa Autoリーダー(MR5000;Dynatech Laboratories、Alexandria、VA.)により測定した。細菌培養物のODを、450nmおよび630nmmの二重フィルターを使用してそれぞれの染色の前に測定した。それぞれの細菌株の試験を四連で行った。
実験を、様々な間隔で粘着物付着を評価するために設計した。速度論的評価のための時間表は、18時間、20時間、22時間、24時間および43時間であった。3つの菌株のすべてを同じプレートで評価した。液体組成物を標準的な培地調製のために使用し、液体組成物は標準的なオートクレーブ滅菌を受けた。
付着の値を、同じプレート試験について、反復測定によるANOVAを使用して比較した。グループ化因子はプレートおよび菌株であった。3元配置ANOVAを、Microsoft Windows(登録商標)用のSPSS(商標)11.0を使用して異なるプレート試験について使用した。
結果
図13a〜図13cは粘着物産生の表皮ブドウ球菌(上記の表8を参照のこと)のすべてにおけるODを示す。付着が本発明の液体組成物では著しく異なっていた(p<0.001)。
図13a〜図13cは粘着物産生の表皮ブドウ球菌(上記の表8を参照のこと)のすべてにおけるODを示す。付着が本発明の液体組成物では著しく異なっていた(p<0.001)。
菌株24および菌株44の速度論は、増大した粘着物付着を明らかにし(それぞれ図13a〜図13b)、菌株54は、低下した付着を明らかにした(図13c)。時間が、付着を低下させることにおける重要な因子であることが見出され、この場合、最後の1時間で、最も低い付着が観測された。著しい差が菌株間で見出され(p<0.001)、それぞれの菌株がそれ自身の付着特性を有していた。著しい相互作用が、異なる菌株および時間との間で見出され(p<0.001)、菌株間の差は時間依存的であった。回帰分析により、時間および使用された水のタイプとの間での相互作用は何ら見出されなかった(p=0.787)。液体組成物およびコントロールにおける付着の差はすべての時間で維持され、18時間目から始まり、43時間目でピークに達した。
菌株および水との間での著しい相互作用(p<0.001)が見出された。液体組成物およびコントロールとの間での違いは菌株依存的であった。それぞれの菌株がそれ自身の付着特性を有していた。菌株、時間および水との間には相互作用は何ら見出されなかった(p=0.539)。
下記の表9には、粘着物付着速度論の結果がまとめられる(3元配置ANOVA)。
反復粘着物付着実験を同じタイプの異なるプレートでのインキュベーション後24時間で行った。この場合、それぞれの菌株を別個のマイクロタイタープレートでインキュベーションした。
図14は、異なるマイクロタイタープレートでの粘着物付着の15回の反復実験を表すヒストグラムである。示されるように、液体組成物の存在下での付着はコントロールにおける付着よりも大きい。
マイクロタイタープレート間および菌株間での液体組成物およびコントロールにおける付着の著しい違いが見出された(p<0.001)。著しい相互作用が、プレート、菌株および使用された水のタイプとの間で見出された。付着の程度は、菌株、プレートおよび使用された水に依存している。
下記の表10には、別個のマイクロタイタープレートでの粘着物付着の結果がまとめられる(3元配置ANOVA)。
プレート対プレートの変動の可能性を調べるために、多数回の分析を同じプレートで行った(すべての菌株)。
図15は、同じマイクロタイタープレートでの本発明の液体組成物とコントロールにおける粘着物付着の違いを示す。下記の表11〜表12には、同じマイクロタイタープレートでの粘着物付着の結果がまとめられる(反復測定によるANOVA)。
表11〜表12に示されるように、液体組成物およびコントロールによる粘着物付着の間での著しい差がもう一度認められた。しかしながら、新たな著しい相互作用が、プレートとの間(p<0.001)、菌株との間(p<0.001)および水との間(p<0.001)で存在することもまた見出された。このことから、液体組成物における付着の差が、プレート、菌株、および、それとの相互作用に依存することが確認される。
菌株およびプレートとの間での付着における著しい差はプレート毎の変動の可能性を指摘している。液体組成物によるプレート毎の変動は、液体組成物と相互作用し得る他の因子がプレート表面に存在し得るか、または、プレート調製時に存在し得ることを示している。
考察
その変化した表面付着性により細菌付着を変化させる本発明の液体組成物の能力を調べた。液体組成物による培地は、何らかの有機物またはPH改変を除外して、コントロール培地と比較したとき、同一の緩衝液を含有し、かつ、同一のオートクレーブ滅菌を受けた。液体組成物における疎水性修飾は、粘着物がより付着性になるための、または、粘着物がより付着性にならないための環境的選択を生じさせることができる。表面特性の変化は、ナノ構造によって持ち込まれ、これにより、水の疎水的能力における変化を生じさせる新しい秩序によって説明されるかもしれない。
その変化した表面付着性により細菌付着を変化させる本発明の液体組成物の能力を調べた。液体組成物による培地は、何らかの有機物またはPH改変を除外して、コントロール培地と比較したとき、同一の緩衝液を含有し、かつ、同一のオートクレーブ滅菌を受けた。液体組成物における疎水性修飾は、粘着物がより付着性になるための、または、粘着物がより付着性にならないための環境的選択を生じさせることができる。表面特性の変化は、ナノ構造によって持ち込まれ、これにより、水の疎水的能力における変化を生じさせる新しい秩序によって説明されるかもしれない。
実施例9
電気化学的析出試験
本発明の液体組成物は擬二次元セルにおいて一連の電気化学的析出試験に供されている。
電気化学的析出試験
本発明の液体組成物は擬二次元セルにおいて一連の電気化学的析出試験に供されている。
実験構成
実験構成が図16a〜図16cに示される。擬二次元セル20は、直径が125mmであり、Plexiglassのベース部22およびPlexiglassのカバー部24を含んでいた。カバー部24がベース部22に置かれたとき、擬二次元の空洞(高さが約1mmである)が形成された。2つの同心状の電極26がセル20に配置され、12.4V±0.1Vの電源28に接続された。外側電極がリング(直径が90mmである)として形状化され、0.5mmの銅ワイヤから作製された。内側電極が、0.1mmの厚さおよび28mmの直径を有するディスクとして形状化された。外側電極を電源の正極に接続し、内側電極をその負極に接続した。
実験構成が図16a〜図16cに示される。擬二次元セル20は、直径が125mmであり、Plexiglassのベース部22およびPlexiglassのカバー部24を含んでいた。カバー部24がベース部22に置かれたとき、擬二次元の空洞(高さが約1mmである)が形成された。2つの同心状の電極26がセル20に配置され、12.4V±0.1Vの電源28に接続された。外側電極がリング(直径が90mmである)として形状化され、0.5mmの銅ワイヤから作製された。内側電極が、0.1mmの厚さおよび28mmの直径を有するディスクとして形状化された。外側電極を電源の正極に接続し、内側電極をその負極に接続した。
最初に、この実験構成を使用して、電気化学的析出プロセスを、本発明の液体組成物に対して直接、また、比較のために、逆浸透(RO)水から構成されるコントロール溶液に対して行った。
次に、この実験構成を使用して、電気化学的析出の形跡を残す液体組成物の能力を下記のように調べた。液体組成物をセル20に入れた。べース部22と30分間にわたって接触させた後、液体組成物をRO水で置き換え、電気化学的析出プロセスをRO水に対して行った。
結果
図17a〜図17bは本発明の液体組成物(図17a)およびコントロール(図17b)の電気化学的析出を示す。密集した枝分かれ形態と、樹枝状成長との間での移行が液体組成物において観測された。密集した枝分かれ形態は負極の表面から数ミリメートルの距離にわたって広がった。コントロールでは、密集した枝分かれ形態が、負極の近い近傍でのみ観測されただけであり、形態の移行は全く観測されなかった。
図17a〜図17bは本発明の液体組成物(図17a)およびコントロール(図17b)の電気化学的析出を示す。密集した枝分かれ形態と、樹枝状成長との間での移行が液体組成物において観測された。密集した枝分かれ形態は負極の表面から数ミリメートルの距離にわたって広がった。コントロールでは、密集した枝分かれ形態が、負極の近い近傍でのみ観測されただけであり、形態の移行は全く観測されなかった。
図18は、本発明の液体組成物と30分間にわたって接触していたセルにおけるRO水の電気化学的析出を示す。図18および図17bを比較すると、液体組成物はセルの表面に明確な形跡を残しており、従って、セルの表面における枝分かれ形態および樹枝状形態の形成を可能にすることを認めることができる。そのような形成は、RO水が清浄なセルに置かれた図17bには存在しない。
電気化学的析出の形跡をセル上に保つ液体組成物の能力は、液体組成物とのインキュベーションの後でセル表面によってRO水に誘導される遠距離の秩序として説明することができる。
実施例10
細菌コロニーの成長
枯草菌のコロニー成長を本発明の液体組成物の存在下で調べた。コントロール群はRO水の存在下での同じ細菌を含んだ。
細菌コロニーの成長
枯草菌のコロニー成長を本発明の液体組成物の存在下で調べた。コントロール群はRO水の存在下での同じ細菌を含んだ。
図19a〜図19bは液体組成物(図19a)およびコントロール(図19b)について24時間後の枯草菌のコロニー成長の結果を示す。示されるように、本発明の液体組成物はコロニー成長を著しく促進させている。
本発明の液体組成物の特異な特徴をさらに明らかにするために、さらなる実験を、液体組成物のナノ構造が形成される原料粉末と、RO水との混合物を、上記でさらに詳述されるような製造プロセスを用いることなく使用して行った。この混合物は以降、原料源粉末(SP)水として示される。
図20a〜図20cは、SP水(図20a)、RO水(図20b)および液体組成物(図20c)について枯草菌のコロニー成長の結果を示す。示されるように、SP水の存在下でのコロニー成長は、RO水におけるコロニー成長よりも一層遅く、このことは、原料自体が細菌に対して負の影響を有することを示している。他方で、本発明の液体組成物はコロニー成長を著しく促進させている。だが、原理上、液体組成物は同じ物質から構成されている。
実施例11
固相マトリックスに対する高分子の結合
無数の生物学的な処理および反応が固相マトリックス(例えば、マイクロ滴定プレート、メンブラン、ビーズおよびチップなど)において行われる。固相マトリックスは、例えば、疎水的性質、親水的性質、電気的性質(例えば、荷電、極性)および親和性性質をはじめとする種々の物理的性質および化学的性質を有し得る。
固相マトリックスに対する高分子の結合
無数の生物学的な処理および反応が固相マトリックス(例えば、マイクロ滴定プレート、メンブラン、ビーズおよびチップなど)において行われる。固相マトリックスは、例えば、疎水的性質、親水的性質、電気的性質(例えば、荷電、極性)および親和性性質をはじめとする種々の物理的性質および化学的性質を有し得る。
本実施例において記載される実験の目的は、異なる物理的性質および化学的性質を有するマイクロ滴定プレートおよびメンブランへの生物学的物質の結合に対する本発明の液体組成物の影響を調べることであった。
方法
下記のマイクロ滴定プレート(すべてがNUNC(商標)によって製造される)を使用した:(i)MaxiSorp(商標)(これは親水性/疎水性の混合領域を含有し、IgGおよび他の分子の大きい結合容量およびそれらに対する大きい結合親和性によって特徴づけられる(IgGの結合容量は650ng/cm2に等しい));(ii)PolySorp(商標)(これは疎水性表面を有し、脂質の大きい結合容量および脂質に対する大きい結合親和性によって特徴づけられる);(iii)MediumSorp(商標)(これはPolySorp(商標)とMaxiSorp(商標)との間の表面化学を有し、タンパク質の大きい結合容量およびタンパク質に対する大きい結合親和性によって特徴づけられる);(iv)Non−Sorp(商標)(これは、生体分子の低い結合容量および生体分子の低い結合親和性によって特徴づけられる非処理のマイクロ滴定プレートである);および(v)MultiSor(商標)(これは親水性表面を有し、グリカンの大きい結合容量およびグリカンに対する大きい結合親和性によって特徴づけられる)。
下記のマイクロ滴定プレート(すべてがNUNC(商標)によって製造される)を使用した:(i)MaxiSorp(商標)(これは親水性/疎水性の混合領域を含有し、IgGおよび他の分子の大きい結合容量およびそれらに対する大きい結合親和性によって特徴づけられる(IgGの結合容量は650ng/cm2に等しい));(ii)PolySorp(商標)(これは疎水性表面を有し、脂質の大きい結合容量および脂質に対する大きい結合親和性によって特徴づけられる);(iii)MediumSorp(商標)(これはPolySorp(商標)とMaxiSorp(商標)との間の表面化学を有し、タンパク質の大きい結合容量およびタンパク質に対する大きい結合親和性によって特徴づけられる);(iv)Non−Sorp(商標)(これは、生体分子の低い結合容量および生体分子の低い結合親和性によって特徴づけられる非処理のマイクロ滴定プレートである);および(v)MultiSor(商標)(これは親水性表面を有し、グリカンの大きい結合容量およびグリカンに対する大きい結合親和性によって特徴づけられる)。
CORNING(商標)(Costar)の下記のマイクロ滴定プレートを使用した:(i)中程度の結合性のマイクロ滴定プレート(これは親水性表面を有し、IgGに対する結合容量が250ng/cm2である);(ii)炭素結合性のマイクロ滴定プレート(これは炭水化物に共有結合的にカップリングする);(iii)高結合性のマイクロ滴定プレート(これは大きい吸着容量を有する);および(iv)高結合性の黒色のマイクロ滴定プレート(これもまた大きい吸着容量を有する)。
上記マイクロ滴定プレートに対する生体分子の結合効率を、イオン強度、緩衝液pH、温度および時間の4つのカテゴリーにおいて試験した。
結合実験を、蛍光標識された生体分子、または、同じタイプの標識された生体分子および標識されていない生体分子の混合物でマイクロ滴定プレートをコーティングし、非結合分子を洗浄によって除き、プレート上に残留する蛍光シグナルを測定することによって行った。
下記のプロトコルを用いた:
1)蛍光性の標識された生体分子を結合緩衝液で種々の濃度(典型的には0.4μg/ml〜0.02μg/ml)に予備希釈する。各1組の希釈を2つの結合緩衝液で行った:(i)本発明の液体組成物および(ii)コントロールのRO水。
2)各濃度からの100μlのサンプルをマイクロ滴定プレートに(三連で)分注し、最初の蛍光レベルを測定する。
3)プレートを4℃で一晩または37℃で2時間インキュベーションする。
4)コーティング溶液を捨てる。
5)150μlの洗浄液を各ウエルに加え、室温で5分間振とうする。この洗浄工程を3回繰り返した。典型的な洗浄液は、1xPBS(pH7.4)、0.05%Tween20(商標)、および0.06M NaClを含む。
6)0.01Mの水酸化ナトリウムを含む200μlの蛍光読み取り溶液を加え、室温で180分または一晩インキュベーションする。
7)485nmの励起波長、535nmの放射波長および10フラッシュの最適なゲインを用いて、蛍光底部モードを使用して蛍光を読み取る。
1)蛍光性の標識された生体分子を結合緩衝液で種々の濃度(典型的には0.4μg/ml〜0.02μg/ml)に予備希釈する。各1組の希釈を2つの結合緩衝液で行った:(i)本発明の液体組成物および(ii)コントロールのRO水。
2)各濃度からの100μlのサンプルをマイクロ滴定プレートに(三連で)分注し、最初の蛍光レベルを測定する。
3)プレートを4℃で一晩または37℃で2時間インキュベーションする。
4)コーティング溶液を捨てる。
5)150μlの洗浄液を各ウエルに加え、室温で5分間振とうする。この洗浄工程を3回繰り返した。典型的な洗浄液は、1xPBS(pH7.4)、0.05%Tween20(商標)、および0.06M NaClを含む。
6)0.01Mの水酸化ナトリウムを含む200μlの蛍光読み取り溶液を加え、室温で180分または一晩インキュベーションする。
7)485nmの励起波長、535nmの放射波長および10フラッシュの最適なゲインを用いて、蛍光底部モードを使用して蛍光を読み取る。
上記プレートへの糖タンパク質(フルオレセインイソチオシアナート(FITX)により標識されているか、また標識されていない150000DのIgG)の結合効率に対する本発明の組成物の影響を調べた。IgGは、主に親水性分子の混合物から構成されるポリクローナル抗体である。この分子は、共通領域において炭水化物の親水性領域を有し、かつ、可変領域においてわずかに疎水性である。そのようなタイプの分子は、MaxiSorp(商標)プレートに非常に大きい効率(650ng/cm2)で結合することが知られている。
下記のタイプの本発明の液体組成物を使用した:LC1、LC2、LC3、LC4、LC5およびLC6(これらは本明細書中上記においてさらに詳述される通りである)。
下記の表13には、IgGについて行われた6回のアッセイがまとめられる。表13において、標識抗体のみが使用されたアッセイがAb*として表され、標識抗体および非標識抗体の混合物が使用されたアッセイがAb*/Abとして表される。
ピーナッツ(Arachis hypogaea)アグルチニン(PNA)の結合効率に対する本発明の液体組成物の影響をMaxSorp(商標)プレートおよびNon−Sorp(商標)プレートに関して調べた。PNAは110000ダルトンのレクチンであり、それぞれが約27000ダルトンである4つの同一の糖タンパク質サブユニットから構成される。PNAレクチンは、親水性領域を介して、特定の立体配座の糖残基を有する糖タンパク質および糖脂質と結合する。PNAはまた、疎水性領域を有する。PNA*として表されるアッセイは3つのコーティング緩衝液の使用を含んでいた:(i)炭酸塩緩衝液(pH9.6)、(ii)酢酸塩緩衝液(pH4.6)、および(iii)リン酸塩緩衝液(pH7.4)。下記の表14には、実験がまとめられる。
核酸の結合効率に対する本発明の液体組成物の影響を、MaxSorp(商標)プレート、Polysorp(商標)プレートおよびNon−Sorp(商標)プレートに関して調べた。一般に、DNA分子はポリスチレンプレートには良好に結合しない。より一層問題的であるのは、数千ダルトンの分子量を有する小さい一本鎖DNA分子であるオリゴヌクレオチドの結合である。下記の表15には、標識されたオリゴヌクレオチドの結合について行われた実験がまとめられる。このアッセイはOligo*として表される。
IgGの結果および考察
図21a〜図22dは、中程度Costar(商標)プレート(a)、Non−Sorp(商標)プレート(b)、Maxisorp(商標)プレート(c)およびPolysorp(商標)プレート(d)に対するAb*/Abアッセイの結果(図21a〜図21d)およびAb*アッセイの結果(図22a〜図22d)を示す。本発明の液体組成物を使用して得られた結果が中塗り記号(三角、四角など)により表され、コントロールの結果が白記号により表される。直線は線形回帰近似に対応する。結合効率を直線の勾配によって推定することができ、それにより、より大きい勾配はより良好な結合効率に対応する。
図21a〜図22dは、中程度Costar(商標)プレート(a)、Non−Sorp(商標)プレート(b)、Maxisorp(商標)プレート(c)およびPolysorp(商標)プレート(d)に対するAb*/Abアッセイの結果(図21a〜図21d)およびAb*アッセイの結果(図22a〜図22d)を示す。本発明の液体組成物を使用して得られた結果が中塗り記号(三角、四角など)により表され、コントロールの結果が白記号により表される。直線は線形回帰近似に対応する。結合効率を直線の勾配によって推定することができ、それにより、より大きい勾配はより良好な結合効率に対応する。
図21a〜図22dに示されるように、本発明の液体組成物を使用して得られた勾配は、コントロール実験で得られた勾配よりも急である。従って、本発明の液体組成物は結合効率を高めることができる。本発明の液体組成物の増強結合能がSrとして表され、これは、それぞれの図における2つの勾配の比率として定義され、その結果、Sr>1は結合増強に対応し、Sr<1は結合抑制に対応する。図21a〜図21dで得られた勾配について計算されたSrパラメーターの値はそれぞれ、1.32、2.35、1.62および2.96であり、図22a〜図22dで得られた勾配について計算されたSrパラメーターの値はそれぞれ、1.42、1.29、1.10および1.71であった。
図23a〜図24dは、NonSorp(商標)プレート(a)、中程度Costar(商標)プレート(b)、PolySorp(商標)プレート(c)およびMaxiSorp(商標)プレート(d)における4℃での一晩のインキュベーションについてのAb*アッセイの結果(図23a〜図23d)および37℃での2時間のインキュベーションについてのAb*アッセイの結果(図24a〜図24d)を示す。図21a〜図22dと同様に、本発明の液体組成物およびコントロールを使用して得られた結果が中塗り記号および白記号によりそれぞれ表される。図23a〜図24dに示されるように、2つの発生事例(NonSorp(商標)プレートにおける一晩のインキュベーション、および、PolySorp(商標)プレートにおける2時間のインキュベーション)を除いて、本発明の液体組成物を使用して得られた勾配は、コントロール実験で得られた勾配よりも急である。具体的には、図23a〜図23dについて得られたSrパラメーターの計算値はそれぞれ、0.94、1.10、1.20および1.27であり、一方、図24a〜図24dについて得られたSrパラメーターの計算値はそれぞれ、1.16、1.35、0.94および1.11であった。
図25a〜図26dは、中程度Costar(商標)プレート(a)、PolySorp(商標)プレート(b)、MaxiSorp(商標)プレート(c)およびNonSorp(商標)プレート(d)における4℃での一晩のインキュベーションについてのAb*/Abアッセイの結果(図25a〜図25d)および室温での一晩のインキュベーションについてのAb*/Abアッセイの結果(図26a〜図26d)を示す。図25a〜図26dに示されるように、1つの発生事例(non−sorpプレートにおける室温でのインキュベーション)を除いて、本発明の液体組成物を使用して得られた勾配は、コントロール実験で得られた勾配よりも急である。具体的には、図25a〜図25dについて得られたSrパラメーターの計算値はそれぞれ、1.15、1.25、1.07および2.10であり、図26a〜図26dについて得られたSrパラメーターの計算値はそれぞれ、1.30、1.48、1.38および0.84であった。
種々の洗浄プロトコルが、中程度Costar(商標)プレートを使用して図27a〜図27dにおいて比較される。図27a〜図27bは、リン酸塩緩衝液が洗浄緩衝液として使用されたときのAb*/Abアッセイの結果(図27a)およびAb*アッセイの結果(図27b)を示し、図27c〜図27dは、PBSを使用するAb*/Abアッセイの結果(図27c)およびAb*アッセイの結果(図27d)を示す。Ab*/AbアッセイおよびAb*アッセイについてのSrパラメーターの計算値(図27a〜図27d)はそれぞれ、1.03、0.97、1.04および0.76であった。
図28a〜図28bは、中程度Costar(商標)プレートが4℃での一晩のインキュベーションのために使用された1回の実験の結果を示す(表13における最初の実験を参照のこと)。この実験で示されるように、Srパラメーターの計算値は、Ab*/Abアッセイについては0.37であり(図28a)、Ab*アッセイについては0.67であった(図28b)。
下記の表17には、図21a〜図28bの結果が上記プレートのそれぞれについて結合増強(Sr>1)および結合抑制(Sr<1)に関してまとめられる。
表17および図21a〜図28bにおいて明らかにされるように、本発明の液体組成物はIgG結合を高め、MaxiSorp(商標)プレートおよびPolySorp(商標)プレートにおいてより顕著な効果を有する。
レクチンの結果および考察
図29a〜図29cは、酢酸塩緩衝液(図29a)、炭酸塩緩衝液(図29b)およびリン酸塩緩衝液(図29c)についてのNon−Sorp(商標)プレートに対するPNA吸収アッセイの結果を示す。図29a〜図29cにおいて、本発明の液体組成物を使用して得られた結果が白記号により表され、コントロールの結果が中塗り記号により表される。
図29a〜図29cは、酢酸塩緩衝液(図29a)、炭酸塩緩衝液(図29b)およびリン酸塩緩衝液(図29c)についてのNon−Sorp(商標)プレートに対するPNA吸収アッセイの結果を示す。図29a〜図29cにおいて、本発明の液体組成物を使用して得られた結果が白記号により表され、コントロールの結果が中塗り記号により表される。
酢酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液およびリン酸塩緩衝液についてのSrパラメーターの計算値はそれぞれ、0.65、0.75および0.78であった。従って、3つの緩衝液のすべてにおいて、本発明の液体組成物はPNAの結合を著しく阻害している。
図30a〜図30dは、炭酸塩コーティング緩衝液(図30a〜図30b)、酢酸塩コーティング緩衝液(図30c)およびリン酸塩コーティング緩衝液(図30d)においてMaxiSorp(商標)プレートが使用されたPNA吸収アッセイの結果を示す。図29a〜図29cの場合と同様な記号が表示のために使用された。図30aを参照すると、炭酸塩緩衝液に関して、2相性の曲線が得られ、この場合、影響が観測されなかった低いタンパク質濃度における直線部分と、本発明の液体組成物がPNAの結合を著しく阻害する(約0.72を超える)高いタンパク質濃度における非直線部分とが存在した。図30bはグラフの直線部分を表し、Srパラメーターの計算値は炭酸塩緩衝液については1.01である。酢酸塩緩衝液およびリン酸塩緩衝液についてのSrパラメーターの計算値はそれぞれ、0.91および0.83であった。このことは、本発明の液体組成物がPNAの結合を阻害する類似した傾向を示している。
PNA*アッセイの結果が、結合増強(Sr>1)および結合抑制(Sr<1)に関して下記の表18にまとめられる。
従って、Non−Sorp(商標)プレートでは、阻害はこれらの異なる緩衝液(pH)によって影響されなかった。他方で、MaxiSorp(商標)プレートでは、顕著な影響が、曲線が飽和した炭酸塩緩衝液において観測された。このことは、4つのサブユニットの解離、これにより、競合する分子の数が効果的に増大することによって説明することができる。
2つのタンパク質(IgGおよびPNA)がMaxiSorp(商標)プレートに関しては逆の様式で挙動することに留意すること。このことは、本発明の液体組成物がタンパク質の分子構造に影響を及ぼしていることを示している。
オリゴヌクレオチドの結果および考察
オリゴヌクレオチドは酢酸塩コーティング緩衝液においてMaxiSorp(商標)プレートにだけ結合した。
オリゴヌクレオチドは酢酸塩コーティング緩衝液においてMaxiSorp(商標)プレートにだけ結合した。
下記の表19には、酢酸塩コーティング緩衝液においてMaxiSorp(商標)プレートが使用されたアッセイに関して平均された、オリゴヌクレオチドの9つの異なる濃度および4つの異なる実験条件についてSrパラメーターの得られた値がまとめられる。
図31a〜図31bは、表19に示されたSrパラメーターの平均値を示し、図31aには、それぞれの実験条件についての平均値が示され、図31bには、すべての実験条件について等しい重さによる全平均が示される。
図31a〜図31bに示されるように、Srパラメーターの平均値は1よりも著しく大きく、より高濃度のオリゴヌクレオチドについては結合効率がより大きかった。従って、本発明の液体組成物は、コーティング緩衝液への塩の添加により、また、コーティング緩衝液に塩を添加することなく、結合効率を高めることができると結論することができる。
酢酸塩緩衝液が、水溶液中のDNAを沈殿させるために使用されることは一般に知られていることである。そのような条件のもとで、DNA分子は相互作用して、プレートの底で沈殿する「塊」を形成し、これは高濃度の領域をもたらし、それにより、結合する確率を増大させ、かつ、より大きいシグナルを結合事象あたり生じさせる。分子間相互作用が塊形成機構と競合する。コントロールの水とは対照的に、本発明の液体組成物は、より高濃度については塊形成の強化を抑制することができる。
本発明の液体組成物から構成される酢酸塩緩衝液を使用したときのMaxiSorp(商標)プレートにおけるDNAのより大きい結合効率は、DNA分子を少なくとも部分的に解きほぐすことができる本発明の液体組成物の能力を明らかにしている。本発明のこの特徴はまた、下記の実施例14においてさらに詳述されるように、DNA電気泳動実験において観測された。
実施例12
DNAの単離および精製
核酸(DNAおよびRNA)は、生命科学における研究者によって使用される基本的かつ最も重要な物質である。遺伝子機能、生体分子産生および薬物開発(ファルマコゲノミクス)はすべてが、核酸技術を日常的に応用する分野である。典型的には、PCR技術が、DNAまたはRNAの特定の配列を増大させるために必要とされる。抽出されたDNAまたはRNAは最初に精製される。研究中の特定の領域を増幅した後、配列が、オリゴヌクレオチドプライマー、プライマーダイマー、デオキシヌクレオチド塩基(A、T、C、G)および塩から精製され、続いて確認される。
DNAの単離および精製
核酸(DNAおよびRNA)は、生命科学における研究者によって使用される基本的かつ最も重要な物質である。遺伝子機能、生体分子産生および薬物開発(ファルマコゲノミクス)はすべてが、核酸技術を日常的に応用する分野である。典型的には、PCR技術が、DNAまたはRNAの特定の配列を増大させるために必要とされる。抽出されたDNAまたはRNAは最初に精製される。研究中の特定の領域を増幅した後、配列が、オリゴヌクレオチドプライマー、プライマーダイマー、デオキシヌクレオチド塩基(A、T、C、G)および塩から精製され、続いて確認される。
材料および方法
PCR生成物の増幅に対する本発明の液体組成物の影響を、Promega社のキット「Wizard−PCR preps DNA精製システム」(A7170)の再構築によって調べた。
PCR生成物の増幅に対する本発明の液体組成物の影響を、Promega社のキット「Wizard−PCR preps DNA精製システム」(A7170)の再構築によって調べた。
Promega社のWizard(商標)キットの使用は下記の工程を伴う:
1)精製緩衝液をPCRサンプルと混合して、DNAを樹脂に結合させるための条件を作る。
2)DNAを樹脂に結合させるために樹脂懸濁物をPCR混合物と混合し、樹脂サンプルをシリンジに加え、真空を生じさせる。
3)イソプロパノールを加え、溶液を真空によって吸引し、非結合のDNAを除く。
4)結合したDNAを水により溶出する。
5)ゲル電気泳動を本明細書中下記でさらに詳述されるように行う。
1)精製緩衝液をPCRサンプルと混合して、DNAを樹脂に結合させるための条件を作る。
2)DNAを樹脂に結合させるために樹脂懸濁物をPCR混合物と混合し、樹脂サンプルをシリンジに加え、真空を生じさせる。
3)イソプロパノールを加え、溶液を真空によって吸引し、非結合のDNAを除く。
4)結合したDNAを水により溶出する。
5)ゲル電気泳動を本明細書中下記でさらに詳述されるように行う。
キットの再構成を、キットとともに供給された本来の水(以降、コントロール)を用いて、あるいは、工程1、工程2および工程3について、キットの水溶液をRO水または本発明の液体組成物のいずれかで置き換えることによって行った。工程3では、キットに見出されるのと同一の80%イソプロパノール溶液をすべての実験において使用した。
下記のプロトコルをゲル電気泳動のために使用した:
(a)ゲル溶液:8%PAGE(+尿素)を下記の表20に従ってRO水または本発明の液体組成物のいずれかにより調製した。
(b)405μlの10%APSおよび55μlのTEMED(Sigma、T−7024)を含有する重合試薬を50mlのゲル溶液に加える。
(c)ゲル溶液をゲルカセット(Rhenium Ltd、Novex NC2015、09−01505−C2)に注ぎ、プラスチックコームを置き、室温で30分間重合させる。
(d)コームを除き、テープを剥がして、1つのデバイスの2つの向き合う側での2つのゲルの組み立てを可能にする。
(e)内側チャンバーをゲルの上端まで、外側チャンバーをゲルの高さの約1/5まで泳動緩衝液(RO水または本発明の液体組成物のいずれかでの1xTBE)で満たす。
(f)サンプルを、TBE、フィコール、ブロモフェノールブルーおよび尿素を含有するサンプル緩衝液(SBU)で希釈することによってサンプルを調製し、DNAサンプルと1:1で混合する。
(g)ミックスの8μl〜10μlを各ウエルに負荷する。
(h)電源を100Vに設定し、着色色素(ブロモフェノールブルー)が底部から1cmに達するまでDNAを移動させ続ける。
(a)ゲル溶液:8%PAGE(+尿素)を下記の表20に従ってRO水または本発明の液体組成物のいずれかにより調製した。
(b)405μlの10%APSおよび55μlのTEMED(Sigma、T−7024)を含有する重合試薬を50mlのゲル溶液に加える。
(c)ゲル溶液をゲルカセット(Rhenium Ltd、Novex NC2015、09−01505−C2)に注ぎ、プラスチックコームを置き、室温で30分間重合させる。
(d)コームを除き、テープを剥がして、1つのデバイスの2つの向き合う側での2つのゲルの組み立てを可能にする。
(e)内側チャンバーをゲルの上端まで、外側チャンバーをゲルの高さの約1/5まで泳動緩衝液(RO水または本発明の液体組成物のいずれかでの1xTBE)で満たす。
(f)サンプルを、TBE、フィコール、ブロモフェノールブルーおよび尿素を含有するサンプル緩衝液(SBU)で希釈することによってサンプルを調製し、DNAサンプルと1:1で混合する。
(g)ミックスの8μl〜10μlを各ウエルに負荷する。
(h)電源を100Vに設定し、着色色素(ブロモフェノールブルー)が底部から1cmに達するまでDNAを移動させ続ける。
下記のプロトコルを、ゲル染色、可視化、写真撮影および分析のために使用した:
(a)ゲルを、1U/μlのGelStar(商標)を1xTBEに含有する染色液に5分間入れる。この間、振とうする。
(b)ゲルを、30分間、1xTBE緩衝液において脱染色する。
(c)ゲルをU.V.台に置く;DNAを見るために365nmの光を使用する。
(d)DC120(商標)デジタルカメラを使用して、ゲルを写真撮影し、さらなる分析のためにデジタル情報を保存する。
(a)ゲルを、1U/μlのGelStar(商標)を1xTBEに含有する染色液に5分間入れる。この間、振とうする。
(b)ゲルを、30分間、1xTBE緩衝液において脱染色する。
(c)ゲルをU.V.台に置く;DNAを見るために365nmの光を使用する。
(d)DC120(商標)デジタルカメラを使用して、ゲルを写真撮影し、さらなる分析のためにデジタル情報を保存する。
PCRを、下記のプロトコル(100回分の反応について)に従って、ApoE遺伝子特異的プライマー(フラグメントサイズ、265bp)を使用してヒトDNA(Promega G3041)から調製した:
(a)適切なシリアル番号に従って0.2μlのPCR用チューブに印を付ける。
(b)2.5μlの40μg/ml ヒトDNA(Promega、G3041)または水を関連チューブに加える。
(c)14.5μlのDDWにより17μlに調節する。
(d)3630μlのPCRミックスを表21(下記参照)に従って調製する。
(e)33μlのPCRミックスを各チューブに加える。
(f)サンプルをPCR装置に入れる。
(g)PCRプログラムを表22(下記参照)に従って作動させる。
(h)5μlの各生成物を8%PAGEゲルで分析する。
(i)反応液を−20℃で保存する。
(a)適切なシリアル番号に従って0.2μlのPCR用チューブに印を付ける。
(b)2.5μlの40μg/ml ヒトDNA(Promega、G3041)または水を関連チューブに加える。
(c)14.5μlのDDWにより17μlに調節する。
(d)3630μlのPCRミックスを表21(下記参照)に従って調製する。
(e)33μlのPCRミックスを各チューブに加える。
(f)サンプルをPCR装置に入れる。
(g)PCRプログラムを表22(下記参照)に従って作動させる。
(h)5μlの各生成物を8%PAGEゲルで分析する。
(i)反応液を−20℃で保存する。
結果
明確にするために、本実施例および下記の実施例では、コントロールは「CO」と略記され、逆浸透水は「RO」と略記され、本発明の液体組成物は「LC」と略記される。
明確にするために、本実施例および下記の実施例では、コントロールは「CO」と略記され、逆浸透水は「RO」と略記され、本発明の液体組成物は「LC」と略記される。
図32は、本実施例では実験3として示される実験における50μlのPCR生成物サンプルの画像である。図32には11個のレーンがあり、レーン1は精製前のPCR生成物に対応し、レーン7はラダーマーカーであり、レーン2〜6および8〜11は、上記の工程1、工程2および工程4の下記の組合せに対応する:CO/CO/CO溶出1(レーン2)、RO/RO/RO溶出1(レーン3)、LC/LC/LC溶出1(レーン4)、CO/CO/CO溶出2(レーン5)、RO/RO/RO溶出2(レーン6)、LC/LC/LC溶出2(レーン8)、CO/CO/CO溶出3(レーン9)、RO/RO/RO溶出3(レーン10)、およびLC/LC/LC溶出3(レーン11)。
3つのアッセイ系はすべてが、類似する精製特徴を示している。低M.W.分子(100bp未満)の効率的な除去が明らかにされる。望まれない分子には、プライマーおよびそのダイマー、ならびに、ヌクレオチド塩基が含まれる。
図33a〜図33bは、溶出1(図33a)および溶出2(図33b)について、本実施例では実験4として示される実験における50μlのPCR生成物サンプルの画像である。図33a〜図33bには11個のレーンがあり、レーン6はラダーマーカーであり、レーン1〜5および7〜13は下記の組合せに対応する:CO/CO/CO(レーン1)、RO/RO/RO(レーン2)、LC/LC/LC(レーン3)、CO/LC/LC(レーン4)、CO/RO/RO(レーン5)、CO/CO/LC(レーン7)、CO/CO/RO(レーン8)、CO/LC/CO(レーン9)、CO/RO/CO(レーン10)、LC/LC/CO(レーン11)、RO/RO/CO(レーン12)、LC/LC/LC(レーン13)、この場合、レーン13では、異なる濃度が本発明の液体組成物について使用された。
図34a〜図34bは、溶出1(図34a)および溶出2(図34b)について、本実施例では実験5として示される実験における50μlのPCR生成物サンプルの画像である。図34a〜図34bにおいて、レーン4はラダーマーカーであり、レーン1〜3および5〜13は下記の組合せに対応する:CO/CO/CO(レーン1)、RO/RO/RO(レーン2)、LC/LC/LC(レーン3)、CO/LC/LC(レーン5)、CO/RO/RO(レーン6)、CO/CO/LC(レーン7)、CO/CO/RO(レーン8)、CO/LC/CO(レーン9)、CO/RO/CO(レーン10)、LC/LC/CO(レーン11)、RO/RO/CO(レーン12)、およびLC/CO/CO(レーン13)。図34aにおけるレーン14はRO/CO/COの組合せに対応する。
図35a〜図35bは、溶出1(図35a)および溶出2(図35b)について、本実施例では実験6として示される実験における50μlのPCR生成物サンプルの画像である。図35a〜図35bにおいて、レーン1〜13は、図34aの場合と同じ組合せに対応し、レーン15は精製前のPCR生成物に対応する。
実施例13
カラム容量
本実施例では、カラム容量に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた。100個のPCR反応液(それぞれが実施例12のプロトコルに従って調製された)を調製し、一緒にして、5mlのストック溶液を作製した。実験(本実施例では実験7として示される)は2つの工程を含んでいた:予備的な工程(以降、工程A)が、結合および溶出のときにカラムに加えられる体積の影響を調べることに向けられ、最初の工程(以降、工程B)が、カラム容量に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられた。
カラム容量
本実施例では、カラム容量に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた。100個のPCR反応液(それぞれが実施例12のプロトコルに従って調製された)を調製し、一緒にして、5mlのストック溶液を作製した。実験(本実施例では実験7として示される)は2つの工程を含んでいた:予備的な工程(以降、工程A)が、結合および溶出のときにカラムに加えられる体積の影響を調べることに向けられ、最初の工程(以降、工程B)が、カラム容量に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられた。
工程Aにおいて、4個のカラム(カラム1〜4)に、50μl、150μl、300μlまたは600μlのストックPCR生成物溶液が加えられ、また、13個のカラム(5〜17)に、300μlのストックPCR溶液が加えられた。すべてのカラムを50μlの水により溶出した。溶出された溶液を下記の順でレーン7〜10に負荷した:レーン7(PCR原液、濃度係数、x1)、レーン8(原液、x3)、レーン9(x6)およびレーン10(x12)。カラム5〜17(x6)からのすべての溶出液の「ミックス」をレーン11に負荷した。レーン1〜5には、カラム1〜4からの溶出液、および、カラムの5〜17の「ミックス」が、元の濃度(x1)に事前に希釈されて負荷された。レーン6はラダーマーカーであった。
下記のプロトコルを工程Aでは用いた:
1)各サンプルについてWizar(商標)ミニカラムおよびシリンジに印を付け、真空マニホールドに入れる。
2)100μlのそれぞれの直接のPCR精製緩衝液溶液をミクロチューブに分注する。
3)軽くボルテックス撹拌する。
4)1mlのそれぞれの樹脂溶液を加え、1分間、3回軽くボルテックス撹拌する。
5)樹脂/DNAミックスをシリンジに加え、真空を加える。
6)2mlの80%イソプロパノール溶液を各シリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する。
7)真空を30秒間維持することによって樹脂を乾燥する。
8)ミニカラムを1.5mlの微量遠心分離チューブに移す。
9)10000gで2分間遠心分離する。
10)ミニカラムを清浄な1.5mlチューブに移す。
11)50μlの関連する水(ヌクレアーゼ非含有または本発明の液体組成物)を加える。
12)10000gで20秒間遠心分離する。
13)50μlの保存用ミクロチューブに移し、−20℃で保存する。
14)工程11〜13を第2の溶出サイクルについて繰り返す。
可視化工程:
15)6μlの各サンプルを6μlの負荷用緩衝液と混合する。
16)10μlの各ミックスをアクリルアミド尿素ゲル(AAU)に負荷し、ゲルを70V、10mAmpで泳動する。
17)ゲルをGelStar(商標)溶液(50mlのTBEにおける10000u溶液の5μl)により染色し、室温で15分間振とうする。
18)室温で30分間にわたってTBE中で振とうして、ゲルを脱染色する。
19)ゲルを写真撮影する。
1)各サンプルについてWizar(商標)ミニカラムおよびシリンジに印を付け、真空マニホールドに入れる。
2)100μlのそれぞれの直接のPCR精製緩衝液溶液をミクロチューブに分注する。
3)軽くボルテックス撹拌する。
4)1mlのそれぞれの樹脂溶液を加え、1分間、3回軽くボルテックス撹拌する。
5)樹脂/DNAミックスをシリンジに加え、真空を加える。
6)2mlの80%イソプロパノール溶液を各シリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する。
7)真空を30秒間維持することによって樹脂を乾燥する。
8)ミニカラムを1.5mlの微量遠心分離チューブに移す。
9)10000gで2分間遠心分離する。
10)ミニカラムを清浄な1.5mlチューブに移す。
11)50μlの関連する水(ヌクレアーゼ非含有または本発明の液体組成物)を加える。
12)10000gで20秒間遠心分離する。
13)50μlの保存用ミクロチューブに移し、−20℃で保存する。
14)工程11〜13を第2の溶出サイクルについて繰り返す。
可視化工程:
15)6μlの各サンプルを6μlの負荷用緩衝液と混合する。
16)10μlの各ミックスをアクリルアミド尿素ゲル(AAU)に負荷し、ゲルを70V、10mAmpで泳動する。
17)ゲルをGelStar(商標)溶液(50mlのTBEにおける10000u溶液の5μl)により染色し、室温で15分間振とうする。
18)室温で30分間にわたってTBE中で振とうして、ゲルを脱染色する。
19)ゲルを写真撮影する。
工程Bでは、工程Aの「混合された」溶出液を「濃縮されたPCR溶液」として使用し、12個のカラムに加えた。カラム1〜5に、キットの試薬を使用して、8.3μl、25μl、50μl、75μlおよび100μlをそれぞれ加えた。カラムを50μlのキットの水によって溶出し、各溶出液の5μlをゲル上の対応するレーンに加えた。カラム7〜11を、本発明の液体組成物を結合緩衝液および溶出緩衝液として用いたことを除いて、カラム1〜5のように処理した。サンプルを対応するゲルレーンに加えた。カラム13は、工程Aのカラム5〜17の「ミックス」を伴うコントロールとして役立った。
下記のプロトコルを工程Bでは用いた:
1)各サンプルのために使用されるWizar(商標)ミニカラムおよびシリンジに印を付け、真空マニホールドに入れる。
2)100μlのそれぞれの直接のPCR精製緩衝液溶液をミクロチューブに分注する。
3)軽くボルテックス撹拌する。
4)1mlのそれぞれの樹脂溶液を加え、1分間、3回軽くボルテックス撹拌する。
5)樹脂/DNAミックスをシリンジに加え、真空を加える。
6)2mlの80%イソプロパノール溶液を各シリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する。
7)真空を30秒間加え続けることによって樹脂を乾燥する。
8)ミニカラムを1.5mlの微量遠心分離チューブに移す。
9)10000gで2分間遠心分離する。
10)ミニカラムを清浄な1.5mlチューブに移す。
11)50μlのヌクレアーゼ非含有または本発明の液体組成物を加える。
12)10000gで20秒間遠心分離する。
13)50μlの保存用ミクロチューブに移し、−20℃で保存する。
14)工程11〜13を第2の溶出サイクルについて繰り返す。
1)各サンプルのために使用されるWizar(商標)ミニカラムおよびシリンジに印を付け、真空マニホールドに入れる。
2)100μlのそれぞれの直接のPCR精製緩衝液溶液をミクロチューブに分注する。
3)軽くボルテックス撹拌する。
4)1mlのそれぞれの樹脂溶液を加え、1分間、3回軽くボルテックス撹拌する。
5)樹脂/DNAミックスをシリンジに加え、真空を加える。
6)2mlの80%イソプロパノール溶液を各シリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する。
7)真空を30秒間加え続けることによって樹脂を乾燥する。
8)ミニカラムを1.5mlの微量遠心分離チューブに移す。
9)10000gで2分間遠心分離する。
10)ミニカラムを清浄な1.5mlチューブに移す。
11)50μlのヌクレアーゼ非含有または本発明の液体組成物を加える。
12)10000gで20秒間遠心分離する。
13)50μlの保存用ミクロチューブに移し、−20℃で保存する。
14)工程11〜13を第2の溶出サイクルについて繰り返す。
可視化工程は工程Aの場合と同じであった。
結果:
図36〜図37は、工程Aのレーン1〜11の画像(図36)およびSionImage(商標)ソフトウエアを使用する定量分析(図37)を示す。図36に示されるように、レーン8〜11は過負荷である。レーン3およびレーン4は、カラム3およびカラム4が過負荷であり、その結果として、より少ないDNAが溶出サンプルの希釈後に回収されたので、より少ないDNAを含有する。図37に示されるように、DNA負荷体積がより大きいとき、DNA損失が大きくなっている。
図36〜図37は、工程Aのレーン1〜11の画像(図36)およびSionImage(商標)ソフトウエアを使用する定量分析(図37)を示す。図36に示されるように、レーン8〜11は過負荷である。レーン3およびレーン4は、カラム3およびカラム4が過負荷であり、その結果として、より少ないDNAが溶出サンプルの希釈後に回収されたので、より少ないDNAを含有する。図37に示されるように、DNA負荷体積がより大きいとき、DNA損失が大きくなっている。
図38a〜図38cは、溶出1(図38a)、溶出2(図38b)および溶出3(図38c)について工程Bのレーン1〜12の画像を示す。最初の溶出図は、カラムが同じように過負荷であったことを示している。結合容量の違いが第2の溶出において明確に認められる。バンド強度が、レーンの番号と一致して増大している。
対応するレーン1〜5およびレーン7〜11の強度を比較することにより、本発明の液体組成物はキットの試薬よりも多くのDNAと結合できることが示される。
図39a〜図39bは、SionImage(商標)ソフトウエアを使用する定量分析を示し、図39aには、コントロール(図39a〜図39bにおいてCOとして表される)および本発明の液体組成物(図39a〜図39bにおいてLCとして表される)の面積が、3回の溶出のそれぞれについて負荷体積を関数として表され、図39bには、LC/COの比率が示される。溶出3において図39a〜図39bに示されるように、面積は、本発明の液体組成物についてはより大きい。
実施例14
ゲル電気泳動によるDNAの単離
ゲル電気泳動は、サイズおよび形状に基づくDNA分子の決定および単離のための日常的に使用されている方法である。DNAサンプルが、DNA分子を取り囲む泳動緩衝液として役立つゲルの上部部分に加えられる。ゲルは正に荷電しており、電流が加えられたとき、負に荷電したDNAフラグメントをゲルの下流側に移動させる。移動速度は、より小さい分子およびコイル状または折り畳まれた分子についてはより速く、大きい分子および解きほぐされた分子についてはより遅い。移動が完了すると、DNAは蛍光性標識によって標識することができ、UV照明下で可視化される。DNAはまた、メンブランに転写し、酵素による着色によって高感度で可視化することができる。DNAはゲル上のその位置およびバンド強度に従って評価される。
ゲル電気泳動によるDNAの単離
ゲル電気泳動は、サイズおよび形状に基づくDNA分子の決定および単離のための日常的に使用されている方法である。DNAサンプルが、DNA分子を取り囲む泳動緩衝液として役立つゲルの上部部分に加えられる。ゲルは正に荷電しており、電流が加えられたとき、負に荷電したDNAフラグメントをゲルの下流側に移動させる。移動速度は、より小さい分子およびコイル状または折り畳まれた分子についてはより速く、大きい分子および解きほぐされた分子についてはより遅い。移動が完了すると、DNAは蛍光性標識によって標識することができ、UV照明下で可視化される。DNAはまた、メンブランに転写し、酵素による着色によって高感度で可視化することができる。DNAはゲル上のその位置およびバンド強度に従って評価される。
下記は、ゲル電気泳動によるDNA移動に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験の記載である。
材料および方法:
2つのタイプのDNAを使用した:(i)PCR生成物(280塩基対)および(ii)下記のサイズを有する11個のDNAフラグメントから構成されるラダーDNA(80bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900および1030bp)。ゲルを実施例12のプロトコルに従って調製した。
2つのタイプのDNAを使用した:(i)PCR生成物(280塩基対)および(ii)下記のサイズを有する11個のDNAフラグメントから構成されるラダーDNA(80bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900および1030bp)。ゲルを実施例12のプロトコルに従って調製した。
3つの実験を行った。実験1では、PCRバッチ番号181103をレーン2〜10に負荷し、ラダーDNAをレーン1に負荷した。実験2では、PCRバッチ番号31203をレーン2〜11に負荷し、ラダーDNAをレーン1に負荷した。実験3では、PCRバッチ番号31203をレーン1〜5およびレーン7〜11に負荷し、ラダーDNAをレーン6に負荷した。
結果:
図40a〜図42bは、実験1、実験2および実験3についてそれぞれ、RO水の存在下(図40a、図41aおよび図42a)および本発明の液体組成物の存在下(図40b、図41bおよび図42b)における移動速度を比較するDNA画像である。図40a〜図42bの画像において、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともに、同じタイプの液体から構成された。すなわち、図40a、図41aおよび図42aでは、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともにRO水から構成され、一方、図40b、図41bおよび図42bでは、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともに本発明の液体組成物から構成された。
図40a〜図42bは、実験1、実験2および実験3についてそれぞれ、RO水の存在下(図40a、図41aおよび図42a)および本発明の液体組成物の存在下(図40b、図41bおよび図42b)における移動速度を比較するDNA画像である。図40a〜図42bの画像において、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともに、同じタイプの液体から構成された。すなわち、図40a、図41aおよび図42aでは、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともにRO水から構成され、一方、図40b、図41bおよび図42bでは、泳動緩衝液およびゲル緩衝液はともに本発明の液体組成物から構成された。
図40a〜図42bに示されるように、両タイプのDNA(PCR生成物およびラダーDNA)は、本発明の液体組成物との比較で、RO水において著しく速く移動した。
ゲル含有量に対する本発明の液体組成物の影響、および、泳動緩衝液に対するその影響を分ける試みにおいて、上記の実験を、泳動緩衝液およびゲル緩衝液のすべての可能な組合せで繰り返した。
従って、図43a〜図45dは、泳動緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられる実験1(図43a〜図43d)、実験2(図44a〜図44d)および実験3(図45a〜図45d)の画像である。各対の図(すなわち、a〜bおよびc〜dの対)において、ゲルが同じ液体から構成され、泳動緩衝液が異なる。実施例12で導入された略号を使用して、ゲル緩衝液/泳動緩衝液の下記の組合せが図43a〜図45dに示される:図43a〜図43bはそれぞれRO/ROおよびRO/LCの画像であり、図43c〜図43dはそれぞれLC/LCおよびLC/ROの画像であり、図44a〜図44bはそれぞれRO/ROおよびRO/LCの画像であり、図44c〜図44dはそれぞれLC/ROおよびLC/LCの画像であり、図45a〜図45bはそれぞれRO/LCおよびRO/ROの画像であり、図45c〜図45dはそれぞれLC/LCおよびLC/ROの画像である。
図46a〜図48dは、ゲル緩衝液に対する本発明の液体組成物の影響が調べられる実験1(図46a〜図46d)、実験2(図47a〜図47d)および実験3(図48a〜図48d)の画像である。各対の図(a〜bおよびc〜d)において、泳動緩衝液が同じ液体から構成され、しかし、ゲル緩衝液が異なる。具体的には、図46a〜図46bはそれぞれRO/ROおよびLC/ROの画像であり、図46c〜図46dはそれぞれLC/LCおよびRO/LCの画像であり、図47a〜図47bはそれぞれRO/ROおよびLC/ROの画像であり、図47c〜図47dはそれぞれRO/LCおよびLC/LCの画像であり、図48a〜図48bはそれぞれRO/ROおよびLC/ROの画像であり、図48c〜図48dはそれぞれRO/LCおよびLC/LCの画像である。
図43a〜図48dに示されるように、本発明の液体組成物は、RO水と比較したとき、DNA移動の遅れを引き起こしている。電場における著しい変化は観測されなかったことに留意すること。ゲル緩衝液が本発明の液体組成物から構成され、泳動緩衝液がRO水から構成されるとき、この影響はより顕著である。
従って、上記の実験は、本発明の液体組成物の影響のもとでは、DNAの形態が、DNAの折り畳みが低下する(解きほぐされる)様式で変化することを明らかにしている。DNAが本発明の液体組成物において解きほぐされることは、RO水との比較で、より強い水素結合した相互作用がDNA分子と本発明の液体組成物との間に存在することを示しているかもしれない。
実施例15
酵素活性および安定性
酵素活性および安定性の両方を増大させることは、酵素を利用する任意のプロセスの効率を高め、かつ、そのコストを低下させるために重要である。長期間にわたる貯蔵の間、働きが長期にわたる間、そしてまた、過度に希釈されたとき、酵素は典型的には、安定性の喪失、従って、最終的には、活性の喪失の一因になり得るストレスにさらされる。
酵素活性および安定性
酵素活性および安定性の両方を増大させることは、酵素を利用する任意のプロセスの効率を高め、かつ、そのコストを低下させるために重要である。長期間にわたる貯蔵の間、働きが長期にわたる間、そしてまた、過度に希釈されたとき、酵素は典型的には、安定性の喪失、従って、最終的には、活性の喪失の一因になり得るストレスにさらされる。
本実施例では、酵素の活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響が明らかにされる。この研究は、生物工学業界における2つの一般に使用されている酵素(アルカリホスファターゼ(AP)およびβ−ガラクトシダーゼ)に関連する。2つの形態のAPを使用した:非結合型形態、および、APがストレプトアビジンに結合した結合型形態(ST−AP)。
下記は、希釈された酵素に対する本発明の液体組成物の影響が調べられた実験の記載である。希釈を、添加剤を伴うことなく、また、中性pH(7.4)において、RO水または本発明の液体組成物のいずれかで行った。
非結合型形態のアルカリホスファターゼ
材料および方法:
アルカリホスファターゼ(Jackson INC)をRO水または本発明の液体組成物のいずれかで連続希釈した。希釈されたサンプル(1:1000および1:10000)を室温でチューブにおいてインキュベーションした。
材料および方法:
アルカリホスファターゼ(Jackson INC)をRO水または本発明の液体組成物のいずれかで連続希釈した。希釈されたサンプル(1:1000および1:10000)を室温でチューブにおいてインキュベーションした。
種々の時間間隔で、酵素活性を、10μlの酵素を90μlのpNPP溶液(AP特異的な比色測定用基質)と混合することによって求めた。アッセイをマイクロ滴定プレートにおいて行った(それぞれの試験点について少なくとも4回の繰り返し)。色の強度を405nmの波長でELISA読み取り装置によって求めた。
酵素活性を、本明細書中下記でさらに詳述されるように、RO水と、3つの異なる濃度の本発明の液体組成物(LC3、LC7およびLC8)との両方で、各希釈について時間t=0において求めた。安定性を、t=0における活性によって除される22時間後(t=22)の活性および48時間後(t=48)の活性として求めた。
結果&考察:
下記の表23〜表25には、t=0(表23)、t=22(表24)およびt=48(表25)について、1〜6と番号が付けられた6つの実験の平均活性値がまとめられる。実験1〜5のすべてが室温で行われた。
下記の表23〜表25には、t=0(表23)、t=22(表24)およびt=48(表25)について、1〜6と番号が付けられた6つの実験の平均活性値がまとめられる。実験1〜5のすべてが室温で行われた。
表23〜表25に示されるように、LC7、LC8およびLC3の存在下での活性は、RO水の存在下での活性を一貫して上回っている。安定性に対する本発明の液体組成物の影響を定量化するために、安定性強化パラメーターSeを、RO水における安定性によって除された本発明の液体組成物の存在下での安定性として定義した。
図49は、22時間(中塗り三角)および48時間(中塗り四角)についてSeの値を希釈の関数として示す。LC7、LC8およびLC3についてのSeの値が、図49において、青色、赤色および緑色でそれぞれ示される。図49に示されるように、測定された安定化作用は、1:10000の酵素希釈については約2〜3.6の範囲であり、1:1000の希釈については約1.5〜3の範囲である。同じ現象が、少しより小さい程度ではあったが、低い温度で観測された。
結合型形態のアルカリホスファターゼ
酵素を別の分子に結合することにより、典型的には、その安定性が増大する。酵素は、典型的には、高濃度で貯蔵され、所望の希釈度に使用前に希釈されるだけである。下記の実験は、酵素が長期間にわたって高濃度で貯蔵される本発明の液体組成物の安定化作用を調べることに向けられている。
酵素を別の分子に結合することにより、典型的には、その安定性が増大する。酵素は、典型的には、高濃度で貯蔵され、所望の希釈度に使用前に希釈されるだけである。下記の実験は、酵素が長期間にわたって高濃度で貯蔵される本発明の液体組成物の安定化作用を調べることに向けられている。
材料および方法:
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Sigma)をRO水および上記の本発明の液体組成物(LC7、LC7およびLC3)において1:10および1:10000で希釈した。希釈されたサンプルを室温で5日間チューブにおいてインキュベーションした。
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Sigma)をRO水および上記の本発明の液体組成物(LC7、LC7およびLC3)において1:10および1:10000で希釈した。希釈されたサンプルを室温で5日間チューブにおいてインキュベーションした。
すべてのサンプルを1:10000の最終酵素濃度に希釈し、活性を本明細書中上記でさらに詳述されるように求めた。酵素活性を時間t=0および5日後において測定した。
結果および考察:
図50は、RO水および本発明の液体組成物について、1:10の希釈(青色)および1:10000の希釈(赤色)における5日間の貯蔵の後でのコンジュゲート化酵素の活性を示す図である。RO水において、酵素活性は両方の希釈について約0.150のODである。対照的に、本発明の液体組成物の存在下では、活性は、1:10の希釈では、1:10000の希釈の場合よりも約3.5倍高い。しかしながら、両方の希釈について、酵素は、本発明の液体組成物において、RO水の場合よりも実質的に大きい活性である。
図50は、RO水および本発明の液体組成物について、1:10の希釈(青色)および1:10000の希釈(赤色)における5日間の貯蔵の後でのコンジュゲート化酵素の活性を示す図である。RO水において、酵素活性は両方の希釈について約0.150のODである。対照的に、本発明の液体組成物の存在下では、活性は、1:10の希釈では、1:10000の希釈の場合よりも約3.5倍高い。しかしながら、両方の希釈について、酵素は、本発明の液体組成物において、RO水の場合よりも実質的に大きい活性である。
β−ガラクトシダーゼ
材料および方法:
β−ガラクトシダーゼを用いた実験を、酵素タイプ、濃度およびインキュベーション時間を除いて、上記のアルカリホスファターゼ実験のために使用された同じプロトコルに従って行った。β−ガラクトシダーゼ(Sigma)をRO水および本発明の液体組成物で連続希釈した。サンプルを1:330および1:1000に希釈し、室温でインキュベーションした。
材料および方法:
β−ガラクトシダーゼを用いた実験を、酵素タイプ、濃度およびインキュベーション時間を除いて、上記のアルカリホスファターゼ実験のために使用された同じプロトコルに従って行った。β−ガラクトシダーゼ(Sigma)をRO水および本発明の液体組成物で連続希釈した。サンプルを1:330および1:1000に希釈し、室温でインキュベーションした。
酵素活性を、10μlの酵素を100μlのONPG溶液(β−Gal特異的な比色測定用基質)と37℃で15分間混合し、50μlの停止溶液(1Mの Na2CO3)を加えることによって、0、24時間、48時間、72時間および120時間の時間間隔で求めた。アッセイをマイクロ滴定プレートで行った(各試験点から8回の反復)。405nmの波長でのELISA読み取り装置を使用して、色の強度を求めた。
酵素活性を、RO水について、また、本発明の上記液体組成物(LC7、LC8およびLC3)について、各希釈について時間t=0において求めた。5つの実験を同一条件のもとで行った。酵素安定性および安定性強化パラメーターSeを本明細書中上記でさらに詳述されるように計算した。
結果および考察:
図51a〜図51dは、t=24時間(図51a)、t=48時間(図51b)、t=72時間(図51c)およびt=120時間(図51d)における安定性(t=0における活性によって除されるt≠0での活性)を示す。RO、LC7、LC8、LC3およびLC4の液体が、図51a〜図51dにおいて、青色、赤色、緑色および紫色でそれぞれ示され、安定性の平均値が丸として示される。図51a〜図51dに示されるように、LC7、LC8およびLC3の存在下での活性は、RO水の存在下での活性を一貫して上回っている。
図51a〜図51dは、t=24時間(図51a)、t=48時間(図51b)、t=72時間(図51c)およびt=120時間(図51d)における安定性(t=0における活性によって除されるt≠0での活性)を示す。RO、LC7、LC8、LC3およびLC4の液体が、図51a〜図51dにおいて、青色、赤色、緑色および紫色でそれぞれ示され、安定性の平均値が丸として示される。図51a〜図51dに示されるように、LC7、LC8およびLC3の存在下での活性は、RO水の存在下での活性を一貫して上回っている。
図52a〜図52dは、t=24時間(図52a)、t=48時間(図52b)、t=72時間(図52c)およびt=120時間(図52d)における安定性強化パラメーターSeを、図51a〜図51dの場合と同じような色表記法を用いて示す。図52a〜図52dに示されるように、測定された安定化作用は、1:1000の酵素希釈については約1.3〜2.21の範囲であり、1:330の希釈については約0.83〜1.3の範囲である。
従って、β−ガラクトシダーゼに対する本発明の液体組成物の安定化作用は、APについて見出された安定化作用と類似している。安定化の程度は少し低くなっている。これは、高いタンパク質濃度をアッセイにおいて有する比較的低い比活性(464u/mg)、これにより、弱化した活性が時間の経過により失われることによって説明することができる。
乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性
多くの酵素は貯蔵前に乾燥される。乾燥プロセス、および、長期間にわたる乾燥状態でのその後の貯蔵は、酵素活性をもたらすことが知られている。下記の実験は、乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられている。
多くの酵素は貯蔵前に乾燥される。乾燥プロセス、および、長期間にわたる乾燥状態でのその後の貯蔵は、酵素活性をもたらすことが知られている。下記の実験は、乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性に対する本発明の液体組成物の影響を調べることに向けられている。
材料および方法:
アルカリホスファターゼ(Jackson INC)を、本明細書中上記でさらに詳述されるように、RO水および本発明の上記液体組成物(LC7、LC8およびLC3)において1:5000で希釈した。
アルカリホスファターゼ(Jackson INC)を、本明細書中上記でさらに詳述されるように、RO水および本発明の上記液体組成物(LC7、LC8およびLC3)において1:5000で希釈した。
9枚のマイクロ滴定プレートを5μlの溶液のアリコートで満たした。1枚のプレートを、本明細書中上記でさらに詳述されるように時間t=0における酵素活性について試験し、残る8枚のプレートを37℃で一晩乾燥した。乾燥プロセスを、乾燥した環境において16時間行った。
2枚のプレートを、最初、室温に冷却し、続いて、100μlのpNPP溶液を室温で加えることによって酵素活性について試験した。色の強度を405nmの波長でELISA読み取り装置によって求め、安定性を本明細書中上記でさらに詳述されるように計算した。6枚のプレートを60℃に30分間移し、その後、酵素活性を求めた。
結果:
図53aは乾燥後の酵素の活性(2つの反復物)および60℃での30分間の熱処理の後での酵素の活性(6つの反復物)を示す。平均値が「+」記号によって図53aに示される。両方の処理は酵素を実質的に傷つけ、それらの作用は付加的であった。
図53aは乾燥後の酵素の活性(2つの反復物)および60℃での30分間の熱処理の後での酵素の活性(6つの反復物)を示す。平均値が「+」記号によって図53aに示される。両方の処理は酵素を実質的に傷つけ、それらの作用は付加的であった。
図53bは安定性強化パラメーターSeを示す。比較的小さいデータベース、および、酵素がさらされた極端な条件にもかかわらず、本発明の液体組成物は酵素の活性を明らかに安定化させている。例えば、LC7については、安定性強化パラメーターの平均値が1.16から1.22に増大した。
実施例16
DNAの固定
本実施例では、DNAを本発明の液体組成物の存在下または非存在下でガラスビーズに固定することの影響が調べられた。ポリヌクレオチドを固体支持体(例えば、ガラスビーズなど)に固定することは、分子生物学研究および医学の分野ではこの上なく有益であり得る。典型的には、DNA操作は、PCR、連結、制限および形質転換をはじめとする一連の反応を次々に含む。それぞれの反応が、好ましくは、それ自身の特有の緩衝液を必要とするそれ自身の好適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応の間で、DNAサンプルまたはRNAサンプルを沈殿させ、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成しなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間がかかり、そして、より重要なことに、出発物質の喪失をもたらし、このことは、出発物質が希少であるときには最大の関心事であり得る。一例として、本発明者らは、本発明の液体組成物がPCR反応時におけるガラスビーズの存在下でDNAに対してどのような影響を有するかを調べることを選んでいる。
DNAの固定
本実施例では、DNAを本発明の液体組成物の存在下または非存在下でガラスビーズに固定することの影響が調べられた。ポリヌクレオチドを固体支持体(例えば、ガラスビーズなど)に固定することは、分子生物学研究および医学の分野ではこの上なく有益であり得る。典型的には、DNA操作は、PCR、連結、制限および形質転換をはじめとする一連の反応を次々に含む。それぞれの反応が、好ましくは、それ自身の特有の緩衝液を必要とするそれ自身の好適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応の間で、DNAサンプルまたはRNAサンプルを沈殿させ、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成しなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間がかかり、そして、より重要なことに、出発物質の喪失をもたらし、このことは、出発物質が希少であるときには最大の関心事であり得る。一例として、本発明者らは、本発明の液体組成物がPCR反応時におけるガラスビーズの存在下でDNAに対してどのような影響を有するかを調べることを選んでいる。
材料および方法:
PCRを、得られるフラグメントサイズが750bpであるようにT7フォワードプライマー(TAATACGACTCACTATAGGG)配列番号5およびM13リバースプライマー(GGAAACAGCTATGACCATGA)配列番号6を使用して、750塩基対の遺伝子がクローン化されているpBSプラスミドから調製した。これらのプライマーを200μM(200pmol/μl)の濃度でPCR規格の水において構成した。これらは続いて、組み合わされたミックスを作製するためにそれぞれ10μMの作業用濃度にNeowater(商標)において1:20で希釈された。例えば、1μlの各プライマー(200μMのストックから)を一緒にし、18μlのNeowater(商標)により希釈し、混合し、遠心器により集めた。高濃度のDNAをNeowater(商標)により1:500で希釈して2pg/μlの作業用濃度にした。PCRをBiometra T−Gradient PCR装置において行った。使用された酵素は、緩衝液YにおけるSAWADY Taq DNAポリメラーゼ(PeqLab01−1020)であった。
PCRを、得られるフラグメントサイズが750bpであるようにT7フォワードプライマー(TAATACGACTCACTATAGGG)配列番号5およびM13リバースプライマー(GGAAACAGCTATGACCATGA)配列番号6を使用して、750塩基対の遺伝子がクローン化されているpBSプラスミドから調製した。これらのプライマーを200μM(200pmol/μl)の濃度でPCR規格の水において構成した。これらは続いて、組み合わされたミックスを作製するためにそれぞれ10μMの作業用濃度にNeowater(商標)において1:20で希釈された。例えば、1μlの各プライマー(200μMのストックから)を一緒にし、18μlのNeowater(商標)により希釈し、混合し、遠心器により集めた。高濃度のDNAをNeowater(商標)により1:500で希釈して2pg/μlの作業用濃度にした。PCRをBiometra T−Gradient PCR装置において行った。使用された酵素は、緩衝液YにおけるSAWADY Taq DNAポリメラーゼ(PeqLab01−1020)であった。
PCRミックスを下記のように調製した:
サンプルを、ボルテックス撹拌することなく混合した。サンプルをPCR装置に入れ、正確に1分間94℃で置き、その後、取り出した。その後、4.5μlのPCRミックスを清浄なチューブに分注し、これに0.5μlのプライマーミックスおよび5μlの希釈DNAをその順番で加えた。ボルテックス撹拌することなく混合し、または遠心分離した後、サンプルをPCR装置に入れ、下記のPCRプログラムを使用した:
PCR反応の生成物を、本明細書中上記に記載されるように分析のために8%PAGEゲルで泳動した。
ゲルに負荷されたPCR生成物は下記の通りであった:
レーン1:Neowater(商標)で希釈されたDNA、H2Oで希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含む)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン2:Neowater(商標)で希釈されたDNA、Neowater(商標)で希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含む)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン3:すべてH2Oで(陽性コントロール)(ガラスビーズあり)。
レーン4:陰性コントロール。DNAなし、Neowater(商標)におけるプライマーを(ガラスビーズを含む)H2Oにより(10μlに)。
レーン5:Neowater(商標)で希釈されたDNA、H2Oで希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含まない)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン6:Neowater(商標)で希釈されたDNA、Neowater(商標)で希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含まない)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン7:すべてH2Oで(陽性コントロール)(ガラスビーズなし)。
レーン8:陰性コントロール。DNAなし、Neowater(商標)におけるプライマーを(ガラスビーズを含まない)H2Oにより(10μlに)。
レーン1:Neowater(商標)で希釈されたDNA、H2Oで希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含む)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン2:Neowater(商標)で希釈されたDNA、Neowater(商標)で希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含む)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン3:すべてH2Oで(陽性コントロール)(ガラスビーズあり)。
レーン4:陰性コントロール。DNAなし、Neowater(商標)におけるプライマーを(ガラスビーズを含む)H2Oにより(10μlに)。
レーン5:Neowater(商標)で希釈されたDNA、H2Oで希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含まない)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン6:Neowater(商標)で希釈されたDNA、Neowater(商標)で希釈されたプライマー(ミックス)、(ガラスビーズを含まない)Neowater(商標)により所定の体積(10μlに)。
レーン7:すべてH2Oで(陽性コントロール)(ガラスビーズなし)。
レーン8:陰性コントロール。DNAなし、Neowater(商標)におけるプライマーを(ガラスビーズを含まない)H2Oにより(10μlに)。
結果および結論
図54はDNA画像である。認められ得るように、PCRがガラスビーズの存在下で行われるとき、neowaterが、反応が生じるために要求される。neowaterが反応に含まれないとき、PCR生成物が観測されない(レーン3を参照のこと)。
図54はDNA画像である。認められ得るように、PCRがガラスビーズの存在下で行われるとき、neowaterが、反応が生じるために要求される。neowaterが反応に含まれないとき、PCR生成物が観測されない(レーン3を参照のこと)。
まとめると、本発明の液体組成物は、ガラスビーズの存在下でのPCR時において要求される。
実施例17
リアルタイムPCR
DNA核酸配列およびcDNA核酸配列の検出および定量化は、法医科学、医療、薬物開発および分子生物学研究をはじめとする広範囲の様々な適用のために重要である。リアルタイムPCRでは、アガロースゲルにおける臭化エチジウムの可視化に頼る常套のPCRの終点検出とは対照的に、PCR反応の期間中に発光される蛍光が、それぞれのPCRサイクルの期間中におけるアンプリコン生成の指標として(すなわち、リアルタイムで)モニタリングされる。
リアルタイムPCR
DNA核酸配列およびcDNA核酸配列の検出および定量化は、法医科学、医療、薬物開発および分子生物学研究をはじめとする広範囲の様々な適用のために重要である。リアルタイムPCRでは、アガロースゲルにおける臭化エチジウムの可視化に頼る常套のPCRの終点検出とは対照的に、PCR反応の期間中に発光される蛍光が、それぞれのPCRサイクルの期間中におけるアンプリコン生成の指標として(すなわち、リアルタイムで)モニタリングされる。
その高感度のために、リアルタイムPCRは、非常に少量のDNAまたはcDNAを検出および定量するために特に適切である。感度および再現性を改善すること、ならびに、リアルタイムPCRのために要求される反応体積を低下させることは、貴重なサンプルを保存することを助ける。
本実施例では、本発明の液体組成物の存在下または不在下におけるリアルタイムPCR反応の感度および反応体積を調べた。
A.感度試験
材料および方法:
リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystem 7300 PCR SystemでのSYBR Green法を使用して行った。反応を96ウエルプレート(Corning、NY)で行った。プライマーの配列は下記の通りであった:
フォワードプライマー:CACCAGACTGACTCCTCATT 配列番号7
リバースプライマー:CCTGTTGCTGCACATATTCC 配列番号8
材料および方法:
リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystem 7300 PCR SystemでのSYBR Green法を使用して行った。反応を96ウエルプレート(Corning、NY)で行った。プライマーの配列は下記の通りであった:
フォワードプライマー:CACCAGACTGACTCCTCATT 配列番号7
リバースプライマー:CCTGTTGCTGCACATATTCC 配列番号8
それぞれが12個のサンプルからなる2つのセットを下記の表28に詳述されるように調製した。一方がヌクレアーゼ非含有の水に関し、他方がNeowater(商標)に関するものであった。それぞれのセットについて、13Xミックスを調製した:
cDNAサンプルを、1:5から始まり、1:2560で終わる連続希釈物(合計で10個の希釈物)で、水またはNeowater(商標)で希釈した。1:5の希釈物を、3μlの最初のcDNA+12μlのH2OまたはNeowater(商標)を使用して調製した。その後の希釈物を、7.5μlのサンプルと、7.5μlのH2OまたはNeowater(商標)とを取ることによって調製した。
17μlのミックスを3μlのcDNAサンプルに加えた。それぞれのセットにおける最初の反応液は非希釈のcDNAサンプルであった。
蛍光が所定の選ばれたレベルを超えるために必要とされたPCRサイクルの数(閾値サイクル(Ct))の、それらの対応Log(cDNA濃度)に対する標準曲線を水希釈サンプルおよびNeowater(商標)希釈サンプルの両方についてプロットした。この標準曲線はプロセスの直線性(すなわち、反応効率)の尺度である。
解離曲線を水希釈サンプルおよびNeowater(商標)希釈サンプルの両方についてのそれぞれの標準曲線の反応についてプロットした。
標準曲線および解離曲線はともに、自動ベースライン決定を使用してプロットされた。標準曲線だけは、0.2の手動バックグラウンドカットオフで、かつ、同一又は非同一の外れ値をそれぞれのセットから除いた後でプロットされた。
結果
自動ベースライン決定による未処理データが下記において表29に示される:
自動ベースライン決定による未処理データが下記において表29に示される:
自動ベースライン決定による標準曲線および解離曲線がNeowater(商標)については図55a〜図55bに例示され、水については図56a〜図56bに例示される。Neowater(商標)については、解離曲線の傾き値が−2.969であり、回帰値が0.987であった。水については、解離曲線の傾き値が−4.048であり、回帰値が0.875であった
0.2のベースラインカットオフによる未処理データが下記において表30に示される:
0.2のベースラインカットオフによる標準曲線がNeowater(商標)については図57aに例示され、水については図57bに例示される。Neowater(商標)については、解離曲線の傾き値が−2.965であり、回帰値が0.986であった。水については、解離曲線の傾き値が−4.094であり、回帰値が0.885であった。
それぞれのセットからの同一外れ値の除去および0.2のベースラインカットオフの後での未処理データが下記において表31に示される:
それぞれのセットからの同一外れ値の除去および0.2のベースラインカットオフの後での標準曲線がNeowater(商標)については図58aに例示され、水については図58bに例示される。Neowater(商標)については、解離曲線の傾き値が−3.338であり、回帰値が0.994であった。水については、解離曲線の傾き値が−2.918であり、回帰値が0.853であった。
それぞれのセットからの異なった外れ値の除去および0.2のベースラインカットオフの後での未処理データが下記において表32に示される:
それぞれのセットからの異なった外れ値の除去および0.2のベースラインカットオフの後での標準曲線がNeowater(商標)については図59aに例示され、水については図59bに例示される。Neowater(商標)については、解離曲線の傾き値が−3.338であり、回帰値が0.994であった。水については、解離曲線の傾き値が−3.399であり、回帰値が0.999であった。
結論
図55aおよび図56aにおける標準曲線の傾きの値は、増幅効率がNeowater(商標)の存在下にはより大きいことを反映しているが、Neowater(商標)での標準曲線の大きい傾き値(−2.969)はまた、いくつかのバックグラウンドノイズの存在を反映する場合もある。両方の解離曲線を調べることにより、非特異的な生成物が何ら存在しないことが明らかにされる。このことは、Neowater(商標)の存在下では、バックグラウンド(BG)読み取りが上昇することを示している(水における0.09とは対照的に0.7)。この高いBGカットオフの結果が、Neowater(商標)での標準曲線が、水での標準曲線(−23.02のCt値から始まる)よりも大きい26.24のCt値から始まることである。高いBGのこの現象はおそらくは、Neowater(商標)の存在下における高まった感度の1つの態様を反映している。この高まった感度の別の態様が、まれな標的アンプリコンを確実に検出することができることを反映する、高いDNA希釈度におけるNeowater(商標)での標準曲線の直線性である。
図55aおよび図56aにおける標準曲線の傾きの値は、増幅効率がNeowater(商標)の存在下にはより大きいことを反映しているが、Neowater(商標)での標準曲線の大きい傾き値(−2.969)はまた、いくつかのバックグラウンドノイズの存在を反映する場合もある。両方の解離曲線を調べることにより、非特異的な生成物が何ら存在しないことが明らかにされる。このことは、Neowater(商標)の存在下では、バックグラウンド(BG)読み取りが上昇することを示している(水における0.09とは対照的に0.7)。この高いBGカットオフの結果が、Neowater(商標)での標準曲線が、水での標準曲線(−23.02のCt値から始まる)よりも大きい26.24のCt値から始まることである。高いBGのこの現象はおそらくは、Neowater(商標)の存在下における高まった感度の1つの態様を反映している。この高まった感度の別の態様が、まれな標的アンプリコンを確実に検出することができることを反映する、高いDNA希釈度におけるNeowater(商標)での標準曲線の直線性である。
Neowater(商標)についてのより大きい回帰値は、Neowater(商標)の存在下では、量のより正確な評価が濃度のより広いダイナミックレンジにわたってもたらされることを示している。
これら2つの反応セットを等しいBGカットオフ値で比較するために、バックグラウンドノイズを調べ、0.2のBG値を両方のセットについて手動で選択した。この値は、両方のセット(図60aおよび図60b)について、また、直線範囲においてバックグラウンド読み取りを上回っていることが見出された。
図57aおよび図57bは、0.2の等しいBGカットオフでプロットされた標準曲線を例示する。Neowater(商標)での標準曲線はより低いR2値を有するが、水での標準曲線の場合のように、等しいCt値を高いcDNA濃度では有する(Ct−1:1のcDNA希釈物において24.24)。増幅のダイナミックレンジおよび効率は、Neowater(商標)の存在下での方が依然として大きい。
より最適な曲線に到達するために、1:5、1:640、1:1280、1:2560のcDNA濃度に対応する外れ値を除き、標準曲線を、図58aおよび図58bに例示されるように引き直した。
それぞれのセットについて可能である最適な曲線に到達するために、外れ値をそれぞれのセットから個々に除いた。標準曲線を、図59aおよび図59bに例示されるように引き直した。これらの図は、より大きいダイナミックレンジ(より多数の点)、より大きい正確性(より少ない外れ値)、および、より大きい感度が、Neowater(商標)の存在下で達成されたことを明らかにする。Neowater(商標)でのセットの最適な標準曲線(−3.3の傾き値)には、水でのセットの標準曲線よりも多くの測定点(これらのうちの2つはより大きいテンプレート希釈度を表す)が含まれる。
B.体積試験
リアルタイムPCR反応を、Neowater(商標)を水の代わりに使用して実行することにより、より少ない反応体積が、感度を保持しながら可能になるという可能性を調べた。
リアルタイムPCR反応を、Neowater(商標)を水の代わりに使用して実行することにより、より少ない反応体積が、感度を保持しながら可能になるという可能性を調べた。
材料および方法
すべての材料は、感度を求めるために上記で使用された材料と同一であった。cDNAサンプルを1:80で希釈した。これは、この希釈度が、図59aおよび図59bに例示されるように、正確な結果が両方のセット(Neowater(商標)および水)において達成された最大の希釈度であったからであった。
すべての材料は、感度を求めるために上記で使用された材料と同一であった。cDNAサンプルを1:80で希釈した。これは、この希釈度が、図59aおよび図59bに例示されるように、正確な結果が両方のセット(Neowater(商標)および水)において達成された最大の希釈度であったからであった。
試験された反応体積は、5μl、10μlおよび15μlであった。これら3つの体積セットのそれぞれには、8つの反応からなる一組が含まれた(Neowater(商標)を伴う反応およびNeowater(商標)を伴わない反応の三連、ならびに、1つの陰性コントロール(テンプレートを除く))。低下した反応体積に加えて、SYBRグリーン溶液と、溶媒(水またはNeowater(商標)のいずれか)との間での比率を(下記の表33に詳述されるように)変化させた。比率の変化により、結果を、感度試験から得られた結果と比較することが避けられた。
それぞれの体積試験のためのプールを、示されるように、水またはNeowater(商標)のいずれかにおいて調製し、その後、所望の体積で反応ウエルに等分した。すべての結果を0.2のバックグラウンドカットオフ値で読み取った。
結果
これら3つの反応三連物(すなわち、5μl、10μlおよび15μl)の増幅曲線を、Neowater(商標)については図61a〜cに例示されるようにプロットし、水については図62a〜cに例示されるようにプロットした。
これら3つの反応三連物(すなわち、5μl、10μlおよび15μl)の増幅曲線を、Neowater(商標)については図61a〜cに例示されるようにプロットし、水については図62a〜cに例示されるようにプロットした。
図61a〜cおよび図62a〜cに対応する未処理データが下記において表34に示される。
結論
結果を調べることにより、一般には、Neowater(商標)の存在下で行われた反応は再現性がより大きいことが示される。それぞれの三連内での類似性は、Neowater(商標)でのセットでの方が大きく、これに対して、水でのセットでは、読み取り値の間における変動がすべてのセットにおいて非常に大きく、また、未決定の読み取りがより多く存在する。このことは、これらの反応が、低下した体積において正確に行われ得ることを示し得る。
結果を調べることにより、一般には、Neowater(商標)の存在下で行われた反応は再現性がより大きいことが示される。それぞれの三連内での類似性は、Neowater(商標)でのセットでの方が大きく、これに対して、水でのセットでは、読み取り値の間における変動がすべてのセットにおいて非常に大きく、また、未決定の読み取りがより多く存在する。このことは、これらの反応が、低下した体積において正確に行われ得ることを示し得る。
実施例18
超音波試験
本発明の液体組成物を超音波共振器における一連の超音波試験に供す。
超音波試験
本発明の液体組成物を超音波共振器における一連の超音波試験に供す。
方法
本発明の液体組成物(本実施例ではNeowater(商標)として示される)および2回蒸留水における超音波速度の測定を、ResoScan(登録商標)研究システム(Heidelberg、ドイツ)を使用して行った。
本発明の液体組成物(本実施例ではNeowater(商標)として示される)および2回蒸留水における超音波速度の測定を、ResoScan(登録商標)研究システム(Heidelberg、ドイツ)を使用して行った。
校正
ResoScan(登録商標)研究システムの両方のセルを、0.005%のTween20が補充された標準水(脱塩水、Roth.Art.3175.2、Charge:03569036)で満たし、20℃での等温測定の期間中に測定した。両方のセルの間における超音波速度の差を、本明細書中下記でさらに詳述されるような等温測定におけるゼロ値として使用した。
ResoScan(登録商標)研究システムの両方のセルを、0.005%のTween20が補充された標準水(脱塩水、Roth.Art.3175.2、Charge:03569036)で満たし、20℃での等温測定の期間中に測定した。両方のセルの間における超音波速度の差を、本明細書中下記でさらに詳述されるような等温測定におけるゼロ値として使用した。
等温測定
ResoScan(登録商標)研究システムのセル1を参照として使用し、蒸留水(Roth Art.34781、ロット#48362077)で満たした。セル2を本発明の液体組成物で満たした。絶対値の超音波速度を20℃で測定した。実験値の比較を可能にするために、超音波速度を20.000℃に補正した。
ResoScan(登録商標)研究システムのセル1を参照として使用し、蒸留水(Roth Art.34781、ロット#48362077)で満たした。セル2を本発明の液体組成物で満たした。絶対値の超音波速度を20℃で測定した。実験値の比較を可能にするために、超音波速度を20.000℃に補正した。
結果
図63は、20.051℃で測定されたときの、観測時間の関数としての絶対値の超音波速度Uを本発明の液体組成物(U2)および蒸留水(U1)について示す。両方のサンプルが観測の時間枠(35分)において安定な等温速度を示した。
図63は、20.051℃で測定されたときの、観測時間の関数としての絶対値の超音波速度Uを本発明の液体組成物(U2)および蒸留水(U1)について示す。両方のサンプルが観測の時間枠(35分)において安定な等温速度を示した。
下記の表35には、測定された超音波速度(U1、U2)および20℃へのそれらの補正をまとめる。補正を、蒸留水については1℃あたり3m/sの温度−速度補正を使用して計算した。
図63および表35に示されるように、蒸留水と、本発明の液体組成物との間における差が等温測定によって認められた。差ΔU=U2−U1が、20.051℃の温度では15.68cm/sであり、20℃の温度では13.61cm/sであった。ΔUの値は、ResoScan(登録商標)システムのどのノイズシグナルよりも著しく大きい。結果が第2のResoScan(登録商標)研究システムで1回繰り返された。
実施例19
チップへのRNAのハイブリダイゼーション
DNAチップに対するRNAサンプルの間でのハイブリダイゼーションの強さを本発明の液体組成物の存在下および不在下で調べた。
チップへのRNAのハイブリダイゼーション
DNAチップに対するRNAサンプルの間でのハイブリダイゼーションの強さを本発明の液体組成物の存在下および不在下で調べた。
材料および方法
GEArray Q Series Human Signal Transduction PathwayFinder Gene Array:HS−008を使用した。
GEArray Q Series Human Signal Transduction PathwayFinder Gene Array:HS−008を使用した。
RNAを、Rneasyキット(QIAGEN)を使用してヒトリンパ球から抽出した。RNAを、GEArray AmpoLabeling−LPRキット(カタログ番号L−03)を製造者のプロトコルに従って使用して標識した。
アレイに対するRNAサンプルのハイブリダイゼーションを製造者のプロトコルに従って行った。本質的には、膜を脱イオン水で5分間事前に湿らせ、その後、事前に加温されたGEAhyb Hybridization Solution(GEArray)において60℃で2時間インキュベーションした。標識されたRNAをハイブリダイゼーション溶液に加え、メンブランと60℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、膜をオートラジオグラフィのためにX線フィルムに2秒または10秒の露光時間にわたって暴露させた。
結果
図64A〜図64Dに例示されるように、RNAハイブリダイゼーションが、同一の露光期間の後でのシグナル強度によって証明されるように、DNAチップに対して、本発明の液体組成物の存在下では増大する。
図64A〜図64Dに例示されるように、RNAハイブリダイゼーションが、同一の露光期間の後でのシグナル強度によって証明されるように、DNAチップに対して、本発明の液体組成物の存在下では増大する。
実施例20
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
材料および方法
フェノールレッド溶液(20mg/25ml)を調製した。290μlを、13mlのRO水、または、ナノ構造を含む水(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始pHを有したことが認められた。2.5mlのそれぞれの水+フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを430nmにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを557nmにおいて与える。波長の範囲は200nm〜800nmであり、しかし、0.02M水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは557nmの波長だけを示す。
フェノールレッド溶液(20mg/25ml)を調製した。290μlを、13mlのRO水、または、ナノ構造を含む水(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始pHを有したことが認められた。2.5mlのそれぞれの水+フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを430nmにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを557nmにおいて与える。波長の範囲は200nm〜800nmであり、しかし、0.02M水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは557nmの波長だけを示す。
結果
表36には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の557nmにおける吸光度がまとめられる。
表36には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の557nmにおける吸光度がまとめられる。
図65および表36に例示されるように、RO水は、水酸化ナトリウムを加えたとき、pHにおけるより大きい変化を示す。RO水はわずかな緩衝作用を有するが、吸光度が0.09Aに達したとき、緩衝作用が「破れ」、pH変化が、より多くの水酸化ナトリウムを加えた後ではより大きくなる。HA−99水はROと類似している。NM(#150905−106)(Neowater(商標))、AB水Alexander(AB1−22−1 HA Alexander)は若干の緩衝作用を有する。HAPおよびHA−18はNeowater(商標)よりも一層大きい緩衝作用を示す。
まとめると、この実験から、HA−99−Xを除いて、試験されたナノ構造を含むすべての新しい水タイプ(HAP、AB1−2−3、HA−18、Alexander)が、Neowater(商標)と類似した特性を示す。
実施例21
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
材料および方法
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、50mlのRO水、または、ナノ構造を含む水(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)に加え、pHを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、3回の実験を行った。
水酸化ナトリウム滴定:1μl〜15μlの1M水酸化ナトリウムを加えた。
塩酸滴定:1μl〜15μlの1M塩酸を加えた。
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、50mlのRO水、または、ナノ構造を含む水(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)に加え、pHを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、3回の実験を行った。
水酸化ナトリウム滴定:1μl〜15μlの1M水酸化ナトリウムを加えた。
塩酸滴定:1μl〜15μlの1M塩酸を加えた。
結果
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図66A〜Cおよび図67A〜Cに示す。塩酸滴定についての結果を図68A〜Cおよび図69に示す。
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図66A〜Cおよび図67A〜Cに示す。塩酸滴定についての結果を図68A〜Cおよび図69に示す。
ナノ構造を含む水は、RO水について必要とされる同じpHレベルに到達するためにより多量の水酸化ナトリウムを要求するので、ナノ構造を含む水は緩衝能力を有する。この特徴は7.6〜10.5のpH範囲においてより著しい。加えて、ナノ構造を含む水は、RO水について必要とされる同じpHレベルに到達するためにより多量の塩酸を必要とする。この作用は、アルカリ範囲よりも、酸性pH範囲での方が大きい。例えば、10μlの水酸化ナトリウム(1M)を(総和で)加えたとき、ROのpHが7.56から10.3に増大した。ナノ構造を含む水のpHは7.62から9.33に増大した。10μlの塩酸(0.5M)を(総和で)加えたとき、ROのpHが7.52から4.31に低下し、これに対して、ナノ構造を含む水のpHは7.71から6.65に低下した。この特徴は7.7〜3のpH範囲においてより著しい。
実施例22
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
材料および方法
フェノールレッド溶液(20mg/25ml)を調製した。1mlを、45mlのRO水、または、ナノ構造を含む水(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)に加えた。pHを測定し、必要ならば、滴定した。3mlのそれぞれの水+フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを430nmにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを557nmにおいて与える。波長の範囲は200nm〜800nmであり、しかし、0.02M水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは557nmの波長だけを示す。
フェノールレッド溶液(20mg/25ml)を調製した。1mlを、45mlのRO水、または、ナノ構造を含む水(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)に加えた。pHを測定し、必要ならば、滴定した。3mlのそれぞれの水+フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを430nmにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを557nmにおいて与える。波長の範囲は200nm〜800nmであり、しかし、0.02M水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは557nmの波長だけを示す。
塩酸滴定:
RO:45ml pH5.8
1mlのフェノールレッドおよび5μlの水酸化ナトリウム(1M)を加えた。新しいpH=7.85
Neowater(商標)(#150905−106):45ml pH6.3
1mlのフェノールレッドおよび4μlの水酸化ナトリウム(1M)を加えた。新しいpH=7.19
RO:45ml pH5.8
1mlのフェノールレッドおよび5μlの水酸化ナトリウム(1M)を加えた。新しいpH=7.85
Neowater(商標)(#150905−106):45ml pH6.3
1mlのフェノールレッドおよび4μlの水酸化ナトリウム(1M)を加えた。新しいpH=7.19
水酸化ナトリウム滴定:
I.RO:45ml pH5.78
1mlのフェノールレッド、6μlの塩酸(0.25M)および4μlの水酸化ナトリウム(0.5M)を加えた。新しいpH=4.43
Neowater(商標)(#150604−109):45ml pH8.8
1mlのフェノールレッドおよび45μlの塩酸(0.25M)を加えた。新しいpH=4.43
II.RO:45ml pH5.78
1mlのフェノールレッドおよび5μlの水酸化ナトリウム(0.5M)を加えた。新しいpH=6.46
Neowater(商標)(#120104−107):45ml pH8.68
1mlのフェノールレッドおよび5μlの塩酸(0.5M)を加えた。新しいpH=6.91
I.RO:45ml pH5.78
1mlのフェノールレッド、6μlの塩酸(0.25M)および4μlの水酸化ナトリウム(0.5M)を加えた。新しいpH=4.43
Neowater(商標)(#150604−109):45ml pH8.8
1mlのフェノールレッドおよび45μlの塩酸(0.25M)を加えた。新しいpH=4.43
II.RO:45ml pH5.78
1mlのフェノールレッドおよび5μlの水酸化ナトリウム(0.5M)を加えた。新しいpH=6.46
Neowater(商標)(#120104−107):45ml pH8.68
1mlのフェノールレッドおよび5μlの塩酸(0.5M)を加えた。新しいpH=6.91
結果
図70A〜Cおよび図71A〜Bに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はRO水の緩衝能力よりも大きかった。
図70A〜Cおよび図71A〜Bに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はRO水の緩衝能力よりも大きかった。
実施例23
rf水の緩衝能力
緩衝能力に対するRF水の影響を調べた。
rf水の緩衝能力
緩衝能力に対するRF水の影響を調べた。
材料および方法
水酸化ナトリウム(1M)の数μlの液滴を加えて、150mlのRO水のpH(pH=5.8)を上げた。この水の50mlを3つのボトルに等分した。3つの処理を行った:
ボトル1:非処理(RO水)
ボトル2:30Wにより30分間照射されたRO水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に10分間放置された(RF水)。
ボトル3:pHが5に達したとき、2回目の照射に供されたRF水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に10分間放置された。
水酸化ナトリウム(1M)の数μlの液滴を加えて、150mlのRO水のpH(pH=5.8)を上げた。この水の50mlを3つのボトルに等分した。3つの処理を行った:
ボトル1:非処理(RO水)
ボトル2:30Wにより30分間照射されたRO水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に10分間放置された(RF水)。
ボトル3:pHが5に達したとき、2回目の照射に供されたRF水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に10分間放置された。
1μlの0.5M塩酸を50mlの水に加えることによって滴定を行った。pH値が4.2未満に達したときに滴定を終えた。
実験を三連で行った。
結果
図72A〜Cおよび図73から理解され得るように、RF水およびRF2水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
図72A〜Cおよび図73から理解され得るように、RF水およびRF2水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
実施例24
ナノ構造を含む液体組成物の溶媒能力
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が、1mg/mlの濃度で水に溶解しないことがともに知られている2つの材料を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
ナノ構造を含む液体組成物の溶媒能力
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が、1mg/mlの濃度で水に溶解しないことがともに知られている2つの材料を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
A.エタノール/Neowater(商標)(Do−Coop technologies、イスラエル)型溶液における溶解
材料および方法
5回の試みを、粉末を様々な組成で溶解することを目指して行った。
組成は下記の通りであった:
A.10mgの粉末(赤色/白色)+990μlのNeowater(商標)。
B.10mgの粉末(赤色/白色)+990μlのNeowater(商標)(90分間脱水されたもの)。
C.10mgの粉末(赤色/白色)+495μlのNeowater(商標)+495μlのEtOH(50%−50%)。
D.10mgの粉末(赤色/白色)+900μlのNeowater(商標)+90μlのEtOH(90%−10%)。
E.10mgの粉末(赤色/白色)+820μlのNeowater(商標)+170μlのEtOH(80%−20%)。
材料および方法
5回の試みを、粉末を様々な組成で溶解することを目指して行った。
組成は下記の通りであった:
A.10mgの粉末(赤色/白色)+990μlのNeowater(商標)。
B.10mgの粉末(赤色/白色)+990μlのNeowater(商標)(90分間脱水されたもの)。
C.10mgの粉末(赤色/白色)+495μlのNeowater(商標)+495μlのEtOH(50%−50%)。
D.10mgの粉末(赤色/白色)+900μlのNeowater(商標)+90μlのEtOH(90%−10%)。
E.10mgの粉末(赤色/白色)+820μlのNeowater(商標)+170μlのEtOH(80%−20%)。
これらのチューブをボルテックスし、60℃に1時間加熱した。
結果
1.白色粉末は5個すべての試験チューブにおいて溶解しなかった。
2.赤色粉末は溶解したが、しばらくして沈降した。
色がわずかに黄色に変化したので、試験チューブCは粉末をより良好に溶解したかのようであった。
1.白色粉末は5個すべての試験チューブにおいて溶解しなかった。
2.赤色粉末は溶解したが、しばらくして沈降した。
色がわずかに黄色に変化したので、試験チューブCは粉末をより良好に溶解したかのようであった。
B.粉砕後の、エタノール/Neowater(商標)(Do−Coop technologies、イスラエル)型溶液における溶解
材料および方法
粉砕後、赤色粉末を4つの組成で溶解した:
A.1/2mgの赤色粉末+49.5μlのRO。
B.1/2mgの赤色粉末+49.5μlのNeowater(商標)。
C.1/2mgの赤色粉末+9.9μlのEtOH→39.65μlのNeowater(商標)(20%−80%)。
D.1/2mgの赤色粉末+24.75μlのEtOH→24.75μlのNeowater(商標)(50%−50%)。
総反応体積:50μl。
材料および方法
粉砕後、赤色粉末を4つの組成で溶解した:
A.1/2mgの赤色粉末+49.5μlのRO。
B.1/2mgの赤色粉末+49.5μlのNeowater(商標)。
C.1/2mgの赤色粉末+9.9μlのEtOH→39.65μlのNeowater(商標)(20%−80%)。
D.1/2mgの赤色粉末+24.75μlのEtOH→24.75μlのNeowater(商標)(50%−50%)。
総反応体積:50μl。
これらのチューブをボルテックスし、60℃に1時間加熱した。
結果
粉砕後、赤色粉末を溶解するために、Neowater(商標)との組合せにおいて、わずかに20%のエタノールだけが必要であった。
粉砕後、赤色粉末を溶解するために、Neowater(商標)との組合せにおいて、わずかに20%のエタノールだけが必要であった。
C.徹底的な粉砕の後における、エタノール/Neowater(商標)(Do−Coop technologies、イスラエル)型溶液における溶解
材料および方法
2つの粉砕プロトコルを行った。第1は粉末単独に対してであり(バイアル1)、第2は、100μlのNeowater(商標)(1%)に分散された粉末に対してあった(バイアル2)。
材料および方法
2つの粉砕プロトコルを行った。第1は粉末単独に対してであり(バイアル1)、第2は、100μlのNeowater(商標)(1%)に分散された粉末に対してあった(バイアル2)。
これら2つの組成物を2つのバイアルに入れ、攪拌機上に置いて、材料を一晩粉砕した:
15時間後、100μlのNeowater(商標)を数分毎に10μlの滴定によって1mgの赤色粉末(バイアル1)に加えた。
15時間後、100μlのNeowater(商標)を数分毎に10μlの滴定によって1mgの赤色粉末(バイアル1)に加えた。
変化を、試験チューブの写真を0時間〜24時間の間で撮影することによってモニタリングした(図74F〜J)。
比較として、2つのチューブを観察した。2つのうちの一方が、990μlのNeowater(商標)(90分間脱水されたもの)に分散された赤色粉末(1%溶液)を含み、他方が、50%エタノール/50%Neowater(商標)を含む溶液に分散された赤色粉末(1%溶液)を含んだ。チューブを60℃で1時間加熱した。これらのチューブが図74A〜Eに例示される。24時間の期間の後、それぞれの溶液からの2μlを採取し、その吸光度をnanodropで測定した(図75A〜C)。
結果
図74A〜Jは、徹底的な粉砕の後では、赤色材料が24時間にわたって安定であり続け、沈下しないように、赤色材料を溶解することが可能であることを例示する。しかしながら、図74A〜Eは、時間が経過するとき、該材料は色が変化すること(安定でないこと)を示す。
図74A〜Jは、徹底的な粉砕の後では、赤色材料が24時間にわたって安定であり続け、沈下しないように、赤色材料を溶解することが可能であることを例示する。しかしながら、図74A〜Eは、時間が経過するとき、該材料は色が変化すること(安定でないこと)を示す。
バイアル1はほとんど吸収しなかった(図75A);溶液Bの吸光度ピークは、左側(220nm)への変化を伴って220nm〜270nmの間にあり(図75B)、溶液Cの吸光度ピークは250nm〜330nmの間にあった(図75C)。
結論
赤色材料を粉砕することにより、該材料をNeowater(商標)に分散させることがもたらされた。この分散物は24時間にわたって持続した。該材料をガラス製バイアルにおいて維持することにより、溶液は、100%の脱水Neowater(商標)およびEtOH−Neowater(商標)の両方において、その後72時間安定に保たれた。
赤色材料を粉砕することにより、該材料をNeowater(商標)に分散させることがもたらされた。この分散物は24時間にわたって持続した。該材料をガラス製バイアルにおいて維持することにより、溶液は、100%の脱水Neowater(商標)およびEtOH−Neowater(商標)の両方において、その後72時間安定に保たれた。
実施例25
ダイゼイン、ダウノルビシンおよびt−boc誘導体を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が3つの材料(ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート(CD−Dau);ダウノルビシン(セルビジン塩酸塩);ダイゼインのt−boc誘導体(tboc−Daid)、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている)を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
ダイゼイン、ダウノルビシンおよびt−boc誘導体を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が3つの材料(ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート(CD−Dau);ダウノルビシン(セルビジン塩酸塩);ダイゼインのt−boc誘導体(tboc−Daid)、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている)を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
A.CD−Dauの可溶化−パート1:
要求濃度:3mg/ml(Neowater)
属性:この材料を、DMSO、アセトン、アセトニトリルに溶解した。
属性:この材料をEtOHに溶解した。
A.CD−Dauの可溶化−パート1:
要求濃度:3mg/ml(Neowater)
属性:この材料を、DMSO、アセトン、アセトニトリルに溶解した。
属性:この材料をEtOHに溶解した。
5個の異なるガラス製バイアルを調製した:
1.5mgのCD−Dau+1.2mlのNeowater(商標)。
2.1.8mgのCD−Dau+600μlのアセトン。
3.1.8mgのCD−Dau+150μlのアセトン+450μlのNeowater(商標)(25%アセトン)。
4.1.8mgのCD−Dau+600μlの10%*PEG(ポリエチレングリコール)。
5.1.8mgのCD−Dau+600μlのアセトン+600μlのNeowater(商標)。
1.5mgのCD−Dau+1.2mlのNeowater(商標)。
2.1.8mgのCD−Dau+600μlのアセトン。
3.1.8mgのCD−Dau+150μlのアセトン+450μlのNeowater(商標)(25%アセトン)。
4.1.8mgのCD−Dau+600μlの10%*PEG(ポリエチレングリコール)。
5.1.8mgのCD−Dau+600μlのアセトン+600μlのNeowater(商標)。
これらのサンプルをボルテックスし、分光光度計での測定を、バイアル#1、バイアル#4およびバイアル#5に対して行った。
バイアルを、アセトンを蒸発させるために開けたままにした(バイアル#2、バイアル#3およびバイアル#5)。
結果
バイアル#1(100%のNeowater):CD−Dauが数時間後に沈降した。
バイアル#2(100%のアセトン):CD−Dauがアセトン内に懸濁されたが、48時間後には、アセトンが材料を溶解したので、材料が部分的に沈降した。
バイアル#3(25%のアセトン):CD−Dauがあまり良好に溶解せず、材料が溶液内部でに漂った(溶液は濁っているようであった)。
バイアル#4(10%PEG+Neowater):CD−Dauが、バイアル#1におけるCD−Dauよりも良好に溶解したが、CD−Dauは、100%アセトンとの混合物の場合ほど良好に溶解しなかった。
バイアル#5:CD−Dauが最初、アセトン内に懸濁され、CD−Dauが完全に溶解した後で、Neowater(商標)を、アセトンを交換するために加えた。最初、アセトンは、Neowater(商標)の存在にもかかわらず、この材料を溶解した。しかしながら、アセトンが蒸発するにつれ、材料は一部がバイアルの底に沈降した。しかしながら、材料は懸濁されたままであった。
バイアル#1(100%のNeowater):CD−Dauが数時間後に沈降した。
バイアル#2(100%のアセトン):CD−Dauがアセトン内に懸濁されたが、48時間後には、アセトンが材料を溶解したので、材料が部分的に沈降した。
バイアル#3(25%のアセトン):CD−Dauがあまり良好に溶解せず、材料が溶液内部でに漂った(溶液は濁っているようであった)。
バイアル#4(10%PEG+Neowater):CD−Dauが、バイアル#1におけるCD−Dauよりも良好に溶解したが、CD−Dauは、100%アセトンとの混合物の場合ほど良好に溶解しなかった。
バイアル#5:CD−Dauが最初、アセトン内に懸濁され、CD−Dauが完全に溶解した後で、Neowater(商標)を、アセトンを交換するために加えた。最初、アセトンは、Neowater(商標)の存在にもかかわらず、この材料を溶解した。しかしながら、アセトンが蒸発するにつれ、材料は一部がバイアルの底に沈降した。しかしながら、材料は懸濁されたままであった。
分光光度計での測定(図76)は、アセトンの存在下および不在下の両方における材料の挙動を例示する。アセトンがある場合、水または10%PEGにより懸濁される材料(両方の場合に、これらは1つだけのピークを示すだけである)との比較において、2つのピークが存在する。
B.CD−Dauの可溶化−パート2:
アセトンが、溶液#2、溶液#4および溶液#5から蒸発するとすぐに、材料はわずかに沈降した。さらなる量のアセトンをこれらのバイアルに加えた。このプロトコルは、材料をアセトンおよびNeowater(商標)の存在下で溶解することを可能にし、一方で、同時に、その後の、溶液からのアセトンの蒸発を可能にする(この処置を2回行った)。2回目のサイクルの後で、液相をバイアルから取り出し、さらなる量のアセトンを沈降した材料に加えた。沈降した材料が溶解すると、それを以前に取り出された液相と一緒にした。一緒にした溶液を再び蒸発させた。材料が全く溶解しなかったので、バイアル#1からの溶液を取り出し、代わりに、1.2mlのアセトンを沈降物に加えて、材料を溶解した。その後、1.2mlの10%PEG+Neowater(商標)もまた加え、しばらくした後で、アセトンを溶液から蒸発させた。これらの処置を終了したとき、これらのバイアルを一緒にして1つのバイアルにした(3mlの総体積)。この最終的な体積の上に、3mlのアセトンを、材料を溶解し且つ透明な液化溶液を収容するために加え、その後、この溶液を50℃で再び蒸発させた。溶液は平衡に達しなかった。これは、そのような状態に一旦達すると、溶液は分離してしまうであろうという事実のためである。平衡を避けることによって、材料の水和状態が維持され、液体として保たれた。溶媒を蒸発させた後、材料を清浄なバイアルに移し、真空条件下で閉じた。
アセトンが、溶液#2、溶液#4および溶液#5から蒸発するとすぐに、材料はわずかに沈降した。さらなる量のアセトンをこれらのバイアルに加えた。このプロトコルは、材料をアセトンおよびNeowater(商標)の存在下で溶解することを可能にし、一方で、同時に、その後の、溶液からのアセトンの蒸発を可能にする(この処置を2回行った)。2回目のサイクルの後で、液相をバイアルから取り出し、さらなる量のアセトンを沈降した材料に加えた。沈降した材料が溶解すると、それを以前に取り出された液相と一緒にした。一緒にした溶液を再び蒸発させた。材料が全く溶解しなかったので、バイアル#1からの溶液を取り出し、代わりに、1.2mlのアセトンを沈降物に加えて、材料を溶解した。その後、1.2mlの10%PEG+Neowater(商標)もまた加え、しばらくした後で、アセトンを溶液から蒸発させた。これらの処置を終了したとき、これらのバイアルを一緒にして1つのバイアルにした(3mlの総体積)。この最終的な体積の上に、3mlのアセトンを、材料を溶解し且つ透明な液化溶液を収容するために加え、その後、この溶液を50℃で再び蒸発させた。溶液は平衡に達しなかった。これは、そのような状態に一旦達すると、溶液は分離してしまうであろうという事実のためである。平衡を避けることによって、材料の水和状態が維持され、液体として保たれた。溶媒を蒸発させた後、材料を清浄なバイアルに移し、真空条件下で閉じた。
C.CD−Dauの可溶化−パート3:
別の3mlの材料(6mlの総体積)を、2mlのアセトン溶解材料と、以前の実験から残った1mlの残留材料とを加えることにより作製した。
別の3mlの材料(6mlの総体積)を、2mlのアセトン溶解材料と、以前の実験から残った1mlの残留材料とを加えることにより作製した。
1.9mlのNeowater(商標)を、アセトンを含有するバイアルに加えた。
100μlのアセトン+100μlのNeowater(商標)を残留材料に加えた。
蒸発を、50℃に調節されたホットプレート上で行った。
この処置を、溶液が安定になるまで3回繰り返した(アセトンの添加およびその蒸発)。
これら2つのバイアルをまとめて一緒にした。
これら2つの溶液を一緒にした後、材料がわずかに沈降した。アセトンを加え、溶媒の蒸発を繰り返した。
バイアル(3ml+2ml)を混合する前に、本明細書中上記のパート2に記載されるような実験で調製された第1の溶液を9℃で一晩インキュベーションして、その結果、溶液が平衡に達し、平衡を維持することを確実にした。そうすることによって、既に溶解している材料は沈降しないはずである。翌朝、溶液の吸収を明らかにし、差グラフを得た(図77)。これら2つのバイアルを一緒にした後、材料がわずかに沈降するので、吸収測定を再び行った。一部の沈降の結果として、溶液をアセトン(5ml)の添加によって1:1で希釈し、続いて、溶液の蒸発をホットプレートにて50℃で行った。蒸発処置を行いながらでの溶液の分光光度計での読み取りはアセトンの存在のために変化した(図78)。これらの実験から、微量のアセトンが存在するとき、アセトンは、もたらされる吸収読み取りに影響を及ぼし得ることが暗示される。
B.ダウノルビシン(セルビジン塩酸塩)の可溶化
要求濃度:2mg/ml
要求濃度:2mg/ml
材料および方法
2mgのダウノルビシン+1mlのNeowater(商標)を1つのバイアルにおいて調製し、2mgのダウノルビシン+1mlのROを第2のバイアルにおいて調製した。
2mgのダウノルビシン+1mlのNeowater(商標)を1つのバイアルにおいて調製し、2mgのダウノルビシン+1mlのROを第2のバイアルにおいて調製した。
結果
この材料は、分光光度計での測定(図79)によって例示されるように、Neowater(商標)および水の両方において容易に溶解した。
この材料は、分光光度計での測定(図79)によって例示されるように、Neowater(商標)および水の両方において容易に溶解した。
結論
ダウノルビシンは難なくNeowater(商標)および水に溶解する。
ダウノルビシンは難なくNeowater(商標)および水に溶解する。
C.t−bocの可溶化
要求濃度:4mg/ml
要求濃度:4mg/ml
材料および方法
1.14mlのEtOHを、18.5mgのt−boc(油状材料)を含有する1つのガラス製バイアルに加えた。その後、これを2つのバイアルに分け、1.74mlのNeowater(商標)またはRO水を、溶液が25%のEtOHを含むようにバイアルに加えた。分光光度計での測定の後、溶媒を溶液から蒸発させ、Neowater(商標)を両方のバイアルに加えてそれぞれのバイアルにおいて2.31mlの最終体積にした。これら2つのバイアルにおける溶液を1つの清浄なバイアルに一緒にし、真空条件下での輸送のためにパッケージングした。
1.14mlのEtOHを、18.5mgのt−boc(油状材料)を含有する1つのガラス製バイアルに加えた。その後、これを2つのバイアルに分け、1.74mlのNeowater(商標)またはRO水を、溶液が25%のEtOHを含むようにバイアルに加えた。分光光度計での測定の後、溶媒を溶液から蒸発させ、Neowater(商標)を両方のバイアルに加えてそれぞれのバイアルにおいて2.31mlの最終体積にした。これら2つのバイアルにおける溶液を1つの清浄なバイアルに一緒にし、真空条件下での輸送のためにパッケージングした。
結果
分光光度計での測定が図80に例示される。この材料はエタノールに溶解した。Neowater(商標)を加え、その後、溶媒を熱(50℃)により蒸発させた後、この材料はNeowater(商標)に溶解することができた。
分光光度計での測定が図80に例示される。この材料はエタノールに溶解した。Neowater(商標)を加え、その後、溶媒を熱(50℃)により蒸発させた後、この材料はNeowater(商標)に溶解することができた。
結論
材料を溶解するための最適な方法は、最初、材料を溶媒(アセトン、酢酸またはエタノール)とともに溶解し、その後、親水性流体(Neowater(商標))を加え、続いて、その溶媒を、溶液を加熱し、溶媒を蒸発させることによって除くことである。
材料を溶解するための最適な方法は、最初、材料を溶媒(アセトン、酢酸またはエタノール)とともに溶解し、その後、親水性流体(Neowater(商標))を加え、続いて、その溶媒を、溶液を加熱し、溶媒を蒸発させることによって除くことである。
実施例26
AG−14aおよびAG−14bを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む担体組成物が2つの薬草材料(AG−14AおよびAG−14B、これらはともに、25mg/mlの濃度で水に溶解しないことが知られている)を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
AG−14aおよびAG−14bを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む担体組成物が2つの薬草材料(AG−14AおよびAG−14B、これらはともに、25mg/mlの濃度で水に溶解しないことが知られている)を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
パート1
材料および方法
2.5mgのそれぞれの材料(AG−14AおよびAG−14B)を、4つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が2.5mg/mlであるように、Neowater(商標)単独、または、75%のNeowater(商標)および25%のエタノールを含む溶液のいずれかで希釈した。これらのチューブをボルテックスし、50℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
材料および方法
2.5mgのそれぞれの材料(AG−14AおよびAG−14B)を、4つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が2.5mg/mlであるように、Neowater(商標)単独、または、75%のNeowater(商標)および25%のエタノールを含む溶液のいずれかで希釈した。これらのチューブをボルテックスし、50℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
結果
エタノールの存在下および不在下でのNeowater(商標)における2つの薬草材料の分光光学的測定を図81A〜Dに示す。
エタノールの存在下および不在下でのNeowater(商標)における2つの薬草材料の分光光学的測定を図81A〜Dに示す。
結論
ROにおける懸濁はAG−14Bを溶解しなかった。Neowater(商標)におけるAG−14Bの懸濁は凝集せず、これに対して、ROでは、AG−14Bが凝集した。
ROにおける懸濁はAG−14Bを溶解しなかった。Neowater(商標)におけるAG−14Bの懸濁は凝集せず、これに対して、ROでは、AG−14Bが凝集した。
AG−14AおよびAG−14BはNeowater/ROに溶解しなかった。
パート2
材料および方法
5mgのAG−14AおよびAG−14Bを62.5μlのEtOH+187.5μlのNeowater(商標)で希釈した。さらに62.5μlのNeowater(商標)を加えた。これらのチューブをボルテックスし、50℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
材料および方法
5mgのAG−14AおよびAG−14Bを62.5μlのEtOH+187.5μlのNeowater(商標)で希釈した。さらに62.5μlのNeowater(商標)を加えた。これらのチューブをボルテックスし、50℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
結果
Neowater(商標)を加える前でのEtOHにおける溶解、その後、EtOHの蒸発により、AG−14AおよびAG−14Bが溶解した。
Neowater(商標)を加える前でのEtOHにおける溶解、その後、EtOHの蒸発により、AG−14AおよびAG−14Bが溶解した。
図82に示されるように、AG−14AおよびAG−14Bは、48時間を超えて懸濁状態で安定なままであった。
実施例27
ペプチドを溶解する、ナノ構造を含む担体の能力
ナノ構造を含む担体組成物が7つの細胞傷害性ペプチド(これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている)を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。加えて、Skov−3細胞に対するこれらのペプチドの影響を、ナノ構造を含む担体組成物がペプチドの細胞傷害活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために測定した。
ペプチドを溶解する、ナノ構造を含む担体の能力
ナノ構造を含む担体組成物が7つの細胞傷害性ペプチド(これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている)を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。加えて、Skov−3細胞に対するこれらのペプチドの影響を、ナノ構造を含む担体組成物がペプチドの細胞傷害活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために測定した。
材料および方法
可溶化:7個すべてのペプチド(ペプチドX、X−5FU、NLS−E、Palm−PFPSYK(CMFU)、PFPSYKLRPG−NH2、NLS−p2−LHRHおよびF−LH−RH−palm kGFPSK)を0.5mMでNeowater(商標)に溶解した。分光光学的測定を行った。
可溶化:7個すべてのペプチド(ペプチドX、X−5FU、NLS−E、Palm−PFPSYK(CMFU)、PFPSYKLRPG−NH2、NLS−p2−LHRHおよびF−LH−RH−palm kGFPSK)を0.5mMでNeowater(商標)に溶解した。分光光学的測定を行った。
インビトロ実験:Skov−3細胞を96ウエルプレートにおいてマッコイ5A培地で成長させ、1500細胞/ウエルの濃度に希釈した。24時間後、2μl(0.5mM、0.05mMおよび0.005mM)のペプチド溶液を、10−6M、10−7Mおよび10−8Mの最終濃度のために1mlのマッコイ5A培地でそれぞれ希釈した。9個の反復物をそれぞれの処理のために作製した。それぞれのプレートは、3つの濃度での2つのペプチド、および、コントロール処理の6つのウエルを含有した。90μlのマッコイ5A培地+ペプチドを細胞に加えた。1時間後、10μlのFBSを(競合を防止するために)加えた。細胞を、クリスタルバイオレットに基づく生存性アッセイで24時間後および48時間後に定量した。このアッセイにおける色素はDNAを染色する。可溶化したとき、単層により取り込まれた色素の量をプレート読取り機で定量した。
結果
Neowater(商標)で希釈された7個のペプチドの分光光学的測定を図83A〜Gに示す。図84A〜Gに示されるように、溶解されたペプチドのすべてが細胞傷害活性を含んでいた。
Neowater(商標)で希釈された7個のペプチドの分光光学的測定を図83A〜Gに示す。図84A〜Gに示されるように、溶解されたペプチドのすべてが細胞傷害活性を含んでいた。
実施例28
レチノールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物がレチノールを溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
レチノールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物がレチノールを溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
レチノール(ビタミンA)をSigma(Fluka、99%HPLC)から購入した。レチノールを下記の条件下でNeowater(商標)において可溶化した。
EtOHおよびNeowater(商標)における1%レチノール(1mlに0.01gr)。
EtOHおよびNeowater(商標)における0.5%レチノール(1mlに0.005gr)。
EtOHおよびNeowater(商標)における0.5%レチノール(25mlに0.125gr)。
EtOHおよびNeowater(商標)における0.25%レチノール(25mlに0.0625gr)。最終的なEtOH濃度:1.5%
レチノール(ビタミンA)をSigma(Fluka、99%HPLC)から購入した。レチノールを下記の条件下でNeowater(商標)において可溶化した。
EtOHおよびNeowater(商標)における1%レチノール(1mlに0.01gr)。
EtOHおよびNeowater(商標)における0.5%レチノール(1mlに0.005gr)。
EtOHおよびNeowater(商標)における0.5%レチノール(25mlに0.125gr)。
EtOHおよびNeowater(商標)における0.25%レチノール(25mlに0.0625gr)。最終的なEtOH濃度:1.5%
EtOHにおけるレチノールの吸光度スペクトル:レチノール溶液を、校正用グラフを作製するために、種々のレチノール濃度とともに無水EtOHにおいて作製した。吸光度スペクトルを分光光度計で検出した。
Neowater(商標)における0.25%および0.5%のレチノールを有し、EtOHの濃度が不明である2つの溶液を分光光度計で検出した。数滴の油滴が水に溶解されないので、レチノールの実際の濃度もまた不明である。
ろ過:Neowater(商標)における0.25%のレチノールを有し、EtOHの最終濃度が1.5%である2つの溶液を調製した。これらの溶液を0.44μlおよび0.2μlのフィルターでろ過した。
結果
レチノールは、アルカリ性のNeowater(商標)において、酸性のNeowater(商標)よりも容易に可溶化した。溶液の色は黄色であり、この色は時間とともに退色した。吸光度実験において、0.5%のレチノールは、0.125%のレチノールと類似するパターンを示し、0.25%のレチノールは、0.03125%のレチノールと類似するパターンを示した(図85を参照のこと)。レチノールは熱において不安定であるので、(その融点は63℃であり)、レチノールはオートクレーブ処理することができない。ろ過は、レチノールが(EtOHに)完全に溶解されたときに可能であった。図86に示されるように、ろ過後の溶液におけるレチノールは0.03125%未満である。両方のろ液は、類似した結果を与えた。
レチノールは、アルカリ性のNeowater(商標)において、酸性のNeowater(商標)よりも容易に可溶化した。溶液の色は黄色であり、この色は時間とともに退色した。吸光度実験において、0.5%のレチノールは、0.125%のレチノールと類似するパターンを示し、0.25%のレチノールは、0.03125%のレチノールと類似するパターンを示した(図85を参照のこと)。レチノールは熱において不安定であるので、(その融点は63℃であり)、レチノールはオートクレーブ処理することができない。ろ過は、レチノールが(EtOHに)完全に溶解されたときに可能であった。図86に示されるように、ろ過後の溶液におけるレチノールは0.03125%未満である。両方のろ液は、類似した結果を与えた。
実施例29
材料Xを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料Xを40mg/mlの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料Xを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料Xを40mg/mlの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
パート1−水およびDMSOにおける溶解性
材料および方法
第1の試験チューブにおいて、25μlのNeowater(商標)を1mgの材料「X」に加えた。第2の試験チューブにおいて、25μlのDMSOを1mgの材料「X」に加えた。両方の試験チューブをボルテックスし、60℃に加熱し、振とう機で1時間振とうした。
材料および方法
第1の試験チューブにおいて、25μlのNeowater(商標)を1mgの材料「X」に加えた。第2の試験チューブにおいて、25μlのDMSOを1mgの材料「X」に加えた。両方の試験チューブをボルテックスし、60℃に加熱し、振とう機で1時間振とうした。
結果
この材料はNeowater(商標)に全く溶解しなかった(試験チューブ1)。この材料はDMSOに溶解し、黄褐色の色を与えた。これらの溶液を24時間〜48時間放置し、それらの安定性を経時的に分析した(図87A〜B)。
この材料はNeowater(商標)に全く溶解しなかった(試験チューブ1)。この材料はDMSOに溶解し、黄褐色の色を与えた。これらの溶液を24時間〜48時間放置し、それらの安定性を経時的に分析した(図87A〜B)。
結論
Neowater(商標)は材料「X」を溶解せず、材料が沈降し、これに対して、DMSOは材料「X」をほぼ完全に溶解した。
Neowater(商標)は材料「X」を溶解せず、材料が沈降し、これに対して、DMSOは材料「X」をほぼ完全に溶解した。
パート2−DMSOの削減および異なる溶媒における材料の安定性/速度論の経時的な試験
材料および方法
それぞれが25μlの総反応体積を含有する6個の異なる試験チューブを分析した:
1.1mgの「X」+25μlのNeowater(商標)(100%)。
2.1mgの「X」+12.5μlのDMSO→12.5μlのNeowater(商標)(50%)。
3.1mgの「X」+12.5μlのDMSO+12.5μlのNeowater(商標)(50%)。
4.1mgの「X」+6.25μlのDMSO+18.75μlのNeowater(商標)(25%)。
5.1mgの「X」+25μlのNeowater(商標)+スクロース*(10%)。
6.1mgの「X」+12.5μlのDMSO+12.5μlの脱水Neowater(商標)**(50%)。
*0.1gのスクロース+1mlのNeowater(商標)=10%Neowater(商標)+スクロース
**脱水Neowater(商標)は、Neowater(商標)を60℃で90分間脱水することによって得た。
材料および方法
それぞれが25μlの総反応体積を含有する6個の異なる試験チューブを分析した:
1.1mgの「X」+25μlのNeowater(商標)(100%)。
2.1mgの「X」+12.5μlのDMSO→12.5μlのNeowater(商標)(50%)。
3.1mgの「X」+12.5μlのDMSO+12.5μlのNeowater(商標)(50%)。
4.1mgの「X」+6.25μlのDMSO+18.75μlのNeowater(商標)(25%)。
5.1mgの「X」+25μlのNeowater(商標)+スクロース*(10%)。
6.1mgの「X」+12.5μlのDMSO+12.5μlの脱水Neowater(商標)**(50%)。
*0.1gのスクロース+1mlのNeowater(商標)=10%Neowater(商標)+スクロース
**脱水Neowater(商標)は、Neowater(商標)を60℃で90分間脱水することによって得た。
すべての試験チューブをボルテックスし、60℃に加熱し、1時間振とうした。
結果
6つの溶媒および材料Xを含む、時間0での試験チューブを図88A〜Cに示す。6つの溶媒および材料Xを含む、可溶化後60分での試験チューブを図89A〜Cに示す。6つの溶媒および材料Xを含む、可溶化後120分での試験チューブを図90A〜Cに示す。6つの溶媒および材料Xを含む、可溶化後24時間での試験チューブを図91A〜Cに示す。
6つの溶媒および材料Xを含む、時間0での試験チューブを図88A〜Cに示す。6つの溶媒および材料Xを含む、可溶化後60分での試験チューブを図89A〜Cに示す。6つの溶媒および材料Xを含む、可溶化後120分での試験チューブを図90A〜Cに示す。6つの溶媒および材料Xを含む、可溶化後24時間での試験チューブを図91A〜Cに示す。
結論
すべての試験チューブにおいて、材料が24時間後に沈降したので、材料「X」は期間中を通して安定なままではなかった。
すべての試験チューブにおいて、材料が24時間後に沈降したので、材料「X」は期間中を通して安定なままではなかった。
試験チューブ2の溶媒と、試験チューブ6の溶媒との間には、同じ割合の溶媒を含有するにしても、違いが認められる。これは、試験チューブ6が、非脱水のNeowater(商標)より疎水性である脱水Neowater(商標)を含有するためである。
パート3 DMSOのさらなる削減および異なる溶媒における材料の安定性/速度論の経時的な試験
材料および方法
1mgの材料「X」+50μlのDMSOをガラス製チューブに入れた。50μlのNeowater(商標)をチューブに少しずつ加え(数秒毎に、5μl)、その後、Neowater(商標)の溶液(9%DMSO+91%Neowater(商標))500μlを加えた。
材料および方法
1mgの材料「X」+50μlのDMSOをガラス製チューブに入れた。50μlのNeowater(商標)をチューブに少しずつ加え(数秒毎に、5μl)、その後、Neowater(商標)の溶液(9%DMSO+91%Neowater(商標))500μlを加えた。
第2のガラス製チューブにおいて、1mgの材料「X」+50μlのDMSOを加えた。50μlのROをチューブに少しずつ加え(数秒毎に、5μl)、その後、ROの溶液(9%DMSO+91%RO)500μlを加えた。
結果
図92A〜Dに例示されるように、材料「X」は、Neowater(商標)を含む溶液に分散されたままであったが、RO水を含む溶液では、チューブの底に沈降した。図93は、ボルテックス後6時間での、RO/Neowater(商標)およびアセトンに分散された材料の吸収特徴を示す。
図92A〜Dに例示されるように、材料「X」は、Neowater(商標)を含む溶液に分散されたままであったが、RO水を含む溶液では、チューブの底に沈降した。図93は、ボルテックス後6時間での、RO/Neowater(商標)およびアセトンに分散された材料の吸収特徴を示す。
結論
材料「X」が、Neowater(商標)と比較したとき、ROに異なって溶解すること、および、材料「X」は、ROと比較したとき、Neowater(商標)においてより安定であることが明らかである。分光光度計での測定(図93)からは、グラフ下面積がROの場合よりも大きいので、材料「X」が、5時間後でさえ、Neowater(商標)にはより良好に溶解していたことが明らかである。Neowater(商標)は材料「X」を水和することが明らかである。DMSOの量を20%〜80%減らすことができ、また、材料「X」を水和し、材料「X」をNeowater(商標)に分散する、Neowater(商標)に基づく溶液を得ることができる。
材料「X」が、Neowater(商標)と比較したとき、ROに異なって溶解すること、および、材料「X」は、ROと比較したとき、Neowater(商標)においてより安定であることが明らかである。分光光度計での測定(図93)からは、グラフ下面積がROの場合よりも大きいので、材料「X」が、5時間後でさえ、Neowater(商標)にはより良好に溶解していたことが明らかである。Neowater(商標)は材料「X」を水和することが明らかである。DMSOの量を20%〜80%減らすことができ、また、材料「X」を水和し、材料「X」をNeowater(商標)に分散する、Neowater(商標)に基づく溶液を得ることができる。
実施例30
SPL2101およびSPL5217を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料SPL2101およびSPL5217を30mg/mlの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
SPL2101およびSPL5217を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料SPL2101およびSPL5217を30mg/mlの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
SPL2101をその最適な溶媒(エタノール)に溶解し(図94A)、SPL5217をその最適な溶媒(アセトン)に溶解した(図94B)。これら2つの化合物をガラス製バイアルに入れ、冷暗所環境で保った。微量の溶媒が全く認められなくなるまで、溶媒の蒸発をデシケータにおいて長時間行い、Neowater(商標)を溶液に加えた。
SPL2101をその最適な溶媒(エタノール)に溶解し(図94A)、SPL5217をその最適な溶媒(アセトン)に溶解した(図94B)。これら2つの化合物をガラス製バイアルに入れ、冷暗所環境で保った。微量の溶媒が全く認められなくなるまで、溶媒の蒸発をデシケータにおいて長時間行い、Neowater(商標)を溶液に加えた。
結果
SPL2101およびSPL5217は、図95A〜Bにおける分光光度計データによって示されるように、Neowater(商標)に溶解した。
SPL2101およびSPL5217は、図95A〜Bにおける分光光度計データによって示されるように、Neowater(商標)に溶解した。
実施例31
タキソールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む担体組成物が材料タキソール(パクリタキセル)を0.5mMの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
タキソールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む担体組成物が材料タキソール(パクリタキセル)を0.5mMの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
可溶化:0.5mMのタキソール溶液を、DMSO、または、17%のEtOHを伴うNeowater(商標)のいずれかで調製した(4mlにおいて0.0017gr)。吸光度を分光光度計により検出した。
細胞生存性アッセイ:150000個の293T細胞を3mlのDMEM培地とともに6ウエルプレートに播種した。それぞれの処理物を、ROまたはNeowater(商標)に基づくDMEM培地で成長させた。タキソール(Neowater(商標)またはDMSOに溶解されたもの)を1.666μMの最終濃度に加えた(3mlの培地中10μlの0.5mMタキソール)。細胞をタキソールによる24時間処理の後で集め、死細胞を検出するためのトリパンブルー溶液を使用して計数した。
可溶化:0.5mMのタキソール溶液を、DMSO、または、17%のEtOHを伴うNeowater(商標)のいずれかで調製した(4mlにおいて0.0017gr)。吸光度を分光光度計により検出した。
細胞生存性アッセイ:150000個の293T細胞を3mlのDMEM培地とともに6ウエルプレートに播種した。それぞれの処理物を、ROまたはNeowater(商標)に基づくDMEM培地で成長させた。タキソール(Neowater(商標)またはDMSOに溶解されたもの)を1.666μMの最終濃度に加えた(3mlの培地中10μlの0.5mMタキソール)。細胞をタキソールによる24時間処理の後で集め、死細胞を検出するためのトリパンブルー溶液を使用して計数した。
結果
タキソールは、図96A〜Bに示されるように、DMSOおよびNeowater(商標)の両方に溶解した。タキソールの様々な溶液の後での293T細胞の生存性を図97に示す。
タキソールは、図96A〜Bに示されるように、DMSOおよびNeowater(商標)の両方に溶解した。タキソールの様々な溶液の後での293T細胞の生存性を図97に示す。
結論
タキソールは、Neowater(商標)における溶液の後で細胞傷害作用を含んでいた。
タキソールは、Neowater(商標)における溶液の後で細胞傷害作用を含んでいた。
実施例32
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
2つの市販のTaqポリメラーゼ酵素(Peq−labおよびBio−lab)を、ddH2O(RO)におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)におけるそれらの活性を求めるために、PCR反応において調べた。酵素を1時間〜2.5時間までの種々の期間にわたって95℃に加熱した。2つのタイプの反応液を作製した:
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した(酵素、水、緩衝液、dNTP類、ゲノムDNAおよびプライマー)。
2つの市販のTaqポリメラーゼ酵素(Peq−labおよびBio−lab)を、ddH2O(RO)におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)におけるそれらの活性を求めるために、PCR反応において調べた。酵素を1時間〜2.5時間までの種々の期間にわたって95℃に加熱した。2つのタイプの反応液を作製した:
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した(酵素、水、緩衝液、dNTP類、ゲノムDNAおよびプライマー)。
煮沸後、必要とされる任意のさらなる反応成分をPCRチューブに加え、通常のPCRプログラムを30サイクルに設定した。
結果
図98A〜Bに示されるように、ナノ構造を含む担体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、RO水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
図98A〜Bに示されるように、ナノ構造を含む担体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、RO水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
実施例33
ナノ構造を含む担体の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む担体組成物が2つの市販のTaqポリメラーゼ酵素(Peq−labおよびBio−lab)の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
ナノ構造を含む担体の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む担体組成物が2つの市販のTaqポリメラーゼ酵素(Peq−labおよびBio−lab)の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
PCR反応を下記のように設定した:
Peq−labサンプル:ナノ構造を含む担体組成物(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)、または、蒸留水(逆浸透=RO)のいずれか20.4μl。
0.1μlのTaqポリメラーゼ(Peq−lab、Taq DNAポリメラーゼ、5U/μl)
PCR反応を下記のように設定した:
Peq−labサンプル:ナノ構造を含む担体組成物(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)、または、蒸留水(逆浸透=RO)のいずれか20.4μl。
0.1μlのTaqポリメラーゼ(Peq−lab、Taq DNAポリメラーゼ、5U/μl)
3つのサンプルを設定し、95℃の一定温度でのPCR装置に入れた。インキュベーション時間は、60分、75分および90分であった。
Taq酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた:
2.5μlの10X反応緩衝液Y(Peq−lab)
0.5μlのdNTP類(10mM)(Bio−lab)
1μlのプライマー GAPDHミックス 10pmol/μl
0.5μlのゲノムDNA 35μg/μl
2.5μlの10X反応緩衝液Y(Peq−lab)
0.5μlのdNTP類(10mM)(Bio−lab)
1μlのプライマー GAPDHミックス 10pmol/μl
0.5μlのゲノムDNA 35μg/μl
Biolabサンプル
ナノ構造を含む担体(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)、または、蒸留水(逆浸透=RO)のいずれか18.9μl。
0.1μlのTaqポリメラーゼ(Bio−lab、Taqポリメラーゼ、5U/μl)
ナノ構造を含む担体(Neowater(商標)、Do−Coop technologies、イスラエル)、または、蒸留水(逆浸透=RO)のいずれか18.9μl。
0.1μlのTaqポリメラーゼ(Bio−lab、Taqポリメラーゼ、5U/μl)
5つのサンプルを設定し、95℃の一定温度でのPCR装置に入れた。インキュベーション時間は、60分、75分、90分、120分および150分であった。
Taq酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた:
2.5μlのTAQ 10X緩衝液(Mg非含有)(Bio−lab)
1.5μlのMgCl2(25mM)(Bio−lab)
0.5μlのdNTP類(10mM)(Bio−lab)
1μlのプライマー GAPDHミックス(10pmol/μl)
0.5μlのゲノムDNA(35μg/μl)
2.5μlのTAQ 10X緩衝液(Mg非含有)(Bio−lab)
1.5μlのMgCl2(25mM)(Bio−lab)
0.5μlのdNTP類(10mM)(Bio−lab)
1μlのプライマー GAPDHミックス(10pmol/μl)
0.5μlのゲノムDNA(35μg/μl)
それぞれの処理(NeowaterまたはRO)のために、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製した。陽性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わないものであった。陰性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わず、かつ、DNAを反応において伴わないものであった。PCRミックスを、煮沸taqアッセイ、ならびに、コントロール反応のために作製した。
サンプルをPCR装置に入れ、下記のように操作した:
PCRプログラム:
1.94℃で2分間の変性
2.94℃で30秒間の変性
3.60℃で30秒間のアニーリング
4.72℃で30秒間の伸長
工程2〜4を30回繰り返す
5.72℃で10分間の伸長
PCRプログラム:
1.94℃で2分間の変性
2.94℃で30秒間の変性
3.60℃で30秒間のアニーリング
4.72℃で30秒間の伸長
工程2〜4を30回繰り返す
5.72℃で10分間の伸長
結果
図99に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、1.5時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
図99に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、1.5時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
実施例34
液体組成物およびナノ構造における熱脱水された多重PCRミックス
液体組成物およびナノ構造が多重PCRシステムにおいて使用することができたかを確認するために、下記の実験を行った。
液体組成物およびナノ構造における熱脱水された多重PCRミックス
液体組成物およびナノ構造が多重PCRシステムにおいて使用することができたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
下記の成分も含む標準的なPCR混合物を調製した(KCl緩衝液、dNTP類、、Taq、BPB):
添加物(最終濃度):スクロース(150mM、200mM)
Taq酵素:Biolab
ヒトインスリン遺伝子に対するプライマー(内部コントロール)
ヒトゲノムDNA(内部コントロール)
下記の成分も含む標準的なPCR混合物を調製した(KCl緩衝液、dNTP類、、Taq、BPB):
添加物(最終濃度):スクロース(150mM、200mM)
Taq酵素:Biolab
ヒトインスリン遺伝子に対するプライマー(内部コントロール)
ヒトゲノムDNA(内部コントロール)
サンプルを、水が蒸発するまでオーブンにおいて熱脱水した(RO/NWベース)。
再水和を、(A)DDWのみ(EO/NW)および(B)PBFDVのDNAセグメントのEGDプライマーミックス(ROおよびNWに基づく)(多重)により行った。
結果
図100において理解され得るように、反応の忠実性を維持しながら、完全なPCRミックスを熱脱水し、それを、NeowaterまたはRO水を使用して再水和することが可能である。さらに、熱脱水されたPCRミックスの多重能を、Neowaterの再水和ミックスを使用して観測することができる。主な標的遺伝子(PBFDVセグメント)が、ヒトゲノムのインスリン遺伝子およびその増幅用プライマーセットを増幅することなく成功裏に増幅されたことを認めることができる。従って、この方法は、多目的PCR反応のための内部コントロールとして使用することができ、これは、PCR反応が、サンプルに基づいて正確に行われたことを保証する特性(これにより、偽陰性の結果が排除される)である。
図100において理解され得るように、反応の忠実性を維持しながら、完全なPCRミックスを熱脱水し、それを、NeowaterまたはRO水を使用して再水和することが可能である。さらに、熱脱水されたPCRミックスの多重能を、Neowaterの再水和ミックスを使用して観測することができる。主な標的遺伝子(PBFDVセグメント)が、ヒトゲノムのインスリン遺伝子およびその増幅用プライマーセットを増幅することなく成功裏に増幅されたことを認めることができる。従って、この方法は、多目的PCR反応のための内部コントロールとして使用することができ、これは、PCR反応が、サンプルに基づいて正確に行われたことを保証する特性(これにより、偽陰性の結果が排除される)である。
実施例35
Neowater(商標)における微小体積PCR
液体組成物およびナノ構造が微小体積PCR反応において使用することができたかを確認するために、下記の実験を行った。
Neowater(商標)における微小体積PCR
液体組成物およびナノ構造が微小体積PCR反応において使用することができたかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
MVPを2μlの最終体積で行った。標的DNAは、PDX遺伝子を含むプラスミドであった。ミックスを調製し、2μlの完全ミックス(両方のDNA、プライマーおよびNeowater(商標)を含有する)をチューブに等分し、PCRを行った。
MVPを2μlの最終体積で行った。標的DNAは、PDX遺伝子を含むプラスミドであった。ミックスを調製し、2μlの完全ミックス(両方のDNA、プライマーおよびNeowater(商標)を含有する)をチューブに等分し、PCRを行った。
結果
図101から理解され得るように、反応のすべてが正しく行われた。このことは、Neowater(商標)がPCRにおける微量反応体積に関与することができることを明らかにする。
図101から理解され得るように、反応のすべてが正しく行われた。このことは、Neowater(商標)がPCRにおける微量反応体積に関与することができることを明らかにする。
実施例36
Neowater(商標)を用いたQPCR
液体組成物およびナノ構造がQPCR反応(定量PCR)において使用することができるかを確認するために、下記の実験を行った。
Neowater(商標)を用いたQPCR
液体組成物およびナノ構造がQPCR反応(定量PCR)において使用することができるかを確認するために、下記の実験を行った。
材料および方法
QPCRを、いくつかのDNA標的(プラスミドおよびゲノム)および遺伝子標的(β−アクチン、PDX、PCTなど)に対してSybr Greenとともに行った。
QPCRを、いくつかのDNA標的(プラスミドおよびゲノム)および遺伝子標的(β−アクチン、PDX、PCTなど)に対してSybr Greenとともに行った。
結果
図102A〜Cにおいて理解され得るように、Neowater(商標)を用いたβ−アクチンのQPCRは優れており、プライマー二量体の形成を何ら伴うことなく、増幅を指数様式(103%の効率、指数的傾き)で利用する。図103A〜Cにおいて理解され得るように、Neowater(商標)を用いたPDXプラスミドのQPCRは優れており、プライマー二量体の形成を何ら伴うことなく、増幅を指数様式(101%の効率、指数的傾き)で利用する。
図102A〜Cにおいて理解され得るように、Neowater(商標)を用いたβ−アクチンのQPCRは優れており、プライマー二量体の形成を何ら伴うことなく、増幅を指数様式(103%の効率、指数的傾き)で利用する。図103A〜Cにおいて理解され得るように、Neowater(商標)を用いたPDXプラスミドのQPCRは優れており、プライマー二量体の形成を何ら伴うことなく、増幅を指数様式(101%の効率、指数的傾き)で利用する。
実施例37
ヒドロキシアパタイトを使用するNeowater(商標)の製造
5つの異なるヒドロキシアパタイト(HA)粒子(1〜5と印が付けられる)を使用して、Neowater(商標)を下記のように作製した。
ヒドロキシアパタイトを使用するNeowater(商標)の製造
5つの異なるヒドロキシアパタイト(HA)粒子(1〜5と印が付けられる)を使用して、Neowater(商標)を下記のように作製した。
異常点未満(すなわち、4℃未満)で維持されたRO水を15ワットの出力で915MHzでのRFシグナルによって照射した。10分のRF照射の後、約900℃に加熱されたヒドロキシアパタイトのサブミクロン粉末を炉から水中に落とした。RF照射をさらに5分間続け、その後、水を室温で2日間置いた。供給源粉末のほとんど(より大きい粒子/凝集物を含有する)が底に沈み、水の透明な部分を分離した。
供給源粉末を、4kVで操作される高分解能走査電子顕微鏡(HRSEM、Ziess、Leo982)によって特徴づけた。粉末を炭素接着テープに広げることによってサンプルを調製した。
作製されたNeowaterもまた特徴づけられた。最初に、NeowaterのQC試験を行い、5個すべての溶液が陽性であることが見出された。次に、HA型Neowater(商標)および供給源粉末を、HRSEM(Leo982)と、200kVで操作され、Gatan CCDを備える透過電子顕微鏡(TEM、Tecnai T20、FEI)との両方によって特徴づけた。HRSEM用のサンプルを、3滴のHA型Neowaterを(良好なコントラストを有するために)Siウエハに置くことによって調製し、TEM用のサンプルを、1滴を銅の400メッシュの炭素薄膜TEMグリッドに置くことによって調製した。すべてのサンプルを、基体の何らかの考えられる分解を防止するために、真空デシケータにおいて乾燥した。
結果
5個すべてのスラリーが、10nm〜100nmの直径範囲を有する個々の丸い粒子を含有することが見出された。図104〜図127のA〜Fに示されるように、電子顕微鏡観察により、HA型Neowater(商標)がBaTiO3型Neowater(商標)のものと非常に類似していたことが明らかにされた。図104は、1〜10の範囲の数字によりNeowater(商標)の性質を調べるQC試験のデジタル顕微鏡写真を示す。この場合、これは陽性で、10であった。このことは高品質のNeowater(商標)を意味する。図105A〜Hは、供給源粉末から得られたHRSEM顕微鏡写真を示す。供給源粉末が球体の大きい凝集物を含有し、一方で、それぞれの球体が、約50nmの程度の直径を有するより小さい粒子から組み立てられることを認めることができる。図106A〜Hは、HA型Neowater(商標)から得られたHRSEM顕微鏡写真を示す。Neowater(商標)製造プロセス後に残るものが、ほとんどの場合、直径が10nm〜100nmである細かい個々の粒子を含有することを認めることができる。図107はHA型Neowater(商標)のTEM顕微鏡写真を示す。TEMのより大きい分解能を使用して、粒子の形状およびサイズをより容易に見ることができる。
5個すべてのスラリーが、10nm〜100nmの直径範囲を有する個々の丸い粒子を含有することが見出された。図104〜図127のA〜Fに示されるように、電子顕微鏡観察により、HA型Neowater(商標)がBaTiO3型Neowater(商標)のものと非常に類似していたことが明らかにされた。図104は、1〜10の範囲の数字によりNeowater(商標)の性質を調べるQC試験のデジタル顕微鏡写真を示す。この場合、これは陽性で、10であった。このことは高品質のNeowater(商標)を意味する。図105A〜Hは、供給源粉末から得られたHRSEM顕微鏡写真を示す。供給源粉末が球体の大きい凝集物を含有し、一方で、それぞれの球体が、約50nmの程度の直径を有するより小さい粒子から組み立てられることを認めることができる。図106A〜Hは、HA型Neowater(商標)から得られたHRSEM顕微鏡写真を示す。Neowater(商標)製造プロセス後に残るものが、ほとんどの場合、直径が10nm〜100nmである細かい個々の粒子を含有することを認めることができる。図107はHA型Neowater(商標)のTEM顕微鏡写真を示す。TEMのより大きい分解能を使用して、粒子の形状およびサイズをより容易に見ることができる。
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許及び特許願はすべて、個々の刊行物、特許及び特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
配列番号1〜8は、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの配列である。
Claims (60)
- 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
- 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、ナノ構造がヒドロキシアパタイトから配合され、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
- 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、水と比較して、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
- 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、水と比較して高まった緩衝能力によって特徴づけられ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
- 物質を、物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む、物質を溶解または分散する方法であって、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、方法。
- 物質は、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 物質は医薬用薬剤である、請求項3または5に記載の液体組成物または方法。
- 医薬用薬剤は、治療剤、化粧剤または診断剤である、請求項7に記載の液体組成物または方法。
- 前記流体分子の少なくとも一部は前記液体の分子と同一である、請求項1、3、4または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記流体分子の前記少なくとも一部はガス状状態にある、請求項1、3、4または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記ナノ構造の濃度は1リットルあたり1020個未満である、請求項1、3、4または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記ナノ構造は、前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項1、3、4または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記ナノ構造は、ナノ構造間で遠距離の相互作用を維持することができる、請求項1、3、4または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記ナノ構造のそれぞれが、前記液体の比重よりも小さい比重、または、前記液体の比重と等しい比重を有する、請求項1、3、4または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項1、3または5のいずれかに記載の組成物または方法。
- 前記組成物は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む、請求項1、4または5に記載の組成物または方法。
- 前記接触の前に、溶媒に前記薬剤を溶解または分散することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記接触の後で、溶媒に前記薬剤を溶解または分散することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記溶媒は極性溶媒である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記溶媒は非極性溶媒である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記溶媒は有機溶媒である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記有機溶媒はエタノールまたはアセトンである、請求項21に記載の方法。
- 前記溶媒は非有機溶媒である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記溶解または分散の後で前記溶媒を蒸発させることをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記蒸発は、熱または圧力によって行われる、請求項24に記載の方法。
- 液体およびナノ構造を含む液体組成物であって、この液体組成物は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の効率を改善することができ、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物。
- 前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のDNAポリメラーゼの触媒活性を高めることができる、請求項26に記載の組成物。
- 前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応はマグネシウムを含まない、請求項26に記載の組成物。
- 前記流体分子の少なくとも一部は前記液体の分子と同一である、請求項26に記載の組成物。
- 前記流体分子の前記少なくとも一部はガス状状態にある、請求項26に記載の組成物。
- 前記ナノ構造の濃度は1リットルあたり1020個未満である、請求項26に記載の組成物。
- 前記ナノ構造は、前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項26に記載の組成物。
- 前記ナノ構造は、ナノ構造間で遠距離の相互作用を維持することができる、請求項26に記載の組成物。
- 前記ナノ構造は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項26に記載の組成物。
- 前記ナノ構造は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む、請求項26に記載の組成物。
- (a)熱安定性DNAポリメラーゼと、
(b)二本鎖DNA検出分子と、
(c)液体およびナノ構造を有する液体組成物であって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、前記コア材料、および、前記整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある、液体組成物と
を含む、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のためのキット。 - 少なくとも1つのdNTPをさらに含む、請求項36に記載のキット。
- 少なくとも1つのコントロールテンプレートDNAをさらに含む、請求項36に記載のキット。
- 少なくとも1つのコントロールプライマーをさらに含む、請求項36に記載のキット。
- 前記二本鎖DNA検出分子は、二本鎖DNAにインターカレーションする検出分子である、請求項36に記載のキット。
- 前記二本鎖DNAにインターカレーションする検出分子は、臭化エチジウム、YO−PRO−1、Hoechst33258、SYBR GoldおよびSYBR GreenIからなる群から選択される、請求項40に記載のキット。
- 前記二本鎖DNA検出分子は、プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子である、請求項40に記載のキット。
- 前記プライマーに基づく二本鎖DNA検出分子は、フルオレセイン、FAM、JOE、HEX、TET、Alexa Fluor594、ROX、TAMRA、ローダミンおよびBODIPY−FIからなる群から選択される、請求項42に記載のキット。
- 前記流体分子の少なくとも一部は前記液体の分子と同一である、請求項36に記載のキット。
- 前記流体分子の前記少なくとも一部はガス状状態にある、請求項36に記載のキット。
- 前記ナノ構造の濃度は1リットルあたり1020個未満である、請求項36に記載のキット。
- 前記ナノ構造は、前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項36に記載のキット。
- 前記ナノ構造は、ナノ構造間で遠距離の相互作用を維持することができる、請求項36に記載のキット。
- 前記ナノ構造は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項36に記載のキット。
- 前記ナノ構造は、水に比較して、薬剤を溶解または分散する高まった能力を含む、請求項36に記載のキット。
- 前記ナノ構造は、ヒドロキシアパタイトから配合される、請求項1、3、4、5、26または36のいずれかに記載の組成物、方法、またはキット。
- 液体組成物を製造する方法であって、この方法は、
(a)ヒドロキシアパタイトを液体に浸すこと、ただし、前記ヒドロキシアパタイトは前記液体より少なくとも500℃温かい;および
(b)前記液体および前記ヒドロキシアパタイトを電磁放射線によって照射すること、ただし、前記電磁放射線は、ナノ構造がヒドロキシアパタイトの粒子から形成されるように選択された振動数によって特徴づけられる
を含む、方法。 - ヒドロキシアパタイトはミクロサイズの粒子を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記ミクロサイズの粒子は結晶性粒子である、請求項52に記載の方法。
- 前記ナノ構造は結晶性のナノ構造である、請求項52に記載の方法。
- 前記液体は水を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記電磁放射線は高周波範囲にある、請求項52に記載の方法。
- 前記電磁放射線は連続波の電磁放射線である、請求項57に記載の方法。
- 前記電磁放射線は変調電磁放射線である、請求項57に記載の方法。
- 前記浸すことと前記照射することは同時に行なわれる、請求項57に記載の方法。
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