KR102116954B1 - 태아 유래 줄기세포의 동결 보존 및 동결 건조용 배지 조성물 - Google Patents

태아 유래 줄기세포의 동결 보존 및 동결 건조용 배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조시 동결 스트레스로부터 줄기세포를 보호하여, 우수한 생존율 및 배양효율을 유지할 수 있도록 하는 조성물에 관한 것이다.

Description

태아 유래 줄기세포의 동결 보존 및 동결 건조용 배지 조성물{Composition for cryopreservation and lyophilization of fetal stem cells}
본 발명은 줄기세포의 동결보존 및 동결건조에 사용하기 위한 세포 보존용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 동결보존 및 동결건조용 배지 조성물은 해동되거나 재수화된 후에도 줄기세포의 생존율 및 배양율을 유지할 수 있도록 하며, 향후 세포치료제의 제조에 이용할 수 있는 특징을 갖는다.
줄기세포는(Stem cell)는 자기 복제(Self-renewal)가 가능하고 다양한 조직의 세포로 분화(Differentiation) 할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로서, 신체 조직의 회복 및 세포 재생 능력을 가지고 있어 현재 확실한 치료법이 없는 퇴행성 질병이나 심한 외상과 같은 치료가 어려운 조직 손상에 있어 의학적 활용도가 매우 높은 차세대 치료 대안으로 활발한 연구가 진행 중이다.
줄기세포를 포함한 세포는 인위적으로 동물의 조직의 일부 및 유기체로부터 분리하여 생체 외(in vitro)의 배양 접시 또는 시험관에서 배양이 가능하며, 생명공학(Biotechnology)분야의 기초 기술, 의약품 생산 및 세포치료제 개발연구 등에 이용되고 있다. 적절한 조건의 배양시스템에서 줄기세포는 계속 증식이 가능하며, 계대배양(subculture)을 통해 증식을 유지한다. 하지만 장기간에 걸쳐 계대배양을 할 경우, 세포 내 돌연변이 및 오염으로 인한 세포 손실이 일어날 수 있으므로, 이를 최소화하고 노화와 형질전환을 방지하는 등 세포가 가지고 있는 특성이 변하지 않는 안정적인 세포주(cell line)를 유지하기 위해 세포 보존 기술은 매우 중요하다.
세포 보존 기술은 세포 배양 기술의 발전과 더불어, 생물학적 연구를 기초로 한 생명공학 분야에 널리 이용되고 있으며, 그 중 동결 보존(cryopreservation) 방법이 주로 사용되고 있다. 동결 보존 방법은 세포를 동결배지에 현탁하여 세포의 온도를 일정하게 낮추어 최종적으로 -196℃에 냉동 보존 하는 것으로 일반적으로 세포에 내동성을 부여하고 보호하는 역할로 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 글리세롤(glycerol)등의 동해방지제와 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)또는 이를 포함한 세포배양 배지가 주 성분으로 이용되고 있다.그러나, 이와 같은 세포 동결 보존 방법은 동해방지제 DMSO와 동물 유래 혈청 FBS가 갖는 세포 독성, 동물 병원성 오염 등의 세포 손상을 야기할 수 있으므로, 새로운 세포 보존 방법과 조성액에 대한 개발과 검증이 필요하다.
동결 건조 기술은 물질을 동결 한 다음 수증기의 부분압을 낮추어 얼음을 직접 기체로 승화시킴으로써 수분을 제거하는 공법으로, 보존과 운반의 편리성을 위해 현재 식품, 제약 및 생명공학 분야에서 많이 쓰이고 있다. 세포 분야에는 아직 임상 연구 중인 분야이지만, 이 기술이 정착된다면 일반 세포 동결 시 필요한 기계나 설비가 필요하지 않아 가격적 비용 절감이 예상되며, 장기 보존이 가능하고 활용 지역 및 운송수단에 제약을 받지 않아 특히 줄기세포 치료제 분야에서 매우 중요한 기술로 이용될 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 동결건조시 혹독한 환경에 줄기세포가 장시간 노출되면서 재수화가 잘되지 않는 등 세포치료제의 품질 및 효과가 저하될 우려가 있다.
따라서 본 발명에서는 태아 유래 줄기세포를 포함한 세포의 새로운 세포 안정적인 보존을 위해, 동해방지제와 동물 유래 혈청 성분이 없는 동결 보존용 및 동결 건조용 배지 조성물을 제시하고자 하며, 치료 시장 확보를 위해 운반 및 치료제 작용 특성상 살아있는 줄기세포를 안정하게 수송하는 방법이 필요한 세포치료제 분야에 도움이 될 것으로 기대 한다.
본 발명은 알부민류; 단당류, 이당류, 당알코올, 다당류 또는 이들의 조합인, 당류; 수용성 중합체; 및 항산화제를 포함하는, 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물 및 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 줄기세포 배양물에 상기 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 줄기세포 보관 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예로서, 알부민류; 단당류, 이당류, 당알코올, 다당류 또는 이들의 조합인, 당류; 수용성 중합체; 및 항산화제를 포함하는, 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물을 제공한다.
상기 “동결보존(cryopreservation) 또는 동결건조(lyophilization) 보조제”는 줄기세포가 동결 스트레스에 의해서 손상되거나 기능을 잃음으로써 해동하거나 재수화하더라도 원래의 줄기세포로 회복되지 못하는 현상을 예방하기 위해 배양시 사용될 수 있는 구성 성분의 조합을 의미할 수 있다.
상기 조성물은 배양액이나 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 배양액 또는 용매는, 예를 들어, DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지, MEM(Minimum Essential Media) 배지, 또는 이의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 해동 또는 재수화된 후에도 곧바로 배양 배지로 사용될 수 있다. 이 경우, 줄기세포가 성장하기에 적합하도록 적절한 배양액이나 용매와 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 "줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미할 수 있다. 상기 줄기세포는, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 또는 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “알부민류”는 알부민으로 분류되는 단백질류를 의미하는 것으로, 예를 들어, 인간혈청알부민, 소혈청알부민, α-락트알부민, 난알부민 또는 이들의 조합이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 알부민류는, 전체 조성물을 기준으로 1 내지 30 w/v%, 1 내지 25 w/v%, 1 내지 20 w/v%, 1 내지 15 w/v%, 3 내지 15 w/v%, 5 내지 15 w/v%, 또는 6 내지 12 w/v%일 수 있다.
상기 “당류”는 단당류, 이당류, 이들의 환원당인 당알코올, 단일 또는 혼합된 다수 당의 폴리머 등을 의미할 수 있고, 상기 다당류는 3당류 이상 당류를 의미할 수 있다. 상기 단당류는, 예를 들어, 만노스, 글루코스, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스 등이 있고; 상기 이당류는, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 멜리보우스, 등이 있고; 상기 당알코올은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨 등이 있고; 상기 다당류는, 라피노스, 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, 셀룰로스, 헤타스타치, 올리고당이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 당류는 두 종류 이상의 혼합물로 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 이당류 및 다당류의 조합을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 트레할로스 및 헤타스타치의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 단당류, 이당류 또는 당알코올은, 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 0.5 M, 0.02 내지 0.4 M, 또는 0.05 내지 0.3 M일 수 있고, 상기 다당류는 전체 조성물을 기준으로 1 내지 30 w/v%, 1 내지 20 w/v%, 1 내지 15 w/v%, 1 내지 10 w/v%, 3 내지 30 w/v%, 3 내지 20 w/v%, 또는 3 내지 10 w/v%일 수 있다.
상기 수용성 중합체는, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴록사머, 카르복시비닐폴리머, 히알루론산 또는 이들의 조합이 있으나, 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 수용성 중합체는 폴리비닐피롤리돈일 수 있다. 상기 수용성 중합체는 전체 조성물을 기준으로 1 내지 20 w/v%, 1 내지 15 w/v%, 1 내지 10 w/v%, 또는 2 내지 8 w/v%일 수 있다.
상기 항산화제는, L-카르니틴, 알카노일 L-카르니틴, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 C, 글루타치온, 폴리페놀, 안토시아닌, 안토시아노이드, 셀레늄, 식이섬유 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 셀레늄은 셀레늄염(selenite)일 수 있고, 예를 들어, 아셀렌산나트륨 (Na2SeO3)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항산화제는 셀레늄일 수 있다. 상기 항산화제는 전체 조성물을 기준으로, 10 내지 80 nM, 20 내지 70 nM, 또는 30 내지 60 nM일 수 있다.
일 구현예에 따른 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물은, 다른 화학적 동결방지제 및/또는 알부민을 제외한 동물 유래 혈청 성분을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 “화학적 동결방지제”는 예를 들어, 다이메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO), 글리세롤 등이 있고, 동물 유래 혈청 성분으로는, 알부민을 제외하고, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 있다. DMSO와 같은 화학적 동결방지제는 줄기세포나 이를 투여 받을 개체에 세포 독성 성분으로 작용할 수 있고, FBS와 같은 동물 유래 혈청 성분은 그 동물로부터 유래된 병원성 인자로 인해 줄기세포 배양물이 오염되어 세포치료제를 오염시킬 위험이 있다.
상기 조성물은, 필요에 따라, pH 완충제, 계면활성제, 완충액, 염 등을 더 포함할 수 있다. 상기 pH 완충제는 글라이신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 아스파르테이트 또는 이들의 조합이 있고, 상기 계면활성제는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트, 디옥틸나트륨 술포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트, 글리코데옥시콜산 나트륨염, 벤즈알코늄 클로라이드, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 라우로마크로골 (lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조에 적합한 구성성분을 포함하므로, 줄기세포의 동결보존 및 동결건조에 사용하기 위한 세포 보존용으로 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예는, 줄기세포 및 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물을 포함하는, 세포치료제를 제공한다.
상기 "세포치료제"란, 사람 및 동물로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 세포치료제는 해동 또는 재수화 후에도 줄기세포의 생존율 및 배양효율을 유지하므로, 장기 보관 또는 취급이 용이한 동결물 또는 동결건조물 형태로 가공된 것일 수 있다. 상기 “동결물”은 줄기세포가 상기 줄기세포 및 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물 또는 이를 포함하는 배양액에 현탁되거나 첨가된 상태로 동결된 것을 의미할 수 있고, 상기 “동결건조물”은 상기 동결물이 추가적인 건조 단계를 거쳐 용매는 현저히 감소되거나 실질적으로 제거된 상태의 산물을 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른, 동결보존용 보조제 조성물은 20 내지 38 ℃, 25 내지 38℃, 또는 30 내지 38℃에서, 10 분 이내, 5 분 이내, 3 분 이내, 또는 2 분 이내에 해동하기에 적합한 것일 수 있다.
상기 세포치료제는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물인 세포치료제는 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 국소 (협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구 (피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로, 가장 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 줄기세포는 적합한 희석제에 약 1×103 내지 5×106 세포/ml의 농도로 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액, 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 필요시, 세포치료제에서 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물은 사용 전에 제거될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예는, 줄기세포 배양물에 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 줄기세포 보관 방법을 제공한다.
상기 줄기세포는, 영하의 온도에서 보관되는 것으로서, 예를 들어, -2 ℃이하, -15 ℃이하, -30 ℃이하, -50 ℃이하, -80 ℃이하, -100℃이하, -150 ℃이하, 또는 -180 ℃이하에서 보관하는 것을 의미할 수 있다.
상기 줄기세포를 보관하는 방법은, -1℃/분 내지 -5℃/분 또는 -1 ℃/분 내지 -2℃/분의 속도로 냉각하면서, -10℃ 내지 -25℃ 또는 -15℃ 내지 -25℃까지 냉각시키는 1차 냉각 단계; 상기 1차 냉각 후, 1차 냉각된 온도에서 30 분 내지 120 분 또는 45 분 내지 90분 인큐베이션하는 단계; 및 상기 인큐베이션 후 -10℃ 내지 -25℃ 또는 -15℃ 내지 -20℃로 급속 냉각하면서, -50℃ 내지 -200℃, -100℃ 내지 -200℃, 또는 -150 ℃ 내지 -200℃까지 냉각하는 2차 냉각 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 단계적 냉각은, 혹독한 온도로 냉각되는 동안 줄기세포의 손상을 더욱 줄일 수 있어 유리할 수 있다.
상기 줄기세포를 보관하는 방법은, 1차 냉각 및/또는 2차 냉각 후 이를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 동결하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 이루어질 수 있고, 예를 들어, 동결건조기의 얼음냉각기 온도 범위를 -30℃ 내지 -150℃ 또는 -50℃ 내지 -120℃로 하여 용매가 충분히 건조될 때까지 건조시킬 수 있다. 건조 단계는 동결 후 48시간 이후에 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 시간 이내에 건조하는 경우 동결된 세포의 안정화가 이루어 지지 않아 건조 과정에 의해 유발되는 스트레스에 따른 손상이 유발될 확률이 높아질 수 있다.
본 발명의 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물은 줄기세포가 동결 스트레스에 대해 안정성을 유지할 수 있도록 하여, 해동되거나 재수화된 후에도 생존율과 배양율을 유지하여 줄기세포의 장기 보존에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 유해한 동결방지제나 동물 유래 혈청 성분을 포함하지 않으므로, 세포 독성이나 동물 유래 병원성 요인에 의한 오염을 최소화할 수 있다. 이러한 이점에 따라, 보관 안정성 및 사용 안전성이 모두 향상된 세포치료제를 제공할 수 있다.
도 1은 알부민 단백질의 함량 (0.1, 1, 5, 10%)에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 2는 수용성 중합체의 함량 (0.1, 1, 5%)에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 3 은 항산화제의 첨가 유무에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 4 는 알부민 단백질과 수용성 중함체의 첨가에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 5는 실시예 5의 배지에서의 동결 보존 이후 해동 (A)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (B)을 거친 세포가 배양 접시 표면에 부착되어 줄기세포가 가지고 있는 섬유아세포 형태로 자라는 모양을 나타낸다. 세포의 형태는 Diff-quick으로 염색한 결과이다(X100).
도 6은 실시예 5의 배지에서의 동결 건조한 세포의 주사전자현미경에서의 분석 결과를 나타낸다. (A)와 (B)는 각각 X250, X650배율에서 동결 건조된 세포의 미세영역을 고배율로 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1: 줄기세포의 수득 및 배지의 제조
1-1. 줄기세포의 수득 및 배양
임신이 확인된 암말의 분만 시에 파열되지 않은 양막낭으로부터 말의 양수(amniotic fluid)를 멸균된 18 G를 장착한 50 cc 주사기로 획득하였다. 채집한 양수를, 5% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin) 항생제를 포함하는 PBS (phosphate Buffered Saline)와 1:1로 섞은 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하였다. 회수한 펠렛을 다시 5 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 PBS를 이용해 세척 및 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 단핵 세포를 분리하였다. 이를 15 % FBS, 1 % Glutamax 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) 배지를 이용하여 0.1% 젤라틴으로 코팅된 배양 접시를 통해 말과동물의 체온과 같은 38 ℃에서 5 % CO2 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하여, 태아 유래 줄기세포를 얻었다.
1-2. 줄기세포 동결보존 또는 동결건조용 배지의 제조
제조예 1-1에서 수득한 태아 유래 양수 줄기세포에 적합한 동결 배지를 하기의 표 1과 같은 조성으로 헤타스타치, 트레할로스, 알부민 단백질 (BSA), 수용성 중합체 (PVP) 및 항산화제 (Selenite)를 기본 용매 DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline)에 혼합하여 실시예 1-1 내지 4-3의 배지를 제조하였다.
샘플 번호 Hetastarch
(V/V%)		 Trehalos
(V/V%)		 BSA
(V/V%)		 PVP
(V/V%)		 Selenite
(V/V%)
1-1 40 10 0.1 0 0.01
1-2 40 10 1 0 0.01
1-3 40 10 5 0 0.01
1-4 40 10 10 0 0.01
2-1 40 10 0 0.1 0.01
2-2 40 10 0 1 0.01
2-3 40 10 0 5 0.01
3-1 40 10 0 0 0
3-2 40 10 0 0 0.01
4-1 40 10 10 0 0.01
4-2 40 10 0 5 0.01
4-3 40 10 10 5 0.01
시험예 1: 배지의 줄기세포 보존력 평가
1-1. 줄기세포의 동결보존 및 해동
상기 제조예 1-1에서 수득된 태아 유래 줄기세포를 제조예 1-2에서 제조된 실시예의 각 배지에 동결한 뒤, 이를 해동하여 보존 배지의 줄기세포 보존력을 평가하였다.
구체적으로, 배양접시 내의 배지를 제거하고 PBS 로 세척 후 0.05% Typsin-EDTA를 이용하여 태아 유래 양수 줄기세포를 기저면에서 분리시켰다. 이후 새로운 5 % FBS가 포함된 배양액으로 Trypsin-EDTA 의 작용을 중지시키고, 세포 배양 접시에서 분리된 세포를 2.5×106/mL의 농도가 되도록 실시예 1-1 내지 4-3의 동결 배지에 혼합하였다. 동결 배지에 혼합된 세포는 2ml 동결 튜브(NUNC)에 담아 이소프로판올 (isopropanol) 동결 박스를 이용하여 -70℃ 냉동고에 1일 이상 냉동한 후 -196℃ 질소(LN2) 탱크로 옮겨서 보관하였다.
동결 보존된 세포의 생존율 및 배양 양상을 확인하기 위해 동결된 세포를 꺼내어 37℃ 항온 수조에서 빠르게 해동하였다. 2분 이내에서 해동된 세포 동결 현탁액을 확인한 뒤, 각 실시예의 배지를 이용하여 0.1 % 젤라틴으로 코팅된 배양 접시를 통해 38 ℃에서 5 % CO2 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하였다.
1-2. 줄기세포의 동결건조 및 재수화(rehydration) 과정
세포 동결 건조 과정 또한 상기 실시예 1-1 내지 4-3의 배지 조성을 통해 만들어진 세포 보존용 배지를 이용하여 태아 유래 줄기세포를 동결 건조한 뒤, 이를 재수화하여 보존 배지를 통한 유효성을 평가 하였다.
상기의 동결 방법과 마찬가지로, 0.05% Typsin-EDTA를 이용하여 태아 유래 양수 줄기세포를 기저면에서 분리시켰으며 5 % FBS가 포함된 배양액으로 Trypsin-EDTA의 작용을 중지시키고, 세포 배양 접시에서 분리된 세포를 2.5×106/mL의 농도가 되도록 각 실시예의 배지에 혼합하였다. 동결 배지에 혼합된 세포는 2ml 동결 튜브(NUNC)에 담아 이소프로판올 (isopropanol) 동결 박스를 이용하여 -1℃/min 속도로 -20℃ 조건에서 1시간, 그 후 약 -18℃/min 속도로 급속 동결 과정을 거쳐 -196℃ 질소 탱크로 옮겨서 보관하였다.
동결 건조 과정은 2일 이상의 동결된 세포를 이용하여 이루어졌으며, 동결건조기 (HyperCOOLTM-HS3110, labogene, South Korea)를 이용하여 건조과정을 수행하였다 동결 건조기의 ice condeser의 온도 범위는 -55℃ 내지 -110℃에서 동결 된 샘플들은 48시간 이내에서 동결 건조된 후 진공상태로 실온 및 -4℃에서 보관 하였다.
세포 재수화 과정은 0.9 % 염화나트륨 (NaCl) 을 녹인 DPBS를 이용하였으며, 동결 건조된 샘플에 재수화 용액을 넣은 후, 각 실시예의 배지를 이용하여 0.1 % 젤라틴으로 코팅된 배양 접시를 통해 38 ℃에서 5 % CO2 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하였다.
1-3. 줄기세포의 생존율 평가
상기 시험예 1-1 및 1-2에서 해동 또는 재수화된 줄기세포를 Trypan blue로 염색하고, automatic cell counter LUNAⅡ (Logos, South Korea)를 사용하여 생존한 세포를 측정하였다. 생존하는 세포는 염색이 되지 않는다. 세포 생존율은 하기의 식으로 계산하여 평가하였다. 그 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.
세포 생존율(%) = (동결 또는 건조 직후 살아있는 세포 / 동결 전 살아있는 세포) X 100
시험예 2: 줄기세포의 형태 보존 평가
상기 시험예 1의 결과에 기반하여, 하기의 표 2와 같은 조성으로 실시예 5의 배지를 제조하고, 동결되거나 동결건조된 줄기세포를 다시 해동하거나 재수화하여 형태가 보존되는지 확인하였다.
실시예 5 농도 (g/L) Molecular Weight (MW)
Hetastarch 60 46mM
Trehalose 378.33 100mM
BSA (Bovine Serum Albumin) 100 151mM
PVP (Poly-vinylpyrrolidone) 50 125mM
Selenite 0.01 58nM
용매: DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)
동결보존 및 동결건조 방법과 해동 및 재수화 방법은 상기 시험예 1과 동일하게 수행하였다.
구체적으로, 동결된 줄기세포를 37℃ 항온 수도에서 1 내지 2분 동안 인큐베이션하여 해동하였고, 동결건조된 줄기세포 배양물에 200-400 ㎕ DPBS를 첨가하여 재수화하였다. 상기 해동 및 재수화 과정을 마친 줄기세포 배양물은 원심분리나 세척을 하지 않고 15 v/v% FBS 및 1 w/v% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) 배지에 첨가하여 38℃, 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다. 그 후, 세포 형태의 자세한 관찰을 위해 Diff-quick 염색 하였다.
Diff-quick 염색은, 배양접시 내의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후, 적당량의 Diff-Quik Fixative 용액 10초, Diff-Quik Solution I 용액 5초, Diff-Quik Solution II 용액 5초 처리한다. 각각의 염색 용액은 섞이지 않으며, 마지막 과정 후 정제수로 배양 접시를 세척 해 준 뒤, 건조 후 현미경으로 세포의 형태를 확인하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 섬유아세포와 같은 방추형으로 바닥에 부착되어 있는 형태를 관찰함으로써, 줄기세포의 외형적 특징을 그대로 유지하고 있음을 확인하였다.
시험예 3: 줄기세포의 손상 여부 평가
동결 건조한 세포의 표면을 자세히 관찰하기 위하여 주사전자 현미경 분석을 실시 하였다.
시험예 2에서 해동되거나 재수화된 염색 전의 줄기세포 배양물을 2.5 w/v% 파라포름알데히드-글루타르알데히드 (paraformaldehyde-glutaraldehyde)(4℃, 인산 완충액, pH 7.2) 고정액에서 2시간 동안 전고정하고, 완충액(0.1M 인산 완충액, pH 7.2)으로 10분씩 3회 세척한 후, 1% OsO4(25℃, 0.1M 인산 완충액, pH 7.2)에서 2시간 동안 후고정하였다. 고정이 끝난 후, 동일한 완충액으로 수회 세척한 후, 에탄올 농도를 증가시키면서 탈수시켜 이소아밀 아세테이트로 치환하고 임계점 건조기(critical point dryer)(Leica, cpd300)로 건조한 후 현미경 분석 하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

Claims (18)

  1. 3 내지 15 w/v%의 알부민류;
    헤타스타치 및 트레할로스;
    2 내지 8 w/v%의 폴리비닐피롤리돈; 및
    10 내지 80 nM의 셀레늄염을 포함하는, 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지, MEM(Minimum Essential Media) 배지, 또는 이의 조합을 더 포함하는 것인,
    조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 알부민류는 인간혈청알부민, 소혈청알부민, α-락트알부민, 난알부민 또는 이들의 조합인 것인,
    조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 배양배지로 사용가능한 것인,
    조성물.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 트레할로스는 0.01 내지 0.5M이고, 상기 헤타스타치는 1 내지 30w/v%인,
    조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서,
    줄기세포의 동결보존 및 동결건조에 사용하기 위한 세포 보존용인 것인,
    조성물.
  15. 줄기세포 및 제1항에 따른 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물을 포함하는,
    세포치료제.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 세포치료제는 동결물 또는 동결건조물인,
    세포치료제.
  17. 줄기세포 배양물에 제1항에 따른 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는,
    줄기세포 보관 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 줄기세포는 영하의 온도에서 보관되는 것인 방법.
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