CN102206285B - 基于内***肽2和神经肽ff的嵌合肽及其合成和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽，其在保留内***肽2的N末端结构和神经肽FF的C末端结构基础上，利用内***肽2的C末端和神经肽FF的N末端中都存在的苯丙氨酸残基的特点而构建的一种全新的嵌合肽EN-9。体内的药理学研究发现：EN-9表现出比内***肽2更强、更持续的镇痛活性，并具有无耐受作用、低成瘾性等优点。此外，化合物EN-9皮下EN-9能引起显著的镇痛作用，能克服内***肽外周注射无镇痛活性的缺陷，从而具有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。

Description

基于内***肽 2 和神经肽 FF 的嵌合肽及其合成和应用

技术领域

本发明属于生化技术领域，涉及一种基于内***肽2和神经肽FF而构建的嵌合肽及其合成方法；本发明同时还涉及该嵌合肽在制备镇痛药物中的应用。

背景技术

在临床上，***类的阿片药物已被人们广泛的应用于治疗和缓解各种疼痛，但是由于阿片类的镇痛药能引起严重的不良反应和阿片依赖作用，而大大限制其在临床治疗中的应用。已有的研究表明哺乳动物中枢和外周都广泛存在着阿片受体。1997年，发现内***肽（endomorphins，EMs），即内***肽1（EM-1，Tyr-Pro- Trp-Phe-NH₂）和2（EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂）为μ阿片受体（MOR）内源性的高效选择性的激动剂，它们对μ阿片受体的K_i分别为360 pM和690 pM （Nature. 1997, 386:499; Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999;897:136）。它们的性能类似于***，能参与体内多种生理功能的调节，尤其是痛觉调节，因此被视为潜在的可替代***的深层次镇痛药物（Jpn. J. Pharmacol. 1998, 78:337；Brain Res. 2000, 881:1；J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999, 291:12; Pharmacol. Rev. 2007, 59:88等）。内***肽为μ-阿片受体的高效选择性激动剂，能介导明显的镇痛活性。已有研究发现中枢注射EM-1和EM-2在CPP实验中表现出完全相反的结果，即分别引起环境的偏爱和厌恶（J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309:816；Neurosci. Lett. 2004, 365:157等）。因此EM-2比EM-1具有更低的药物成瘾性。

1985年，神经肽FF（NPFF，Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂）作为一种抗阿片肽而从牛脑中被分离和鉴定，并发现它具有抗***镇痛的作用（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82:7757）。随后的研究表明，神经肽FF***涉及到两种不同的受体前体（Pro-NPFF_A和NPFF_B受体）和两种不同受体（NPFF₁和NPFF₂受体）（FEBS Lett. 1997, 409:426；Mol. Pharmacol. 1999, 55:804；Nat. Cell Biol. 2000, 2: 703；J. Biol. Chem. 2001, 276:36961；J. Biol. Chem. 2000, 275:25965；J. Biol. Chem. 2000, 275:39324等）。大量的研究结果表明，NPFF 及其相关肽能介导多种生物学活性，即在痛觉、心血管活性、体温、胃肠道活动、摄食、内分泌、阿片耐受和依赖等方面具有一定的调节作用，特别是对阿片类物质所引起的镇痛、耐受和成瘾都具有重要的影响（Prog. Neurobiol. 1996, 48:461；Eur. J. Pharmacol. 1998, 345(1):1；Curr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341等）。

众所周知，内源性的神经肽在机体内都能介导一种或多种主要的生理和药理学活性。但是，神经肽在发挥其主要活性的同时，经常伴随着产生了其次要活性，而这些次要活性就成为了它的副作用。比如，阿片肽在缓解疼痛的同时，会伴随着耐受、成瘾和呼吸抑制等副作用的出现。为了解决这一矛盾，传统的研究策略是以神经肽的母体为化学模板，来进行***的化学修饰而筛选出受体选择性较高且具有优势构象的神经肽类似物，从而达到保持较高生物活性并降低其副作用的预期效果。近年来还发展了一些新策略，基于内源性神经肽设计并构建了一系列杂合肽并对其进行了研究，以期使嵌合肽能够在发挥主要活性的同时，最大限度的减少其副作用的出现。尤其是，Foran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物质（SP）而成功地设计构建了一类全新的杂合肽ESP7（Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂），并且发现脊髓水平注射ESP7能产生阿片受体依赖的镇痛作用，但又不产生镇痛耐受现象的副作用（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97:7621）。

近年的药理学活性鉴定表明，NPFF不仅具有抗阿片的功能，还具有原阿片活性，从而被归为一类重要的阿片调节肽（Curr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341）。NPFF自身对基础痛阈值无影响，即在生理剂量水平对机体的生物学活性影响不大。但NPFF作为阿片调节肽之一，在维持机体的内源性阿片和抗阿片***平衡过程中起着重要作用，参与了镇痛耐受的调节，并能减弱***等阿片物质所引起的条件位置偏爱作用（Curr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341；Peptides. 2006, 27:964；Peptides. 2007, 28:2235；Peptides. 2010, 31:1374等）。因此，NPFF的药理学特性使其适合作为化学模板分子来发展成一类全新的阿片类嵌合肽。

发明内容

本发明的目的是针对***等阿片类镇痛药物在临床应用中具有阿片依赖和成瘾等副作用，提供一种基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽。

本发明的另一目的是提供一种合成基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽的方法。

本发明还有一个目的，就是提供该嵌合肽在制备镇痛药物中的应用。

（一）基于内***肽 2 和神经肽 FF 的嵌合肽

本发明基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽，基于内***肽2和神经肽FF而构建的，其N末端和C末端分别为内***肽-2和神经肽FF（3-8）的结构，其结构式如下：

。

（二）基于内***肽 2 和神经肽 FF 的嵌合肽的合成

本发明基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽的合成，包括以下工艺步骤：

（1）树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌30-40 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

（2）脱除Fmoc基团保护：使溶胀、抽干溶剂后的树脂在体积浓度20-22％的六氢吡啶DMF溶液中，搅拌3-5min后抽干，重复2-3次；再加入到体积浓度20-22％的六氢吡啶DMF溶液，搅拌10-15min ，使Fmoc基团脱除完全，然后抽干溶剂；最后用DMF洗涤除净六氢吡啶；

（3）缩合：依次将2-4eq 的N-α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）完全溶解于DMF中，再加入4-8eq的二异丙基乙胺（DIEA）后混匀混合溶液；然后在氩气保护下使脱除Fmoc基团保护的树脂在上述混合溶液中搅拌反应50-60min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤除去未反应的N-α-Fmoc保护基团氨基酸、HOBt、HBTU；

（4）肽链的延长：重复步骤（2）、（3），依次将带有N-α-Fmoc保护基团氨基酸逐个缩合至树脂上，直至完成所有氨基酸残基的缩合，得到肽树脂；

（5）肽链从树脂上的切割：肽链缩合全部完成后，按照步骤（2）的方法将肽树脂最后一个氨基酸的 Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15-20ml的切割剂，于室温下切割反应2-3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的***析出沉淀；静置后先去除上清的***，再用水充分溶解后用分液漏斗除去***相，合并水相，冷冻干燥得白色的粗肽固体粉末；所述切割剂是由三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、水以95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶剂；

（6）粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度15-20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末。

上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成功合成了基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽，纯化后样品纯度为98％以上。

（三）基于内***肽 2 和神经肽 FF 的嵌合肽的镇痛实验

本发明基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽，是基于内***肽2和神经肽FF两类内源性神经肽嵌合而成的全新化合物EN-9，其同时保留了决定这两种神经肽生物活性的关键结构区域，因此，在保持了阿片镇痛作用的同时，能有效地降低阿片耐受和成瘾等副作用。下面通过药理实验说明本发明的嵌合肽的EN-9的镇痛及耐受作用。

1、EN-9的镇痛实验

本发明的化合物EN-9和内***肽EM-2，通过侧脑室中枢注射后，利用小鼠光热甩尾实验进行了体内痛觉调节作用的活性检测和比较。

（1） 小鼠侧脑室埋管

脑立体定位仪为江湾I型。昆明系雄性小鼠，体重20±2 g。用戊巴比妥钠麻醉（i.p.，80mg/kg小鼠体重）后，置于脑立体定位仪上。将小鼠头部手术区用碘伏消毒，剪去毛发，沿矢状缝切开头皮，露出颅骨，找到前囟位置。从前囟向后3 mm，向左/右1 mm，即为侧脑室的上方位置。自制不锈钢管（24-gauge的一段，上面接一小段PE-10管）按上述位置向下***3 mm，即为侧脑室。一段不锈钢琴弦（28-gauge）***到上述钢管中，以防止脑脊液外溢或感染。用医科牙托粉固定钢管，凝固后，缝合伤口。手术后，小鼠恢复4天，第5天开始后续实验。实验中涉及到的手术器械、不锈钢管等均消毒。药物溶解在生理盐水中，在-20℃保存，使用前解冻。

（2） 痛觉检测实验

使用上述侧脑室埋管小鼠，利用光热甩尾仪来检测药物对痛觉作用的影响。环境温度控制在20±1℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物。给药前先测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。记录给药之后第5，10，15，20，25，30，40，50，60分钟甩尾潜伏期。为防止烫伤，甩尾时间超过10秒都以10秒来计算。

（3）计算药物的MPE和AUC值

痛觉调节作用利用MPE（maximum possible effect）值来评价，MPE（％）＝ [(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。由于药物镇痛作用时间主要为0-30 min，因此每只小鼠的MPE数据被转化为曲线下面积AUC（area under the curve）值（0-30 min），来评价药物对小鼠痛觉的调节作用。获得的AUC数据用平均值±标准误差（Means±S.E.M.）表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Dunnett检验）来进行数据统计和分析，^**P < 0.01, ^***P < 0.001 表示药物处理组的AUC值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果如图1和图2所示。

生理盐水组为空白溶剂对照组，EN-9的药物浓度分别为5, 10, 20和30 nmol，EM-2的药物浓度分别为1, 5, 10, 20和30 nmol。每组动物数为8-11只。实验结果表明小鼠侧脑室注射新化合物EN-9能剂量依赖地产生镇痛作用。EN-9的镇痛作用在注射后的第10分钟达到最大效应。在给药后的前15分钟，EN-9都保持了较强的镇痛活性，其镇痛作用的持续时间比EM-2的更长。如图2所示，各组的数据转化为曲线下面积AUC值（0-30 min），与空白溶剂对照生理盐水组相比，侧脑室注射EM-2（5 ~ 30 nmol）和EN-9（10 ~ 30 nmol）都显著地增加了小鼠的甩尾潜伏期。与同剂量的EM-2相比，侧脑室注射EN-9表现出更强、更持续的镇痛活性。

2、EN-9的镇痛耐受实验

进一步比较本发明的化合物EN-9和EM-2在镇痛耐受方面的生物活性。通过小鼠侧脑室连续六天注射药物，用光热甩尾法检测了它们对镇痛作用的耐受现象。

（1）小鼠的痛觉耐受实验方法

昆明系雄性小鼠，侧脑室埋管后恢复5天，连续注射高剂量药物6天，每天注射一次，利用光热甩尾仪来检测药物连续注射对痛觉作用的影响。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物。实验在每天9点到11点之间进行。第一天药物注射前测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。实验中记录给药之后第5、10、15、20、25和30分钟甩尾潜伏期。为防止烫伤，甩尾时间不超过10秒。

（2）耐受实验数据统计

实验数据用MPE（maximum possible effect）来表示，MPE（％）＝100×[（给药后的痛阈－基础痛阈）/（10秒－基础痛阈）]。每只小鼠的MPE数据被转化为曲线下面积AUC值，来评价药物对小鼠痛觉的调节作用。获得的AUC数据用平均值±标准误差（Means±S.E.M.）表示，小鼠六天镇痛作用的差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Tukey HSD检验）来进行统计，^**P < 0.01，^***P < 0.001表示AUC值与第一天EM-2镇痛作用相比有显著性差异。实验结果如图3所示。

生理盐水组为空白溶剂对照组，EN-9的药物浓度为30和60 nmol，EM-2的药物浓度为60 nmol。每组动物数为8-15只，每组的数据转化为曲线下面积AUC值（0-30 min）。实验数据表明小鼠的侧脑室连续六天注射空白溶剂对照生理盐水后，小鼠都不产生镇痛活性。与空白溶剂对照生理盐水组相比，第一天侧脑室注射EM-2（60 nmol）和EN-9（30和60 nmol）都显著地增加了小鼠的甩尾潜伏期。但小鼠侧脑室连续注射六天的EM-2，会在注射的第四天开始其AUC值就显著地降低，即镇痛作用从第四天起出现了耐受现象。与第一天相比，第四天差异性非常显著（P < 0.01），第五天和第六天的差异性极其显著（P < 0.001）。而30和60nmol的EN-9侧脑室连续注射六天期间，其镇痛活性的AUC值都无明显变化（P > 0.05），在连续注射的六天内一直保持较好的无耐受的镇痛活性。

3、EN-9的药物成瘾实验

条件位置偏爱（CPP）实验，被广泛用于检测药物的奖赏性质，是一种反应性强化模型。经过不断地改进和完善，此实验已成功地用于评价各类精神药物的作用，并且检测的结果与经典药物成瘾实验模型——自身给药实验的研究结果相一致，因而这一方法已被广泛地认同，并成为评价药物精神依赖性潜力和作用机制的方法之一。

考虑到内***肽1和2在CPP实验中表现出完全相反的结果，即分别引起环境的偏爱和厌恶，故而选择CPP实验作为研究本发明的化合物EN-9药物成瘾的研究模型。本实验的原理主要为巴甫洛夫条件反射，当某主要强化刺激与环境相关联时，该环境就获得了强化作用。其主要优点是不仅能测出药物的奖赏效果，而且能测出药物的厌恶效果，并已普遍用于评价包括阿片在内的不同***的奖赏作用。本实验中将老鼠在给药的格子中所逗留的时间作为药物渴求的间接量度。

（1） 非偏差CPP的实验模型装置

总共三个格子。左右两个大格子（20×20×20 cm）被中间的小间（5×20×20 cm）分开。两个大格子底部开一个5×5的小门供小鼠出入，小门可以关闭，小鼠出入大格子的时候，用“Π”形的套管连接两个小门，防止小鼠在中间的格子中逗留。按照如下的方法修饰格子，造成视觉和触觉的差异：一个大格子的墙壁及顶部贴上黑白相间的条纹（黑2 mm，白18 mm），底部为粗糙的铁丝网地板；另一个大格子的墙壁和顶部贴上白底黑色斑点（直径10 mm，间隔10 mm），底部为光滑的有机玻璃地板。

（2） CPP实验的具体操作过程。

第一天：测基础值。休息至少3天，挑选行为、体态以及活性正常的侧脑室埋管小鼠。CPP装置清洗干净，将小门打开使得小鼠可以在两个格子之间自由移动。将小鼠放入CPP盒，测其在两个格子中停留的时间。测定总时间为15min。测定后删除在某个格子中逗留时间超过60％的小鼠。挑选出的小鼠编号。

第二到四天：训练。将CPP盒的小门关闭，使得小鼠不能离开所处的格子。早上（9：00-12：00），小鼠侧脑室注射生理盐水，然后立即置于斑点格子中训练15min。下午（15：00-18：00），小鼠侧脑室注射药物（盐水对照、***、EM-2或EN-9），然后立即置于条纹格子中训练15min。保持小鼠接受注射的时间在每一天是固定的，连续训练三天。

第五天：评价CPP表现。同第一天一样，测定给药后小鼠在每个格子中的逗留时间。

（3） 实验结果分析和统计

CPP实验结果用CPP得分（CPP score）来表示。CPP得分的定义为第五天小鼠在药物关联格子（即本实验的条纹格子）中的逗留时间减去第一天小鼠在药物关联格子中的逗留时间。实验数据用平均值±标准误差表示，并用单因素方差方法（one-way ANOVA的Tukey HSD检验）进行分析和统计，^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001表示药物处理组的CPP得分与盐水对照组相比，小鼠条件位置偏爱或厌恶有差异。实验结果如图4所示。

生理盐水组为空白溶剂对照组，***的药物浓度为6 nmol，EM-2的药物浓度为15和30 nmol，EN-9的药物浓度分别为15、30和60 nmol。每组小鼠数为10-12只。实验结果发现小鼠的侧脑室注射空白溶剂对照生理盐水后，小鼠既不产生条件位置偏爱也不出现厌恶。与生理盐水对照组相比，侧脑室注射6 nmol ***能产生显著的条件位置偏爱。而侧脑室注射15和30 nmol的EM-2，小鼠会表现出条件位置厌恶，并在30 nmol高浓度时其条件位置厌恶作用显著。然而，15 nmol的EN-9既不产生条件位置偏爱也不出现厌恶。与生理盐水组相比，30 nmol的EN-9表现出轻微的条件位置厌恶（P > 0.05），而较高剂量的EN-9（60nmol）才表现出非常显著条件位置厌恶活性（P < 0.01）。这些结果表明本发明的化合物EN-9与***相比，具有低成瘾性的优点，并且它比EM-2具有更低的条件位置厌恶作用。

4、EN-9在外周水平注射时对痛觉的调节

（1）痛觉检测实验

昆明系雄性小鼠，体重20±2 g。利用光热甩尾仪来检测药物对痛觉作用的影响。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠皮下注射药物的体积为100 μl。EN-9和EM-2均用无菌的生理盐水溶解，在-20℃保存，使用前解冻。给药前先测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。记录给药之后第5，10，15，20，30，40，50，60分钟甩尾潜伏期。为防止烫伤，甩尾时间超过10秒都以10秒来计算。

（2）计算药物的MPE值

痛觉调节作用利用MPE（maximum possible effect）值来评价，MPE（％）＝100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。数据用平均值±标准误差（Means±S.E.M.）表示，不同药物处理组各时间点所测定的MPE值与空白溶剂对照组之间的差异用单因素方差（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行分析和统计，^**P < 0.01, ^***P < 0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组相同时间点的MPE值相比差异显著。实验结果如图5所示。

生理盐水组为空白溶剂对照组，EN-9和EM-2处理组的药物浓度均为30 mg/kg。每组动物数为7-8只。实验结果表明小鼠皮下注射空白溶剂对照生理盐水基本不影响其基础痛阈值。而皮下注射30 mg/kg 的EM-2也基本无痛觉调节作用。但与空白溶剂对照生理盐水组相比，小鼠皮下注射本发明的新化合物EN-9能时间依赖地引起镇痛作用。EN-9的镇痛作用在注射后的第10分钟达到最大效应（约65 %的MPE值），其镇痛作用能持续50分钟。从而表明新化合物EN-9能克服内***肽在外周水平注射无镇痛活性的弱点。

体内的痛觉调节、耐受和条件位置偏爱等一系列的药理学实验的研究结果表明：本发明基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽EN-9表现出比内***肽2更强、更持续的中枢镇痛活性，并具有无耐受作用、低成瘾性等优点。此外，皮下EN-9能引起显著的镇痛作用，能克服内***肽在外周注射无镇痛活性的缺陷，具有治疗疼痛的潜在临床应用价值。

附图说明

图1 小鼠侧脑室注射EN-9所产生剂量依赖性镇痛作用的时效曲线。

图2 小鼠侧脑室注射EN-9和EM-2所产生镇痛作用的比较。

图3 小鼠侧脑室中连续六天注射EN-9和EM-2所引起的镇痛作用的变化。

图4 小鼠侧脑室注射EN-9和EM-2所诱导的小鼠条件位置厌恶。

图5小鼠皮下注射EN-9和EM-2所产生镇痛作用的比较。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明嵌合肽的合成方法作进一步说明。

I 材料

仪器：高效液相色谱仪（HPLC）为Waters公司的Delta 600；分析柱：DELTA PAK 5μC18 300Å 3.9×150mm；制备柱：DELTA PAK 15μ C18 300 Å 7.8×300mm。质谱仪为PE Biosystems，Mariner System 5074。手动固相多肽合成仪，由本实验室设计后由玻璃工制作（合成仪的设计原理具体参考Chen WC和White PD所编的《Fmoc solid phase peptide synthesis》中第14页图4，并在其基础上作部分改进，将机械搅拌方式替代鼓氮气法，从而达到反应溶液充分混合的目的）。试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin （1% DVB，200 ~ 400mesh，取代值S = 0.40 mmol/g resin），购自天津南开和成公司。N-α-Fmoc保护的氨基酸（Fmoc-Aa）、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）、二异丙基乙胺（DIEA）和三异丙基硅烷（TIS）购自吉尔生化（上海）有限公司。茚三酮为上海试剂三厂产品。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、六氢吡啶（哌啶）、甲醇（MeOH）和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸（TFA）、苯酚和吡啶均为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。

粗肽合成

采用Fmoc保护策略的固相多肽合成法。肽链延长采用逐一接肽法（step by step）。具体操作步骤如下：

（1）树脂预处理：将900 mg Rink-Amide-MBHA树脂加入至合成仪中，加入12 ml的DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。

（2）脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入12ml 的体积浓度20％的六氢吡啶DMF溶液，搅拌5min后抽干，重复2次。再加入12ml 的体积浓度20％的六氢吡啶DMF溶液，搅拌15min 后抽干。最后加入12ml 的DMF，搅拌3min后抽干，重复4次，得肽树脂样品；按照步骤（3）操作进行茚检，溶液、树脂均为蓝色表示脱保护完全。

（3）茚检：合成过程用茚三酮试剂检验来确定每一步的缩合和脱保护是否完全。用于茚检的三种试剂的配法：试剂

80g苯酚/20ml乙醇；试剂

2.0ml 0.001M***（水）/ 98ml吡啶；试剂 5g 茚三酮/100ml乙醇。按以下顺序加入：肽树脂样品+0.1ml试剂

+ 0.2ml试剂

+0.1ml试剂

，沸水浴3-10min后观察。

（4）缩合：在小烧杯中用DMF依次将2.5eq Fmoc-Aa、HOBt、HBTU完全溶解，再加入5eq DIEA后混合充分，将12ml的混合溶液加入到装有脱除Fmoc树脂的合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60min，抽干溶剂。加入12ml 的DMF，搅拌3min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。

（5）肽链的延长：重复步骤（2）、（4），按照嵌合肽结构由C-末端向N-末端的顺序，依次将带有N-α-Fmoc保护基团氨基酸逐个缩合至树脂上，每步反应完成后，经负压作用过滤去除反应器中试剂。直至完成所有氨基酸残基的缩合。

肽链从树脂上的切割

肽链缩合全部完成后，按照上述步骤（2）中操作将肽树脂最后一个氨基酸的 Fmoc基团脱除完全。然后按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽链树脂置于反应器中，加入18ml的切割剂（体积比为TFA:TIS:水= 95:2.5:2.5），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的***析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清***吸出，加水充分溶解后，利用分液漏斗将***从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得白色的粗肽固体粉末383.7 mg，产率为86.8 %。

粗肽的脱盐和纯化。

称取 90mg左右粗产物，溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm）, 流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐处理后白色粉末323.1 mg。再用反向高效液相色谱（HPLC）C₁₈柱（XBridge TM BEH 130 C₁₈，19 mm×250mm）对所得脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，冷冻干燥得白色的纯肽固体粉末209.8 mg。纯化后的EN-9样品纯度为98％以上。质谱和色谱分析检测结果如表2所示。

表 1 EN-9 的质谱和色谱分析检测结果

注：

方法1：梯度洗脱：10–100% 乙腈/水(0.05% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：Delta Pak C₁₈, 5 μm, 150×3.9 mm；

方法2：梯度洗脱：10–80%乙腈/水(0.05% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：Delta Pak C₁₈, 5 μm, 150×3.9 mm。

从质谱结果分析说明，所合成的肽化合物EN-9与设计的化合物结构一致。色谱检测结果表明，所合成的肽化合物EN-9与内***肽2和神经肽FF具有不同的保留时间，与预期的结果一致。

Claims (4)

1.基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽，其结构式：

。

2.如权利要求1所述基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽的制备方法，包括以下工艺步骤：

（1）树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌30-40 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

（2）脱除Fmoc基团保护：使溶胀、抽干溶剂后的树脂在体积浓度20-22％的六氢吡啶DMF溶液中，搅拌3-5min后抽干，重复2-3次；再加入到体积浓度20-22％的六氢吡啶DMF溶液，搅拌10-15min ，使Fmoc基团脱除完全，然后抽干溶剂；最后用DMF洗涤除净六氢吡啶；

（3）缩合：依次将2-4eq 的N-α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入4-8eq的二异丙基乙胺后混匀混合溶液；然后在氩气保护下使脱除Fmoc基团保护的树脂在上述混合溶液中搅拌反应50-60min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤除去未反应的N-α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐；

（4）肽链的延长：重复步骤（2）、（3），依次将带有N-α-Fmoc保护基团的氨基酸逐个缩合至树脂上，直至完成所有氨基酸残基的缩合，得到肽树脂；

（5）肽链从树脂上的切割：肽链缩合全部完成后，按照步骤（2）的方法将肽树脂最后一个氨基酸的 Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15-20ml的切割剂，于室温下切割反应2-3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的***析出沉淀；静置后先去除上清的***，再用水充分溶解后用分液漏斗除去***相，合并水相，冷冻干燥得白色的粗肽固体粉末；

（6）粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度15-20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末。

3.如权利要求2所述基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶剂。

4.如权利要求1所述基于内***肽2和神经肽FF的嵌合肽在制备镇痛药的应用。

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