KR101092411B1 - 이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 디메틸 설폭사이드, 동물세포배양 배지 및 우태아 혈청을 기본 성분으로 하여 이에 수크로스를 첨가하여 동결 보호제를 만들고, 이 용액을 이용하여 이식용 피부 조직을 동결 처리하는 방법에 관한 것이다.

동종 피부, 동결 처리, 수크로스

Description

이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부{METHOD FOR PROCESSING ALLOGRAFT SKIN AND CRYO-PRESERVED ALLOGRAFT SKIN MANUFACTURED THEREFROM}

본 발명은 이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 동물세포배양 배지 및 우태아 혈청(fetal bovine serum)을 기본 성분으로 하여 이에 수크로스(sucrose)를 첨가하여 동결 보호제를 만들고, 이 용액을 이용하여 이식용 피부 조직을 동결 처리하는 방법에 관한 것이다.

피부는 인체 표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 체액의 유실 및 외부로부터 유해물질과 미생물의 유입을 막고, 물리적, 화학적 자극 등으로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 수행하고 있다. 심한 화상, 외상, 상피암 절제 및 피부 질환 등으로 피부가 심각하게 손실된 환자의 경우, 손실 부위의 감염 및 체액의 손실을 막아주는 보호막의 기능과 함께 환자의 상처 부위에 흉터가 남지 않고, 자연치유과정에서 발생될 수 있는 심각한 수축을 막아 주어야 한다. 손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법으로는 환자 자신의 피부를 이식하는 자가 이식(autograft), 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식(allograft), 동물의 피부를 이식하는 이종이식(xenograft)의 세가지 방법이 있다. 이들 방법 중 자가이식이 가장 이상적이지만, 화상부위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 따르며, 채취 부위가 새로운 상처 부위로 남게 되는 어려움이 있다. 동종이식은 영구적인 생착 보다는 상처 주변부의 세포의 이동과 치유를 돕는 역할을 한다.

특별히 표피층, 진피층 및 피하층까지 손상되는 3도 화상의 경우에는 피부이식 치료가 필수적으로 요구된다. 현재 주로 사용되고 있는 피부이식 치료는 자가이식 방법을 이용하는데, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새로운 외상이 발생되어 환자의 고통이 증가하고, 완치되는데 시간이 많이 소요되며, 경제적 부담 또한 크다. 또한 심한 화상환자와 같이 건강한 신체부위가 충분히 남아있지 않는 경우에는 자가 이식방법을 적용할 수 없거나 또는 여러 차례에 걸쳐 이식수술을 시행하여야 한다는 문제점이 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다른 사람의 피부를 이용하는 동종이식, 돼지 등과 같은 다른 동물의 피부를 이용하는 이종이식 등이 시도되고 있으나, 면역거부반응뿐만 아니라 다른 부작용을 종종 초래하고 있다.

따라서, 가장 일반적으로 국내외 병원에서 시행하는 화상수술의 경우 먼저 죽은 표피층과 진피층을 제거를 하고 면역거부반응을 없애기 위해 기증된 사체의 피부를 이용하여 표피를 제거한 후 진피 내 세포들을 제거한 무세포 진피를 이용하여 피부 이식을 수행한다. 이후 배양된 각질 세포가 그 위에 온전한 피부를 완성하게 된다. 이렇게 완성된 피부는 기저막층을 포함하고 있어 실제 피부와 같이 외부 유해 물질로부터 우리 몸을 보호하는 역할을 수행할 수 있다. 하지만 이러한 이식 용 피부는 워낙 고가인데다 대부분 수입산이기 때문에 수급이 원활하지 않다는 문제가 있다.

또한, 기증자로부터 채취된 피부의 처리를 위해 종래에 널리 사용되는 방법은 피부를 글리세롤 농도 별로 처리하는 글리세롤 보존 방법인데 이 방법은 세포의 생명력을 잃게 하여 세포의 생존율이 낮아 치료기간이 길다는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명은 이식용 피부를 가공 시 종래의 글리세롤 보존 방법 보다 효과적으로 세포의 생존율을 높이고 생물학적 성질의 변화를 최소화 시킬 수 있는 새로운 이식용 동종피부의 처리 방법을 제공하는 것을 그 기술적인 과제로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 우태아 혈청(fetal bovine serum), 동물세포배양 배지 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 혼합하고;

ⅱ) 상기 용액에 수크로스(sucrose)를 용해하여 동결 보호제를 제조하며;

ⅲ) 상기 동결 보호제를 분리된 피부에 침투시키고;

ⅳ) 동결 보호제가 침투된 피부를 controlled rate freezer에서 동결하는 것을 포함하는 이식용 동종 피부의 처리 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 처리 방법에 의하여 제조된 동결보존동종피부를 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 동결 보호제의 기본 성분으로는 디메틸 설폭사이드, 동물세포배양 배지 및 우태아 혈청이 사용된다. 본 발명에서 디메틸 설폭사이드, 동물세포배 양 배지 및 우태아 혈청은 바람직하게는 중량 기준으로 1 : 3~5 : 4~6의 혼합비로 사용된다. 본 발명에서 동물세포배양 배지의 혼합비가 3 미만이면 필수 영양물질의 결핍으로 인한 세포 사멸율의 증가 문제가 있을 수 있고, 5를 초과하면 동결 시 냉해로 인한 세포 사멸율의 증가 문제가 있을 수 있다. 본 발명에서 우태아 혈청의 혼합비가 4 미만이면 냉해 방지 혈장 단백질의 결핍으로 인하여 동결 시 냉해로 인한 문제가 있을 수 있고, 6을 초과하면 과도한 혈장 성분으로 인하여 세포 활성에 대한 문제가 있을 수 있다. 본 발명에서 디메틸 설폭사이드, 동물세포배양 배지 및 우태아 혈청은 가장 바람직하게는 중량 기준으로 1 : 4 : 5의 혼합비로 사용된다. 본 발명에서 동물세포배양 배지는 당 분야에 공지된 임의의 배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포배양 배지는, 예를 들면 MEM, DMEM, RPMI 1640, IMDM, Defined Keratinocyte-SFM(without BPE), Keratinocyte-SFN(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium, AmnioMAX-C100 Complete Medium 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 동결 보호제는 상기 기본 성분이 혼합된 용액에 수크로스(sucrose)가 용해됨으로써 제조된다. 본 발명에서 동결 보호제에 수크로스가 첨가되면 세포막과 세포막 단백질을 동결시 나타나는 얼음결정으로부터 보호하고 안정화시키는 역할을 한다. 따라서 본 발명의 처리 방법에 의해 제조된 동결보존동종피부의 세포 생존율이 향상될 수 있고 수크로스, 우태아혈청 및 디메틸 설폭사이드의 이상적인 혼합비로 더욱 세포 생존율을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서 수크로 스는 바람직하게는 상기 기본 성분이 혼합된 용액에 최종 농도가 25 내지 40 중량%가 되도록 용해된다. 본 발명에서 동결 보호제에 수크로스가 25 중량% 미만으로 포함되면 세포 생존율 향상에 필요한 세포막과 막 단백질의 보호 및 안정화 등이 미약해질 수 있고, 40 중량%를 초과하여 포함되면 고농도의 당(sugar) 성분으로 인하여 세포 사멸율의 증가가 유발되는 문제가 있을 수 있다. 본 발명에서 동결 보호제는 가장 바람직하게는 상기 기본 성분이 혼합된 용액에 수크로스를 최종 농도가 30 중량%가 되도록 용해함으로써 제조된다.

본 발명에서 피부 조직에 동결 보호제를 침투시키는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 이루어질 수 있고, 바람직하게는 저온 반응기에서 피부에 동결 보호제를 침투시킨다. 침투에 걸리는 시간은 피부 조직의 크기 등에 따라 다양할 수 있고, 예를 들면 4℃의 저온 반응기에서 약 6 시간 내지 24 시간 동안 침투시킬 수 있다.

본 발명에서 동결 보호제가 침투된 피부는 controlled rate freezer를 사용하여 동결한다. 동결 시 controlled rate freezer를 사용하면 원하는 속도로 피부를 동결할 수 있다. 본 발명에서 controlled rate freezer를 사용하여 피부를 동결하는 속도는 바람직하게는 분당 -0.1℃ 내지 -7℃, 가장 바람직하게는 분당 -1℃이다. 본 발명에서 동결을 시킬 경우 동결보호제가 침투된 피부의 온도와 controlled rate freezer 챔버의 온도는 같을 수가 없기 때문에 냉동 시 잠재용융 열이 발생하는 구간에서부터 물 분자의 움직임이 없는 온도인 -80℃까지 급속한 동결로 속도가 분당 10℃를 초과하여 잠재용융열을 조절하지 못하면 얼음결정현상으로 인한 조직의 파괴 문제가 있을 수 있다.

본 발명의 처리 방법에 따라 제조된 동결보존동종피부는 세포의 생존율이 높고 세포의 생물학적 성질의 변화도 적어서 이식된 부위에 빠른 육아조직의 생성을 도움으로써 무세포진피의 이식율을 높이고 치료 기간을 단축시킬 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예로 보다 상세하게 설명한다. 다만, 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시되는 것일 뿐 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

기증자(시체)로부터의 인체 피부조직의 용도가 제한됨에 따라 인체 피부에 가까운 돼지 피부를 사용하여 하기 실시예 및 비교예의 방법에 따라 각각 10개씩의 동결보존 피부 및 글리세롤보존 피부를 제작하였다.

실시예

돼지 피부를 사용하여 다음의 단계에 따라 동결보존 피부를 준비하였다.

(1) 돼지 피부를 생리식염수로 깨끗이 세척하였다.

(2) 돼지 피부를 각각 5 × 10 cm²의 크기로 절단하였다.

(3) 디메틸 설폭사이드(Sigma, 미국), DMEM(GIBCO, 미국) 및 우태아 혈청(GIBCO, 미국)을 1 : 4 : 5의 중량비로 혼합하였다.

(4) (3)의 용액에 최종 농도가 30 중량%가 되도록 수크로스를 넣고 용해시켜 동결 보호제를 만들었다.

(5) (4)의 동결 보호제에 (2)의 돼지피부를 넣었다.

(6) 4℃ 저온 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.

(7) 4℃ 저온 반응기에 (5)의 돼지 피부를 넣은 다음 동결 보호제를 12시간 동안 침투시켰다.

(8) 침투가 완료된 돼지피부와 50㎖의 냉해보호제를 폴리아마이드 백(CryoBag, Origen, 미국)에 넣었다.

(9) Controlled rate freezer(14S-A, SY Lab, 미국)를 준비하였다.

(10) (8)의 폴리아마이드 백을 controlled rate freezer 안으로 넣고 분당 -1℃의 속도로 -150℃ 까지 동결하였다.

(11) 동결이 끝나고 난 후 폴리아마이드 백을 분석 실험 전까지 드라이 쉬퍼에 냉동 보관하였다.

비교예

돼지 피부를 사용하여 다음의 단계에 따라 50% 글리세롤 및 85% 글리세롤을 순차적으로 처리하여 글리세롤보존 피부를 준비하였다.

(1) 돼지 피부를 생리식염수로 깨끗이 세척하였다.

(2) 돼지 피부를 각각 5 × 10 cm²의 크기로 절단하였다.

(3) 증류수로 희석시킨 50% 글리세롤에 돼지 피부를 72시간 동안 담갔다.

(4) (3)의 피부를 85% 글리세롤에 72시간 동안 담갔다.

실험예 1

상기 실시예 및 비교예에 따라 준비된 돼지 피부를 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석법을 이용하여 분석하였다. TUNEL 분석은 In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein(Roche, 독일)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 분석한 세포 사멸율의 결과(결과는 10개 시료에 대한 평균값이다)를 도 1에 나타내었다.

실시예 및 비교예의 피부를 현미경(Olympus BX51)으로 촬영하여 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 1의 결과로부터 볼 수 있듯이, 비교예에 비하여 실시예의 경우가 4-5배 정도 세포 사멸율이 낮음을 알 수 있었다.

또한, 도 2 및 도 3의 현미경 사진으로부터 비교예에 비해 실시예에서 세포사멸이 확연히 적음을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 처리 방법이 종래의 글리세롤보존 처리 방법에 비해 높은 세 포 생존율을 보임으로서 본 발명의 처리 방법에 의해 제조된 이식용 피부가 이식된 부위에 빠른 육아조직의 생성을 도와 무세포진피의 이식률을 높이고 치료시간을 단축시킬 수 있다.

실험예 2

본 발명에 있어 수크로스 농도의 차이에 따른 세포 사멸율의 변화를 살펴보기 위하여 수크로스의 농도가 각각 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 및 40 중량%가 되도록 동결보호제를 제조하여 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법으로 동결보존 피부를 준비한 다음 TUNEL 분석법을 이용하여 분석하였다. TUNEL 분석은 In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein(Roche, 독일)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였고, 형광 마커는 4'.6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)를 사용하였다. 분석한 세포 사멸율의 결과를 다음의 표 1에 나타내었고, 그래프로 도 4에 나타내었다.

상기 표 1 및 도 4로부터 볼 수 있듯이 동결보호제가 25 내지 40 중량%의 최종 농도로 수크로스를 포함할 경우 세포 사멸율이 특히 낮음을 알 수 있었다.

도 1은 글리세롤보존 피부(GPA) 및 동결보존 피부(CPA)를 TUNEL 분석법으로 세포 사멸율을 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 2a는 글리세롤보존 피부를 H&E 염색 후 광학 현미경으로 200 배 확대하여 촬영한 사진이고, 도 2b는 동결보존 피부를 H&E 염색 후 광학 현미경으로 200 배 확대하여 촬영한 사진이다.

도 3a는 글리세롤보존 피부를 TUNEL 염색 후 형광 현미경으로 100 배 확대하여 촬영한 사진이고, 도 3b는 동결보존 피부를 TUNEL 염색 후 형광 현미경으로 100 배 확대하여 촬영한 사진이다.

도 4는 수크로스 농도 차이에 따른 세포 사멸율의 변화를 TUNEL 분석법으로 분석하여 나타낸 그래프이다.

Claims (8)

1. i) 디메틸 설폭사이드(DMSO), 동물세포배양 배지 및 우태아 혈청(FBS)을 혼합하고;

   ⅱ) 상기 용액에 수크로스를 최종 농도가 25 내지 40 중량%가 되도록 용해하여 동결 보호제를 제조하며;

   ⅲ) 상기 동결 보호제를 분리된 피부에 침투시키고;

   ⅳ) 동결 보호제가 침투된 피부를 controlled rate freezer에서 동결하는 것을 포함하는 이식용 동종 피부의 처리 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 수크로스의 최종 농도가 30 중량%인 것을 특징으로 하는 이식용 동종 피부의 처리 방법.
4. 제1항에 있어서, 디메틸 설폭사이드, 동물세포 배양 배지 및 우태아 혈청의 혼합비가 중량 기준으로 1 : 3~5 : 4~6인 것을 특징으로 하는 이식용 동종 피부의 처리 방법.
5. 제1항에 있어서, 동물세포 배양 배지가 MEM, DMEM, RPMI 1640 및 IMDM 중에 서 선택되는 것을 특징으로 하는 이식용 동종 피부의 처리 방법.
6. 제1항에 있어서, 동결 보호제를 분리된 피부에 침투시키는 것이 4℃ 저온 반응기에서 6 시간 내지 24 시간 동안 침투시키는 것을 특징으로 하는 이식용 동종 피부의 처리 방법.
7. 제1항에 있어서, 동결 보호제가 침투된 피부를 controlled rate freezer에서 분당 -1℃의 속도로 동결하는 것을 특징으로 하는 이식용 동종 피부의 처리 방법.
8. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 처리된 동결보존동종피부.

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