JP2857886B2 - バチルス・エス・ピー、ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するｄｎａ断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 - Google Patents
バチルス・エス・ピー、ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するｄｎａ断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、バチルス・エス・ピー（Bacillus・sp.）T
P262株（FERM P−10450）、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を含有するDNA断片およびそれを含有する組み換え体プ
ラスミド並びに後述する第１図のＬ−乳酸脱水素酵素遺
伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミドに関す
る。
P262株（FERM P−10450）、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を含有するDNA断片およびそれを含有する組み換え体プ
ラスミド並びに後述する第１図のＬ−乳酸脱水素酵素遺
伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミドに関す
る。
［従来の技術］ Ｌ−乳酸脱水素酵素は、「酵素的測定法」（第101〜1
02頁、医学書院、1982年発行）に記載されているよう
に、人間の肝臓の診断薬などとして大いに使用されてい
るものであり、有用性の高い酵素である。
02頁、医学書院、1982年発行）に記載されているよう
に、人間の肝臓の診断薬などとして大いに使用されてい
るものであり、有用性の高い酵素である。
また、「バイオインダストリー」（第３巻、第９号、
第５〜13頁）に記載されているように、一般に、好熱菌
由来の酵素は、酵素としての基本的な性質を充分に備え
ているばかりではなく、耐熱性ひいては保存安定性に優
れている。さらに、好熱菌は、雑菌の混入を防ぐための
熱処理にも安定なため、この性質を利用することによっ
て高純度な酵素が得られやすいなど、通常安定性が悪い
という酵素の最大の欠点をカバーした実用的価値の高い
酵素といえる。
第５〜13頁）に記載されているように、一般に、好熱菌
由来の酵素は、酵素としての基本的な性質を充分に備え
ているばかりではなく、耐熱性ひいては保存安定性に優
れている。さらに、好熱菌は、雑菌の混入を防ぐための
熱処理にも安定なため、この性質を利用することによっ
て高純度な酵素が得られやすいなど、通常安定性が悪い
という酵素の最大の欠点をカバーした実用的価値の高い
酵素といえる。
一方、Ｌ−乳酸脱水素酵素を菌体内で生産させるＬ−
乳酸脱水素酵素遺伝子は、「バイオロジカル・ケミスト
リー・ホップ・セィラー（Biol.Chem.Hoppe−Seyle
r）」｛第368巻、第1167〜1177頁（1987年）｝に記載さ
れているように、いくつか知られている。しかし、つぎ
のような特徴、たとえば、50〜70℃付近でよく生育する
ことができ、ゼラチン液化がなく、デンプンを加水分解
せず、Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産する好熱菌である新規
なバチルス・エス・ピー（Bacillus・sp.）TP262株およ
びこの菌株由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子は知られて
いない。
乳酸脱水素酵素遺伝子は、「バイオロジカル・ケミスト
リー・ホップ・セィラー（Biol.Chem.Hoppe−Seyle
r）」｛第368巻、第1167〜1177頁（1987年）｝に記載さ
れているように、いくつか知られている。しかし、つぎ
のような特徴、たとえば、50〜70℃付近でよく生育する
ことができ、ゼラチン液化がなく、デンプンを加水分解
せず、Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産する好熱菌である新規
なバチルス・エス・ピー（Bacillus・sp.）TP262株およ
びこの菌株由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子は知られて
いない。
［発明が解決しようとする課題］ このような状況下において、熱に安定なＬ−乳酸脱水
素酵素およびその遺伝子などを、遺伝子操作により提供
すること、並びに遺伝子操作により、耐熱性ひいては保
存安定性に優れており、かつ高純度のＬ−乳酸脱水素酵
素を大量に生産する方法の開発が望まれていた。
素酵素およびその遺伝子などを、遺伝子操作により提供
すること、並びに遺伝子操作により、耐熱性ひいては保
存安定性に優れており、かつ高純度のＬ−乳酸脱水素酵
素を大量に生産する方法の開発が望まれていた。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、好熱菌由来のＬ−乳酸脱水素酵素を見
出すべく鋭意検討した結果、温泉水より分離した好熱菌
バチルス・エス・ピー TP262株（FERM P−10450、以下
単に「バチルス・エス・ピー TP262株」という）を見
出した。さらに、本発明者らは、上記課題を解決するた
め、この菌株由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む複
合プラスミドpHC1を単離し、これを遺伝子組み換え技術
を用いて微生物に導入し、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を
発現させ、これを用いれば有用な酵素を容易かつ大量に
生産することができることを見出し、本発明を完成する
に至った。
出すべく鋭意検討した結果、温泉水より分離した好熱菌
バチルス・エス・ピー TP262株（FERM P−10450、以下
単に「バチルス・エス・ピー TP262株」という）を見
出した。さらに、本発明者らは、上記課題を解決するた
め、この菌株由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む複
合プラスミドpHC1を単離し、これを遺伝子組み換え技術
を用いて微生物に導入し、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を
発現させ、これを用いれば有用な酵素を容易かつ大量に
生産することができることを見出し、本発明を完成する
に至った。
さらに詳しく述べれば、本発明者らは、50〜70℃付近
でよく生育することができ、ゼラチン液化がなく、デン
プンを加水分解せず、熱に安定なＬ−乳酸脱水素酵素を
生産する好熱菌であるバチルス・エス・ピーTP262株を
見出した。また、この菌株のDNA上のＬ−乳酸脱水素酵
素遺伝子またはそれを含有するDNA断片とベクタープラ
スミドを連結することによって組み換え体プラスミドを
得た。さらに、この組み換え体プラスミドをエシェリシ
ア・コリ（Escherichia coli）などを含むエシェリシア
属などの宿主微生物に導入することにより、Ｌ−乳酸脱
水素酵素遺伝子を発現させ、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を含有する宿主微生物を用いれば、Ｌ−乳酸脱水素酵素
を容易かつ大量に生産することができることを見出し、
本発明を完成するに至った。
でよく生育することができ、ゼラチン液化がなく、デン
プンを加水分解せず、熱に安定なＬ−乳酸脱水素酵素を
生産する好熱菌であるバチルス・エス・ピーTP262株を
見出した。また、この菌株のDNA上のＬ−乳酸脱水素酵
素遺伝子またはそれを含有するDNA断片とベクタープラ
スミドを連結することによって組み換え体プラスミドを
得た。さらに、この組み換え体プラスミドをエシェリシ
ア・コリ（Escherichia coli）などを含むエシェリシア
属などの宿主微生物に導入することにより、Ｌ−乳酸脱
水素酵素遺伝子を発現させ、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を含有する宿主微生物を用いれば、Ｌ−乳酸脱水素酵素
を容易かつ大量に生産することができることを見出し、
本発明を完成するに至った。
なお、バチルス・エス・ピー TP262株由来のＬ−乳
酸脱水素酵素遺伝子の構造が第１図におけるDNA塩基配
列148〜1104として示されることを確認した。
酸脱水素酵素遺伝子の構造が第１図におけるDNA塩基配
列148〜1104として示されることを確認した。
本発明の目的は、50〜70℃付近でよく生育することが
でき、ゼラチン液化がなく、デンプンを加水分解せず、
Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産する好熱菌であるバチルス・
エス・ピー TP262株、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含
有するDNA断片およびそれを含有する組み換え体プラス
ミド並びに後述する第１図のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子
およびそれを含有する組み換え体プラスミドを提供する
ことにある。
でき、ゼラチン液化がなく、デンプンを加水分解せず、
Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産する好熱菌であるバチルス・
エス・ピー TP262株、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含
有するDNA断片およびそれを含有する組み換え体プラス
ミド並びに後述する第１図のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子
およびそれを含有する組み換え体プラスミドを提供する
ことにある。
これらの組み換え体プラスミドを導入した宿主微生物
を用いれば、好熱菌バチルス・エス・ピー TP262株由
来のＬ−乳酸脱水素酵素を容易かつ大量に生産すること
ができる。
を用いれば、好熱菌バチルス・エス・ピー TP262株由
来のＬ−乳酸脱水素酵素を容易かつ大量に生産すること
ができる。
また、本発明の目的の１つであるバチルス・エス・ピ
ー TP262株は、第５図−Ａに示されるように数種のＬ
−乳酸脱水素酵素アイソザイムを生産するものであり、
このことにより数種のＬ−乳酸脱水素酵素を一度に生産
することもできる有用な菌株である。
ー TP262株は、第５図−Ａに示されるように数種のＬ
−乳酸脱水素酵素アイソザイムを生産するものであり、
このことにより数種のＬ−乳酸脱水素酵素を一度に生産
することもできる有用な菌株である。
本発明を以下に詳細に説明する。
第１図は、後述する本発明のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝
子を含む複合プロスミドpHTC1に挿入された好熱菌バチ
ルス・エス・ピー TP262株由来DNA断片のうち、Ｌ−乳
酸脱水素酵素遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。該塩
基配列の構造遺伝子は、第１図の塩基配列の148〜1104
に示される。すなわち、第１図の塩基配列には148〜150
（ATG開始コドン）で始まり、1105〜1107［オーカー（T
AA終止コドン）］に終わる957塩基対からなるオープン
リーディングフレーム（これらは319個のアミノ酸から
成るタンパク質をコードする）が存在する。ATGは、148
〜150以外にもいくつか存在するが、（１）確認された
アミノ末端のアミノ酸配列、すなわち、メチオニン−リ
ジン−アルギニンをコードしている塩基配列はここだけ
であること、そして、（２）リボゾーム結合部位である
シャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配列、すな
わち、GAAAGGAが129〜135に存在し、さらには、（３）
バチルス・エス・ピー TP262株から精製したＬ−乳酸
脱水素酵素遺伝子のサブユニットの分子量37,000〜39,0
00にほぼ合致する分子量35,894のタンパク質をコードし
ていることから、148〜150に存在するATGがＬ−乳酸脱
水素酵素の翻訳開始コドンと考えられる。
子を含む複合プロスミドpHTC1に挿入された好熱菌バチ
ルス・エス・ピー TP262株由来DNA断片のうち、Ｌ−乳
酸脱水素酵素遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。該塩
基配列の構造遺伝子は、第１図の塩基配列の148〜1104
に示される。すなわち、第１図の塩基配列には148〜150
（ATG開始コドン）で始まり、1105〜1107［オーカー（T
AA終止コドン）］に終わる957塩基対からなるオープン
リーディングフレーム（これらは319個のアミノ酸から
成るタンパク質をコードする）が存在する。ATGは、148
〜150以外にもいくつか存在するが、（１）確認された
アミノ末端のアミノ酸配列、すなわち、メチオニン−リ
ジン−アルギニンをコードしている塩基配列はここだけ
であること、そして、（２）リボゾーム結合部位である
シャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配列、すな
わち、GAAAGGAが129〜135に存在し、さらには、（３）
バチルス・エス・ピー TP262株から精製したＬ−乳酸
脱水素酵素遺伝子のサブユニットの分子量37,000〜39,0
00にほぼ合致する分子量35,894のタンパク質をコードし
ていることから、148〜150に存在するATGがＬ−乳酸脱
水素酵素の翻訳開始コドンと考えられる。
また、148の上流の101〜106（TTGTGA）および121〜12
6（AATTTT）に、それぞれプロモーター構造の“−35"領
域および“−10"領域に対応する塩基配列が存在してい
る。
6（AATTTT）に、それぞれプロモーター構造の“−35"領
域および“−10"領域に対応する塩基配列が存在してい
る。
本発明のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子は、バチルス・エ
ス・ピー TP262株に由来し、その菌の染色体DNA上に存
在する。バチルス・エス・ピー TP262株は、温泉水よ
り分離された好熱菌であり、つきの表−１に示す菌学的
性質を有する。
ス・ピー TP262株に由来し、その菌の染色体DNA上に存
在する。バチルス・エス・ピー TP262株は、温泉水よ
り分離された好熱菌であり、つきの表−１に示す菌学的
性質を有する。
以上の諸性状をバージーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Systematic Bacteriolgy）第１巻（1984年）に照して
検討したところ、本菌株の性状がバチルス（Bacillus）
属の性状に酷似することから、本菌株は、バチルス属に
属する菌として同定した。さらに、本菌株は50〜70℃付
近でよく生育することができ、肉汁ゼラチン穿刺培地に
おいてゼラチン液化がなく、デンプンを加水分解せず、
しかも熱に安定なＬ−乳酸脱水素酵素を生産する好熱菌
であることから、新規な菌であり、本菌株をバチルス・
エス・ピー TP262株（微工研菌寄第10450号）と命名し
た。
テマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Systematic Bacteriolgy）第１巻（1984年）に照して
検討したところ、本菌株の性状がバチルス（Bacillus）
属の性状に酷似することから、本菌株は、バチルス属に
属する菌として同定した。さらに、本菌株は50〜70℃付
近でよく生育することができ、肉汁ゼラチン穿刺培地に
おいてゼラチン液化がなく、デンプンを加水分解せず、
しかも熱に安定なＬ−乳酸脱水素酵素を生産する好熱菌
であることから、新規な菌であり、本菌株をバチルス・
エス・ピー TP262株（微工研菌寄第10450号）と命名し
た。
なお、本菌株は、動植物に対する病原性はない。
本発明において、前記菌株のほか、その自然変異菌株
および人工変異菌株もすべて使用することができる。
および人工変異菌株もすべて使用することができる。
つぎに、本発明の新規なバチルス・エス・ピー TP26
2株の培養法を説明する。
2株の培養法を説明する。
本発明の新規なバチルス・エス・ピー TP262株は、
通常知られているバチルス属に属する微生物の公知の培
養法、たとえば、肉汁、酵母エキス、ペプトン、牛脳エ
キス末およびハートエキス末などより選ばれる有機栄養
源を含有する培地中で好気性条件下に培養することがで
きる。また、必要に応じて上記培地に、食塩およびリン
酸塩などより選ばれる無機化合物を添加することもでき
る。
通常知られているバチルス属に属する微生物の公知の培
養法、たとえば、肉汁、酵母エキス、ペプトン、牛脳エ
キス末およびハートエキス末などより選ばれる有機栄養
源を含有する培地中で好気性条件下に培養することがで
きる。また、必要に応じて上記培地に、食塩およびリン
酸塩などより選ばれる無機化合物を添加することもでき
る。
本菌株は、前記のような培地に直接菌体を接種して培
養すればよい。
養すればよい。
培養温度は、微生物から発育しうる範囲で適宜設定さ
れるが、通常37〜70℃、好ましくは、50〜70℃である。
れるが、通常37〜70℃、好ましくは、50〜70℃である。
また、培地のpHは、通常pH6.0〜8.5で調整される。
培養期間は、使用する培地の種類により異なるが、通
常10〜20時間程度である。
常10〜20時間程度である。
つぎに、バチルス・エス・ピー TP262株の染色体DNA
上のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子またはそれを含有するDN
A断片をクローニングする方法について説明する。
上のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子またはそれを含有するDN
A断片をクローニングする方法について説明する。
なお、本発明で用いられる、適当な宿主微生物におい
て発現させうる複製可能な発現ベクターおよび宿主微生
物としては、遺伝子工学の分野で通常用いられる複製可
能な発現ベクターおよび宿主微生物が挙げられる。
て発現させうる複製可能な発現ベクターおよび宿主微生
物としては、遺伝子工学の分野で通常用いられる複製可
能な発現ベクターおよび宿主微生物が挙げられる。
発現ベクターとしては、たとえば、エシェリシア・コ
リではpUC19のようなpUC系ベクター、pBR322のようなpB
R系ベクター、pACYC184のようなプラスミドベクター、
λおよびM13などのファージベクター；枯草菌ではpUB11
0、pC194およびpE194などのプラスミドベクターが挙げ
られる。
リではpUC19のようなpUC系ベクター、pBR322のようなpB
R系ベクター、pACYC184のようなプラスミドベクター、
λおよびM13などのファージベクター；枯草菌ではpUB11
0、pC194およびpE194などのプラスミドベクターが挙げ
られる。
また、宿主微生物としては、たとえば、エシェリシア
・コリ JM103株およびJM109株などのJM系宿主並びにHB
101およびC600などのエシェリア属の微生物；並びにバ
チルス・ズブチリス（Bacillus subtilis） RM125株お
よびRM141株などの枯草菌などが挙げられる。
・コリ JM103株およびJM109株などのJM系宿主並びにHB
101およびC600などのエシェリア属の微生物；並びにバ
チルス・ズブチリス（Bacillus subtilis） RM125株お
よびRM141株などの枯草菌などが挙げられる。
まず、バチルス・エス・ピー TP262株を常法で培養
した後、集菌し、常法により処理して染色体DNA標品を
採取する。染色体DNA標品をHind IIIで切断する。一
方、発現ベクターとしてのpUC19をHind IIIで切断し、D
NA断片を、Hind IIIで切断されたpUC19とリガーゼで連
結させ、複合プラスミドを得る。
した後、集菌し、常法により処理して染色体DNA標品を
採取する。染色体DNA標品をHind IIIで切断する。一
方、発現ベクターとしてのpUC19をHind IIIで切断し、D
NA断片を、Hind IIIで切断されたpUC19とリガーゼで連
結させ、複合プラスミドを得る。
得られた複合プラスミドから、熱に安定なＬ−乳酸脱
水素酵素遺伝子を含む複合プラスミドを選択、採取する
ために、これを通常の形質転換法により、たとえば、エ
シェリア・コリ JM103株［ファルマシア株式会社製］
［参照；ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic
Acids Research）第９巻、第309〜321頁（1981年）］に
導入して、アンピシリン耐性で、ラクトースを分解でき
ない形質転換株を得る。
水素酵素遺伝子を含む複合プラスミドを選択、採取する
ために、これを通常の形質転換法により、たとえば、エ
シェリア・コリ JM103株［ファルマシア株式会社製］
［参照；ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic
Acids Research）第９巻、第309〜321頁（1981年）］に
導入して、アンピシリン耐性で、ラクトースを分解でき
ない形質転換株を得る。
得られた形質転換株を常法で培養し、60℃でＬ−乳酸
脱水素酵素活性を示す株を、常法で分離する（TC1株と
いう）。得られたTC1株を常法で培養し、ついで、Ｌ−
乳酸脱水素酵素遺伝子を含む複合プラスミド（pTC1とい
う）を、たとえば、後述するボイリング法（Boiling Me
thod）またはトリトンＸ−100法などの常法で単離す
る。
脱水素酵素活性を示す株を、常法で分離する（TC1株と
いう）。得られたTC1株を常法で培養し、ついで、Ｌ−
乳酸脱水素酵素遺伝子を含む複合プラスミド（pTC1とい
う）を、たとえば、後述するボイリング法（Boiling Me
thod）またはトリトンＸ−100法などの常法で単離す
る。
以上のようにして得られた複合プラスミドpTC1の分子
量は、アガロースゲル電気泳動分析により測定した結
果、約4.3メガダルトン（6.6Kb）であり、そのうち、Ｌ
−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むバチルス・エス・ピー
TP262株由来のDNA断片の分子量は2.5メガダルトン（3.9
Kb）であった。
量は、アガロースゲル電気泳動分析により測定した結
果、約4.3メガダルトン（6.6Kb）であり、そのうち、Ｌ
−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むバチルス・エス・ピー
TP262株由来のDNA断片の分子量は2.5メガダルトン（3.9
Kb）であった。
pTC1の制限酵素地図を、第２図に示す。
第２図において、太線を示した部分は、Ｌ−乳酸脱水
素酵素遺伝子を含むDNA部分であり、その制限酵素地図
を第３図に示す。
素酵素遺伝子を含むDNA部分であり、その制限酵素地図
を第３図に示す。
一方、別にpTC1の挿入DNA部分の種々の部分を欠失し
たプラスミドを作製し、それらプラスミドによってエシ
ェリシア・コリ JM103株またはJM109株の形質転換株を
得、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性の有無を調べた結果、Ｌ−
乳酸脱水素酵素遺伝子は、第３図に示されるXba I、Ava
IおよびHinc IIによる切断部位を含む範囲に存在して
いることが分かった。そこでXba I、Ava IおよびHinc I
Iによる切断部位を含む範囲のDNA断片の塩基配列を、ダ
イデオキシ（dideoxy）法により決定した。その結果を
第１図に示す。第１図における塩基配列１〜1197として
示されるヌクレオチドが、本発明のＬ−乳酸脱水素酵素
遺伝子を含んでいる。
たプラスミドを作製し、それらプラスミドによってエシ
ェリシア・コリ JM103株またはJM109株の形質転換株を
得、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性の有無を調べた結果、Ｌ−
乳酸脱水素酵素遺伝子は、第３図に示されるXba I、Ava
IおよびHinc IIによる切断部位を含む範囲に存在して
いることが分かった。そこでXba I、Ava IおよびHinc I
Iによる切断部位を含む範囲のDNA断片の塩基配列を、ダ
イデオキシ（dideoxy）法により決定した。その結果を
第１図に示す。第１図における塩基配列１〜1197として
示されるヌクレオチドが、本発明のＬ−乳酸脱水素酵素
遺伝子を含んでいる。
上記した方法で形質転換された微生物を培養し、菌体
を得た後、超音波破砕、加熱処理およびカラムクトマト
グラフィーなどによって、好熱菌バチルス・エス・ピー
TP262株由来の数種のＬ−乳酸脱水素酵素アイソザイ
ムを精製単離することができる。
を得た後、超音波破砕、加熱処理およびカラムクトマト
グラフィーなどによって、好熱菌バチルス・エス・ピー
TP262株由来の数種のＬ−乳酸脱水素酵素アイソザイ
ムを精製単離することができる。
［発明の効果］ 本発明のバチルス・エス・ピー TP262株は、有用な
Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産することができる新規で有用
な菌である。さらに、バチルス・エス・ピー TP262株
は、第５図−Ａに示されるように、数種のＬ−乳酸脱水
素酵素アイソザイムを生産するため、このことにより数
種のＬ−乳酸脱水素酵素を一度に生産することもでき
る。
Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産することができる新規で有用
な菌である。さらに、バチルス・エス・ピー TP262株
は、第５図−Ａに示されるように、数種のＬ−乳酸脱水
素酵素アイソザイムを生産するため、このことにより数
種のＬ−乳酸脱水素酵素を一度に生産することもでき
る。
また、本発明のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含有する
複合プラスミドを用いる遺伝子操作により、バチルス・
エス・ピー TP262株の数種のＬ−乳酸脱水素酵素アイ
ソザイムを、エシェリシア属などの宿主微生物中で生産
させることができる。
複合プラスミドを用いる遺伝子操作により、バチルス・
エス・ピー TP262株の数種のＬ−乳酸脱水素酵素アイ
ソザイムを、エシェリシア属などの宿主微生物中で生産
させることができる。
さらに、本発明のＬ−乳酸脱水素酵素の耐熱性を利用
すれば、易熱性のエシェリア属などの宿主微生物タンパ
ク質からの分離精製が容易である。
すれば、易熱性のエシェリア属などの宿主微生物タンパ
ク質からの分離精製が容易である。
［実施例］ 以下、本発明を具体的に実施例を挙げて説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本願明細書および図面において、塩基などを略
号で表示する場合、国際純正および応用化学連合（Inte
rnational Union of Pure and Applied Chemistry;略称
IUPAC）；および国際生化学連合（International Union
of Biochemistry;略称IUB）の生化学命名委員会（Comm
ision on Biochemical Nomenclature;略称CBN）による
略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので
あり、その例を下記する。
号で表示する場合、国際純正および応用化学連合（Inte
rnational Union of Pure and Applied Chemistry;略称
IUPAC）；および国際生化学連合（International Union
of Biochemistry;略称IUB）の生化学命名委員会（Comm
ision on Biochemical Nomenclature;略称CBN）による
略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので
あり、その例を下記する。
DNA:デオキシリボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン DEAE:ジエチルアミノエチル SDS:ドデシル硫酸ナトリウム EDTA:エチレンジアミン四酢酸 NADH:還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド 実施例１ バチルス・エス・ピー TP262株が生産するＬ−乳酸脱
水素酵素の精製 （１） バチルス・エス・ピー TP262株は第５図−Ａ
に示されるように、数種のＬ−乳酸脱水素酵素（以降、
第５図−Ａに示すＬ−乳酸脱水素酵素のバンドをバンド
Ｉ〜VIと称する。）を生産するが、このうち、特に活性
の強いバンドIV bに示されるＬ−乳酸脱水素酵素の精製
法を示す。
水素酵素の精製 （１） バチルス・エス・ピー TP262株は第５図−Ａ
に示されるように、数種のＬ−乳酸脱水素酵素（以降、
第５図−Ａに示すＬ−乳酸脱水素酵素のバンドをバンド
Ｉ〜VIと称する。）を生産するが、このうち、特に活性
の強いバンドIV bに示されるＬ−乳酸脱水素酵素の精製
法を示す。
バチルス・エス・ピー TP262株を、Ｌ−寒天平板培
地（１％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.1％ブドウ
糖、0.5％食塩、0.3％寒天、pH7.0）に植菌し、60℃、1
5〜18時間培養した後、集菌し、0.1Mリン酸緩衝液（pH
7.0）で洗浄すれば、湿重量にして95gの菌体を得る。得
られた菌体を、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）400mlに懸濁
させ、得られた懸濁液を、超音波破砕［なお、超音波破
砕処理した菌体のＬ−乳酸脱水素酵素活性は、破砕菌体
1gについて78単位（unit）であった。］した後、遠心分
離（10,000rpm、20分間）を行い、細胞抽出液を調製す
る。得られた細胞抽出液に硫酸アンモニウムを40％飽和
になるように加え、その上清液を集める。得られた上清
液を、予め40％飽和硫酸アンモニウム−0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化させておいたブチルトヨパール650
S［東ソー株式会社製］カラム（ベッド体積80ml）に吸
着させ、ついで、20％飽和硫酸アンモニウム−0.1Mリン
酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した後、15％飽和硫酸アンモ
ニウム−0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させた画分
を集め、得られた画分を、限外濾過に付し脱塩する。脱
塩した粗のＬ−乳酸脱水素酵素を含む画分を、予め50mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させておいたDEAE−セ
ルロースDE52［ワットマン社製］カラム（ベッド体積5m
l）に吸着させ、ついで、0.1〜0.2Mの塩化ナトリウムの
直線濃度勾配を持つ50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出
させた画分を分取する。得られた溶出液を限外過に付
し、脱塩して50mMリン酸緩衝液（pH7.0）を調整する。
これを予め50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させて
おいたDEAE−セルロースDE52カラムに吸着させ、150mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した後、200mMリン酸緩衝
液（pH7.0）で溶出させる。この溶出液を、予め50mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させておいたAGNAD（Ｐ−
Ｌバイオケミカルズ社製）アフィニティカラムに吸着さ
せ、ついで、2M塩化カリウム−50mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で溶出させた画分を分取する。得られた溶出液を、
硫酸アンモニウムで沈澱させた後、沈澱物を50mMリン酸
緩衝液（pH7.0）に溶解させ、得られた溶液を、高速液
体クロマトグラフィー［TSKゲルG3000SW（東ソー株式会
社製）］によるゲル過に付し、0.57mgの精製酵素を得
る。得られた精製酵素を、ポリアクリルアミド電気泳動
し、銀染色および活性染色した結果、単一バンドとして
検出された（第５図−Ｂ）。その比活性は135単位（uni
t）/mg蛋白と粗酵素に比べ96倍精製されたものであっ
た。なお、酵素活性の測定においては、60℃で１分間に
ピルビン酸から１μＭのＬ−乳酸を生ずる酵素量を１単
位（unit）として測定した。
地（１％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.1％ブドウ
糖、0.5％食塩、0.3％寒天、pH7.0）に植菌し、60℃、1
5〜18時間培養した後、集菌し、0.1Mリン酸緩衝液（pH
7.0）で洗浄すれば、湿重量にして95gの菌体を得る。得
られた菌体を、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）400mlに懸濁
させ、得られた懸濁液を、超音波破砕［なお、超音波破
砕処理した菌体のＬ−乳酸脱水素酵素活性は、破砕菌体
1gについて78単位（unit）であった。］した後、遠心分
離（10,000rpm、20分間）を行い、細胞抽出液を調製す
る。得られた細胞抽出液に硫酸アンモニウムを40％飽和
になるように加え、その上清液を集める。得られた上清
液を、予め40％飽和硫酸アンモニウム−0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化させておいたブチルトヨパール650
S［東ソー株式会社製］カラム（ベッド体積80ml）に吸
着させ、ついで、20％飽和硫酸アンモニウム−0.1Mリン
酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した後、15％飽和硫酸アンモ
ニウム−0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させた画分
を集め、得られた画分を、限外濾過に付し脱塩する。脱
塩した粗のＬ−乳酸脱水素酵素を含む画分を、予め50mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させておいたDEAE−セ
ルロースDE52［ワットマン社製］カラム（ベッド体積5m
l）に吸着させ、ついで、0.1〜0.2Mの塩化ナトリウムの
直線濃度勾配を持つ50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出
させた画分を分取する。得られた溶出液を限外過に付
し、脱塩して50mMリン酸緩衝液（pH7.0）を調整する。
これを予め50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させて
おいたDEAE−セルロースDE52カラムに吸着させ、150mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した後、200mMリン酸緩衝
液（pH7.0）で溶出させる。この溶出液を、予め50mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化させておいたAGNAD（Ｐ−
Ｌバイオケミカルズ社製）アフィニティカラムに吸着さ
せ、ついで、2M塩化カリウム−50mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で溶出させた画分を分取する。得られた溶出液を、
硫酸アンモニウムで沈澱させた後、沈澱物を50mMリン酸
緩衝液（pH7.0）に溶解させ、得られた溶液を、高速液
体クロマトグラフィー［TSKゲルG3000SW（東ソー株式会
社製）］によるゲル過に付し、0.57mgの精製酵素を得
る。得られた精製酵素を、ポリアクリルアミド電気泳動
し、銀染色および活性染色した結果、単一バンドとして
検出された（第５図−Ｂ）。その比活性は135単位（uni
t）/mg蛋白と粗酵素に比べ96倍精製されたものであっ
た。なお、酵素活性の測定においては、60℃で１分間に
ピルビン酸から１μＭのＬ−乳酸を生ずる酵素量を１単
位（unit）として測定した。
実施例２ （１） バチルス・エス・ピー TP262株の染色体DNA標
品の採取 バチルス・エス・ピー TP262株の染色体DNAをサイト
ウ、ミウラ［バイオキミカ・エ・バイオフィズィカ・ア
クタ（Biochim.Biophys.Acta）第72巻、第619〜629頁
（1963年）］に記載された方法にしたがって調製した。
バチルス・エス・ピー TP262株を、実施例１に記載の
方法と同様に培養した後、集菌し、リゾチーム処理およ
び凍結融解SDS処理に順次付した後、溶菌して、DNAを抽
出する。得られたDNAを、フェノール処理およびフェノ
ール／クロロホルム処理に順次付して除蛋白を行った
後、DNAをエタノールで沈澱させる。これをTE緩衝液［1
0mMトリス塩酸（pH8.0）および1mMEDTA］に溶解させ、
得られた溶液を、リボヌクレアーゼ処理に付した後、さ
らにフェノール／クロロホルム処理に付し、ついでエタ
ノールで沈澱させ、得られた沈澱物を、TE緩衝液に溶解
させる。この溶液を、染色体DNA標品とする。
品の採取 バチルス・エス・ピー TP262株の染色体DNAをサイト
ウ、ミウラ［バイオキミカ・エ・バイオフィズィカ・ア
クタ（Biochim.Biophys.Acta）第72巻、第619〜629頁
（1963年）］に記載された方法にしたがって調製した。
バチルス・エス・ピー TP262株を、実施例１に記載の
方法と同様に培養した後、集菌し、リゾチーム処理およ
び凍結融解SDS処理に順次付した後、溶菌して、DNAを抽
出する。得られたDNAを、フェノール処理およびフェノ
ール／クロロホルム処理に順次付して除蛋白を行った
後、DNAをエタノールで沈澱させる。これをTE緩衝液［1
0mMトリス塩酸（pH8.0）および1mMEDTA］に溶解させ、
得られた溶液を、リボヌクレアーゼ処理に付した後、さ
らにフェノール／クロロホルム処理に付し、ついでエタ
ノールで沈澱させ、得られた沈澱物を、TE緩衝液に溶解
させる。この溶液を、染色体DNA標品とする。
（２） 染色体DNAのpUC19への挿入 （１）で得られた染色体DNA標品約５μｇを、100単位
のHind IIIを用いて、37℃で２時間反応させる。一方、
１μｇのプラスミドpUC19（ファルマシア株式会社製）
を、上記と同様にHind IIIで完全に切断した後、エシェ
リシア・コリ由来のアルカリ性ホスファターゼで処理す
る。Hind IIIで切断された染色体DNAとpUC19を混合し、
これにT4DNAリガーゼ５単位を加え、得られた混合物
を、15℃で１時間反応させて、複合プラスミドを調製す
る。
のHind IIIを用いて、37℃で２時間反応させる。一方、
１μｇのプラスミドpUC19（ファルマシア株式会社製）
を、上記と同様にHind IIIで完全に切断した後、エシェ
リシア・コリ由来のアルカリ性ホスファターゼで処理す
る。Hind IIIで切断された染色体DNAとpUC19を混合し、
これにT4DNAリガーゼ５単位を加え、得られた混合物
を、15℃で１時間反応させて、複合プラスミドを調製す
る。
（３） エシェリシア・コリ JM103株への複合プラス
ミドの導入（形質転換株の調製） （２）で調製した複合プラスミドを、通常の形質転換
法によってエシェリシア・コリ JM103株（ファルマシ
ア株式会社製）に導入した。複合プラスミド溶液50μ
に、エシェリア・コリ JM103株のコンピテント細胞懸
濁液0.2mlを混合させ、得られた混合物を、０℃で30分
間保持した後、これに42℃、２分間のヒートショックを
与え、直ちにバクトペプトン10g、酵母エキス5g、塩化
ナトリウム5g、ブドウ糖1gおよび水１からなる組成の
Ｌ−ブロス（pH7.0）1mlに加え、37℃で１時間振盪す
る。ついでこれを、アンピシリン50μg/ml、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Ｘ−gal）100μg/mlおよびイソプロリル−β−
Ｄ−チオガラクトピロノシド（IPTG）100μg/mlを含む
Ｌ−寒天平板培地に塗布し、37℃で一夜培養し、出現し
た白色コロニーを形質転換株として得る。
ミドの導入（形質転換株の調製） （２）で調製した複合プラスミドを、通常の形質転換
法によってエシェリシア・コリ JM103株（ファルマシ
ア株式会社製）に導入した。複合プラスミド溶液50μ
に、エシェリア・コリ JM103株のコンピテント細胞懸
濁液0.2mlを混合させ、得られた混合物を、０℃で30分
間保持した後、これに42℃、２分間のヒートショックを
与え、直ちにバクトペプトン10g、酵母エキス5g、塩化
ナトリウム5g、ブドウ糖1gおよび水１からなる組成の
Ｌ−ブロス（pH7.0）1mlに加え、37℃で１時間振盪す
る。ついでこれを、アンピシリン50μg/ml、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Ｘ−gal）100μg/mlおよびイソプロリル−β−
Ｄ−チオガラクトピロノシド（IPTG）100μg/mlを含む
Ｌ−寒天平板培地に塗布し、37℃で一夜培養し、出現し
た白色コロニーを形質転換株として得る。
（４） 形質転換株からのＬ−乳酸脱水素酵素生産株の
選択 （３）で得られた形質転換株を、１株につき1mlずつ
培養し、60℃で20分間処理した後、10株ずつ集菌する。
得られた菌体に2mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）を加え、得られた混合物を超音波破砕し、これを0.1
ml採取し、基質溶液［最終濃度0.1Mリン酸カリウム緩衝
液（pH7.0）,0.85mMピルビン酸ナトリウムおよび0.15mM
NADH］に加える。この混合液を、60℃で30分間静置した
後、340nmの吸光度を測定し、有意に減少の認められた
１検体を得る。この検体の10株を再び培養し、各培養液
から１株ずつについて酵素液を調製して、Ｌ−乳酸脱水
素酵素活性を測定した結果、そのうち１株において60℃
でＬ−乳酸脱水素酵素活性を示す株が得られた。この株
をエシェシア・コリ TC1株（微工研菌寄第10449号）と
命名した。
選択 （３）で得られた形質転換株を、１株につき1mlずつ
培養し、60℃で20分間処理した後、10株ずつ集菌する。
得られた菌体に2mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）を加え、得られた混合物を超音波破砕し、これを0.1
ml採取し、基質溶液［最終濃度0.1Mリン酸カリウム緩衝
液（pH7.0）,0.85mMピルビン酸ナトリウムおよび0.15mM
NADH］に加える。この混合液を、60℃で30分間静置した
後、340nmの吸光度を測定し、有意に減少の認められた
１検体を得る。この検体の10株を再び培養し、各培養液
から１株ずつについて酵素液を調製して、Ｌ−乳酸脱水
素酵素活性を測定した結果、そのうち１株において60℃
でＬ−乳酸脱水素酵素活性を示す株が得られた。この株
をエシェシア・コリ TC1株（微工研菌寄第10449号）と
命名した。
（５） Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む複合プラスミ
ドの分離 （４）で得られたTC1株をアンピシリン50mg/mlを含む
Ｌ−ブロス1mlで培養した後、集菌する。
ドの分離 （４）で得られたTC1株をアンピシリン50mg/mlを含む
Ｌ−ブロス1mlで培養した後、集菌する。
プラスミドの単離は、［モノキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）第366〜367頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboranory）に記載されている］ボイリング法（Boili
ng method）に準じて行った。
（Molecular Cloning）第366〜367頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboranory）に記載されている］ボイリング法（Boili
ng method）に準じて行った。
すなわち、得られた菌体に、0.5％トリトンＸ−100
［８％ショ糖、50mMEDTAおよび10mMトリス塩酸（pH8.
0）］溶液0.35mlを加え、温和に懸濁させる。得られた
懸濁液にリゾチーム溶液（10mg/ml）25μを加え、得
られた混合液を、沸騰水で40秒間煮沸して溶菌させ、遠
心分離（10,000rpm,10分間）を行い、不溶物を除去す
る。得られた上清液に3M酢酸ナトリウム40μおよびイ
ソプロパノール420μを加え、得られた溶液を、−70
℃で15分間静置した後、遠心分離（10,000rpm,15分間）
を行ない、沈澱物（DNA分画）を得る。得られた沈澱物
を、TE緩衝液20μに溶解させる。この沈澱物（複合プ
ラスミド）の分子量をアガロースゲル電気泳動で測定し
た結果、約4.3メガダルトン（約6.6Kb）であり、そのう
ちＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片の分子量
は、2.5メガダルトン（3.9Kb）であった。このプラスミ
ドをpTC1と命名した。制限酵素地図を作製するため、
［最新遺伝子操作実用ハンドブック、第146〜147頁、ジ
ャテック出版（1985年）］に記載されているトリトンＸ
−100法に準じて大量調製を行った。すなわち、菌体
を、25％ショ糖を含む50mMトリス塩酸（pH8.0）に懸濁
させ、リゾチーム処理、RNA分解酵素（RNase）処理およ
びトリトンＸ−100処理を行い、5Mの塩化ナトリウムを
最終濃度1Mとなるように加えて混和させ、遠心分離（14
000rpm、40分間）を行い、上清液を分取する。得られた
上清液にプロナーゼを加え、37℃で30分間インキュベー
トし、これに40％ポリエチレングリコール6000（和光純
薬工業株式会社製）を最終濃度10％になるように加え、
得られた混合物を、０℃で２時間静置した後、４℃で遠
心分離（3000rpm、20分間）を行い、沈澱物を得る。こ
の沈澱物をTE緩衝液に溶解させ、塩化セシウム平衡密度
勾配遠心を行って、プラスミドを単離精製した。
［８％ショ糖、50mMEDTAおよび10mMトリス塩酸（pH8.
0）］溶液0.35mlを加え、温和に懸濁させる。得られた
懸濁液にリゾチーム溶液（10mg/ml）25μを加え、得
られた混合液を、沸騰水で40秒間煮沸して溶菌させ、遠
心分離（10,000rpm,10分間）を行い、不溶物を除去す
る。得られた上清液に3M酢酸ナトリウム40μおよびイ
ソプロパノール420μを加え、得られた溶液を、−70
℃で15分間静置した後、遠心分離（10,000rpm,15分間）
を行ない、沈澱物（DNA分画）を得る。得られた沈澱物
を、TE緩衝液20μに溶解させる。この沈澱物（複合プ
ラスミド）の分子量をアガロースゲル電気泳動で測定し
た結果、約4.3メガダルトン（約6.6Kb）であり、そのう
ちＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片の分子量
は、2.5メガダルトン（3.9Kb）であった。このプラスミ
ドをpTC1と命名した。制限酵素地図を作製するため、
［最新遺伝子操作実用ハンドブック、第146〜147頁、ジ
ャテック出版（1985年）］に記載されているトリトンＸ
−100法に準じて大量調製を行った。すなわち、菌体
を、25％ショ糖を含む50mMトリス塩酸（pH8.0）に懸濁
させ、リゾチーム処理、RNA分解酵素（RNase）処理およ
びトリトンＸ−100処理を行い、5Mの塩化ナトリウムを
最終濃度1Mとなるように加えて混和させ、遠心分離（14
000rpm、40分間）を行い、上清液を分取する。得られた
上清液にプロナーゼを加え、37℃で30分間インキュベー
トし、これに40％ポリエチレングリコール6000（和光純
薬工業株式会社製）を最終濃度10％になるように加え、
得られた混合物を、０℃で２時間静置した後、４℃で遠
心分離（3000rpm、20分間）を行い、沈澱物を得る。こ
の沈澱物をTE緩衝液に溶解させ、塩化セシウム平衡密度
勾配遠心を行って、プラスミドを単離精製した。
pTC1の制限酵素地図を第２図に示す。
第２図における挿入DNA部分（太線で表示）、すなわ
ち、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片の制限酵
素地図を第３図に示す。
ち、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片の制限酵
素地図を第３図に示す。
（６） Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子存在位置の確認 （５）で得られた複合プラスミドpTC1に挿入されたDN
A断片を短縮して作製したプラスミドによって、エシェ
リシア・コリを形質転換し、その形質転換株のＬ−乳酸
脱水素酵素生産の有無を調べることによって挿入DNA断
片上のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子の存在位置の確認を行
った。まず、１番目にはpTC1をHinc IIで切断した後、T
4DNAリガーゼで連結し、0.4Kbと2.5Kbの２つのHinc II
消化によって生じたDNA断片を欠失したプラスミドpTC5
を作製する（第４図ｉ）。２番目には、pTC1をAva Iで
切断した後、T4DNAリガーゼで連結し、2.4Kbの１つのAv
a I消化によって生じたDNA断片を欠失したプラスミドpT
C6を作製する（第４図ii）。３番目には、pTC1をHtinc
IIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、2.5K
bのDNA断片のバンドが存在する部分のゲル片を切り出
す。このゲル片から、DNA回収用キットであるジーンク
リーン［GENECLEAN;バイオ101（BIO 101）社製］［参
照；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
ディミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッ
ド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.）第76巻、第615頁（1974年）］によって、2.5kb
のHinc II−DNA断片を回収する。一方、プラスミドベク
ターpUC19をHinc IIで切断し、2.5KbのHinc II−DNA断
片と、T4DNAリガーゼで連結してpTC10を作製する（第４
図iii）。４番目には、pTC1をXba Iで切断した後、T4DN
Aリガーゼで連結し、2.1Kbの１つのXba I消化によって
生じたDNA断片を欠失したプラスミドpTC7を作製する
（第４図iv）。５番目には、pTC1をXba Iで切断した
後、アガロースゲル電気泳動を行い、ジーンクリーンに
よって2.1KbのXba I−DNA断片を回収する。一方、プラ
スミドベクターpUC19をXba Iで切断し、2.1KbのXba I−
DNA断片と、T4DNAリガーゼで連結してpTC9を作製する
（第４図ｖ）。６番目には、pTC1をHind IIIで切断し、
アガロースゲル電気泳動を行い、3.9KbのHind III断片
のバンドがある部分のゲル片を切り出す。このゲル片か
ら、ジーンクリーンによって3.9KbのHind III−DNA断片
を回収する。3.9KbのHind III−DNA断片をSau3A Iによ
って部分消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、ジー
ンクリーンによって2Kb前後の長さのDNA断片をゲル片か
ら回収する。一方、プラスミドベクターpUC19を、BamH
Iで切断した後、上記2Kb前後の長さのDNA断片とT4NDAリ
ガーゼで連結し、pTC17を作製する。
A断片を短縮して作製したプラスミドによって、エシェ
リシア・コリを形質転換し、その形質転換株のＬ−乳酸
脱水素酵素生産の有無を調べることによって挿入DNA断
片上のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子の存在位置の確認を行
った。まず、１番目にはpTC1をHinc IIで切断した後、T
4DNAリガーゼで連結し、0.4Kbと2.5Kbの２つのHinc II
消化によって生じたDNA断片を欠失したプラスミドpTC5
を作製する（第４図ｉ）。２番目には、pTC1をAva Iで
切断した後、T4DNAリガーゼで連結し、2.4Kbの１つのAv
a I消化によって生じたDNA断片を欠失したプラスミドpT
C6を作製する（第４図ii）。３番目には、pTC1をHtinc
IIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、2.5K
bのDNA断片のバンドが存在する部分のゲル片を切り出
す。このゲル片から、DNA回収用キットであるジーンク
リーン［GENECLEAN;バイオ101（BIO 101）社製］［参
照；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
ディミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッ
ド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.）第76巻、第615頁（1974年）］によって、2.5kb
のHinc II−DNA断片を回収する。一方、プラスミドベク
ターpUC19をHinc IIで切断し、2.5KbのHinc II−DNA断
片と、T4DNAリガーゼで連結してpTC10を作製する（第４
図iii）。４番目には、pTC1をXba Iで切断した後、T4DN
Aリガーゼで連結し、2.1Kbの１つのXba I消化によって
生じたDNA断片を欠失したプラスミドpTC7を作製する
（第４図iv）。５番目には、pTC1をXba Iで切断した
後、アガロースゲル電気泳動を行い、ジーンクリーンに
よって2.1KbのXba I−DNA断片を回収する。一方、プラ
スミドベクターpUC19をXba Iで切断し、2.1KbのXba I−
DNA断片と、T4DNAリガーゼで連結してpTC9を作製する
（第４図ｖ）。６番目には、pTC1をHind IIIで切断し、
アガロースゲル電気泳動を行い、3.9KbのHind III断片
のバンドがある部分のゲル片を切り出す。このゲル片か
ら、ジーンクリーンによって3.9KbのHind III−DNA断片
を回収する。3.9KbのHind III−DNA断片をSau3A Iによ
って部分消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、ジー
ンクリーンによって2Kb前後の長さのDNA断片をゲル片か
ら回収する。一方、プラスミドベクターpUC19を、BamH
Iで切断した後、上記2Kb前後の長さのDNA断片とT4NDAリ
ガーゼで連結し、pTC17を作製する。
これらのプラスミドの作製手順を第４図に示す。
プラスミドpTC5、pTC6、pTC7、pTC9またはpTC10によ
ってエシェリシア・コリ JM103株（ファルマシア株式
会社製）を、また、pTC17によってエシェリア・コリ J
M109株［ストラタジン（STRATAGENE）製］を形質転換
し、得られた形質転換株が、好熱菌バチルス・エス・ピ
ー TP262株由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性を示すか否
かを前記（４）に記載された方法と同様にして調査し
た。
ってエシェリシア・コリ JM103株（ファルマシア株式
会社製）を、また、pTC17によってエシェリア・コリ J
M109株［ストラタジン（STRATAGENE）製］を形質転換
し、得られた形質転換株が、好熱菌バチルス・エス・ピ
ー TP262株由来のＬ−乳酸脱水素酵素活性を示すか否
かを前記（４）に記載された方法と同様にして調査し
た。
形質転換に用いたプラスミドに含まれるバチルス・エ
ス・ピー TP262株染色体由来DNA断片の範囲およびこれ
らプラスミドの導入によって得られた形質転換株のＬ−
乳酸脱水素酵素活性の有無を第３図に示す。pTC17の含
むTC17株は、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性を示したが、それ
以外の株はＬ−乳酸脱水素酵素活性を示さなかった。
ス・ピー TP262株染色体由来DNA断片の範囲およびこれ
らプラスミドの導入によって得られた形質転換株のＬ−
乳酸脱水素酵素活性の有無を第３図に示す。pTC17の含
むTC17株は、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性を示したが、それ
以外の株はＬ−乳酸脱水素酵素活性を示さなかった。
この結果から、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子は、第３図
における2.1KbのXba Iサイトから2.5KbのHinc IIサイト
までの0.4Kbの範囲を少なくとも完全に包含する場所に
存在すると推定される。
における2.1KbのXba Iサイトから2.5KbのHinc IIサイト
までの0.4Kbの範囲を少なくとも完全に包含する場所に
存在すると推定される。
（７） Ｌ−乳酸脱水素酵素アミノ末端のアミノ酸配列
の確認 （１）の方法により得られたＬ−乳酸脱水素酵素のア
ミノ末端のアミノ酸配列を直接エドマン法［フェニルイ
ソチオシアネート（PITC）法］［参照：続生化学実験講
座２ タンパク質の化学上日本生化学会編 第313〜317
頁（東京化学同人）（1987年）］に準じて行った。
の確認 （１）の方法により得られたＬ−乳酸脱水素酵素のア
ミノ末端のアミノ酸配列を直接エドマン法［フェニルイ
ソチオシアネート（PITC）法］［参照：続生化学実験講
座２ タンパク質の化学上日本生化学会編 第313〜317
頁（東京化学同人）（1987年）］に準じて行った。
その結果、アミノ末端から３番目までのアミノ酸はメ
チオニン、リジン、アルギニンの順に配列されているこ
とが確認された。
チオニン、リジン、アルギニンの順に配列されているこ
とが確認された。
（８） Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列の決定 第３図に示されるpTC1のHpa Iの切断部位付近から左
へ1197塩基の範囲の塩基配列をダイデオキシ法により決
定した。その結果を第１図に示す。ついで、（６）にお
ける結果から2.1KbのXba Iのサイトと2.5KbのHinc IIサ
イトの間におけるオープンリーディングフレームを探し
たところ、148〜150番目のATG開始コドンで始まるオー
プンリーディングフレームを見出した。なお、148〜150
以外にもATGはいくつか見られるが、（１）確認された
アミノ末端のアミノ酸配列、すなわち、メチオニン−リ
ジン−アルギニンをコードしている塩基配列はここだけ
であること、また、（２）リボゾーム結合部位であるシ
ャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配列、すなわ
ち、GAAAGGAが129〜135に存在し、さらには、（３）バ
チルス・エス・ピー TP262株から精製したＬ−乳酸脱
水素酵素のサブユニットの分子量37,000〜39,000にほぼ
合致する分子量35,894のタンパク質をコードしているこ
とから、148〜150（ATG）がＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子
の翻訳開始コドンと考えられる。該塩基配列の構造遺伝
子は、第１図の塩基配列の148〜1104に示される。すな
わち、第１図の塩基配列には148〜150（ATG開始コド
ン）で始まり、1105〜1107［オーカー（TAA終止コド
ン）］に終わる957塩基対からなるオープンリーディン
グフレーム（これらは319個のアミノ酸から成るタンパ
ク質をコードする）が存在する。
へ1197塩基の範囲の塩基配列をダイデオキシ法により決
定した。その結果を第１図に示す。ついで、（６）にお
ける結果から2.1KbのXba Iのサイトと2.5KbのHinc IIサ
イトの間におけるオープンリーディングフレームを探し
たところ、148〜150番目のATG開始コドンで始まるオー
プンリーディングフレームを見出した。なお、148〜150
以外にもATGはいくつか見られるが、（１）確認された
アミノ末端のアミノ酸配列、すなわち、メチオニン−リ
ジン−アルギニンをコードしている塩基配列はここだけ
であること、また、（２）リボゾーム結合部位であるシ
ャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgarno）配列、すなわ
ち、GAAAGGAが129〜135に存在し、さらには、（３）バ
チルス・エス・ピー TP262株から精製したＬ−乳酸脱
水素酵素のサブユニットの分子量37,000〜39,000にほぼ
合致する分子量35,894のタンパク質をコードしているこ
とから、148〜150（ATG）がＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子
の翻訳開始コドンと考えられる。該塩基配列の構造遺伝
子は、第１図の塩基配列の148〜1104に示される。すな
わち、第１図の塩基配列には148〜150（ATG開始コド
ン）で始まり、1105〜1107［オーカー（TAA終止コド
ン）］に終わる957塩基対からなるオープンリーディン
グフレーム（これらは319個のアミノ酸から成るタンパ
ク質をコードする）が存在する。
（９） Ｌ−乳酸脱水素酵素の精製とその性質 エシェリシア・コリ TC1株が生産するＬ−乳酸脱水素
酵素の精製 エシェリシア・コリ TC1株においても、バチルス・
エス・ピー TP262株と同様、数種のＬ−乳酸脱水素酵
素（バンドＩ〜IV）を生産するが（写真第６図−Ａ）、
このうち、特に活性の強いバンドIV bで示されるＬ−乳
酸脱水素酵素の精製法を示す。
酵素の精製 エシェリシア・コリ TC1株においても、バチルス・
エス・ピー TP262株と同様、数種のＬ−乳酸脱水素酵
素（バンドＩ〜IV）を生産するが（写真第６図−Ａ）、
このうち、特に活性の強いバンドIV bで示されるＬ−乳
酸脱水素酵素の精製法を示す。
アンピシリン50μg/mlを含むＬ−ブロス５に、エシ
ェリシア・コリ TC1株を37℃で培養した後、集菌し、
湿重量にして40gの菌体を得る。得られた菌体に、100mM
の0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）280mlを加えて懸濁液と
し、60℃で15分間インキュベートした後、超音波破砕
（なお、長音波破砕処理した菌体のＬ−乳酸脱水素酵素
活性は、破砕菌体1gについて574単位（unit）であっ
た。）し、再び60℃で15分間インキュベートした後、遠
心分離を行い、上清液と沈澱物に分けた。沈澱物に上記
の緩衝液120mlを加え、再抽出を行った。２回の上清液
を合わせ、ストレプトマイシン硫酸塩を加えて核酸を除
去し、飽和硫酸アンモニウム水溶液（pH7.5）380mlを加
えて50％飽和とし、沈澱物を除去する。この上清液730m
lを、70℃で15分間インキュベートした後、再び沈澱物
を除去する。この上清液を、予め25％飽和硫酸アンモニ
ウム水溶液で平衡化させておいたブチルトヨパール650S
カラム（ベッド体積100ml）に吸着させ、20％飽和硫酸
アンモニウム水溶液で洗浄した後、15％飽和硫酸アンモ
ニウム水溶液で溶出させた画分を分取する。得られた溶
出液を限外過で濃縮した後、10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）に置換し、ついで、この溶液を予め50mMリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化させておいたDEAE−セファデック
スＡ−25（ファマルシア株式会社製）（ベッド体積130m
l）に吸着させ、100mMリン酸緩衝液で洗浄した後、200m
Mリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させた画分を分取する。
溶出液をセファデックスG100（ファルマシア株式会社
製）によるゲル過および高速液体クロマトグラフィー
［TSKゲルG3000SW（東ソー株式会社製）］によるゲル
過に順次付した後、得られた精製酵素をポリアクリルア
ミド電気泳動し、銀染色および活性染色した結果、単一
バンドが検出された（第６図−Ｂ）。また、高速液体ク
ロマトグラフィーおよびポリアクリルアミド電気泳動に
より、この酵素の分子量は、約120,000であった。そし
て、SDS−ポリアクリルアミド法によれば、分子量39,00
0の単一の分子が与えられることから、このＬ−乳酸脱
水素酵素は４つのサブユニットより成ると考えられる。
ェリシア・コリ TC1株を37℃で培養した後、集菌し、
湿重量にして40gの菌体を得る。得られた菌体に、100mM
の0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）280mlを加えて懸濁液と
し、60℃で15分間インキュベートした後、超音波破砕
（なお、長音波破砕処理した菌体のＬ−乳酸脱水素酵素
活性は、破砕菌体1gについて574単位（unit）であっ
た。）し、再び60℃で15分間インキュベートした後、遠
心分離を行い、上清液と沈澱物に分けた。沈澱物に上記
の緩衝液120mlを加え、再抽出を行った。２回の上清液
を合わせ、ストレプトマイシン硫酸塩を加えて核酸を除
去し、飽和硫酸アンモニウム水溶液（pH7.5）380mlを加
えて50％飽和とし、沈澱物を除去する。この上清液730m
lを、70℃で15分間インキュベートした後、再び沈澱物
を除去する。この上清液を、予め25％飽和硫酸アンモニ
ウム水溶液で平衡化させておいたブチルトヨパール650S
カラム（ベッド体積100ml）に吸着させ、20％飽和硫酸
アンモニウム水溶液で洗浄した後、15％飽和硫酸アンモ
ニウム水溶液で溶出させた画分を分取する。得られた溶
出液を限外過で濃縮した後、10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）に置換し、ついで、この溶液を予め50mMリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化させておいたDEAE−セファデック
スＡ−25（ファマルシア株式会社製）（ベッド体積130m
l）に吸着させ、100mMリン酸緩衝液で洗浄した後、200m
Mリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出させた画分を分取する。
溶出液をセファデックスG100（ファルマシア株式会社
製）によるゲル過および高速液体クロマトグラフィー
［TSKゲルG3000SW（東ソー株式会社製）］によるゲル
過に順次付した後、得られた精製酵素をポリアクリルア
ミド電気泳動し、銀染色および活性染色した結果、単一
バンドが検出された（第６図−Ｂ）。また、高速液体ク
ロマトグラフィーおよびポリアクリルアミド電気泳動に
より、この酵素の分子量は、約120,000であった。そし
て、SDS−ポリアクリルアミド法によれば、分子量39,00
0の単一の分子が与えられることから、このＬ−乳酸脱
水素酵素は４つのサブユニットより成ると考えられる。
精製酵素の比活性は103単位（Unit）/mg蛋白であり、
粗酵素に比べ約32倍精製されたものであった。
粗酵素に比べ約32倍精製されたものであった。
なお、pTC1およびpTC17でエシェリシア・コリ JM109
株を形質転換して得られたTC1B株およびTC17株を前記
（４）に記載された方法と同様にして培養して粗酵素液
を調製し、そのＬ−乳酸脱水素酵素活性を測定した結
果、上記したTC1株の酵素活性に比して、それぞれ、2.3
8および2.05倍の活性が認められた。
株を形質転換して得られたTC1B株およびTC17株を前記
（４）に記載された方法と同様にして培養して粗酵素液
を調製し、そのＬ−乳酸脱水素酵素活性を測定した結
果、上記したTC1株の酵素活性に比して、それぞれ、2.3
8および2.05倍の活性が認められた。
（10） pBR322への遺伝子の組換え pTC1をHind IIIで切断し、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を含む3.9KbのDNA切断をアガロースゲル電気泳動した
後、ジーンクリーンにより、3.9KbのHind III−DNA断片
を回収する。一方、プラスミドpBR322をHind IIIで切断
し、3.9KbのHind III−DNA断片とT4DNAリガーゼで連結
して、pTC20を得る。
を含む3.9KbのDNA切断をアガロースゲル電気泳動した
後、ジーンクリーンにより、3.9KbのHind III−DNA断片
を回収する。一方、プラスミドpBR322をHind IIIで切断
し、3.9KbのHind III−DNA断片とT4DNAリガーゼで連結
して、pTC20を得る。
得られたプラスミドをエシェリシア・コリに導入し、
形質転換株を得、前記（４）と同様にして培養して粗酵
素液を調製し、そのＬ−乳酸脱水素酵素活性を測定した
結果、エシェリシア・コリ TC1株と同様のＬ−乳酸脱
水素酵素活性を有していることが確認された。
形質転換株を得、前記（４）と同様にして培養して粗酵
素液を調製し、そのＬ−乳酸脱水素酵素活性を測定した
結果、エシェリシア・コリ TC1株と同様のＬ−乳酸脱
水素酵素活性を有していることが確認された。
第１図は、プラスミドpTC1のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子
を含むDNA断片の塩基配列を示し、 第２図は、プラスミドpTC1の制限酵素地図を示し、 第３図は、プラスミドpTC1、pTC5、pTC6、pTC7、pTC9、
pTC10およびpTC17の好熱菌由来挿入DNA断片の制限酵素
地図およびこれらのプラスミドによって形質転換した株
のＬ−乳酸脱水素酵素活性の有無を示し、 第４図は、プラスミドpTC5、pTC6、pTC7、pTC9、pTC10
およびpTC17の作製ルートを示す模式図を示し、 第５図は、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を
示す図面である。なお、Ａは、バチルス・エス・ピーTP
262株より生産された数種のＬ−乳酸脱水素酵素（バン
ドＩ〜VI）をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動し、活
性染色を行った結果を示し、Ｂは、上記Ａに示した数種
のＬ−乳酸脱水素酵素（バンドＩ〜VI）のうち、バンド
IV bのみを精製したものを、SDS−ポリアクリルアミド
電気泳動し、活性染色を行った結果を示す。 第６図は、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を
示す図面である。なお、Ａは、組み換え体エシェリシア
・コリTC1株より生産された数種のＬ−乳酸脱水素酵素
（バンドＩ〜VI）をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動
し、活性染色を行った結果を示し、Ｂは、上記Ａに示し
た数種のＬ−乳酸脱水素酵素（バンドＩ〜VI）のうち、
バンドIV bのみを精製したものを、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動し、活性染色を行った結果を示す。
を含むDNA断片の塩基配列を示し、 第２図は、プラスミドpTC1の制限酵素地図を示し、 第３図は、プラスミドpTC1、pTC5、pTC6、pTC7、pTC9、
pTC10およびpTC17の好熱菌由来挿入DNA断片の制限酵素
地図およびこれらのプラスミドによって形質転換した株
のＬ−乳酸脱水素酵素活性の有無を示し、 第４図は、プラスミドpTC5、pTC6、pTC7、pTC9、pTC10
およびpTC17の作製ルートを示す模式図を示し、 第５図は、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を
示す図面である。なお、Ａは、バチルス・エス・ピーTP
262株より生産された数種のＬ−乳酸脱水素酵素（バン
ドＩ〜VI）をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動し、活
性染色を行った結果を示し、Ｂは、上記Ａに示した数種
のＬ−乳酸脱水素酵素（バンドＩ〜VI）のうち、バンド
IV bのみを精製したものを、SDS−ポリアクリルアミド
電気泳動し、活性染色を行った結果を示す。 第６図は、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を
示す図面である。なお、Ａは、組み換え体エシェリシア
・コリTC1株より生産された数種のＬ−乳酸脱水素酵素
（バンドＩ〜VI）をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動
し、活性染色を行った結果を示し、Ｂは、上記Ａに示し
た数種のＬ−乳酸脱水素酵素（バンドＩ〜VI）のうち、
バンドIV bのみを精製したものを、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動し、活性染色を行った結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓ ｅｙｌｅｒ 368［９］（1987）ｐ1167 −1177 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) (54)【発明の名称】 バチルス・エス・ピー、Ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するＤＮＡ断片およびそれを含有する 組み換え体プラスミド並びにＬ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラス ミド。
Claims (6)
- 【請求項１】50〜70℃付近で生育することができ、ゼラ
チン液化がなく、デンプンを加水分解せず、Ｌ−乳酸脱
水素酵素を生産する好熱菌であるバチルス・エス・ピー
TP262株（FERM P−10450）。 - 【請求項２】バチルス・エス・ピー TP262株（FERM P
−10450）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含み、下
図に示す制限酵素地図で特徴づけられる制限酵素Hind I
IIによる切断で生じた分子量2.5メガダルトン（3.9kb）
のDNA断片。 - 【請求項３】バチルス・エス・ピー TP262株（FERM P
−10450）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含み、下
図に示す制限酵素地図で特徴づけられる制限酵素Hind I
IIによる切断で生じた分子量2.5メガダルトン（3.9kb）
のDNA断片を、宿主微生物において発現させうる複製可
能な発現ベクターに連結した組み換え体プラスミド。 - 【請求項４】遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の
塩基が置換されているかまたは置換されていない塩基配
列； の全体で示されるＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子。 - 【請求項５】塩基配列； 塩基配列； の５′末端に連結してなる特許請求の範囲第（４）項に
記載のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子。 - 【請求項６】塩基配列； および塩基配列； 塩基配列； の５′末端および３′末端にそれぞれ連結してなる特許
請求の範囲第（４）項に記載のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝
子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1108432A JP2857886B2 (ja) | 1989-04-27 | 1989-04-27 | バチルス・エス・ピー、ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するｄｎａ断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1108432A JP2857886B2 (ja) | 1989-04-27 | 1989-04-27 | バチルス・エス・ピー、ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するｄｎａ断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02286077A JPH02286077A (ja) | 1990-11-26 |
| JP2857886B2 true JP2857886B2 (ja) | 1999-02-17 |
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ID=14484628
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1108432A Expired - Fee Related JP2857886B2 (ja) | 1989-04-27 | 1989-04-27 | バチルス・エス・ピー、ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するｄｎａ断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2857886B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747310A (en) * | 1992-07-10 | 1998-05-05 | Meiji Milk Products Co., Ltd. | Gene integration into chromosomes of lactobacillus delbrueckii species and integrants thereof |
| JP2931939B2 (ja) * | 1992-07-10 | 1999-08-09 | 明治乳業株式会社 | Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ 種染色体への遺伝子組込み方法及び遺伝子組込み体 |
| WO2002029030A2 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Elsworth Biotechnology Limited | Ethanol production |
| AU2002355975A1 (en) * | 2001-08-13 | 2003-03-03 | Dtu, Technical University Of Denmark | Plasmids from anaerocellum thermophilum and uses thereof |
-
1989
- 1989-04-27 JP JP1108432A patent/JP2857886B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３６８［９］（１９８７）ｐ１１６７−１１７７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02286077A (ja) | 1990-11-26 |
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