CN101374951B - 同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属(Bacillus)物种的工业应用的遗传修饰。本发明包括用于通过遗传改造来修饰兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的方法,所述方法包括将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒***中的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中;于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细胞,以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞;于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经转化的细胞,以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞。本发明的方法可用于修饰芽孢杆菌以用于R-乳酸的生产,除乳酸以外的其他有机酸、醇、酶、氨基酸和维生素的生产。特别地,本发明提供了一种方法,其中通过将编码S-乳酸脱氢酶的基因替换为包含编码R-乳酸脱氢酶的DNA序列的DNA构建体来修饰芽孢杆菌属物种。
Description
本发明涉及用于兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属(Bacillus)物种的工业应用的遗传修饰。
乳酸及其盐(称为乳酸盐)是市售可得的产品,其可用于各种领域,包括医药、生物可降解聚合物和食品加工。兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种是用于乳酸的工业制备的理想生物。它们能够在30-65℃的温度下生长,并在高于50℃的温度下允许厌氧工业发酵。当以工业规模进行发酵时,该高温度具有几个优点:低感染风险并因此更高的对映异构体纯度,更快的反应等等。同型乳酸性质允许从烃来源(包括六糖和五糖;参见WO 04/063382)生产乳酸,而不形成多于15wt%的副产物,例如甲酸和乙酸。所述芽孢杆菌的兼性厌氧性质允许在厌氧条件下进行发酵,或者至少在低氧气分压下进行发酵,由于这允许相对便宜的设备和工艺,所以这对于工业规模来说是所需要的。此外,这些细菌的营养要求比乳酸细菌例如乳杆菌属(Lactobacillus)物种低,所述乳酸细菌也允许相对便宜的工业工艺。已知的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌的一个缺点是,它们不或者几乎不产生R-乳酸。由于生物可降解乳酸聚合物的成功应用依赖于便宜的S-乳酸和便宜的R-乳酸两者的可用性,因此需要这两种对映异构体的有成本效益的生产。如今,已知的产R-乳酸的细菌是嗜热的(例如左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)或者具有苛求的营养要求(例如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)),这使得R-乳酸的制备比S-乳酸的制备要贵得多。
因此,本发明的一个目的是利用中度嗜热芽孢杆菌菌株,其是兼性厌氧的并且通过同型乳酸发酵来生产R-乳酸。本发明的另一个目的是利用用于产生经遗传改造的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌的方法。
芽孢杆菌属包括超过200个不同的物种(参见Sneath,P.H.A.,1986:Endospore-forming Gram-positive rods and cocci.Bergey’smanual of systematic bacteriology.Vol 2.Sneath,P.H.A.,Mair,N.S.,Sharpe,M.E.,Holt,J.G.(编辑)Williams & Wilkins,Baltimore)。已知这些芽孢杆菌只有少部分是遗传上可了解的。例如,原生质体转化对于许多不同的芽孢杆菌属物种发挥作用,但仅证明感受态细胞的转化通常对于严格需氧的且嗜温的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的细胞的作用是令人满意的。工业菌株常常对于遗传修饰更具有抗性,如从地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中所获知的。将这种兼性厌氧的中度嗜热芽孢杆菌属物种用于酶的工业生产。然而,因为其异型乳酸性质,其不能用于乳酸的生产(参见Bulthuis,B.A.,C.Rommens,G.M.Koningstein,A.H.Stouthamer,H.W.van Verseveld,1991:Formation of fermentation products and extracellular protease during anaerobic growth of Bacillus licheniformis in chemostat and batch-culture,Antonie van Leeuwenhoek 60:355-371)。通常,高频率的感受态转化操作不可用于工业菌株(参见Outtrup,H.和S.T.2002:The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes in Applications and systematics of Bacillus and relatives.R.Berkeley,M.Heyndrickx,N.Logan,和P.de Vos(eds.),pp.206-218,BlackwellPublishing,Malden,USA)。可通过原生质体转化来修饰这样的菌株,如US 6,083,718中所公开的。
至今,没有记述表明兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的遗传改造的方法。尽管已发表的一个报告要求保护通过原生质体融合来进行从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)至凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的质粒转移(参见Ball,A.S.和C.Edwards,1989:Properties of protoplasts from the thermophile Bacillus coagulans and their significance for genetic studies.Lett.Appl.Microbiol.9:141-144),但其没有提供凝结芽孢杆菌确实具有该质粒的证据。所声称的仅仅基于观察到抗生素抗性菌落的生长,所述菌落能够非常好地成为自发抗生素抗性突变体。常常对于各种类型的抗生素,我们已观察到凝结芽孢杆菌的此类自发抗生素抗性突变体。在另一篇出版物中:Transformation of Bacillus spp.:An Examination of the transformation of Bacillus protoplasts by plasmids pUB110 and pHV33,Current Microbiology,Vol 13(1986),pp 191-195,描述了在各种芽孢杆菌中的原生质体转化。然而,在凝结芽孢杆菌中的转化被报道为不成功。
电穿孔广泛用于细菌,但需要对生长培养基和电穿孔缓冲液进行物种特异性的(或者甚至菌株特异性的)优化。芽孢杆菌属物种的成功电穿孔经常需要质粒DNA的体内或体外甲基化以防止其在转化后的限制。WO 02/29030公开了对通过电穿孔将经体内甲基化的质粒引入嗜热芽孢杆菌菌株TN的细胞中。所使用的质粒基于热敏感型质粒pUB110。然而,我们发现,当用于转化兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种时,该质粒不能产生经转化的细胞。
我们现在已发现,通过遗传改造对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传修饰是可能的。因此,本发明第一次显示了通过转化来对中度嗜热的兼性厌氧且同型乳酸的芽孢杆菌属物种进行遗传改造。除了就R-乳酸生产来改造所述兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌外,还可以就工业化合物的生产来遗传改造所述芽孢杆菌,所述工业化合物包括除乳酸以外的其他有机酸、醇、酶、氨基酸和维生素。
根据本发明,重要的是该中度嗜热芽孢杆菌属物种是同型乳酸的,因为这确保了新引入的功能性将会导致高产量生产,并有少量副产物。此外,使用同型乳酸的芽孢杆菌属物种使得能够只必须应用少量修饰以获得工业上可应用的微生物。
将中度嗜热芽孢杆菌属物种定义为能够在30-65℃之间的温度生长的细菌。中度嗜热的兼性厌氧且同型乳酸的物种的实例是凝结芽孢杆菌和史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)。同型乳酸的芽孢杆菌可通过同型乳酸发酵而天然地生产S-乳酸。本领域技术人员可容易地确定哪种特定菌株可通过同型乳酸发酵来生产乳酸。本发明还包括衍生自中度嗜热的兼性厌氧的芽孢杆菌属物种的菌株,其中该同型乳酸表型被修饰。优选地,选择具有在孢子形成方面具有缺陷的菌株和衍生物。
由于关于中度嗜热的兼性厌氧且同型乳酸的芽孢杆菌没有可用的文献,发明人需要发现能够在这些芽孢杆菌中复制的质粒,需要优化用于将DNA引入这些细胞的方法,以及需要发现用于所定义的芽孢杆菌属物种类群的合适的选择标记,以能够通过转化来遗传改造这些芽孢杆菌。
发明人决定使用电穿孔作为方法来发现何种质粒能在这些芽孢杆菌中复制。所测试的质粒为pIL253(参见Simon,D.和A.Chopin,1988:Construction of a vector plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis.Biochimie70:559-566)、pMV158(参见Burdett,V.,1980:Identification of tetracycline resistant R-plasmids in Streptococcus agalactiae (group B),Antimicrob.Agents Chemother.18:753-766.)、pHP13(参见Haima,P.,S.Bron,G.Venema,1987:The effect of restriction on shotgun cloning and plasmid stability in Bacillus subtilis Marburg.Mol.Gen.Genet.209:335-342.)、pUB110(参见Keggins,K.M.,P.S.Lovett,E.J.Duvall,1978:Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1423-1427)、pAMS100(参见Kiewiet,R.,J.Kok,J.F.M.L.Seegers,G.Venema,S.Bron,1993:The mode of replication is a major factor in segregational plasmid instability in Lactococcus lactis.Appl.Environ.Microbiol.59:358-364)、pWCFS105(参见Van Kranenburg,R.,N.Golic,R.Bongers,R.J.Leer,W.M.de Vos,R.J.Siezen,M.Kleerebezem,2005:Functional anyalysis of three plasmids from Lactobacillus plantarum,Appl.Environ.Microbiol.71:1223-1230)、pNZ280(参见Platteeuw,C.,F.Michiels,H.Joos,J.Seurinck和W.M.de Vos,1995:Characterization and heterologous expression of the tetL gene and identification of iso-ISS1 elements from Enterococcus faecalis plasmid pJH1,Gene160:89-93.)、pNZ124(参见Platteeuw,C.,G.Simons和W.M.deVos.1994:Use of the Escherichia coli β-glucuronidase(gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria,Appl.Environ.Microbiol.60:587-593)和pNW33n(参加Zeigler,D.R.2001:The genus Geobacillus:introduction and strain catalog,第7版,第3卷.Bacillus Genetic Stock Center,www.bgsc.org)。在各种试验之后,发现后三种质粒能够复制并获得转化体。
一旦鉴定了能够在这些芽孢杆菌中复制的质粒,就可以方便地优化与转化方案相关的其他操作参数。另外,还就可行性测试了用于引入DNA的其他方法,例如天然转化或接合。
使用抗生素抗性标记物的测试证明,至少可使用氯霉素抗性、四环素抗性和卡那霉素抗性。应当小心避免过低的浓度,因为这些会导致产生自发抗生素抗性菌落。引入克隆在pNZ124或pNW33n中的来自pIL253的红霉素抗性基因不能得到转化体。
因此,在第一个方面中,本发明公开了用于通过遗传改造来对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传修饰的方法。该方法包括以下步骤:
将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒***中的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中;
于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细胞,以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞;
于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经转化的细胞,以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞。
于所述许可温度下在选择培养基上培养所述细胞允许选择转化体,即摄取了所述转化性DNA(transforming DNA)的细胞。优选地,于非许可温度下培养经转化的细胞之前分离经转化的菌落,以允许检查所述转化性DNA的完整性。然后于非许可温度下培养一个或少量独个菌落的细胞,以允许选择整合体。
根据本发明,将目的DNA克隆入包含pSH71复制子(GenBank登录号A09338)或其同系物的热敏感型质粒***中。pSH71复制子是提供热敏感复制功能性的复制子。热敏感复制功能性提供了包含该复制子的质粒在许可温度下的复制,以及所述质粒在非许可温度下的复制的缺乏。通过复制起点和由该复制子编码的复制蛋白质(RepA)提供了pSH71复制子的该热敏感复制功能性。
在本发明的情况下,将“pSH71复制子或其同系物”定义为包含编码多肽的DNA序列的DNA,所述多肽具有热敏感复制功能性(RepA蛋白)并具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有80%同一性,优选地90%同一性,更优选地95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。pSH71复制子或其同系物进一步包括复制起点,在所述复制起点中上述RepA蛋白能够发挥作用。pSH71复制子的同系物的一个实例是pWV01(GenBank登录号X56954)。pSH71复制子或其同系物可进一步包括调节蛋白(RepC)。
对于本发明的目的,2个氨基酸序列之间的同一性的程度指在这2个序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法来确定同一性的程度,该算法描述在Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定了该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用11的字长(W)、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))、50的比对(B)、10的期望值(E)、M=5、N=-4以及2条链的比较作为缺省设置。
当想要获得转化性DNA的染色体整合时,具有条件复制子的整合质粒的可用性是希望的。可以在许可条件下引入这样的质粒,其后改变生长条件(例如通过变为非许可温度),从而致使该质粒不复制并且允许就由同源或非同源重组造成的染色体整合事件进行选择。作为条件克隆载体,可以使用热敏感型复制子例如在pNZ124中存在的pSH71,或者基本与其等同(同源)的质粒或保留了该质粒的热敏感特性的其衍生物。在兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种中,对于该复制子而言的许可温度优选地为37-50℃。非许可温度优选地大于50℃。许可和非许可温度可能不只依赖于复制子,而且还依赖于宿主芽孢杆菌属物种。后者在现有技术中是已知的现象,其由pG+宿主质粒所例示,对于所述pG+宿主质粒而言,37℃在德氏乳杆菌中是许可温度而对于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是非许可温度(参见US 5919678)。
也可以作为pNW33n的热敏感衍生物或能够在兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种中复制的其他质粒,来获得条件克隆载体。
通过以下方法,将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒***中的目的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中:
A.原生质体转化或原生质体融合,
B.电穿孔,
C.基因枪转化,
D.接合,或
E.天然感受态细胞的转化。
可以通过经过含有兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种和合适的转化性DNA的悬浮液进行高压放电来实现通过电穿孔进行的这些芽孢杆菌属物种的转化,所述转化性DNA包含所需的功能性和/或与该特定的芽孢杆菌的基因组序列同源的DNA序列。
可以通过将兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种(群落)与含有具有所需功能性的自我转移或可移动的质粒的供体细胞(群落)接触,来实现通过接合进行的这些芽孢杆菌属物种的转化。自我转移质粒编码它们在细胞之间迁移所需要的所有功能,并且有时候它们也帮助染色体DNA和可移动质粒的转移。可移动质粒不编码转移所需要的所有蛋白质,并因而需要由供体基因组(染色体或质粒编码的)来提供这些功能。可移动质粒至少包含转移起点(oriT)区域。可与待修饰的中度嗜热芽孢杆菌共培养的任何供体细胞基本上适合用作供体细胞。合适的供体细胞的实例是下列物种的细胞:芽孢杆菌属物种,包括嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(B.brevis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、史氏芽孢杆菌(B.smithii)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、热噬淀粉芽孢杆菌(B.thermoamylovorans)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus),大肠杆菌(E.coli),粪肠球菌(Enterococcusfaecalis),乳杆菌属(Lactobacillus)物种,包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、干酪乳杆菌(L.casei)、棒状乳杆菌(L.coryniformis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、植物乳杆菌(L.plantarum)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、L.sanfriscensis,链球菌属(Streptococcus)物种,包括无乳链球菌(S.agalactiae)、变异链球菌(S.mutans)、口腔链球菌(S.oralis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、唾液链球菌(S.salivarius)、表兄链球菌(S.sobrinus)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。合适的自我迁移质粒包括pRK24、pLS20、pAMβ1,或者与其基本上相同的质粒或保留了质粒自我迁移能力的其衍生物。合适的可移动载体包括pAT18、pAT28、pJS28,或者与其基本上相同的质粒或保留了质粒移动能力的其衍生物。
发明人进一步设法开发用于这些芽孢杆菌属物种的天然转化方案。这需要确定用于生长、饥饿和转化的正确培养基组成、用于形成和收获感受态细胞的正确时机以及正确的转化操作程序。尽管已知天然转化在芽孢杆菌属物种中不是广泛存在的,但发明人发现,兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌可被制成天然感受态。
对于电穿孔和原生质体转化,转化性DNA的来源可以影响到转化的结果。待转化的DNA来源(从乳酸乳球菌MG 1363、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌JM11 0中分离的)不影响在所述芽孢杆菌属物种中的转化效率,这说明DNA的甲基化状态不是重要的。这与其他芽孢杆菌属物种相反(参见例如WO 02/29030)。
在本发明的优选实施方案中,用于引入至芽孢杆菌中的转化性DNA分离自乳酸乳球菌。更优选地,还在乳酸乳球菌中进行用于构建该转化性DNA的克隆步骤。这是因为在大肠杆菌中的克隆经常似乎导致所克隆的DNA中的缺失和/或重排。
通过本发明,提供了用于优选地通过天然感受态的诱导进行转化、转化电感受(electrocompetent)细胞以及接合的方法,显示了热敏感型质粒的用途,并显示了这些要素用于产生经遗传改造的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的应用,例如用于生产R-乳酸。
转化性DNA包含pSH71复制子或其同系物,以及能够为芽孢杆菌细胞提供所需功能性的目的DNA。
染色体修饰是兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的优选修饰,因为染色体修饰可确保所述功能性在后代细胞中稳定散布。可以采用非同源重组以及同源重组来进行在染色体中引入所需要的功能性。同源重组是优选的,因为其开启了引入、去除或者同时引入和去除功能性的机会。
在本发明的情况下,功能性可以是编码待由该细胞产生的所需多肽的基因和/或编码参与由该细胞进行的初级或次生代谢物生产的多肽的基因和/或使得能够从该细胞的染色体中删除DNA序列的DNA序列。
与在细胞中具有功能的调节序列(例如启动子序列)一起提供编码多肽的基因。所述调节序列可以是与编码序列天然相连的序列,或者与其异源的序列。
编码多肽的基因可以与在所选择的芽孢杆菌属物种中具有功能的任何调节或启动子序列融合。合适的启动子序列包括从所选择的芽孢杆菌属物种中可获得的启动子、来源于不同天然芽孢杆菌启动子的杂合启动子和人工启动子。优选的启动子是待通过同源重组进行失活的芽孢杆菌基因的启动子。特别优选的是来自凝结芽孢杆菌的1dhL启动子或在US 5171673中公开的淀粉酶基因的启动子。
为使得能够从大量未转化的细胞中选择经转化的芽孢杆菌细胞,将选择标记作为转化性DNA的一部分。所述选择标记可存在于与目的功能性相同的DNA片断或质粒上,或者存在于分开的DNA片断或质粒上。优选的选择标记是来自pMH3的编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因。
可以引入的所需功能性是如下文描述的R-乳酸生产,以及提供可从丙酮酸代谢而来的化合物的生产的其他功能性。这些化合物的实例是丙酮酸、乙酸乳酸、双乙酰、3-羟基丁酮、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、醋酸、甲酸、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸、富马酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。
当想要进行同源重组时,转化性DNA进一步包含与待改造的特定芽孢杆菌的基因组靶序列同源的DNA序列。本领域技术人员应当理解,对于获得同源重组而言100%的同一性并不是必需的。大约90%的同一性百分比也是足够的。一般而言,待通过同源重组***到染色体中的目的DNA序列的侧翼为具有足够长度的同源序列以使得能够同源重组。该长度是至少大约200bp,例如大约200-大约1500bp,优选大约200-大约1000bp。
本发明旨在借助于对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传改造来进行的修饰,其中优选地通过同源重组引入所需的功能性。
本发明还旨在借助于对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传改造来进行的修饰,其中通过同源重组去除不需要的功能性。
本发明进一步旨在借助于对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传改造来进行的修饰,其中通过同源重组向染色体中引入所需的功能性并同时去除不需要的功能性。
经遗传改造的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌菌株或者同型乳酸的亲本菌株的衍生物可通过所述借助于遗传改造的修饰而获得,这形成了本发明的进一步的方面。借助于遗传改造的修饰包括对于细菌染色体引入功能性、去除功能性或者同时引入功能性和去除功能性。
在优选的实施方案中,通过同源重组来进行借助于遗传改造的修饰。
在一个优选的实施方案中,兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的经遗传改造的衍生物是这样的菌株,在所述菌株中阻断了丙酮酸转化为乳酸并且积累丙酮酸,或者在所述菌株中应用另外的修饰以将丙酮酸重新定向到其他产物的生产,所述其他产物包括乙酸乳酸、双乙酰、3-羟基丁酮、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、醋酸、甲酸、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸、富马酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。
在另一个优选的实施方案中,兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的经遗传改造的衍生物是这样的菌株,在所述菌株中通过同源重组去除编码S-乳酸脱氢酶活性的1dhL基因。
在另一个优选的实施方案中,兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的经遗传改造的衍生物是这样的菌株,在所述菌株中通过同源重组将编码S-乳酸脱氢酶活性的1dhL基因替换为编码具有R-乳酸脱氢酶活性的NADH依赖性2-羟基酸脱氢酶的基因。
在这些实施方案中,用于同源重组的构建体包含不编码具有功能的S-乳酸脱氢酶的缺陷型1dhL基因。可以由其中删除了部分或全部1dhL编码序列的构建体来提供缺陷型1dhL基因。
可通过将部分或全部1dhL基因替换为另一种基因例如编码选择标记或目的基因的基因来制作缺陷型1dhL基因。优选地,将编码S-乳酸脱氢酶活性的1dhL基因替换为构建体,所述构建体包含编码具有R-乳酸脱氢酶活性的NADH依赖性2-羟基酸脱氢酶(包括EC号为EC1.1.1.28的酶)的基因。
合适的编码R-乳酸脱氢酶活性的基因是能够补偿大肠杆菌1dhA-突变体例如由Bernard等人(参见Bernard,N.,T.Ferrain,D.Garmyn,P.Hols和J.Delcour,1991:Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli.FEBS Lett.290:61-64)描述的大肠杆菌FMJ114的那些基因。合适的编码R-乳酸脱氢酶活性的1dhA基因例如是来自德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)的1dhA基因(也可参见Bernard等人),或来自相同物种的hdhD基因(Bernard,N.,K.Johnsen,T.Ferain,D.Garmyn,P.Hols,J.J.Holbrook和J.Delcour.1994.NAD + -dependent D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus.Eur.J.Biochem.224:439-446)。由1dhA基因编码的R-乳酸脱氢酶的氨基酸序列描述在SEQ ID NO:2中。看起来,由能够补偿上述大肠杆菌突变体的基因所编码的多肽在氨基酸序列方面基本上不同。与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的低至30%的同一性百分比是可行的。1dhA和hdhD基因似乎编码具有大约50%同一性程度的蛋白质。
合适的编码R-乳酸脱氢酶活性的基因是编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的那些基因,或者同源基因,所述同源基因编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列显示出至少30%,更优选地至少40%,更加优选地至少50%、60%、70%、80%、90%的同一性程度的氨基酸序列,并且能够补偿大肠杆菌1dhA-突变体例如大肠杆菌FMJ144。此类同源序列可包括多态性,所述多态性可以存在于来自不同群体的细胞中或者由于天然的等位基因或菌株内变异而存在于一个群体中。进一步地,同系物可以来自除该指定DNA或氨基酸序列所源自的物种以外的其他芽孢杆菌属物种,或者可以人工设计和合成。
除了引入所需的功能性之外,遗传改造还可用于优化工业发酵,例如使得能够发酵便宜的底物例如衍生自木质素纤维素的糖(包括木糖和***糖),和/或去除不需要的功能性。
在进一步的方面,本发明提供了用于生产目的化合物的方法,包括在有益于产生所述化合物的条件下培养前述方面的经遗传改造的菌株。
附图描述
图1显示了分离自3种大肠杆菌分离株的pNW33N的限制性分析,所述大肠杆菌分离株用分离自3种经转化的凝结芽孢杆菌DSM 1分离株的质粒材料转化。泳道1、4和7是用EcoRI消化的pNW33N;4217-bp片段。泳道2、5和8是用EcoRI-StuI消化的pNW33N;333-bp和3884-bp片段。泳道3和6是Kb DNA梯(Stratagene)250bp、500bp、750bp、1.0kb、1.5kb、2.0kb、3.0kb、4.0kb、5.0kb、6.0kb、7.0kb、8.0kb、9.0kb、10.0kb和12.0kb。
图2显示了pJS28的质粒图谱。以箭头表示复制基因(repB)和氯霉素抗性基因(cat)。将IncP质粒RK2转移起点(oriT)和大肠杆菌复制起点(ori)显示为加框的区域。
图3显示了基于在US 5171673中公开的序列的合成的凝结芽孢杆菌ATCC 23498淀粉酶启动子区的核苷酸序列。对Bg1II(AGATCT)、BamHI(GGATCC)和NcoI(CCATGG)克隆位点加下划线。NcoI位点允许与淀粉酶启动子的翻译融合。以黑体显示淀粉酶基因的ATG起始密码子。
图4显示了pJS25的质粒图谱。以箭头表示复制基因(repA和repC)、没有NcoI位点的氯霉素抗性基因(cm*)。将凝结芽孢杆菌启动子区(P)显示为加框的区域。
图5显示了pJS26的质粒图谱。以箭头表示复制基因(repA和repC)、没有NcoI位点的氯霉素抗性基因(cm*)和LMG 6901 1dhA基因(1dhA 6901)。加框显示凝结芽孢杆菌启动子区(P)。
图6显示了pJS27的质粒图谱。以箭头表示复制基因(repB)、氯霉素抗性基因(cat)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)LMG 6901 1dhA基因(1dhA 6901)。将凝结芽孢杆菌启动子区(P)和大肠杆菌复制起点(ori)显示为加框的区域。
图7显示了pRK1的质粒图谱。以箭头表示复制基因(repA和repC)、氯霉素抗性基因(cat)和保加利亚乳杆菌1dhA基因(1dhA)。将凝结芽孢杆菌启动子区(Pamy ATTC)以及凝结芽孢杆菌1dhL上游和下游区域显示为加框的区域。
通过下述非限制性的实施例来进一步示例性地描述本发明。
实施例
材料和方法
质粒和菌株
从NIZO食品研究所获得质粒pNZ124(Platteeuw,C.,G.Simons和W.M.de Vos.1994.Use of the Escherichia coli -glucuronidase(gusA)gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria.Appl.Environ.Microbiol.60:587-593)。其基于在EP 0228726 B1中公开的克隆载体pNZ12。
从Bacillus Genetic Stock Center,Ohio State University,Columbus,Ohio,USA获得质粒pNW33N(Zeigler,D.R.2001:The genus Geobacillus;introduction and strain catalog.第7版,第3卷.Bacillus Genetic Stock Center,www.bgsc.org),并在大肠杆菌DH5α(Invitrogen Life Technologies)中进行繁殖。pNW33N的核苷酸序列可以以GenBank登录号AY237122获得。
从巴斯德研究所(Institute Pasteur)获得包含IncP质粒RK2转移起点(oriT)的质粒pATΔS28(Namy,O.,M.Mock,A.Fouet,1999:Co-existence of clpB and clpC in the Baciliceae.FEMSMicrobiol.Lett.173:297-302)。
从DSMZ,Braunschweig,Germany获得凝结芽孢杆菌DSM 1。
乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)MG1363由Gasson所描述(M.J.Gasson.1983:Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing.J.Bacteriol.154:1-9)。
从BCCM/LMG细菌保藏中心,Gent,Belgium获得德氏乳杆菌保加利亚亚种LMG 6901。
含有pRK24的大肠杆菌HB101由Trieu-Cuot等人描述(Trieu-Cuot,P.,C.Carlier,P.Martin和P.Courvalin,1987:Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria.FEMS Microbiol.Lett.48:289-294)。
培养条件
凝结芽孢杆菌常规地在需氧条件下于45℃在含有10g/L酵母提取物、2g/L磷酸二铵、3.5g/L硫酸二铵、10g/L Bis-Tris缓冲剂(双[2-羟甲基]亚氨基三[羟甲基]-甲烷)、3mg/L CaCl2、5mg/L MgCl2的BC-液体培养基(用于凝结芽孢杆菌的BC)中生长;如果合适,向培养基中补充50g/L蔗糖;将pH调节到6.6-6.7并且在使用前对培养基高压灭菌(20分钟,121℃)。对于平板,向培养基中补充10g/L脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)和1g/L MgCl2。分开地添加过滤灭菌的痕量元素。终浓度为:0.2mg/L CoCl2·6H2O、0.01mg/L CuCl2·2H2O、0.3mg/L H3BO3、0.03mg/L Na2MoO4·2H2O、0.02mg/L NiSO4·6H2O、0.03mg/L MnCl2·4H2O、0.05mg/L ZnCl2。如果合适,以7mg/L向培养基中补充过滤灭菌的氯霉素。感受态培养基(C-液体培养基)包含0.05g/L酵母提取物、2g/L磷酸二铵、3.5g/L硫酸二铵、10g/L葡萄糖、10mg/L CaCl2、0.5g/L KCl、25mg/L MgCl2;将pH调节到6.8,并且在使用前对培养基高压灭菌(20分钟,121℃)。分开地添加过滤灭菌的痕量元素和维生素。终浓度为:2.4mg/L CoCl2、3.6mg/L FeCl3、3mg/L MnCl2、1.2mg/L ZnCl2、0.024mg/L生物素、0.012mg/L硫胺素、20mg/L甲硫氨酸。转化培养基(T-液体培养基)是用0.025g/L酵母提取物代替0.05g/L酵母提取物的C-液体培养基。
大肠杆菌常规地在需氧条件下于37℃在LB液体培养基(Molecular Cloning,a laboratory manual.第3版,J.Sambrook和D.W.Russell.2001.Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)中进行培养。如果合适,分别以5mg/L和100mg/L的浓度使用氯霉素和/或氨苄青霉素。
保加利亚乳杆菌常规地在厌氧条件下于37℃在MRS液体培养基(BD Biosciences)中进行培养。
乳酸乳球菌常规地在厌氧条件下于30℃在补充有0.5%葡萄糖的M17液体培养基(BD Biosciences)中进行培养。如果合适,以5mg/L的浓度使用氯霉素。
DNA操作技术
如Sambrook和Russell所描述的(J.Sambrook和D.W.Russell.2001:Molecular Cloning,a laboratory manual.第3版.ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York)来实施标准DNA操作技术。
分别在乳酸乳球菌和大肠杆菌中进行pNZ124和pNW33N衍生物的构建。
根据制造商的说明书,使用Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit(Genomed)从100mL培养物中进行大规模的大肠杆菌质粒DNA分离。根据制造商的说明书,使用Nucleospin Plasmid Quick Pure(Macherey-Nagel)试剂盒从1mL培养物中进行小规模的大肠杆菌质粒DNA分离。
使用在氯化铯-溴化乙锭梯度中的平衡离心来进行大规模的凝结芽孢杆菌质粒DNA分离。通过离心收获2个300mL的于45℃在需氧条件(170rpm)下生长的过夜培养物。汇集细胞粒状沉淀并重悬在7mL含有2mg/mL溶菌酶、30mM Tris/HCl(pH8.0)、3mM MgCl2和25%蔗糖的缓冲液中,并且在冰上温育15分钟。通过添加16mL含有0.2M NaOH和1%SDS的溶液来裂解细胞。5分钟后,通过添加12mL的3M KAc并混合来中和该样品在冰上的温育。通过离心去除沉淀。通过添加20mL异丙醇来沉淀上清液中的DNA。通过离心来使所述DNA形成粒状沉淀、干燥并溶解在含有1.0g/mL CsCl和0.4mg/mL溴化乙锭的TE缓冲液中。通过使用垂直转子(Stepsaver 65 V13;Sorvall)以45000rpm进行氯化铯密度梯度离心16小时,来分开染色体和质粒DNA。收集质粒DNA,并如在别处的描述来去除溴化乙锭(Molecular Cloning,a laboratory manual.第3版.J.Sambrook和D.W.Russell.2001.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。
根据用于***的小量制备方案(Rapid mini-prep isolation of high quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp.D.J.O′Sullivan和T.R.Klaenhammer.1993.Appl.Environ.Microbiol.59:2730-2733)从10ml培养物中进行小规模的乳酸乳球菌和凝结芽孢杆菌质粒DNA分离。
如Sambrook和Russell所描述的(Molecular Cloning,a laboratory manual.第3版.J.Sambrook和D.W.Russell.2001.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York),使用氯化钙来制备大肠杆菌感受态细胞,并通过热休克进行转化。
如Holo和Nes所描述的(High-freguency transformation by electroporation of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media.1989.Holo,H.和I.F.Nes.Appl.Environ.Microbiol.55:3119-3123),通过电穿孔来转化乳酸乳球菌。
根据制造商的说明书,使用高保真Pwo聚合酶(Roche)来进行用于克隆目的的PCR反应。
菌落-PCR分析用于证明pNW33N在氯霉素抗性菌落中的存在。设计用于鉴定pNW33N复制基因repB的PCR引物,其序列为5′-TCGCCTTCTTCTGTGTCATC-3′和5′-CTGGAGGAGAGCAATGAAAC-3′。用牙签挑取菌落,并将少量的细胞材料转移到0.5mL PCR反应管中。通过在微波炉中于1000W温育1分钟来破裂细胞。如制造商所推荐的来制备具有rTaq聚合酶(Amersham Biosciences)和0.5μg每种引物的50μL PCR反应混合物,并添加到具有破裂的细胞的反应管中。在RoboCycler(Stratagene)中进行PCR反应。于94℃温育4分钟,随后进行25个循环的94℃30秒变性、58℃1分钟引物退火和72℃1分钟延长。在最后一个循环后,于72℃将反应混合物另外再温育5分钟。
电穿孔
电感受细胞的制备需要确定正确的培养条件、收获的时机以及洗涤和电穿孔缓冲液的组成。尽管凝结芽孢杆菌DSM 1能够在LB液体培养基上生长,但开发的BC液体培养基提高了电穿孔效率。添加甘氨酸以削弱细胞壁,并对浓度进行优化。甘氨酸的浓度为0.5-2.0%,并且优选地为1.0-1.5%。为了最佳结果,在对数中期初期收获细胞。电穿孔缓冲液的pH为4.3-6.0,并且优选地为4.3-5.0。还需要确定最优的电穿孔设置(电压、电阻、电容)。电压优选地为1.0-2.5kV,并且更优选地为1.25-2.0kV。电阻优选地为100-800Ω,并且更优选地为200-600Ω。在涂布在选择培养基上之前的恢复是重要的,并且至少是2小时,优选地是3小时。
如下制备凝结芽孢杆菌的电感受细胞。将过夜培养物用于接种(5%体积/体积)50ml补充有1%甘氨酸的培养基(产生大约0.13-0.14的在600nm处的浊度)。在45℃需氧温育2.5小时后,通过离心收获细胞。分别用50mL和25mL冰冷的电穿孔缓冲液(5mM KH2PO4、0.4M山梨醇、10%甘油、4mM MgCl2,并调整到pH4.5)洗涤细胞粒状沉淀2次,并重重悬于1mL冰冷的电穿孔缓冲液中。为了电穿孔,将100μl细胞悬浮液与1μg质粒DNA混合并转移到在冰上预冷的0.2cm电穿孔池(electroporation cuvet)(Bio-Rad)中。使用Gene Pulser和Pulse Controller设备(Bio-Rad)于200Ω和25μF使该样品经历1.6kV脉冲。电穿孔后立即加入1mL培养基,并且在Thermomixer(Eppendorf)中于45℃在900rpm下温育3小时,随后将它们涂布在补充有氯霉素的平板上。将这些平板在需氧条件下于45℃温育1-2天。
接合
将滤膜交配法(filter mating)用于重组质粒从大肠杆菌至凝结芽孢杆菌的接合转移。汇集供体(2mL)和接受者(2mL)的对数生长期细胞,并使用注射器收获在处于塑料滤膜固定器(Schleiger &Schuell)中的经灭菌的0.45μm醋酸纤维素滤膜(Schleiger &Schuell)上。用10mL的BC-液体培养基洗涤细胞,并通过强迫空气经过滤膜来干燥滤膜。将滤膜置于无抗生素的BC-平板的表面上,并于45℃温育过夜。在交配后,将细胞从滤膜上重悬浮于BC-液体培养基中,并将稀释系列涂布在含有7mg/L氯霉素的BC-平板上,并于55℃需氧温育1-2天。
酶分析
在指数生长期培养物中测定使用凝结芽孢杆菌启动子的在凝结芽孢杆菌中酶的过量产生。通过离心收获细胞。使用FastPrep FP120仪器(Qbiogene)以2轮(每轮于速度4进行30秒)来制备无细胞提取物。在每轮之间,将细胞在冰上冷却1分钟。使用牛血清白蛋白作为标准,通过Bradford的方法(Bio-Rad)来测定蛋白质含量。如Sambrook和Russell所描述的(Molecular Cloning,a laboratory manual.第3版.J.Sambrook和D.W.Russell.2001.Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York),使用Protean II电泳***(Bio-Rad)来进行SDS-PAGE(12.5%)。
在340nm处通过分光光度法测定R-乳酸脱氢酶比活性,并且使用1ml含有0.3M甘氨酰甘氨酸缓冲液pH10、0.25%(v/v)TritonX-100、5mM NAD和1%R-乳酸的测定法混合物于50℃进行。通过添加40或50μl无细胞提取物来起始反应。将比活性表示为ΔA·分钟-1·mg-1,其中ΔA是对于1cm路径长度和mg蛋白质量而言在340nm处的吸光度的增加。
发酵
在生物反应器(7 L Applikon)中,用没有Bis-Tris缓冲剂并补充有30g/L葡萄糖的4L BC液体培养基来进行分批发酵。将从甘油储液接种的并在50℃下生长的过夜需氧培养物(40mL)转移到360mL新鲜BC液体培养基中,并再温育4-5小时。该400mL用于接种生物反应器。通过自动添加20%(w/v)的石灰溶液来维持pH。在54℃、pH6.5和250-300rpm的搅动速度下进行发酵。利用水浴(Lauda)来控制温度,同时通过ADI 1020 Bio-Processor(Applikon)来读取/控制pH。通过在线数据获取(Applikon FM V5.0)来处理所有的数据(pH和碱消耗)。在接种前和发酵结束时抽取样品以用于测量R-和S-乳酸以及可能的副产物。离心样品,并使用Millex GP 0.22μmfilter(Millipore)通过过滤来去除残留的碎片。将滤液保存在-21℃直至进一步的分析。
使用衍生化和GLC来测量有机酸(乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸)。将R-和S-乳酸甲基化成乳酸甲酯,并通过在手性柱上的顶空分析来进行测量。
结果
实施例1.使用天然感受态细胞,用质粒pNW33N转化凝结芽孢杆菌
1)凝结芽孢杆菌DSM 1的感受态细胞的制备
在3个独立的实验中使用如下操作程序。在需氧条件下于45℃在5ml BC-液体培养基中过夜培养凝结芽孢杆菌DSM 1。该培养物用于接种25ml预热的C-液体培养基,导致得到0.15的在600nm处的浊度。于45℃需氧温育该新鲜培养物直至在600nm处的浊度达到0.9-1.2(表1)。
2)用pNW33N转化凝结芽孢杆菌DSM 1
使所述感受态细胞的0.5mL部分形成粒状沉淀,并将此粒状沉淀重悬于0.1mL的T-液体培养基中,并与5μg的pNW33N质粒DNA混合。在Thermomixer(Eppendorf)中以900rpm于45℃温育1.5小时后,添加0.3mL预热的BC液体培养基,并继续温育2小时,其后将细胞涂布在补充有7mg/L氯霉素的BC平板上。将平板在45℃下需氧温育。温育3天后出现菌落(表1)。
表1.凝结芽孢杆菌DSM 1的天然转化
3)从凝结芽孢杆菌DSM 1中分离质粒
将菌落划线到补充有7mg/L氯霉素的新鲜BC平板上,以用于在45℃下过夜温育。使用菌落PCR来检测来自质粒pNW33N的repB基因的存在。所有的PCR反应产生预期大小的产物。将每个实验中的一个菌落转移到BC-液体培养基中以用于O/N温育以及小量制备质粒的分离。尽管琼脂糖凝胶电泳不能显现任何质粒DNA,但用此小量制备DNA转化大肠杆菌DH5α导致产生可从中回收pNW33N的转化体。用EcoRI-StuI消化质粒DNA以确证pNW33N的完整性。限制性模式如预期的一样(图1),这证明质粒pNW33N被转化到凝结芽孢杆菌DSM 1中。
实施例2.使用电穿孔,用质粒pNW33N转化凝结芽孢杆菌
通过电穿孔用1μg质粒pNW33N常规地转化凝结芽孢杆菌DSM 1。通常,在45℃下温育1天后,在含有氯霉素的平板上出现超过20个的菌落。在一个实验中,在2天的温育后将15个菌落转移到新鲜的含有氯霉素的平板上。在45℃下温育24小时后,使用repB-特异性引物通过菌落-PCR分析来确证转化。对于所有测试的转化体,获得预期大小的PCR产物,这证明存在pNW33N的repB基因。凝结芽孢杆菌DSM 1用作阴性对照并且未得到PCR产物。从氯化铯梯度中分离单个转化体的质粒DNA。用EcoRI以及用EcoRI-StuI消化质粒DNA以确证pNW33N的完整性。限制性模式如预期的一样(333-bp和3884-bp片段),这证明质粒pNW33N被转化到凝结芽孢杆菌DSM 1中。
实施例3.使用接合,用质粒pNW33N转化凝结芽孢杆菌
1)含有转移起点的pNW33N-衍生物的构建
将IncP质粒RK2的转移起点(oriT)克隆到pNW33N中。这允许通过共存于大肠杆菌供体中的任何可自我转移的IncP质粒来进行的有效共移动(comobilization)(Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria.Trieu-Cuot,P.,Carlier,C.,Martin,P.和Courvalin,P.1987.FEMS Microbiol.Lett.48:289-294)。将RK2 oriT区域作为来自pATΔS28的平端0.5-kb AccI-AvaII片段克隆到用SmaI消化的pNW33N中。将所得到的质粒pJS28(图2)转化到具有pRK24的大肠杆菌HB101中。该菌株在与凝结芽孢杆菌DSM 1的平板交配法(plate matings)中用作供体。
2)pJS28从大肠杆菌至凝结芽孢杆菌的接合转移
将于37℃在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB中需氧生长的具有pJS28和pRK24的大肠杆菌过夜培养物以1/50转移到含有抗生素的新鲜LB液体培养基中,并培养到在600nm处的浊度为0.56。将于45℃在BC液体培养基中需氧生长的凝结芽孢杆菌DSM 1过夜培养物以1/50转移到新鲜BC液体培养基中,并培养到在600nm处的浊度为0.52。将等体积(2mL)的大肠杆菌和凝结芽孢杆菌收获到0.45μm滤膜上。将包含细胞的滤膜转移到没有抗生素的BC平板上并于45℃温育过夜。从滤膜上去除细胞,并且将稀释系列涂布在BC平板上,和于55℃需氧温育。1-2天后出现菌落。通过质粒DNA分离来确证pJS28的存在,并通过用NcoI消化得到预期的消化模式(1444-bp和3299-bp片段)来确证完整性。接合效率为大约9.310-7/接受者。
实施例4.衍生自凝结芽孢杆菌的表达***的构建
1)凝结芽孢杆菌表达***的构建
作为合成的DNA片段(图3)来产生具有启动子活性的凝结芽孢杆菌ATCC 23498核苷酸序列片段(公开在US 5171673中),并将其作为BglII-BamHI片段克隆到用相同酶消化的pMH3中。所得到的克隆载体pJS25(图3)允许通过使用与起始密码子重叠的NcoI位点而与该启动子的翻译融合。为了使得能够使用该NcoI位点,通过使用大引物(megaprimer)从cat基因中去除NcoI位点而从质粒pNZ124构建了第一质粒pMH3。序列为5′-CTATTATTCCGTGGACTTC-3′和5′-CAGCTGAGATCTTGGAG-3′的引物用于产生大引物,其与序列为5′-GACGAAAGTCGACGGCAATAGTTAC-3′的引物组合用于第二PCR反应。所得到的PCR产物包括完整的cat基因,并用BglII-SalI消化以替代pNZ124 cat基因,从而产生质粒pMH3。pJS25(图4)可用在各种嗜温的革兰氏阳性生物,包括枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和乳明串珠菌(Leuconostoc lactis),以及革兰氏阴性生物大肠杆菌中(Use of the Escherichia coli β-glucuronidase (gusA)gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria.C.Platteeuw,G.Simons和W.M.de Vos.1994.Appl.Environ.Microbiol.60:587-593)。
2)1dhA过表达***的构建
使用序列为5′-GACAATTCATGACTAAAATTTTTGC-3′和5′-GGATTTCTCTAGACTGCAGTTAGCCAACCTTAA-3′的引物,通过PCR产生编码R-乳酸脱氢酶并由Bernard等人公开的(Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus by complementation in Escherichia coli.1991.Bernard,N.,T.Ferra in,D.Garmyn,P.Hols和J.Delcour.FEBSLett.290:61-64)保加利亚乳杆菌LMG 6901 1dhA基因。将PCR产物作为平端-XbaI片段克隆到用XbaI-SmaI消化的pUC18中,并通过核苷酸序列分析来确证其完整性。随后,将1dhA基因作为RcaI-XbaI片段克隆到用NcoI-XbaI消化的pJS25中。所得到的表达载体pJS26(图5)具有与凝结芽孢杆菌启动子在翻译上融合的保加利亚乳杆菌的1dhA基因。随后,将包含凝结芽孢杆菌启动子和德氏乳杆菌1dhA基因的完整片段作为PstI-BglII片段(通过用BglII的部分消化)转移到用PstI-BamHI消化的嗜热克隆载体pNW33N中,从而产生质粒pJS27(图6)。
3)R-乳酸脱氢酶的过量产生
通过电穿孔将质粒pJS27转化到凝结芽孢杆菌DSM 1中。将R-乳酸脱氢酶比活性测定为在50℃下每mg蛋白质每分钟在340nm处的吸光度的降低。具有pNW33N的凝结芽孢杆菌DSM 1的比活性为0.45ΔA分钟-1mg蛋白质-1,和具有pJS27的凝结芽孢杆菌DSM 1的比活性为2.15ΔA分钟-1mg蛋白质-1,这证明在包含德氏乳杆菌LMG 6901 1dhA基因的经修饰的菌株中R-乳酸脱氢酶的过量产生导致4.8倍的活性升高。
实施例5.用于R-乳酸生产的凝结芽孢杆菌DSM 1的遗传修饰
具有pJS27(实施例4)的凝结芽孢杆菌DSM 1在模拟工业条件的分批培养中进行生长。具有pNW33N的凝结芽孢杆菌DSM 1和没有质粒的凝结芽孢杆菌DSM 1用作参照菌株。在发酵后,测定有机酸的浓度和乳酸的光学纯度(表2)。由凝结芽孢杆菌DSM 1和具有pNW33N的凝结芽孢杆菌DSM 1产生的乳酸以S-形式是对映纯的(enantiopure),而由具有pJS27的凝结芽孢杆菌DSM 1产生的乳酸的相当部分是R-形式。没有检测到副产物形成方面的差异。2-羟基丁酸、乙酸、丁酸、甲酸、丙酮酸的浓度低于检测极限(对于丙酮酸<0.02%;对于其他<0.01%)。琥珀酸的浓度低于0.1%(v/v)。这些结果证明,可通过引入R-乳酸脱氢酶基因来实现通过凝结芽孢杆菌的R-乳酸生产。只产生R-乳酸的凝结芽孢杆菌菌株的构建需要通过随机或定点诱变来破坏负责S-乳酸脱氢酶活性的基因。
表2.从50g/L蔗糖的有机酸生产(重复发酵)
实施例6.在用于对映纯的R-乳酸生产的凝结芽孢杆菌DSM 1中的基因替换
1)整合质粒的构建
通过将编码主要S-乳酸脱氢酶活性的凝结芽孢杆菌1dhL基因替换为编码R-乳酸脱氢酶的保加利亚乳杆菌1dhA基因,来构建产R-乳酸的经修饰的凝结芽孢杆菌菌株。使用条件克隆载体(例如在45℃下具有功能而在55℃下不具有功能的热敏感型复制子),在2步操作过程中通过同源重组来完成该替换。我们使用在pNZ124或pMH 3中存在的pSH71复制子,其被发现在兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种中具有这样的热敏感性质。整合载体pRK1(图7)包含pNZ124复制子,2个在凝结芽孢杆菌DSM 1染色体中位于1dhL侧翼并且现在位于与保加利亚乳杆菌1dhA基因融合的凝结芽孢杆菌ATCC 23498amy启动子侧翼的1-kb区域,以及编码氯霉素抗性的cat基因。通过下述盒的连接来构建该整合载体:(i)1.8-kb SalI-XbaI片段,其具有制成平端的SalI位点,包含pNZ124复制子;(ii)1.1-kb XbaI-BamHI片段,其包含1dhL基因的上游区域,所述片段剪切自使用引物
5′-GCGAGATCTAGAGGCCATCTGGGGGGCTTTCT-3′和
5′-CGCGGATCCATGGATAATCTTCCTCCCCATCAAAAGTA-3′以及作为模板的凝结芽孢杆菌DSM 1而产生的PCR片段;(iii)1.0-kb BamHI-PstI片段,其包含cat基因,所述片段剪切自使用引物
5′-CGCGGATCCCCTTCTTCAACTAACGGG-3′和
5′-GCGCTGCAGTTCGCTACGCTCAAATCC-3′以及作为模板的pMH3(实施例4)而产生的PCR片段;(iv)1.3-kb PstI-KpnI片段,其包含与凝结芽孢杆菌ATCC 23498 amy启动子在翻译上融合的保加利亚乳杆菌LMG6901 1dhA基因,所述片段剪切自pJS27(实施例5);(v)1.1-kbKpnI-BglII片段,其具有制成平端的BglII位点,包含1dhL基因的下游区域,所述片段剪切自使用引物
5′-CGCGGGTACCGGCCGGGCTTTATGG-3′和
5′-GCGCAGATCTGTCGAGTAAACGCGGAAAGCATTG-3′以及作为模板的凝结芽孢杆菌DSM 1而产生的PCR片段。
2)用保加利亚乳杆菌LMG 6901 1dhA基因交换凝结芽孢杆菌DSM1 1dhL基因
通过电穿孔将质粒pRK1转化到凝结芽孢杆菌DSM 1中。在于45℃生长的补充有7mg/L氯霉素的BC平板上获得转化体。在通过质粒分离确证转化之后,于45℃在BC液体培养基中培养单个菌落至对数中期,其后将温度变为55℃并继续温育1小时。将稀释系列涂布在BC平板上并于55℃温育过夜。汇集菌落,并以第二稀释系列涂布在BC平板上。于55℃过夜温育后,通过PCR分析来测试菌落的整合状况,从而确证单交换事件。选择出一个菌落以用于通过于55℃在含有抗生素的BC液体培养基中相续转移1/1000稀释液(大约10代)来进行连续培养。大约100代后,将稀释系列涂布在具有抗生素的BC平板上。于55℃过夜培养后,通过菌落PCR就1dhL基因的不存在来测试菌落系列。备选地,通过经菌落PCR就1dhL基因的不存在进行测试,可以在第一事件中的单交换突变体中筛选双交换突变体。从在这些PCR反应中呈现阴性的菌落中分离染色体DNA,并进一步就1dhA的存在进行评估,和通过Southern印记分析来确证正确的整合。
实施例7.使用经修饰的凝结芽孢杆菌DSM 1来生产对映纯的R-乳酸
1)经修饰的菌株的构建
使用实施例6中描述的方法来构建凝结芽孢杆菌DSM 1的衍生物,其中1dhL基因被盒替换,所述盒包含与来自工业凝结芽孢杆菌菌株的1dhL启动子融合的来自工业德氏乳杆菌菌株的1dhA基因以及来自pMH 3的cat基因。所得菌株被命名为RDSM 1。
2)使用RDSM 1进行的发酵
RDSM 1菌株在模拟工业条件的分批培养中进行生长。在发酵后,测定有机酸的浓度和乳酸的光学纯度(表3)。由凝结芽孢杆菌RDSM 1产生的乳酸的99.5%为R-形式。与凝结芽孢杆菌DSM 1(实施例5)相比,没有检测到副产物形成的差异。2-羟基丁酸、乙酸、丁酸、甲酸、丙酮酸的浓度低于检测极限(对于丙酮酸<0.02%;对于其他<0.01%)。琥珀酸的浓度低于0.1%(v/v)。这些结果证明,天然凝结芽孢杆菌基因的染色体删除和染色体***以及(异源)基因的功能表达是可能的,并且可应用于通过凝结芽孢杆菌来生产对映纯的R-乳酸。
表3.从50g/L蔗糖的有机酸生产(重复发酵)
Claims (12)
1.用于通过遗传改造来修饰兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的方法,所述方法包括:
将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒***中的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中,其中所述同系物包含编码具有热敏感型复制功能的多肽即RepA蛋白的DNA序列,所述多肽具有与SEQ ID NO:1至少98%相同的氨基酸序列;
于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细胞,以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞;
于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经转化的细胞,以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞;
其中所述芽孢杆菌属物种是凝结芽孢杆菌。
2.根据权利要求1的方法,其中所述芽孢杆菌属物种是在孢子形成方面具有缺陷的。
3.根据权利要求1的方法,其中所述DNA提供所需的功能性。
4.根据权利要求1的方法,其中于对于质粒复制而言的非许可温度下进行的培养允许将所述DNA引入芽孢杆菌染色体中。
5.根据权利要求4的方法,其中所述DNA通过同源重组引入芽孢杆菌染色体中。
6.根据权利要求1的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1至少99%相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法,其中通过同源重组从芽孢杆菌染色体中去除不需要的功能性。
8.根据权利要求1-6中任一项的方法,其中通过同源重组向芽孢杆菌染色体中引入所需的功能性并同时从芽孢杆菌染色体中去除不需要的功能性。
9.根据权利要求8的方法,其中通过将编码S-乳酸脱氢酶的基因替换为DNA构建体来修饰芽孢杆菌属物种,所述DNA构建体包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的DNA序列,所述DNA序列与在芽孢杆菌属物种中有功能的启动子相融合。
10.根据权利要求9的方法,其中所述启动子来自被去除的内源S-乳酸脱氢酶基因。
11.通过权利要求9或10的方法可获得的经遗传修饰的中度嗜热芽孢杆菌菌株,其是兼性厌氧且同型乳酸的,并且所述芽孢杆菌菌株是凝结芽孢杆菌菌株,其中编码S-乳酸脱氢酶的l dhL基因被编码具有R-乳酸脱氢酶活性的NADH依赖性2-羟酸脱氢酶的基因所取代。
12.用于制备R-乳酸和/或R-乳酸盐的方法,其中使用权利要求11的经遗传修饰的兼性厌氧的中度嗜热芽孢杆菌菌株。
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