JP2008220320A - 細胞培養支持体とその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、温度応答性ポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体の製造方法であって、放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるプレポリマーと、有機溶媒とを含む組成物を、前記温度応答性ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含む表面を備えた基材に塗布して、前記基材の表面上に塗膜を形成する塗布工程と、前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記温度応答性ポリマーとの結合反応を進行させる放射線照射工程と、前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含む前記方法に関する。
【選択図】なし
Description
(1)温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体の製造方法であって、放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーと、有機溶媒とを含む組成物を、前記ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含む表面を備えた基材に塗布して、前記基材の表面上に塗膜を形成する塗布工程と、前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記ポリマーとの結合反応を進行させる放射線照射工程と、前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含む前記方法。
(2)前記ポリマーが温度応答性ポリマーである、(1)記載の方法。
(3)温度応答性ポリマーがアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーである、(2)記載の方法。
(4)アクリル系ポリマーがポリ−N−イソプロピルアクリルアミドである、(3)記載の方法。
(5)前記組成物が5×10−3Pa・s〜10Pa・sの粘度を有する組成物である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量が3,000以上である、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記モノマーと、前記オリゴマー又はプレポリマーとの重量比が500:1〜1:20である、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)放射線照射工程が1回の放射線照射により行われる、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)放射線がγ線又は電子線である、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)放射線が5Mrad〜50Mradの線量の電子線であるか、あるいは0.5Mrad〜5Mradの線量のγ線である、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)乾燥工程が放射線照射工程の前に行われる、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)基材の形状がフィルム形状である、(1)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)基材が、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、アクリル系樹脂、ポリアミド、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、及びポリシリコンを含有するシリコンゴムからなる群から選択される少なくとも1種の材料からなる、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、及び表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂からなる群から選択される少なくとも1種の材料からなる、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(15)合成樹脂がナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも1種の材料である、(14)記載の方法。
(16)(1)〜(15)のいずれかに記載の方法により製造された、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体。
(17)細胞培養支持体の表面に固定化された前記ポリマーの層の乾燥時の厚さが0.001〜10μmである、(16)記載の細胞培養支持体。
(18)(16)又は(17)記載の細胞培養支持体上で細胞培養する工程を含む、細胞シートの作製方法。
(19)(18)記載の方法により作製された細胞シート。
本発明は、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーが共有結合により表面に固定化(すなわちグラフト化)された細胞培養支持体の製造方法に関する。
本発明の方法には、放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーと、有機溶媒とを含む塗布用組成物を用いる。この塗布用組成物はオリゴマー又はプレポリマーを含むことから、有機溶媒が少量の場合にも結晶化しにくい。このため、この塗布用組成物を基材表面に塗布し、放射線照射により重合を進行させると、基材表面の全面に亘り均一なポリマー層を形成することができる。
塗布用組成物が塗布される基材は、その表面が、前記応答性ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含むものである限り特に限定されない。表面のみが、前記応答性ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面または中間層に本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、支持体表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。
本発明の方法は、前記塗布用組成物を、前記基材の表面に塗布してその表面上に塗膜を形成する塗布工程を含む。
大面積への塗布方法としてはブレードコーティング法、グラビアコーティング法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。
本発明の方法は、前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記ポリマーとの結合反応(すなわちグラフト化)を進行させる放射線照射工程を含む。ここでいう結合反応(グラフト化)は、放射線照射による重合によってモノマー又はオリゴマーもしくはプレポリマーからin situで形成された遊離のポリマーが基材表面に結合する現象だけでなく、遊離のモノマーが基材表面に結合した後に当該モノマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象や、塗布用組成物に由来する遊離のプレポリマー又はオリゴマーが基材表面に結合する現象や、基材表面に結合したポリマー又はオリゴマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象などを包含する。
本発明の方法は、前記塗膜を乾燥させて塗布用組成物に由来する有機溶媒を除去する乾燥工程を含む。
上述の各工程を経て形成された細胞培養支持体のポリマー層には、基材表面上に共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応のモノマー又はオリゴマー分子等が存在している。そこでこれらの遊離ポリマー或いは未反応物を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。
本発明はまた、本発明の方法により製造された細胞培養支持体に関する。本発明の細胞培養支持体は、原料モノマー/溶媒混合物を塗布用組成物として用いる従来法により製造された細胞培養支持体と比較してより均一なグラフトポリマー層を有することを特徴とする。
本発明の細胞培養支持体を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ES細胞等から細胞シートを作製することができる。こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。
以下の分子量のポリイソプロピルアクリルアミドは市販のものを購入した。
500mLセパラブルフラスコの中にN-イソプロピルアクリルアミド17.8gと純水150mLを投入し、攪拌下、溶解・分散した。窒素ガス気流下、室温で過硫酸アンモニューム0.24g、N,N,N',N',-テトラメチルエチレンジアミン0.30mLを加えて重合を開始させた。重合終了後、加温してゲルを取り出し、100℃の電気乾燥器中で乾燥した。乾燥したゲルを粉砕して、NMP溶媒でGPC分析したところ、市販の1、2および4比較で分子量約35〜40万であった。
n-ブチルメルカプタンを連鎖移動剤とした低分子量のポリイソプロピルアクリルアミドおよびイソプロピルアクリルアミドオリゴマーは非特許文献3のトレースによって合成した。ポリマー合成:1Lセパラブルフラスコの中にN-イソプロピルアクリルアミド11.3gとベンゼン300mLを投入し、攪拌下、溶解・分散した。窒素ガス気流下、(a)4.31mLのn-ブチルメルカプタンおよび(b)40mLの0.1Mn-ブチルメルカプタンベンゼン溶液を加えたものを各々作製し、総量が400mLになるように1.2gの過酸化ベンゾイルをベンゼンで溶かしたものを加え重合開始した。反応終了後、冷水抽出したものをファルマシア社のセファデックスG−25ゲルでろ過し、n-ブチルメルカプタンを除去、ポリマー分画のみを凍結乾燥して合成ポリマーを得た。脱硫は非特許文献4にも記載のあるレニーニッケル触媒を用いて行った。(a)条件から得たポリマーを5分子(分子量650)、(b)条件から得たポリマーを28分子(分子量3300)として以下の実験を実施した。
(試験1)
実施例1〜8として、BD社1008ペトリディッシュに表1の市販ポリイソプロピルアクリルアミド1〜5(実施例1〜5)、レドックス合成ポリイソプロピルアクリルアミド(実施例6)、連鎖移動剤使用の合成ポリイソプロピルアクリルアミド(a)(実施例7)、あるいは同(b)(実施例8)がそれぞれ1wt%、イソプロピルアクリルアミドモノマーが40wt%になるようイソプロピルアルコールに溶解した液を室温25℃、湿度60%で0.1mLづつ添加した。比較例1として実施例のポリマーを含まない40wt%イソプロピルアクリルアミドモノマーのイソプロピルアルコール溶液を同様に添加したディッシュを作製した。この溶液を一時間放置したところ、表2に示すように比較例1では結晶が析出し、実施例1〜6および8では結晶は析出しなかった。実施例7では結晶が析出する場合としない場合があり、顕微鏡で観察すると微小な結晶が観察された。次にこの溶液の添加量を0.03mLとし、デッシュを水平に静置して添加すると5秒以内にディッシュ底面は溶液で被覆されるが、10分経過で比較例1では表2のように結晶が析出した。実施例1〜6および8では同様に結晶は析出しなかった。実施例7でも同様に結晶が析出する場合としない場合があり、顕微鏡で観察すると微小な結晶が観察された。
次に実施例1〜6について同様の溶液を作製し、130μm厚の二軸延伸ポリスチレンシート(OPS/防曇品として普及しているため、事前にエタノールで防曇剤は除去・乾燥した)にワイヤーバー4番手で約5g/m2の塗工厚で塗工し、ドライヤー乾燥および40℃、1×102Pa、1分の減圧乾燥で乾燥面質を確認した。ドライヤー乾燥においては表3のように実施例1〜6の全ての塗工膜の面質は透明平滑で微結晶も析出しなかった。比較例1は結晶白化して一部平滑性も壊れていた。40℃、1×102Pa、1分の減圧乾燥においては、実施例1〜6の全てで塗工膜の面質は透明平滑であったが、実施例1のみ微結晶を観察した。比較例1では結晶白化してシートからほとんど浮いた状態であった。 実施例1のポリマー量を0.5%に下げた場合および2%、5%に上げた場合、微結晶の析出頻度はポリマー添加量に反比例した。
次に実施例1〜8および比較例1の溶液0.1mLおよび0.03mLをペトリディッシュに被覆したものに電子線を2回に分けて照射した。照射量を初回5Mrad、2回目25Mradとした。電子線照射後、5℃のイオン交換水を用いて、ペトリディッシュを洗浄し、残留モノマーおよびペトリディッシュ表面に結合していないポリマーを取り除いた。クリーンベンチ内で乾燥させ、さらにエチレンオキサイド(EO)ガス滅菌を行い、さらに十分に脱気を行うことにより、最終的な製品である細胞培養支持体を得た。このものの被覆面の平滑性を光学顕微鏡下で表面に凹凸の有無を調べることにより検討した。結果を表4に示す。ウシ大動脈血管内皮細胞の培養は、得られた細胞培養支持体材料上にて、ウシ胎児血清(FCS)を10%含むダルベッコー改変イーグル培地(DMEM)を培養として、5%二酸化炭素中、37℃で行なった。十分に細胞が増殖したのを確認した後、培養液を支持体ごと20℃、5%CO2下のチャンバー内に移し、30分間放置して、付着/増殖細胞を剥離させ、増殖細胞剥離回収率を下式に従って求めた。結果を表4に示す。
増殖細胞剥離回収率(%)=100×剥離回収した細胞総数/増殖させた細胞総数
その際、剥離回収した細胞総数および、増殖させた細胞総数を計測するためには、細胞を個々の状態にしなければならない。従って、剥離回収した細胞総数の測定は、20℃に冷却、放置した後、回収した細胞塊に対し、トリプシン−EDTA処理を行ない細胞を個々の状態にして行なった。また増殖させた細胞総数は、上記方法で剥離回収した細胞総数に、20℃に冷却、放置しても剥離しなかった細胞をトリプシン−EDTA処理にて、個々の状態に剥離させた細胞総数を加え合わせることにより求めた。また、37℃のチャンバー内で5日間培養し、ディッシュ周囲以外全体がコンフレントになった細胞シート状塊についても、メスでディッシュ周囲のサブコンフレント状態の細胞層に切れ目を入れて、培養液を支持体ごと20℃、5%CO2下のチャンバー内に移し、細胞シートの剥離を観察した。
延伸ポリエチレンOPS上に実施例1〜6および比較例1と同様に作製した溶液をワイヤーバー塗工し、ドライヤー乾燥した塗工面に電子線を照射したものをペトリディッシュに被覆したもの同様に洗浄・乾燥し、ペトリディッシュ底面に両面テープで貼付した後、引き続き同様にEOG滅菌をして細胞培養支持体を得た。
実施例2および6について、ポリマー含有量を0.5wt%、2wt%、5wt%にして40wt%のモノマーを含むイソプロピルアルコール組成物を各1Kg調整し、粘着剤が塗工されて剥離フィルムで保護された易接着PETのロール形状の連続ベースフィルムにグラビアダイレクトロールのベタ48線で9mg/m2の塗工量を毎分5m塗工し、連続の1m、45℃の熱風乾燥機で乾燥し、連続の電子線照射ユニットで酸素濃度50ppm以下の環境で電子線照射した。電子線の電子流量を変化させて照射量を10、12、16、20、24Mradにした。各条件で作製した塗工フィルムを洗浄・乾燥し、ディッシュサイズに切り抜いたものを粘着剤でディッシュに固定してEOG滅菌して細胞培養支持体を得た。
実施例9として上記実施例2の連続塗工・乾燥・電子線照射工程の連続塗工フィルム作製時に電子線を照射しない状態のサンプルを作製した。このフィルムにコバルト60からのγ線を室温、1.5Mradを2時間で照射した。これを上記同様に洗浄・乾燥して、切り抜き・貼付したディッシュをEOG滅菌して細胞培養支持体を得た。作製した細胞培養支持体は全て平滑透明な表面で細胞回収、細胞シート剥離は良好であった。
実施例10〜16として表6のベースフィルム上に実施例2の組成物をワイヤーバー(番手4)コートし、ドライヤー乾燥後、塗工面に電子線を照射したものをペトリディッシュに被覆したもの同様に洗浄・乾燥した。電子線照射量は10Mrad、15Mradおよび25Mradの3通りで1回照射のみで行った。ポリスチレンフィルムは25Mradの照射で基材が70℃になり、実施例1〜6の時同様、多少の歪を生じた。PETとポリイミドも基材が70℃になったが、基材の耐熱性があり、歪は見られなかった。ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレンは基材温度が上がらず、歪は見られなかった。洗浄・乾燥したフィルムを円形に切り、塗工裏面とペトリディッシュの底を両面テープで貼り合せた。これをEOG滅菌をして細胞培養支持体を得た。実施例12の自調製フィルムは、実施例11のフィルムに表7の組成物をワイヤーバー(番手4)コートし、高圧水銀灯を用いて、170mJ/cm2(365nm)の条件で紫外線照射してコート面を硬化させた。この硬化コート面を他フィルムと同様に用いた。比較例2のポリスチレンフィルムは、事前にエタノールで防曇剤を除去・乾燥して用いた。
Claims (19)
- 温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体の製造方法であって、放射線照射により重合して前記ポリマーを形成し得るモノマーと、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーと、有機溶媒とを含む組成物を、前記ポリマーと放射線照射により共有結合し得る材料を含む表面を備えた基材に塗布して、前記基材の表面上に塗膜を形成する塗布工程と、前記塗膜に放射線を照射して、重合反応及び基材表面と前記ポリマーとの結合反応を進行させる放射線照射工程と、前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含む前記方法。
- 前記ポリマーが温度応答性ポリマーである、請求項1記載の方法。
- 温度応答性ポリマーがアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーである、請求項2記載の方法。
- アクリル系ポリマーがポリ−N−イソプロピルアクリルアミドである、請求項3記載の方法。
- 前記組成物が5×10−3Pa・s〜10Pa・sの粘度を有する組成物である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記オリゴマー又はプレポリマーの分子量が3,000以上である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記モノマーと、前記オリゴマー又はプレポリマーとの重量比が500:1〜1:20である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 放射線照射工程が1回の放射線照射により行われる、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 放射線がγ線又は電子線である、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 放射線が5Mrad〜50Mradの線量の電子線であるか、あるいは0.5Mrad〜5Mradの線量のγ線である、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 乾燥工程が放射線照射工程の前に行われる、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 基材の形状がフィルム形状である、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
- 基材が、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、アクリル系樹脂、ポリアミド、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、及びポリシリコンを含有するシリコンゴムからなる群から選択される少なくとも1種の材料からなる、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、及び表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂からなる群から選択される少なくとも1種の材料からなる、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 合成樹脂がナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも1種の材料である、請求項14記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載の方法により製造された、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーが共有結合により表面に固定化された細胞培養支持体。
- 細胞培養支持体の表面に固定化された前記ポリマーの層の乾燥時の厚さが0.001〜10μmである、請求項16記載の細胞培養支持体。
- 請求項16又は17記載の細胞培養支持体上で細胞培養する工程を含む、細胞シートの作製方法。
- 請求項18記載の方法により作製された細胞シート。
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