JP5080848B2 - 細胞培養支持体とその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は上記問題点を解消した細胞培養支持体を提供することを目的とする。
(1)温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種の環境応答性ポリマーが共有結合により表面に固定化された基材を備える細胞培養支持体の製造方法であって、放射線照射により重合して前記環境応答性ポリマーを形成し得るモノマーと有機溶媒とを含む組成物を、放射線照射により前記環境応答性ポリマーと共有結合し得る表面を備えた基材に塗布して、前記基材の表面上に塗膜を形成する塗布工程と、前記塗膜に放射線を照射して、前記環境応答性ポリマーを形成する重合反応及び前記環境応答性ポリマーと基材表面とを結合させる結合反応を進行させる放射線照射工程と、前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含み、前記基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂、表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム、及び微多孔質のポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種の材料を含むものである、前記方法。
(6)(4)又は(5)記載の細胞培養支持体上で細胞培養する工程を含む、細胞シートの作製方法。
(7)(6)記載の方法により作製された細胞シート。
本発明において塗布用組成物が塗布される基材は、放射線照射により温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種の環境応答性ポリマーと共有結合し得る表面を備えた基材であって、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂、表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂、共役結合を持つ天然ゴム、共共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム、及び微多孔質ポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種の材料を含むものである。基材は、細胞を培養させて細胞シートを形成可能な面(細胞接着面)を少なくとも一つ備え、少なくとも該細胞接着面が前記材料により形成されていればよい。もちろん、基材全体が前記材料により構成されていてもよい。基材の形状としては、ディッシュ形状や、フィルム形状などが挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面に環境応答性ポリマーのグラフトポリマー層を形成した後、細胞培養に適した形状(例えばディッシュ形状)に加工することができる。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組み合わせて使用することもできる。ディッシュ形状基材を用いる場合、少なくとも細胞接着面となるディッシュ内底面部分がグラフトポリマー層により被覆されればよい。
本発明は、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種の環境応答性ポリマーが共有結合により表面に固定化(すなわちグラフト化)された基材を備える細胞培養支持体の製造方法に関する。
本発明の方法には、放射線照射により重合して前記環境応答性ポリマーを形成し得るモノマーと有機溶媒とを含む塗布用組成物を用いる。該塗布用組成物には更に、前記モノマーが重合してなるオリゴマー又はプレポリマーを混合して用いることが好ましい。オリゴマー又はプレポリマーを含む塗布用組成物を用いることにより、有機溶媒が少量の場合にも結晶化が抑制される。このため、この塗布用組成物を基材表面に塗布し、放射線照射により重合を進行させると、基材表面の全面に亘り均一な環境応答性ポリマー層を形成することができる。
塗布用組成物がオリゴマー又はプレポリマーを含有するものである場合、該組成物中のオリゴマー又はプレポリマーの含有量は0.1〜20重量%であることが好ましい。該組成物中に含まれるモノマーと、オリゴマー又はプレポリマーとの重量比は500:1〜1:20であることが好ましい。
塗布用組成物の粘度は5×10−3Pa・s〜10Pa・sであることが好ましい。
本発明の方法は、前記塗布用組成物を、前記基材の表面に塗布してその表面上に塗膜を形成する塗布工程を含む。
本発明の方法は、前記塗膜に放射線を照射して、前記環境応答性ポリマーを形成する重合反応及び前記環境応答性ポリマーと基材表面とを結合させる結合反応(すなわちグラフト化)を進行させる放射線照射工程を含む。ここでいう結合反応(グラフト化)は、放射線照射による重合によってモノマー又はオリゴマーもしくはプレポリマーからin situで形成された遊離のポリマーが基材表面に結合する現象だけでなく、遊離のモノマーが基材表面に結合した後に当該モノマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象や、塗布用組成物に由来する遊離のプレポリマー又はオリゴマーが基材表面に結合する現象や、基材表面に結合したポリマー又はオリゴマーを基点としてポリマー鎖が伸張する現象などを包含する。
本発明の方法は、前記塗膜を乾燥させて塗布用組成物に由来する有機溶媒を除去する乾燥工程を含む。
上述の各工程を経て形成された細胞培養支持体の環境応答性ポリマー層には、基材表面上に共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応のモノマー分子が存在している。また、塗布用組成物がオリゴマー又はプレポリマー分子を含有するものを使用した場合は更に未反応のオリゴマー分子又はプレポリマー分子等が存在していることがある。そこでこれらの遊離ポリマー或いは未反応物を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。
本発明はまた、本発明の方法により製造された細胞培養支持体に関する。本発明の細胞培養支持体は、前記環境応答性ポリマーが共有結合により表面に固定化された、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂、表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム、及び微多孔質ポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種の材料を含む基材を備える。
本発明の細胞培養支持体を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ES細胞等から細胞シートを作製することができる。こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。
温度応答性ポリマーのプレポリマーとして2種類を試験した。
アルドリッチ社から市販されている分子量20000〜25000のポリイソプロピルアクリルアミド(アルドリッチ社品番535311)をプレポリマー1として以下の実験で用いた。
本試験例では、上記試験1における塗布用組成物1、2又は3を用いた連続塗工フィルム作製時に電子線を照射しない状態のサンプルを作製した。このフィルムにコバルト60からのγ線を室温、1.5Mradを2時間で照射した。これを試験1記載の手順と同様に洗浄・乾燥して、切り抜き・貼付したディッシュをEOG滅菌して細胞培養支持体を得た。作製した細胞培養支持体は全て平滑透明な表面で細胞回収、細胞シート剥離は良好であった。
実施例1〜14として、表1に示す各ベースフィルム上に、試験1記載のプレポリマー1が1wt%、イソプロピルアクリルアミドモノマーが40wt%になるようイソプロピルアルコールに溶解した液(塗布用組成物7)をワイヤーバー(番手4)コートし、ドライヤー乾燥後、塗工面に電子線を照射したものを試験1と同様の手順で洗浄・乾燥した。電子線照射量は10Mrad、15Mrad及び25Mradの3通りで1回照射のみで行った。洗浄・乾燥後の塗工フィルムを円形に切り、塗工裏面とペトリディッシュの内底面を両面テープで貼り合せた。これにEOG滅菌を施して細胞培養支持体を得た。得られた細胞培養支持体を用いて試験1と同様の手順でウシ大動脈血管内皮細胞の培養を行い、細胞シートを作製した。そして試験1と同様の手順で細胞の回収率の測定と細胞シート剥離の観察を行った。
本試験では、試験3で用いたプラズマ処理を施した微多孔質フィルム(実施例6〜11)の表面に温度応答性ポリマーを結合させて得られる基板の培養液の透過性を検討した。
Claims (8)
- 温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種の環境応答性ポリマーが共有結合により表面に固定化された基材を備える細胞培養支持体の製造方法であって、
放射線照射により前記環境応答性ポリマーと共有結合し得る表面を備えたロール状のフィルム形状の基材を準備し、放射線照射により重合して前記環境応答性ポリマーを形成し得るモノマーと有機溶媒とを含む組成物を、前記基材に連続塗工して、前記基材の表面上に塗膜を形成する塗布工程と、
前記塗膜に放射線を連続照射して、前記環境応答性ポリマーを形成する重合反応及び前記環境応答性ポリマーと基材表面とを結合させる結合反応を進行させる放射線照射工程と、
前記塗膜を乾燥させる乾燥工程とを含み、
前記基材が、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂、表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム、及び微多孔質ポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種の材料を含むものである、前記方法。 - 前記乾燥工程後に、前記基材を細胞培養に適した形状に切り抜く基材加工工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 請求項1または2記載の細胞培養支持体の製造方法であって、
前記塗布工程に用いる前記組成物は、さらにオリゴマー又はプレポリマーを含有し、
前記放射線照射工程では、連続した1回の放射線照射により前記環境応答性ポリマーを形成する重合反応及び前記環境応答性ポリマーと基材表面とを結合させる結合反応を進行させる、前記方法。 - 合成樹脂がナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂が、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された、微多孔質の、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、及びポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の方法により製造された、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーからなる群から選択される少なくとも1種の環境応答性ポリマーが共有結合により表面に固定化された、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂、表面がアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム、及び微多孔質ポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種の材料を含む基材を備える細胞培養支持体。
- 前記基材の表面に固定化された前記環境応答性ポリマーの層の乾燥時の厚さが0.001〜10μmである、請求項6記載の細胞培養支持体。
- 請求項6又は7記載の細胞培養支持体上で細胞培養する工程を含む、細胞シートの作製方法。
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