JP2009165417A - 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ及びそれをコードするdna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(a)又は(b)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。(a)Brevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ活性を有する特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド。(b)上記該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ。
【選択図】なし
Description
[1] 下記の酵素学的性質を有するBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ:
(1)酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する;
(2)至適pHは8〜10付近である;
(3)70℃、1時間の熱処理でも失活せず、80%以上の残存活性を有する;
(4)至適温度は50〜70℃である;
(5)アンモニウム塩により活性化される;及び
(6)分子量はSDS-PAGEで測定した場合50〜60kDaである。
[2] さらに、以下の酵素学的性質を有する[1]の酵素:
(7)NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない;及び
(8)Kmは約0.022mMである。
[3] Brevibacterium sp.KU1309(受託番号:FERM P-21008)由来である[1]又は[2]のNADHオキシダーゼ。
[4] Brevibacterium属微生物を培養し、培養物からNADHオキシダーゼを回収することを含む、[1]〜[3]のいずれかのNADHオキシダーゼの製造法。
[5] Brevibacterium属微生物が、Brevibacterium sp.KU1309(受託番号:FERM P-21008)である[4]のNADHオキシダーゼの製造法。
[6] 以下の(a)又は(b)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ。
(a) 配列番号18で表わされるアミノ酸配列を含むNADHオキシダーゼ
(b) 配列番号18で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ
[7] 以下の(a)又は(b)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。
(a) 配列番号18で表わされるアミノ酸配列を含むNADHオキシダーゼ
(b) 配列番号18で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ
[8] 以下の(c)又は(d)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。
(c) 配列番号17で表わされる塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号17で表わされる塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
[9] [8]のDNAを含有する発現ベクター。
[10] [9]の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[11] [10]の宿主細胞をDNAの発現可能な条件下で培養して、NADHオキシダーゼを産生させ、該NADHオキシダーゼを回収することを含むNADHオキシダーゼの製造方法。
[12] 宿主細胞が大腸菌であって、[9]記載の発現ベクターをシャペロンプラスミドを共発現させることにより可溶性NADHオキシダーゼを製造する、[11]の製造方法。
[13] [1]〜[3]及び[6]のいずれかのNADHオキシダーゼを用いて、光学活性マンデル酸又はD-フェニルアラニンを製造する方法。
(a)形態
(1)細胞の大きさ:0.8×1.0〜1.5μm(24h)、0.8×0.8〜1.0μm(72h)の桿菌。Rod-coccus cycleあり。
(2)グラム染色性:陽性。
(3)胞子の有無:なし。
(4)運動性:なし。
(5)コロニー形態(培地;Nutrient Agar、培養時間24時間):
円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、黄色。
(6)生育温度:37℃で+、45℃で−。
(7)カタラーゼ:陽性。
(8)オキシダーゼ:陰性。
(9)酸/ガス産生(グルコース):-/-。
(10)O/Fテスト(グルコース):-/-。
(1)本発明の酵素は以下の反応式で酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する
NADH + H+ + O2 → NAD+ + H2O2;
(2)本発明の酵素の至適pHは8〜10付近であり、酸化還元酵素と共にアルコールの酸化反応を行う際に、好適である;
(3)本発明の酵素は温度安定性に優れており、70℃、1時間の熱処理でも失活せず、80%以上、好ましくは90%以上、さらにほぼ100%の残存活性を有する。この性質は、物質生産プロセスに於いて好適である;
(4)本発明の酵素の至適温度は50〜70℃、好ましくは約60℃である;
(5)本発明の酵素はアンモニウム塩により活性化される。反応系を弱アルカリ性に保つ際にアンモニア水を用いると、酵素も活性化されるので好適である;
(6)本発明の酵素はZn2+(39%)、Cu2+(42%)、Ag+(37%)などの柔らかい酸に阻害される;
(7)本発明の酵素は、NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない。NADPHを酸化できないという本酵素の特性は、NADHとNADPHが混在する生体試料中のNADH量を選択的に測定できるという利点がある。;
(8)本発明の酵素のKmは0.1mM以下、好ましくは約0.02mM例えば0.022mMである;
(9)本発明の酵素を用いてNADHを1mol酸化すると、1molの過酸化水素が生成する;及び
(10)本発明の酵素はホモダイマーを形成し、サブユニットの分子量はSDS-PAGEで測定した場合、50kDa〜60kDa、好ましくは約57kDaである。ゲルろ過で想定したホモダイマーの分子量は約102kDaである。また、アミノ酸配列から推定したサブユニットの分子量は約49kDaである。
(1)細胞の培養
Brevibacterium属微生物Brevibacterium sp.KU1309を土壌から単離し、以下の方法で培養した。単離したBrevibacterium sp.KU1309は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター(日本、茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に2006年8月29日付けで寄託した(受託番号:FERM P-21008)。
無細胞抽出液の調製
湿潤した細胞(20g)を100mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)5mM 2-メルカプトエタノールに懸濁し、Dyno-mill(Willy A. Bachofen Co.)で破砕した。この混合物を遠心分離し、上澄みを回収し、これを無細胞抽出液とした。
酵素活性は、NADHがNAD+へ酸化されると減少する340nmの吸光度を吸光光度計で測定して評価した。反応は0.1mM NADH、100mMトリス塩酸(pH8.8)、500mM硫酸アンモニウムに酵素溶液を加えて行った。1ユニットはNADH1μモルを1分間あたりに酸化する酵素量として定義した。
無細胞抽出液を0℃で攪拌しながら、硫酸アンモニウムを35%飽和の濃度となるまで15分間かけて少しずつ添加した。その後さらに1時間攪拌した。遠心分離により沈殿を除去し、上澄みに65%飽和となるまで硫酸アンモニウムを15分間かけて加えた。加え終わってから1時間攪拌した後、遠心分離により沈殿を回収した。この沈殿を10mMリン酸緩衝溶液、5mM 2-メルカプトエタノール、30%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解した。
5mM 2-メルカプトエタノール、飽和30%硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(=緩衝溶液A)で平衡化したPhenyl toyopearlカラム(東ソー、カラム体積150ml)に試料をのせた。Econo Gradient Pump(Bio Rad)を用いてクロマトグラフィーを行った(流速1.5ml/min)。450mlの緩衝溶液Aで洗浄したのち、450mlの緩衝溶液Aと450mlの5mM 2-メルカプトエタノール、20%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液B(pH7.0)の硫酸アンモニウム直線勾配でタンパク質を溶出させた。各フラクションの酵素活性を調べ、活性フラクションを集めて、10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に透析した。このフラクションプールを5mM 2-メルカプトエタノール、200mM NaClを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(緩衝溶液C)で平衡化されたDEAE toyopearlカラム(東ソー、カラム体積50ml)にのせた。150mlの緩衝溶液Cで洗浄後、150mlの緩衝溶液Cと150mlの5mM 2-メルカプトエタノール、300mM NaClを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液D)による、NaCl直線勾配でタンパク質を溶出した(流速1ml/min)。これらの中から活性のあるフラクションを回収し、30%飽和となるまで硫酸アンモニウムを加えた。この溶液を、5mM 2-メルカプトエタノール、30%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液E)で平衡化したButyl toyopearlカラム(東ソー、カラム体積10ml)にのせた。30mlの緩衝溶液Eで洗浄後、30mlの緩衝溶液Eと30mlの5mM 2-メルカプトエタノール、15%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液F)の硫酸アンモニウム直線勾配でタンパク質を溶出した(流速1ml/min)。活性なフラクションを回収し、10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に透析した。Butyl toyopearlカラムによる各フラクションの酵素活性を図1Bに示す。図1Aに示すように単一ピークが認められた。さらに、精製後にSDS-PAGEを行った。CBBによる染色では50kDa付近(56.8kDa)に均一なバンドを確認することができた(図1A)。またゲルろ過クロマトグラフィーから非変性状態での分子量は102kDaであったことから2量体として存在する酵素であることがわかった。また精製した酵素の溶液は黄色透明であったことからフラビン酵素であると考えられる。
(1)pH依存性
pH5.5〜11.5の範囲で酸化反応の最適pHを測定した。緩衝溶液は各pH範囲に適した緩衝溶液、すなわちMES(pH5.5〜6.5)、MOPS(pH6.5〜7.4)、HEPES(pH7.0〜8.0)、Tris(pH7.5〜8.8)、グリシン(pH8.8〜10.4)、CAPS(pH9.4〜10.8)、リン酸ナトリウム(pH10.54〜11.52)を用いた。各pHでの相対反応速度を図2にまとめた。
本酵素は、アルカリ側pH8.5〜10)に至適pHを有することが判明した。
酵素をpH4.5〜11.5の各pHで70℃、1時間インキュベートし、その後の残存活性を測定した。緩衝溶液はクエン酸(pH4.7)、MES(pH5.5、6.3)、MOPS(pH6.6、7.4)、Tris(pH7.4、8.5)、TAPS(pH8.4、9.2)、CAPS(pH9.4、10.2)、リン酸ナトリウム(pH10.5、11.5)を用いた。
図に示すようにpH6〜10の広いpH範囲で安定であった。
MOPS緩衝溶液(pH6.6)中での熱に対する安定性の検討を行った。各温度で1時間インキュベートし、その後の活性を室温で測定した。これを図4のグラフの(◆)で示した。また各温度(30℃〜70℃)で酵素活性を測定し、これを図4のグラフに(□)で示した。
図に示すように70℃、1時間のインキュベートに対してほぼ100%安定であった。
各種塩を加えて反応を行い、340nmの吸光度を測定し反応速度を決定した。図5Aに各種塩の酵素活性に対する効果を示す。このようにアンモニウム塩を加えることに酵素活性は上昇することがわかった。そこで、アンモニウム塩濃度の酵素活性に対する影響を調べた。方法は、硫酸アンモニウムを0Mから4.35Mの各濃度存在下で反応を行い、反応速度の相対値を算出した。図5Bにアンモニウム塩の酵素活性に対する効果を示す。
図に示すように、活性にはアンモニウム塩が必要であり、活性が最大となるアンモニウム塩濃度([NH4 +])は、3.0Mであった。
酵素溶液を100mM Tris-HCl(pH8.8)に加え、さらに阻害剤を終濃度1mMとなるように加え、3分間室温でインキュベートした。その後、NADHを10μM、(NH4)2SO4を500mMとなるように加え、340nmの吸光度を測定することにより、反応速度を決定した。
図6に相対活性値を示す。図6に示すように、Zn2+(39%)、Cu2+(42%)、Ag+(37%)などの柔らかい酸に阻害された。
速度論的解析はNADH濃度を10μMから100μMの間で反応速度を測定し、この値からLineweaver-Burkプロットを作成した。反応は次のように行った。反応液{NOX;0.28ug/ml、NADH;10μM-100μM、(NH4)2SO4; 500mM、Tris-HCl;100mM (pH8.8)}を吸光光度計用セルに入れ、340nmの吸光度を測定することにより、反応速度を決定した。
NOXはH2O副生型とH2O2副生型に分類される。図8Aに示すアッセイ法を用いてH2O2の生成確認と定量を行った。
まず、既知濃度の過酸化水素とo-ジアニシジン、ペルオキシダーゼを用いて反応を行い、[H2O2] vs Abs460の検量線を作成した。これによって得られたプロットが、図8Bの(◆)である。つづいて、実際にNOXでのNADH酸化反応を行い、反応後に生成した過酸化水素濃度を測定した。すなわち、NOXによる酸化反応をNADH濃度を75μM、100μM、150μMで行い、十分な反応時間で反応を完了した。反応の完了は吸光光度計により確認した。この反応液50μlを、o-ジアニシジン、ペルオキシダーゼを含む100mMのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に加え、吸光度を測定した。これにより得られたプロットが図8Bの(□)で示した。一番左から、NADH濃度が75、100及び150μMの時のAbs460である。これは[H2O2]濃度と同じ値をとっていることがわかる。
このことから、H2O2の生成が確認できた。またNADHを1mol酸化すると、1molの過酸化水素が生成することがわかった。
(i)マンデル酸デヒドロゲナーゼとの併用による光学活性マンデル酸の調製
Enterococcus faecalis IAM 10071からのマンデル酸デヒドロゲナーゼ(Tamura, Y., et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:957-957)とBrevibacterium sp.からのNADHオキシダーゼを組み合わせることで、マンデル酸の酸化を行った。
本発明の酵素とマンデル酸デヒドロゲナーゼのカップリング反応の反応機構を図9Aに示す。
L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは和光純薬より購入したものを用いた。
反応は次の組成で行った。2.5mM DLフェニルアラニン、0.1mM NAD+、10mM硫酸アンモニウム、100mM CAPS(pH 10.2)、NADHオキシダーゼ0.2U/ml、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ0.2U/mlの混合物を30℃でインキュベートし、HPLCによって系中のフェニルアラニンの光学純度を調べた。[HPLC条件:Crownpak CR(+)展開相5.7%過塩素酸、流速0.5ml/min、検出UV200nm、保持時間D-フェニルアラニン18.5min、L-フェニルアラニン25.1min]
単離した酵素遺伝子のクローニングは、N末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列を解析後、縮重プライマーを用いたPCRで断片を獲得しインバースPCRにより全長遺伝子配列のクローニングを行った。以下に詳細を示す。
実施例1に記載の方法で精製した酵素についてSDS-PAGEを行った。アクリルアミドゲルからセミドライブロッティング装置によってPVDF膜に転写した。この膜をCBB染色して、目的のバンドをプロテインシーケンサーを用いて解析したところ、本酵素のN末端はXDELTYDLVVLGGGTGG(配列番号2)であることが分かった。
実施例1に記載の方法で精製した酵素についてSDS-PAGEを行った。SDS-PAGEをCBB染色し目的のバンドを切り出し、ゲル内消化を行った。はじめはリジルエンドペプチダーゼによる消化を試みたが、なかなかペプチド断片に分解することができずHPLCではあまり切断されていない大きな断片のものと思われるピークが観察された。そこでトリプシンを用いて消化を行うこととした。トリプシンはリジンとアルギニンのC末端を切断する酵素なので、リジルエンドペプチダーゼを用いた場合より、細かく断片に消化できると期待した。この結果、断片化することに成功しプロテインシーケンサーによって解析したところ、GPVTEGFGFEEQGIPMDR(配列番号3)であることがわかった。
得られたN末端及び内部配列をもとに以下のような縮重したセンスプライマー(F01,F02)とアンチセンスプライマー(R01,R02)を設計した。
DELTYDLVVL(配列番号4)に対応したNOX degenerate primer F01
5’- GAYGARYTIACITAYGAYYTIGTIGTNYT-3’(配列番号5)
VLGGGTGGY(配列番号6)に対応したNOX degenerate primer F02
5’-AARYTIGGNGGIGGNACIGGIGGNTA-3’(配列番号7)
PVTEGFGFE(配列番号8)に対応したNOX degenerate primer R01
5’-TCRAANCCRAAICCYTCIGTNACNGG-3’(配列番号9)
TEGFGFEEQ(配列番号10)に対応したNOX degenerate primer R02
5’-TCCATIGGDATNCCYTGYTCYTCRAA-3’(配列番号11)
得られた遺伝子断片を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。pGEMNOXinからNotIを用いて酵素の内部配列を切り出し、精製してこれをプローブとしてゲノミックサザンハイブリダーゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは55℃で終夜振とうすることで行った。また一次洗浄も55℃で行った。この結果を図11に示す。図11(a)はUVによるゲノム消化物の検出の結果を示し、図11(b)は酵素発行による検出の結果を示す。用いたサンプルは、レーン1〜6でそれぞれSal I消化物、Sac I消化物、Hinc II消化物、Xho I消化物、Bgl I消化物、Sma I消化物であり、Mはマーカーである。Sal・I消化物中に約3000b.p.程度のフラグメントが検出された。
ゲノムDNAのSalI消化物をアガロースゲルで分離し2.0kb.p.〜3.4kb.p.の部分を切り出し精製しTEに溶解しDNA断片溶液(20ng/μL)を得た。この溶液20μLに水80μLとTOYOBO社製2×Ligation highを100μL加え16℃で終夜静置した。この溶液を精製して50μLのTE溶液としてインバースPCRに用いた。インバースPCRには以下のプライマーを組み合わせて用いた。
NOX inverse primer F02; 5’-GCGTTCGATCAAAGCGACCTTCATGTCGAG-3’(配列番号13)
NOX inverse primer R01; 5’-GGCGTCATGTTCAAGGGCGTCGAAGAGACG-3’(配列番号14)
NOX inverse primer R02; 5’-GCCGACGGGGTCAAGGTCACTCTCGAAGAC-3’(配列番号15)
反応は表5に示す組成及び方法で行った。
NOX sequence 2; 5’-TCCGTCGGACTCTCCTCTGCACAG-3’(配列番号16)
大腸菌を用いて本酵素の大量発現に関する検討を行った。
Brevibacterium sp.KU1309ゲノムをテンプレートとして、プライマーを以下のように設計した。N末端のバリン(GTG)はメチオニン(ATG)に換えて設計した。
NOXForNde01: 5’-GGAATTCCATATGAGTGACGAATTGACCTACGACCTT-3’(配列番号19)下線はNdeIサイト)
NOXRevEco01:5’-GGAATTCTTATGAGTGGAAGTGCAGGGGTTTGCC-3’(配列番号20)
(下線はEcoRI, 斜体は終止コドン)
得られた遺伝子(nox遺伝子)を用いてpET21-b(+)とpCold IIIに組み込んだプラスミドpET21BNOX, pCBNOXを作成した。pET21BNOXはT7プロモータ制御下に野生型BNOXを発現するように挿入した。pCBNOXはコールドショックプロモーター制御下にTEE融合型BNOXを発現するように挿入した(図14)。
構築したプラスミドベクターを用いて、様々な宿主に関して発現検討を行った。発現は37℃で培養後、IPTGを添加後、数時間誘導することで行った。得られた菌体を超音波で破砕し、その上清中のNADH酸化活性を測定した。IPTGを添加していない場合でも、大腸菌自体がNOX活性を有しているため、IPTGの非添加時と比べて有意な差のある系を検討することとした。この結果を表7に示す。
Claims (6)
- 以下の(a)又は(b)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。
(a) 配列番号18で表わされるアミノ酸配列を含むNADHオキシダーゼ
(b) 配列番号18で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ - 以下の(c)又は(d)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。
(c) 配列番号17で表わされる塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号17で表わされる塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA - 請求項2記載のDNAを含有する発現ベクター。
- 請求項3記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項4記載の宿主細胞をDNAの発現可能な条件下で培養して、NADHオキシダーゼを産生させ、該NADHオキシダーゼを回収することを含むNADHオキシダーゼの製造方法。
- 宿主細胞が大腸菌であって、請求項3記載の発現ベクターをシャペロンプラスミドを共発現させることにより可溶性NADHオキシダーゼを製造する、請求項5記載の製造方法。
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