JP2007519662A5 - - Google Patents

Description

６−ベンゾ[ｂ]チオフェン−３−イル−３−[４−メトキシ−フェニル)−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
３−(３−メトキシ−フェニル)−６−チオフェン−３−イル−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
６−(３−ベンジルオキシ−フェニル)−３−(３−メトキシ−フェニル)−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
３−[７−アミノ−３−(３−メトキシ−フェニル)−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−６−イル]−フェノール；
(４−｛７−アミノ−３−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−６−イル｝−フェニル)−カルバミン酸エチルエステル
６−(３−クロロ−フェニル)−５−メチル−３−[３−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
６−(３−クロロ−フェニル)−５−メチル−３−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
６−(３−クロロ−フェニル)−３−[２−メトキシ−５−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−５−メチル−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
６−(３−クロロ−フェニル)−３−[２−メトキシ−４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−５−メチル−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
３−｛７−アミノ−３−[２−メトキシ−４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−６−イル｝−フェノール；
６−(２−クロロ−フェニル)−３−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
６−(２−クロロ−フェニル)−３−[３−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；
６−(４−フルオロ−フェニル)−５−メチル−３−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン；

本明細書で使用する用語“官能基”は：カルボン酸；ヒドロキシル；ハロゲン；シアノ(−ＣＮ)；エーテル(−ＯＲ)；ケトン(−ＣＯ−Ｒ)；エステル(−ＣＯＯＲ)；アミド(−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮＲＲ')；チオエーテル(−ＳＲ)；スルホンアミド(−ＳＯ_２ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＨＲ、−ＳＯ_２ＮＲＲ')；スルホン(−ＳＯ_２−Ｒ)；スルホキシド(−ＳＯ−Ｒ)；アミン(−ＮＨＲ、ＮＲ'Ｒ)；ウレア(−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ_２、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ)；エーテル(−Ｏ−Ｒ)；ハロゲン；カルバメート(−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ)；アルデヒド−官能基(−ＣＨＯ)；そしてまた逆アミド；スルホンアミドおよびエステル(−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ、−ＮＨ−ＳＯ_２−Ｒ、−ＯＯＣ−Ｒ)を含み；
ＲおよびＲ'は同一または異り、Ｈまたは上記で定義の任意の脂肪族、アリールまたはヘテロアリール部分であり得る。

その後に用語“使用”が記載されているとき、これは、適当であり、かつ予測される限り、他に異なる記載がなければ、下記の本発明の態様の任意の１個またはそれ以上を各々含む：(とりわけチロシン)タンパク質キナーゼ依存性疾患の処置における使用、該疾患の処置に使用するための医薬組成物の製造における使用、該疾患の処置におけるピラゾロ[１,５ａ]ピリミジン−７−イルアミン誘導体の処置法、該疾患を処置するためのピラゾロ[１,５ａ]ピリミジン−７−イルアミン誘導体を含む医薬製剤、および該疾患の処置に使用するためのピラゾロ[１,５ａ]ピリミジン−７−イルアミン誘導体を含む。特に、処置すべき、故に、式(Ｉ)の化合物の使用に好ましい疾患は、下記の(とりわけチロシン)タンパク質キナーゼ依存性(“依存性”はまた“単なる依存性”だけでなく“支持されている”も含む)疾患、とりわけ対応する増殖性疾患、よりとりわけｃ−Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｒａｆ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、ＫＤＲ、Ｈｅｒ−１、ＰＤＧＦＲ−キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲＥＴ−受容体キナーゼ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ３、ＦＧＦ−Ｒ４、Ｅｐｈｒｉｎ受容体キナーゼ(例えば、ＥｐｈＢ２キナーゼ、ＥｐｈＢ４キナーゼおよび関連Ｅｐｈキナーゼ)、カゼインキナーゼ(ＣＫ−１、ＣＫ−２、Ｇ−ＣＫ)、Ｐａｋ、ＡＬＫ、ＺＡＰ７０、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ａｘｌ、Ｃｄｋ１、ｃｄｋ４、ｃｄｋ５、Ｍｅｔ、ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、Ｓｙｋ、インスリン受容体キナーゼ、Ｔｉｅ−２またはＢｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｒａｆ、Ｆｌｔ−３、ＦＧＦ−Ｒ３、ＰＤＧＦ−受容体、ＲＥＴ、およびＭｅｔのようなキナーゼの構成的に活性化された変異体(活性化キナーゼ)(以後“該キナーゼ”)に依存した疾患であり、故にキナーゼ依存性疾患、とりわけ該キナーゼに依存する疾患および(とりわけ異常に高度に発現されたまたは構造的に活性化された)該キナーゼ依存性疾患または該キナーゼ経路の活性化ならびに記載のキナーゼの２個またはそれ以上の任意の組み合わせに依存する疾患の処置に使用できる。

本発明の化合物の、ｃ−Ａｂｌタンパク質−チロシンキナーゼ活性の阻害剤としての効果を、下記の通り証明できる：インビトロ酵素アッセイを、下記の改変をしたGeissler et al. in Cancer Res. 1992;52:4492-4498に記載の通りの、９６ウェルプレートでのフィルター結合アッセイで行う。ｃ−ＡｂｌのＨｉｓ標識キナーゼドメインを、Bhat et al. in J.Biol.Chem. 1997;272:16170-16175に記載の通り、バキュロウイルス／Ｓｆ９系でクローン化し、発現させる。３７kDタンパク質(ｃ−Ａｂｌキナーゼ)を、コバルト金属キレートカラム、その後のアニオン交換カラムでの２工程法で精製し、１−２mg／ＬのＳｆ９細胞を得る(Bhat et al.、上記引用文献)。ｃ−Ａｂｌキナーゼの純度は、クーマシーブルー染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断して＞９０％である。本アッセイは下記を含む(３０μLの総量)：１％ＤＭＳＯの存在下ｃ−Ａｂｌキナーゼ(５０ng)、２０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０mM ＭｇＣｌ_２、１０μM Ｎａ_３ＶＯ_４、１mM ＤＴＴおよび３０μg／mL ポリ−Ａｌａ,Ｇｌｕ,Ｌｙｓ,Ｔｙｒ−６：２：５：１(Poly-AEKY, Sigma P1152)を使用した０.０６μCi／アッセイ[γ^３３Ｐ]−ＡＴＰ(５μM ＡＴＰ)。反応を１０μLの２５０mM ＥＤＴＡの添加により停止させ、３０μLの反応混合物を、予めメタノールに５分浸漬したImmobilon−ＰＶＤＦ膜(Millipore, Bedford, MA, USA)に移し、水で濯ぎ、次いで５分０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。全サンプルをスポットした後、真空を繋ぎ、各々２００μL ０.５％Ｈ_３ＰＯ_４でよく濯ぐ。膜を除去し、シェーカー上で０.５％Ｈ_３ＰＯ_４(４回)および１回エタノールで洗浄する。膜を環境温度で乾燥し、Packard TopCount ９６ウェルフレーム上にマウントし、１０μL／ウェルのMicroscint TM(Packard)の添加後に計数する。

Ｆｌｔ３キナーゼ阻害を下記の通り決定する：バキュロウイルスドナーベクターｐＦｂａｃＧ０１(GIBCO)を使用して、ヒトＦｌｔ−３の細胞質キナーゼドメインのアミノ酸領域アミノ酸５６３−９９３を発現する組み換えバキュロウイルスを産生する。Ｆｌｔ−３の細胞質ドメインのコード配列を、ヒトｃ−ＤＮＡライブラリー(Clontech)からＰＣＲにより増幅する。増幅したＤＮＡフラグメントおよびｐＦｂａｃＧ０１ベクターを、ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄIIIでの消化によりライゲーションに適合性とする。これらのＤＮＡフラグメントのライゲーションにより、バキュロウイルスドナープラスミドＦｌｔ−３(１.１)をもたらす。ウイルスの産生、Ｓｆ９細胞中のタンパク質発現およびＧＳＴ−融合タンパク質の精製は、下記の通り行う：
ウイルスの産生：Ｆｌｔ−３キナーゼドメインを含むトランスファーベクター(ｐＦｂａｃＧ０１−Ｆｌｔ−３)を、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞系(GIBCO)にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、選択的寒天プレートに播種する。融合配列のウイルスゲノムへの挿入がないコロニーは(細菌により運搬)、青色である。単一、白色コロニーを採取し、ウイルスＤＮＡ(bacmid)を、標準プラスミド精製法により細菌から単離する。Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１(American Type Culture Collection)細胞を、次いでフラスコに、ウイルスＤＮＡと共に、セルフェクチン試薬を使用してトランスフェクトする。

ＧＳＴ−標識タンパク質の精製：遠心分離した細胞溶解物を２mL グルタチオン−セファロースカラム(Pharmacia)に負荷し、３回１０mLの２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、２００mM ＮａＣｌで洗浄する。ＧＳＴ標識タンパク質を、次いで、２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０mM 還元グルタチオン、１００mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、１０％グリセロールの１０回の適用(各１mL)により溶出し、−７０℃で貯蔵する。

ＩκＢをｃ−Ｒａｆ−１キナーゼの基質として使用した。ＩκＢはＨｉｓ−標識タンパク質として細菌中で発現する(クローン化され、Dr. Eder;ABM, Novartis, Baselから恵与された)。ＩκＢプラスミドを含むＢＬ２１ ＬｙｓＳ細菌を、ＬＢ培地中で０.６のＯＤ_６００まで増殖させ、次いでｋｂを発現するように３時間、３７℃でＩＰＴＧ(１mMの最終濃度)で誘発し、次いで、細菌を超音波処理により溶解させ(マイクロチップ設定限界、３回、１分、各々超音波緩衝液中[５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０、１mM ＤＴＴ、１mM ＥＤＴＡ])、１０,０００ｇで１５分遠心分離する。上清を硫酸アンモニウムと混合し、３０％の最終濃度とする。この混合物を１５分、４℃で振盪し、次いで１０,０００ｇで１５分回転させる。本ペレットを、１０mM ＢＳＡ含有結合緩衝液(Novagen)に再懸濁する。この溶液をNovagenマニュアルに従いＮｉ−アガロース(Novagen)に適用し、洗浄する。ＩκＢを、本カラムから溶出緩衝液(０.４Ｍ イミダゾール、０.２Ｍ ＮａＣｌ、８mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７.９)を使用して溶出する。タンパク質含有フラクションを、５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１mM ＤＴＴ中で透析する。

ｃ−Ｒａｆ−１タンパク質キナーゼの活性を、阻害剤の存在下または非存在下、[γ^３３Ｐ]ＡＴＰからＩＢへの^３３Ｐの取り込みによりアッセイする。本アッセイを９６ウェルプレートで環境温度で６０分行う。それは(３０μlの総容量)下記を含む：ｃ−ｒａｆｌ１キナーゼ(４００ng)、２５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５mM ＭｇＣｌ_２、５mM ＭｎＣｌ_２、１０μM Ｎａ_３ＶＯ_４、１mM ＤＴＴおよび１％ＤＭＳＯ存在下６００ng ＩＢを使用して０.３μCi／アッセイ[γ^３３Ｐ]−ＡＴＰ(１０μM ＡＴＰ)。反応を１０μLの２５０mM ＥＤＴＡの添加により停止し、３０μLの反応混合物を、予めメタノールで５分浸漬したImmobilon−ＰＶＤＦ膜(Millipore, Bedford, MA, USA)に移し、水で濯ぎ、次いで５分、０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で浸漬し、未接続の真空源を有する真空マニホルドにマウントする。全サンプルをスポットした後、真空を繋ぎ、各ウェルを２００μL ０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で濯ぐ。膜を除去し、シェーカー上で４回０.５％Ｈ_３ＰＯ_４で、および１回エタノールで洗浄する。膜を環境温度で乾燥させ、Packard TopCount ９６ウェルフレーム上にマウントし、１０μL／ウェルのMicroscint TM(Packard)の添加後に計数する。

式(Ｉ)の化合物の抗腫瘍活性を証明するためのインビボ実験：例えば、式(Ｉ)の化合物、例えば下記実施例１のものが、ＶＥＧＦ介在血管形成をインビボで阻害するか否かを試験するために、マウスにおける増殖因子インプラントモデルにおいて、ＶＥＧＦにより誘発された血管新生応答に対するその効果を試験する：多孔性Teflonチャンバー(容量０.５mL)に、増殖因子(２μｇ／mlヒトＶＥＧＦ)含有または非含有の、ヘパリン(２０単位／ml含有０.８％ｗ／ｖ寒天を、Ｃ５７／Ｃ６マウスの横腹の背面に皮下的にインプラントする。マウスを試験化合物(例えば２５、５０または１００mg／kg ｐ.ｏ.１日１回)または媒体で処置し、チャンバーのインプラントの日に開始し、その後連続４日続ける。処置の最後に、マウスを殺し、チャンバーを除去する。チャンバー周辺で増殖した血管新生組織を注意深く除き、秤量し、血液含量を組織中のヘモグロビン含量の測定により評価する(Drabkins method;Sigma, Deisenhofen, Germany)。以前に、これらの増殖因子は、チャンバーの周辺で増殖する(繊維芽細胞および小血管の含有により組織学的に特徴付けられる)組織の重量および血液含量の用量依存性増加を誘発し、この応答がＶＥＧＦを特異的に中和する抗体で遮断されることが示されている(Wood JM et al., Cancer Res. 60(8), 2178-2189, (2000);およびSchlaeppi et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, 336-342, (1999))。このモデルで、式(Ｉ)の化合物の場合に阻害が示され得る。

あるいは、式(Ｉ)の化合物は、対応する官能基(Ｘ、図３参照)を担持するピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−７−イルアミン核骨格を最初に合成することにより製造でき、ここで、残基Ａ、Ｒ_２、またはＲ_３は各々図３に示す通りの既知の方法で製造できる。

また好ましいのは、キナーゼ依存性疾患、とりわけ該キナーゼおよび(とりわけ異常に高度に発現または活性化された)該キナーゼ依存性疾患または該キナーゼ経路の活性化に依存性の疾患もしくは該キナーゼの任意の２個またはそれ以上に依存性の疾患の処置に使用するための、上記の通りの式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

Ｆｌｔ３(ＦＭＤ様チロシンキナーゼ)は、とりわけ造血前駆細胞ならびにリンパ系および骨髄系において発現される。Ｆｌｔ３遺伝子の異常な発現は、ＡＭＬ(急性骨髄性白血病)、三血球系骨髄異形成を伴うＡＭＬ(ＡＭＬ／ＴＭＤＳ)、ＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＭＬ(慢性骨髄性白血病)および骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)を含む成体および子供の両方の白血病で報告されており、故に、式(Ｉ)の化合物で処置すべき好ましい疾患である。Ｆｌｔ３における活性化変異は、ＡＭＬ患者の約２５から３０％で見られている。故に、ヒト白血病におけるＦｌｔ３の役割の証拠が蓄積されてきており、本発明に従いＦｌｔ３阻害剤として有用な、ピラゾロ[１,５ａ]ピリミジン−７−イルアミン誘導体、とりわけ式(Ｉ)の化合物は、このタイプの疾患の治療においてとりわけ有用である(Tse et al., Leukemia 15(7), 1001-1010(2001);Tomoki et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 48(Suppl. 1), S27-S30(2001);Birkenkamp et al., Leukemia 15(12), 1923-1921(2001);Kelly et al., Neoplasia 99(1), 310-318(2002)参照)。

慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)において、造血幹細胞(ＨＳＣ)における相互にバランスのとれた染色体転座がＢＣＲ−ＡＢＬハイブリッド遺伝子を形成する。後者は、発癌性Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質をコードする。ＡＢＬは、細胞増殖、付着およびアポトーシスの制御に重要な役割を有する、厳しく制御されたタンパク質チロシンキナーゼをコードするが、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子は構成的に活性化されたキナーゼとしてコードされ、これはＨＳＣを形質転換して脱制御されたクローン増殖、骨髄基質への付着の減少した能力および変異誘発性刺激に対する減少したアポトーシス応答を示す表現型を産生し、それは漸増的により悪性の形質転換を蓄積できる。得られた顆粒球は成熟リンパ球への発達ができず、循環に遊離され、成熟細胞の不足と感染への増加した感受性に至る。Ｂｃｒ−ＡｂｌのＡＴＰ競合的阻害剤が記載されており、それはキナーゼが活性化された有糸***促進性および抗アポトーシス性経路(例えばＰ−３キナーゼおよびＳＴＡＴ５)からのキナーゼを防止でき、ＢＣＲ−ＡＢＬ表現型細胞の死を導き、それによりＣＭＬに対する有効な治療を提供する。Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤として、本発明に従って有用なピラゾロ[１,５ａ]ピリミジン−７−イルアミン誘導体、とりわけ式(Ｉ)の化合物は、その過剰発現に関連する疾患、とりわけ白血病、例えばＣＭＬまたはＡＬＬのような白血病の治療に適している。

経口投与用医薬組成物は、活性成分と固体担体を合わせ、望むのであれば得られた混合物を造粒し、得られた混合物を、望むならばまたは必要であれば、適当な賦形剤の添加後に、錠剤、糖衣錠コアまたはカプセルに加工することにより得ることができる。活性成分を一定量で拡散または放出することを可能にするプラスチック担体にそれらを包含させることも可能である。

コルチコステロイド含有インプラントは、例えば、フルシノロン、デキサメタゾンのような薬剤に関する。

他の化学療法剤は、植物アルカロイド、ホルモン剤およびアンタゴニスト；生物学的応答修飾剤、好ましくはリンホカインまたはインターフェロン；アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体；またはその他の薬剤もしくは他のもしくは未知の作用機構を有する薬剤を含むが、これらに限定されない。

合成
フラッシュクロマトグラフィーをシリカゲル(Merck;40-63μm)を使用して行う。薄層クロマトグラフィーについて、予めコートしたシリカゲル(Merck 60 F254)プレートを使用する。成分の検出は、ＵＶ光(２５４nm)により行う。ＨＰＬＣをNucleosil 100-3 C₁₈ HD １２５×４.０mmカラム[１mL／分；２０−１００％ＮｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ、７分で)(方法Ａ)使用して、Agilent HP 1100で；Nucleosil 100-5 C₁₈ AB ２５０×４.６mmカラム(２mL／分；２−１００％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ、１０分で)を使用してSpectraSystem SP8800/UV2000で(方法Ｂ)；Chromalith Speed ROD RP18 ５０−４.６mmカラム(Merck)を使用して(２mL／分；２−１００％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ、２分で)(方法Ｃ)；またはＣ８ ２.１−５０mm ３μmカラム(Waters)(２mL／分；５−９５％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ、２分で)(方法Ｄ)で行う。^１Ｈ−ＮＭＲを測定は、Varian Gemini 400またはBruker DRX 500スペクトロメーターで、テトラエチルシランを内部標準として使用して行う。化学シフトをテトラエチルシランからのダウンフィールドにおけるppmで示し、結合定数(Ｊ)をヘルツ(Hz)で示す。エレクトロスプレーマススペクトルは、Fisons Instruments VG Platform IIで得る。融点はBuechi 510融点装置で測定する。市販の溶媒および化学物質を合成に使用する。

ステージ１.２ ４−(４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル)−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミン
ＡｃＯＨに溶解した２−[４−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)−フェニル]−３−オキソ−プロピオニトリル(ステージ１.４)(３７０mg、１.５２mmol)、ヒドラジン一水和物(０.１８５mL、３.８mmol)を、９８℃で３時間撹拌する。ＲＴに冷却後、Ｈ_２Ｏ(８mL)および濃ＨＣｌ(０.８mL)を添加し、反応混合物を還流下２０分撹拌する。ＲＴに冷却後、反応混合物を、アルカリｐＨにＮＨ_３(２５％)をゆっくり添加することにより調整する。沈殿した物質を濾取し、さらに精製のために維持する。反応溶液をＣＨ_２Ｃｌ_２(５０mL、３×)で抽出し、乾燥(Ｎａ_２ＳＯ_４)させ、減圧下濃縮する。沈殿したおよび抽出した物質を合わせ、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、３.０×１８cm、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３＝９：１：０１)に付し、ステージ１.２の化合物を白色固体として得る(２７７mg、１.０８mmol；７１％)；ＥＳ−ＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝２５８.１、Ｒ_ｆ(ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３＝９０：１０：０.１)＝０.２８；ＨＰＬＣ：^Ａｔ_Ｒｅｔ＝４.３３分。