CN111087446B - 一种抑制血管紧张素转换酶的十肽及其应用 - Google Patents
一种抑制血管紧张素转换酶的十肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抑制血管紧张素转换酶的十肽及其应用。所述的多肽包含10个氨基酸残基,分子量为1212.35,理论等电点为6.00,其氨基酸序列为:苯丙氨酸‑丝氨酸‑谷氨酸‑酪氨酸‑脯氨酸‑脯氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸‑精氨酸‑苯丙氨酸(Phe‑Ser‑Glu‑Tyr‑Pro‑Pro‑Leu‑Gly‑Arg‑Phe)。本发明所述的十肽来源于食用酵母酶解产物,可通过固相合成制备。本发明的多肽具有良好的血管紧张素转移酶(ACE)抑制活性,对ACE的半抑制浓度IC50为51.31μM,并且对细胞增殖影响小,安全性高,可用于降血压功能食品或药品的开发与制备,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能食品及生物医药领域,特别涉及一种抑制血管紧张素转换酶的十肽及其应用。
背景技术
高血压是世界上死亡率最高的疾病之一,引起人们的广泛关注。在调节人体血压的众多因素中,血管紧张素转移酶(ACE)是影响升压、降压两个***平衡的主要因素,因此,成为治疗高血压、心力衰竭等疾病的理想靶点。对ACE活性进行抑制,可以有效降低人体血压。
人工合成的降血压药物,具有良好的降血压效果,然而其副作用也不容忽视。如引起咳嗽、味觉失灵、过敏及血压过低等症状。
因此,亟待研发获得具有降压效果好、无毒副作用的ACE抑制剂。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种具有ACE(血管紧张素转换酶)抑制活性的十肽。所述的十肽来源于天然产物,本发明利用食用酵母经具有蛋白酶和β-葡聚糖酶活性的枯草芽孢杆菌发酵酶制剂水解后,酵母酶解产物经LC-MS/MS鉴定、筛选得到,研究发现其对ACE具有良好的抑制活性。
本发明的另一目的在于提供所述的十肽的应用。
本发明的又一目的在于提供一种降血压功能食品、ACE抑制剂或降血压药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种具有ACE抑制活性的十肽,其氨基酸序列为:苯丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸(Phe-Ser-Glu-Tyr-Pro-Pro-Leu-Gly-Arg-Phe)。
所述的具有ACE抑制活性的十肽可通过本领域常规技术手段制备得到,例如通过固相合成制备。
所述的具有ACE抑制活性的十肽在制备ACE抑制剂中的应用。
所述的具有ACE抑制活性的十肽在降血压功能食品中的应用。
所述的具有ACE抑制活性的十肽在制备降血压药物中的应用。
一种降血压功能食品,含有所述的具有ACE抑制活性的十肽。
一种ACE抑制剂,含有所述的具有ACE抑制活性的十肽。
一种降血压药物,含有所述的具有ACE抑制活性的十肽。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明的十肽具有良好的ACE抑制活性,其对ACE的半抑制率IC50为51.31μM。
2.本发明方法是一种小分子多肽,结构易于调控,容易合成、修饰、以得到更好的活力,具有明显的应用潜力。
3.本发明的十肽来源于食用酵母的酶解产物,安全性高,食用酵母被列入FDA发布的“一般认为安全”(GRAS)食品配料,安全性高。
附图说明
图1是固相合成十肽FSEYPPLGRF色谱图。
图2是固相合成十肽FSEYPPLGRF质谱图。
图3是不同浓度FSEYPPLGRF对ACE的抑制率结果分析图。
图4是多肽FSEYPPLGRF对ACE的Lineweaver-Burk双倒数图。
图5是多肽FSEYPPLGRF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响结果分析图。其中,**与##分别表示培养24小时和48小时后,样品组与对照组相比差异极显著(p<0.01);*表示培养24小时后,样品组与对照组相比差异显著(p<0.05)。
图6是来源于酵母酶解物的合成多肽ACE抑制活性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例中的枯草芽孢杆菌HU528保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:60364,已在中国专利申请CN201810668986.8中公开。
1.酶制剂的制备
按下述方法配制液体培养基:在蒸馏水中加入蛋白胨1.5%(w/w,下同)、葡萄糖0.8%、CaCl2 0.05%、NaCl 0.15%,混合均匀后,调节液体培养基pH为6.0。在121℃灭菌20min后,按1.0%(v/v)将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌HU528接种于液体培养基,在温度为25℃,搅拌转速为180r/min的条件下发酵培养60h后,所得发酵液于4℃、8000r/m离心10min后去除菌体,发酵上清液即为酶制剂。
2.蛋白酶酶活的测定
对得到的酶制剂的蛋白酶酶活进行测定。
蛋白酶酶活的测定参照国标GB/T 23527-2009进行,用不同浓度的酪氨酸作标准曲线,详细操作如下所述。用pH 7.5的磷酸盐缓冲液将酶液稀释至1mL,2%(w/v)的酪蛋白(pH 7.5)1mL,40℃水浴中预热2min后混匀,置于40℃水浴反应10min,水解反应结束后,加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸终止反应,40℃水浴20min后10000g离心5min,弃去沉淀;取1mL上清液加入1mL福林酚试剂和5mL 0.4mol/L的Na2CO3混匀后于40℃保温20min,680nm下测定其的吸光值。空白对照组中,取1mL酶液,先加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸,反应10min后加入1mL 2%(w/v)酪蛋白,之后与实验组的处理相同。每次测量重复三次,取平均值。测得的OD值通过标准曲线获得相应的酪氨酸浓度,并计算酶活性。蛋白酶活单位定义:在一定温度和反应体系中,稀释一定倍数的1mL样品每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1个蛋白酶活性单位,每毫升酶液的酶活用U/mL表示。测得所述的酶制剂中蛋白酶活力为1600U/mL。
3.β-葡聚糖酶活的测定
对得到的酶制剂的β-葡聚糖酶活力进行测定。
β-葡聚糖酶活采用DNS比色法进行测定。分别吸取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL的葡萄糖标准溶液(1mg/mL),补充蒸馏水至1mL,用1mL蒸馏水做空白对照,每支试管中加入3mL DNS试剂,摇匀后沸水浴5min,常温冷却后测定540nm处的吸光度值,绘制标准曲线。取稀释一定倍数的所述酶制剂0.5mL,加入0.5mL在55℃预热3min的可溶性酵母β-葡聚糖溶液(1%,w/v),摇匀后在55℃水浴下反应10min。反应完成后立即加入3mL DNS溶液,充分混匀后,沸水浴5min,常温冷却后测定540nm处的吸光度值。同时,以先煮沸灭酶的所述酶制剂加0.5mL可溶性酵母β-葡聚糖溶液为空白。酶活力的计算按照公式(1)。
β-葡聚糖酶活力单位(U/mL)=(C×K)/(180×T)(公式1)
式中,C:标准曲线上测定的吸光度值所对应的标准葡萄糖浓度(μg/mL);K:稀释倍数;180:葡萄糖的分子量;T:反应时间,10min。
β-葡聚糖酶活定义:在适宜的反应条件下,每分钟分解β-葡聚糖产生1μmol葡萄糖所需酶蛋白的量定义为一个酶活单位,每毫升酶液的酶活力表示为U/mL。
测得所述的酶制剂中β-葡聚糖酶活力为3.0U/mL。
4.酵母酶解产物的制备及研究
在食用酵母粉(来源于广东五洲药业有限公司,干酵母2017年6月)中按每克酵母粉添加含蛋白酶活性9600U的上述酶制剂(6mL酶制剂/g干酵母),补充无菌水至食用酵母粉与混合液体积比(料液比,w/v)为1:25。调节混合液的pH为9.0。在70℃酶解反应2h后,100℃下灭酶10min,离心取上清,将上清液进行喷雾干燥,得到酵母酶解产物。喷雾干燥的条件为进风温度150℃,出风温度为80℃,进料流量为25mL/min。
应用LC-MS/MS鉴定上述酵母酶解产物,发现含有一种序列为苯丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸(Phe-Ser-Glu-Tyr-Pro-Pro-Leu-Gly-Arg-Phe)的十肽,来源于面包酒酵母(Saccharomyces cerevisiae(strainATCC 204508/S288c))的内源蛋白质:延伸因子1-α(蛋白质登录号:P02994)。所述小分子十肽的理论等电点为6.00。所述小分子多肽的分子量为1212.35g/mol。
实施例2
所述十肽采用Fmoc固相合成法人工合成制备。根据十肽的氨基酸残基组成,以氨基端具有芴甲氧羰酰基(Fmoc-)保护基团的各种氨基酸(Fmoc-Phe、Fmoc-Ser、Fmoc-Glu、Fmoc-Tyr、Fmoc-Pro、Fmoc-Leu、Fmoc-Gly、Fmoc-Arg)为原料,将Fmoc-Phe的羧基以共价键与高分子树脂(Wang树脂)相连;加入含20%(v/v)的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF),反应0.5h脱去氨基保护基Fmoc-;加入过量的Fmoc-Arg,以羟基苯并***为缩合剂,在30℃下反应2h,使得Fmoc-Arg的羧基与树脂上Phe的活性氨基缩合;重复脱保护基和缩合反应,依次连接余下的其它氨基酸后,将十肽从树脂上裂解,经C18柱分离纯化,冷冻干燥,制得该ACE抑制十肽。通过液相色谱图(图1)分析可知,该法合成的本发明所述小分子多肽,纯度为98.35%。液相色谱-质谱图(图2)证明合成的该多肽为Phe-Ser-Glu-Tyr-Pro-Pro-Leu-Gly-Arg-Phe。
实施例3
以硼酸盐缓冲液将本发明小分子多肽分别配制成为1~100μg/mL浓度溶液。分别取100μL不同浓度小分子多肽溶液和50μL 1.55mmol/L HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)溶液(溶剂为硼酸盐缓冲液),37℃保温5min,加入10μL 0.1U/mL的ACE溶液(溶剂为硼酸盐缓冲液)混合均匀,37℃保温反应30min后加入80μL 1.0mol/L的HCl终止反应。同时用100μL的硼酸盐缓冲液替代样品溶液来制备反应液,作为空白对照组。反应液经0.22μm滤膜过滤后用RP-HPLC法检测马尿酸的峰面积,并与标准曲线对比,计算出产物马尿酸的量。
RP-HPLC检测条件:Agilent C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相A为去离子水(含0.1%三氟乙酸TFA(v/v)),B为甲醇(含0.1%TFA(v/v)),A:B=40:60,柱温为25℃,流速0.8mL/min,检测波长228nm,进样量20μL。
半抑制浓度(IC50)是当ACE抑制率达到50%时所需样品的浓度。分别配制不同浓度的样品溶液,测定ACE活性抑制率,以样品浓度为横坐标,ACE抑制率为纵坐标,通过GraphPad Prism软件log(inhibitor)vs.response/Variable slope(four parameters)进行拟合,并计算出IC50值。
从图3可知,本发明所述的十肽在不同浓度下均对ACE具有抑制作用,经计算可知其半抑制浓度IC50为51.31μM。本发明小分子多肽具有较强的ACE抑制活性,可用于降血压功能食品及药物开发。
实施例4
上述ACE抑制活性实验中,底物HHL分别配置不同浓度梯度:0.39,0.78,1.55和3.10mM。测定不同底物浓度下,十肽FSEYPPLGRF在50和100μg/mL时对ACE的抑制率。绘制Lineweaver-Burk双倒数图(图4),结果显示多肽FSEYPPLGRF对ACE的抑制类型属于非竞争性抑制。
实施例5
取原代人脐静脉内皮细胞(购买于All cells公司,产品编号H-001F-C),加入5mL内皮细胞完全培养液(含10%胎牛血清、生长因子、双抗,All cells公司产品编号:H-004),以1.0e5 cells/mL密度接入0.25%明胶包被后的T25细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2培养箱内培养,每2天换一次培养液,每4天传代一次。取3~5代细胞,培养至对数期后,用胰酶消化,以1.0e5 cells/mL密度加入96孔板,每孔100μL,每组6个复孔,边缘孔及未用孔以等量灭菌PBS填充。待培养至细胞长满孔底80%以上时,吸弃原培养液换以100μL无血清培养液培养12h,使细胞处于同一周期。之后各孔加入100μL不同浓度的十肽FSEYPPLGRF,对照组加入100μL无血清培养液继续培养,以100μL常见的ACE抑制药物卡托普利(浓度10e-5M)为阳性对照。于24h和48h时,每孔加入20μL MTT(5mg/mL),培养4h,吸弃孔中液体,加入150μLDMSO轻微震荡10min,用酶标仪测定570nm处吸光值。以无细胞培养液,加入等量MTT,4h后吸弃培养液,加入150μL DMSO作为调零孔。
细胞存活率(%)=实验组吸光值/对照组吸光值
从图5可见,十肽FSEYPPLGRF加入人脐静脉内皮细胞培养24h后低剂量组(150μg/mL)的细胞存活率与对照组无显著性差异。高剂量组(300μg/mL)细胞存活率为对照组的92.06±3.16%。培养48h后,十肽FSEYPPLGRF低剂量组与高剂量组和对照组无显著差异。而阳性对照卡托普利当浓度为10e-5M时,细胞培养24h和48h的存活率有极显著降低。可见与常用药物卡托普利相比,十肽FSEYPPLGRF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响较小,安全性更高。
实施例6
在本发明研究过程中,通过LC-MS/MS从实施例1中的酵母酶解物中鉴定了778条多肽。通过固相合成法合成了其中数条,利用实施例3的方法对这些多肽的ACE抑制活性进行研究,多肽在100μg/mL浓度时ACE抑制活性如图6所示。可以发现十肽FSEYPPLGRF对ACE的抑制活性显著,本发明的十肽FSEYPPLGRF是特别的,其效果是难以预料的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中新国际联合研究院
<120> 一种抑制血管紧张素转换酶的十肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 十肽氨基酸序列
<400> 1
Phe Ser Glu Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe
1 5 10
Claims (8)
1.一种具有ACE抑制活性的十肽,其特征在于:
其氨基酸序列为苯丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸。
2.权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽在制备降血压功能食品中的应用。
3.权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽在制备ACE抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽在制备降血压药物中的应用。
5.一种降血压功能食品,其特征在于:
含有权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽。
6.一种ACE抑制剂,其特征在于:
含有权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽。
7.一种降血压药物,其特征在于:
含有权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽。
8.一种制备权利要求1所述的具有ACE抑制活性的十肽的方法,其特征在于:
所述的具有ACE抑制活性的十肽通过固相合成制备得到。
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