CN111718927A - 一种提高核酸稳定性的保存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高核酸稳定性的保存液及其应用，本发明所述的保存液，包括10mM～500mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非离子表面活性剂、1mM～0.5MEDTA、10mM～500mM无机盐、0.1～20mg/ml山梨糖醇中的一种或几种。本发明所述的保存液不仅可以直接用于后续提取步骤，不需要离心去除，不仅不影响硅胶质膜和磁珠对核酸的吸附，且可以促进后续核酸提取时核酸对离心柱和磁珠的吸附作用，提高提取得率并节约时间。

Description

一种提高核酸稳定性的保存液及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核酸稳定性的保存液及其应用。

背景技术

微生物(microorganism)是存在于自然界的一群体形微小、结构简单的微小生物。微生物肉眼不可见，必须借助光学显微镜或电子显微镜进行放大才能观察到。微生物在自然界是广泛存在的，其中，有一部分微生物可以侵犯人体引起感染导致传染病，这类微生物被称为病原微生物。病原微生物包含朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒，其中，以细菌和病毒的危害性最大。

病原微生物侵入人体后，人体就是病原微生物生存的场所，医学上称为病原微生物的宿主。病原微生物在宿主中生长繁殖、释放毒性物质等引起机体不同程度的病理变化，这一过程称为感染。病原微生物感染宿主后，通过不断繁殖、变异和进化，增强自己的毒力或致病力，进而引发机体的免疫排斥反应，当超过机体自身正常生理承受范围，则表现出症状，引发疾病甚或是严重的传染和感染性疾病。由病原微生物引起的传染和感染性疾病是临床面临的最常见的疾病之一，约占常见疾病的50％。病原微生物因为繁殖快、核酸不稳定导致高度易变异，因而使得病原微生物呈现多样性；此外，随着人群结构的变化、环境污染以及药物滥用等因素的影响，使得病原微生物导致的疾病呈现复杂化的趋势，严重威胁人类健康。

目前，常用的针对病原微生物检测方法包括涂片镜检、生化反应、免疫检测、培养法、常规PCR法、qPCR、基因芯片技术、高通量测序(NGS)、质谱等技术；其中，基于核酸的检测，因为其高灵敏度、高准确率以及快速等特点，而成为确诊的金标准，包括上述介绍的、常规PCR法、qPCR、基因芯片技术、高通量测序(NGS)等方法。

核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类,已知核酸是一切生物体的遗传物质,在细胞主要存在于细胞核内,在病毒存在于病毒衣売内。核酸因为很容易被环境中存在的核酸酶分解，因此在一般的环境下能完整保存的时间很短；特别是RNA保存难度更大,一方面，因为RNA是单链，极其不稳定，另一方面，常规的实验环境中广泛存在RNA酶(RNase)，且Rnase非常稳定，难以去除。因此，如何从样品中得到高品质及完整的核酸一直是生物领域亟待解决的问题。

在核酸保存方面，美国Ambion公司(现为Thermo Fisher公司收购)开发了一种可保存完整细胞的溶液RNAlater，该产品由柠檬酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)与硫酸铵组成。RNAlater保存的核酸样品在37摄氏度下可稳定保存一天，不会明显降解。此外，胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍等)作为一种经典的蛋白变性剂，常用于核酸提取中的细胞裂解，因而，市场上有很多基于胍盐开发的核酸保存液。

在核酸提取方面，目前，传统方法是酚/氯仿有机溶剂抽提，硅胶膜吸附离心柱法以及兼容自动化平台广泛应用的磁珠法核酸提取方法。酚/氯仿提取的原理主要是苯酚使蛋白质变性，同时抑制了核酸酶的降解作用；氯仿可以制造分相，蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。此外，在提取过程中经常加入异戊醇促进分相，并通过降低表面张力，去减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，维持分相稳定。离心柱法采用的硅胶质膜经过修饰，表面带有大量的阴离子基团，在高盐低pH时，可以高效吸附核酸。磁珠法核酸提取采用的是超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体,通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸，而不吸附蛋白和其他杂质；在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附，从而达到快速分离纯化核酸的目的。目前，离心柱纯化法和磁珠纯化法因为其提取的纯度高、产量高，受人为操作因素影响小，可以兼容自动化(磁珠法)而得到广泛应用。

基于核酸的病原微生物检测的基础是核酸的安全保存和有效提取，最终核酸得率成为下游核酸研究能否成功的制约因素。

在核酸保存方面，美国Ambion公司开发的RNAlater类似的保存液在使用中，在核酸提取之前，必须离心去除上清后才可以进行后续实验。而市面上的基于胍盐的保存液同样存在诸多局限，因为胍盐成分的不稳定性,被氧化后结构发生变化,造成保存效果极其不稳定，容易造成产量低以及检测“假阴性”。在核酸提取方面，虽然离心柱法和磁珠法提取应用广泛，但是仅仅局限于大量样本和高完整度的样本，在针对病原微生物的微量样本进行提取时，往往受制于样本本身保存的质量，表现出得率低、重复性差的缺陷。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够提高核酸稳定性，同时与后续核酸提取兼容性好，提高核酸得率的保存液及其应用。本发明所述的保存液既能有效保存包括但不限于病原微生物样本在内的核酸不被降解，同时使用时不需要去除，可以完美兼容后续的核酸提取。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种提高核酸稳定性的保存液，包括10mM～500mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非离子表面活性剂、1mM～0.5M EDTA、10mM～500mM无机盐、0.1～20mg/ml山梨糖醇中的一种或几种。

在一些实施例中，本发明所述的保存液还包括0.1～10mg/ml聚二甲基硅氧烷。

在一些实施例中，本发明所述的保存液余量成分为水。

在一些实施例中，本发明所述的保存液中的非离子表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、洋地黄皂苷、IGEPALCA-630中的一种或多种。

在一些实施例中，本发明所述的保存液中的无机盐选自氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化铵(NH₄Cl)、硫酸钠(Na₂SO₄)、硫酸钾(K₂SO₄)、硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]中的一种或多种。

在一些实施例中，本发明所述的保存液，包括10mM～200mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非离子表面活性剂、0.1M～0.5M的EDTA、10mM～200mM无机盐、0.1～20mg/ml山梨糖醇和0.1～10mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种。

在一些实施例中，本发明所述的保存液，包括10mM～100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5～20mg/ml的非离子表面活性剂、0.1M～0.5M的EDTA、10mM～100mM无机盐、0.5～5mg/ml山梨糖醇和0.5～5mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种。

在一些实施例中，本发明所述的保存液，包括20mM～80mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5～15mg/ml的非离子表面活性剂、0.1M～0.4M的EDTA、20mM～50mM无机盐、0.5～2mg/ml山梨糖醇和0.5～2mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种。

在一些实施例中，本发明所述的保存液，包括40mM～60mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8～12mg/ml的非离子表面活性剂、0.2M～0.3M的EDTA、40mM～50mM无机盐、0.5～1.5mg/ml山梨糖醇和0.5～1.5mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种。

在一些实施例中，无机盐优选地使用氯化钾(KCl)和硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]组合；在一些更具体的实施例中，氯化钾(KCl)和硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]的摩尔比为(1～5)：1。

本发明还提供一种试剂盒，包含本发明所述的保存液，所述试剂盒包括或者不包括拭子或/和核酸提取试剂。

本发明所述的保存液与后续提取步骤的兼容性好，因此本发明所述试剂盒中如果包含核酸提取试剂，可以为现有技术常用的核酸提取试剂，包括但不限于离心柱法或磁珠法等对样本要求较高的提取试剂。

本发明还提供本发明所述的保存液在含有核酸的样品保存中的应用。

本发明所述的含有核酸的样品，可以为含有核酸的包括人以及各种动植物的组织样品，也可以为培养细胞、真菌、细菌、病毒等微生物或含有这些微生物的样品；人或动物样品包括但不限于唾液、鼻咽黏膜、下呼吸道分泌物、肝脏、脑、肺、脾脏、肾脏、心脏、肌肉、血液、粪便等；植物包括但不限于根、茎、叶等。

在一些实施例中，所述病毒或病毒样品为猪流行性腹泻病毒。

在一些实施例中，所述病毒或病毒样品为COVID-19。

在一些实施例中，本发明还提供一种具体的所述的保存液在含有核酸的样品保存中的应用，将含有核酸的样品加入保存液中，1～60℃保存；优选为4～56℃；更优选为4～37℃。

在一些实施例中，含有核酸的样品与保存液的体积比为1：(3～20)；或者1～100万细胞量/ml；在一些具体的实施例中，含有核酸的样品与保存液的体积比为1：(3～10)；或者30～70万细胞量/ml。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述的保存液，与后续核酸提取兼容性好，可以适用于各类核酸提取方法，包括适用于离心柱法或磁珠法等对样品规模和完整性具有一定要求的提取方法。

(2)本发明所述的保存液不仅可以直接用于后续提取步骤，不需要离心去除，不仅不影响硅胶质膜和磁珠对核酸的吸附，且可以促进后续核酸提取时核酸对离心柱和磁珠的吸附作用，提高提取得率并节约时间。

(3)本发明所述的保存液，可以快速裂解细胞，促进细胞和病原微生物的渗透，使保存液组分快速渗透进入细胞或病原微生物内部，，抑制核酸降解保持稳定；山梨糖醇的加入进一步提高核酸稳定性；聚二甲基硅氧烷则可以有效防止气泡破裂引物样本之间的污染，提升操作体验。

(4)本发明所述保存液适用温度范围更广，可以适用于1～60℃保存，可适用于不同温度环境下样品的保存，具有更重要的实用价值。

若无特别说明，本发明所用名词具有如下含义：

病原微生物：病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。

脱氧核糖核酸(DNA)：脱氧核糖核酸(英文DeoxyriboNucleic Acid，缩写为DNA)是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。

核糖核酸(RNA)：核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。

附图说明

图1为实施例1对应的核酸完整度检测；

图2为实施例2对应的保存液各处理组PEDV扩增曲线(4℃VS 56℃60min和120min)；

图3为实施例2对应的保存液各处理组PEDV扩增曲线(4℃VS 37℃3d 5d 7d)；

图4为实施例2对应的Hank’s溶液各处理组PEDV扩增曲线(4℃VS 56℃60min和120min)；

图5为实施例2对应的Hank’s溶液各处理组PEDV扩增曲线(4℃VS 37℃3d 5d 7d)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例所述化学品来自中国医药集团有限公司(国药集团)或是西格玛奥德里奇Sigma-Aldrich。

若无特别说明，以下实施例所用的样本对照保存液，为Hank’s溶液：8g/L NaCl，0.4g/L KCl，0.14g/L CaCl₂，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.048g/L Na₂HPO₄，0.06g/L KH₂PO₄,0.35g/L NaHCO₃,0.01g/L酚红。

实施例1：

本实施例以正常培养的HEK293细胞作为模型研究保存液对核酸保存和促进提取的效果。本实施例中使用的核酸提取试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司磁珠法核酸提取试剂，货号RM101。

本实施例中保存液配比为：50mM Tris、10mg/ml Tween-20、0.2M EDTA、30mM KCl、15mM(NH₄)₂SO₄、1mg/ml山梨糖醇和1mg/ml硅油，余量为水。具体实验流程如下：

1、样本采集和保存：

收集新鲜培养的HEK293细胞；进行细胞活性检测，显示细胞活性大于95％；将收集的细胞进行计数，按照50万细胞量每份分别加入1ml本实施例保存液或常规的样本对照保存液(Hank’s溶液)，旋紧管盖，轻轻涡旋离散细胞；

2.样本处理

针对本实施例保存液和Hank’s溶液分别设置4℃保存(作为对照)，56℃烘箱加热30min和120min，37℃烘箱加热3天、5天、7天不同的处理组。

3.核酸提取(采用Vazyme#RM101)

3.1在1.5ml Nuclease-free低吸附EP管(自备)中加入上述不同处理的样本，然后加入20μl蛋白酶K，轻微涡旋或上下颠倒混匀后加入20μl磁珠和600μl裂解液，涡旋震荡混匀15sec，室温裂解5min，期间上下颠倒混匀两次。

3.2瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置1min，用移液器移除上清。

3.3洗涤：将上述样品取下磁力架，加入700μl洗涤液，涡旋15sec混匀，瞬时离心，将EP管放上磁力架，静置1min，除尽上清。

3.4漂洗：将上述样品取下磁力架，加入700μl漂洗液，涡旋15sec混匀，瞬时离心，将EP管放上磁力架，静置1min，除尽上清。

3.5瞬时离心后重新放上磁力架，移尽残留上清。开盖室温晾置3～5min，直至磁珠表面无反光。

注：为保证核酸的纯度，漂洗液要去除干净；同时，磁珠过分干燥(龟裂)会影响最终产量。

3.6加入50μl洗脱液，温和混匀15sec，室温静置3min，期间震荡混匀2次。瞬时离心至EP管底后将样品重新置于磁力架上，静置1min后，吸取上清至新的Nuclease-free离心管(自备)中，用于后续检测。

4.核酸提取产量完整度检测

4.1细胞核酸浓度以及纯度OneDrop检测

用洗脱液清洗检测探头并校正，分别取1μL样本按OneDrop仪的操作说明进行RNA浓度，DNA浓度以及纯度检测，结果如表1所示。

4.2细胞基因组DNA与RNA完整性检测

4.2.1使用1X TAE配制1.2％琼脂糖凝胶；

4.2.2分别取5μL提取产物，加入1μL 10×DNA Loading buffer(Vazyme#P022)以及4μL RNase-free H₂O，涡旋混匀后，放置PCR仪中72℃，2min变性处理；

4.2.3取5μL DL15000 Marker(Vazyme#MD103)一起点样；

4.2.4于电泳仪中进行琼脂糖凝胶电泳，220V，10-12min；

4.2.5凝胶成像仪拍照，结果如图1所示。

表1细胞核酸浓度以及纯度Onedrop检测

根据表1可知，无论是DNA还是RNA，在核酸提取的产量方面，在本实施例配置的保存液中保存的样本经过不同的处理，产量均显著高于Hank’s溶液保存组；在4度提取对照组，经过保存液保存的核酸产量也要高于Hank’s溶液保存组，说明该保存液具有提升核酸提取效率的作用。

根据图1分析核酸完整性可知，在RNA的完整度方面，使用本案例配置的保存液中保存的样本，在经过不同的处理后始终保持核酸的完整，电泳条带未发生弥散；而使用Hank’s溶液保存的样品在经过56℃烘箱加热60min和37℃烘箱加热1天时即出现明显的降解，在随后更长的加压时间上表现更差。

上述结果共同说明本案例所述的核酸保存液可以有效保护细胞核酸不被降解，且能促进磁珠法核酸提取的得率。

实施例2：

本实施例用于保存唾液样本中病原微生物。本实施例采用的猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diaherra virus,PEDV)活疫苗(购自武汉科前，兽药生字170041133)，该病毒属于冠状病毒科α冠状病毒属,是一种单股正链RNA病毒,能够引起猪流行性腹泻(Procine epidemic diaherra,PED)，该病毒疫苗可有效模拟临床上RNA病毒类型的病原微生物。本实施例中使用的核酸提取试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司离心柱核酸提取试剂，货号RC311-C1。

本实施例中保存液配比为：50mM Tris、10mg/ml NP-40、0.3M EDTA、30mM KCl、15mM(NH₄)₂SO₄、1mg/ml山梨糖醇和1mg/ml硅油，余量为水。具体实验流程如下：

1、样本采集和与模型构建：

1.1猪流行性腹泻(PEDV)病毒模型制备

采购来自武汉科前生物股份有限公司的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(WH-1R株+AJ1102-R株)(武汉科前，兽药生字170041133)，10头份/瓶，病毒含量≥10⁵TCID₅₀，每瓶采用10ml生理盐水(0.9％NaCl)充分溶解；

1.2深咳痰液样本制备

按照规范操作，深吸气后用力咳出呼吸道深部痰液，标本量约3ml；涡旋混匀后，分成两部分，每部分吸取1ml痰液，其中一份加入5ml本实施例配置的保存液，另一份加入5mlHank’s溶液；分别加入6ul前一步稀释好的PEDV病毒疫苗。

2.样本处理

分装上述样本，针对保存液和Hank’s溶液分别设置4℃保存(作为对照)，56℃烘箱加热60min和120min，37℃烘箱加热3天、5天、7天不同的处理组。

3.核酸提取(采用Vazyme#RC311-C1)

3.1在1.5ml RNase-free离心管(自备)中加入500μl裂解液；

3.2加入200μl上述不同处理的样品，涡旋混匀。

3.3将吸附柱置于2ml收集管中，转移上述混合液至吸附柱中，12,000×g离心1min。

3.4弃滤液，将吸附柱装回2ml收集管中，加入600μl漂洗液12,000×g离心30sec，弃滤液。

3.5重复步骤3.4一次。

3.6将吸附柱装回收集管中，12,000×g空柱离心2min。

3.7将吸附柱转移至新的1.5ml收集管(试剂盒提供)中，加入50μl洗脱液至吸附柱的膜中央，室温放置1min。12,000×g离心1min。

3.8弃去吸附柱，所得到的DNA/RNA可直接用于后续检测。

4.提取微量样本RNA检测(采用Vazyme#Q222-CN)

4.1在RNase-free离心管中配制如下表2混合液(以ABI StepOnePlus^TM为测试机型)

【表2】

4.2按下列表3条件进行一步法qRT-PCR反应

【表3】

实验采用的引物和探针序列如表4所示，实验结果如表5和图2-5所示。

表4针对PEDV设计特异性的引物和探针

根据表5和图2-5的结果可知，通过针对PEDV设计特异性的引物和探针，然后采用不同分组处理的核酸进行检测，可以发现，本案例保存液样品组在经过多种温度处理后，与4℃保存相比△CT相差均在0.5以内；而Hank’s溶液组在经过37℃烘箱加热之后，与对应的4℃保存相比△CT相差距随时间延长而显著增加，均大于0.5。上述结果共同说明本案例所述的核酸保存液可以有效抑制病毒核酸的降解。

表5实施例2各处理组针对对应的对照组的△CT差值

Claims (10)

1.一种提高核酸稳定性的保存液，其特征在于，包括10mM～500mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非离子表面活性剂、1mM～0.5M EDTA、10mM～500mM无机盐、0.1～20mg/ml山梨糖醇中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的保存液还包括0.1～10mg/ml聚二甲基硅氧烷。

3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的保存液余量成分为水。

4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的保存液中的非离子表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、洋地黄皂苷、IGEPALCA-630中的一种或多种；无机盐选自氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化铵(NH₄Cl)、硫酸钠(Na₂SO₄)、硫酸钾(K₂SO₄)、硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]中的一种或多种；优选的，无机盐使用氯化钾和硫酸铵的组合；更优选的，氯化钾和硫酸铵的摩尔比为(1～5)：1。

5.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括10mM～200mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非离子表面活性剂、0.1M～0.5M的EDTA、10mM～200mM无机盐、0.1～20mg/ml山梨糖醇和0.1～10mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种；优选的，包括10mM～100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5～20mg/ml的非离子表面活性剂、0.1M～0.5M的EDTA、10mM～100mM无机盐、0.5～5mg/ml山梨糖醇和0.5～5mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种；进一步优选的，包括20mM～80mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5～15mg/ml的非离子表面活性剂、0.1M～0.4M的EDTA、20mM～50mM无机盐、0.5～2mg/ml山梨糖醇和0.5～2mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种；最优选的，包括40mM～60mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8～12mg/ml的非离子表面活性剂、0.2M～0.3M的EDTA、40mM～50mM无机盐、0.5～1.5mg/ml山梨糖醇和0.5～1.5mg/ml聚二甲基硅氧烷中的一种或几种。

6.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述的保存液；优选的，所述试剂盒包括或者不包括拭子或/和核酸提取试剂。

7.权利要求1～5任一项所述的保存液在含有核酸的样品保存中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的含有核酸的样品，为含有核酸的包括人以及各种动植物的组织样品，或为培养细胞、真菌、细菌、病毒样品；优选的，所述病毒样品为猪流行性腹泻病毒或COVID-19。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将含有核酸的样品加入保存液中，1～60℃保存；优选为4～56℃；更优选为4～37℃。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，含有核酸的样品与保存液的体积比为1：(3～20)；或者1～100万细胞量/ml；优选的，含有核酸的样品与保存液的体积比为1：(3～10)；或者30～70万细胞量/ml。

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