CN101085799A

CN101085799A - 核酸提取方法

Info

Publication number: CN101085799A
Application number: CNA2007101061638A
Authority: CN
Inventors: 金原秀行
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2007-12-12
Also published as: EP1870462A1; JP2007325562A; US20080033161A1

Abstract

一种核酸提取方法，该方法包括以下步骤：(a)将生物材料与裂解液接触从而溶出核酸；(b)将水溶性有机溶剂加入到所得到的含有溶解的核酸的溶液中从而制备裂解物溶液；(c)将裂解物溶液与固体材料接触从而使得核酸被吸附到固体材料上；(d)用洗涤液洗掉固体材料上的杂质，其中，实施两次或多次洗涤程序，并且在两次或多次洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的至少一次洗涤程序中所用的洗涤液所形成的液面高于第一洗涤程序中所用的洗涤液所形成的液面；以及(e)用回收液使吸附到固体材料上的核酸解吸附。

Description

核酸提取方法

技术领域

本发明涉及从生物材料中提取核酸的方法。

背景技术

核酸提取方法宽泛地分为以下几种：包括在溶液状态下提取核酸的步骤的方法，和使用固体材料提取核酸的方法，其中后者包括以下过程：通过使含有核酸的溶液与固体材料接触而使核酸吸附到固体材料上，洗掉多余的物质，随后使所需核酸从固体材料上解吸附。

传统上大多使用包括在溶液状态下提取核酸的步骤的核酸提取方法，该方法用乙醇使核酸沉淀，并使所得到的核酸缠绕在玻璃棒上。此类方法非常简单，但不利的是，此类方法在回收量和纯度方面产生了严重的问题。能够克服这些问题的方法包括AGPC(酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿)法和利用RNA比DNA具有更高悬浮密度的胍-氯化铯沉降法，其中所述的AGPC法包括以下过程：加入硫氰酸胍使细胞裂解并在酸性条件下用苯酚除去共存的DNA从而回收RNA，如文献P.D.Siebert，A.Chenchik，Nucleic Acids Res.，21，2019-2020(1993)中所报导的那样。然而这些方法具有许多缺点，例如使用有害的有机化合物(例如苯酚和氯仿)以及为了进行高精确度的提取而需要繁杂的程序以及熟练的技术。

作为改善上述缺点的方法，人们研发了这样一种方法：该方法使用能够抑制具有核酸降解作用的酶(例如核酸酶)的活性的离液盐(例如硫氰酸胍)使细胞裂解，然后将乙醇加入到所得到的溶液中，从而制备出裂解物溶液，使裂解物溶液与诸如二氧化硅之类的固体材料接触以便吸附核酸，并且在洗涤步骤后使核酸解吸附(R.Boom等人，Journal of Clinical Micobiology，28，495-503(1990))。

为了提高反应效率和洗涤效率，人们还研发出了用磁性二氧化硅颗粒来提取核酸的方法作为可供选用的另一种方法。人们还研发出了使用多孔膜来提取核酸的其它方法，从而可通过这种简单的程序在很短的时间内获得高纯度的核酸。

本发明人还研发出了这样一种核酸分离纯化方法，该方法中使用较薄的多孔膜作为将固体物质吸附在其上的材料。此方法更简单，并且具有优异的分离特征。在大量的生物材料被用作样品的情况下，例如在欲处理较多量的细胞的情况下，发现各种溶液穿过多孔膜明显需要更长的时间。本发明人对以下方面进行了各种研究，所述方面包括：分散液(尤其是Bis-Tris缓冲液)、表面活性剂的种类和浓度、离液盐的类型和浓度、加入裂解液后的移液程序和搅拌程序、加入水溶性有机溶剂后的搅拌程序、水溶性有机溶剂的加入次数、均化方法和多孔膜的孔径。由此，本发明人研发出了通过性得到提高的方法，即能够处理较多量的细胞的方法(JP-A-2003-128691，WO 2007/037509和JP-A-2006-211973)。

发明概述

本发明的一个目的是通过尽可能减少核酸提取液中的杂质来获得高纯度的核酸。本发明的另一个目的是提供这样一种方法，该方法能够通过缩短洗涤液的穿过时间而减少在核酸提取过程中发生的堵塞，因此该方法由于通过性的提高而能够处理较大体积的样品(例如较多量的细胞)，从而缩短了提取时间。

本发明的另一个目的是提供使用固相的核酸提取方法以及提供适合实施该方法的核酸提取单元，所述核酸可以以大批量并且具有基本稳定分离性能的方式进行生产。本发明的又一个目的是提供一种以简便快捷的方式提取核酸的小型装置，而无需使用任何特殊的技术或繁杂的程序、或任何特定的装置。

根据本发明，核酸的分离和纯化是通过裂解生物材料，并将该生物材料中所含的核酸片段与固定在容器(例如柱子)内的固体材料(例如多孔膜)接触而进行的。为了减少所得到的含有经提取的核酸的回收液中的杂质，使用了洗涤液。本发明人发现，通过检测洗涤液的体积可以实现上述目的。换言之，本发明包括以下的内容。

(1)一种核酸提取方法，该方法包括以下步骤：

(a)将生物材料与裂解液接触、从而使该生物材料裂解、进而溶出核酸的步骤；

(b)将水溶性有机溶剂加入到由所述的步骤(a)得到的含有溶解的核酸的溶液中从而制备裂解物溶液的步骤；

(c)将由所述的步骤(b)得到的裂解物溶液与固体材料接触从而使裂解物溶液中的核酸被吸附到所述的固体材料上的步骤；

(d)用洗涤液洗掉固体材料上除了作为提取对象的核酸以外的其它杂质的洗涤步骤，其中，实施两次或多次洗涤程序，并且在该两次或多次洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的至少一次洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面高于所述的第一洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面；以及

(e)用回收液使吸附到所述固体材料上的核酸解吸附的提取步骤。

(2)如上述(1)所述的核酸提取方法，该方法还包括在将所述裂解液加入到所述生物材料中之前，用分散液使所述生物材料分散的步骤。

(3)如上述(1)或(2)所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的裂解液含有浓度为0.1摩尔/1到10摩尔/1的离液盐。

(4)如上述(1)到(3)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的裂解液含有小于或等于50体积％的水溶性有机溶剂。

(5)如上述(4)所述的核酸提取方法，

其中所述裂解液中所含的水溶性有机溶剂为以下物质中的一种：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、或它们的混合物。

(6)如上述(1)到(5)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的裂解液含有0.001质量％到30质量％的表面活性剂。

(7)如上述(1)到(6)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的裂解液含有缓冲液。

(8)如上述(1)到(7)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的裂解液含有消泡剂。

(9)如上述(1)到(8)中任意一项所述的核酸提取方法，该方法还包括在所述的步骤(a)之后加入含有0.001质量％到30质量％的表面活性剂的溶液的步骤。

(10)如上述(1)到(9)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中在所述的步骤(b)中，将所述的水溶性有机溶剂加入到含有所述核酸的所述裂解液中，以便将所述的水溶性有机溶剂的体积调节到10体积％到60体积％，从而制备出裂解物溶液。

(11)如上述(1)到(10)中任意一项所述的核酸提取方法，该方法还包括在所述的步骤(a)和/或(b)之后，实施机械式往复运动的步骤。

(12)如上述(1)到(11)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(c)中的固体材料的表面具有羟基。

(13)如上述(1)到(12)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(c)中使用容器，其中，所述的固体材料被容装在柱子内。

(14)如上述(1)到(13)中任意一项所述的核酸提取方法，该方法还包括在所述的步骤(c)中，将所述的裂解物溶液注入两个或多个容器内以进行提取。

(15)如上述(1)到(14)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中在所述的步骤(c)中，在将所述的裂解物溶液注入到所述的柱子中的过程中，没有将所述裂解物溶液中的泡沫引入到所述的柱子中。

(16)如上述(1)到(15)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中在所述的步骤(c)中，在将所述的裂解物溶液注入到所述的柱子中的过程中，除了所述的裂解物溶液所要浸渍的所述柱子的内壁外，该柱子的其它内壁不附着有所述的裂解物溶液。

(17)如上述(1)到(16)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中将两种含有不同浓度的水溶性有机溶剂的洗涤液用作所述步骤(d)中的洗涤液。

(18)如上述(1)到(17)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(d)中的洗涤液含有盐。

(19)如上述(1)到(18)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述的盐为氯化钠。

(20)如上述(1)到(19)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(d)中的洗涤液含有消泡剂。

(21)如上述(1)到(20)中任意一项所述的核酸提取方法，该方法还包括通过压力变化或离心使所述步骤(c)、(d)或(e)中的裂解物溶液、洗涤液和回收液中的至少一种与固体材料接触的步骤。

(22)一种实施上述(1)到(21)中任意一项所述的核酸提取方法的成套用具，该成套用具包含：至少两个容器、分散液、裂解液、洗涤液、回收液和用于将核酸吸附于其上的固体材料。

(23)如上述(1)到(21)中任意一项所述的核酸提取方法，

其中在所述的步骤(d)中，在两次或多次洗涤程序中除了所述的第一洗涤程序以外的至少一次洗涤程序中所用的洗涤液的体积大于所述第一洗涤程序中所用的洗涤液的体积。

附图简要说明

图1示出在所加NaCl的浓度改变时，穿过时间与回收量间的关系；

图2示出在RNA提取过程中加入痕量的低浓度乙醇的效果。

发明详述

本发明涵盖日本专利申请No.2005-282130、2005-028991、2006-027383、2006-027495、2005-249694、2005-082283、2005-080040、2005-059057、2005-029177、2005-027918和2004-066801中所描述的方法。

在使用固体材料提取核酸的情况下，通过使裂解物溶液穿过固体材料、用洗涤液洗涤该固体材料、并用回收液使核酸从所述固体材料上解吸附来回收核酸。为了尽可能消除影响后续步骤(例如基因检测)的可能性，所提取的核酸优选具有高纯度。例如，裂解液中含有离液盐(例如硫氰酸胍)会影响酶反应等。关于尽可能减少来自样品和裂解液的各种此类杂质的方法，本发明人将其注意力集中在使用洗涤液的洗涤操作上，并对其进行研究。由此，完成本发明。

根据本发明的核酸提取方法包括至少以下(a)到(e)的步骤：

(a)将生物材料与裂解液接触从而使生物材料裂解并使该生物材料中含有的核酸溶出的步骤(下文称为“裂解步骤”)；

(b)加入水溶性有机溶剂从而制备裂解物溶液的步骤(下文称为“裂解物步骤”)；

(c)将裂解物溶液与固体材料接触从而使裂解物溶液中的核酸被吸附到固体材料上的步骤(下文称为“吸附步骤”)；

(d)用洗涤液洗涤固体材料的洗涤步骤(下文称为“洗涤步骤”)；和

(e)用回收液使核酸从固体材料上解吸附、然后从柱子容器排出核酸的步骤(下文称为“回收步骤”)。

1.裂解步骤(a)

根据本发明的核酸提取方法，优选的是，在步骤(a)中，当由生物材料提取核酸时，首先将生物材料分散在合适的分散液中。具体而言，在使用成团细胞(pelletized cell)的情况下，从改善成团细胞的分散性来说优选使用分散液。通过使用分散液可以使固态或接近固态的生物材料分散，从而实现以下目的：在加入裂解液后，使被裂解的生物材料达到均匀；由于均匀化而使回收量和穿过时间达到稳定；以及缩短裂解物溶液、洗涤液和回收液的穿过时间。

可以使用任何分散液，只要该分散液能够在通过渗透压差使生物材料膨胀、破裂和收缩的同时尽可能地分散生物材料即可。优选的是，此类分散液包括(例如)缓冲液。在缓冲液中，优选生物化学用的pH缓冲液，尤其是Good缓冲液。

本发明人对此进行了研究。结果，本发明人指出，在Good缓冲液中，Bis-Tris缓冲液(N，N-双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)可以在短时间段内使所述固体材料以发生堵塞的可能性较低的方式穿过。因此，优选使用Bis-Tris缓冲液。除Bis-Tris缓冲液外，Good缓冲液包括(例如)MES(2-吗啉代乙磺酸)、HEPES (2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪基-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)和TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。

对分散液的体积没有特别限定。但是，因为随着细胞数量的增多，生物材料的体积就越大，所以，优选的是增加分散液的体积，然后使用该分散液。然而，分散液体积的增加引起具有裂解细胞作用和抑制核酸酶活性作用的离液盐的浓度降低，并引起由于分散液的体积增加而使其穿过时间延长。这些表明，根据本发明所用的分散液的体积优选为裂解物溶液体积的80体积％或更少、更优选为裂解物溶液体积的50体积％或更少、最优选为裂解物溶液体积的20体积％或更少。

优选的是，以细胞不会由于渗透压的作用而全部或部***解的浓度使用分散液。浓度太大或太小都不是优选的。此外，分散液的浓度影响裂解物溶液和洗涤液的穿过时间。在将体积为30μL的Bis-Tris缓冲液(pH 6.5)用作分散液情况下，较低浓度的分散液会使裂解物溶液或洗涤液的穿过时间延长。较高浓度的分散液会使细胞部***解，以致使细胞内的核酸或蛋白质被溶出。由此，核酸被溶解的核酸酶等分解，从而导致提取后核酸的回收量下降的可能性。当核酸回收量降低时，相对于核酸的杂质量增加。因此提出，根据本发明的核酸提取方法所用的分散液的浓度为0.01摩尔/1或更高到10摩尔/1或更低、优选为0.1摩尔/1或更高到1摩尔/1或更低。

在制备成团细胞的情况下，应尽可能避免用PBS来替换Bis-Tris缓冲液，或应尽可能避免在加有Bis-Tris缓冲液的成团细胞中使用PBS，以便显著地缩短裂解物溶液或洗涤液的穿过时间。因而，在除去引起穿过时间延长的分散液(例如PBS)之后，符合要求的是可加入另一种分散液来再次分散细胞。另外，符合要求的是在细胞团内残留的PBS的量极少并且PBS以原样保留在细胞团中的条件下加入所需体积的Bis-Tris缓冲液。当穿过时间不是问题时，不需要使用任何分散液。此外，加入分散液后，可以通过轻扣来有效地分散细胞。可供选用的方式是，通过移液抽吸可更有效地分散细胞。另外，就可操作性而言，优选的是在这些处理之前将冷冻的细胞团解冻。

当在平板(例如Petri培养皿)上培养细胞时，可以不需要使用分散液就进行上述的核酸提取。优选的是，首先除去Petri培养皿上的培养液。可在除去培养液后将裂解液保持原样适当地加入到Petri培养皿上。从通过性的角度考虑，在除去培养液后用洗涤液(例如PBS)漂洗细胞。此外，优选的是，减少提取的核酸内来自样品的杂质。需要进行这些操作是因为通过洗涤可以除去胞外基质等。

根据本发明的核酸提取方法，在步骤(a)中裂解生物材料。同时，将生物材料与裂解液接触，以溶出生物材料中所含的核酸。优选的是，裂解液含有离液盐。离液盐包括(例如)(但不特别限定于)已知的离液盐，其包括(例如)：胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾、脲、溴化钠、溴化钾、溴化钙、溴化铵、高氯酸钠、硫氰酸钠、硫氰酸钾、异硫氰酸铵、氯化钠、氯化钾和氯化铵。在它们之中，胍盐是优选的。胍盐包括(例如)：氯化胍、异硫氰酸胍和胍的硫氰酸盐(硫氰酸胍)。在它们之中，氯化胍和胍的硫氰酸盐是优选。这些盐可以单独使用，或以多种此类的盐的组合方式使用。

裂解液中离液盐的浓度可以为任何浓度而没有特别限定，只要细胞在该浓度下能被充***解并且所制备的裂解物溶液以及洗涤液在该浓度下能在短时间内穿过即可。当离液盐的浓度太低时，虽然可以缩短穿过时间，但是，由于生物材料的不充***解而使提取后核酸的回收量显著降低。或者，当离液盐的浓度太高时，在裂解液的贮存过程中，离液盐在低温下析出。当提取后核酸的回收量降低时，提取液中杂质的量相对于核酸增加。由此，裂解液中离液盐的浓度优选为0.1摩尔/1到10摩尔/1、更优选为0.5摩尔/1到5摩尔/1或更低、最优选为3摩尔/1到4.5摩尔/1或更低。

裂解液优选含有核酸稳定剂。本文中，术语“核酸稳定剂”是指能够使核酸稳定地存在于样品中的试剂。核酸稳定剂是能够使核酸本身稳定存在的试剂，此外，核酸稳定剂包括通过降低或完全抑制核酸降解酶(例如核酸酶)的核酸降解作用而起到防止核酸的不稳定改变(例如分解)的试剂。优选的是，核酸稳定剂与选自离液盐、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂中的任何一种或多种共存。

作为具有使核酸酶活性失活的作用的核酸稳定剂，可使用通常被用作还原剂的化合物。此类还原剂包括(例如)：氢；氢化物，如碘化氢、硫化氢、氢化铝锂和硼氢化钠；高正电性金属，如碱金属、镁、钙、铝和锌，或它们的汞合金；醛类、糖类、甲酸和草酸的有机氧化物；以及巯基化合物。在这些物质当中，巯基化合物是优选的。巯基化合物包括(例如)：N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇和烷基硫醇。巯基化合物可以单独使用或以多种此类的巯基化合物的组合方式使用。在将2-巯基乙醇用作核酸稳定剂的情况下，其浓度越高，穿过时间越短。然而，较高浓度的2-巯基乙醇会使工作环境恶化。

由此，核酸稳定剂的浓度优选为0.01质量％到20质量％、更优选0.03质量％到15质量％。在将巯基化合物用作核酸稳定剂的情况下，裂解液中巯基化合物的浓度优选为0.01质量％到20质量％、更优选为0.05质量％到15质量％、最优选为0.05质量％到5质量％。(在本说明书中，质量比相当于重量比。)

本发明人发现，通过将表面活性剂加入到裂解液中可以缩短裂解物溶液的穿过时间和洗涤液的穿过时间。此外，表面活性剂可以很好地防止由于使用细胞数低的生物材料而引起的核酸回收量的降低。这种作用是显著的，当裂解物溶液中水溶性有机溶剂的浓度较低时尤其如此。作为上述情况的例子，有时可以减小水溶性有机溶剂的浓度，以便缩短裂解物溶液或洗涤液的穿过时间。在那种情况下，虽然可以缩短穿过时间，但是可能也降低了回收量。当回收量降低时，提取液内杂质的量相对于其中的核酸的量增加，从而在将提取后所得的核酸用于基因检测时，会不利地产生潜在性的问题。因此，加入表面活性剂可以提高被降低的回收量。表面活性剂包括(例如)：非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性表面活性剂。非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂是优选的。

非离子型表面活性剂包括：聚氧化亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧化亚乙基烷基醚类表面活性剂和脂肪酸烷醇酰胺。聚氧化亚乙基烷基醚类表面活性剂是更优选的。在聚氧化亚乙基(POE)烷基醚类表面活性剂中，更优选的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸醚、POE脱水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE乙炔二醇(acetylene glycol)。

阳离子型表面活性剂包括：溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶。

本发明人对表面活性剂的浓度进行了研究。结果，本发明人发现较高浓度的表面活性剂缩短了裂解物溶液的穿过时间和洗涤液的穿过时间。当表面活性剂的浓度过高时，回收的核酸的量根据离液盐的种类以及泡沫的产生情况而降低。由此，根据本发明的核酸提取方法，裂解液中表面活性剂的浓度优选为0.05质量％到30质量％、更优选为0.1质量％到7.5质量％。

另外，由于使用表面活性剂，裂解物溶液容易产生泡沫。由此，就易于操作而言，不一定必须使用任何表面活性剂，只要在完全没有使用任何表面活性剂的情况下可以获得充分的性能即可。否则，消泡剂可以与表面活性剂一起使用。通过使用消泡剂，可以在裂解的细胞液或裂解物溶液的制备过程中，抑制泡沫产生，从而使可操作性得到改善。此外，可预计的是，抑制泡沫产生可以使搅拌效率提高，从而缩短裂解物溶液、洗涤液或回收液的穿过时间，并且还提高回收量。另外，在将裂解物溶液引入柱子的过程中所形成的泡沫的量的减少会抑制由于柱子内存留的泡沫而导致的回收液的纯度降低，从而得到高纯度的核酸。

即使在不使用表面活性剂时，消泡剂也是有效的。换言之，即使在不含有表面活性剂时，生物材料有时也可以是泡沫产生源。通过使用消泡剂，可以降低产生泡沫的可能性。

消泡剂包括(例如)：有机硅类消泡剂(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物等)、醇类消泡剂(例如，乙炔二醇、庚醇、乙基己醇、较高级的醇和聚氧化亚烷基二醇等)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇等)、油类和脂肪类消泡剂(例如，动物油和植物油等)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸和棕榈酸等)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙等)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯等)、磷酸盐酯类消泡剂(例如，辛醇磷酸钠等)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺等)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺等)和其它消泡剂(例如，硫酸铁和矾土等)。这些消泡剂可以单独使用或者以多种此类消泡剂的组合方式使用。特别优选使用的是两种成分(即，有机硅类消泡剂和醇类消泡剂)的组合物。根据本发明的核酸提取方法，裂解液中此类消泡剂的浓度优选为0.1质量％到10质量％。

根据本发明的核酸提取方法，在步骤(a)中应将水溶性有机溶剂混合在裂解液中，以缩短裂解物溶液或洗涤液的穿过时间。这种效果对洗涤液的穿过时间是尤其明显的。此外，单独的洗脱步骤更容易将核酸从提取膜上洗脱下来。在步骤(a)中，裂解液中水溶性有机溶剂的浓度优选为70体积％或更小、尤其优选为50体积％或更小、最优选为20体积％或更小。

水溶性有机溶剂的种类包括(例如)：丙酮、醇类和二甲基甲酰胺。在它们之中，醇类是优选的。醇可以是伯醇、仲醇和叔醇。特别的是，优选使用甲醇、乙醇、丙醇及其异构体和丁醇及其异构体。在它们之中，从减小环境负担和毒性的角度考虑，乙醇是尤其优选的。这些水溶性有机溶剂可以单独使用或者以多种此类的水溶性有机溶剂的组合方式使用。

根据本发明的核酸提取方法，适宜的是可以不加入任何水溶性有机溶剂，只要裂解物溶液或洗涤液的穿过速度足够快即可。作为此类情况的例子，可以举出处理少量细胞的情况。

此外，优选的是，在步骤(a)中加入裂解液后，实施机械式往复运动。机械式往复运动包括(例如)移液程序。在处理大量细胞的情况下，进行移液抽吸是尤其有效的。就可操作性而言，优选的是，用其中含有裂解液的移液管进行移液抽吸，同时加入裂解液。

优选的是，通过搅拌程序来处理经过移液程序之后的由生物材料制备的裂解物溶液或通过裂解生物材料而制备的裂解物溶液。较长时间的搅拌会缩短裂解物溶液的穿过时间或洗涤液的穿过时间，从而使回收的核酸的量增加并使回收的核酸的量稳定。提取后，回收的核酸的量的增加减少了相对于核酸的量的杂质的量。

可以在加入裂解液之前和之后、制备裂解物溶液之后或任何所述步骤中将生物材料均化。通过均化处理，可以粉碎或碎化延长穿过时间的组分(例如引起堵塞的物质)，从而克服堵塞并缩短穿过时间。可通过(例如)超声波处理、使用尖锐的突出物对材料进行处理、高速搅拌处理、从微孔隙进行挤出处理和移液处理，或使用玻璃珠、不锈钢珠和氧化锆珠子的处理来进行均化处理。

均化操作包括(但不限于)任何通用的操作。其一个例子优选为使用搅拌器在30rpm到3000rpm的条件下混合1秒到3分钟。通过这种方式，可以优选地增加最终提取的核酸的回收量，同时可缩短穿过时间。此外，可以提高提取后核酸的纯度。例如，在提取RNA的情况下，基因组DNA被分解，使得进入提取液中的基因组DNA的污染被极大地减少。

2.裂解物步骤(b)

根据本发明的核酸提取方法，将水溶性有机溶剂引入到通过裂解生物材料而溶出的核酸溶液(如步骤(a)中所示的方式制备)中，然后将得到的溶液与具有核酸吸附能力的固体材料(例如表面上具有羟基的固体材料)接触。通过此程序，样品溶液中的核酸被吸附到表面具有羟基的有机聚合物上或被捕获和吸附到过滤器的表面上或多孔膜的孔中。

优选的是，水溶性有机溶剂包括(例如)(但不限于)醇类。醇类包括伯醇、仲醇和叔醇中的任何一种，优选为甲醇、乙醇、丙醇或其异构体和丁醇或其异构体。这些水溶性有机溶剂可以单独使用或者以多种此类水溶性有机溶剂的组合方式使用。乙醇是尤其优选的水溶性有机溶剂。

当水溶性有机溶剂的浓度较低时，回收的核酸的量减少。这可能是由于欲保留在膜上的核酸被转移到了洗脱溶液的一侧而没有结合到膜上，从而使得回收的核酸的量减少。当水溶性有机溶剂的浓度较高时，溶液(例如裂解物溶液和洗涤液)容易穿过，但是回收的核酸的量减少。当回收的核酸的量减少时，杂质的量相对于提取后核酸的量增加，使得很难得到高纯度的核酸。基于制备裂解物溶液时的浓度情况，步骤(b)中水溶性有机溶剂的浓度优选为10体积％到60体积％、尤其优选20体积％到40体积％。

根据本发明的核酸提取方法，在步骤(b)中，在将水溶性有机溶剂引入到通过裂解生物材料而溶出的核酸溶液(如步骤(a)中所示的方式制备)中之后，优选进行至少一次机械式往复运动，该机械式往复运动包括(例如)移液程序和/或搅拌程序。符合要求的是，可以进行单一一次的搅拌程序。然而，可以进行两次搅拌程序，其中，通过第一次搅拌程序独立搅拌各样品，而通过第二次搅拌程序集中搅拌样品。两次搅拌程序对大量的样品而言是尤其有效的。第一次搅拌程序和第二次搅拌程序优选进行大于或等于0.1秒到小于或等于600秒。从节省操作者劳动的观点来考虑，优选的是，第一次搅拌程序的时间较短，而第二次搅拌程序的时间较长。

在加入水溶性有机溶剂后进行多次的搅拌程序会更加缩短裂解物溶液和洗涤液的穿过时间，从而使核酸的回收量提高。在使用少量细胞的情况下，从节省操作者工作负担的观点来考虑，只进行单一的搅拌程序或单一的移液程序是合适的。

3.吸附步骤(c)

根据本发明的核酸提取方法，将步骤(b)中得到的裂解物溶液与步骤(c)中的固体材料接触，从而使裂解物溶液中的核酸被吸附到固体材料上。符合要求的是，本发明所用的固体材料可以为单片或多片。在使用多片固体材料的情况下，其可以是相同的固体材料或者是不同的固体材料。

通过在步骤(c)中将所制备的裂解物溶液注入两个或多个柱子中，那么即使在仅使用一个柱子时必然引起堵塞或使裂解物溶液或洗涤液的穿过时间延长的样品也可用于提取，而不会在短时间内发生堵塞。

可以使用多个所述的柱子。在使用多个所述的柱子的情况下，需要进行一次或多次移液程序。这会使裂解物溶液均匀，从而将恒量的核酸引入柱子中。此外，如此操作会使引起堵塞的物质均匀分布，从而减少由于任何不均匀分布所导致的穿过时间发生偏差从而引起的堵塞的发生。由于同样的原因，优选的是，欲装入柱子中的裂解物溶液的体积应尽可能相同。

当欲将裂解物溶液引入柱子中时，优选的是，应在尽可能避免将泡沫引入其中的条件下引入裂解物溶液。如此操作是为了避免来源于提取液内泡沫中的杂质污染。尽可能避免引入泡沫的方法包括(例如)：在裂解物的制备过程中使用消泡剂从而抑制起泡；在裂解物的制备完成后通过离心消除泡沫；在用移液管将裂解物溶液从裂解物制备所使用的容器中引入柱子的过程中，应尽可能防止吸入泡沫；加入裂解物溶液使得裂解物溶液在柱子的壁表面上流动；将裂解物溶液引入柱子后吸出保留在柱子内的泡沫；以及将裂解物溶液加入柱子后通过离心消除泡沫。

在步骤(c)中，优选的是，在避免使裂解物溶液附着在除柱子内用裂解物溶液浸渍的内表面以外的其它内表面的条件下，将裂解物溶液置于柱子中。如此操作是为了减少提取液中来源于裂解物溶液的杂质污染。在避免使裂解物溶液附着在除柱子内用裂解物溶液浸渍的内表面以外的其它内表面的条件下将裂解物溶液置于柱子中的方法的一个例子为这样一种方法：在加入裂解物溶液时，将移液管的下端放置于在将裂解物溶液引入柱子之后所形成的裂解物溶液的液面以下的位置处。

4.洗涤步骤(d)

根据本发明的核酸提取方法，在步骤(d)中用洗涤液洗掉除了欲提取的核酸以外的杂质。将醇类用作包含在洗涤液中的水溶性有机溶剂。醇类包括(例如)：甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇。丙醇可以是异丙醇或正丙醇。丁醇可以是直链或支链的。这些醇可以与该醇类中的多种醇组合使用。在这些醇之中，优选使用乙醇。

洗涤液中含有的水溶性有机溶剂的量优选为5质量％到100质量％。更优选的是，水溶性有机溶剂的量为5质量％到40质量％。在该范围内，可得到高纯度和高回收量的RNA，而不会增加DNA污染物或不会使所需的RNA从多孔膜上解吸附。

同时，洗涤液中含有的水溶性盐优选为卤化物盐、更优选为氯化物。水溶性盐优选为单价阳离子或二价阳离子；并且更优选的是，水溶性盐包括碱金属盐或碱土金属盐。在这些盐中，钠盐和钾盐是优选的。最优选的是，水溶性盐为钠盐。

当在步骤(d)中欲将水溶性盐引入到洗涤液中时，其浓度为10m摩尔/1或更高，虽然对其浓度的上限没有限定，但是不会使杂质的溶解度下降的范围是符合要求的。所述的上限优选为1摩尔/1或更低、更优选为0.1摩尔/1或更低。水溶性盐优选为氯化钠，尤其是浓度为大于或等于20m摩尔/1的氯化钠。

优选的是，水溶性盐不含有任何离液物质。在该情况下，就可减小回收步骤中发生任何离液物质污染的可能性。当在回收步骤中发生离液物质污染时，离液物质通常会在RT-PCR等反应过程中抑制酶反应。因此，考虑到后续的酶反应等过程，理想的情况是洗涤液中不含有任何离液物质。此外，因为离液物质具有腐蚀性和危害性，所以考虑到试验操作的安全性，不需使用离液物质对实验人员是非常有利的。

在步骤(d)中，在裂解物溶液的体积小于柱子的体积并且将裂解物溶液施加到柱子内部的情况下，在洗涤步骤中施加到柱子内部的洗涤液所形成的液面高度可高于施加到柱子内部的裂解物溶液所形成的液面高度。提高洗涤液液面高度的方法包括(例如)：加入体积大于具体方案所用的裂解物溶液的体积的洗涤液。所述程序可通过非自动方法进行或通过这样一种方法进行：首先将洗涤液的体积输入到核酸提取器中，然后自动加入洗涤液。符合要求的是，通过离心程序可降低裂解物溶液的液面。

通过将洗涤步骤中施加到柱子内部的洗涤液所形成的液面高度调节到高于施加到柱子内部的裂解物溶液所形成的液面高度，使得保留在柱子内壁表面上的裂解物溶液被漂洗，从而减小了回收(提取)的核酸溶液中来自裂解物溶液的组分(除了欲提取的核酸以外)的污染的可能性。当柱子内部的裂解物溶液所形成的液面高于洗涤液的液面时，裂解物溶液通过重力作用从柱子内所形成的裂解物溶液相流向柱子的底部，从而增加了裂解物溶液进入回收液的污染的可能性。或者，当裂解物溶液所形成的液面高度低于洗涤液所形成的液面高度时，裂解物溶液得到充分漂洗，从而减小了来自裂解物溶液的组分进入回收液的污染的可能性。

在裂解物溶液的制备过程中，有时会由于各种原因而形成泡沫。本发明人发现，通过尽可能避免所产生的泡沫进入柱子的污染可以减少在核酸回收后杂质进入回收液的污染。当泡沫保留在柱子中时，泡沫通过其浮力作用在柱子内部的裂解物溶液或洗涤液(当引入这些溶液后)所形成的液面周围而积聚。在这种情况下，泡沫保留在柱子内部的溶液所形成的液面上。即使当裂解物溶液和洗涤液通过压力作用或离心而穿过柱子内部的固体材料后，泡沫通常会原样保留在柱子的内壁上。在将回收液施加到柱子的内部之后，来自保留在回收液中的泡沫的杂质会造成污染，从而导致杂质对核酸提取液的污染的可能性。通过在尽可能避免泡沫污染的同时将回收液施加到柱子中，可以减小来自裂解物溶液中的杂质对提取液造成污染的可能性。

在步骤(d)中，在裂解物溶液的体积近似等于柱子体积的情况下，那么可以使柱子中洗涤液所形成的液面低于裂解物溶液所形成的液面。在这种情况下，在柱子中裂解物溶液所形成的泡沫可以积聚在柱子内较低位置处，从而可提高后续洗涤步骤中的漂洗效率。其原因如下。

裂解物溶液内含有多种产生泡沫的物质。在引入洗涤液的过程中，高浓度的裂解物溶液的体积越大，所引起的起泡的可能性越高。在将裂解物溶液引入柱子中并使其通过压力作用或离心而穿过固体材料之后，来自裂解物溶液的组分仍然保留。在该情形下引入洗涤液时，非常可能会产生泡沫。当柱子内第一洗涤液所形成的液面低于裂解物溶液所形成的液面时，即使形成泡沫并且即使在通过压力作用或离心使第一洗涤液穿过之后泡沫仍然保留，也可使柱子内第二洗涤液所形成的液面高于所形成的泡沫层。换言之，通过增加液体体积，可以提高泡沫破裂的可能性或使泡沫在洗涤液通过的过程中被洗掉的可能性。所提出的是，可以减小来自泡沫的杂质对提取液造成污染的可能性，从而可以得到高纯度的核酸。这对难以将洗涤液的体积调节到高于裂解物溶液的液体体积的水平的较大体积的裂解物溶液是有效的。在较低浓度的水溶性有机溶剂条件下，起泡现象更突出。在将浓度为小于或等于30体积％的水溶性有机溶剂用作洗涤液时，本发明是尤其有效的。

当通过本发明的核酸提取方法用洗涤液进行多次步骤(d)的洗涤程序以便洗涤在步骤(c)中具有吸附于其上的核酸的固体材料时，将洗涤程序中所用的洗涤液的液面设定为洗涤程序越靠后其液面越高。换言之，在多个洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的至少一个洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面高于第一洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面，并且优选的是，在多个洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面高于第一洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面。更优选的是，应当增加较靠后的洗涤程序中所使用洗涤液的体积。换言之，在多个洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的至少一个洗涤程序中所使用的洗涤液的体积大于第一洗涤程序中所使用的洗涤液的体积，并且优选的是，在多个洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的洗涤程序中所使用洗涤液的体积大于第一洗涤程序中所使用的洗涤液的体积。例如，第一洗涤液的体积可以为500μl，而第二洗涤液的体积可以为750μl，第三洗涤液的体积可以为750μl。通过如此操作可以获得高纯度的核酸。当在洗涤过程中在引入裂解物溶液的过程中或在先前洗涤程序中在柱子内所形成的泡沫仍保留在柱子的内壁上时，通过将较后的洗涤液所形成的液面调节到高于柱子内泡沫的位置，可以在通过压力作用或离心使洗涤液穿过固体材料时，使泡沫破裂或将其洗掉，以便可以减小回收液中来自泡沫的杂质的量，从而可以容易地进行高纯度的核酸的回收。

在洗涤步骤(d)中，也可以使用由各种浓度的水溶性有机溶剂组成的洗涤液。水溶性有机溶剂(例如乙醇)具有消泡作用。在洗涤步骤中，通过一次或多次将高浓度的水溶性有机溶剂引入到柱子中可以提高消泡的可能性，从而提高漂洗效率。在这种情况下，可以减少杂质对提取液造成的污染，从而易于回收高纯度的核酸。然而，在洗涤步骤中，在即将向柱子中加入回收液之前，优选不使用高浓度的水溶性有机溶剂。这是由于要减少此类水溶性有机溶剂对提取液污染的原因。

洗涤液中可以含有消泡剂。这就是在洗涤过程中抑制泡沫产生可以减少来自泡沫的杂质对提取液的污染的原因。然而，优选的是，在即将引入回收液之前，避免将含有消泡剂的洗涤液作为洗涤液。这是由于要减少消泡剂对提取液的污染的原因。

洗涤步骤(d)中减小第一洗涤液的体积会有效地缩短穿过时间。当在整个洗涤步骤中将洗涤液的体积预先设定为一个既定的值时，第一洗涤液穿过膜所需的穿过时间通常是最长的。随着洗涤程序的次数的增加，穿过时间缩短，从而使得减小第一洗涤液的体积可有效缩短整个穿过时间。当在裂解物溶液和洗涤液穿过膜之后而用于贮存这些溶液的废液槽的容积较大时，由于废液从废液槽内冒出而使所述溶液可能附着在柱子的顶部。当回收液穿过柱子的下端时，所附着的溶液可能会污染提取液。然而，减小第一洗涤液的体积可减少液体的总体积，从而减少废液的冒出，最终得到更高纯度的核酸。

在洗涤步骤(d)中，可以使用由两种不同浓度的水溶性有机溶剂组成的洗涤液。洗涤液中较高浓度的水溶性有机溶剂缩短了洗涤液穿过膜的穿过时间。例如，在欲提取RNA的情况下，使用较高浓度的水溶性有机溶剂的不会使基因组DNA从膜上解吸附而造成基因组DNA进入提取液的污染问题。通过使用由浓度低于洗涤步骤的最初阶段、中间阶段或最终阶段的洗涤液中的水溶性有机溶剂浓度的水溶性有机溶剂组成的洗涤液，可以使基因组DNA从膜上解吸附，从而减小了基因组DNA对提取液污染的可能性。

在这种情况下，由较低浓度的水溶性有机溶剂组成的洗涤液的体积小于由较高浓度的水溶性有机溶剂组成的洗涤液的体积。这是由于由较低浓度的水溶性有机溶剂组成的洗涤液的穿过膜的时间较长的原因。此外，可以在洗涤步骤过程中的中间阶段加入盐浓度较高的洗涤液(例如氯化钠水溶液)，即完全不含任何水溶性有机溶剂的洗涤液，以便代替较低浓度的水溶性有机溶剂。所提出的是，高浓度的盐可以促使核酸吸附到膜上。即使洗涤液不含有乙醇时，核酸从膜上解吸附的量也较低。

为了从含有DNA和RNA的裂解物溶液中只选择性地分离和纯化RNA，使裂解物溶液穿过容装有能吸附核酸的多孔膜的核酸提取柱，从而使核酸被吸附在能够吸附核酸的多孔膜上。然后进行洗涤。随后是使用脱氧核糖核酸酶等的步骤。脱氧核糖核酸酶的种类包括(但不限于)任何脱氧核糖核酸酶。此外，可以使用含有水溶性有机溶剂(例如浓度为小于或等于50体积％、优选为小于或等于20体积％的乙醇)和盐(例如浓度为大于或等于10mM、更优选为大于或等于300mM的氯化钠)的溶液来代替脱氧核糖核酸酶。

用脱氧核糖核酸酶作用于核酸提取柱内能吸附核酸的多孔膜的步骤所需的时间随核酸混合物(含有DNA和RNA)溶液中的DNA的量和脱氧核糖核酸酶的浓度的变化而变化。该时间优选为5秒到360分钟、更优选为30秒到180分钟。用脱氧核糖核酸酶作用于核酸提取柱内能吸附核酸的多孔膜的步骤所需的温度为4℃或更高、优选为10℃到50℃。为了提高反应效率，可以在高温(例如50℃到70℃)下实施该步骤。本文中，术语“用脱氧核糖核酸酶作用于核酸提取柱内能吸附核酸的多孔膜”是指在能吸附核酸的多孔膜上其上吸附有核酸的位点与脱氧核糖核酸酶的相互作用。术语“在能吸附核酸的多孔膜上”包括不仅在能吸附核酸的多孔膜上，还包括多孔膜中的孔的内部以及在多孔膜的膜背面上孔的出口处。脱氧核糖核酸酶作用有效地缩短了在加入脱氧核糖核酸酶后的洗涤液的穿过时间，或者改善了堵塞现象。

除了脱氧核糖核酸酶以外，还可以加入蛋白酶、脂降解酶、糖降解酶、核酸酶和有机溶剂(例如氯仿和甲醇)、以及它们的混合物中的任何一种。所提出的是，通过加入以上成分，可以使残留在膜上引起堵塞的物质成分以加速的方式分解。由此，改善了洗涤液的通过性，从而缩短了洗涤液的穿过时间并且改善了堵塞现象。符合要求的是，可以在裂解物溶液穿过之后加入上述成分，或者优选的是，在用洗涤液洗涤几次后加入上述成分。具体而言，在使用蛋白酶、脂降解酶、糖降解酶和核酸酶的情况下，这些降解酶由于受到保留在膜上的离液盐的影响而变性，使得它们的活性被抑制，从而降低了其分解能引起堵塞的物质的能力，从而潜在地造成洗涤液的穿过时间不能缩短。另外，在除去基因组DNA的情况下，所述酶对基因组DNA的酶切活性被降低。

5.回收步骤(e)

根据本发明的核酸提取方法，用回收液使核酸从固体材料上解吸附，然后将其从柱子容器排出。通过相对于由样品制得的核酸混合物溶液的体积调节回收液的体积可以使RNA解吸附。含有所分离和纯化的RNA的回收液的体积取决于所用的样品的量。通常所用的回收液的体积为几十微升到几百微升。当样品体积为痕量时或旨在分离和纯化大量的RNA时，回收液的体积可在1微升到几十毫升的范围内改变。

关于回收液，可以优选使用(例如)蒸馏水和Tris/EDTA缓冲液。在使回收的RNA在该步骤之后进行RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)的情况下，也可以使用在RT-PCR中使用的缓冲液(最终浓度分别为(例如)75mmol/l、50mmol/l、3.0mmol/l和10mmol/l的KCl、Tris-HCl、MgCl₂和DTT的水溶液形式)。

回收液的pH优选为1到10、更优选为2到7。具体而言，离子强度和盐浓度对被吸附的RNA的溶解性有影响。回收液的离子强度优选为500m摩尔/1或更低。盐浓度优选为0.5m摩尔/1或更低、更优选为大于或等于0.01m摩尔/1到小于或等于50m摩尔/1。在这种情况下，RNA的收率得到提高，从而可以回收到回收量更高的RNA。

通过减小回收液的体积，可以回收到含有核酸的浓缩溶液。优选的是，回收液的体积与含有核酸混合物的溶液的体积之比优选为1∶100到99∶100、更优选为1∶10到9∶10。在这种情况下，可以容易地浓缩核酸，而无需在核酸提取之后实施浓缩程序的步骤。根据这种方法，可提供一种用于获得含有浓缩核酸(其浓度高于样品)的核酸溶液的方法。

在另一个实施方案中，通过调节回收液的体积使核酸解吸附可以回收到含有所需浓度的核酸的溶液，从而提供含有合适浓度的核酸的回收液，以进行后续步骤(例如RT-PCR)。优选的是，回收液的体积与含有核酸混合物的溶液体积之比优选为1∶1到50∶1、更优选为1∶1到5∶1。在这种情况下，可以有利地节省在核酸提取之后进行的繁琐的调节浓度的操作。另外，通过使用足量的回收液可以增加核酸从多孔膜上的收率。

根据目的调节回收液的温度就可以以简单的方式回收核酸。由于通过将回收液的温度调节到0℃到10℃而使核酸从多孔膜上解吸附，使得核酸酶的活性可以在不加入防止酶分解的某些试剂或不采取防止酶分解的特定程序的条件下受到抑制，从而防止了核酸的分解而简便高效地得到核酸溶液。此外，在将回收液的温度设定为10℃到35℃的情况下，可以在室温下回收核酸，从而通过使核酸解吸附来分离纯化核酸而不需要繁琐的步骤。

在其它实施方案中，将回收液的温度调节到高温(例如30℃到70℃)，从而方便地使核酸以高收率从多孔膜上解吸附，而不需要繁杂的程序。

对注入回收液的次数没有限定，而是一次或多次。通常，通过一次注入来回收核酸，从而以简单的方式快速地提取核酸。为了回收大量的核酸，可多次注入回收液。

在步骤(e)的核酸回收步骤中，可将核酸的回收液配制成可在后续步骤中使用的组合物。经分离和纯化的核酸可用于RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)。在此情况下，经提取的核酸溶液必须使用适于RT-PCR的缓冲液进行稀释。在本方法的回收步骤中，使用适于RT-PCR的缓冲液作为回收液能够方便快捷地转入随后的RT-PCR步骤。

此外，在上述的回收步骤中，为了防止在核酸的回收液中所回收的核酸发生分解，可以加入稳定剂。关于稳定剂，可以加入抗细菌剂、抗真菌剂和核酸分解抑制剂。核酸分解抑制剂包括核酸酶的抑制剂，尤其包括EDTA。在另外的实施方案中，可以将此类稳定剂先加入回收容器中。

在使核酸从膜上解吸附的情况下，当在不经过多次提取程序(假若浸渍时间较短)需解吸附的核酸就不发生解吸附时，应使回收液浸渍膜的时间延长，从而可以经过一次或较少次数的提取程序使较大量的需解吸附的核酸解吸附。本发明人进行了详细的研究。当提取核酸过程中的浸留时间为大于或等于0.1秒到小于或等于600秒、优选为大于或等于10秒到小于或等于30秒时，可以得到足量的核酸。

因此，当增加裂解液中表面活性剂的浓度时，可以缩短裂解物溶液和洗涤液的穿过时间。虽然所回收的核酸的浓度较低，但是为了得到预期回收量的核酸，仍需要进行几次提取程序。通过延长其上吸附有核酸的膜在回收液中的浸渍时间，可以回收较高回收量的核酸。

本发明所用的样品可以包括(但不限于)含有核酸的任何生物材料。例如，在诊断领域中，应用于本方法的对象可以是体液，如作为样品收集的全血、血浆、血清、尿、粪便、***和唾液；或诸如植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒、培养细胞之类的生物材料；或上述样品的裂解物或上述样品的匀浆产物。

培养细胞包括漂浮型细胞和粘着型细胞。漂浮型细胞是指其漂浮在培养液中进行生长和增殖，并且不必粘着在容器壁上，例如，举出HL60、U937和HeLaS3等作为代表性的细胞株。粘着型细胞是指粘着在容器的底面和壁上在培养液中进行生长和增殖的细胞，例如，举出NIH 3T3、HEK293、HeLa、COS和CHO等作为代表性的细胞株。根据本发明作为样品使用的动物(或其一部分)包括动物组织。例如，可以使用由动物解剖或活体解剖而得到的组成动物个体的所有组织，例如，肝脏、肾脏、脾脏、脑、心脏、肺或胸腺。优选的是，使用用于裂解细胞膜和核膜的试剂(称为核酸溶解试剂)的水溶液处理这些试验样品，从而溶出核酸。在这种情况下，细胞膜和核膜被裂解，从而得到其中核酸分散到水溶液中的核酸混合物溶液。

根据本发明，术语“核酸”是指单链核酸、双链核酸、三链核酸和四链核酸、或它们的混合物中的任何一种。此外，该术语不包括对分子量的任何限定。另外，DNA、RNA、和DNA和RNA的修饰产物、以及它们的混合物中任何一种都是合适的。

在本发明中，具有亲水性基团的固相(固体材料)是指这样的固相(固体材料)：在该固相中，构成固相的材料本身具有亲水性基团，或是指这样的固相(固体材料)：在该固相中，通过处理或涂敷将亲水性基团引入构成固相(固体材料)的材料中。构成固相的材料可以为有机材料或无机材料。例如，可使用如下的固相：其中构成材料为具有亲水性基团的有机材料的固相；通过对不含亲水性基团的有机材料的固相进行处理，从而向其中引入亲水性基团而得到的固相；通过用具有亲水性基团的材料对不含亲水性基团的有机材料的固相进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而得到的固相；其中构成材料为具有亲水性基团的无机材料的固相；通过对不含亲水性基团的无机材料的固相进行处理，从而向其中引入亲水性基团而得到的固相；或通过用具有亲水性基团的材料对不含亲水性基团的无机材料的固相进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而得到的固相。

具有羟基的材料的固相可以为由以下材料形成的固相：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物，并且优选具有羟基的有机材料的固相。

具有羟基的有机材料的固相优选具有多糖结构的材料，并且更优选由乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物形成的有机聚合物固相。乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物优选：三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；或二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物，尤其优选三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比优选为99∶1到1∶99、更优选为90∶10到50∶50。

具有羟基的更优选的有机材料是专利文献JP-A-2003-128691中所述的醋酸纤维素的皂化物质。醋酸纤维素的皂化物质通过使乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化所得，并且优选的是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化物质，三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物质，三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物质，或二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物质；更优选的是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化物质。三醋酸纤维素与二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99、更优选为90∶10到50∶50。这样就可以根据皂化处理的水平(皂化率)来控制固相表面上的羟基含量(密度)。为了提高核酸的分离效率，优选较高含量(密度)的羟基。例如，就醋酸纤维素(例如三醋酸纤维素)而言，皂化率(表面皂化率)优选为约5％或更高、更优选为10％或更高。而且，为了增大具有羟基的有机聚合物的表面积，优选的是，使醋酸纤维素固相皂化。

皂化是指使醋酸纤维素与皂化液(例如，氢氧化钠水溶液)接触。由此，在与皂化液接触的醋酸纤维素的酯衍生物中，酯基被水解，并且引入羟基而使纤维素再生。如此制备的再生纤维素与起始纤维素在结晶态等方面是不同的。而且，通过其中改变氢氧化钠的浓度或处理时间的皂化处理，可以改变皂化率。通过(例如)NMR、IR或XPS(例如，根据羰基峰值的减少)可以容易地测定皂化率。

为了将亲水性基团引入不含亲水性基团的有机材料固相中，将聚合物主链或侧链上具有亲水性基团的接枝聚合物链键合到固相上。为了将接枝聚合物链键合到有机材料的固相上，可以使用以下两种方法：即，使固相与接枝聚合物链化学键合的方法；以及从固相开始，使具有可聚合双键的化合物聚合，从而形成接枝聚合物链的方法。

在固相与接枝聚合物链化学键合的方法中，通过使用在聚合物的末端或侧链上具有能够与固相发生反应的官能团的聚合物、并且使其官能团与固相的官能团之间发生化学反应而进行接枝。对能与固相发生反应的官能团没有特别限定，只要它能与固相的官能团反应即可，并且其可以为(例如)硅烷偶联基(例如，烷氧基硅烷)、异氰酸酯基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基等。关于在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的聚合物，特别有用的是以下聚合物：在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有环氧基的聚合物，或在其末端具有异氰酸酯基的聚合物。在这种情形下可使用的聚合物可以为具有参与吸附核酸的亲水性基团的任何聚合物，但是可以是(例如)：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸和它们的盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐；或聚氧乙烯。

由固相开始、使具有可聚合的双键的化合物进行聚合而形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指这样一种方法：通过等离子体辐射、光辐射或加热，使基材表面产生活性部位，从而将具有可聚合双键并且被设置为可与固相接触的化合物通过聚合反应与固相键合。可用于形成与基材键合的接枝聚合物链的化合物需要同时具有可聚合的双键和参与吸附核酸的亲水性基团这两个特征。此类化合物可以是具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体，只要其分子中具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。具有亲水性基团的特别有用的单体的具体实例包括具有羟基的以下单体，例如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、单甲基丙烯酸甘油酯。此外，还适合使用的是诸如丙烯酸或甲基丙烯酸、或其碱金属盐或胺盐之类的含羧基的单体。

作为另一种把亲水性基团引入到不具有亲水性基团的有机材料的固相中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂敷。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可，但是考虑到操作的容易程度，所述材料优选为有机材料的聚合物。此类聚合物可以为(例如)：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸或它们的盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸或它们的盐；聚氧乙烯、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物，并且优选为具有多糖结构的聚合物。

在将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的有机材料固相上之后，还可以对所涂敷的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在这种情况下，皂化率优选为约5％或更高、更优选为约10％或更高。

具有亲水性基团的无机材料固相可以为(例如)由二氧化硅化合物等形成的固相。就以膜形式使用而言，固相可以是玻璃滤膜。固相还可为如日本专利No.3058342所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备：把具有形成双分子膜能力的阳离子两性物质的展开液分散到基板上，然后从基板上的液体膜中除去溶剂，从而制成两性物质的双分子膜的多层膜，然后将双分子膜的多层膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，并提取双分子膜的多层膜。

为了将亲水性基团引入不具有亲水性基团的无机材料固相上，可使用以下两种方法：即，将固相和接枝聚合物链化学键合的方法；和使用分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体由固相开始聚合进而形成接枝聚合物链的方法。就将固相与接枝聚合物链化学键合而言，将能够与接枝聚合物链的末端官能团发生反应的官能团引入无机材料中，并且使接枝聚合物链被化学键合到该官能团上。此外，就使用分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体由固相开始聚合进而形成接枝聚合物链而言，将在具有双键的化合物进行聚合时作为起始点的官能团引入到无机材料中。

具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体可以优选为在上述将不具有亲水性基团的有机材料固相和接枝聚合物链化学键合的方法中所述的具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体。

关于另一种将亲水性基团引入不具有亲水性基团的无机材料固相中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂敷。对涂敷所用的材料没有限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可，但考虑到操作的容易程度，优选为有机材料的聚合物。此类聚合物可以为(例如)：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸以及它们的盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或它们的盐；聚氧乙烯、醋酸纤维素以或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物。

在将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的无机材料固相上之后，还可以对如此涂敷的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在这种情况下，皂化率优选为约5％或更高、更优选为约10％或更高。

不具有亲水性基团的无机材料的固相可由金属(例如铝)、玻璃、水泥、陶瓷(如瓷)、新型陶瓷、硅和活性炭制备。

适合用作本发明中固相的核酸吸附性多孔膜为溶液可以穿过的材料。术语“溶液能穿过”是指当与膜的一面接触的空间和与该膜的另一面接触的空间之间产生压力差时，溶液可从高压空间向低压空间流动而穿过所述膜的内部。另一方面是指当向所述膜施加离心力时，溶液可以沿着离心力的方向穿过该膜内部。

核酸吸附性多孔膜的厚度优选为10μm到500μm、更优选为50μm到250μm。考虑到洗涤的容易程度，核酸吸附性多孔膜的厚度优选为较薄。

核酸吸附性多孔膜的前表面和其背面可以是对称的，但是可优选使用前表面和背面不对称的多孔膜。

核酸吸附性多孔膜的最小孔径优选为0.22μm或更大、更优选为0.5μm或更大。此外，优选多孔膜的最大孔径与最小孔径之比为2或更大，从而，可得到用于吸附核酸的足够的表面积，并且孔不容易被堵。更优选的是，最大孔径与最小孔径之比为5或更大。

实施例

现在，通过以下实施例详细描述本发明。但本发明不被这些实施例所限定。

(实施例1)

RNA提取过程中使用洗涤液实施洗涤程序的次数和穿过时间之间的关系

将30μl0.5M的Bis-Tris缓冲液(pH为6.5)加入到HL60冷冻细胞团(含有5×10⁶个细胞)中，进而通过移液抽吸分散该细胞。将540μl LRC(由Fuji Photo Film有限公司(为现在的FUJIFILM公司)制造)作为裂解液加入，从而使细胞裂解，并对所得的混合物立刻进行5次移液抽吸。使用高速振荡器(Cute Mixer)CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。向其中加入260μl高级乙醇(由Wako Pure Chemical有限公司制造)，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。

在将NEXT柱(由Fuji Photo Film有限公司制造；开口直径为7mm)、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800(由Fuji Photo Film有限公司制造)中后，将裂解物溶液置于NEXT柱中，使用QuickGene 800的RNA模式进行提取。在这种情况下，进行如下预设置：所有洗涤液的体积都为500μl；回收液的体积为100μl；在回收液中的浸渍时间为120秒。

用紫外可见分光光度计NanoDrop(由NanoDrop Technologies公司制造)对回收的RNA进行定量测定，并确定RNA的纯度。基于RNA在260nm处的吸光度测定收率，而基于RNA在260nm和280nm处的吸光度之比测定核酸纯度。当吸光度之比为1.8或更大时，可确定纯度很高。回收量为386μg。通过凝胶电泳对DNA污染物等进行分析。进行凝胶电泳的条件如下：将TAE(Tris-乙酸)用作缓冲液；将5μl样品与负载缓冲液(10×Blue Juice)混合在一起，并将所得的全部混合物进行电泳。

结果，洗涤液的第一穿过时间为36.8秒；第二穿过时间为20.2秒；第三穿过时间为16.3秒；第四穿过时间为14.9秒；和第五穿过时间为13.2秒。随着洗涤程序的次数的增加，穿过时间缩短。穿过时间是指从用Quick Gene的加压压头开始加压的时间到柱内溶液穿过该柱的时间。

(实施例2)

RNA提取过程中，在较后的洗涤程序中洗涤液体积增加的情况下提取液中所含的杂质的量

将30μl 0.5M的Bis-Tris缓冲液(pH为6.5)加入到HL60冷冻细胞团(含有0.5×10⁶个细胞)中，进而通过移液抽吸分散该细胞。向其中加入450μl含有主要成分为硫氰酸胍的裂解液，从而使细胞裂解，并对所得的混合物立刻进行5次移液抽吸。使用高速振荡器CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。

向所得物中加入195μl高级乙醇，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。在将NEXT柱(由Fuji Photo Film有限公司制造；开口直径为7mm)、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800(由Fuji Photo Film有限公司制造)中后，将裂解物溶液置于NEXT柱中，使用QuickGene 800的RNA模式进行提取。在这种情况下，裂解物溶液的体积为645μl；而第一洗涤液的体积为600μl；第二洗涤液的体积为750μl；第三洗涤液的体积为750μl。回收液的体积为100μl，而将在回收液中的浸渍时间预设定为30秒。为进行对比，使所有洗涤液的体积都为750μl来用于提取。

采用与实施例1相同的方法对回收的RNA进行定量测定并对RNA的纯度进行测定。结果，当使用600μl的第一洗涤液和750μl的第二洗涤液和第三洗涤液时，230nm处的吸光度(在10mm的基础上校正的1mm光路)为1.85，其主要是硫氰酸胍的吸光度。在对比例中，当将洗涤液的体积保持在750μl时，230nm处的吸光度为1.98，这表明在洗涤液的体积保持恒定的条件下，核酸的纯度随着主要含有硫氰酸胍的杂质的增加而降低。由此，上述结果表明在较后的程序中洗涤液的体积增加使得提取液中所含有的杂质较少。

(实施例3)

RNA提取过程中，在较后阶段中洗涤液的体积增加的情况下的穿过时间

将20μl PBS加入到HL60冷冻细胞团(含有5×10⁶个细胞)中，并通过轻叩分散上述细胞。向其中加入400μl含有主要成分为硫氰酸胍的裂解液，从而使细胞裂解,并对所得的混合物立刻进行5次移液抽吸。使用高速振荡器CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。向所得物中加入170μl高级乙醇，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。

在将NEXT柱、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800中后，将裂解物溶液置于NEXT柱中，使用QuickGene800的RNA模式进行提取。在这种情况下，将洗涤次数预设定为3次；第一次洗涤的液体体积预设定为50μl；第二次和第三次洗涤的液体体积预设定为750μl。在对比例中，将洗涤次数预设定为3次；第一、第二和第三次洗涤的液体体积都预设定750μl。

采用与实施例1相同的方法对回收的RNA进行定量测定并对RNA的纯度进行测定。结果，两种方法的RNA回收量相等，均为41μg。两种方法中的裂解物溶液的穿过时间都等于约30秒。洗涤液1(第一次洗涤的洗涤液)的穿过时间为3.7秒，洗涤液2(第二次洗涤的洗涤液)的穿过时间为17.3秒，而对比例中的洗涤液1的穿过时间为22.8秒。这些表明在增加较后阶段中洗涤液的体积的情况下，这些洗涤液的最大穿过时间比对比例中的最大穿过时间缩短63.2％。这表明，在较后阶段中增加洗涤液的体积可有效地缩短穿过时间。

(实施例4)

RNA提取过程中，洗涤液体积和纯度之间的关系

将30μl 0.5M的Bis-Tris缓冲液(pH为6.5)加入到HL60冷冻细胞团(含有0.5×1 0⁶个细胞)中，进而通过移液抽吸分散该细胞。向其中加入450μl含有主要成分为硫氰酸胍的裂解液，从而使细胞裂解，并对所得的混合物立刻进行5次移液抽吸。使用高速振荡器CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。向所得物中加入195μl高级乙醇，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。

在将NEXT柱(由Fuji Photo Film有限公司制造；开口直径为7mm)、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800(由Fuji Photo Film有限公司制造)中后，将裂解物溶液置于NEXT柱中，使用QuickGene 800的RNA模式进行提取。在这种情况下，裂解物溶液的体积为645μl。在洗涤步骤中，进行3次洗涤，并且3次洗涤都使用等量的洗涤液，并且进行3个实验，每个实验中的每次洗涤分别使用750μl洗涤液、500μl洗涤液和250μl洗涤液。

采用与实施例1相同的方法对回收的RNA进行定量测定并对RNA的纯度进行测定。结果，当使用750μl的洗涤液时，230nm处的吸光度为1.98，其主要是硫氰酸胍的吸光度；当使用500μl的洗涤液时，所述吸光度为2.03；当使用250μl的洗涤液时，所述吸光度为2.44。由于裂解物溶液的体积为645μl，所以使用远小于裂解物溶液体积的250μl洗涤液时，纯度相当低，然而随着洗涤液体积的增加，纯度提高。在使用大于裂解物溶液体积的750μl洗涤液的情况下，纯度值很高。

(实施例5)

RNA提取过程中，在尽可能避免裂解物溶液附着在柱子的壁表面上的条件下加入裂解物溶液及所得结果

将30μl 0.5M的Bis-Tris缓冲液(pH为6.5)加入到HL60冷冻细胞团(含有0.5×10⁶个细胞)中，进而通过移液抽吸分散该细胞。向其中加入450μl含有主要成分为硫氰酸胍的裂解液，从而使细胞裂解，并对所得的混合物即刻进行5次移液抽吸。使用高速振荡器CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。向所得物中加入195μl高级乙醇，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。

在将NEXT柱(由Fuji Photo Film有限公司制造；开口直径为7mm)、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800(由Fuji Photo Film有限公司制造)中后，将裂解物溶液置于NEXT柱中，使用QuickGene 800的RNA模式进行提取。在这种情况下，裂解物溶液的体积为645μl。所有洗涤液的体积都等于750μl。

采用与实施例1相同的方法对回收的RNA进行定量测定并对RNA的纯度进行测定。结果，在裂解物溶液被故意附着在柱子的内壁上的情况下在230nm处的吸光度为2.49，而当在尽可能避免裂解物溶液附着在柱子的内壁上的条件下加入裂解物溶液时，在230nm处的吸光度为1.98。这表明尽可能避免裂解物溶液附着在柱子的内壁上是优选的。

(实施例6)

RNA提取过程中，NaCl浓度和穿过时间的关系

将20μl PBS加入到HL60冷冻细胞团(含有5×10⁶个细胞)中，并通过轻叩分散上述细胞。向其中加入400μl含有主要成分为硫氰酸胍的裂解液，从而使细胞裂解，并对所得的混合物立刻进行5次移液抽吸。使用高速振荡器CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。向所得物中加入170μl高级乙醇，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。

在将NEXT柱、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800中后，将裂解物溶液置于NEXT柱中，使用QuickGene800的RNA模式进行提取。在这种情况下，进行如下预设定：在裂解物溶液穿过提取器之后，该提取器自动停止；然后进行4次洗涤(第一次洗涤的液体体积为50μl，第二、第三和第四次洗涤的液体体积为750μl)。由于在裂解物溶液穿过提取器之后，提取器自动停止，所以在此时加入200μl浓度为100mM到5000mM的NaCl溶液。加入后，再次启动提取器。

采用与实施例1相同的方法对回收的RNA进行定量测定并对RNA的纯度进行测定。结果，确定了RNA回收量和穿过时间的关系，并示于图1中。回收量在所有情况下都为41μg到46μg，而裂解物溶液的穿过时间几乎是相同的，并且在所有情况下都为约30秒。在第一次洗涤时，穿过时间在NaCl浓度为1,000mM时最短。在第二次洗涤时，穿过时间最短，即为13.5秒(如图1所示)。当加入浓度为100mM的NaCl时，第一次洗涤的穿过时间为10.7秒，而第二次洗涤的穿过时间为22.5秒。当加入1000mM的NaCl时，第一洗涤液和第二洗涤液的最大穿过时间比加入100mM的NaCl时的情况缩短了约40％。这表明，NaCl以1000mM的浓度加入对缩短穿过时间是有效的。

(实施例7)

RNA提取过程中，加入痕量的低浓度乙醇的效果

吸出HEK 293(在存在5％CO₂的条件下于37℃培养3天)的液体培养物(含有2.3×10⁶个细胞/3.5-cm²培养皿)，并在1ml PBS中漂洗，然后吸出PBS。将525μl含有主要成分为硫氰酸胍的裂解液加入所述培养皿中，从而使细胞裂解，并用细胞刮棒从培养皿的表面刮下细胞。将所得溶液转移到1.7ml的微型管中。使用高速振荡器CM-1000(由EYELA公司制造)在2,500rpm条件下振摇1分钟，然后离心沉降。向所得物中加入175μl高级乙醇，并用高速振荡器CM-1000在2,500rpm条件下振摇1分钟。随后，进行离心沉降，从而制备出裂解物溶液。

在将NEXT柱、洗涤液(WRT)和回收液(CRT)设置于QuickGene-800中后，将裂解物溶液加入NEXT柱中，并且在压力存在下，该裂解物溶液穿过容装在NEXT柱中的核酸吸附膜。然后，使用含有50μl主要成分为70％乙醇的洗涤液和200μl主要成分为10％乙醇和500mM NaCl的洗涤液的混合物溶液进行洗涤，接着，以单次洗涤的体积为750μl的方式用主要成分为70％乙醇的洗涤液进行3次洗涤。

在对比例中，使用含有主要成分为10％乙醇的洗涤液，并以单次洗涤的液体体积为750μl的方式进行3次洗涤。

采用与实施例1相同的方法对回收的RNA进行定量测定并对RNA的纯度进行测定。结果，裂解物溶液的穿过时间几乎等于对比例中为约30秒的穿过时间。洗涤液的穿过时间为4秒到6秒，其远低于对比例中15秒到25秒的穿过时间。在不加入含有10％乙醇的洗涤液的情况下，产生由于基因组核酸引起的污染(如图2所示)。在加入含有10％乙醇的洗涤液的情况下，洗涤液的穿过时间为4秒到6秒，并且基因组核酸几乎处于和对比例(如图2所示)中一样低的水平。回收量在任何情况下都为40μg。在图2中，底部的梯带为由Invitrogen公司生产的1kb Plus DNA Ladder。每个相同的试验进行两次，并将两次结果示于图2中。

上述结果表明，在RNA提取过程中，使用具有不同乙醇浓度的较小体积的洗涤液缩短了RNA提取中的穿过时间，产生较少的基因组DNA污染和几乎相同的RNA回收量。由此，认为本方法是非常有效的方法。

与常规方法相比，本发明的方法减少了核酸提取后回收的溶液中存在的杂质，从而得到了纯度较高的所需产物，即纯度较高的核酸。此外，根据本发明的方法，调节了洗涤步骤，从而缩短洗涤步骤中洗涤液的穿过时间，并减小堵塞发生的频率，使得可以处理大量的样品，从而提高了提取的回收量。另外，根据本发明的方法，可以简便快捷地自动提取核酸，而不需要任何特别的技术、繁杂的程序和任何特定的装置。

在本申请中，已要求外国优先权的每一个外国专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文，如同全部列出的一样。

Claims

1.一种核酸提取方法，该方法包括以下步骤：

(b)将水溶性有机溶剂加入到由所述的步骤(a)得到的含有该溶解的核酸的溶液中从而制备裂解物溶液的步骤；

(c)将由所述的步骤(b)得到的该裂解物溶液与固体材料接触从而使该裂解物溶液中的所述核酸被吸附到所述的固体材料上的步骤；

(d)用洗涤液洗掉所述固体材料上除了作为提取对象的核酸以外的其它杂质的洗涤步骤，其中，实施两次或多次洗涤程序，并且在该两次或多次洗涤程序中，除了第一洗涤程序以外的至少一次洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面高于所述的第一洗涤程序中所使用的洗涤液所形成的液面；以及

(e)用回收液使吸附到所述固体材料上的所述核酸解吸附的提取步骤。

2.根据权利要求1所述的核酸提取方法，该方法还包括：在将所述裂解液加入到所述生物材料中之前、用分散液使所述生物材料分散的步骤。

3.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的所述裂解液含有浓度为0.1摩尔/1到10摩尔/1的离液盐。

4.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的所述裂解液含有小于或等于50体积％的水溶性有机溶剂。

5.根据权利要求4所述的核酸提取方法，

6.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的所述裂解液含有0.001质量％到30质量％的表面活性剂。

7.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的所述裂解液含有缓冲液。

8.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(a)中的所述裂解液含有消泡剂。

9.根据权利要求1所述的核酸提取方法，该方法还包括在所述的步骤(a)之后加入含有0.001质量％到30质量％的表面活性剂的溶液的步骤。

10.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中在所述的步骤(b)中，将所述的水溶性有机溶剂加入到含有所述核酸的所述裂解液中，以便将所述的水溶性有机溶剂的体积调节到10体积％到60体积％，从而制备出所述裂解物溶液。

11.根据权利要求1所述的核酸提取方法，该方法还包括在所述的步骤(a)和/或(b)之后，实施机械式往复运动的步骤。

12.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(c)中的所述固体材料的表面具有羟基。

13.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

14.根据权利要求1所述的核酸提取方法，该方法还包括在所述的步骤(c)中，将所述的裂解物溶液注入两个或多个容器内以进行提取。

15.根据权利要求13所述的核酸提取方法，

16.根据权利要求13所述的核酸提取方法，

17.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中将两种含有不同浓度的水溶性有机溶剂的洗涤液用作所述步骤(d)中的所述洗涤液。

18.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(d)中的所述洗涤液含有盐。

19.根据权利要求18所述的核酸提取方法，

其中所述的盐为氯化钠。

20.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中所述步骤(d)中的所述洗涤液含有消泡剂。

21.根据权利要求1所述的核酸提取方法，该方法还包括通过压力变化或离心使所述步骤(c)、(d)或(e)中的所述裂解物溶液、所述洗涤液和所述回收液中的至少一种与固体材料接触的步骤。

22.一种实施根据权利要求1所述的核酸提取方法的成套用具，该成套用具包含：至少两个容器、分散液、裂解液、洗涤液、回收液和用于将核酸吸附于其上的固体材料。

23.根据权利要求1所述的核酸提取方法，

其中在所述的步骤(d)中，在所述的两次或多次洗涤程序中除了所述的第一洗涤程序以外的至少一次洗涤程序中所用的洗涤液的体积大于所述第一洗涤程序中所用的洗涤液的体积。