JP2008073017A - 凹凸を持つ容器を用いた核酸抽出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高収量、高濃度、高純度の核酸が得られ、膜を用いた場合には、ライセート溶液、洗浄液、回収液の通過時間が短く、高収量、高濃度、高純度の核酸が得られ、さらに、ゲノムコンタミの混入を軽減でき、抽出時間が短く、また、より多くの生体材料が処理できる核酸抽出法を提供する。
【解決手段】内側に凹凸を持つ容器内で核酸を含む試料を攪拌する工程を含む、核酸抽出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体材料から核酸を抽出する方法に関する。

核酸抽出法は、溶液状態で行う方法と、核酸を含む溶液と固体材料とを接触させることで核酸を吸着させ、不要物を洗浄した後、目的の核酸を脱離させることで行う固体材料を用いた方法に大別できる。

溶液状態で行う方法は最も古くから行われており、エタノールで核酸を沈殿させ、これをガラス棒に絡ませて行う。この方法は、非常に簡便であるが、収量や純度に大きな問題がある。

これらを改良する方法として、非特許文献１で報告されたグアニジンチオシアネートを加えて細胞を溶解させた後、酸性条件下でフェノールを用いて共存するＤＮＡを除去することでＲＮＡを得るＡＧＰＣ（Acid Guanidinium Phenol Chloroform）法、ＲＮＡがＤＮＡやタンパク質と比較して浮遊密度が高いことを利用したグアニジン−塩化セシウム遠心法などがある。しかしながら、フェノールやクロロホルムなどの有害な有機化合物を使用すること、煩雑な操作が必要で精度ある抽出を行うためには熟練した技術が必要であることなど多くの欠点がある。

これらの欠点を改良する方法として、核酸分解作用を持つヌクレアーゼ等の酵素活性を阻害するグアニジンチオシアネートなどのカオトロピック塩を用いて細胞を溶解し、エタノールを加えることでライセート溶液を調製し、これをシリカなどの固体材料と接触させることで核酸を吸着した後、洗浄工程を経て核酸を脱離させる方法が開発された（非特許文献２）。

これとは別の方法で、磁性シリカ粒子を用いた核酸抽出法が開発され、反応効率、洗浄効率の改善が行われた。さらに、多孔質膜を用いた核酸抽出法が開発され、高純度の核酸を短時間で、簡便な方法で得られるようになった。

本発明者らも、固体吸着材料として、非常に薄い多孔質膜を用いることで、より簡便で分離特性に優れた核酸分離精製法を開発してきた。しかし、大量の生体材料を試料とした場合、例えばより多くの細胞数を処理する場合、多孔質膜を種々溶液が通過するのに必要な通過時間が長くなることが明らかとなったので、分散液、特にＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、界面活性剤の種類と濃度、カオトロピック塩の種類と濃度、溶解液添加後のピペッティングと攪拌、水溶性有機溶媒を添加後の攪拌、水溶性有機溶媒を添加する回数、ホモジナイズ法、多孔質膜の細孔サイズなどを種々検討し、通過性を改善、すなわちより多くの細胞数を処理できる方法を開発してきた（特許文献１、２、３）。
特開２００３−１２８６９１号公報 特願２００５−２８２１３０ 特願２００５−０２８９９１ P. D. Siebert, A.Chenchik, Nucleic Acids Res., 21, 2019-2020 (1993). R. Boom et al., Journal of Clinical Microbiology, 28, 495-503 (1990).

本発明の目的は、高収量、高純度の核酸を分離精製する方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、検体中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱離させて核酸を分離精製する方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、抽出操作時の目詰まりを改善し、高収量、高純度を維持したまま、ライセート溶液、洗浄液の通過時間を短縮させる、別の表現では、より多くの生体材料が処理可能な方法を提供することである。

本発明の目的は、攪拌効率を向上し、目詰まりを防止するために、容器の内側に凹凸をつけることで、上記課題が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。

＜１＞内側に凹凸を持つ容器内で核酸を含む試料を攪拌する工程を含む、核酸抽出方法。
＜２＞以下の工程を含む上記＜１＞の核酸抽出方法。
（ａ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解し、生体材料中に含まれている核酸を溶出させて試料溶液を作成する工程、
（ｂ）試料溶液を攪拌する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた溶液に対して水溶性有機溶媒もしくは水溶性有機溶液を加える工程、
（ｄ）攪拌によりライセート溶液を調製する工程、
（ｅ）ライセート溶液と固体材料とを接触させて溶解液中に含まれている核酸を固体材料に吸着させる工程、および、
（ｆ）核酸を吸着させた固体材料と回収液とを接触させて、核酸を固体材料から脱離させ核酸を含む溶出液を得る工程。
＜３＞工程（ａ）における生体材料を溶解液と接触させる前に、緩衝液を含む分散液を用いて生体材料を分散させる、上記＜２＞の核酸抽出方法。
＜４＞工程（ａ）における溶解液が、溶解液に対して０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌのカオトロピック塩を含む、上記＜２＞または＜３＞の核酸抽出方法。
＜５＞工程（ａ）における溶解液の水溶性有機溶媒濃度が、１０〜５０体積％である、上記＜２＞〜＜４＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜６＞工程（ａ）における溶解液が、界面活性剤を０．００１〜３０質量％含む、上記＜２＞〜＜５＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜７＞工程（ａ）における溶解液が、緩衝液を含む、上記＜２＞〜＜６＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜８＞工程（ａ）における溶解液が、消泡剤を含む、上記＜２＞〜＜７＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜９＞工程（ｂ）の後に、０．００１〜３０質量％の界面活性剤を含む溶液を添加する、上記＜２＞〜＜５＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１０＞工程（ｄ）で得られたライセート溶液が、水溶性有機溶媒を終濃度１０〜６０体積％で含有している、上記＜２＞〜＜９＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１１＞工程（ｂ）もしくは（ｄ）における攪拌が、機械的往復運動を伴う攪拌である、上記＜２＞〜＜１０＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１２＞工程（ｆ）における固体材料が、表面に水酸基を含む固体材料である、上記＜２＞〜＜１１＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１３＞工程（ｆ）における固体材料が、カートリッジに保持されている、上記＜２＞〜＜１２＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１４＞工程（ｅ）で、ライセート溶液を複数のカートリッジに分注する、上記＜２＞〜＜１３＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１５＞工程（ｅ）で、一つのカートリッジにライセート溶液を二回以上入れることを特徴とする、上記＜２＞〜＜１３＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１６＞工程（ｆ）の前に、核酸が吸着している固体材料に対して、水溶性有機溶媒を０．１から８０質量％含む洗浄液を接触させる工程を含む、上記＜２＞〜＜１３＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１７＞前記工程（ｅ）および（ｆ）において、ライセート溶液、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材料と接触させる工程を含む、上記＜２＞〜＜１５＞のいずれかの核酸抽出方法。
＜１８＞内側に凹凸を持った容器、分散液、溶解液、洗浄液、回収液、核酸を結合させるための固体材料のうち少なくとも二つ以上から構成された上記＜２＞〜＜１６＞のいずれかの核酸抽出法を行うためのキット。

本発明の方法により、高純度で高収量の核酸を容易に得ることが出来る。さらに、本発明の方法により、検体中の核酸を固相表面に吸着させることで、ライセート調製後は、自動的に分離精製することもできる。さらに、本発明の抽出法により、従来法よりも、より多くの細胞数を目詰まりすることなく、より短時間でライセート溶液、洗浄液が通過し、従来法よりも高速な核酸抽出法を提供できる。

本発明における核酸抽出としては、特願２００５−２８２１３０、特願２００５−０２８９９１、特願２００６−０２７３８３、特願２００６−０２７４９５、特願２００５−２４９６９４、特願２００５−０８２２８３、特願２００５−０８００４０、特願２００５−０５９０５７、特願２００５−０２９１７７、特願２００５−０２７９１８、特願２００４−０６６８０１に記載された方法も含むものとする。

生体材料から核酸を抽出する場合、その収量を向上させるためには、いかにして生体材料を効率よく核酸抽出に適した状態に溶解させるかということが重要である。本発明では、このことに着目して、内側に凹凸構造を持った容器を用いることにより、その攪拌効率を向上、すなわち、生体材料の溶解を効率よく進行させることで、より多くの核酸を得ることに成功した。

本発明は、内側に凹凸を持つ容器内で核酸を含む試料を攪拌する工程を含む、核酸抽出方法に関する。

本発明の核酸抽出方法は、内側に凹凸を持つ容器内で核酸を含む試料を攪拌する工程を含む。核酸抽出方法は特に限定されず、例えばエタノールで核酸を沈殿させこれをガラス棒に絡ませるような、溶液状態で行う方法や、フイルムやカラム等の固体材料を用いることもできる。本発明においては、固体材料を用いることが好ましい。
本発明の核酸抽出方法は、好ましくは以下の工程を含む。
（ａ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解し、生体材料中に含まれている核酸を溶出させて試料溶液を作成する工程、
（ｂ）試料溶液を攪拌する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた溶液に対して水溶性有機溶媒もしくは水溶性有機溶液を加える工程、
（ｄ）攪拌によりライセート溶液を調製する工程、
（ｅ）ライセート溶液と固体材料とを接触させて溶解液中に含まれている核酸を固体材料に吸着させる工程、および、
（ｆ）核酸を吸着させた固体材料と回収液とを接触させて、核酸を固体材料から脱離させ核酸を含む溶出液を得る工程。
ここで、前記した内側に凹凸を持つ容器内で核酸を含む試料を攪拌する工程、（ｂ）、（ｄ）およびその他の何れの工程であってもよいが、（ａ）〜（ｄ）は同じ容器で行うことができ、（ｂ）、（ｄ）両方の攪拌工程を凹凸を持つ容器内で行うことが好ましい。

＜内側に凹凸を持つ容器＞
本発明者らはこれまでに核酸抽出時の収量を向上させること、および膜を用いた核酸抽出時の通過時間を短くする種々の方法を開発してきた。これらの経験から、溶液を攪拌することで収量の向上や通過時間が短くなることを見出した。今回新たに、生体材料を処理する際の容器に着目し、容器の内壁に凹凸構造を採用することで、攪拌効率が大幅に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の方法により、核酸収量が向上するとともに、ライセート溶液、洗浄液の通過時間を短くさせるとともに、ＲＮＡを抽出する際には、抽出液中へのゲノムの混入も減少させることも出来る。これは、突起物と目詰まりを起こす物質（通過時間を長くする物質）との衝突により、この様な物質の構造が破壊されることによるものと推定している。更に、鎖長が長いゲノムＤＮＡなどが突起物との衝突により切断され、その結果、核酸抽出膜へのこれらの核酸の吸着力が低下し、抽出液へのゲノム核酸の混入量が減少したものと推定している。

本発明で言うところの凹凸とは、容器の内壁に高低差がある構造のことをいい、凸構造を含む構造、凹構造を含む構造、凹凸構造の中に更に凹凸構造を持つ構造などどの様な構造でもかまわない。凹凸は例えば枝分かれを持った樹形のような構造であっても良い。

この様な構造体は、容器内壁に少なくとも１個以上あれば良く、何個あってもかまわない。構造体の数は、多いほど攪拌効率が向上し、固体材料をライセート溶液、洗浄液、回収液が通過する時間が短くなり、抽出時間が短くなる。更に、処理可能な試料の量を増やすことも出来る。製造性、試料の構造体部位への残存、泡の発生を考慮すると、１００００００個以下であることが好ましい。
以上のことから、本発明では、好ましくは凹凸構造が少なくとも１個以上１００００００個以下ある容器を用いるのが良く、さらに好ましくは、３個以上１００００個以下、最も好ましくは５個以上１００個以下の凹凸構造がある容器を用いるのが良い。

容器の水平方向における凹凸構造の断面は、円形もしくは楕円形が好ましいが、四角形、三角形などどの様な形状であってもかまわない。
この様な構造体の形状は、一つの容器内に何種類用いてもかまわない。例えば、断面の形状が三角形のものと四角形のものを同時に用いても良い。
ここで、水平方向とは、容器に試料を出し入れする際における水平方向を表し、通常、開口部と水平の方向を表す。

凹凸の高低差は、０．０１ｍｍ以上あることが好ましい。高低差が大きいほど、攪拌効率が良くなり、その結果、種々溶液の通過時間は短くなる。しかし、高低差が小さいほど、製造が容易であり、容器から溶液を吸い取る際のチップの取り扱いが簡便となり、泡の発生による攪拌効率の低下を防ぐことが出来るので、好ましくは直径に対して０．０１％以上、４９％以下、さらに好ましくは、直径に対して０．１％以上、３０％以下、最も好ましくは５％以上、２０％以下が良い。

凹凸構造の断面形状は、容器の鉛直方向に対して水平面の段面積よりも鉛直方向の段面積の方が小さいほうが好ましい。これは、攪拌の際の溶液によって形成された溶液面が、より乱されやすく、攪拌効率が向上するからである。

凹凸構造は、容器を鉛直面、例えば、遠心処理を行う場合の遠心方向に対して、上側に凹凸構造を形成し、下側は平坦構造にすることが好ましい。これは、溶液が凹凸構造と接触している場合、溶液の回収性が悪くなるためである。これは、スピンダウンなどの遠心処理によって、溶液は容器の下側に移動するが、この際に、溶液と凹凸構造とが可能な限り接触している面積を減らすことで、溶液の回収性を良くするためである。本発明では、凹凸構造が形成されている領域は、容器の上側からの距離が、好ましくは８０％以内、更に好ましくは５０％以内であることが好ましい。

凹凸構造の素材は特に限定しない。金属、プラスチック、木、ガラスなどいかなる素材でもかまわず、容器自体の素材でもよい。

凹凸構造は、容器製造時に形成しても良いし、平坦な内壁を持つ容器に、熱処理などを行うことで後から形成させても良い。
さらに、凹凸構造部分だけを製造しておき、平坦な容器にこの部分をセットすることも出来る。これにより、攪拌時のみ凹凸構造部位を容器に取り付け、凹凸構造がない方が好ましい工程の時に、凹凸構造部位を取り外すことが出来る。

本発明の凹凸構造を持つ容器には、ふたが取り付けられていることが好ましい。ふたが取り付けられていることにより、攪拌時の液こぼれを防ぐことが出来るからである。ふたは、本体に結合していても良いし、ねじ式にしても良い。

本発明の凹凸構造を持つ容器の、容器自体は、通常核酸抽出で用いられる各種容器と同様の素材、構造を持つものがあげられる。例えば、金属、プラスチック、木、ガラスなどいかなる素材でもかまわず、凹凸構造と同じ素材でもよい。本発明においては、下部が円錐状になっている円柱構造を有し、密閉可能な蓋を有し、容積が０．１ｍＬ〜１０Ｌの所謂マイクロチューブの形態が好ましい。

＜生体材料＞
本発明における生体材料として使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス、培養細胞、あるいはそれらの溶解物およびホモジネート物などの生物材料が対象となる。培養細胞としては、浮遊系細胞、接着系細胞等が挙げられる。浮遊系細胞とは培養液中で容器壁に付着することなく漂いながら生育、増殖する細胞を指し、例えばＨＬ６０，Ｕ９３７，ＨｅＬａＳ３等が代表的な細胞株として挙げられる。接着系細胞とは培養液中で容器壁底面に付着し生育、増殖する細胞を指し、例えばＮＩＨ３Ｔ３，ＨＥＫ２９３，ＨｅＬａ，ＣＯＳ，ＣＨＯ細胞等が代表的な細胞株として挙げられる。検体として用いられる動物（またはその一部）としては、動物組織が挙げられる。例えば、動物を解剖したとき或いは生検により採取可能な、肝臓、腎臓、脾臓、脳、心臓、肺や胸腺など個体を構成する組織全てを使用することができる。

これらの検体は、細胞膜・核膜を溶解して核酸を溶出する試薬を含む水溶液、いわゆる核酸可溶化試薬で処理することが好ましい。これにより細胞膜・核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散した核酸混合物溶液を得ることができる。

本発明において「核酸」は一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖のいずれかもしくはそれらの混合物のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらが修飾されたもの、およびそれらの混合物、いずれのものでも良い。

生体材料、例えば、細胞から核酸成分を分離精製する場合、カオトロピック塩などを含む溶解液により細胞を溶解し、水溶性有機溶媒を添加することでライセート溶液を調製することがあるが、この際に、溶解液中に溶解させた核酸が凝集するとともに、核酸以外の成分も凝集する。この様な凝集物を含むライセート溶液を固体材料、例えば、多孔質膜を通過させると、これらの凝集物が多孔質膜中の細孔を塞ぎ、その結果、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が長くなると推定される。目詰まり成分が多い場合、例えば、処理する細胞数が多い場合には、ライセート溶液や洗浄液の通過時間が長くなり目詰まりが発生する可能性が高くなる。本発明では凝集物を小さくする効果があると考えられる攪拌工程での攪拌効率の向上に着目し、このための方法として、容器の内壁に突起状物、すなわち凹凸構造を持つ容器を用いて攪拌を行うことで、攪拌効率の大幅な向上を達成することが出来、これらの問題点を解決するに至った。

本発明で言うところの目詰まりとは、ライセート溶液もしくは洗浄液もしくは回収液が加圧や遠心などの操作によって膜を通過しなくなったとき、もしくは、ライセート溶液もしくは洗浄液もしくは回収液の通過時間がある敷居値以上、例えば、７０秒以上になった場合を目詰まりと呼ぶ。通過時間が短くなることは、核酸抽出全体の処理時間の短縮にも寄与するとともに、これまでと同等の時間内でより多くの生体材料を処理することが可能となる。本発明では、通過時間を短くすることで、目詰まりを減らすこと、各工程の通過時間を短くすること、抽出全体の処理時間を短くすること、以上２つの結果からこれまでよりも多くの生体材料を処理することを可能にすることも目的としている。さらに、ＲＮＡを抽出する場合、不要物であるゲノムＤＮＡの低減も目的としている。

＜分散液＞
生体材料から核酸を抽出する場合には、生体材料を溶解液と接触させる前に、予め生体材料を適当な分散液に分散させておくことが好ましい。特に、ペレット化した細胞を使用する場合には、分散性向上の観点から、分散液を用いることが好ましい。分散液を用いることにより、固体状態もしくはそれに近い状態の生体材料を分散させることで、溶解液添加時の生体材料溶解の均一化を行うことができる。その結果、核酸の収量や純度が向上する。また、収量、通過時間などが安定し、さらに、ライセート溶液や洗浄液、回収液の通過時間短縮を行うことが出来る。

分散液の種類は、浸透圧の違いによる生体材料の膨潤、破裂、収縮が最小限であり、細胞を分散させることが可能なものであれば、どの様なものでも用いることが出来る。この様な分散液として、例えば、緩衝液をあげることができる。

緩衝液の中でも、生化学用のｐＨ緩衝剤、特にグッド緩衝液が好ましい。本発明者らが鋭意検討を行った結果、グッド緩衝液の中でもＢｉｓ−Ｔｒｉｓ(N,N-bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane）緩衝液は通過時間が短く、目詰まりを起こす可能性が低いことを明らかにしたので、好適として用いることが出来る。

グッド緩衝剤としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ以外に、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperaxine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid）等が挙げられる。

分散液の液量は特に指定しないが、生体材料の量が多いほど、細胞数が多いほど分散液量を増加させて使用することが好ましい。しかし、分散液量の増加は、細胞の溶解作用とヌクレアーゼ活性を抑制する作用を持つカオトロピック塩濃度の低下を招くとともに、液量増加による通過時間の増加をも招く。これらのことから、本発明で使用する分散液の液量は、好ましくはライセート液量の８０体積％以下、更に好ましくは５０体積％以下、最も好ましくは２０体積％以下の液量であることが好ましい。

分散液は、浸透圧などの作用により細胞が全壊もしくは部分的に分解しないような濃度で使用することが好ましく、低すぎても高すぎても好ましくない。さらに、分散液の濃度は、ライセート溶液および洗浄液の通過時間に影響を及ぼし、例えば、分散液としてＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、液量として３０μＬを用いる場合、分散液の濃度が低いと、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が長くなる。分散液の濃度が高いと細胞は部分的に溶解し、細胞内の核酸やタンパクなどが溶出し、溶出した核酸分解酵素の作用などにより核酸が分解され、抽出後の核酸の収量が低下する可能性がある。これらのことから、本発明では、分散液を使用する場合には、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、１０ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。

細胞ペレットを調製する際に使用するＰＢＳを可能な限り取り除きＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に置換、もしくはペレット細胞にＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を添加することで、ライセート溶液、洗浄液の通過時間を大幅に短縮させることができる。これらのことから、本発明では、ＰＢＳなどの通過時間を長くする原因となる分散液などを取り除いてから、別の分散液を添加することで、細胞を再分散させることもできるし、細胞ペレットに極少量残存するＰＢＳはそのままにしておき、必要量のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を加えることもできる。

また、細胞を分散させても通過時間は長くなるが問題とならない通過速度であれば、特に、分散液の使用はしなくとも良い。

また、分散液を加えた後に、タッピングにより細胞を効率よく分散させることもできるし、ピペッティングを行うことにより、より効率よく細胞を分散させることもできる。また、凍結した細胞ペレットは、これらの処理の前に融解しておくことが、操作性の観点から好ましい。

平面板、例えば、シャーレ上で培養した細胞の場合、分散液を使用せずとも抽出は可能である。シャーレ上の培養液は除去しておくことが好ましく、除去後にＰＢＳなどの洗浄液を用いて細胞を洗浄することは、通過性の観点からもより好ましい。

＜溶解液＞
本発明において、核酸を含む試料を調製する際、好ましくは生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解し、生体材料中に含まれている核酸を溶出させて試料溶液を作成する。
溶解液としては、生体材料、例えば細胞を溶解できるものであれば、特に限定されず、核酸抽出の分野で使われる細胞等のサンプルを溶解する溶液を使用することができ、例えば、カオトロピック塩や界面活性剤、種々分解酵素、種々有機溶媒、それらの混合物などを挙げることができる。さらに、物理的に破壊することもできる。例えば、機械的往復運動を用いた方法、超音波処理、熱処理、小さなノズルを高速で通過させる方法、ボールミルを用いる方法、凍結と融解とを繰り返す方法などが挙げられる。
溶解液は、カオトロピック塩を含むことが好ましい。
溶解液中のカオトロピック塩としては、特に限定は無く、公知のカオトロピック塩を使用することができる。例えば、カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。

溶解液中のカオトロピック塩の濃度は、本発明者らが鋭意検討を行った結果、細胞を十分に溶解することが出来、調製したライセート溶液、洗浄液の通過時間が短い濃度を使用すれば特に指定はしない。しかし、濃度が低すぎると生体材料の溶解が不十分であることが原因で、通過時間は短くなるが、抽出後、核酸を全く得ることが出来ず、また、高濃度にしすぎると、溶解液保存時に低温下でカオトロピック塩は析出する。

以上の事から、カオトロピック塩の溶解液中の濃度は、０．１から１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、３ｍｏｌ／Ｌから４．５ｍｏｌ／Ｌ以下が最も好ましい。カオトロピック塩の、試料に添加した後の試料溶液における終濃度は、好ましくは０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌである。

溶解液は、核酸安定化剤を含むことが好ましい。本発明で言うところの核酸安定化剤とは、検体中の核酸を安定に存在させることができる試薬のことである。これには、核酸そのものを安定に存在させることが出来る試薬であるとともに、核酸を不安定化、例えば、核酸を分解するようなヌクレアーゼなどの核酸分解酵素による分解作用を低下もしくは完全に阻害させることで、核酸を分解させない試薬をも含むものとする。核酸安定化剤は、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤および消泡剤の中から選ばれるいずれか１つ以上と共存させることが好ましい。

ヌクレアーゼ活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。

核酸安定化剤として、２−メルカプトエタノールを用いた場合、その濃度が高いほど通過時間は短くなる。その一方で、濃度が低い方が作業環境性の点で優れている。
以上のことから、核酸安定化剤は、溶解液における濃度が０．０１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．０３〜１５質量％で用いることができる。メルカプト化合物は、溶解液における濃度が０．０１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．０５〜１５質量％で用いることができ、最も好ましくは、０．０５〜５質量％で用いることができる。

本発明者らは、溶解液中に界面活性剤を加えることによって、ライセート溶液の通過時間、洗浄液の通過時間を短くすることが出来ることを見出した。加える界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。更に、界面活性剤は、低細胞数の生体材料を用いたことによる核酸収量の低下を大幅に防ぐことが出来る。これは、水溶性有機溶媒のライセート中での濃度が低い場合に特に顕著である。この様な例として、ライセート溶液や洗浄液の通過時間を短くするために、ライセート溶液中の水溶性有機溶媒の濃度を下げることがあるが、その場合には、通過時間が短くなる反面、収量低下が生じる。そこで、界面活性剤を添加することによって、収量低下を改善することも出来る。

ライセート中の水溶性有機溶媒の濃度を低下させることで、通過時間を短くすることが可能であるが、これにより核酸収量は低下する。この収量低下も界面活性剤の添加により改善することが出来る。

本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤を好ましく用いることができる。

ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがさらに好ましい。

カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。

界面活性剤の濃度を鋭意検討した結果、溶解液中の界面活性剤の濃度を高くすると、ライセート溶液通過時間、洗浄液通過時間が短くなった。しかし、界面活性剤の濃度を高くしすぎると、カオトロピック塩の種類によっては核酸回収量の低下を招くとともに、泡の発生が問題となった。これらの結果から、本発明では、界面活性剤の溶解液中の濃度は、０．０５質量％〜３０質量％、特に好ましくは０．１質量％〜７．５質量％にすることが好ましい。また、界面活性剤を使用することで、ライセート溶液が泡立ち易くなるので、操作のし易さから界面活性剤を全く使用しなくとも十分な性能が得られるのであれば、使用しなくとも良いし、界面活性剤と共に消泡剤を用いても良い。

消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。これらの消泡剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。特に好ましくは、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。
消泡剤の溶解液中における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。

尚、界面活性剤は、工程（ｂ）の後に加えることも好ましい。この際の界面活性剤の具体例は上記と同様のものがあげられる。工程（ｂ）の後に加える際、０．００１〜３０質量％の界面活性剤を含む溶液の形態で添加されることが好ましい。溶液は水溶液であることが好ましい。このように界面活性剤を工程（ｂ）の後で添加することで、工程（ｂ）における攪拌を機械ホモジナイズ法のように激しく行ったとしても泡の発生を防ぐことが可能となり、好ましい。

溶解液は、水溶性有機溶媒を含んでいることが好ましい。
溶解液中に水溶性有機溶媒を混合しておくことで、界面活性剤の溶解性が上がり、溶解液量が増え、ライセート溶液、洗浄液の通過時間を大幅に短くすることが出来る。特に、洗浄液通過時間への効果は大きい。さらに、一回の溶出工程において、抽出膜からより核酸が溶出しやすくなる。本発明では、溶解液中の水溶性有機溶媒の濃度が７０体積％以下であることが好ましく、５０体積％以下が特に好ましく、最も好ましくは、２０％以下である。

溶解液中に加える水溶性有機溶媒の種類は、アセトン、アルコール類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類は、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。とりわけメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの中でも、環境負荷の低減、有毒性の観点からエタノールが特に好ましい。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。

ライセート溶液、洗浄液の通過速度が十分に速ければ、水溶性有機溶媒を加えなくとも良い。この様な例として、例えば、低細胞数を取り扱う場合を挙げることが出来る。

また、溶解液は、緩衝液を含むことも好ましい。
溶解液中に緩衝液を加えることは、溶解液のｐＨ変化を防ぐ観点から好ましい。緩衝液としては、ｐＨを一定に保つことが出来るものであれば、どの様な緩衝液をも用いることが出来るが、生化学用に一般的に使用されているものが好ましい。例えば、グッド緩衝液を用いることが好ましい。グッド緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(N,N-bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane）、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperaxine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid）等が挙げられる。
緩衝液の濃度もｐＨを一定に出来る濃度であればどの様な濃度でも良い。好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下が良い。

＜攪拌＞
ライセート溶液を作成する際、生体材料に溶解液を添加する前、溶解液を添加し試料溶液を作成した後、ライセート溶液を調製した後、のいずれの工程で攪拌（ホモジナイズやボルテックス処理）処理を行ってもかまわない。ホモジナイズ処理することで、通過時間を長くするような成分、例えば、目詰まりの原因となる物質が粉砕され、目詰まりの改善および通過時間が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、高速攪拌処理を用いる処理、微細空隙から押し出す処理、ピペッティング、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのビーズを用いる処理等で行うことができる。
＜機械的往復運動による攪拌＞
本発明で言うところの機械的往復運動による攪拌とは、一定の方向に対して（但し８の字型の様な運動も含む）、容器に対して往復運動を行いながらホモジナイズ処理を行うことを言う。この処理を行う際に、ガラス、ステンレスやジルコニアなどのボールを添加するとよりホモジナイズ処理が進行し、通過時間が短くなるので好適に用いることが出来る。この様な処理を一般的にビーズミル処理という。

ホモジナイズの方法は、特に限定されず、一般的に行われている方法を用いることが出来る。一例を挙げると、攪拌装置により３０から６０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、最終的に分離精製される核酸収量を好適に増加させることができるとともに、通過時間が短くなる。例えば、ＲＮＡを抽出する場合、ゲノムＤＮＡの切断により、抽出溶液中へのゲノムＤＮＡの混入が大幅に減少する。

本発明では、溶解液を加えた後にピペッティングを行うことが好ましい。細胞数が多い場合には、ピペッティングは特に有効である。ピペッティングを行う際は、溶解液を加えたピペットを用いて、溶解液を加えると同時に行うことが作業性の観点から望ましい。

ペレット状の細胞から核酸を抽出する場合には、本発明で使用する凹凸構造を持つ容器を用いてペレット状の細胞を準備してもかまわない。こうすることで、容器の使用量を減らすことが出来、また、途中で容器内の溶液を移し変える必要性がなくなり、作業性が向上するからである。

凹凸構造を持つ容器を使用するプロトコール上での位置は、生体材料を調製する時、生体材料を溶解液で溶解させた後、水溶性有機溶媒を添加した後、いずれの場合においても良い。

溶解液添加後の攪拌処理、水溶性有機溶媒添加後の攪拌処理の前に、内部に凹凸構造を持つ容器から内部に凹凸構造を持たない容器に移し替えることもできる。特に、内部に凹凸構造を持つ容器を用いた場合、水溶性有機溶媒添加後の攪拌処理によって、泡が発生することがあり、この場合には、攪拌処理の前に、内部に凹凸構造を持たない容器に移してから攪拌処理を行うことは有効である。

本発明では、生体材料を溶解した溶液に対してピペッティング操作を行って作成した溶解液、もしくは生体材料を溶解することで調製した溶解液に対して、攪拌操作を行うことが好ましい。攪拌時間を長くすればするほど、ライセート溶液通過時間、洗浄液通過時間が短くなり、核酸の回収量が増加し、さらには核酸回収量が安定する。

＜ライセート溶液の調製＞
以上の工程によって調製した生体材料を溶解し核酸を溶出させた試料溶液中に、好ましくは水溶性有機溶媒を添加する。
本発明では、水溶性有機溶媒として、特に限定はしないが、アルコール類を好ましく用いることができる。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール又はその異性体、ブタノール又はその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよい。特に好ましい水溶性有機溶媒として、エタノールを用いることが出来る。

尚、ライセート溶液の通過時間は、水溶性有機溶媒の濃度（ライセート溶液中の終濃度）によって山型に変化する。低濃度では、通過時間が短く、濃度を増すほど通過時間は長くなる。通常、約３０〜３５％ぐらいで通過時間が最も長くなる。水溶性有機溶媒の濃度を更に増していくと、通過時間は短くなる。ライセート中の水溶性有機溶媒の終濃度は、細胞溶解後に加える水溶性有機溶媒の量、あるいは溶解液中にあらかじめ加えておく水溶性有機溶媒の量によっても調製できる。
また、水溶性有機溶媒の濃度を最適にすることで核酸の回収量を向上させることが出来る。水溶性有機溶媒の濃度を高くし最適値に近づけるほど、また、水溶性有機溶媒の濃度を低くし最適値に近づけるほど核酸の収量は増加する。すなわち、核酸の回収量を増加させるためには、水溶性有機溶媒の濃度を最適値にすることが重要である。
以上の事から、本発明では水溶性有機溶媒の濃度は、ライセート溶液を調製した時の濃度（即ち工程（ｄ）における修濃度）で１０体積％から６０体積％が好ましく、２０体積％から４０体積％が特に好ましい。

水溶性有機溶媒を加えた後、少なくとも一回のピペッティング操作もしくは攪拌操作もしくはこれらの両方を行うことが好ましい。攪拌操作を行う場合には、一回で行うこともできるが、攪拌を二回行い、最初の攪拌では検体一本ずつ行い、二回目の攪拌では検体をまとめて行うこともできる。二回攪拌を行うことは、検体数が多い場合には、特に有効である。

攪拌時間は、一回目も二回目も０．１秒以上６００秒以下であることが好ましい。使用者の負担軽減から、一回目の攪拌時間を短く、二回目の攪拌時間を一回目よりもより長くする方が好ましい。

水溶性有機溶媒を加えた後のピペッティングは、その回数を増やせば増やすほど、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が短くなり、核酸の収量が向上する。

使用する細胞数が少ない場合には、使用者の負担軽減の観点から、一回の攪拌操作、もしくはピペッティング操作だけでもかまわない。

＜核酸の吸着＞
以上の工程によって調製したライセート溶液を、固体材料に接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が固体材料に吸着される。

本発明の固体材料は、好ましくは核酸吸着性多孔性膜であり、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。

また、本発明の固体材料は、表面に親水基を有する膜であることが好ましい。ここで親水基とは、水と相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。本発明には、特開２００５−１９２５５８の内容を含むものとする。

使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

固体材料は、カートリッジに保持されていることが好ましい。
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであっても良い。
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。

ライセート溶液は、複数のカートリッジに分注することが好ましい。
作成したライセート溶液を二個以上のカートリッジに分注することで、本来ならばより少ない本数のカートリッジを使用した場合には、目詰まり、もしくはライセート溶液、洗浄液の通過時間が長くなるような検体でも通過させることが出来る。

尚、工程（ｅ）で、一つのカートリッジにライセート溶液を二回以上入れることも好ましい。
細胞を十分に溶解していればライセート液量は多いほど目詰まり改善に好適であるものの、固体材料を内側に保持しているカートリッジを用いた場合には、カートリッジ内に入るライセート液量は固定されてしまう。そこで、カートリッジへのライセート添加を数回に分けることが好ましい。つまり、ライセート溶液をカートリッジに添加した後、加圧あるいは遠心によってライセートをカートリッジ内の膜を通過させ、次いで、一回目のライセート添加でカートリッジに入りきらなかったライセート溶液を添加し、次いで、加圧あるいは遠心によってライセートをカートリッジ内の膜を通過させる、という工程を繰り返すことが好ましい。

＜洗浄工程＞
核酸を固体材料に吸着させた後、洗浄液を接触させて洗浄することが好ましい。
洗浄工程により、最終的に得られる核酸の純度が向上し、必要な核酸を含む検体の液量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作を簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。

洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、固体材料を収容したカートリッジ（核酸分離精製カートリッジ）へ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして固体材料を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、固体材料を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることが、洗浄効率が優れてより好ましい。

洗浄工程において、洗浄液の使用時の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。

洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくともいずれかを含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、固体材料に核酸と共に吸着した核酸混合物溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、固体材料から核酸は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが必要である。この目的には、核酸はアルコール等の水溶性有機溶媒に対し難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱離させるのに水溶性有機溶媒が適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用を向上することができる。

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。

洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、５〜１００質量％であることが好ましく、５〜４０質量％であることがより好ましい。この範囲で、ＤＮＡのコンタミネーションが増大することなく、目的のＲＮＡが固体材料から脱離することがなく、したがって、ＲＮＡを純度よく、回収量を高くすることができ好ましい。

一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。

水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。

洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。これによって、回収工程においてカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＲＴ−ＰＣＲ反応等を行う場合の酵素反応を阻害するので、後に酵素反応等を行う場合を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性があり有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。

ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。

従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、回収工程の際に洗浄液が混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱離を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次工程以降に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が回収工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。

しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ2以上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。

核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回としてもよい、(2)洗浄工程を室温でできる。(3)洗浄工程の後、直ちに次工程を行うことができる。(4)前記(1)、(2)、(3)のいずれか１つもしくは２つ以上組み合わせることも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くためには、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に用いる核酸吸着性多孔性膜は薄膜を用いることも出来るので乾燥工程を省略できる。

従来、核酸の分離精製方法において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に固体材料を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。

ＤＮＡとＲＮＡを含むライセート溶液からＲＮＡのみを選択的に分離精製するには、固体材料を収容した核酸分離精製カートリッジに通過させ、固体材料に核酸を吸着させた（吸着工程）後、洗浄を行い（洗浄工程）、ＤＮａｓｅを作用させる工程を経ることにより行うことが出来る。

ＤＮａｓｅは特に限定無く、いずれのＤＮａｓｅも用いることが出来る。

核酸分離精製カートリッジの固体材料でＤＮａｓｅを作用させる工程における時間は、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡ量と作用させるＤＮａｓｅ濃度により異なるが５秒〜３６０分が好ましく、３０秒〜１８０分がより好ましい。また、核酸分離精製カートリッジの固体材料でＤＮａｓｅを作用させる工程における温度は４℃以上であればよく、１０〜５０℃が好ましく、反応効率を高めるため高温、例えば５０〜７０℃で行うこともできる。尚、「固体材料でＤＮａｓｅを作用させる」とは、固体材料における、核酸が吸着している部位とＤＮａｓｅを作用させることを意味し、「固体材料で」とは、固体材料上に限らず、多孔性膜における孔中や、膜の裏側の孔の出口等も含む。

また、本発明でのＤＮａｓｅの添加は、洗浄液の通過時間を短くする、もしくは目詰まりを改善する目的も有する。

ＤＮａｓｅ以外に、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、糖分解酵素、核酸分解酵素、クロロホルムやメタノールなどの有機溶媒のいずれか一つもしくはこれらを混合したものを添加することもできる。これらの添加により、固体材料上に残っている目詰まり原因物質の構成成分が分解促進されると推定している。その結果、洗浄液の通過性を向上させ、洗浄液通過時間の短縮、目詰まりの改善を行うことができる。

これらの添加は、ライセート溶液通過後に行ってもかまわないが、数回洗浄液による洗浄を行った方がより好ましい。特に、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、糖分解酵素、核酸分解酵素を用いる場合には、固体材料上に残存しているカオトロピック塩の影響で、これらの分解酵素が変性を受け、活性を阻害されることで、目詰まり原因物質の分解能力が低下し、洗浄液通過時間が短くならない可能性が高く、さらに、ゲノムＤＮＡを除去する場合、そのゲノムＤＮＡを切断する活性が低くなるからである。

＜回収工程＞
核酸を吸着させた固体材料に対して、回収液を接触させて、核酸を固体材料から脱離させ溶出液を得ることができる。
回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、固体材料を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして固体材料を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、固体材料を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れてより好ましい。

検体から調整した試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整してＲＮＡの脱離を行うことができる。分離精製されたＲＮＡを含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量のＲＮＡを分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる。また、工程後に回収したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液（例えば、ＫＣｌ ７５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ₂ ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＴＴ １０ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液）を用いることもできる。

回収液のｐＨは、ｐＨ１〜１０であることが好ましい。さらには、ｐＨ２〜７であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着ＲＮＡの溶出に効果を及ぼす。回収液は、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましい。塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらには、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。こうすることで、ＲＮＡの回収率が向上し、より多くのＲＮＡを回収できることができる。

回収液の体積を少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。

また別の態様としては、回収液の体積を調整することで核酸の脱離を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程、例えばＲＴ−ＰＣＲなどを行う場合に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、固体材料からの核酸回収率の増加を図ることができる。

また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の使用時の温度を０〜１０℃にして固体材料からの核酸の脱離を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。

また、回収液の使用時の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱離させて分離精製することができる。

また別の態様としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、固体材料からの核酸の脱離を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。カートリッジを複数本用いる場合には、第一のカートリッジに対して回収液を加え、核酸を溶出させ、この溶出液を第２のカートリッジに加え、再び核酸を溶出させることも出来る。このような操作は、用いたカートリッジの本数分行うことが出来る。これらの操作により、高濃度の核酸を得ることが出来る。また、一つのカートリッジに対して、回収液を加えて核酸を溶出させた後、その溶出液を再び同じカートリッジに加えて、再度核酸を溶出させることも出来る。この様な操作により、一回の操作による核酸の濃度、量よりもより高い濃度、より多い核酸を得ることが出来る。

回収工程においては、核酸の回収液をその後の工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェインリアクション）法が適用される。この場合、分離精製された核酸溶液はＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＲＴ−ＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。

回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがこれに限定されるものではない。

上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に固体材料を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する方法はその含まれる工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。また、前記のキットの使用を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置により、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。

以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に固体材料を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動装置の例を示すが、本発明の自動装置はこれに限定されるものではない。

核酸を固体材料から脱離させる場合の回収液と固体材料との浸漬時間を長くすることで、浸漬時間が短い場合には数回の抽出操作を行わなければ吸着させた核酸が溶出しなかったのが、一回もしくはより少ない回数でより多くの核酸を溶出させることが可能となる。本発明者らが詳細に検討した結果、核酸を抽出する際の浸漬時間が０．１秒以上６００秒以下、好ましくは、１０秒以上１２０秒以下であれば、十分な量の核酸を得ることが出来た。機械的往復運動を用いた核酸抽出法の場合、回収液の浸漬時間は、１０秒以上１０分以下、好ましくは１２０秒以上６００秒以下であれば、十分な量の核酸を得ることが出来た。

溶解液中の界面活性剤の濃度を上げると、ライセート溶液、洗浄液の通過速度が短くなるが、予想される核酸の収量を得るためには、数回の抽出操作が必要となり、回収した核酸の濃度が低下するが、核酸を吸着させた固体材料と回収液との浸漬時間を増加させることでより多くの核酸が回収できる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実施例１＞突起物あり、なしが回収量、通過時間、ゲノムコンタミへ及ぼす影響
直径３．５ｃｍのディッシュ上で培養した接着細胞Ｈｅｋ２９３（細胞数は約2×10⁶個）の培養液を吸引除去した。１ｍＬのＰＢＳでディッシュを洗浄後、洗浄液を吸引除去した。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を４５０μＬ加え、セルスクレイパー（岩城硝子製）でディッシュ表面から細胞をはがし、その溶液をマイクロチューブに移した。この時、突起物があるチューブとして、日本ミリポア製のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０からフイルターを固定している部品を取り除いたチューブを使用した。なお、突起物の数は６個、長さは約１２ｍｍ、高さは約１ｍｍ、断面はかまぼこ状のものを用いた。突起物がないマイクロチューブとしては、１．７ｍＬのプラチナチューブ（ビーエム機器株式会社）を使用した。マイクロチューブをＣＵＴＥ ＭＩＸＥＲ ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウさせた。

特級エタノールを１９５μＬ加え、１分間ＣＵＴＥ ＭＩＸＥＲ ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。

ＮＥＸＴカートリッジ（富士写真フイルム株式会社製、口径７ｍｍ、細孔２．５μｍ）、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士写真フイルム株式会社製）にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、洗浄液量を７５０μＬ、回収液量を５０μＬ、回収液の浸漬時間を２４０秒に設定した。

ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、紫外可視分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定し、回収量は２６０ｎｍの吸光度から、核酸の純度は２６０ｎｍと２８０ｎｍの比率から決定し、この比率が１．８以上であれば、純度は良好と判断した。ＤＮＡの混入などはゲル電気泳動を用いて分析した。ゲル電気泳動の条件は、バッファーとしてＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ）を用い、試料５μＬとローディングバッファー（１０×Ｂｌｕｅ Ｊｕｉｃｅ）とを混合後、全量を電気泳動した。

ライセートの通過時間の結果を図１に示した。通過時間は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅの加圧ヘッドが加圧を開始してから、カートリッジ内の溶液が抜けるまでの時間である。突起物なしの場合は、平均３８秒で通過し、これに対して、突起物がある場合は、平均２２秒で通過した。これらの結果から、マイクロチューブの内側に突起物を設けることで、ライセートの通過時間は約４０％低下し、大きな効果を示した。

図２には、洗浄液の通過時間を示した。突起物なしの場合、洗浄液が通過するためには平均２３秒必要としたが、突起物がある場合は、平均１４秒で通過した。これらの結果から、マイクロチューブの内側に突起物があると、ライセートの通過時間は約４０％低下し、大きな効果を示した。

図３は、回収した核酸の収量をプロットしたものである。突起物なしも突起物ありも、ほぼ同程度の核酸が得られた。

図４は、ゲノムＤＮＡのコンタミを見るためのゲル電気泳動を示したものである。突起物ありと突起物なしとを比較すると、ゲノムＤＮＡが減少していた。

以上の結果から、内側に突起物を持ったマイクロチューブを使用すると、ライセート通過時間、洗浄液通過時間ともに短くなり、抽出後の核酸の収量も同程度に得られ、ゲノムＤＮＡのコンタミも減少する。

＜実施例２＞スピンカラム法での突起物の効果
直径３．５ｃｍのディッシュ上で培養した接着細胞Ｈｅｋ２９３（細胞数は約2×10⁶個）の培養液を吸引除去した。１ｍＬのＰＢＳでディッシュを洗浄後、洗浄液を吸引除去した。溶解液ＲＬＴ（株式会社キアゲン）を６００μＬ加え、セルスクレイパーでディッシュ表面から細胞をはがし、その溶液をマイクロチューブに移した。この時、突起物があるチューブとして、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０からフイルターを固定している部品を取り除いたチューブを使用した。なお、突起物の数は６個、長さは約１２ｍｍ、高さは約１ｍｍ、断面はかまぼこ状のものを用いた。突起物がないマイクロチューブとしては、１．７ｍＬのプラチナチューブ（ビーエム機器株式会社）を使用した。マイクロチューブをＣＵＴＥ ＭＩＸＥＲ ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウさせた。７０％エタノール水を６００μＬ加え、マイクロチューブをＣＵＴＥ ＭＩＸＥＲ ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウさせ、ライセート溶液を調製した。

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｃｏｌｕｍｎ（株式会社キアゲン）にライセート溶液を入れ、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。Ｃｏｌｕｍｎにはライセート溶液が一回では入りきらなかったので、同じカラムに残りのライセート溶液を入れ、同様の遠心処理をもう一度行った。

ＲＷ１（株式会社キアゲン）を７００μＬカラムに加えて、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。ＲＰＥ（株式会社キアゲン）を５００μＬカラムに加え、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心処理を行った。もう一度、ＲＰＥを５００μＬカラムに加え、１５０００ｒｐｍで２分間遠心処理を行った。

ＲＮａｓｅフリー水を５０μＬカラムに加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心処理を行った。この処理を２回行い、合計１００μＬの核酸抽出液を得た。

核酸の定量、電気泳動は実施例１と同様にして行った。

突起物ありと突起物なしとを比較すると、突起物ありの方が１．４倍多く、核酸が得られた。

図５には、ゲル電気泳動の結果を示した。突起物なしは突起物ありと比較して、ゲノムＤＮＡのバンドが薄くなっており、突起物はゲノムＤＮＡを減少させる効果も併せ持っていることが分かった。

ライセートの通過時間 洗浄液（一回目）の通過時間 抽出後の核酸の収量 抽出後の抽出液のゲル電気泳動 スピンカラム法に対して、突起物を持つマイクロチューブを用いた場合の抽出液のゲル電気泳動 内側に凸部を持つ容器の具体例 内側に凸部を持つ容器における、凸のある部位の断面図

Claims (18)

1. 内側に凹凸を持つ容器内で核酸を含む試料を攪拌する工程を含む、核酸抽出方法。
2. 以下の工程を含む請求項１の核酸抽出方法。
   （ａ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解し、生体材料中に含まれている核酸を溶出させて試料溶液を作成する工程、
   （ｂ）試料溶液を攪拌する工程、
   （ｃ）工程（ｂ）で得られた溶液に対して水溶性有機溶媒もしくは水溶性有機溶液を加える工程、
   （ｄ）攪拌によりライセート溶液を調製する工程、
   （ｅ）ライセート溶液と固体材料とを接触させて溶解液中に含まれている核酸を固体材料に吸着させる工程、および、
   （ｆ）核酸を吸着させた固体材料と回収液とを接触させて、核酸を固体材料から脱離させ核酸を含む溶出液を得る工程。
3. 工程（ａ）における生体材料を溶解液と接触させる前に、緩衝液を含む分散液を用いて生体材料を分散させる、請求項２の核酸抽出方法。
4. 工程（ａ）における溶解液が、溶解液に対して０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌのカオトロピック塩を含む、請求項２または３の核酸抽出方法。
5. 工程（ａ）における溶解液の水溶性有機溶媒濃度が、１０〜５０体積％である、請求項２〜４のいずれかの核酸抽出方法。
6. 工程（ａ）における溶解液が、界面活性剤を０．００１〜３０質量％含む、請求項２〜５のいずれかの核酸抽出方法。
7. 工程（ａ）における溶解液が、緩衝液を含む、請求項２〜６のいずれかの核酸抽出方法。
8. 工程（ａ）における溶解液が、消泡剤を含む、請求項２〜７のいずれかの核酸抽出方法。
9. 工程（ｂ）の後に、０．００１〜３０質量％の界面活性剤を含む溶液を添加する、請求項２〜５のいずれかの核酸抽出方法。
10. 工程（ｄ）で得られたライセート溶液が、水溶性有機溶媒を終濃度１０〜６０体積％で含有している、請求項２〜９のいずれかの核酸抽出方法。
11. 工程（ｂ）もしくは（ｄ）における攪拌が、機械的往復運動を伴う攪拌である、請求項２〜１０のいずれかの核酸抽出方法。
12. 工程（ｆ）における固体材料が、表面に水酸基を含む固体材料である、請求項２〜１１のいずれかの核酸抽出方法。
13. 工程（ｆ）における固体材料が、カートリッジに保持されている、請求項２〜１２のいずれかの核酸抽出方法。
14. 工程（ｅ）で、ライセート溶液を複数のカートリッジに分注する、請求項２〜１３のいずれかの核酸抽出方法。
15. 工程（ｅ）で、一つのカートリッジにライセート溶液を二回以上入れることを特徴とする、請求項２〜１３のいずれかの核酸抽出方法。
16. 工程（ｆ）の前に、核酸が吸着している固体材料に対して、水溶性有機溶媒を０．１から８０質量％含む洗浄液を接触させる工程を含む、請求項２〜１３のいずれかの核酸抽出方法。
17. 前記工程（ｅ）および（ｆ）において、ライセート溶液、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材料と接触させる工程を含む、請求項２〜１５のいずれかの核酸抽出方法。
18. 内側に凹凸を持った容器、分散液、溶解液、洗浄液、回収液、核酸を結合させるための固体材料のうち少なくとも二つ以上から構成された請求項２〜１６のいずれかの核酸抽出法を行うためのキット。

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