JP2007298350A - 細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】気泡の発生を極力抑制することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を実現することを目的とする。
【解決手段】第一の貫通孔2を有した薄板1と、第二の貫通孔4を有した保持プレート3と、第一の貫通孔2の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレート5とを有し、薄板1を第二の貫通孔4を塞ぐように固着し、流路プレート5を保持プレート3の下部に固着させた細胞電気生理センサであって、流路プレート5に第三の貫通孔6を第二の貫通孔4と同軸上に設け、この第三の貫通孔6を通して外部より中空管プローブ7を挿入した構成とする。
【選択図】図1
【解決手段】第一の貫通孔2を有した薄板1と、第二の貫通孔4を有した保持プレート3と、第一の貫通孔2の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレート5とを有し、薄板1を第二の貫通孔4を塞ぐように固着し、流路プレート5を保持プレート3の下部に固着させた細胞電気生理センサであって、流路プレート5に第三の貫通孔6を第二の貫通孔4と同軸上に設け、この第三の貫通孔6を通して外部より中空管プローブ7を挿入した構成とする。
【選択図】図1
Description
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよびその製造方法に関するものである。
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、このイオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを1個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、2つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞の電気生理的測定を可能にしている。これは、平板に作製された貫通孔はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引などの方法により細胞が自動的に引きつけられ、細胞を容易に保持できるという利点を有している(例えば、特許文献1参照)。
特表2002−508516号公報
しかしながら、前記従来の構成では、細胞の電気生理現象を測定する場合、細胞は溶液中で存在し、この細胞は溶液の状態、例えば薬剤の溶解濃度、イオン濃度などには極めて敏感に反応する。このとき、溶液の内部に残留する気泡などの状態は測定結果に悪影響を及ぼすことが分かっている。このため、溶液の流れの制御は極めて重要である。
特に、細胞の電気生理現象の一つである細胞膜を流れるイオン電流を測定する工程において、二つの領域それぞれに蓄積されている液体の種類を交換する必要性がしばしば存在する。このため、ピペットによって内部に蓄積される液体を交換する方法、平板の上下の領域を閉空間の流路に閉じこめて、この閉空間の流路の内部の溶液を置換する方法などがあるが、閉空間の内部の圧力制御が難しく、流路の内部に気泡が発生することによって測定が不安定になるという課題を有していた。
本発明は、気泡の発生を極力抑制することによって高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することを目的とするものである。
前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を有した薄板と、第二の貫通孔を有した保持プレートと、第一の貫通孔の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレートとを有し、前記薄板を第二の貫通孔を塞ぐように固着し、前記流路プレートを保持プレートの下部に固着させた細胞電気生理センサであって、流路プレートに第三の貫通孔を第二の貫通孔と同軸上に設け、この第三の貫通孔を通して外部より中空管プローブを挿入し、且つこの中空管プローブの先端を第二の貫通孔の内部に流路とシール性を保持して挿入したものである。
本発明の細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、流路に溶液を流出入させて薄板の一方の領域内の溶液を迅速に交換できるとともに、第三の貫通孔から中空管プローブを挿入することによって、薄板の一方の領域周辺の圧力制御を気泡が発生することを極力抑えながら制御することができることから、効率よく高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができる。
(実施の形態1)
以下、本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を参照しながら説明する。
以下、本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を参照しながら説明する。
図1は本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサの断面図であり、測定時における細胞電気生理センサのセンサ構造の様子を示している。図1において、1はシリコン、二酸化シリコン、ガラスなどからなる薄板であり、上下の面に貫通するように第一の貫通孔2を設けている。3は樹脂よりなる保持プレートであり、この保持プレート3には上下に貫通する第二の貫通孔4を設けている。
そして、この第二の貫通孔4の内部に薄板1を第二の貫通孔4を塞ぐように保持している。これによって、保持プレート3の上下の空間は第一の貫通孔2を通してのみ、連通している。
また、5は樹脂材料等よりなる流路プレートであり、この流路プレート5を保持プレート3の下面に当接させることで、この内部に流路12aを形成しており、この流路12aは流入孔10および流出孔11を通して外部と連通している。
さらに、流路プレート5には第三の貫通孔6を設けており、この第三の貫通孔6には中空管プローブ7を挿入して設置することができるように構成している。
また、この中空管プローブ7の内部には第一の測定電極8を形成し、薄板1の上部には第二の測定電極13を形成している。そして、これら測定電極8,13はそれぞれの領域に蓄積された第二の溶液16または第一の溶液15と接している。これによって、二つの領域間で発生する電位差、電流、抵抗値などを測定することができるように構成している。
なお、測定時においては中空管プローブ7の先端は第二の貫通孔4の開口部に密着して設置することによって、前記流路とシール性を保持している。
これによって、中空管プローブ7の内部に蓄積された第二の溶液16は流路12a側へ漏れることなく、電気的にも絶縁が保たれることから、薄板1の上下領域で発生する電気化学的変化を高精度に測定することができる。ここで、上下領域で発生する電気化学的変化とは、被検体細胞18を第一の貫通孔2へ保持させることによって、被検体細胞18が細胞の内外へ各種イオンを透過させることによって生じる細胞膜電流、細胞膜電位などを含むものである。
また、前記中空管プローブ7の第二の貫通孔4の開口部に密着して挿入するために、図2に示したように中空管プローブ7の先端の内壁面にスリットを設けることによって第二の貫通孔4への挿入を容易にするとともに、よりシール性の高い気密性を保持することができる。
なお、このような構成において、中空管プローブ7の設置の際の密着度をゆるめれば、簡単に流路12aの内部の液体を中空管プローブ7の内部へ導入することも可能である。すなわち、流入孔10および流出孔11を通して流路12aの内部に流入蓄積させた第二の溶液16は、図3に示すように中空管プローブ7を第二の貫通孔4の設置位置から抜いて隙間を作ることで、中空管プローブ7の内部に蓄積していた第一の溶液15を押し出して第二の溶液16を内部へ導入することができる。
このとき、好ましくは中空管プローブ7の根元側に吸引システム9を接続しておくことで、より簡単に流路12aの液体を中空管プローブ7の内部へ導入することができる。
そして、再度中空管プローブ7を第二の貫通孔4へ密着させれば、再び中空管プローブ7の内部の液体は流路12a側とシール性を保持して隔離することが可能であることから電気的にも絶縁することができ、薄板1の上下領域で発生する電気化学的変化を高精度に測定することができる。
このように、前記構成を用いれば、溶液の種類を培養液、薬液あるいは試薬などの液体などに自由に変えることが容易となる細胞電気生理センサを実現することができる。
なお、前記構成のような構成および方法によって溶液を交換することが可能となることから、一度中空管プローブ7の内部の液体を抜き取ったりする必要がなくなり、気泡の発生を効率よく抑制することができる。
次に、本実施の形態1における細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。
図4は本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサに中空管プローブ7を挿入する前の状態を示している。この中空管プローブ7を挿入する前には、第三の貫通孔6をフィルム14によって塞いでおり、流路12aの内部に液体を流入・蓄積させても液体が漏れ出さないようにしている。
まず始めに、図5に示すように薄板1の上部領域と下部領域に第一の溶液15を導入する。例えばこの第一の溶液15は細胞外液である。
次に、図6に示すように中空管プローブ7を第三の貫通孔6の内部に挿入する。このとき、フィルム14を搾孔することとなるが、フィルム14の材質をポリエチレン、シリコンゴムなどの弾力性の高い材料にしておけば、搾孔された場合でも外部に第一の溶液15が漏れ出すことはないので好都合である。
そして、図7に示すように中空管プローブ7の根元側の吸引システム9から吸引することによって、第一の溶液15を速やかに中空管プローブ7の内部へ導入することができる。
なお、第二の貫通孔4の付近、あるいは中空管プローブ7の内部に気泡を残留させないためには、流入孔10から流出孔11あるいは中空管プローブ7へ向かって第一の溶液15を流し続けることが極めて効果的である。
次に、図8に示すように中空管プローブ7を第二の貫通孔4の内部へ十分密着するように突き当てる。このとき、別の例として、十分に密着させるためには図11に示すように中空管プローブ7の先端をテーパ形状とすることが好ましい。そして、中空管プローブ7の先端の外形を第二の貫通孔4より小さくし、第三の貫通孔6よりも小さくし、且つ第二の貫通孔4より第三の貫通孔6に向かって大きくなるテーパ形状としておくことが好ましい。これによって、挿入を容易にできるのと、シール性を容易に高めることができる。
また、図8に示す状態において、薄板1の上下の領域、第一の貫通孔2の内部、中空管プローブ7の内部は、いずれも第一の溶液15で満たしており、第一の測定電極8と第二の測定電極13間で所定の抵抗値、代表的には1MΩから10MΩの値が観測される。
次に、図9に示すように薄板1の上部領域に被検体細胞18を投入する。このとき、被検体細胞18は薄板1の上部領域にある第一の溶液15中を浮遊しているが、その後、図10に示すように中空管プローブ7に連結した吸引システム9から吸引を行うと、被検体細胞18は第一の貫通孔2へと引き込まれる。
しかしながら、被検体細胞18の大きさは第一の貫通孔2より大きいことから、第一の貫通孔2を通り抜けることはできず、第一の貫通孔2の開口部の表面で保持される。この状態で、被検体細胞18の第一の貫通孔2の開口部への密着力が十分に高いと、第一の測定電極8と第二の測定電極13との間で観測される抵抗値は100MΩ以上、好ましくは1GΩ以上となる。
このように、被検体細胞18が十分高い密着度で第一の貫通孔2へ保持されると、被検体細胞18の内外で、例えばNa+,Ca2+,K+などのイオンの流出入によって発生する膜電流、あるいは細胞膜の内外の電位差の変化は、第一の測定電極8と第二の測定電極13間に観測される電流値、電圧値の変化として高精度に測定することができる。
なお、前記抵抗値や電流や電圧を測定する際、薄板1の上下領域で溶液の種類を変える必要がある場合には、図3に示すように、一度、中空管プローブ7を第二の貫通孔4から離し、流路12aの内部へ第二の溶液16を投入して、流路12aの内部、中空管プローブ7の内部を置換した後、再度、中空管プローブ7を第二の貫通孔4へ密着させて吸引を行うことができる。このように、前記工程は被検体細胞18が密着して抵抗値が十分高くなった後でも随時行うことができ、例えば、さらに薄板1の下部領域および中空管プローブ7内を第三の溶液(図示せず)に置換することも可能である。
以上説明してきたように、本実施の形態1における細胞電気生理センサの構成によって、薄板1とこれに保持された被検体細胞18によって仕切られた上下の領域に蓄積される溶液の種類を簡単に変えることができることから、細胞が発する物理化学的現象である電気生理現象をより効率的に高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができる。
(実施の形態2)
次に、本発明の実施の形態2における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を用いて説明する。
次に、本発明の実施の形態2における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を用いて説明する。
特に、本実施の形態2が実施の形態1と異なる点は、図12に示すように保持プレート3に複数の第二の貫通孔4が設けられており、それぞれに薄板1が保持固着されており、これら複数の薄板1の下部側は共通の流路12b、流入孔10、流出孔11を持つことである。なお、薄板1の上部側は隔壁19によって個別に仕切られていても良い。
そして、それぞれの薄板1の位置に対応するように、流路プレート5に第三の貫通孔6を第二の貫通孔4と同軸上に設け、この第三の貫通孔6の下部より中空管プローブ7を挿入することができる。
また、それぞれに測定のための第一の測定電極8と第二の測定電極13を設けており、各薄板1に保持された被検体細胞18の電気生理現象を個別に測定することができる。
また、このような複数の中空管プローブ7を一括して挿入するためには測定電極である第一の測定電極8を中空管プローブ7の内壁面に電極を接着、埋設などの方法によって固着しておくことによって測定操作の簡便化を向上することができる。
本実施の形態2においても、実施の形態1と同様に薄板1の下部領域と中空管プローブ7の内部の溶液を交換することができるが、本実施の形態2では、特に流路12bを共通にしていることから、同じ溶液をそれぞれの中空管プローブ7の内部に置換することが可能である上、測定時においては中空管プローブ7が第三の貫通孔6の内部へ十分密着すれば、それぞれの中空管プローブ7の内部の溶液は互いに電気的に遮断されることから、それぞれの領域における測定が他の領域に及ぼす影響をなくすことができる。
一方、流路12b、流入孔10および流出孔11が共通であることから、設置される薄板1の数を増やした場合においても、流路12b、流入孔10および流出孔11の占有面積を減らすことができ、細胞電気生理センサの小型化・簡素化に効果的である。
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、細胞の電気生理現象の測定を効率的に行えることから、例えば高速で薬理判定を行う薬品スクリーニングシステムに有用である。
1 薄板
2 第一の貫通孔
3 保持プレート
4 第二の貫通孔
5 流路プレート
6 第三の貫通孔
7 中空管プローブ
8 第一の測定電極
9 吸引システム
10 流入孔
11 流出孔
12a,12b 流路
13 第二の測定電極
14 フィルム
15 第一の溶液
16 第二の溶液
18 被検体細胞
19 隔壁
2 第一の貫通孔
3 保持プレート
4 第二の貫通孔
5 流路プレート
6 第三の貫通孔
7 中空管プローブ
8 第一の測定電極
9 吸引システム
10 流入孔
11 流出孔
12a,12b 流路
13 第二の測定電極
14 フィルム
15 第一の溶液
16 第二の溶液
18 被検体細胞
19 隔壁
Claims (10)
- 第一の貫通孔を有した薄板と、第二の貫通孔を有した保持プレートと、前記第一の貫通孔の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレートとを有し、前記薄板を前記第二の貫通孔を塞ぐように固着し、前記流路プレートを前記保持プレートの下部に固着させた細胞電気生理センサであって、前記流路プレートに第三の貫通孔を前記第二の貫通孔と同軸上に設け、この第三の貫通孔を通して外部より中空管プローブを挿入し、且つこの中空管プローブの先端を第二の貫通孔の内部に前記流路とシール性を保持して挿入した細胞電気生理センサ。
- 中空管プローブの外形を第三の貫通孔より小さくし、且つその先端を第二の貫通孔の内部に前記流路とシール性を保持して挿入した請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 中空管プローブの先端の外形を、第二の貫通孔より小さくし、第三の貫通孔より小さくするとともに、且つ第二の貫通孔より第三の貫通孔に向かって大きくなるテーパ形状とした請求項2に記載の細胞電気生理センサ。
- 中空管プローブを挿入する前に、第三の貫通孔を搾孔可能な封止材によって封止した請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 中空管プローブの先端の内壁面にスリットを設けた請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 薄板を第二の貫通孔の内部へ挿入し、保持プレートの平面と同一平面となるように固着して第二の貫通孔を塞いだ請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 中空管プローブの中空管の内壁面に電極を設けた請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 中空管プローブの中空管の内部を吸引する手段に連結した請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 薄板を保持プレートの内部に複数保持し、これら複数の薄板を共通の流路と繋いだ請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 第一の貫通孔を有した薄板と、第二の貫通孔を有した保持プレートと、前記第一の貫通孔の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレートとを有し、前記薄板を前記第二の貫通孔を塞ぐように固着し、前記流路プレートを前記保持プレートの下部に固着させ、前記流路プレートに第三の貫通孔を前記第二の貫通孔と同軸上に設け、この第三の貫通孔を通して外部より中空管プローブを挿入し、且つこの中空管プローブの先端を第二の貫通孔の内部に前記流路とシール性を保持して挿入した細胞電気生理センサを準備する第一の工程と、
前記薄板の上部と前記流路の内部に流体を流入させる第二の工程と、
前記中空管プローブを前記流路プレートの一部に挿入して第三の貫通孔を作製する第三の工程と、前記中空管プローブの先端を前記第二の貫通孔の内部に挿入する第四の工程と、
前記保持プレートの前記薄板の上下の領域間の電位、電流または抵抗を測定する第五の工程を含み、前記第一の貫通孔の開口部に細胞を保持させて測定する細胞電気生理現象の測定方法。
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