JP4720638B2 - 細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法に関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかしながら、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞の電気生理的測定を行う方法について開示している（例えば、特許文献１参照）。

また、一つのチャネルが貫通している表面に、細胞の下面から吸引して位置決めした後、圧力差を増大させて細胞の下面一部を破裂させることにより、液体中に含まれる細胞の測定を行う方法について開示している（例えば、特許文献２参照）。

これらに開示しているように、平板に作製された貫通孔はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引などの方法により細胞が自動的に引きつけられ、細胞を容易に保持できるという利点を有している。
特表２００２−５０８５１６号公報 特表２００３−５１１６９９号公報

前記従来の構成における細胞電気生理センサの主な目的は細胞の電気生理現象を従来のパッチクランプ法で使われる微細プローブを用いることなく簡便に計測することであり、そのためには確実に平板の一部に形成した貫通孔（穴）に細胞を保持密着させることが必要である。

しかしながら、平板の下方を吸引するためには、平板の下方において液体が密閉された空間に閉じこめられている必要があるが、この密閉空間に気泡が存在していると、吸引によって下方空間を減圧しても気泡が膨張することによって高精度な減圧制御に支障をきたすことがある。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、密閉空間を減圧する際に内部に気泡の残留を少なくし、高精度に減圧制御することが可能な細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を有したウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートからなり、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を有した薄板を当接した細胞電気生理センサであって、前記保持プレート下方に、流れる液体の流れ方向に沿って溝を設けた構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、細胞を保持するために薄板の下方を減圧する際、密閉空間における気泡の残留を少なくすることができることによって高精度な減圧制御を可能とする細胞電気生理センサを実現することができることから、高精度な細胞の電気生理現象を測定することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２は保持プレートの下面図である。１は樹脂よりなるウエルであり、このウエル１に細胞内液あるいは細胞外液を貯留しておくための第一の貫通孔５を形成している。

この第一の貫通孔５は少なくとも一つを形成していれば良く、複数を設けることも可能である。

また、前記ウエル１の下方には第二の貫通孔６を有した保持プレート２を当接しており、この保持プレート２の前記第二の貫通孔６の内部には、少なくとも一つの第三の貫通孔７を有した平面を持つ薄板４を備えたセンサチップを固着保持している。このセンサチップはシリコン基板を加工することによって効率良く作製することができる。例えば、厚み；２０μｍ、第三の貫通孔７の開口径を１〜３μｍφの寸法形状でエッチング加工によって作製する。そして、この第三の貫通孔７の開口径は細胞の大きさによって適宜選択することができる。

さらに、前記保持プレート２の下方には、その両端に液体を流出入させるための流入口９と流出口１０を備えた少なくとも一つの第一の溝１１を有した流路プレート３を当接して細胞電気生理センサを構成しており、前記第三の貫通孔７の上面に被検体細胞を密着保持し、この被検体細胞の電気生理現象を測定することができるようになっている。

そして、第一の溝１１の流路内および第二の貫通孔６の近傍の気泡を抑制、除去するための構成として、第二の溝１２を流入口９と流出口１０に沿って複数本形成しており、それぞれ片側の端面は第二の貫通孔６と連通している。

このような構成とすることによって、気泡の発生を抑制するとともに、速やかに気泡を除去することが可能となり、効率よく高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を実現することができる。

次に、このような構成を有する細胞電気生理センサの作用について説明する。

通常、測定前の細胞電気生理センサは乾燥した状態で保存、あるいは包装されている。この細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定するとき、測定に入る前段階として、流路の内部を液体で満たすことが必要である。このとき、純水などの液体は、第二の溝１２の谷間に当初は侵入しにくくなっており、第二の溝１２の隙間に気相流体が通りやすい空間ができる。これによって、流入口９から流出口１０に向かって液体を流す際、発生した気相流体である気泡は形成した第二の溝１２の隙間を通り、液体は第二の溝１２の上部付近を容易に通ることが分かった。

その結果、液体および気泡が滞ることなく速やかに流入口９から流出口１０に向かって流れることができることから、第一の溝１１の内部の気泡をすべて流出口１０側へ追い出すことが可能となる。その後、測定に必要な薬液などの液体を純水に変えて充填することによって、第一の溝１１の内部に気泡を残すことなく薬液などの液体で満たすことが可能となる。

このように、気泡のない状態で細胞を投入して、例えば流出口１０より真空ポンプなどを用いて吸引することによって、第一の貫通孔５から投入した細胞は徐々に自重で落下し、その後第三の貫通孔７を塞ぐように保持することができるとともに、その後安定した圧力で吸引することによって、安定したギガシールド状態を保持することができる。

例えば、第二の貫通孔６を５０μｍφの形状で形成している場合、第二の溝１２の幅および深さを５０μｍとし、その第二の溝１２の断面形状を三角形となるようにエッチング加工などによって形成しておくことによって、その効果を発揮することができる。さらに、第二の貫通孔６が２００〜１０００μｍφとなるような寸法形状とした場合には、前記寸法からなる三角形状の溝を並列に複数本並べた形状からなる第二の溝１２を形成しておくことによって、同様の効果を発揮することができる。

このように、第二の貫通孔６の開口径の寸法形状によって第二の溝１２の形状と本数を適宜選択することによって柔軟に対応することができる。そして、これらの仕様を決めるのは最も気泡の発生を抑制できる条件から決定することが重要である。

なお、前記の現象は第二の溝１２の間隔が狭く、突起の谷が鋭角に切れ込んでいるほど顕著にその効果を発揮することが分かった。従って、鋭角に切れ込んだ小さな寸法形状を有する第二の溝１２を複数並列に配置することがより好ましい。

これによって、より高精度な減圧制御を実現できることによって高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができる。

また、図１および図２において、第二の溝１２を第二の貫通孔６の前後（流入口９側と流出口１０側）に設けているが、少なくとも流入口９と第二の貫通孔６の間に形成しておくことによってその効果を発揮することができ、特に第二の貫通孔６の近傍に形成しておくことが効果的である。その理由は、細胞に近く、第二の貫通孔６の近傍で気泡は発生しやすいからである。

また、この第二の溝１２の幅は少なくとも第二の貫通孔６の外形よりも広く形成しておくことがより効果的である。

なお、当初の準備段階として純水を用いるのは薬液などの液体を節約するためであり、直接、薬液などの液体を用いるときも同様の効果を発揮することができる。

次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象の測定方法について簡単に述べる。

まず、ウエル１に細胞内液あるいは細胞外液を充填する。ここで、細胞内液としては、例えば、ほ乳類筋細胞の場合、代表的には、Ｋ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃ１^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液とは、Ｋ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃ１^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。この状態で、ウエル１の内部に設置した第一の電極（図示せず）と第一の溝１１の適当な場所に設置した塩化銀などからなる第二の電極（図示せず）との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観測することができる。これは細胞電気生理センサの薄板４の内部に設けられた第三の貫通孔７に電解液である細胞内液あるいは細胞外液が浸透し、前記電極間で電気回路が形成されるからである。

次に、マイクロピペットなどを用いて、第一の貫通孔５の内部へ細胞を投入する。このとき、第一の貫通孔５の内壁面をテーパ形状とすることが好ましい。これによって、細胞はセンサチップである薄板４に形成した第三の貫通孔７の近傍まで到達しやすい構造を実現している。

その後、例えば流入口９を塞いで流出口１０から吸引すると、細胞は第三の貫通孔７へ引きつけられ、ついにはこの第三の貫通孔７を塞ぐように保持することができる。その結果、薄板４を介してウエル１と第一の溝１１との間の電気抵抗は十分に高くなる（このような状態をギガシールと呼ぶ）。

この状態において、薬液などを投入したときの細胞の電気生理活動によって細胞の内外の電位が変化した場合、わずかな電位差あるいは電流であっても前記第一の電極と第二の電極との間における電流あるいは電圧の変化を測定することによって細胞の電気生理現象の高精度な測定方法を実現することができる。

ここで、迅速、且つ高精度に測定するためには、細胞を速やかに第三の貫通孔７の上に移動させた後、第三の貫通孔７の上に一定のシール性（高いギガシールド性）を維持しながら細胞を保持することが重要である。この保持状態を一定に維持するためには、吸引圧力を微細に制御しながら細胞を速やかに移動させた後、第三の貫通孔７の上に安定して保持することが重要である。

これに対して、気泡などが第二の貫通孔６の近傍に存在すると吸引の圧力が不安定となり、測定に必要な十分なシール性を維持することが困難となってくる。

従って、高精度な測定を実現するためには第二の貫通孔６の付近に気泡の発生が少なく、気泡が抜けやすい細胞電気生理センサを用いることが非常に重要なことである。

（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。図３は本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図であり、図４は流路プレート３の上面図である。

本実施の形態２における細胞電気生理センサの構成は、図３および図４に示すように第一の貫通孔５を有したウエル１と、ウエル１の下方には第二の貫通孔６を有した保持プレート２を当接しており、前記第二の貫通孔６の内部には、少なくとも一つの第三の貫通孔７を有した平面を持つ薄板４からなるセンサチップを固着保持している。

さらに、前記保持プレート２の下方には、その両端に液体の流入口９と流出口１０を備えた少なくとも一つの第一の溝１１を有した流路プレート３を当接している。また、この流路プレート３の底面において、第二の溝１２を第二の貫通孔６の下方に相当する配置になるように形成している。

そして、前記第三の貫通孔７に被検体細胞を密着保持してこの被検体細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサを構成している。

以上のような構成を有する細胞電気生理センサにおいて、第二の溝１２を第二の貫通孔６の下方に配置するように形成することによって、実施の形態１と同様の効果を発揮することができる細胞電気生理センサを実現することができる。

このような構成において、液体は複数の第二の溝１２の谷間に進入しにくくなり、第二の溝１２の間に気相流体が通りやすい空間ができる。

これによって、流入口９から流出口１０に向かって液体を流す際、気相流体である気泡は第二の溝１２の谷間を通り、液体は第二の溝１２の上部付近を通ることになり、液体および気泡が速やかに滞ることなく流入口９から流出口１０に向かって流れることとなる。結果として、第一の溝１１の内部の気泡をすべて流出口１０側へ追い出すことが可能となり、第一の溝１１の内部に気泡を残すことなく薬液あるいは培養液などの液体で満たすことが可能となる。

なお、上記の現象は第二の溝１２の間隔が狭く、谷が鋭角に切れ込んでいるほど顕著にその効果を発揮することができる。

また、図３、および図４に示したように流路プレート３に第二の溝１２を設けた構成とすることによって、細胞電気生理センサを効率よく作製することができる。

本実施の形態２における細胞電気生理センサの作製方法としては、初めにウエル１と保持プレート２を熱可塑性樹脂などを用いて融着接合し、さらにその後流路プレート３を積層して融着接合することによって一体化し、所望の形状を有する細胞電気センサを作製すると効率が良い。ここで、第二の溝１２が保持プレート２に形成されていると、この融着接合のときに加圧しながら接合する工法を用いる場合、第二の溝１２を鋭角な鋸状の尖った形状に加工しているときには、その先端部にダメージを与えてしまうことがある。

そのような場合において、本実施の形態２に示したように流路プレート３に第二の溝１２を形成しておくことによって、接合などの組み立て時における作業効率の低下を防止することができる。

なお、前記のようなことを考慮しながら、保持プレート２の下面側と流路プレート３の上面側の両面に第二の溝１２を形成した場合、気泡の除去をより効率よく行うことができる。

次に、本実施の形態２におけるさらに別の例の細胞電気生理センサの構成について説明する。図５は本実施の形態２における別の例の細胞電気生理センサの流路プレート３の上面図であり、図６はその要部拡大図である。

ここで、図５および図６に示すように流路プレート３に形成した第一の溝１１の側壁側の内壁の形状を複数の鋭角な形状からなる凹部を有した第三の溝１３の構成としている。このとき、第一の溝１１の上面あるいは下面には第二の溝１２を形成しておき、前記第三の溝１３は第二の溝１２に連通している。このような構成とするためには、第二の溝１２の幅を第一の溝１１の幅と同じとし、且つ第一の溝１１の側壁面に第三の溝１３を形成することによって実現することができる。

このような構成において、第三の溝１３に形成した鋭角な凹形状の先端には液層流体は進入しにくくなり、側壁に発生した気泡の気相流体の通り道となる。これによって、第一の溝１１の側壁付近において発生した気相流体である気泡が第三の溝１３を移動し、その後第二の溝１２へ移動し、次に流出口１０から速やかに滞ることなく抜けることとなり、これまでに他の実施形態において述べたような構造と相まって、第一の溝１１の内部に気泡が残ることなく、最終的には液体によって容易に効率良く満たされるという効果を発揮することができる。

以上説明してきたように、このような構成とすることによって流入口９側の圧力を相対的に流出口１０側に比べて精度良く高く設計することができ、薄板４を保持した第二の貫通孔６の付近に気泡の発生を少なくすることができる細胞電気生理センサを提供することができる。そして、このような構成を有する細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定するとき、効率よく高精度に測定することができる細胞電気生理現象の測定方法を提供することができる。

以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、高精度な測定を可能にすることから、高速で薬理判定を行う薬品スクリーニング等の測定器に有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図 同保持プレートの下面図 本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図 同流路プレートの上面図 同別の例の流路プレートの上面図 同要部拡大図

符号の説明

１ ウエル
２ 保持プレート
３ 流路プレート
４ 薄板
５ 第一の貫通孔
６ 第二の貫通孔
７ 第三の貫通孔
９ 流入口
１０ 流出口
１１ 第一の溝
１２ 第二の溝
１３ 第三の溝

Claims (11)

1. 第一の貫通孔を有したウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートからなり、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を有した薄板を当接した細胞電気生理センサであって、前記保持プレート下面に、流れる液体の流れ方向に沿って溝を設けた細胞電気生理センサ。
2. 前記溝の幅を第二の貫通孔の幅よりも大きくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 前記溝を複数形成した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 複数の前記溝の幅を第二の貫通孔の幅よりも大きくした請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
5. 前記保持プレートの下方に第一の溝を有した流路プレートを当接し、前記保持プレートに設けた前記溝を第二の溝とし、第二の溝の幅を第一の溝の幅と同じとし、且つ第一の溝の側壁面に第三の溝を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. 第一の貫通孔を有したウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えるとともに第一の溝を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を有した薄板を当接した細胞電気生理センサであって、液体の流れる方向に沿って前記流路プレートの一部に第二の溝を設けた細胞電気生理センサ。
7. 第二の溝の幅を第二の貫通孔の幅よりも大きくした請求項６に記載の細胞電気生理センサ。
8. 第二の溝を複数形成した請求項６に記載の細胞電気生理センサ。
9. 複数の第二の溝の幅を第二の貫通孔の幅よりも大きくした請求項８に記載の細胞電気生理センサ。
10. 第二の溝の幅を第一の溝の幅と同じとし、且つ第一の溝の側壁面に第三の溝を設けた請求項６に記載の細胞電気生理センサ。
11. 第一の貫通孔を有したウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えるとともに第一の溝を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を有した薄板を当接した細胞電気生理センサであり、液体の流れる方向に沿って前記保持プレートまたは流路プレートの一部に第二の溝を設けた細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理現象の測定方法。

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