JP2006314292A - Array for comprehensively profiling protein kinase activity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ガラス基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質を固定化させてなり、放射性物質（以下、ＲＩと示すこともある。）を用いた反応によりリン酸化されたペプチドもしくは蛋白質を検出するためのアレイに関する。より詳細には、ガラス基板とプロテインキナーゼの基質をヘテロ二官能基型のリンカーを介して固定化させることで簡便なアレイの作製を実現し、しかもプロテインキナーゼによりリン酸化されたペプチドもしくは蛋白質をＲＩを用いることで効果的に検出できる新規アレイに関する。 In the present invention, a peptide or protein that is a substrate for a protein kinase is immobilized on a glass substrate, and the peptide or protein phosphorylated by a reaction using a radioactive substance (hereinafter sometimes referred to as RI) is obtained. It relates to an array for detection. More specifically, a glass substrate and a protein kinase substrate are immobilized via a heterobifunctional type linker to realize a simple array, and a peptide or protein phosphorylated by a protein kinase is RI. It is related with the novel array which can be detected effectively by using.
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。例えば、シグナル伝達経路に関わる様々な種類のプロテインキナーゼの基質を基板上に固定化し、プロテインキナーゼの活性を蛍光物質もしくは放射性物質で検出する技術がある。この技術によりプロテインキナーゼとその候補となる基質を１対１（一種類ずつ混ぜて）反応させていた従来の方法では難しい網羅的な解析を可能とし、より効率的にプロテインキナーゼの活性をプロファイリングすることができる。しかし、その一方で基板上への生体分子の固定化は、様々な作製段階で操作的な困難さがあり、また検出感度にもまだまだ改良する余地が残っているのが現状である。 In recent years, biochips used for biomolecule interaction analysis, profiling of expressed molecules, or diagnosis have attracted attention. The operation is facilitated by immobilizing the biomolecule on the substrate, and in some cases, the interaction of a very large number of substances can be analyzed. For example, there is a technique in which substrates of various types of protein kinases involved in signal transduction pathways are immobilized on a substrate, and the activity of the protein kinase is detected with a fluorescent substance or a radioactive substance. This technology enables comprehensive analysis that is difficult with conventional methods in which protein kinases and their candidate substrates are reacted one-on-one (mixed one by one), and more efficiently profile protein kinase activity. be able to. However, on the other hand, immobilization of biomolecules on a substrate has operational difficulties at various production stages, and there is still room for improvement in detection sensitivity.
すでに報告されている固定化技術として、例えばａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅによりチオエステル化されたガラススライド表面をアミノ基でコートさせ、その後ペプチドをチオエステルスライド上に固定化させる技術が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。この技術を利用して、ＰＫＡあるいはｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光標識した抗リン酸化セリン・スレオニン抗体あるいは抗リン酸化チロシン抗体によりキナーゼ活性を評価したことが報告されている（非特許文献１）が、標的配列の異なる同型キナーゼ（セリン・スレオニンキナーゼあるいはチロシンキナーゼという意味です）の活性を検出する点では、抗体の特性上、非特異的な結合が問題となり現状では十分なアッセイ系とはいえない。 As an immobilization technique that has already been reported, for example, a technique is known in which a glass slide surface that has been thioesterified by, for example, aminopropyltrioxysilane, is coated with amino groups, and then the peptide is immobilized on the thioester slide (Non-Patent Document 1, Non-patent Document 1, Patent Document 2). It has been reported that the substrate activity of PKA or p60 tyrosine kinase was immobilized on a chip using this technique, and the kinase activity was evaluated by fluorescently labeled anti-phosphorylated serine / threonine antibody or anti-phosphorylated tyrosine antibody ( Non-patent document 1) is not sufficient in the present situation because non-specific binding becomes a problem due to the characteristics of the antibody in terms of detecting the activity of homologous kinases with different target sequences (meaning serine / threonine kinase or tyrosine kinase). It is not an assay system.
また、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドあるいは蛋白質を固定化し（非特許文献１、非特許文献３）、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献3参照）もある。これら報告されたアレイでは、ペプチドあるいは蛋白質に直接ビオチンを結合させており、基板と基質の間の距離が十分取れておらず、したがって安定なキナーゼ反応を行う点で不十分である There are also examples in which a biotin-bonded peptide or protein is immobilized on a substrate coated with avidin (Non-patent Document 1, Non-patent Document 3) and PKA activity is examined (for example, see Non-patent Document 3). In these reported arrays, biotin is directly bound to the peptide or protein, and there is not enough distance between the substrate and the substrate, so that it is insufficient in terms of performing a stable kinase reaction.
さらに、上述したいずれの技術においてもチップ上に生体分子を固定化させる一連の作製段階において複雑な操作が要求される、あるいは、作製されたアレイの反応性が高いため、デシケーター内で保存したり、長期的な保存に向かない（チオエステルスライド：デシケータ内で保存→チオエステルの反応性が高いようだ。アビヂンスライド：40℃保存→あまり長期保存は良くないようだ）といった問題点があり、簡便な固定化方法とはいえない。また、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。 Furthermore, in any of the above-described techniques, a complicated operation is required in a series of production steps for immobilizing biomolecules on the chip, or the produced array has high reactivity, so that it can be stored in a desiccator. , Not suitable for long-term storage (thioester slide: stored in a desiccator → seems to have high reactivity of thioester. Avidin slide: stored at 40 ° C → not so long-term storage seems easy) It cannot be said to be an immobilization method. In any of the above methods, the background at the time of detection has an adverse effect on observing the spot, and its reduction is a major issue.
従来の固定化技術は複雑な操作で熟練を要するという問題がある。従って、本発明の目的は簡易にアレイを調整できる固定化方法を提供することにある。さらに、ＲＩを用いることで良好な感度で検出できるアッセイ系を提供し、種々のプロテインキナーゼにおける活性を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。 Conventional immobilization techniques have the problem of requiring skill in complex operations. Accordingly, an object of the present invention is to provide an immobilization method capable of easily adjusting an array. Furthermore, it is intended to provide an assay system that can be detected with good sensitivity by using RI, and to establish a method capable of comprehensively profiling the activity in various protein kinases.
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質をヘテロ二官能基型のリンカーを介して基板上に固定化させることが種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析する上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、ペプチド又は蛋白質を基板上に固定化させる技術に関する。
１．放射性物質を用いた反応によりペプチド又は蛋白質のリン酸化を判定するためのアレイであって、該ペプチド又は該蛋白質が、ヘテロ二官能基型リンカーを用いて基板上に固定化されていることを特徴とするリン酸化判定用アレイ。
２．基板表面上の官能基（Ａ）とヘテロ二官能基型リンカーの一方の官能基（Ｂ）とが反応し、該ヘテロ二官能基型リンカーの他方の官能基（Ｃ）と該ペプチド又は該蛋白質の官能基（Ｄ）とが反応するよう設計されていることを特徴とする１のリン酸化判定用アレイ。
３．官能基（Ａ）が、アミノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする２のリン酸化判定用アレイ。
４．官能基（Ａ）がアミノ基、官能基（Ｂ）が硫酸スクシンイミド基又はスクシンイミド基、官能基（Ｃ）がマレイミド基であることを特徴とする２または３のリン酸化判定用アレイ。
５．ペプチド又は蛋白質の官能基（Ｄ）が、アミノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする２〜４のいずれかのリン酸化判定用アレイ。
６．ペプチド又は蛋白質の少なくとも一方の末端にチオール基が存在していること特徴とする５のリン酸化判定用アレイ。
７．ペプチド又は蛋白質の少なくとも一方の末端がシステイン残基であることを特徴とする６のリン酸化判定用アレイ。
８．ヘテロ二官能型リンカーの分子量が５００から２０００であることを特徴とする１または２のリン酸化判定用アレイ。
９．ヘテロ二官能型リンカーの分子量が８００から１６００であることを特徴とする１、２または８のリン酸化判定用アレイ。
１０．ヘテロ二官能型リンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む化合物であることを特徴とする１、２、８または９のリン酸化判定用アレイ。
１１．エチレングリコール鎖の繰り返しが４から３０であることを特徴とする１０のリン酸化判定用アレイ。
１２．基板がガラス基板であることを特徴とする１のリン酸化判定用アレイ。
１３．放射性物質が［γ３２Ｐ］−ＡＴＰもしくは［γ３３Ｐ］−ＡＴＰであることを特徴とする特徴とする１のリン酸化判定用アレイ。
１４．１〜１２のいずれかのリン酸化判定用アレイと、放射性物質と、プロテインキナーゼを含むもしくは含まれると考えられる溶液とを作用させ、該リン酸化判定用アレイ上に固定化されているペプチド又は蛋白質への該放射物質の取り込みを調べることを特徴とするリン酸化判定方法。
１５．放射性物質が［γ３２Ｐ］−ＡＴＰもしくは［γ３３Ｐ］−ＡＴＰであることを特徴とする特徴とする１４のリン酸化判定方法。
１６．ペプチド又は蛋白質を基板上に固定化する方法であって、該基板表面上の官能基（Ａ）とヘテロ二官能基型リンカーの一方の官能基（Ｂ）とを反応させ、ヘテロ二官能基型リンカーの他方の官能基（Ｃ）と該ペプチドまたは該蛋白質の官能基（Ｄ）とを反応させることを特徴とする固定化方法。
１７．官能基（Ａ）が、アミノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする１６の固定化方法。
１８．官能基（Ａ）がアミノ基、官能基（Ｂ）が硫酸スクシンイミド基又はスクシンイミド基、官能基（Ｃ）がマレイミド基であることを特徴とする１６または１７の固定化方法。
１９．ペプチド又は蛋白質の官能基（Ｄ）が、アミノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする１６の固定化方法。
２０．ペプチド又は蛋白質の少なくとも一方の末端にチオール基が存在していること特徴とする１９の固定化方法。
２１．ペプチド又は蛋白質の少なくとも一方の末端がシステイン残基であることを特徴とする１９の固定化方法。
２２．ヘテロ二官能型リンカーの分子量が５００から２０００であることを特徴とする１６の固定化方法。
２３．ヘテロ二官能型リンカーの分子量が８００から１６００であることを特徴とする１６又は２２の固定化方法。
２４．ヘテロ二官能型リンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む化合物であることを特徴とする１６、２２又は２３の固定化方法。
２５．エチレングリコール鎖の繰り返しが４から３０であることを特徴とする２４の固定化方法。
２６．基板がガラス基板であることを特徴とする１６の固定化方法。
As a result of intensive studies in view of the above circumstances, the present inventors have found that various protein kinase activities can be achieved by immobilizing a peptide or protein serving as a protein kinase substrate on a substrate via a heterobifunctional linker. The present invention has been found to be extremely useful in comprehensively analyzing the above. That is, the present invention relates to a technique for immobilizing a peptide or protein on a substrate.
1. An array for determining phosphorylation of a peptide or protein by a reaction using a radioactive substance, wherein the peptide or the protein is immobilized on a substrate using a heterobifunctional type linker An array for determining phosphorylation.
2. The functional group (A) on the substrate surface reacts with one functional group (B) of the heterobifunctional linker, and the other functional group (C) of the heterobifunctional linker and the peptide or protein The phosphorylation determination array according to claim 1, wherein the phosphorylation determination array is designed to react with the functional group (D).
3. 2. The array for determining phosphorylation according to 2, wherein the functional group (A) is at least one selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group and a thiol group.
4). 2. The array for determining phosphorylation according to 2 or 3, wherein the functional group (A) is an amino group, the functional group (B) is a succinimide sulfate group or a succinimide group, and the functional group (C) is a maleimide group.
5. The phosphorylation determination array according to any one of 2 to 4, wherein the functional group (D) of the peptide or protein is at least one selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a thiol group.
6). 5. The phosphorylation determination array according to 5, wherein a thiol group is present at at least one end of the peptide or protein.
7). 6. The array for determining phosphorylation according to 6, wherein at least one terminal of the peptide or protein is a cysteine residue.
8). The array for determining phosphorylation according to 1 or 2, wherein the heterobifunctional linker has a molecular weight of 500 to 2,000.
9. The array for determining phosphorylation of 1, 2 or 8 characterized in that the molecular weight of the heterobifunctional linker is 800 to 1600.
10. The array for determining phosphorylation of 1, 2, 8 or 9 wherein the heterobifunctional linker is a compound containing polyethylene glycol (PEG).
11. 10. An array for determining phosphorylation, wherein the number of ethylene glycol chains is 4 to 30.
12 1. The array for determining phosphorylation according to claim 1, wherein the substrate is a glass substrate.
13. 1. The phosphorylation determination array according to claim 1, wherein the radioactive substance is [γ 32 P] -ATP or [γ 33 P] -ATP.
14. Peptides immobilized on the phosphorylation determination array by reacting the phosphorylation determination array of any one of 1 to 12 with a radioactive substance and a solution containing or considered to contain a protein kinase Alternatively, a phosphorylation determination method characterized by examining the incorporation of the radioactive substance into a protein.
15. 14. The method for determining phosphorylation according to 14, wherein the radioactive substance is [γ 32 P] -ATP or [γ 33 P] -ATP.
16. A method for immobilizing a peptide or protein on a substrate, comprising reacting a functional group (A) on the surface of the substrate with one functional group (B) of a heterobifunctional linker to form a heterobifunctional group An immobilization method comprising reacting the other functional group (C) of a linker with the functional group (D) of the peptide or the protein.
17. 16. The immobilization method according to 16, wherein the functional group (A) is at least one selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a thiol group.
18. The immobilization method of 16 or 17, wherein the functional group (A) is an amino group, the functional group (B) is a succinimide sulfate group or a succinimide group, and the functional group (C) is a maleimide group.
19. 16. The immobilization method according to 16, wherein the functional group (D) of the peptide or protein is at least one selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a thiol group.
20. 19. The immobilization method according to 19, wherein a thiol group is present at at least one end of the peptide or protein.
21. 19. The immobilization method according to 19, wherein at least one terminal of the peptide or protein is a cysteine residue.
22. 16. The immobilization method according to 16, wherein the heterobifunctional linker has a molecular weight of 500 to 2,000.
23. The immobilization method according to 16 or 22, wherein the heterobifunctional linker has a molecular weight of 800 to 1600.
24. The immobilization method of 16, 22 or 23, wherein the heterobifunctional linker is a compound containing polyethylene glycol (PEG).
25. 24. Immobilization method according to 24, characterized in that the ethylene glycol chain repeats are 4 to 30.
26. 16. The fixing method according to 16, wherein the substrate is a glass substrate.
本発明により、プロテインキナーゼ活性を解析するためのアレイを簡便に作製することが可能となる。特にＰＥＧを含む化合物をリンカーとして用いる場合には、放射性物質を用いたリン酸化反応の検出系においてバックグラウンドを低減させる効果をもち、非常に効率的な種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的にプロファイリングすることが可能となる。 According to the present invention, an array for analyzing protein kinase activity can be easily prepared. In particular, when a compound containing PEG is used as a linker, it has the effect of reducing background in a phosphorylation detection system using a radioactive substance, and comprehensively profiles various highly efficient protein kinase activities. It becomes possible.
本発明において用いるプロファイリング用アレイは、ヘテロ二官能基型リンカーを用いて基板上に固定化されていることを特徴とする。基板は、ガラス基板を用いてもよい。ガラスの種類や基板の厚さは特に限定されるものではないが、厚さとしては０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度の基板が用いられる。大きさや形状に関しても特に限定されるものではないが、通常市販されているスライドグラスのようなものを用いてもよい。 The profiling array used in the present invention is characterized in that it is immobilized on a substrate using a heterobifunctional linker. A glass substrate may be used as the substrate. Although the kind of glass and the thickness of a board | substrate are not specifically limited, As a thickness, about 0.1-20 mm is preferable, for example, a 1-2 mm board | substrate is used. Although it does not specifically limit regarding a magnitude | size or a shape, You may use things like the slide glass marketed normally.
本発明において、ペプチドもしくは蛋白質はプロテインキナーゼの活性をプロファイリングすることが可能な基質を指し、1種類のペプチドもしくは蛋白質は1種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。ここで、ペプチドもしくは蛋白質とは、複数のアミノ酸が縮合結合されて連結された通常のポリペプチド全般を指すものである。必要に応じて、これらペプチドもしくは蛋白質はタグの付加などの化学修飾がされていてもよい。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できるが、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに関して適用することが可能である。これら該プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質は公知のものであってもよいが、例えばペプチド配列は公知の配列に基づき適宜選択することも可能である。ペプチドの長さは一般的に１００アミノ酸残基以下のものが用いられるが、好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは８〜２５アミノ酸残基、更に好ましくは１０〜２０アミノ酸残基からなるものが用いられる。また、蛋白質を用いる場合の分子量は特に限定されるものではない。上記ペプチドもしくは蛋白質の生成手法は特に限定されるものではなく、化学的もしくは遺伝子工学的な公知の手法により生成することが可能である。 In the present invention, a peptide or protein refers to a substrate capable of profiling the activity of a protein kinase, and one type of peptide or protein is phosphorylated only by one type of protein kinase and not by other protein kinases. Is preferred. Here, the peptide or protein refers to all general polypeptides in which a plurality of amino acids are linked by condensation bonding. If necessary, these peptides or proteins may be chemically modified such as tag addition. Examples of protein kinases to be profiled include enzymes that phosphorylate side chains of amino acids such as protein tyrosine, serine, and threonine. For example, cAMP-dependent protein kinase family (PKA), protein kinase C (PKC) family MAP kinase (MAPK), Src tyrosine kinase family, and receptor tyrosine kinase family, etc., but can be applied basically to all types of protein kinases. The peptide or protein that serves as a substrate for the protein kinase may be a known one. For example, the peptide sequence can be appropriately selected based on the known sequence. The length of the peptide is generally 100 amino acid residues or less, preferably 5 to 60 amino acid residues, more preferably 8 to 25 amino acid residues, still more preferably 10 to 20 amino acid residues. Things are used. Moreover, the molecular weight in the case of using protein is not specifically limited. The method for producing the peptide or protein is not particularly limited, and can be produced by a known chemical or genetic engineering method.
本発明において、上記ペプチドもしくは蛋白質を基板上に固定化させる際には、その間にヘテロ二官能基型リンカーを導入することを特徴とする。ヘテロ二官能基型リンカーの化学組成は特に限定されるものではないが、例えば分子量が５００〜２０００程度であることが好ましく、より好ましくは８００〜１６００程度、更に好ましくは８００〜１２００程度からなるものが用いられる。ヘテロ二官能基型リンカーは化学的に安定であり、また水溶性分子であることが好ましく、具体的には水溶性高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む化合物が特に好ましい。この場合、エチレングリコール鎖の繰り返しは４〜３０であることが好ましいが、より好ましくは８〜２４程度、更に好ましくは１０〜２０程度であるものが用いられる。 In the present invention, when the peptide or protein is immobilized on a substrate, a heterobifunctional linker is introduced between the peptides or proteins. The chemical composition of the heterobifunctional linker is not particularly limited. For example, the molecular weight is preferably about 500 to 2000, more preferably about 800 to 1600, and still more preferably about 800 to 1200. Is used. The heterobifunctional type linker is chemically stable and is preferably a water-soluble molecule. Specifically, a compound containing polyethylene glycol (PEG) which is a water-soluble polymer is particularly preferable. In this case, the number of ethylene glycol chains is preferably 4-30, more preferably about 8-24, and still more preferably about 10-20.
上述したヘテロ二官能基型リンカーを介して、ペプチドもしくは蛋白質をガラス基板表面上に固定化させる方法は特に限定されるものではないが、ガラス基板表面及び該ペプチドもしくは該蛋白質と架橋しやすいようなヘテロ二官能基型リンカーの両官能基を選択し、ガラス基板上にあらかじめヘテロ二官能基型リンカーを導入しておいてから、基質となるペプチドもしくは蛋白質を固定化処理するのが好ましい。 The method for immobilizing the peptide or protein on the glass substrate surface via the heterobifunctional group-type linker described above is not particularly limited, but it is easy to crosslink the glass substrate surface and the peptide or the protein. It is preferable that both functional groups of the heterobifunctional group type linker are selected and the heterobifunctional group type linker is introduced in advance onto the glass substrate, and then the peptide or protein serving as the substrate is immobilized.
ペプチド又は該蛋白質は、本発明に使用される官能基を介して基板上に固定される。基板表面上の官能基を（Ａ）、ヘテロ二官能基型リンカーの一方の官能基を（Ｂ）、ヘテロ二官能基型リンカーの他方の官能基を（Ｃ）、ペプチド又は該蛋白質の官能基を（Ｄ）とすると、基板表面上の官能基（Ａ）とヘテロ二官能基型リンカーの一方の官能基（Ｂ）とが反応し、該ヘテロ二官能基型リンカーの他方の官能基（Ｃ）と該ペプチド又は該蛋白質の官能基（Ｄ）とが反応するよう設計されていることが好ましい。また、官能基（Ａ）と官能基（Ｃ）が反応しないように設計されていることがよいがこれに限定されるものではない。 The peptide or the protein is immobilized on the substrate via the functional group used in the present invention. The functional group on the substrate surface is (A), one functional group of the heterobifunctional linker is (B), the other functional group of the heterobifunctional linker is (C), and the functional group of the peptide or protein Is (D), the functional group (A) on the substrate surface reacts with one functional group (B) of the heterobifunctional linker, and the other functional group of the heterobifunctional linker (C ) And the functional group (D) of the peptide or protein are preferably designed to react. In addition, the functional group (A) and the functional group (C) are preferably designed so as not to react with each other.
より、具体的には、官能基（Ａ）は、アミノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選ばれた１種以上であればよい。官能基は混在していてよく、例えば、アミノ基に統一されていても良い。より好ましくは、アミノ基が好ましい。 More specifically, the functional group (A) may be one or more selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a thiol group. The functional group may be mixed, for example, may be unified with an amino group. More preferably, an amino group is preferable.
ガラス基板表面に官能基（Ａ）としてアミノ基を導入しておけば、ヘテロ二官能基型リンカーの一方の官能基を（Ｂ）を硫酸スクシンイミド基もしくはスクシンイミド基を選択することで簡便にガラス基板上にヘテロ二官能基型リンカーを導入することが可能となり好ましい。特に、ヘテロ二官能基型リンカーは、官能基（Ａ）がアミノ基の場合、ＰＥＧの片末端に官能基（Ｂ）として硫酸スクシンイミド基又はスクシンイミド基、官能基（Ｃ）としてマレイミド基が付加されたものが扱いやすく好適である。具体的な構造式で示すと、例えば式（１）に示したようなものが例示される。 If an amino group is introduced as a functional group (A) on the surface of the glass substrate, one functional group of the heterobifunctional type linker can be easily selected by selecting (B) a succinimide sulfate group or a succinimide group. A heterobifunctional type linker can be introduced on the top, which is preferable. In particular, when the functional group (A) is an amino group, the heterobifunctional type linker has a succinimide sulfate or succinimide group as a functional group (B) and a maleimide group as a functional group (C) at one end of the PEG. It is easy to handle and is suitable. When expressed by a specific structural formula, for example, the one shown in Formula (1) is exemplified.
ペプチド又は蛋白質の官能基（Ｄ）は、アミノ基、カルボキシル基及びチオール基からなる群より選ばれた１種以上であればよい。これらの官能基は、混在していてもよく、一種類に統一されていても良い。これらの基は、ペプチド合成時に人為的に導入しても構わない。好ましくは、チオール基がよく、更に好ましくは、ペプチド又は蛋白質の少なくとも一方の末端にチオール基が存在していることがよい。また、ヘテロ二官能基型リンカーのもう一方の官能基と基質となるペプチドもしくは蛋白質とを作用させるために、該ペプチドもしくは該蛋白質のアミノ酸残基を利用する方法が挙げられる。とくに好ましくは、システイン残基が導入されているのがよい。この場合、システイン残基はペプチドもしくは蛋白質の一方の末端に付加されてなるものが好ましく、より好ましくはプロテインキナーゼによるリン酸化反応に悪影響を及ぼさないように１〜２０残基のスペーサーとなるアミノ酸配列を導入してなるものが用いられ、さらに好ましくは３〜１０残基のアミノ酸配列を導入してなるものが用いられる。スペーサーとなるアミノ酸配列も特に限定されないが、例えばグリシン残基の繰り返し配列、グリシン−アラニン残基の繰り返し配列などが挙げられる。また、末端のシステイン残基と基質配列との間にＰＥＧなどの親水性分子を挿入した態様のものも考えられる。このようにして、多種類の基質となるペプチドもしくは蛋白質を１枚の基板上に固定化されてなるアレイを得ることができる。 The functional group (D) of the peptide or protein may be one or more selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, and a thiol group. These functional groups may be mixed and may be unified into one kind. These groups may be artificially introduced during peptide synthesis. Preferably, a thiol group is preferable, and more preferably, a thiol group is present at at least one terminal of the peptide or protein. In addition, in order to cause the other functional group of the heterobifunctional group type linker to act as a substrate peptide or protein, a method using an amino acid residue of the peptide or protein can be used. Particularly preferably, a cysteine residue is introduced. In this case, a cysteine residue is preferably added to one end of a peptide or protein, and more preferably an amino acid sequence serving as a 1-20 residue spacer so as not to adversely affect the phosphorylation reaction by protein kinase. Are used, and more preferably those obtained by introducing an amino acid sequence of 3 to 10 residues. The amino acid sequence to be a spacer is not particularly limited, and examples thereof include a repeating sequence of glycine residues and a repeating sequence of glycine-alanine residues. Further, a mode in which a hydrophilic molecule such as PEG is inserted between the terminal cysteine residue and the substrate sequence is also conceivable. In this way, it is possible to obtain an array in which peptides or proteins serving as various types of substrates are immobilized on a single substrate.
本発明における測定方法に関する好ましい実施形態として、本発明のアレイ上にプロテインキナーゼ及びＲＩ標識されたヌクレオシド三リン酸、例えば［γ３２Ｐ］−ＡＴＰもしくは［γ３３Ｐ］−ＡＴＰを適用してＯｎ−ｃｈｉｐでリン酸化反応させることができる。特に［γ３３Ｐ］−ＡＴＰが感度、特異性の点で好ましい。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中にすでに含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中にすでに含まれるプロテインキナーゼとＲＩ標識したヌクレオシド三リン酸を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、ペプチドもしくは蛋白質をリン酸化することができる。必要に応じて反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。アレイ上のリン酸化反応が終わった後の検出方法は特に限定されないが、アレイを水や緩衝液等で十分に洗浄を行い、乾燥させた後、オートラジオグラフィを行うことによりＲＩの取り込みをモニターさせることによりリン酸化を検出させて行うのが感度の面からも特に好ましい。 As a preferred embodiment of the measurement method in the present invention, protein kinase and RI-labeled nucleoside triphosphate such as [γ 32 P] -ATP or [γ 33 P] -ATP is applied to the array of the present invention and turned on. -Phosphorylation reaction can be performed with chip. In particular, [γ 33 P] -ATP is preferable in terms of sensitivity and specificity. The protein kinase to be subjected to profiling may be a commercially available reagent, but it is also possible to use a protein kinase already contained in or estimated to be contained in a cell-derived extract. For example, by immobilizing a protein kinase reagent or protein kinase already contained in a cell extract or a mixture of the two in a buffer or cell extract or a mixture of both, the immobilized substrate is allowed to act directly on the array. Can be phosphorylated. The phosphorylation conditions vary depending on the type of protein kinase, but it is usually about 10 to 40 ° C., preferably about 20 to 40 ° C. for about 5 minutes to 8 hours, preferably about 10 minutes to 5 hours. Thus, the peptide or protein can be phosphorylated. If necessary, a substance that assists or promotes phosphorylation such as cAMP, cGMP, Mg 2+ , and Ca 2+ may coexist in the reaction solution. The detection method after the phosphorylation reaction on the array is completed is not particularly limited, but the array is thoroughly washed with water or buffer, dried, and then autoradiography is used to monitor RI uptake. It is particularly preferable from the viewpoint of sensitivity to detect the phosphorylation by carrying out the process.
このようにガラス基板表面及び該ペプチドもしくは該蛋白質と、あらかじめ活性化させなくとも作用するようなヘテロ二官能基型リンカーの両官能基を選択することで、複雑な操作を要せず、作製段階もいくつか省略することが可能となる。また、ヘテロ二官能基型リンカーにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を導入することで、バックグラウンドを低減できる最適な繰り返し数を決定でき、感度の向上につながる。 Thus, by selecting both functional groups of the glass substrate surface, the peptide or the protein, and the heterobifunctional type linker that acts without being activated in advance, no complicated operation is required, and the production stage Can be omitted. In addition, by introducing polyethylene glycol (PEG) into the heterobifunctional linker, the optimum number of repeats that can reduce the background can be determined, leading to improved sensitivity.
以下、実施例を挙げることにより本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not specifically limited to an Example.
実施例１ ＰＫＣδによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化
（ペプチドアレイの作製）
アミノ基を高密度に導入されたガラス基板（松浪硝子工業株式会社製ＳＤＭ００１１；サイズ：２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍ、コートタイプ：高密度化アミノ基導入コート）を３枚用意し、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量３４００；Ｎｅｋｔｅｒ製）、５ｍｇ／ｍｌ濃度のＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ（分子量８６５；Ｑｕａｎｔａ製）溶液、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＳＭＣＣ（分子量４３６；Ｐｉｅｒｃｅ製）溶液（いずれも１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸バッファー；ｐＨ７．４に溶解して調製した。）を各々のガラス基板上のペプチドを固定化する領域を覆うように、各３００μｌをドロップして溶液を広げ、室温で１時間（ＳＳＭＣＣの場合のみ１５分間）静置反応させた。こうして、基板上にマレイミド基表面を形成させることができた。その後ガラス基板をエタノール、水の順で洗浄し乾燥させた。
Example 1 On-chip phosphorylation by PKCδ (preparation of peptide array)
Three glass substrates (SDM0011 manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd .; size: 25.4 mm × 76.2 mm × 1 mm, coat type: densified amino group-introduced coating) prepared with high density of amino groups are prepared, 10 mg NHS-PEG-MAL (Molecular weight 3400; manufactured by Nekter) at 5 mg / ml concentration, MAL-dPEG 12 NHS ester (Molecular weight 865; manufactured by Quanta) solution at 5 mg / ml concentration, SSMCC (Molecular weight 436; Pierce) concentration at 0.4 mg / ml Each solution was prepared by dissolving in 10 mM phosphate buffer containing 150 mM NaCl; prepared in pH 7.4) so as to cover the region on each glass substrate where the peptide was immobilized. The solution was spread and allowed to stand at room temperature for 1 hour (15 minutes only for SSMCC). . In this way, a maleimide group surface could be formed on the substrate. Thereafter, the glass substrate was washed with ethanol and then water and dried.
乾燥後、ガラス基板上に基質となる合成ペプチド（以下、基質ペプチドとも示す。）９６種をスポッター（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター）を用いて１０ｎｌずつスポットし、湿度を保った状態で、室温で１６時間静置して基質ペプチドを固定化させた。用いた９６種の基質ペプチドは、配列表に示したアミノ酸配列のものを用いた。これらは、２種類のｃＳｒｃキナーゼの基質ペプチド（配列番号６９及び７０）を除き、プロテインキナーゼによりセリンもしくはスレオニン残基がリン酸化されることが報告されているアミノ酸配列である。いずれのペプチドも末端にシステイン残基が付加されてなり、このシステイン残基の有するチオール基が、基板表面のマレイミド基とカップリング反応することにより基板上に基質ペプチドが固定化されるものである。基質ペプチドの固定化パターンは図１に示す通りである。基質ペプチド溶液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（東京化成製）を含む１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解したものを用いた。以上の手法により、分子量の異なる３種類のリンカーを介したペプチドアレイを調製することができた。 After drying, 96 types of synthetic peptides (hereinafter also referred to as substrate peptides) serving as substrates on a glass substrate were spotted 10 nl at a time using a spotter (MultiSPRinter automatic spotter manufactured by Toyobo), while maintaining humidity. The substrate peptide was immobilized by allowing to stand at room temperature for 16 hours. The 96 types of substrate peptides used were those having the amino acid sequences shown in the sequence listing. These are amino acid sequences that have been reported to phosphorylate serine or threonine residues by protein kinases, except for two cSrc kinase substrate peptides (SEQ ID NOs: 69 and 70). Each peptide has a cysteine residue added to the end, and the substrate peptide is immobilized on the substrate by a coupling reaction between the thiol group of the cysteine residue and the maleimide group on the substrate surface. . The immobilization pattern of the substrate peptide is as shown in FIG. The substrate peptide solution used was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 1 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry) to a concentration of 1 mg / ml. It was. By the above method, a peptide array via three types of linkers having different molecular weights could be prepared.
（オートラジオグラフィによるリン酸化の検出）
上記の通り調製したアレイ上に、終濃度１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＳＨ（日本油脂株式会社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０５０ＳＨ；分子量５０００）溶液（１０ｍＭ リン酸バッファー；ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。）２００μｌをペプチド固定化領域を覆うようにロップして広げ、室温で３０分間静置反応させた。こうして、基板上に残存する未反応のマレイミド基がＰＥＧ−ＳＨのチオール基によりブロッキングされ、非特異的な吸着を抑制することができるものである。アレイを洗浄し乾燥させた後、ＲＩを用いたＰＫＣδによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化反応を行った。
(Detection of phosphorylation by autoradiography)
On the array prepared as described above, a final concentration of 10 mg / ml PEG-SH (SUNBRIGHT ME-050SH manufactured by NOF Corporation; molecular weight 5000) solution (10 mM phosphate buffer; pH 7.4; 150 mM NaCl included) 200 μl. Was spread over the peptide-immobilized region and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Thus, the unreacted maleimide group remaining on the substrate is blocked by the thiol group of PEG-SH, and nonspecific adsorption can be suppressed. After washing and drying the array, an on-chip phosphorylation reaction with PKCδ using RI was performed.
ＰＫＣδは、Ｓｉｇｍａ製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ δ Ｉｓｏｚｙｍｅを０．５μｇ／ｍｌ濃度で用いた。反応液組成としては、［γ３３Ｐ]−ＡＴＰ（５０ｕＣｉ／ｍｌ；アマシャムバイオサイエンス製）を含み、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、８μｇ／ｍｌ ホスファチジルセリン、０．８μｇ／ｍｌ ジアシルグリセロールを含む５０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いた。ＰＫＣδ溶液３００μｌをアレイの基質固定化領域上にドロップして十分に液を広げて、３０℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ、２Ｍ ＮａＣｌ（１％ Ｔｒｉｔｏｎ×１００を含む）、水の順で洗浄を行い、乾燥させた後、オートラジオグラフィによる各固定化基質におけるＲＩの取り込みの読み取りを、ＢＡＳ−１８００II（富士写真フイルム製）を用いて行った。露光は装置専用のシート（富士写真フイルム製ＳＧイメージングプレート）を用いて、３０分間行った。その結果を図２に示した。 As PKCδ, Protein Kinase Cδ Isozyme manufactured by Sigma was used at a concentration of 0.5 μg / ml. The reaction solution composition includes [γ 33 P] -ATP (50 uCi / ml; manufactured by Amersham Biosciences), 50 mM MOPS buffer (pH 7) containing 50 mM MgCl 2 , 8 μg / ml phosphatidylserine, 0.8 μg / ml diacylglycerol. .4) was used. 300 μl of the PKCδ solution was dropped on the substrate-immobilized region of the array to sufficiently spread the solution, and reacted at 30 ° C. for 1 hour. After the reaction, PBS, 2M NaCl (including 1% Triton × 100) and water were washed in this order, dried, and then read for RI uptake in each immobilized substrate by autoradiography. BAS-1800II ( Fuji Photo Film). The exposure was performed for 30 minutes using a sheet dedicated to the apparatus (SG imaging plate manufactured by Fuji Photo Film). The results are shown in FIG.
図２に示したように、分子量８６５のＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２ＮＨＳ ｅｓｔｅｒをリンカーにしたアレイが最も鮮明で、強いＲＩの取り込みによるリン酸化パターンを示しており最適であることが確認される。他の分子量がより大きいリンカーもしくはより小さいリンカーを用いた場合は、バックグラウンドが高くなって不鮮明であったり、あるいはＲＩの取り込みが弱くなってリン酸化効率も低下したりする傾向が確認されている。キナーゼの作用効率の向上と［γ３３Ｐ] −ＡＴＰの非特異的吸着抑制の両面の効果がバランスよく機能するためのリンカーの長さ、ずなわち、リンカーの分子量の大きさが存在することが示される。なお、このリンカーの構造式は、式（１）に示す通りである。ＥＧの繰り返しが１２回であるヘテロ二官能型リンカーである。 As shown in FIG. 2, the array using MAL-dPEG 12 NHS ester with a molecular weight of 865 as a linker is the clearest, showing a phosphorylation pattern due to strong RI incorporation, and is confirmed to be optimal. When other linkers with higher or lower molecular weight are used, background tends to be high and unclear, or RI uptake becomes weak and phosphorylation efficiency tends to decrease. . The length of the linker, that is, the size of the molecular weight of the linker, exists so that the effects of both the improvement of the action efficiency of the kinase and the suppression of non-specific adsorption of [γ 33 P] -ATP function in a balanced manner. Is shown. The structural formula of this linker is as shown in Formula (1). It is a heterobifunctional linker with 12 EG repeats.
実施例２ ＰＫＣβＩによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化
実施例１と同様にして、３種類のリンカーを用いたペプチドアレイを調製した。アレイのブロッキングも実施例１と同様に行った後、ＰＫＣβＩによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化を行い、オートラジオグラフィ解析を同様に検討した。ＰＫＣβＩはＳｉｇｍａ製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ βＩ Ｉｓｏｚｙｍｅを０．５μｇ／ｍｌ濃度で用いた。実施例１と同様に [γ３３Ｐ] −ＡＴＰを共存させて、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、８μｇ／ｍｌ ホスファチジルセリン、０．８μｇ／ｍｌ ジアシルグリセロールを含む５０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．４）を反応バッファーとして、各々のアレイ上において１時間のリン酸化を行った。反応後、実施例１と同様にアレイを洗浄、乾燥して、オートラジオグラフィを行った。その結果を図３に示した。この場合も、実施例１と同様に、分子量８６５のＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２ＮＨＳ ｅｓｔｅｒをリンカーにしたアレイが最も鮮明で、強いＲＩの取り込みによるリン酸化パターンを示している。他のリンカーを用いたアレイと対比しても、その傾向は顕著である。したがって、プロテインキナーゼの種類に関わらず、同じ傾向の再現性のあることも確認された。
Example 2 On-chip phosphorylation by PKCβI In the same manner as in Example 1, a peptide array using three types of linkers was prepared. After blocking the array in the same manner as in Example 1, On-chip phosphorylation with PKCβI was performed, and autoradiographic analysis was similarly examined. As PKCβI, Protein Kinase CβI Isozyme manufactured by Sigma was used at a concentration of 0.5 μg / ml. Similar to Example 1, 50 mM MOPS buffer (pH 7.4) containing [γ 33 P] -ATP and containing 50 mM MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 8 μg / ml phosphatidylserine, 0.8 μg / ml diacylglycerol. ) Was used as a reaction buffer and phosphorylated for 1 hour on each array. After the reaction, the array was washed and dried in the same manner as in Example 1 and autoradiography was performed. The results are shown in FIG. In this case as well, as in Example 1, the array using the MAL-dPEG 12 NHS ester having a molecular weight of 865 as a linker is the clearest and shows a phosphorylation pattern due to strong RI incorporation. This tendency is remarkable even when compared with arrays using other linkers. Therefore, it was confirmed that the same tendency was reproducible regardless of the type of protein kinase.
本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。 By utilizing the present invention, it is possible to comprehensively analyze many types of protein kinase signals, and to effectively profile protein kinase dynamics in cells accompanying the introduction of genes with unknown functions or drug administration. it can. This is expected to expand into genomic drug discovery, such as functional analysis from new genes and approaches to drug discovery.
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