JP2010117189A - Substrate for immobilizing physiological active substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、基材に固定された生理活性物質等を利用して、生体試料中の対象物質の並列検出および分析等に用いる生理活性物質固定化用基板に関する。 The present invention relates to a substrate for immobilizing a physiologically active substance used for parallel detection and analysis of a target substance in a biological sample using a physiologically active substance or the like immobilized on a base material.
遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。一方、ペプチドは、生物において多彩な生理機能を発揮し、生物の生命の恒常性を維持する基本的な物質であり、近年、この極めて強力な作用を有し、しかも安全性と特異性の高いペプチドを基本とした創薬はドラッグデリバリーシステムの進歩とともにますます重要視されている。 Attempts to decipher the genetic activity and the molecular processes of drug effects at the molecular level have traditionally focused on genomics, but proteomics is more detailed about the biological functions of cells. Provide information. Proteomics involves the qualitative and quantitative measurement of gene activity by detecting and quantifying expression at the protein level, rather than at the gene level. It also includes studies of events that are not encoded by genes such as post-translational modifications of proteins and interactions between proteins. Peptides, on the other hand, are basic substances that exert various physiological functions in living organisms and maintain the homeostasis of living organisms. In recent years, peptides have this extremely powerful action and are highly safe and highly specific. Peptide-based drug discovery is becoming increasingly important as drug delivery systems advance.
「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究やペプチドの研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。そのため、この目的の分子アレイとしてペプチドを有する生理活性物質を固定化した基材の開発・研究が進められている。 Now that the structure of the genome, which is the “blueprint of life”, has been clarified and a vast amount of genome information is available, proteomics research and peptide research are becoming more and more active. There is a need for rapid detection and high efficiency (high throughput). Therefore, development and research of a substrate on which a physiologically active substance having a peptide is immobilized as a molecular array for this purpose has been advanced.
しかし、プロテインチップなどは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。 However, since protein chips and the like are generally developed on the extension line of a DNA chip, studies have been made to immobilize a protein or a molecule that captures it on a glass substrate on a chip surface (for example, patents). Reference 1).
蛋白質等の検体の検出および定量において一般的に用いられている方法にサンドイッチ法がある。この方法は、固相に抗体（一次抗体）を結合させ、不溶化した抗体に標的となる蛋白をトラップさせ、次いで標的蛋白の別のエピトープを認識して結合する標識抗体（二次抗体）を反応させて、この標識物を測定することで蛋白を定量的に測定する方法である（例えば非特許文献１参照）。しかしこの方法では、例えばプロテインチップのように、一度に大量種の蛋白を検出しようとした場合、各々の標的蛋白に対して互いに競合しない複数種の抗体が必要となるため、条件の最適化は解決すべき多くの問題を含んでいる。 There is a sandwich method as a method generally used in detection and quantification of specimens such as proteins. In this method, an antibody (primary antibody) is bound to a solid phase, a target protein is trapped by an insolubilized antibody, and then a labeled antibody (secondary antibody) that recognizes and binds to another epitope of the target protein is reacted. Thus, the protein is quantitatively measured by measuring the label (see, for example, Non-Patent Document 1). However, this method requires multiple types of antibodies that do not compete with each other for each target protein when detecting a large amount of proteins at once, such as a protein chip. It contains many problems to be solved.
また、蛋白質を捕捉する分子（以下、捕捉分子と略す）を基板上に固定化した後、例えばサンドイッチ法のように該表面上で他の蛋白質（抗原抗体反応の場合、抗原に相当）と反応させ、更に、標識された蛋白質を反応させ最終的に検出機等で検出する場合、捕捉分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質、すなわち、抗原や標識された蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献２参照）。特に、臨床診断等で用いられる血清や血漿においては、夾雑蛋白の非特異的吸着が多くノイズが高く出てしまい、Ｓ／Ｎ比が低くなる傾向にあった。 In addition, after immobilizing a protein-capturing molecule (hereinafter abbreviated as a capturing molecule) on a substrate, it reacts with another protein (corresponding to an antigen in the case of an antigen-antibody reaction) on the surface as in the sandwich method, for example. In addition, when a labeled protein is reacted and finally detected by a detector or the like, a protein other than the molecule, that is, an antigen or a labeled protein is immobilized on a portion where the capture molecule is not immobilized. , It becomes noise at the time of detection, causing a reduction in the signal-to-noise ratio (S / N ratio), and lowering the detection accuracy (see Non-Patent Document 2, for example). In particular, in serum and plasma used in clinical diagnosis and the like, there is a large amount of nonspecific adsorption of contaminating proteins, resulting in high noise, and the S / N ratio tends to be low.
このため通常のサンドイッチ法では、一次抗体を固定化した後に抗原および二次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また、一次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまう場合があり、二次抗体と反応できないという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。 For this reason, in the normal sandwich method, after the primary antibody is immobilized, non-specific adsorption of the antigen and the secondary antibody is carried out to prevent the non-specific adsorption of the antigen and the secondary antibody. Not. In addition, since the adsorption inhibitor is coated after immobilizing the primary antibody, it may be coated on the immobilized protein, and there is a problem that it cannot react with the secondary antibody. Therefore, there is a demand for a biochip that does not have an adsorption inhibitor coating step after immobilization of the primary antibody and has a small amount of nonspecific adsorption of a physiologically active substance.
一方、一次抗体を固定化する際、抗体の抗原結合部位が機能しやすいように固定化することが重要である。たとえば特許文献２には、特定の固定化物質を、基盤に作製した微細穴に結合させる方法が記載されている。しかし、この方法では、固定化物質が抗体の場合、アミノ基末端（Ｎ末端）とを用いて基盤とペプチド結合させることになり、抗原結合部位が十分に機能しない場合があった。
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、特にペプチドを固定化できる生理活性物質固定化用基板を提供することを目的とする。ここで言う基材とは、各種チップ、プレート、粒子、容器等、バイオアッセイに利用可能なあらゆる材料を含む。 An object of the present invention is to provide a substrate for immobilizing a physiologically active substance that can suppress nonspecific adsorption / binding of a substance to be detected without coating with an adsorption inhibitor and in particular can immobilize a peptide. The term “substrate” as used herein includes all materials that can be used in bioassays, such as various chips, plates, particles, and containers.
本発明は、以下の通りである。
（１）ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有することを特徴とする生理活性物質固定化用基板。
（２）前記疎水性基がシクロヘキシルである（１）記載の生理活性物質固定化用基板。
（３）ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット、及び一級アミノ基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有する基板から一級アミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換したものである（１）又は（２）記載の生理活性物質固定化用基板。
（４）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基である（３）記載の生活性物質固定化用基板。
（５）前記高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である（１）〜（４）記載の生理活性物質固定化用基板。
（６）前記基板の形状が、スライド形状基板、マイクロプレート、容器、マイクロフルイディスク基板、粒子のいずれかである（１）〜（５）記載の生理活性物質固定化用基板。
（７）前記基板の材質がプラスチック製である（１）〜（６）記載の生理活性物質固定化用基板。
（８）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（７）記載の生理活性物質固定化用基板。
（９）（１）〜（８）記載の生理活性物質固定化用基板にペプチドを固定化した生理活性物質固定化基板。
The present invention is as follows.
(1) A substrate for immobilizing a physiologically active substance, which has a polymer compound on the surface comprising a unit having a phosphorylcholine group, a unit having a hydrophobic group, and a unit having an aldehyde group or a maleimide group.
(2) The substrate for immobilizing a physiologically active substance according to (1), wherein the hydrophobic group is cyclohexyl.
(3) A substance in which a primary amino group is substituted with an aldehyde group or a maleimide group from a substrate having a polymer compound on the surface comprising a unit having a phosphorylcholine group, a unit having a hydrophobic group, and a unit having a primary amino group. The substrate for immobilizing a physiologically active substance according to (1) or (2).
(4) The living substance immobilizing substrate according to (3), wherein the primary amino group is an oxylamino group.
(5) The substrate for immobilizing a physiologically active substance according to (1) to (4), wherein the main chain of the polymer compound is a (meth) acryl skeleton.
(6) The substrate for immobilizing a physiologically active substance according to (1) to (5), wherein the shape of the substrate is any one of a slide-shaped substrate, a microplate, a container, a microfluidic disk substrate, and particles.
(7) The substrate for immobilizing a physiologically active substance according to (1) to (6), wherein the substrate is made of plastic.
(8) The substrate for immobilizing a physiologically active substance according to (7), wherein the plastic contains saturated cyclic polyolefin or polystyrene.
(9) A physiologically active substance-immobilized substrate in which a peptide is immobilized on the physiologically active substance-immobilized substrate according to (1) to (8).
本発明の生理活性物質固定化用基板を用いれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、生理活性物質を固定化することができる。 By using the substrate for immobilizing a physiologically active substance of the present invention, it is possible to immobilize the physiologically active substance by suppressing nonspecific adsorption / binding of the substance to be detected without coating the adsorption inhibitor.
本発明は、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニット、から構成される高分子化合物を表面に有する生理活性物質固定化用基板であり、好ましくは、前記疎水性基がシクロヘキシルである生理活性物質固定化用基板である。
この高分子化合物は、検出対象物質の基材への物理的吸着（非特異的吸着）を抑制する性質を有する。さらに、生理活性物質を固定化する性質を併せ持つ。ホスホリルコリン基が非特異的吸着を抑制する役割を果たし、アルデヒド基、およびマレイミド基が生理活性物質を固定化する役割を果たす。
該生理活性物質固定化用基板は、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット、及び一級アミノ基を有するユニット、から構成される高分子化合物Ａを表面に有する基板から一級アミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換して作製することが好ましい。
The present invention is a physiologically active substance immobilization substrate having on its surface a polymer compound composed of a unit having a phosphorylcholine group, a unit having a hydrophobic group, and a unit having an aldehyde group or a maleimide group, A substrate for immobilizing a physiologically active substance, wherein the hydrophobic group is cyclohexyl.
This polymer compound has a property of suppressing physical adsorption (nonspecific adsorption) of the detection target substance to the base material. Furthermore, it also has the property of immobilizing physiologically active substances. A phosphorylcholine group plays a role of suppressing nonspecific adsorption, and an aldehyde group and a maleimide group play a role of immobilizing a physiologically active substance.
The substrate for immobilizing a physiologically active substance is obtained by converting a primary amino group to an aldehyde from a substrate having a polymer compound A on the surface composed of a unit having a phosphorylcholine group, a unit having a hydrophobic group, and a unit having a primary amino group. It is preferable to prepare it by substitution with a group or a maleimide group.
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれるホスホリルコリン基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、下記一般式［１］の構成単位の左部の構成単位で示されるように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。なかでもXはエチレンオキシ基であることが最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基Ｘの繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。 The unit having a phosphorylcholine group contained in the polymer compound A used in the present invention is not particularly limited in structure, but as shown in the structural unit on the left side of the structural unit of the following general formula [1], (meth) A structure in which an acrylic residue and a phosphorylcholine group are bonded via a chain of an alkyleneoxy group X having 1 to 10 carbon atoms is preferable. Of these, X is most preferably an ethyleneoxy group. The repeating number of the alkyleneoxy group X in the formula is an integer of 1 to 20, and when the repeating number is 2 or more and 20 or less, the carbon number of the repeated alkyleneoxy group may be the same or different. Although l is naturally a natural number, it may be expressed as a composition ratio of each component.
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｌの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して５〜９８ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると、非特異的吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中高分子化合物が溶出してしまう恐れが出てくる。ただし、高分子化合物のいずれかの部分に、基材と共有結合できる官能基類を導入し、基材と化学的に結合させる場合はこの限りではない。たとえば、高分子化合物中にシランカップリング剤を導入しておく方法などが簡便で好ましい。 The composition ratio of the unit having a phosphorylcholine group contained in the polymer compound A used in the present invention (ratio of l relative to the sum of l, m, and n) is not particularly limited. It is preferably 5 to 98 mol%, more preferably 10 to 90 mol%, and most preferably 10 to 80 mol%. When the composition ratio falls below the lower limit, nonspecific adsorption increases. On the other hand, when the upper limit is exceeded, water solubility increases, and the polymer compound may be eluted during the assay. However, this is not the case when a functional group capable of covalently bonding to the substrate is introduced into any part of the polymer compound and chemically bonded to the substrate. For example, a method of introducing a silane coupling agent into the polymer compound is simple and preferable.
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる疎水性基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、前記一般式［１］の構成単位の中央部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基が炭素数２〜２０のアルキル基である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。高分子化合物に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチック等、疎水性の基材に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。式中、ｍは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。 The unit having a hydrophobic group contained in the polymer compound A used in the present invention is not particularly limited in structure, but as represented by the structural unit at the center of the structural unit of the general formula [1], ( A structure in which a hydrophobic group is bonded to a (meth) acrylic group residue is preferable. Although a hydrophobic group is not specifically limited, An alkyl group and aromatics are mentioned. More preferably, the alkyl group is an alkyl group having 2 to 20 carbon atoms. The structure of the alkyl group is not particularly limited, and may be linear, branched, or cyclic. By including a unit having a hydrophobic group in the polymer compound, the wettability is improved even on a hydrophobic base material such as plastic, and coating can be performed without unevenness. In addition, since the hydrophobicity increases, it is possible to prevent the polymer compound from eluting during the assay. In the formula, m is naturally a natural number, but may be expressed as a composition ratio of each component.
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｍの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して、１〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは２０〜８０ｍｏｌ％である。上限値を上回ると非特異的吸着が増加する恐れが出てくる。 The composition ratio (ratio of m to the sum of l, m, and n) of the unit having a hydrophobic group contained in the polymer compound A used in the present invention is not particularly limited, but all units of the polymer compound Is preferably 1 to 90 mol%, more preferably 10 to 80 mol%, and most preferably 20 to 80 mol%. If the upper limit is exceeded, nonspecific adsorption may increase.
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式［１］の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基とオキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は特に制限されるものではないが、下記一般式［２］または［３］（式中ｑ、ｒは１〜２０の整数である。）であることが好ましい。 The unit having a primary amino group contained in the polymer compound A used in the present invention is not particularly limited in structure, but is represented by a structural unit on the right side of the structural unit of the general formula [1]. Thus, it is preferable that the (meth) acryl group residue and the oxylamino group or hydrazide group have a structure through a spacer Y containing an alkylene glycol residue. In the case of an oxylamino group, Z represents an oxygen atom, and in the case of a hydrazide group, Z represents NH. n is originally a natural number, but may be expressed as a composition ratio of each component. The structure of the spacer Y containing an alkylene glycol residue is not particularly limited, but may be the following general formula [2] or [3] (wherein q and r are integers of 1 to 20). preferable.
前記オキシルアミノ基またはヒドラジド基は、基板上に塗布後各館の右記に変換することができる。また、スペーサーがあることにより、アミノ基が主鎖部分から離れるため、生理活性物質が固定化されやすい。さらにスペーサーにアルキレングリコール残基が含まれていることから非特異的吸着性を発現させることができる。アルキレングリコール残基の炭素数は制限されるものではないが、炭素数２のエチレングリコール残基が最も好ましい。 The oxylamino group or hydrazide group can be converted to the right side of each building after coating on the substrate. Further, since the amino group is separated from the main chain portion due to the presence of the spacer, the physiologically active substance is easily immobilized. Furthermore, since an alkylene glycol residue is contained in the spacer, non-specific adsorptivity can be expressed. The number of carbon atoms of the alkylene glycol residue is not limited, but an ethylene glycol residue having 2 carbon atoms is most preferable.
本発明に使用する高分子化合物Ａに含まれる一級アミノ基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｎの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは５〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると、糖、糖鎖および／またはこれらを有する生理活性物質を十分に固定化できなくなる。一方、上限値を上回ると非特異的吸着が増加する恐れが出てくる。 The composition ratio (ratio of n to the sum of l, m and n) of the unit having a primary amino group contained in the polymer compound A used in the present invention is not particularly limited, but all units of the polymer compound Is preferably 1 to 94 mol%, more preferably 2 to 90 mol%, and most preferably 5 to 80 mol%. When the composition ratio falls below the lower limit, the sugar, sugar chain and / or physiologically active substance having these cannot be sufficiently immobilized. On the other hand, if the upper limit is exceeded, non-specific adsorption may increase.
本発明に使用する高分子化合物Ａの化学構造は、少なくともホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及び一級アミノ基を有するユニットを含む構造であれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。 As long as the chemical structure of the polymer compound A used in the present invention is a structure containing at least a unit having a phosphorylcholine group, a unit having a hydrophobic group, and a unit having a primary amino group, the bonding method is random, block, graft Any form may be used.
本発明に使用する高分子化合物Ａの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。 The method for synthesizing the polymer compound A used in the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of synthesis, a monomer having a phosphorylcholine group, a monomer having a hydrophobic group, and a primary amino group are previously used as protecting groups. A production method including a step of radical copolymerization of a protected monomer and a step of removing a protecting group from the polymer compound obtained by the step is preferred. Alternatively, radical copolymerization of a monomer having a phosphorylcholine group, a monomer having a hydrophobic group, and a monomer having a functional group capable of introducing a primary amino group, and introducing a primary amino group into the polymer compound obtained by the step The manufacturing method including the process to do is preferable.
ホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。 The monomer having a phosphorylcholine group is not particularly limited in structure. For example, 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxyethoxyethyl phosphorylcholine, 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10 -(Meth) acryloyloxyethoxynonyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylcholine and the like can be mentioned, and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is preferable from the viewpoint of availability.
疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートである。 Specific examples of the monomer having a hydrophobic group include n-butyl (meth) acrylate, iso-butyl (meth) acrylate, sec-butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate, n-neopentyl ( (Meth) acrylate, iso-neopentyl (meth) acrylate, sec-neopentyl (meth) acrylate, neopentyl (meth) acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, iso-hexyl (meth) acrylate, heptyl (meth) acrylate, n- Octyl (meth) acrylate, iso-octyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, n-nonyl (meth) acrylate, iso-nonyl (meth) acrylate, n-decyl (meth) acrylate, iso-decyl ( (Meth) acrylate, n-dodecyl (Meth) acrylate, iso-dodecyl (meth) acrylate, n-tridecyl (meth) acrylate, iso-tridecyl (meth) acrylate, n-tetradecyl (meth) acrylate, iso-tetradecyl (meth) acrylate, n-pentadecyl (meta ) Acrylate, iso-pentadecyl (meth) acrylate, n-hexadecyl (meth) acrylate, iso-hexadecyl (meth) acrylate, n-octadecyl (meth) acrylate, iso-octadecyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, isobonyl Examples include (meth) acrylate. Of these, n-butyl methacrylate, n-dodecyl methacrylate, n-octyl methacrylate, and cyclohexyl (meth) acrylate are most preferable.
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［４］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子またはＮＨ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。 The monomer in which the primary amino group is previously protected with a protecting group is not particularly limited in structure, but the following general formula [4] (wherein R 3 is a hydrogen atom or a methyl group, Y is a spacer containing an alkylene glycol residue, Z represents an oxygen atom or NH, and W represents a protecting group.) (Meth) acrylic group and oxylamino group or hydrazide group have a structure through a spacer Y containing an alkylene glycol residue. Preferably there is.
保護基Ｗとしてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）などが好適に用いられる。 The protecting group W is not limited as long as it can protect the amino group, and can be arbitrarily used. Of these, t-butoxycarbonyl group (Boc group), benzyloxycarbonyl group (Z group, Cbz group), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc group) and the like are preferably used.
具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。 Deprotection can be performed under general conditions using trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, or anhydrous hydrogen fluoride.
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。 On the other hand, the method for introducing a primary amino group after polymerizing a polymer compound is not limited at all, but at least a monomer having a phosphorylcholine group, a monomer having a hydrophobic group, and a monomer having an alkoxy group are radicalized. A method of producing a hydrazide group by reacting an alkoxy group introduced into the polymer compound with hydrazine after copolymerization is preferred. As the alkoxy group, a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, a t-butoxy group and the like are preferable.
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
本発明に使用する高分子化合物Ａの合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N，N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。 The synthetic solvent for the polymer compound A used in the present invention may be any solvent that dissolves the respective monomers. For example, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, t-butyl alcohol, n-pentanol. Isoalcohols, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, cyclohexanone, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl ethyl ketone, methyl butyl ketone, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene Examples include glycol monomethyl ether and ethylene glycol monobutyl ether. These solvents are used alone or in combination of two or more.
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, for example, 2,
Examples include azo compounds such as 2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), organic peroxides such as benzoyl peroxide and lauryl peroxide. be able to.
本発明に使用する高分子化合物Ａの分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。 The molecular weight of the polymer compound A used in the present invention is preferably 5,000 or more, more preferably 10,000 or more, since separation and purification of the polymer compound and unreacted monomer are facilitated.
本発明に使用する高分子化合物Ａで基材表面を被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。 By coating the substrate surface with the polymer compound A used in the present invention, it is possible to easily impart the property of suppressing nonspecific adsorption of the physiologically active substance and the property of immobilizing the physiologically active substance. is there.
基材表面への高分子化合物Ａの被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。 For coating the substrate surface with the polymer compound A, for example, a polymer solution in which the polymer compound is dissolved in an organic solvent so as to have a concentration of 0.05 to 50% by weight is prepared, and a known solution such as dipping or spraying is prepared. After applying to the surface of the substrate by the method, it is carried out by drying at room temperature or under heating.
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。 Examples of organic solvents include ethanol, methanol, isopropanol, n-butanol, t-butyl alcohol, n-pentanol, cyclohexanol, and other alcohols, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, methyl acetate, ethyl acetate, Examples thereof include butyl acetate, methyl ethyl ketone, methyl butyl ketone, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether, and cyclohexanone. These solvents are used alone or in combination of two or more. Of these, alcohols such as ethanol, methanol, isopropanol, n-butanol, t-butyl alcohol, n-pentanol, and cyclohexanol are preferable because they do not denature the plastic substrate and can be easily dried.
本発明に用いる基材としては、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられる。プラスチック製基板の具体例としては、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサロフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。 As the substrate used in the present invention, a slide-shaped substrate, a 96-well plate, a container, and a microfluidic substrate are preferable. Examples thereof include a plastic substrate, a glass substrate, and a substrate having a metal vapor deposition film. Specific examples of the plastic substrate include substrates made of cycloolefin polymer, polypropylene, polyethylene, polysalophone, polyimide, polycarbonate, polymethyl methacrylate, and the like.
高分子化合物Ａを塗布した基材は、高分子化合物Ａ中のアミノ基をアルデヒド基又はマレイミド基に置換することにより好適にペプチド化合物を固定化できるようになる。置換する方法としては、例えば、高分子化合物Ａを塗布した基材をアルデヒド基又はマレイミド基を有する化合物の溶液に浸漬することが挙げられる。 The base material coated with the polymer compound A can suitably immobilize the peptide compound by replacing the amino group in the polymer compound A with an aldehyde group or a maleimide group. As a method for substitution, for example, a substrate coated with the polymer compound A is immersed in a solution of a compound having an aldehyde group or a maleimide group.
アルデヒド基への置換には、次のような1分子内にアルデヒド基を２つ持つ化合物が好適に使用できる。グルタルアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジボアルデヒド、ナフタレン‐２，６‐ジカルボアルデヒド、クロセチンジアール、テレフタルアルデヒド、ｏ‐フタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、２‐メチルマロンアルデヒド、スペルミンジアルデヒド、２Ｅ，４Ｅ）‐２，４‐ヘキサジエンジアールなどが挙げることができる。これらの試薬は、単独または２種以上の組み合わせで用いても良い。 For substitution with an aldehyde group, the following compound having two aldehyde groups in one molecule can be preferably used. Glutaraldehyde, malondialdehyde, succinaldehyde, adibaldehyde, naphthalene-2,6-dicarbaldehyde, crocetin dial, terephthalaldehyde, o-phthalaldehyde, isophthalaldehyde, 2-methylmalonaldehyde, spermine dialdehyde, 2E, 4E) -2,4-hexadiene dial and the like. These reagents may be used alone or in combination of two or more.
マレイミド基への変換には次のような１分子内にアミノ基と反応できる官能基とマレイミド基を持つ化合物が好適に使用できる。Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシこはく酸イミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（マレイミドシクロヘキシリルオキシ）スクシンイミドなどが挙げることができる。これらの試薬は、単独または２種以上の組み合わせで用いても良い。 For conversion to a maleimide group, a compound having a maleimide group and a functional group capable of reacting with an amino group in one molecule can be preferably used. N- (α-maleimidoacetoxy) succinimide ester, m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide ester, m-maleimidobenzoyl N-hydroxysulfosuccinimide ester, N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide, N- (4 -Maleimidobutyryloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide, N- (8-maleimidocapryloxy) succinimide, N- (8-maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (11-maleimidoundecanoyloxy) succinimide, N- (11-maleimidoundecanoyloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (maleimidocyclohexyloxy) sc It can be N'imido and listed. These reagents may be used alone or in combination of two or more.
このようにして得られた基板は生理活性物質を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。生理活性物質としては、特にペプチドが好適に用いられる。さらにペプチドの片末端をシステイン化してあるペプチドがさらに好ましい。アルデヒド基とシステインとで環化反応によりペプチドの末端で固定化でき、分子の配向性がよくなる。またマレイミド基とシステインのチオール基と結合することによりペプチドの末端で固定化でき、分子の配向性がよくなる。又、ペプチドに限らずとも、生理活性物質の分子内にチオール基を有する化合物が好適に使用できる。 The substrate thus obtained can immobilize a physiologically active substance and can be suitably used for bioassay applications. Peptides are particularly preferably used as the physiologically active substance. Furthermore, a peptide in which one end of the peptide is cysteineated is more preferable. The aldehyde group and cysteine can be immobilized at the end of the peptide by a cyclization reaction, improving the molecular orientation. Moreover, it can fix | immobilize at the terminal of a peptide by couple | bonding with the maleimide group and the thiol group of cysteine, and the orientation of a molecule | numerator improves. Moreover, a compound having a thiol group in the molecule of the physiologically active substance can be suitably used without being limited to the peptide.
これらの生理活性物質の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、生理活性物質が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。 As a method for immobilizing these physiologically active substances on the substrate, a method of spotting a solution in which the physiologically active substance is dissolved using a spotter, or dispensing a solution in which the physiologically active substance is dissolved into a container or the like. There are ways to fix it.
生理活性物質を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス‐塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝剤などが用いられる。 Various buffer materials are preferably used as the solution for dissolving the physiologically active substance. Although not particularly limited, for example, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, Tris-HCl buffer, Tris acetate buffer, PBS buffer, sodium citrate, sodium acetate, HEPES (N-2 -Hydroxyethylperazine-N'-ethanesulfonic acid) buffer, MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid) buffer, etc. are used.
生理活性物質を溶解する溶液のｐHとしては、４〜１０であることが好ましく、さらに好ましくは７−９である。 The pH of the solution for dissolving the physiologically active substance is preferably 4 to 10, more preferably 7-9.
生理活性物質の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。 The concentration of the physiologically active substance in the solution is not particularly limited, but is preferably 0.0001 mg / ml to 10 mg / ml.
生理活性物質の溶液を固定化する温度としては、０℃から１００℃が好ましい。 The temperature at which the solution of the physiologically active substance is immobilized is preferably 0 ° C to 100 ° C.
（高分子化合物の合成例１）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ｎ−シクロヘキシルメタクリレート（ＣＭＡ）、Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド（ＯＡ、式［５］で示した化合物）をそれぞれ順に０．３５ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌ、０．３０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を回収した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
(Synthesis Example 1 of polymer compound)
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC), n-cyclohexyl methacrylate (CMA), N- [2- [2- [2- (t-butoxycarbonylaminooxyacetylamino) ethoxy] ethoxy] ethyl] -methacrylamide (OA) And the compound represented by the formula [5]) were dissolved in ethanol in order of 0.35 mol / L, 0.35 mol / L, and 0.30 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, after making it react at 60 degreeC under argon gas atmosphere, the reaction solution was dripped in diethyl ether, and precipitation was collect | recovered. The obtained polymer compound was measured by 1H-NMR, and the composition ratio of the polymer compound was calculated. Table 1 shows the results.
（比較高分子化合物の合成例２）
ＭＰＣ、ＢＭＡ、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５−エチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯ４．５ＮＰ）、をそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．６０ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．０１ｍｏｌ／ＬのＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を回収した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子化合物の組成比を算出した。表２に結果を示した。
(Synthesis Example 2 of Comparative Polymer Compound)
MPC, BMA, and p-nitrophenyloxycarbonyl-4.5-ethylene glycol methacrylate (MEO4.5NP) were added to ethanol so as to be 0.25 mol / L, 0.60 mol / L, and 0.15 mol / L, respectively. It was dissolved to prepare a monomer mixed solution. Further 0.01 mol / L of AIBN was added thereto and stirred until uniform. Then, after making it react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 4 hours, the reaction solution was dripped in the mixed solvent of diethyl ether and chloroform, and precipitation was collect | recovered. The obtained polymer compound was measured by 1H-NMR, and the composition ratio of the polymer compound was calculated. Table 2 shows the results.
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を高分子化合物の合成例１にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、乾燥することにより、基板表面に合成例１のポリマーを含む層を導入した。
次いで前記基板を２ＮのＨＣｌ水溶液で３７℃２時間処理することにより、ＢＯＣ基の除去を行った。さらに該基板をグルタルアルデヒド（和光純薬製０７３−００５３６）を１重量％となるように０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）（和光純薬製：１９７−０１３０２）に溶解した溶液に室温で２時間浸漬することによりアルデヒド基を表面に有する基板を得た。
Example 1
Saturated cyclic polyolefin resin (hydrogenated ring-opening polymer of 5-methyl-2-norbornene, MFR (Melt flow rate): 21 g / 10 min, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature 123 ° C.) A solid-phase substrate was prepared by processing into a slide glass shape (size: 76 mm × 26 mm × 1 mm). This solid phase substrate was immersed in a 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound obtained in Polymer Compound Synthesis Example 1 and dried to introduce a layer containing the polymer of Synthesis Example 1 on the substrate surface. .
Next, the substrate was treated with 2N HCl aqueous solution at 37 ° C. for 2 hours to remove the BOC group. Further, the substrate was dissolved in a solution obtained by dissolving glutaraldehyde (073-00536, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a 0.1 M aqueous sodium carbonate solution (pH 8.5) (197-01302, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) so as to be 1% by weight. For 2 hours to obtain a substrate having aldehyde groups on the surface.
（実施例２）
Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（和光純薬性：３４７−０５０４１）をグルタルアルデヒドの代わりに用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、マレイミド基を表面に有する基板を得た。
(Example 2)
The same operation as in Example 1 was performed except that N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: 347-05041) was used instead of glutaraldehyde to obtain a substrate having a maleimide group on the surface. It was.
（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を高分子化合物の合成例２にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、乾燥することにより、基板表面に合成例２のポリマーを含む層を導入した。
(Comparative example)
Saturated cyclic polyolefin resin (hydrogenated ring-opening polymer of 5-methyl-2-norbornene, MFR (Melt flow rate): 21 g / 10 min, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature 123 ° C.) A solid-phase substrate was prepared by processing into a slide glass shape (size: 76 mm × 26 mm × 1 mm). This solid phase substrate was immersed in a 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound obtained in Polymer Compound Synthesis Example 2 and dried to introduce a layer containing the polymer of Synthesis Example 2 on the substrate surface. .
《実験１》
工程１（ペプチドの固定化）
実施例で得られた基板上にペプチドを固定化した。詳細は、先ず下記構造のペプチドＡとペプチドＢをそれぞれ０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）（和光純薬製：１９７−０１３０２）に１０μg/ｍＬになるように溶解した。
ペプチドA : CIHSDRFDTYRSKKESERLV (20mer)
ペプチドB : CERIKIKALIPKNAGVSD (18mer)
該基板に自動スポッターによりスポット後、室温の環境下に１４時間静置することによりペプチドA及びBを基板に固定化した。
次に比較例で得られた基板上でも同様の操作を行い、基板上にペプチドA及びBを固定化した。
<Experiment 1>
Step 1 (Peptide immobilization)
Peptides were immobilized on the substrates obtained in the examples. Specifically, first, peptide A and peptide B having the following structures were each dissolved in 0.1 M sodium carbonate aqueous solution (pH 8.5) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: 197-01302) at 10 μg / mL.
Peptide A: CIHSDRFDTYRSKKESERLV (20mer)
Peptide B: CERIKIKALIPKNAGVSD (18mer)
Peptides A and B were immobilized on the substrate by spotting on the substrate with an automatic spotter and then standing in a room temperature environment for 14 hours.
Next, the same operation was performed on the substrate obtained in the comparative example to immobilize peptides A and B on the substrate.
工程２（吸着防止処理）
その後、実施例１の基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間処理することにより残りのアルデヒド基を失活させた。実施例２の基板は０．１Mのメルカプトエタノール（和光純薬製）水溶液に１時間処理することにより残りのマレイミド基を失活させた。
比較例の基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りの活性エステル部を失活させた。
Process 2 (Suction prevention treatment)
Thereafter, the substrate of Example 1 is treated with 0.1 mol / liter ethanolamine (manufactured by Wako Pure Chemicals, deer special grade), 0.1 mol / liter tris buffer (manufactured by SIGMA) aqueous solution (pH 9.5) for 1 hour. To deactivate the remaining aldehyde groups. The substrate of Example 2 was treated with a 0.1 M mercaptoethanol (Wako Pure Chemical) aqueous solution for 1 hour to inactivate the remaining maleimide groups.
The substrate of the comparative example was immersed in 0.1 mol / liter ethanolamine (manufactured by Wako Pure Chemicals, deer special grade), 0.1 mol / liter tris buffer (manufactured by SIGMA) aqueous solution (pH 9.5) for 1 hour, and the rest The active ester part was deactivated.
工程３（抗原抗体反応１）
その後、ラビットにペプチドAを免疫し、得られた抗血清をCy3-monoreactive dye（GEヘルスケア社製）にて蛍光ラベルしたサンプルをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈した溶液を室温にて２時間、各基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。
抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間３回洗浄した。
Step 3 (antigen-antibody reaction 1)
Thereafter, the rabbit was immunized with peptide A, and the resulting antiserum was fluorescently labeled with Cy3-monoreactive dye (GE Healthcare). PBS sample (Nissui Pharmaceutical: Dulbecco PBS (-) for tissue culture) An antigen-antibody reaction was carried out by bringing a solution obtained by diluting 10% with 9.6 g of a solution of 9.6 g in 1 liter of pure water into contact with each substrate at room temperature for 2 hours.
1 × SSC buffer (diluted SSC20 × Buffer manufactured by Zymed Laboratories, Inc.) supplemented with 0.05 wt% nonionic surfactant Tween20 (manufactured by Roche Diagnostics) after antigen-antibody reaction And washed 3 times for 5 minutes at room temperature.
《実験２》
ラビットにペプチドBを免疫し、得られた抗血清をCy3-monoreactive dye（GEヘルスケア社製）にて蛍光ラベルしたサンプルを用いた以外は実験１と同様に操作をした。
<Experiment 2>
Rabbit was immunized with peptide B, and the same operation as in Experiment 1 was performed except that the obtained antiserum was fluorescently labeled with Cy3-monoreactive dye (GE Healthcare).
各基板について蛍光量測定を行いスポットシグナル強度値とバックグランド値を評価した。バックグランド値の結果を表３に示す。 The amount of fluorescence was measured for each substrate, and the spot signal intensity value and the background value were evaluated. The results of the background value are shown in Table 3.
実施例および比較例における蛍光量の測定には、ＰａｃｋａｒｄＢｉｏＣｈｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
実施例は、いずれの比較例よりもスポットシグナル値が強く、Ｓ／Ｎ比が大きい結果になった。
A microarray scanner “ScanArray” manufactured by Packard BioChip Technologies was used for the measurement of the amount of fluorescence in Examples and Comparative Examples. The measurement conditions were laser output 90%, PMT sensitivity 50%, excitation wavelength 649 nm, measurement wavelength 670 nm, and resolution 50 μm.
In Examples, the spot signal value was stronger than in any of the comparative examples, and the S / N ratio was large.
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