JP2005069788A - Method for detecting phosphorylated protein - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for safely and rapidly detecting a phosphorylated substance to be captured with high sensitivity and high efficiency. <P>SOLUTION: In the method for detecting phosphorylated protein, a capturing substance for capturing a substance originating from a living body is fixed to the surface of a substrate and the substance to be captured being protein or peptide is specifically captured by the interaction with the capturing substance to identify whether the substance to be captured is phosphorylated. Preferably, the capturing substance contains either one of protein, peptide and nucleic acid, and protein being the substance to be captured is an antibody. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、特異的に蛋白質或いはペプチドを捕捉する物質を用いて、リン酸化された蛋白質或いはペプチドを捕捉する検出方法に関するものである。   The present invention relates to a detection method for capturing a phosphorylated protein or peptide using a substance that specifically captures a protein or peptide.

蛋白質のリン酸化は細胞の分化、増殖、細胞死に至るまでさまざまな細胞活動に関与している。これまで、リン酸化に対する研究は、ある特定の蛋白質に焦点を当てたピンポイント型の研究であった。しかし、蛋白質のリン酸化によって調節されている生命現象の全体像を知るためには、もっと多くのリン酸化情報が必要である。網羅的解析手段の一つであるＤＮＡマイクロアレイでは一度に大量の情報を得ることができるが、蛋白質のリン酸化のような、翻訳後修飾された蛋白質については調べられない。   Protein phosphorylation is involved in various cellular activities ranging from cell differentiation to proliferation and cell death. So far, phosphorylation has been a pinpoint study focusing on a specific protein. However, more phosphorylation information is needed to get an overview of the life phenomena that are regulated by protein phosphorylation. A DNA microarray, which is one of the comprehensive analysis means, can obtain a large amount of information at a time, but cannot examine a protein that has been post-translationally modified such as protein phosphorylation.

細胞内の蛋白質のリン酸化を検出する方法としてよく用いられているのが、[³²Ｐ]正リン酸による細胞の標識である。該方法は非常に重要な知見が比較的簡単に得られるが、被爆、汚染の恐れがあり、ラジオアイソトープの基本的な性質を理解した上で実験に臨む必要があり注意が必要である。 A commonly used method for detecting phosphorylation of intracellular proteins is the labeling of cells with [ ³² P] orthophosphate. Although this method can obtain very important knowledge relatively easily, there is a risk of exposure and contamination, and it is necessary to understand the basic properties of the radioisotope, so it is necessary to be careful.

その他、アイソトープを用いた手法としては標識したサンプルを電気泳動法で直接分離して[³²Ｐ]リン酸を取り込んだ蛋白質をオートグラフィーなどで検出する方法があるが、測定に１〜２日を要する。 In addition, as a method using isotope, there is a method in which a labeled sample is directly separated by electrophoresis and a protein incorporating [ ³² P] phosphate is detected by autography or the like. Cost.

アイソトープを用いない手法としては抗体、或いは酵素を用いて、上述同様に電気泳動法でサンプルを分離し、ニトロセルロース膜に転写するウエスタンブロッティング法があるが、測定に２〜３日を要する。
「プロテオミクス」、現代化学増刊42、24−30(2002) 「タンパク質実験ノート下巻」、105−117(1996) As a method not using an isotope, there is a Western blotting method in which a sample is separated by electrophoresis as described above using an antibody or an enzyme and transferred to a nitrocellulose membrane. However, it takes 2 to 3 days for the measurement.
Proteomics, Hyundai Kagaku Extra Number 42, 24-30 (2002) "Protein Experiment Notebook Vol. 2", 105-117 (1996)

本発明の目的は、基板の表面に生体由来物を捕捉する物質（以下、捕捉物）が固定されており、該捕捉物との相互作用により蛋白質或いはペプチド（以下、被捕捉物と略す）を特異的に捕捉する検出方法であり、リン酸化された被捕捉物の検出が可能で安全かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）に検出結果を得る事ができる方法を提供することにある。   An object of the present invention is that a substance that captures a biological substance (hereinafter referred to as a captured substance) is immobilized on the surface of a substrate, and a protein or peptide (hereinafter abbreviated as a captured object) is interacted with the captured substance. An object of the present invention is to provide a detection method that specifically captures a phosphorylated capture target, and that can obtain a detection result safely, with high sensitivity, and with high efficiency (high throughput).

本発明は、
（１）基板の表面に生体由来物を捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである被捕捉物を特異的に捕捉し、該被捕捉物のリン酸化の有無を識別するリン酸化蛋白質の検出方法、
（２） 捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含む（１）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（３） 捕捉物である蛋白質が抗体である（２）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（４） 被捕捉物と抗リン酸化蛋白質抗体を相互作用させる（１）、（２）又は（３）いずれか記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（５） 抗リン酸化蛋白質抗体が抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体、又は抗リン酸化チロシン抗体の何れかである（４）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（６） 抗リン酸化蛋白質抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、ペルオキシダーゼ標識されている（４）又は（５）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（７） ビオチン標識された抗リン酸化蛋白質抗体と蛍光標識されたアビジン又はストレプトアビジンと結合させる（６）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
である。 The present invention
(1) A captured substance that is a substance that captures a biological substance is immobilized on the surface of the substrate, and a captured object that is a protein or a peptide is specifically captured by interaction with the captured object. A method for detecting a phosphorylated protein that identifies the presence or absence of phosphorylation,
(2) The method for detecting a phosphorylated protein according to (1), wherein the captured substance includes any one of a protein, a peptide, and a nucleic acid,
(3) The method for detecting a phosphorylated protein according to (2), wherein the protein to be captured is an antibody,
(4) The method for detecting a phosphorylated protein according to any one of (1), (2) and (3), wherein a captured substance interacts with an anti-phosphorylated protein antibody,
(5) The method for detecting a phosphorylated protein according to (4), wherein the anti-phosphorylated protein antibody is any one of an anti-phosphorylated serine antibody, an anti-phosphorylated threonine antibody, and an anti-phosphorylated tyrosine antibody,
(6) The method for detecting a phosphorylated protein according to (4) or (5), wherein the anti-phosphorylated protein antibody is labeled with biotin, fluorescent, or peroxidase,
(7) The method for detecting a phosphorylated protein according to (6), wherein the biotin-labeled anti-phosphorylated protein antibody is bound to fluorescently labeled avidin or streptavidin.
It is.

本発明の方法に従うと、リン酸化された被捕捉物の検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）に検出結果を得る事ができる。   According to the method of the present invention, it is easy to detect a phosphorylated capture target, and it is possible to obtain a detection result with high sensitivity, quickness and high efficiency (high throughput).

本発明に使用する検出方法は、固相基板表面の一部に捕捉物が固定化され、リン酸化された被捕捉物の検出ができることを特徴とする。
本発明の検出方法は、基板作製工程、基板表面修飾工程、捕捉物固定工程、ブロッキング工程、捕捉物／被捕捉物相互作用工程及び検出工程を含む。
基板表面処理工程は省いても使用可能であるが、より強固に捕捉物を固定化する為に用いる事が好ましい。 The detection method used in the present invention is characterized in that a captured substance is immobilized on a part of the surface of a solid phase substrate, and a phosphorylated captured object can be detected.
The detection method of the present invention includes a substrate preparation process, a substrate surface modification process, a captured substance fixing process, a blocking process, a captured / captured substance interaction process, and a detection process.
Although it can be used even if the substrate surface treatment step is omitted, it is preferable to use it in order to immobilize the captured substance more firmly.

（基板の素材）
基板の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基板の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。たとえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等をさす。 (Substrate material)
As the substrate material, glass, metal or the like can be usually used. However, as the substrate material used in the present invention, plastic is used from the viewpoint of easy surface treatment and mass productivity. preferable. As a thermoplastic resin, a thing with little fluorescence generation amount is preferable. For example, it is preferable to use linear polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polypentene, polycarbonate, polystyrene, polyamide, saturated cyclic polyolefin, fluorine-containing resin, etc. It is more preferable to use a cyclic polyolefin. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a polymer having a cyclic olefin structure or a saturated polymer obtained by hydrogenating a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin.

（基板の表面修飾）
本発明に使用する基板の表面修飾方法としては、種々の方法が用いられるが、アルデヒド基を導入すると捕捉物が基板上で共有結合し、より強固に固定されるので該基を導入することが好ましい。アルデヒド基の導入方法として好適に用いられるのは、アミノ基導入の後に多官能性アルデヒドを反応させる方法である。アミノ基の導入手段としては、アミノ基含有シランカップリング剤による処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性の観点から、アミノ基含有シランカップリング剤による処理が好ましい。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒドが好ましい。 (Substrate surface modification)
Various methods can be used as a method for modifying the surface of the substrate used in the present invention. When an aldehyde group is introduced, the captured substance is covalently bonded on the substrate and fixed more firmly. preferable. As a method for introducing an aldehyde group, a method in which a polyfunctional aldehyde is reacted after introduction of an amino group is preferably used. Examples of amino group introduction means include treatment with an amino group-containing silane coupling agent, plasma treatment under a nitrogen atmosphere, and coating of an amino group-containing polymer substance. From the viewpoint of simplicity of treatment and uniformity. The treatment with an amino group-containing silane coupling agent is preferred. As the polyfunctional aldehyde, glutaraldehyde is preferable.

（捕捉物の固定化）
本発明に使用する捕捉物は、アルデヒド基との反応性を高めるため、予めアミノ基を導入しておくことが好ましい。捕捉物が核酸の場合は、アミノ基の導入位置は核酸の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。蛋白質、ポリペプチドの場合は、アミノ基を具備している為、アミノ基導入の必要性はない。固定化は通常、生理活性物質を溶解した溶液を基板上に点着した後、適宜処理を施すことにより行う。 (Immobilization of captured matter)
In order to enhance the reactivity with the aldehyde group, it is preferable to introduce an amino group in advance in the captured product used in the present invention. When the captured product is a nucleic acid, the amino group may be introduced at the molecular chain end or side chain of the nucleic acid, but is preferably introduced at the molecular chain end. In the case of proteins and polypeptides, since amino groups are provided, it is not necessary to introduce amino groups. Immobilization is usually performed by applying a treatment appropriately after spotting a solution in which a physiologically active substance is dissolved on a substrate.

（ブロッキング工程）
捕捉物を固定化し、該捕捉物と被捕捉物を相互作用させる前に基板表面上で捕捉物が固定化されていない部分と被捕捉物が非特異的に吸着するのを防止する事をブロッキングとよぶ。本発明でブロッキングに使用する物質はスキムミルク、アルブミン、抗体及び抗体のＦｃ部分よりなる群より選択された少なくとも１種であることが好ましい。これらの物質を純水或いはトリス酸緩衝液で０．１〜１０重量％に調製し、その溶液中に生理活性物質が固定化された基板を浸し、基板表面の官能基と１〜３時間反応させることにより行う。 (Blocking process)
Blocks the capture target from non-specific adsorption on the substrate surface before immobilizing the captured product and allowing the captured product and the captured product to interact with each other. Called. The substance used for blocking in the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of skim milk, albumin, antibody, and Fc part of the antibody. These substances are prepared to 0.1 to 10% by weight with pure water or tris acid buffer solution, and a substrate on which a physiologically active substance is immobilized is immersed in the solution, and reacted with a functional group on the substrate surface for 1 to 3 hours. To do.

（捕捉物／被捕捉物相互作用工程）
捕捉物が固定化され、ブロッキングが施された基板上に目的のリン酸化の有無を知りたい蛋白質即ち被捕捉物溶液を滴下する。 (Interaction process of captured / acquired objects)
A protein to be detected, ie, a solution to be captured, is dropped onto a substrate on which the captured material is immobilized and subjected to blocking.

（検出工程）
上述、被捕捉物に蛍光標識物質を結合させてそれを検出器で検出しても構わないが、被捕捉物と蛍光標識物質が結合する際に被捕捉物が構造変化を起こし捕捉物と特異的に結合しない場合がある。
その為、被捕捉物と特異的に結合する抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体、抗リン酸化チロシン抗体などの抗リン酸化蛋白質抗体水溶液を被捕捉物と結合した捕捉物が固相化された基板上に滴下し、被捕捉物と該抗リン酸化蛋白質抗体と結合させる事が好ましい。
更に好ましくは該抗リン酸化蛋白質抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、ペルオキシダーゼ標識されているとよい。
蛍光標識されていればそのまま、蛍光量を測定でき、ペルオキシダーゼ標識されていれば基質を基板上に滴下する事により発色させその発色量を検出すればよい。
更にビオチン標識されていれば蛍光標識されたアビジン、又はストレプトアビジンと該ビオチン基が特異的に結合するので、結合させた後その蛍光量を検出すればよい。 (Detection process)
As described above, a fluorescent labeling substance may be bound to the capture target and detected by a detector. However, when the capture target and the fluorescent labeling substance are bound, the capture target undergoes a structural change and is specific to the capture target. May not be combined.
For this reason, the captured product obtained by binding an aqueous solution of an anti-phosphorylated protein antibody such as an anti-phosphorylated serine antibody, an anti-phosphorylated threonine antibody, or an anti-phosphorylated tyrosine antibody that specifically binds to the captured product to the captured product is immobilized. It is preferable that the substance to be captured is bonded to the anti-phosphorylated protein antibody by dropping it on the prepared substrate.
More preferably, the anti-phosphorylated protein antibody is labeled with biotin, fluorescent, or peroxidase.
If it is fluorescently labeled, the amount of fluorescence can be measured as it is, and if it is peroxidase-labeled, the substrate is dropped on the substrate to develop color and detect the color development amount.
Furthermore, if it is biotin-labeled, fluorescence-labeled avidin or streptavidin and the biotin group bind specifically, so that the amount of fluorescence may be detected after binding.

被捕捉物と標識された抗リン酸化蛋白質抗体との反応性が低い場合は非標識の抗リン酸化蛋白質抗体を使用し、次工程でビオチン、蛍光、又は、ペルオキシダーゼなどの標識を施された該抗リン酸化蛋白質抗体と結合させた後、上述同様に検出してもよい。   When the reactivity between the captured substance and the labeled anti-phosphorylated protein antibody is low, an unlabeled anti-phosphorylated protein antibody is used, and in the next step, a label such as biotin, fluorescence, or peroxidase is applied. After binding with an anti-phosphorylated protein antibody, detection may be performed in the same manner as described above.

（実施例１、２）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより一次抗体、ＣＲＥＢ抗体をスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、ブロッキングの為に５％濃度になるようにスキムミルクを溶解させた２５ｍＭのトリス緩衝溶液に該基板を浸し室温で２時間静置した。その後、リン酸化された抗原ＣＲＥＢとリン酸化されていない抗原ＣＲＥＢとをそれぞれ一次抗体と抗原抗体反応を実施した。その後、二次抗体としてビオチン標識された抗リン酸化セリン抗体と抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行い、その際のＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。また、ブロッキング工程以降にかかった時間について計測した。結果を表１に示す。 (Examples 1 and 2)
The saturated cyclic polyolefin resin was processed into a slide glass shape (dimensions: 76 mm × 26 mm × 1 mm). After the surface was hydrophilized, it was immersed in a 2% aqueous solution of an amino group-containing alkylsilane and then heat treated to introduce amino groups on the surface. This was immersed in a 1% glutaraldehyde aqueous solution to react the surface amino groups with glutaraldehyde to introduce aldehyde groups.
Next, a sandwich method was performed on the substrate. For details, first, the primary antibody and CREB antibody were spotted on the substrate by an automatic spotter, and then allowed to stand in an environment of 4 ° C. for 24 hours. Thereafter, the substrate was immersed in a 25 mM Tris buffer solution in which skim milk was dissolved to a concentration of 5% for blocking, and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Thereafter, a primary antibody and an antigen-antibody reaction were performed on the phosphorylated antigen CREB and the non-phosphorylated antigen CREB, respectively. Thereafter, an antigen-antibody reaction was carried out with an anti-phosphorylated serine antibody labeled with biotin as a secondary antibody. Finally, it was reacted with Cy5-labeled streptavidin, the amount of fluorescence was measured for each spot, and the S / N ratio (Signal / noise ratio) at that time was calculated. Moreover, it measured about the time taken after the blocking process. The results are shown in Table 1.

（比較例）
実施例と同じ試料を使用して従来法であるウエスタンブロッティング法を実施した。蛍光強度はスポットの形状が異なる為、比較できなかったが抗原のリン酸化の有無による検出差は確認できた。但し、測定時間は４８時間を要した。 (Comparative example)
The western blotting method which is a conventional method was implemented using the same sample as the Example. The fluorescence intensity could not be compared because the spot shape was different, but the difference in detection depending on the presence or absence of antigen phosphorylation could be confirmed. However, the measurement time required 48 hours.

実施例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製バイオチップスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度７０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。   A biochip scanner “ScanArray” manufactured by Packard BioChip Technologies was used to measure the amount of fluorescence in the examples. The measurement conditions were laser output 90%, PMT sensitivity 70%, excitation wavelength 649 nm, measurement wavelength 670 nm, and resolution 50 μm.

本発明のリン酸化蛋白質の検出方法は、検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）であり、各種のリン酸化蛋白質の解析、分析に適用できる。   The method for detecting a phosphorylated protein of the present invention is easy to detect, safe, highly sensitive, quick and highly efficient (high throughput), and can be applied to the analysis and analysis of various phosphorylated proteins.

Claims (7)

基板の表面に生体由来物を捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである被捕捉物を特異的に捕捉し、該被捕捉物のリン酸化の有無を識別するリン酸化蛋白質の検出方法。 A captured substance, which is a substance that captures a biological substance, is immobilized on the surface of the substrate, and a captured object that is a protein or a peptide is specifically captured by interaction with the captured substance, and phosphorylation of the captured object is performed. A method for detecting a phosphorylated protein for identifying the presence or absence. 捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含む請求項１記載のリン酸化蛋白質の検出方法。 The method for detecting a phosphorylated protein according to claim 1, wherein the captured substance contains any one of a protein, a peptide, and a nucleic acid. 捕捉物である蛋白質が抗体である請求項２記載のリン酸化蛋白質の検出方法。 The method for detecting a phosphorylated protein according to claim 2, wherein the protein that is a captured substance is an antibody. 被捕捉物と抗リン酸化蛋白質抗体を相互作用させる請求項１、２又は３いずれか記載のリン酸化蛋白質の検出方法。 The method for detecting a phosphorylated protein according to any one of claims 1, 2, and 3, wherein a captured substance and an anti-phosphorylated protein antibody interact with each other. 抗リン酸化蛋白質抗体が抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体、又は抗リン酸化チロシン抗体の何れかである請求項４記載のリン酸化蛋白質の検出方法。 The method for detecting a phosphorylated protein according to claim 4, wherein the anti-phosphorylated protein antibody is any one of an anti-phosphorylated serine antibody, an anti-phosphorylated threonine antibody, and an anti-phosphorylated tyrosine antibody. 抗リン酸化蛋白質抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、ペルオキシダーゼ標識されている請求項４又は５記載のリン酸化蛋白質の検出方法。 The method for detecting a phosphorylated protein according to claim 4 or 5, wherein the anti-phosphorylated protein antibody is labeled with biotin, fluorescent or peroxidase. ビオチン標識された抗リン酸化蛋白質抗体と蛍光標識されたアビジン又はストレプトアビジンと結合させる請求項６記載のリン酸化蛋白質の検出方法。 The method for detecting a phosphorylated protein according to claim 6, wherein the biotin-labeled anti-phosphorylated protein antibody is combined with fluorescently labeled avidin or streptavidin.