JP2008289374A - New substrate polypeptide for protein kinase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は各種タンパク質キナーゼによりリン酸化される基質ポリペプチドおよびその用途に関する。 The present invention relates to a substrate polypeptide that is phosphorylated by various protein kinases and uses thereof.
タンパク質キナーゼは細胞情報伝達の中核をなす、翻訳後修飾を担当する酵素群である。タンパク質キナーゼのアッセイは創薬、診断において極めて重要なものである。既に種々のキナーゼに関して幾つかの基質ポリペプチドが報告されており、市販もされている。 Protein kinases are a group of enzymes that are responsible for post-translational modifications, which form the core of cell information transmission. Protein kinase assays are extremely important in drug discovery and diagnosis. Several substrate polypeptides have already been reported for various kinases and are also commercially available.
しかしながら、タンパク質キナーゼの既存の基質ポリペプチドは必ずしも満足できるものではない。種々の能力を持った基質ポリペプチドの開発が望まれている。たとえば、基質を実際の細胞内キナーゼの計測に用いることは、診断や創薬に極めて有用であるが、細胞内キナーゼの量や活性は、細胞の種類や目的とする状態によって様々であるため、よりリン酸化されやすい基質のほうが良いというものではない。実際に目的の系に存在するキナーゼの量に適したリン酸化されやすさが必要である。すなわち、一つの酵素に対して一種類の基質があればいいということではなく、種々のリン酸化のされやすさをもつ多くの基質を用意することが重要である。 However, existing substrate polypeptides for protein kinases are not always satisfactory. Development of substrate polypeptides having various abilities is desired. For example, the use of a substrate for actual measurement of intracellular kinases is extremely useful for diagnosis and drug discovery, but the amount and activity of intracellular kinases vary depending on the type of cells and the intended state. A substrate that is more easily phosphorylated is not better. In fact, it is necessary to be easily phosphorylated in accordance with the amount of kinase present in the target system. That is, it is important not to have only one kind of substrate for one enzyme, but to prepare many substrates having various phosphorylation easiness.
またタンパク質キナーゼの活性検出用の、基質ポリペプチドを基板上に固定化したポリペプチドアレイやバイオチップに用いるための基質ポリペプチドの開発も望まれている。基板上に固定化された状態でタンパク質キナーゼによりリン酸化されるのに適した基質ポリペプチドのアミノ酸配列は、溶液中でリン酸化されるのに適した基質ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なることが多いため、溶液中でのリン酸化反応に基づく従来の基質ポリペプチドのスクリーニング法ではポリペプチドアレイやバイオチップに用いるのに適した基質ポリペプチドを取得することが困難であった。 In addition, development of a substrate polypeptide for use in a polypeptide array or biochip in which a substrate polypeptide is immobilized on a substrate for detecting protein kinase activity is also desired. The amino acid sequence of a substrate polypeptide that is suitable for phosphorylation by a protein kinase while immobilized on a substrate may differ from the amino acid sequence of a substrate polypeptide that is suitable for phosphorylation in solution. For this reason, it has been difficult to obtain a substrate polypeptide suitable for use in a polypeptide array or a biochip by the conventional screening method for a substrate polypeptide based on a phosphorylation reaction in a solution.
すなわち本発明は、優れた能力を有する、好ましくはポリペプチドアレイの作成に適した、タンパク質キナーゼの基質ポリペプチドを提供することを目的とする。 That is, an object of the present invention is to provide a protein kinase substrate polypeptide having excellent ability, preferably suitable for producing a polypeptide array.
本発明者らは、独自に開発した蛍光ペプチドガラスアレイを用いて、タンパク質キナーゼによるリン酸化部位配列を持ちに設計した1300種の基質ポリペプチドから、15種のタンパク質キナーゼそれぞれに対する基質ポリペプチドをスクリーニングし、表１に示す基質ポリペプチドを見出した。 The present inventors screened a substrate polypeptide for each of 15 protein kinases from 1300 substrate polypeptides designed with phosphorylation site sequences by protein kinases using a fluorescent peptide glass array developed uniquely. The substrate polypeptides shown in Table 1 were found.
なお、表１における「lnk」は、基質を基板上に固定化する際に、基板からの距離を確保しつつ、同時に基質の運動性も確保することを目的として導入された柔軟なリンカーを指す。リンカーは具体的には８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸により構成される。 In addition, “lnk” in Table 1 indicates a flexible linker introduced for the purpose of securing the mobility of the substrate while securing the distance from the substrate when the substrate is immobilized on the substrate. . The linker is specifically composed of 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid.
本発明は、(a)各タンパク質キナーゼに対する表１に示すいずれか１つのアミノ酸配列を含む基質ポリペプチド、または(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、(a)に示すポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼによりリン酸化され得るポリペプチドに関する。 The present invention relates to (a) a substrate polypeptide comprising any one amino acid sequence shown in Table 1 for each protein kinase, or (b) one or more amino acids deleted or added in the amino acid sequence shown in (a) above. Relates to a polypeptide comprising an inserted or substituted amino acid sequence, which can be phosphorylated by a protein kinase using the polypeptide shown in (a) as a substrate.
本発明のポリペプチドは標識物質により標識化されていてもよい。 The polypeptide of the present invention may be labeled with a labeling substance.
本発明はまた、表１に示す各タンパク質キナーゼの活性の測定方法であって、
(a) 活性測定対象タンパク質キナーゼに対する本発明の基質ポリペプチドと、該タンパク質キナーゼの活性を有する可能性のある試料とを、該タンパク質キナーゼが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法に関する。
The present invention is also a method for measuring the activity of each protein kinase shown in Table 1,
(a) reacting the substrate polypeptide of the present invention for the protein kinase whose activity is to be measured with a sample that may have the activity of the protein kinase under conditions that allow the protein kinase to phosphorylate the substrate polypeptide; ,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
本発明はまた、表１に示す各タンパク質のキナーゼ活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 診断対象疾患に関連するタンパク質キナーゼに対する本発明の基質ポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含む該タンパク質キナーゼの活性を有する可能性のある試料とを、該タンパク質キナーゼが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法に関する。
The present invention also provides a method for diagnosing a disease associated with the kinase activity of each protein shown in Table 1,
(a) a substrate polypeptide of the present invention for a protein kinase associated with a disease to be diagnosed and a sample that may have the activity of the protein kinase comprising a component isolated from a mammal, Reacting the polypeptide under conditions allowing phosphorylation;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
本発明はまた、本発明の基質ポリペプチドを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性の測定用試薬に関する。 The present invention also relates to a reagent for measuring the activity of a protein kinase using the polypeptide as a substrate, comprising the substrate polypeptide of the present invention.
本発明はまた、本発明の基質ポリペプチドを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性に関連する疾患の診断薬に関する。 The present invention also relates to a diagnostic agent for a disease associated with the activity of a protein kinase using the polypeptide as a substrate, including the substrate polypeptide of the present invention.
本発明はまた、基板と、該基板上に固定化された本発明の基質ポリペプチドとを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also relates to a polypeptide array for detecting the activity of a protein kinase using the polypeptide as a substrate, comprising a substrate and the substrate polypeptide of the present invention immobilized on the substrate.
本発明の基質ポリペプチドの使用により、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性測定を行うことができる。 By using the substrate polypeptide of the present invention, the activity of a protein kinase using the polypeptide as a substrate can be measured.
本発明の基質ポリペプチドは、ポリペプチドアレイ上でのリン酸化反応に基づいてスクリーニングされたものであることから、タンパク質キナーゼの活性検出用ポリペプチドアレイでの使用にも適したものであると考えられる。 Since the substrate polypeptide of the present invention has been screened on the basis of phosphorylation on the polypeptide array, it is considered suitable for use in a polypeptide array for detecting protein kinase activity. It is done.
以下、本発明をより詳細に説明する。
(1) ポリペプチド
本発明は、CaMK II（カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼ２型）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたCaMK II活性の測定方法と測定用試薬、CaMK II活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにCaMK II活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
(1) Polypeptide The present invention relates to a substrate polypeptide that is phosphorylated by CaMK II (calcium calmodulin-dependent kinase type 2), a method and reagent for measuring CaMK II activity using the same, and CaMK II activity. The present invention relates to a disease diagnosis method and diagnostic agent, and a polypeptide array for detecting CaMK II activity.
CaMK IIによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号1〜9のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号1〜9のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。CaMK IIによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、CaMK IIによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by CaMK II include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by CaMK II also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and is phosphorylated by CaMK II. The resulting polypeptide can also be used favorably. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、ERK2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたERK2活性の測定方法と測定用試薬、ERK2活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにERK2活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by ERK2, a method and reagent for measuring ERK2 activity using the same, a diagnostic method and diagnostic agent for a disease associated with ERK2 activity, and a polypeptide array for detecting ERK2 activity About.
ERK2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号10〜36のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号10〜36のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。ERK2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、ERK2によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that undergoes phosphorylation by ERK2 include polypeptides having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 36, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 36 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by ERK2 also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by ERK2. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、JNK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたJNK1活性の測定方法と測定用試薬、JNK1活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにJNK1活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by JNK1, a method and reagent for measuring JNK1 activity using the same, a diagnostic method and diagnostic agent for a disease related to JNK1 activity, and a polypeptide array for detecting JNK1 activity About.
JNK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号37〜56のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号37〜56のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。JNK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JNK1によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by JNK1 include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 37 to 56, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 37 to 56 is more preferable. The substrate polypeptide that is phosphorylated by JNK1 also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by JNK1. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、p38αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたp38α活性の測定方法と測定用試薬、p38α活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにp38α活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by p38α, a method and reagent for measuring p38α activity using the same, a diagnostic method and diagnostic agent for a disease associated with p38α activity, and a polypeptide array for detecting p38α activity About.
p38αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号57〜70のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号57〜70のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。p38αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、p38αによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by p38α include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 57 to 70, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 57 to 70 is more preferable. The substrate polypeptide that is phosphorylated by p38α also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by p38α. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、MAPKAP-K2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたMAPKAP-K2活性の測定方法と測定用試薬、MAPKAP-K2活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにMAPKAP-K2活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by MAPKAP-K2, a method and reagent for measuring MAPKAP-K2 activity using the same, a diagnostic method and a diagnostic agent for a disease associated with MAPKAP-K2 activity, and MAPKAP -Relates to a polypeptide array for detecting K2 activity.
MAPKAP-K2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号71〜84のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号71〜84のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。MAPKAP-K2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、MAPKAP-K2によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that undergoes phosphorylation by MAPKAP-K2 include polypeptides having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 71 to 84, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 71 to 84 is more preferable. A substrate polypeptide that is phosphorylated by MAPKAP-K2 also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and phosphorylated by MAPKAP-K2. Polypeptides that can be oxidized can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、PKA（サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKA活性の測定方法と測定用試薬、PKA活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKA活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by PKA (cyclic AMP-dependent protein kinase), a method and a reagent for measuring PKA activity using the same, a diagnostic method and a diagnostic agent for diseases related to PKA activity And a polypeptide array for detecting PKA activity.
PKAによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号85〜122のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号85〜122のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKAによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKAによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by PKA include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 85 to 122, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 85 to 122 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by PKA also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above-described polypeptide and can be phosphorylated by PKA. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、PKC-α（プロテインキナーゼＣのαサブタイプ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKC-α活性の測定方法と測定用試薬、PKC-α活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKC-α活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-α (α-type of protein kinase C), a method and reagent for measuring PKC-α activity using the same, and a disease associated with PKC-α activity And a polypeptide array for detecting PKC-α activity.
PKC-αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号123〜137のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号123〜137のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKC-αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-αによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-α include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 123 to 137, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 123 to 137 is more preferable. The substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-α also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above-mentioned polypeptide. Polypeptides that can be oxidized can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、PKC-ζ（プロテインキナーゼＣのゼータサブタイプ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKC-ζ活性の測定方法と測定用試薬、PKC-ζ活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKC-ζ活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-ζ (zeta subtype of protein kinase C), a method and reagent for measuring PKC-ζ activity using the same, and a disease associated with PKC-ζ activity And a polypeptide array for detecting PKC-ζ activity.
PKC-ζによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号138〜160のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号138〜160のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKC-ζによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-ζによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-ζ include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 138 to 160, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 138 to 160 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-ζ also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide. Polypeptides that can be oxidized can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、PKC-δ（プロテインキナーゼＣのデルタサブタイプ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKC-δ活性の測定方法と測定用試薬、PKC-δ活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKC-δ活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-δ (delta subtype of protein kinase C), a method and reagent for measuring PKC-δ activity using the same, and a disease associated with PKC-δ activity And a polypeptide array for detecting PKC-δ activity.
PKC-δによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号161〜172のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号161〜172のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKC-δによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-δによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-δ include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 161 to 172, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 161 to 172 is more preferred. A substrate polypeptide that is phosphorylated by PKC-δ also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above-described polypeptide. Polypeptides that can be oxidized can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、Aktによりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたAkt活性の測定方法と測定用試薬、Akt活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにAkt活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by Akt, a method and reagent for measuring Akt activity using the same, a diagnostic method and diagnostic agent for a disease associated with Akt activity, and a polypeptide array for detecting Akt activity About.
Aktによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号173〜177のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号173〜177のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。Aktによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Aktによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by Akt include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 173 to 177, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 173 to 177 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by Akt also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by Akt. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、Srcによりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたSrc活性の測定方法と測定用試薬、Src活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにSrc活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by Src, a method and reagent for measuring Src activity using the same, a diagnostic method and diagnostic agent for a disease associated with Src activity, and a polypeptide array for detecting Src activity About.
Srcによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号178〜191のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号178〜191のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。Srcによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Srcによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by Src include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 178 to 191 and preferably having 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 178 to 191 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by Src also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by Src. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、Abl（アベルソンチロシンキナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたAbl活性の測定方法と測定用試薬、Abl活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにAbl活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by Abl (Abelson tyrosine kinase), a method and a reagent for measuring Abl activity using the same, a diagnostic method and a diagnostic agent for a disease associated with Abl activity, and Abl The present invention relates to a polypeptide array for detecting activity.
Ablによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号192〜206のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号192〜206のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。Ablによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Ablによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by Abl include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 192 to 206, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 192 to 206 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by Abl also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above-mentioned polypeptide and can be phosphorylated by Abl. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、EGFR（上皮細胞成長因子受容体型キナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたEGFR活性の測定方法と測定用試薬、EGFR活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにEGFR活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by EGFR (epidermal growth factor receptor type kinase), a method and reagent for measuring EGFR activity using the same, a diagnostic method and a diagnostic agent for diseases associated with EGFR activity And a polypeptide array for detecting EGFR activity.
EGFRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号207〜221のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号207〜221のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。EGFRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、EGFRによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by EGFR include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 207 to 221 and preferably having 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 207 to 221 is more preferable. A substrate polypeptide that is phosphorylated by EGFR also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by EGFR. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、INSR（インスリン受容体型キナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたINSR活性の測定方法と測定用試薬、INSR活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにINSR活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by INSR (insulin receptor kinase), a method and a reagent for measuring INSR activity using the same, a diagnostic method and a diagnostic agent for a disease associated with INSR activity, and INSR The present invention relates to a polypeptide array for detecting activity.
INSRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号222〜231のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号222〜231のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。INSRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、INSRによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by INSR include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 222 to 231 and preferably having 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 222 to 231 is more preferred. A substrate polypeptide that is phosphorylated by INSR also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the above polypeptide, and can be phosphorylated by INSR. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
本発明はまた、JAK1（ヤヌスキナーゼ１型）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたJAK1活性の測定方法と測定用試薬、JAK1活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにJAK1活性検出用ポリペプチドアレイに関する。 The present invention also provides a substrate polypeptide that is phosphorylated by JAK1 (Janus kinase type 1), a method and reagent for measuring JAK1 activity using the same, a diagnostic method and diagnostic agent for a disease associated with JAK1 activity, and JAK1. The present invention relates to a polypeptide array for detecting activity.
JAK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号232〜246のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号232〜246のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。JAK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JAK1によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。 Examples of the substrate polypeptide that is phosphorylated by JAK1 include a polypeptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 232 to 246, preferably 20 amino acid residues or less. A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 232 to 246 is more preferred. The substrate polypeptide that is phosphorylated by JAK1 also includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence of the polypeptide, and can be phosphorylated by JAK1. Peptides can also be suitably used. Here, “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
(2) ポリペプチドの合成
本発明のポリペプチドは公知のペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置を用いた方法により製造することができる。
(2) Synthesis of polypeptide The polypeptide of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method, for example, a method using a fully automatic peptide synthesizer.
(3) タンパク質キナーゼの活性測定方法
本発明のポリペプチドは、それをリン酸化することができるタンパク質キナーゼの活性を測定するために用いることができる。
(3) Method for Measuring Activity of Protein Kinase The polypeptide of the present invention can be used for measuring the activity of a protein kinase capable of phosphorylating it.
上記のCaMK II基質ポリペプチドと、CaMK II活性を有する可能性のある試料とを、CaMK IIが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりCaMK II活性を測定することができる。このときCaMK IIの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号1〜9によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む9種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 Reacting the above CaMK II substrate polypeptide with a sample that may have CaMK II activity under conditions that allow CaMK II to phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can measure CaMK II activity. At this time, when a plurality of CaMK II substrate polypeptides are used in combination, the activity can be measured with higher accuracy. For example, it is preferable to measure the activity using 5 or more, preferably all, of 9 types of polypeptides each including the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 9.
上記のERK2基質ポリペプチドと、ERK2活性を有する可能性のある試料とを、ERK2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりERK2活性を測定することができる。このときERK2の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号10〜36によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む27種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは20種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 ERK2 activity by reacting the above ERK2 substrate polypeptide with a sample that may have ERK2 activity under conditions that allow ERK2 to phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can be measured. At this time, when a plurality of substrate polypeptides of ERK2 are used in combination, the activity can be measured with higher accuracy. For example, activity measurement is performed using 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 20 or more, and most preferably all of 27 kinds of polypeptides each including the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 10 to 36. Preferably it is done.
上記のJNK1基質ポリペプチドと、JNK1活性を有する可能性のある試料とを、JNK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりJNK1活性を測定することができる。このときJNK1の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号37〜56によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む20種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 The above-mentioned JNK1 substrate polypeptide is reacted with a sample that may have JNK1 activity under conditions where JNK1 can phosphorylate the substrate polypeptide, and then the phosphorylated polypeptide is quantified to determine the JNK1 activity. Can be measured. At this time, when a plurality of kinds of substrate polypeptides of JNK1 are used in combination, more accurate activity measurement becomes possible. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 20 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 37 to 56, respectively.
上記のp38α基質ポリペプチドと、p38α活性を有する可能性のある試料とを、p38αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりp38α活性を測定することができる。このときp38αの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号57〜70によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む14種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 By reacting the above p38α substrate polypeptide with a sample that may have p38α activity under conditions that allow p38α to phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide, p38α activity Can be measured. At this time, when a plurality of p38α substrate polypeptides are used in combination, more accurate activity measurement is possible. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 14 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 57 to 70, respectively.
上記のMAPKAP-K2基質ポリペプチドと、MAPKAP-K2活性を有する可能性のある試料とを、MAPKAP-K2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりMAPKAP-K2活性を測定することができる。このときMAPKAP-K2の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号71〜84によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む14種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 The above MAPKAP-K2 substrate polypeptide is reacted with a sample that may have MAPKAP-K2 activity under conditions that allow MAPKAP-K2 to phosphorylate the substrate polypeptide, and then the phosphorylated polypeptide is reacted. MAPKAP-K2 activity can be measured by quantification. At this time, when a plurality of MAPKAP-K2 substrate polypeptides are used in combination, the activity can be measured with higher accuracy. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 14 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 71 to 84, respectively.
上記のPKA基質ポリペプチドと、PKA活性を有する可能性のある試料とを、PKAが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKA活性を測定することができる。このときPKAの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号85〜122によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む38種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは20種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 PKA activity by reacting the above PKA substrate polypeptide with a sample having PKA activity under conditions that allow PKA to phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can be measured. At this time, when a plurality of PKA substrate polypeptides are used in combination, the activity can be measured with higher accuracy. For example, activity measurement is performed using 5 types or more, preferably 10 types or more, more preferably 20 types or more, and most preferably all types among 38 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 85 to 122, respectively. Preferably it is done.
上記のPKC-α基質ポリペプチドと、PKC-α活性を有する可能性のある試料とを、PKC-αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKC-α活性を測定することができる。このときPKC-αの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号123〜137によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 The above PKC-α substrate polypeptide is reacted with a sample that may have PKC-α activity under conditions where PKC-α can phosphorylate the substrate polypeptide, and then the phosphorylated polypeptide PKC-α activity can be measured by quantification. At this time, when a plurality of PKC-α substrate polypeptides are used in combination, more accurate activity measurement is possible. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 15 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 123 to 137, respectively.
上記のPKC-ζ基質ポリペプチドと、PKC-ζ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-ζが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKC-ζ活性を測定することができる。このときPKC-ζの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号138〜160によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む23種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは20種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 The above PKC-ζ substrate polypeptide is reacted with a sample that may have PKC-ζ activity under conditions that allow PKC-ζ to phosphorylate the substrate polypeptide, and then the phosphorylated polypeptide is PKC-ζ activity can be measured by quantification. At this time, when a plurality of PKC-ζ substrate polypeptides are used in combination, more accurate activity measurement is possible. For example, activity measurement is performed using 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 20 or more, and most preferably all of 23 types of polypeptides each including the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 138 to 160. Preferably it is done.
上記のPKC-δ基質ポリペプチドと、PKC-δ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-δが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKC-δ活性を測定することができる。このときPKC-δの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号161〜172によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む12種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 The above PKC-δ substrate polypeptide is reacted with a sample that may have PKC-δ activity under conditions that allow PKC-δ to phosphorylate the substrate polypeptide, and then the phosphorylated polypeptide PKC-δ activity can be measured by quantification. At this time, when a plurality of PKC-δ substrate polypeptides are used in combination, more accurate activity measurement is possible. For example, it is preferable to measure the activity using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 12 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 161 to 172, respectively.
上記のAkt基質ポリペプチドと、Akt活性を有する可能性のある試料とを、Aktが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりAkt活性を測定することができる。このときAktの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号173〜177によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む5種類のポリペプチドのうち3種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 Akt activity is obtained by reacting the above Akt substrate polypeptide with a sample that may have Akt activity under conditions that allow Akt to phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide. Can be measured. At this time, the use of a plurality of Akt substrate polypeptides in combination enables more accurate activity measurement. For example, it is preferable to perform activity measurement using 3 or more, preferably all, of 5 types of polypeptides each including the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 173 to 177.
上記のSrc基質ポリペプチドと、Src活性を有する可能性のある試料とを、Srcが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりSrc活性を測定することができる。このときSrcの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号178〜191によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む14種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 Src activity by reacting the above Src substrate polypeptide with a sample that may have Src activity under conditions that allow Src to phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can be measured. At this time, when a plurality of Src substrate polypeptides are used in combination, the activity can be measured with higher accuracy. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 14 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 178 to 191, respectively.
上記のAbl基質ポリペプチドと、Abl活性を有する可能性のある試料とを、Ablが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりAbl活性を測定することができる。このときAblの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号192〜206によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 Abl activity by reacting the above Abl substrate polypeptide with a sample that may have Abl activity under conditions where Abl can phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can be measured. At this time, the use of a plurality of Abl substrate polypeptides in combination enables more accurate activity measurement. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 15 types of polypeptides comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 192 to 206, respectively.
上記のEGFR基質ポリペプチドと、EGFR活性を有する可能性のある試料とを、EGFRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりEGFR活性を測定することができる。このときEGFRの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号207〜221によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 EGFR activity by reacting the above EGFR substrate polypeptide with a sample that may have EGFR activity under conditions where EGFR can phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can be measured. At this time, when a plurality of EGFR substrate polypeptides are used in combination, more accurate activity measurement is possible. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and most preferably all of 15 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 207 to 221, respectively.
上記のINSR基質ポリペプチドと、INSR活性を有する可能性のある試料とを、INSRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりINSR活性を測定することができる。このときINSRの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号222〜231によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む10種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 INSR activity by reacting the above INSR substrate polypeptide with a sample that may have INSR activity under conditions in which INSR can phosphorylate the substrate polypeptide, and then quantifying the phosphorylated polypeptide Can be measured. At this time, the activity can be measured with higher accuracy by using a combination of a plurality of INSR substrate polypeptides. For example, activity measurement is preferably performed using 5 or more, preferably all, of 10 types of polypeptides each including the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 222 to 231.
上記のJAK1基質ポリペプチドと、JAK1活性を有する可能性のある試料とを、JAK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりJAK1活性を測定することができる。このときJAK1の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号232〜246によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。 The above-mentioned JAK1 substrate polypeptide is reacted with a sample possibly having JAK1 activity under conditions that allow JAK1 to phosphorylate the substrate polypeptide, and then the phosphorylated polypeptide is quantified to determine the JAK1 activity. Can be measured. At this time, when a plurality of types of substrate polypeptides of JAK1 are used in combination, the activity can be measured with higher accuracy. For example, it is preferable to perform activity measurement using 5 or more, preferably 10 or more, and preferably all of 15 types of polypeptides including the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 232 to 246, respectively.
リン酸化されたポリペプチドの定量は常法により行うことができる。例えば、リン酸化されたポリペプチドに結合する抗体を用いて免疫学的方法により定量することが可能である。 The phosphorylated polypeptide can be quantified by a conventional method. For example, it is possible to quantify by an immunological method using an antibody that binds to a phosphorylated polypeptide.
本発明のポリペプチドは、リン酸化されたポリペプチドの定量をより容易にする目的で標識物質により標識化されていてもよい。標識物質としては、通常の免疫学的測定方法に使用し得るものであれば特に限定されることなく使用できる。例えば、酵素、ビオチン、蛍光物質、放射性物質等を単独または組合せて使用することができる。酵素としてはペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マイクロペルオキダーゼが挙げられる。蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリプロテイン、フィコエリスリン等が挙げられる。発光物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等が挙げられる。放射性物質としては125I、131I、14C、3H 等が挙げられる。また、標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに酵素標識アビジンを用いることにより標識ビオチンの量を高い感度で測定できるので、好ましい。酵素標識アビジンの酵素としては、抗体に標識した場合の酵素と同様の酵素を用いることができる。 The polypeptide of the present invention may be labeled with a labeling substance for the purpose of facilitating the quantification of the phosphorylated polypeptide. Any labeling substance can be used without particular limitation as long as it can be used in a usual immunological measurement method. For example, an enzyme, biotin, a fluorescent substance, a radioactive substance, etc. can be used alone or in combination. Examples of the enzyme include peroxidase, β-D-galactosidase, alkaline phosphatase, and microperoxidase. Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, and phycoerythrin. Examples of the luminescent substance include isolucinol and lucigenin. Examples of radioactive substances include 125 I, 131 I, 14 C, and 3 H. Further, when biotin is used as the labeling substance, it is preferable to use enzyme-labeled avidin since the amount of labeled biotin can be measured with high sensitivity. As the enzyme of the enzyme-labeled avidin, the same enzyme as that used when the antibody is labeled can be used.
また、リン酸化部位に結合する試薬を利用して間接的にリン酸化を検出する計測法も可能であり、この計測法がより好ましい。リン酸化された部位に結合する試薬としては、抗リン酸化セリン・スレオニン抗体、抗リン酸化チロシン抗体、フォスタグがある。フォスタグは、亜鉛の２核錯体であり、リン酸基そのものに結合する。これらの試薬を用いる場合は、抗体を用いる場合は、抗体そのもの、あるいは２次抗体を上述と同様の検出基で標識したものを利用する。フォスタグでは、分子内にビオチン基を有しており、アビジンおよびその類縁体、あるいは抗ビオチン抗体を上述したものと同様の検出基を標識して、ビオチン部位に結合させることによって検出に供する。 In addition, a measurement method in which phosphorylation is indirectly detected using a reagent that binds to a phosphorylation site is possible, and this measurement method is more preferable. Examples of the reagent that binds to the phosphorylated site include an anti-phospho serine / threonine antibody, an anti-phospho tyrosine antibody, and a phos tag. The phos tag is a dinuclear complex of zinc and binds to the phosphate group itself. When using these reagents, when using an antibody, the antibody itself or a secondary antibody labeled with a detection group similar to the above is used. The phos tag has a biotin group in the molecule, and avidin and its analogs, or anti-biotin antibody is labeled with a detection group similar to that described above, and is used for detection by binding to the biotin site.
また、本発明の基質ポリペプチド群は他のあらゆるキナーゼ活性評価法にも利用可能である。例えば、放射性の３２Ｐを有するＡＴＰを利用したオートラジオグラフィーなどの放射化分析や、表面が負に帯電した金コロイドの凝集状態変化を利用したアッセイなどに利用できる。金コロイドを用いるアッセイでは、金コロイド表面の負荷電と、正荷電を有する基質ペプチドの静電相互作用による凝集が、ペプチドのリン酸化にともなうペプチド側の正荷電の減少による凝集能の低下により抑制されることに伴う色調の変化を利用する。 The substrate polypeptide group of the present invention can also be used in any other method for evaluating kinase activity. For example, it can be used for activation analysis such as autoradiography using ATP having radioactive 32 P, and for an assay using a change in the aggregation state of gold colloid whose surface is negatively charged. In the assay using colloidal gold, negative charge on the colloidal gold surface and aggregation due to electrostatic interaction of the positively charged substrate peptide are suppressed by a decrease in aggregation ability due to decrease in positive charge on the peptide side accompanying peptide phosphorylation. Use the color change that accompanies it.
本発明のポリペプチドは測定用途で許容される担体または賦形剤等の任意の成分と組み合わせて、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性の測定用試薬として提供されてもよい。また、当該測定用試薬は、検出用抗体などと組み合わせて測定用キットとして提供されてもよい。 The polypeptide of the present invention may be provided as a reagent for measuring the activity of a protein kinase using the polypeptide as a substrate in combination with any component such as a carrier or an excipient that is acceptable for measurement. In addition, the measurement reagent may be provided as a measurement kit in combination with a detection antibody or the like.
タンパク質キナーゼの活性を測定するには、基板と、該基板上に固定化された本発明のポリペプチドとを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼ活性検出用ポリペプチドアレイを使用することができる。この場合には、ガラス、ポリジメチルシロキサン、金などの基板上に、化学修飾を介してペプチドを固定化する。基板の形状は、平板なもの、ピラーを並べたもの、ウェルを並べたものなど、これまでに報告されたいずれの基板にも適用可能である。これらの基板上にガラスではシランカップリング剤や、表面を多糖などでコートすることにより、ポリジメチルシロキサンでは、表面を多糖などでコートしたり、表面をプラズマなどで修飾することで、また、金ではチオール誘導体で修飾することにより、アミノ基、カルボキシル基などの官能基を導入する。これに架橋剤などを用いたり、末端カルボシキシル基を活性エステル化したり、ホルミル基やマレイミド基を導入後、ペプチド末端をシステイン残基として反応させることにより基質ペプチドを固定化することができる。このようにして多種類の基質を固定化したアレイを、酵素溶液や細胞破砕液で処理して、表面に固定化した基質をリン酸化して、抗リン酸化セリン・スレオニン抗体や抗リン酸化チロシン抗体、フォスタグなどをはじめとするリン酸基と結合する試薬を結合させてから、前述したものと同様の検出手段により、多くの基質のリン酸化の程度を同時に評価することが可能である。 In order to measure the activity of the protein kinase, it is necessary to use a polypeptide array for detecting protein kinase activity comprising the substrate and the polypeptide of the present invention immobilized on the substrate, and using the polypeptide as a substrate. it can. In this case, the peptide is immobilized on a substrate such as glass, polydimethylsiloxane, or gold through chemical modification. The shape of the substrate can be applied to any of the substrates reported so far, such as a flat plate, a pillar array, and a well array. On these substrates, glass is coated with a silane coupling agent, or the surface is coated with a polysaccharide, and polydimethylsiloxane is coated with a surface such as a polysaccharide, or the surface is modified with plasma or the like. Then, functional groups such as amino groups and carboxyl groups are introduced by modification with thiol derivatives. The substrate peptide can be immobilized by using a cross-linking agent or the like for this, converting the terminal carboxy group into an active ester, or introducing a formyl group or a maleimide group and then reacting the peptide terminal as a cysteine residue. An array of various substrates immobilized in this way is treated with an enzyme solution or cell disruption solution to phosphorylate the substrate immobilized on the surface, thereby antiphosphorylated serine / threonine antibody or antiphosphorylated tyrosine. It is possible to simultaneously evaluate the degree of phosphorylation of many substrates by the same detection means as described above after binding a reagent that binds to a phosphate group such as an antibody or phostag.
(4) タンパク質キナーゼ活性に関連する疾患の診断方法
本発明のポリペプチドを用いて、哺乳動物（例えばヒト、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ）から単離された成分（例えば血液、尿、哺乳動物の任意の組織(脳、肝臓、心臓、筋肉、皮膚など)の溶解産物（lysate）、哺乳動物の正常または癌培養細胞の溶解産物、および哺乳動物に発生した癌組織の溶解産物）を含む試料中のタンパク質キナーゼ活性を測定することにより、タンパク質キナーゼ活性に関連する疾患を診断することができる。本発明の診断方法は、投薬前診断、術中診断、臨床診断等の種々の診断に適用可能である。本発明のポリペプチドを用いたタンパク質キナーゼ活性測定方法については、上記(3)で詳述したのと同様である。
(4) Method for diagnosing disease associated with protein kinase activity A component (eg, human, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, horse) isolated from a mammal (eg, human, rat, hamster, rabbit, cat, horse) Of blood, urine, lysate of any mammalian tissue (brain, liver, heart, muscle, skin, etc.), lysates of normal or cancer cultured cells of mammals, and cancer tissue that has developed in mammals By measuring the protein kinase activity in a sample containing a lysate, a disease associated with the protein kinase activity can be diagnosed. The diagnostic method of the present invention can be applied to various diagnoses such as pre-medication diagnosis, intraoperative diagnosis, and clinical diagnosis. The method for measuring protein kinase activity using the polypeptide of the present invention is the same as described in detail in (3) above.
本発明において「CaMK II活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のCaMK II活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては心筋梗塞などの循環器疾患、脳神経疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, “disease related to CaMK II activity” refers to a disease in which CaMK II activity in the sample is different between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, cardiovascular diseases such as myocardial infarction, and cranial nerve diseases.
本発明において「ERK2活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のERK2活性が相違するような疾患を指す。このような疾患として種々のガン、免疫疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to ERK2 activity” refers to a disease in which the ERK2 activity in the sample is different between affected patients and healthy subjects. Such diseases include, but are not limited to, various cancers, immune diseases and the like.
本発明において「JNK1活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のJNK1活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン、アポトーシスの関わる疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to JNK1 activity” refers to a disease in which the JNK1 activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers, diseases related to apoptosis, and the like.
本発明において「p38α活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のp38α活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては間質性肺炎などの免疫性疾患、種々のガンや循環器疾患での血管新生等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to p38α activity” refers to a disease in which p38α activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Such diseases include, but are not limited to, immune diseases such as interstitial pneumonia, angiogenesis in various cancers and cardiovascular diseases, and the like.
本発明において「MAPKAP-K2活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のMAPKAP-K2活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガンや循環器疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to MAPKAP-K2 activity” refers to a disease in which the MAPKAP-K2 activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers and cardiovascular diseases.
本発明において「PKA活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKA活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to PKA activity” refers to a disease in which the PKA activity in the sample differs between affected patients and healthy individuals. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers.
本発明において「PKC-α活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKC-α活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to PKC-α activity” refers to a disease in which the PKC-α activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers.
本発明において「PKC-ζ活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKC-ζ活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, “disease related to PKC-ζ activity” refers to a disease in which the PKC-ζ activity in the sample is different between the affected patient and a healthy subject. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers.
本発明において「PKC-δ活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKC-δ活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to PKC-δ activity” refers to a disease in which the PKC-δ activity in the sample is different between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers.
本発明において「Akt活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のAkt活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to Akt activity” refers to a disease in which the Akt activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers.
本発明において「Src活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のSrc活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガンや循環器疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to Src activity” refers to a disease in which the Src activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers and cardiovascular diseases.
本発明において「Abl活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のAbl活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては白血病など種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, “disease related to Abl activity” refers to a disease in which the Abl activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers such as leukemia.
本発明において「EGFR活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のEGFR活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to EGFR activity” refers to a disease in which the EGFR activity in the sample is different between the affected patient and a healthy subject. Examples of such diseases include, but are not limited to, various cancers.
本発明において「INSR活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のINSR活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては糖尿病や慢性頭痛等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to INSR activity” refers to a disease in which the INSR activity in the sample is different between affected patients and healthy subjects. Such diseases include, but are not limited to, diabetes and chronic headaches.
本発明において「JAK1活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のJAK1活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては白血病や免疫疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。 In the present invention, the “disease related to JAK1 activity” refers to a disease in which the JAK1 activity in the sample differs between affected patients and healthy subjects. Examples of such diseases include, but are not limited to, leukemia and immune diseases.
本発明のポリペプチドは診断用途で許容される担体または賦形剤等の任意の成分と組み合わせてタンパク質キナーゼ活性に関連する疾患の診断薬として提供されてもよい。また、当該診断薬は、検出用抗体などと組み合わせて診断用キットとして提供されてもよい。本発明の各種タンパク質キナーゼ活性検出用ポリペプチドアレイは、タンパク質キナーゼ活性に関連する疾患の診断の用途に使用することができる。 The polypeptide of the present invention may be provided as a diagnostic agent for a disease associated with protein kinase activity in combination with any component such as a carrier or excipient acceptable for diagnostic use. The diagnostic agent may be provided as a diagnostic kit in combination with a detection antibody or the like. The polypeptide arrays for detecting protein kinase activity of the present invention can be used for diagnosis of diseases associated with protein kinase activity.
(5) 核酸
本発明はまた、上記の基質ポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸としてはDNAまたはRNAが挙げられ、DNAが好ましい。当該核酸をベクターに導入し、生体内において本発明の基質ポリペプチドを発現させることが可能である。また、当該核酸と、マーカー分子（例えば抗原抗体反応を使って検出可能なマーカー分子）をコードする核酸とを融合した核酸配列をベクターに組み込み、生体内において本発明の基質ポリペプチドとマーカー分子との融合ポリペプチドを発現させることにより、生体内のキナーゼ活性をインビボで解析することができるものと期待される。
(5) Nucleic acid The present invention also relates to a nucleic acid encoding the above substrate polypeptide. Examples of the nucleic acid include DNA or RNA, and DNA is preferable. The nucleic acid can be introduced into a vector, and the substrate polypeptide of the present invention can be expressed in vivo. In addition, a nucleic acid sequence fused with the nucleic acid and a nucleic acid encoding a marker molecule (for example, a marker molecule detectable using an antigen-antibody reaction) is incorporated into a vector, and the substrate polypeptide of the present invention and the marker molecule in vivo It is expected that the in vivo kinase activity can be analyzed in vivo by expressing the fusion polypeptide.
ぺプチレドアレイによる基質のスクリーニング
まず、ガラス基板を1% グルタルアルデヒド/50mM 炭酸buffer (pH9.5)溶液に浸漬し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、基板を超純水に浸漬し超音波を当てながら3分間洗浄するという操作を2回行い、未反応グルタルアルデヒドを除去した。次に、基質ポリペプチドの候補ポリペプチドとTCEPが終濃度0.1mM、TritonX-100が終濃度0.0002%となるように50mM 炭酸buffer (pH9.5)中で混合した溶液をGenex Arrayer（カケンジェネクス製；ピン先の直径が150μmのピンを使用）にて基板にスポットして、室温で一晩インキュベートし、ペプチドを固定化した。インキュベート後、基板をTBS-T溶液に浸漬し超音波を当てながら3分間洗浄するという操作を3回行い、未反応ペプチドを除去した。ペプチド固定化後、イオン交換水で5倍希釈したBocking One P溶液に基板を浸漬し、室温で40分インキュベートした。ブロッキング処理後、基板をTBS-T溶液に浸漬し超音波を当てながら3分間洗浄するという操作を3回行った。
Screening Substrate by Peptide Red Array First, a glass substrate was immersed in a 1% glutaraldehyde / 50 mM carbonate buffer (pH 9.5) solution and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After the incubation, the substrate was immersed in ultrapure water and washed twice for 3 minutes while applying ultrasonic waves to remove unreacted glutaraldehyde. Next, a solution obtained by mixing the candidate polypeptide of the substrate polypeptide and TCEP in 50 mM carbonate buffer (pH 9.5) so that the final concentration of TCEP is 0.1 mM and TritonX-100 is 0.0002% is generated by Genex Arrayer (manufactured by Kaken Genex). Spotted on a substrate with a pin tip diameter of 150 μm) and incubated overnight at room temperature to immobilize the peptide. After the incubation, the substrate was immersed in a TBS-T solution and washed for 3 minutes while applying ultrasonic waves, and the unreacted peptide was removed three times. After peptide immobilization, the substrate was immersed in a Bocking One P solution diluted 5-fold with ion-exchanged water and incubated at room temperature for 40 minutes. After the blocking treatment, the operation of immersing the substrate in the TBS-T solution and washing for 3 minutes while applying ultrasonic waves was performed three times.
続いて、各種のキナーゼ反応溶液〔ATP(+)及びATP(-)溶液〕をそれぞれ600μlずつ基板上に添加して、37℃で1時間インキュベートしてリン酸化反応を行った。反応終了後、TBS-S溶液に浸漬し超音波を当てながら5分間洗浄するという操作を3回、続いて超純水に浸漬し超音波を当てながら5分間洗浄するという操作を3回行った。そして、10μg/ml phos-tag/phos-tag buffer溶液を基板上に800μl添加して、室温で30分インキュベートした。インキュベート後、基板を超純水に浸漬し超音波を当てながら2分間洗浄した。続いて、2μg/ml Dylight647-streptavidin/Streptavidin buffer（Blocking One Pを10mM HEPES(pH7.3) で20倍希釈した溶液）を基板上に600μl添加して、室温で10分インキュベートした。インキュベート後、基板をTBS-T溶液に浸漬し超音波を当てながら2分間洗浄するという操作を2回行って、よく乾燥させた後、Scan Array Lite（PerkinElmer製）により蛍光イメージングを行った。 Subsequently, each kinase reaction solution [ATP (+) and ATP (−) solution] was added in an amount of 600 μl on the substrate and incubated at 37 ° C. for 1 hour to carry out a phosphorylation reaction. After completion of the reaction, the operation of immersing in the TBS-S solution and washing for 5 minutes while applying ultrasonic waves was performed three times, and then the operation of immersing in ultrapure water and washing for 5 minutes while applying ultrasonic waves was performed three times. . Then, 800 μl of 10 μg / ml phos-tag / phos-tag buffer solution was added onto the substrate and incubated at room temperature for 30 minutes. After incubation, the substrate was immersed in ultrapure water and washed for 2 minutes while applying ultrasonic waves. Subsequently, 600 μl of 2 μg / ml Dylight647-streptavidin / Streptavidin buffer (a solution obtained by diluting Blocking One P with 10 mM HEPES (pH 7.3) 20-fold) was added to the substrate and incubated at room temperature for 10 minutes. After the incubation, the substrate was immersed in a TBS-T solution and washed with ultrasonic waves for 2 minutes twice. After drying well, fluorescence imaging was performed with Scan Array Lite (PerkinElmer).
そして、phos-tagと蛍光標識ストレプトアビジンを用いて蛍光イメージングを行い、それぞれの基質ペプチドについて、ATP(+)から得られた蛍光強度からATP(-)から得られた蛍光強度を差し引いた値を算出した。それぞれのキナーゼについて2回ずつ実験を行い、この値の平均値が一定の基準以上を示したものをピックアップし、そのキナーゼの良好な基質として選定した。 Then, fluorescence imaging was performed using phos-tag and fluorescently labeled streptavidin, and for each substrate peptide, the value obtained by subtracting the fluorescence intensity obtained from ATP (-) from the fluorescence intensity obtained from ATP (+) Calculated. Experiments were performed twice for each kinase, and those with an average value exceeding a certain standard were picked up and selected as a good substrate for the kinase.
こうして、表１に示す、各タンパク質キナーゼに対する基質ポリペプチド（配列番号1〜246）を決定した。 Thus, the substrate polypeptides (SEQ ID NOs: 1 to 246) for each protein kinase shown in Table 1 were determined.
Claims (120)
(a) 配列番号1〜9のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、CaMK II（カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼ２型）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9;
(b) In the amino acid sequence shown in the above (a), the amino acid sequence includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted, and can be phosphorylated by CaMK II (calcium calmodulin-dependent kinase type 2). peptide.
(a) 請求項1又は2記載のポリペプチドとCaMK II活性を有する可能性のある試料とを、CaMK IIが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring CaMK II activity comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 1 or 2 with a sample that may have CaMK II activity under conditions that allow CaMK II to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項1又は2記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むCaMK II活性を有する可能性のある試料とを、CaMK IIが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with CaMK II activity comprising:
(a) The polypeptide according to claim 1 or 2 and a sample that may have CaMK II activity comprising a component isolated from a mammal under conditions that allow CaMK II to phosphorylate a substrate polypeptide. Reacting, and
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号10〜36のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、ERK2によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 36;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by ERK2.
(a) 請求項9又は10記載のポリペプチドとERK2活性を有する可能性のある試料とを、ERK2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring ERK2 activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 9 or 10 with a sample that may have ERK2 activity under conditions that allow ERK2 to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項9又は10記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むERK2活性を有する可能性のある試料とを、ERK2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with ERK2 activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 9 or 10 with a sample having a component isolated from a mammal and having a possibility of having ERK2 activity under a condition in which ERK2 can phosphorylate a substrate polypeptide. Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号37〜56のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JNK1によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 37 to 56;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by JNK1.
(a) 請求項17又は18記載のポリペプチドとJNK1活性を有する可能性のある試料とを、JNK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring JNK1 activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 17 or 18 with a sample that may have JNK1 activity under conditions that allow JNK1 to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項17又は18記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むJNK1活性を有する可能性のある試料とを、JNK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with JNK1 activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 17 or 18 with a sample having a component isolated from a mammal that may have JNK1 activity under conditions that allow JNK1 to phosphorylate a substrate polypeptide. Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号57〜70のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、p38αによりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 57 to 70;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by p38α.
(a) 請求項25又は26記載のポリペプチドとp38α活性を有する可能性のある試料とを、p38αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring p38α activity comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 25 or 26 with a sample that may have p38α activity under conditions that allow p38α to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項25又は26記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むp38α活性を有する可能性のある試料とを、p38αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with p38α activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 25 or 26 with a sample that may have p38α activity comprising a component isolated from a mammal under conditions that allow p38α to phosphorylate the substrate polypeptide Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号71〜84のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、MAPKAP-K2によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 71 to 84;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a), and can be phosphorylated by MAPKAP-K2.
(a) 請求項33又は34記載のポリペプチドとMAPKAP-K2活性を有する可能性のある試料とを、MAPKAP-K2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring MAPKAP-K2 activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 33 or 34 with a sample that may have MAPKAP-K2 activity under conditions that allow MAPKAP-K2 to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項33又は34記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むMAPKAP-K2活性を有する可能性のある試料とを、MAPKAP-K2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with MAPKAP-K2 activity, comprising:
(a) The MAPKAP-K2 is capable of phosphorylating a substrate polypeptide using the polypeptide according to claim 33 or 34 and a sample having a component isolated from a mammal that may have MAPKAP-K2 activity. A step of reacting under conditions,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号85〜122のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKA（サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 85 to 122;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by PKA (cyclic AMP-dependent protein kinase) .
(a) 請求項41又は42記載のポリペプチドとPKA活性を有する可能性のある試料とを、PKAが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring PKA activity,
(a) reacting the polypeptide of claim 41 or 42 with a sample having PKA activity under conditions that allow PKA to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項41又は42記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKA活性を有する可能性のある試料とを、PKAが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with PKA activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 41 or 42 with a sample having a PKA activity including a component isolated from a mammal under conditions that allow PKA to phosphorylate the substrate polypeptide. Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号123〜137のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-α（プロテインキナーゼＣのαサブタイプ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 123 to 137;
(b) The amino acid sequence shown in (a) above includes an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, inserted or substituted, and can be phosphorylated by PKC-α (α subtype of protein kinase C) Polypeptide.
(a) 請求項49又は50記載のポリペプチドとPKC-α活性を有する可能性のある試料とを、PKC-αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring PKC-α activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 49 or 50 with a sample that may have PKC-α activity under conditions that allow PKC-α to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項49又は50記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKC-α活性を有する可能性のある試料とを、PKC-αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with PKC-α activity,
(a) The polypeptide according to claim 49 or 50 and a sample having a component isolated from a mammal, which may have PKC-α activity, can be phosphorylated by PKC-α. A step of reacting under conditions,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号138〜160のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-ζ（プロテインキナーゼＣのゼータサブタイプ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 138 to 160;
(b) The amino acid sequence shown in (a) above includes an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, inserted or substituted, and can be phosphorylated by PKC-ζ (zeta subtype of protein kinase C) Polypeptide.
(a) 請求項57又は58記載のポリペプチドとPKC-ζ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-ζが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring PKC-ζ activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 57 or 58 with a sample having a possibility of having PKC-ζ activity under a condition in which PKC-ζ can phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項57又は58記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKC-ζ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-ζが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with PKC-ζ activity,
(a) The polypeptide according to claim 57 or 58 and a sample that may have PKC-ζ activity comprising a component isolated from a mammal, wherein PKC-ζ can phosphorylate a substrate polypeptide. A step of reacting under conditions,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号161〜172のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-δ（プロテインキナーゼＣのデルタサブタイプ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 161 to 172;
(b) The amino acid sequence shown in (a) above includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted, and can be phosphorylated by PKC-δ (delta subtype of protein kinase C) Polypeptide.
(a) 請求項65又は66記載のポリペプチドとPKC-δ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-δが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring PKC-δ activity,
(a) reacting the polypeptide of claim 65 or 66 with a sample that may have PKC-δ activity under conditions that allow PKC-δ to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項65又は66記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKC-δ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-δが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with PKC-δ activity, comprising:
(a) The polypeptide according to claim 65 or 66 and a sample having a component isolated from a mammal, which may have PKC-δ activity, can be phosphorylated by PKC-δ. A step of reacting under conditions,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号173〜177のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Aktによりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 173 to 177;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by Akt.
(a) 請求項73又は74記載のポリペプチドとAkt活性を有する可能性のある試料とを、Aktが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring Akt activity,
(a) reacting the polypeptide of claim 73 or 74 with a sample that may have Akt activity under conditions that allow Akt to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項73又は74記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むAkt活性を有する可能性のある試料とを、Aktが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with Akt activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 73 or 74 with a sample that may have Akt activity, including a component isolated from a mammal, under conditions that allow Akt to phosphorylate the substrate polypeptide. Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号178〜191のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Srcによりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 178 to 191;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a), and can be phosphorylated by Src.
(a) 請求項81又は82記載のポリペプチドとSrc活性を有する可能性のある試料とを、Srcが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring Src activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 81 or 82 with a sample that may have Src activity under conditions that allow Src to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項81又は82記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むSrc活性を有する可能性のある試料とを、Srcが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with Src activity,
(a) reacting the polypeptide of claim 81 or 82 with a sample that may have Src activity comprising a component isolated from a mammal under conditions that allow Src to phosphorylate the substrate polypeptide Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号192〜206のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Abl（アベルソンチロシンキナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 192 to 206;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by Abl (Abelson tyrosine kinase).
(a) 請求項89又は90記載のポリペプチドとAbl活性を有する可能性のある試料とを、Ablが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring Abl activity comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 89 or 90 with a sample that may have Abl activity under conditions that allow Abl to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項89又は90記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むAbl活性を有する可能性のある試料とを、Ablが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with Abl activity comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 89 or 90 with a sample that may have Abl activity comprising a component isolated from a mammal under conditions that allow Abl to phosphorylate the substrate polypeptide Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号207〜221のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、EGFR（上皮細胞成長因子受容体型キナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 207 to 221;
(b) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and which can be phosphorylated by EGFR (epidermal growth factor receptor type kinase) .
(a) 請求項97又は98記載のポリペプチドとEGFR活性を有する可能性のある試料とを、EGFRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring EGFR activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 97 or 98 and a sample that may have EGFR activity under conditions that allow EGFR to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項97又は98記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むEGFR活性を有する可能性のある試料とを、EGFRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with EGFR activity,
(a) reacting the polypeptide according to claim 97 or 98 with a sample having a possibility of having EGFR activity including a component isolated from a mammal under conditions that allow EGFR to phosphorylate the substrate polypeptide Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号222〜231のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、INSR（インスリン受容体型キナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 222 to 231;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above and can be phosphorylated by INSR (insulin receptor kinase).
(a) 請求項105又は106記載のポリペプチドとINSR活性を有する可能性のある試料とを、INSRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring INSR activity comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 105 or 106 with a sample that may have INSR activity under conditions that allow INSR to phosphorylate the substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項105又は106記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むINSR活性を有する可能性のある試料とを、INSRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for diagnosing a disease associated with INSR activity comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 105 or 106 with a sample having a component isolated from a mammal that may have INSR activity under conditions that allow INSR to phosphorylate the substrate polypeptide Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 配列番号232〜246のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JAK1（ヤヌスキナーゼ１型）によりリン酸化され得るポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 232 to 246;
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in (a) above, and can be phosphorylated by JAK1 (Janus kinase type 1).
(a) 請求項113又は114記載のポリペプチドとJAK1活性を有する可能性のある試料とを、JAK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。 A method for measuring JAK1 activity, comprising:
(a) reacting the polypeptide of claim 113 or 114 with a sample that may have JAK1 activity under conditions that allow JAK1 to phosphorylate a substrate polypeptide;
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
(a) 請求項113又は114記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むJAK1活性を有する可能性のある試料とを、JAK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
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(a) reacting the polypeptide of claim 113 or 114 with a sample that may have JAK1 activity, including a component isolated from a mammal, under conditions that allow JAK1 to phosphorylate the substrate polypeptide Process,
(b) quantifying the polypeptide phosphorylated in step (a).
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