JP2006061061A - Method for detecting gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を高感度に検出するための遺伝子検出方法に関し、より詳細には、挿入剤により電気化学的に遺伝子を検出する技術に関する。 The present invention relates to a gene detection method for detecting a specific gene sequence present in a sample with high sensitivity, and more particularly to a technique for electrochemically detecting a gene with an intercalating agent.
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸を電極表面に固定し、プローブ核酸と１本鎖に変性された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、２本鎖核酸に特異的に結合しかつ電気化学的に活性な挿入剤をプローブ核酸と遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定によりプローブ核酸と目的遺伝子サンプルとの２本鎖核酸に結合した挿入剤を検出し、これによりプローブ核酸とハイブリダイズした目的遺伝子サンプルの存在を検出している（特許文献１及び特許文献２）。 In a conventional DNA chip for electrochemically detecting a specific gene sequence, a single-stranded probe nucleic acid having a base sequence complementary to a target gene to be detected is immobilized on the electrode surface. After hybridizing with a gene sample denatured to a double strand, an electrochemically active intercalating agent that specifically binds to a double strand nucleic acid is added to the reaction system between the probe nucleic acid and the gene sample, and an electrode The intercalating agent binding to the double-stranded nucleic acid of the probe nucleic acid and the target gene sample is detected by electrochemical measurement via, thereby detecting the presence of the target gene sample hybridized with the probe nucleic acid (patent) Document 1 and Patent document 2).
ここで、挿入剤は、２本鎖の核酸を認識し、特異的に結合する物質を指す。挿入剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、挿入基が２本鎖核酸の塩基対と塩基対の間に介入することによって、２本鎖核酸と結合する。この挿入剤は、２本鎖核酸と一定の速度で塩基対間への挿入、および塩基対間からの離脱が繰り返されている平衡反応による結合である。
さらに、挿入剤として電気的に可逆な酸化還元反応を起こす挿入剤を用いることにより、電気化学的変化の測定によって、２本鎖核酸に結合した挿入剤を検出することができる。電気化学的変化の測定としては、酸化還元時に発生する電流や発光を検出する方法がある。
Here, the intercalating agent refers to a substance that recognizes and specifically binds to a double-stranded nucleic acid. Each intercalating agent has a flat intercalating group such as a phenyl group in the molecule, and the intercalating group intervenes between the base pair of the double-stranded nucleic acid to bind to the double-stranded nucleic acid. This intercalating agent is a bond formed by an equilibrium reaction in which insertion into and removal from a base pair are repeated with a double-stranded nucleic acid at a constant rate.
Further, by using an intercalating agent that causes an electrically reversible redox reaction as the intercalating agent, the intercalating agent bound to the double-stranded nucleic acid can be detected by measuring electrochemical changes. As a method for measuring the electrochemical change, there is a method for detecting a current generated during oxidation-reduction or light emission.
以上のように、前記検出方法においては、前記挿入剤が２本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、また、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤の量を検出することが重要となる。しかし、前記挿入剤は、１本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した挿入剤は、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。 As described above, in the detection method, it is important that the intercalating agent specifically binds only to the double-stranded nucleic acid and that the amount of intercalating agent bound to the double-stranded nucleic acid is detected. . However, the intercalating agent non-specifically adsorbs to a single-stranded nucleic acid probe and the electrode surface to which the nucleic acid probe is immobilized. The nonspecifically adsorbed intercalating agent becomes background noise when detecting the amount of intercalating agent bound to the double-stranded nucleic acid, and causes a decrease in detection sensitivity.
これを解消するため、前記検出方法においては、前記挿入剤の添加後に、前記１本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するための洗浄が必要となっている。
しかしながら、従来の検出方法では、挿入剤と２本鎖核酸間の結合は静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によるものであって、結合力が弱いため、前述したように、前記１本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した挿入剤を除去する洗浄工程の際に、２本鎖核酸に挿入させた挿入剤も解離してしまい、逆に検出感度を低下させてしまう、という課題がある。 However, in the conventional detection method, the binding between the intercalating agent and the double-stranded nucleic acid is due to electrostatic interaction or hydrophobic interaction, and the binding force is weak. During the washing step of removing the nucleic acid probe and the non-specifically adsorbed intercalating agent on the electrode surface on which the nucleic acid probe is immobilized, the intercalating agent inserted into the double-stranded nucleic acid is also dissociated and detected in reverse. There is a problem that sensitivity is lowered.
一方、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮した前記洗浄では、該非特異的に吸着した挿入剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズが増加してしまい、検出感度の低下につながる、という課題がある。 On the other hand, in the washing in which the insertion agent bound to the double-stranded nucleic acid is not dissociated, the removal of the non-specifically adsorbed insertion agent becomes insufficient, resulting in an increase in background noise and detection. There is a problem that the sensitivity is reduced.
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、挿入剤の電気化学測定を行うための電極表面に１本鎖の核酸プローブを固定するのではなく、電極とは別の基板上に１本鎖の核酸プローブを固定化しておき、この１本鎖の核酸プローブと目的遺伝子サンプルをハイブリタイズさせた２本鎖核酸に対して、一旦、挿入剤を強固に結合させ、その後、強固に結合された挿入剤のみを分離させる操作を行い、この分離された挿入剤を電気化学的に検出することで、従来の非特異的に吸着する挿入剤によるバックグランドノイズの影響や、洗浄工程による検出感度の低下の問題を無くし、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを高感度に検出可能な遺伝子検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-described problem, and does not fix a single-stranded nucleic acid probe on the surface of an electrode for electrochemical measurement of an intercalating agent, but a substrate separate from the electrode. A single-stranded nucleic acid probe is immobilized on the double-stranded nucleic acid obtained by hybridizing the single-stranded nucleic acid probe and a target gene sample, and then an insert is firmly bound, By performing an operation to separate only the strongly inserted intercalating agent, and detecting the separated intercalating agent electrochemically, the influence of background noise due to the conventional nonspecifically adsorbing intercalating agent and washing An object of the present invention is to provide a gene detection method capable of detecting the nucleic acid probe hybridized with a target gene sample with high sensitivity, eliminating the problem of decrease in detection sensitivity due to the process.
上記課題に鑑みて、本発明の遺伝子検出方法は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を基板に固定させるステップと、
該プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、
前記ハイブリダイズ反応により形成された２本鎖核酸に対し、前記２本鎖核酸に特異的な光架橋性化合物である２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸挿入部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる挿入剤を添加した後、第１の波長の光照射により前記２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、
前記ステップの後、２本鎖核酸の周囲を電解溶液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離させるステップと、
挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、電解溶液中に分離された前記挿入剤の存在を、前記電極部を介した電気化学的な測定により検出するステップと、
を有することを特徴とする。
In view of the above problems, the gene detection method of the present invention comprises a step of fixing a probe nucleic acid having a base sequence complementary to a gene sequence to be detected to a substrate,
Hybridizing the probe nucleic acid and a sample nucleic acid denatured into a single strand; and
For the double-stranded nucleic acid formed by the hybridization reaction, a double-stranded nucleic acid insertion site that is a photocrosslinkable compound specific to the double-stranded nucleic acid, an electrochemically active site having electrochemical activity, After the addition of an intercalating agent comprising a compound having a double-stranded nucleic acid insertion site and a linking site for linking the electrochemically active site, the double-stranded nucleic acid insertion site and the two double-stranded nucleic acid insertion sites are irradiated by light irradiation at a first wavelength. Covalently binding the strand nucleic acid;
Filling the periphery of the double-stranded nucleic acid with an electrolytic solution after the step, and separating the covalently bonded double-stranded nucleic acid insertion site from the double-stranded nucleic acid by irradiation with light of a second wavelength;
Disposing an electrode part in the electrolytic solution from which the intercalating agent is separated, and detecting the presence of the intercalating agent separated in the electrolytic solution by electrochemical measurement via the electrode part;
It is characterized by having.
以上のように本発明の遺伝子検出方法は、挿入剤の電気化学測定を行うための電極とは別の基板上に１本鎖の核酸プローブを固定化しておき、この１本鎖の核酸プローブと目的遺伝子サンプルをハイブリタイズさせた２本鎖核酸に対して、一旦、挿入剤を強固に結合させ、その後、強固に結合された挿入剤のみを電解溶液中に分離させる操作を行うようにしている。そして、電解溶液中に分離された挿入剤を電極にて電気化学発光させて、電気化学的に測定することで目的遺伝子を検出するようにしている。このため従来問題となっていた、１本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしていた挿入剤によるバックグランド電流やバックグランド発光の影響を無くすることができる。 As described above, in the gene detection method of the present invention, a single-stranded nucleic acid probe is immobilized on a substrate different from an electrode for performing electrochemical measurement of an intercalating agent, and the single-stranded nucleic acid probe and For the double-stranded nucleic acid hybridized with the target gene sample, the insertion agent is once bound firmly, and then only the strongly bound insertion agent is separated into the electrolytic solution. . Then, the intercalating agent separated in the electrolytic solution is electrochemiluminescent with an electrode, and the target gene is detected by electrochemical measurement. For this reason, it is possible to eliminate the influence of background current and light emission by a single-stranded nucleic acid probe and an intercalating agent that has nonspecifically adsorbed on the electrode surface, which has been a problem in the past.
以下に、本発明の遺伝子検出法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the gene detection method of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
まず、検体から遺伝子サンプルを抽出する前処理を行う。検体は、痰、血液、糞便、***、唾液、培養細胞、組織細胞、その他遺伝子を有する試料を超音波、振とうなどの物理手段、核酸抽出溶液を用いる化学的手段を用いて抽出する。 First, a pretreatment for extracting a gene sample from a specimen is performed. The specimen is extracted from sputum, blood, stool, semen, saliva, cultured cells, tissue cells, and other samples having genes using physical means such as ultrasound, shaking, or chemical means using a nucleic acid extraction solution.
試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。 The destruction of the cells in the sample can be performed by a conventional method. For example, physical actions such as shaking and ultrasonic waves can be applied from the outside. In addition, nucleic acid can be released from cells using a nucleic acid extraction solution (for example, a solution containing a surfactant such as SDS, Triton-X, or Tween-20, or a saponin, EDTA, or protease). .
抽出された長鎖の２本鎖核酸は制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断される。切断された２本鎖核酸は熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖核酸に分離される。これらの工程により遺伝子サンプルを得る。遺伝子サンプルは、電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。 The extracted long double-stranded nucleic acid is cleaved to an arbitrary length by a restriction enzyme or physical means such as ultrasonic waves. The cleaved double-stranded nucleic acid is separated into single-stranded nucleic acids by heat treatment or alkali denaturation. A gene sample is obtained by these steps. The gene sample may be a nucleic acid fragment purified by electrophoresis separation or the like.
プローブ核酸は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸であり、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸、あるいは化学合成で得られた１本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、１本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。 A probe nucleic acid is a single-stranded probe nucleic acid having a base sequence complementary to the gene sequence to be detected. The nucleic acid extracted from a biological sample is cleaved with a restriction enzyme and purified by electrophoresis or the like. Alternatively, a single-stranded nucleic acid obtained by chemical synthesis can be used. In the case of nucleic acid extracted from a biological sample, it is preferable to dissociate into single-stranded nucleic acid by heat treatment or alkali treatment.
このようにして得られたプローブ核酸を固定部に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。例えば固定部がグラシーカーボンである場合、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、固定部表面にカルボン酸基を導入する。次いで、該核酸は、末端にアミノ基を有することにより、アミド結合により固定部表面に固定される。実際の固定化方法については、文献（ケー． エム． ミラン（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ）外， アナリティカル ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），６５巻，２３１７頁，１９９３年）に詳細が記載されている。また、マイクロアレイで用いられる公知の結合方法（例えばシランカップリング法）を用いることができる。 The probe nucleic acid thus obtained is fixed to the fixing part. A known method is used as the immobilization method. For example, when the fixing part is glassy carbon, a carboxylic acid group is introduced onto the surface of the fixing part by oxidizing the glassy carbon with potassium permanganate. Next, the nucleic acid is fixed to the surface of the fixing part by an amide bond by having an amino group at the terminal. The actual immobilization method is described in detail in the literature (KM Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317, 1993). Moreover, the well-known coupling | bonding method (for example, silane coupling method) used with a microarray can be used.
本発明で用いる固定部材料はプローブ核酸の固定方法によって選択され、金属、半導体、高分子材料など特に限定しないが、挿入剤と吸着もしくは結合を起こさないように親水処理若しくは無電荷状態に保っていることが好ましい。 The immobilization part material used in the present invention is selected according to the immobilization method of the probe nucleic acid, and is not particularly limited to a metal, a semiconductor, a polymer material, etc., but is kept hydrophilic or uncharged so as not to adsorb or bind to the intercalating agent. Preferably it is.
より具体的には、親水性を有する酸化シリコン、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物、或いは高分子材料である、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、テフロン（登録商標）、ポリフッ化エチレン、メラミン、ナイロン等が挙げられる。 More specifically, hydrophilic silicon oxide, titanium oxide, tin oxide, manganese oxide, lead oxide, or polymer materials such as polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, polyethylene terephthalate, polyimide, polycarbonate , Polystyrene, polyethylene, polypropylene, polypropylene, polyethylene, polyethylene terephthalate, Teflon (registered trademark), polyfluorinated ethylene, melamine, nylon and the like.
本発明で用いる電極部は特に限定されるものではなく、使用可能な電極材料としては、例えば金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カ―ボンペ―スト、カ―ボンファイバ―のような炭素電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。 The electrode part used in the present invention is not particularly limited, and usable electrode materials include, for example, noble metal electrodes such as gold, platinum, platinum black, palladium, rhodium, graphite, glassy carbon, pyrolytic graphite, Carbon electrodes such as carbon paste, carbon fiber, oxide electrodes such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide, lead oxide, semiconductors such as Si, Ge, ZnO, CdS, TiO, GaAs An electrode etc. are mentioned.
上記で得られた、プローブ核酸が結合した固定部を、遺伝子サンプルを含む溶液に接触させることにより、プローブ核酸と相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、２本鎖核酸が形成されるが、ハイブリダイズさせる方法は周知である。 By contacting the immobilized portion to which the probe nucleic acid is bound, obtained above, with a solution containing the gene sample, the gene sample having a sequence complementary to the probe nucleic acid is hybridized to form a double-stranded nucleic acid. However, the method of hybridizing is well known.
このように２本鎖核酸を形成した後、挿入剤を添加し、２本鎖核酸に挿入させる。その後、光照射を行い、２本鎖核酸と挿入剤との間で共有結合を形成させる。なお、挿入剤の添加は、ハイブリダイゼ−ション反応前に検体試料中に添加することもできる。 After forming a double-stranded nucleic acid in this way, an intercalating agent is added and inserted into the double-stranded nucleic acid. Thereafter, light irradiation is performed to form a covalent bond between the double-stranded nucleic acid and the intercalating agent. The intercalating agent can be added to the specimen sample before the hybridization reaction.
上記のような特性を満たす挿入剤は、２本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射により２本鎖核酸と共有結合できる２本鎖核酸結合部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位を有する化合物である、ことを特徴とする。 An intercalating agent that satisfies the above-mentioned properties is a double-stranded nucleic acid binding site that can be specifically inserted into a double-stranded nucleic acid and can be covalently bonded to the double-stranded nucleic acid by light irradiation, and an electrochemical activity having electrochemical activity. It is a compound having a site and a linking site that links the double-stranded nucleic acid binding site and the electrochemically active site.
例えば、下記一般式（１）で表すことができる。 For example, it can be represented by the following general formula (1).
一般式（１）Ｆ − Ｌ − Ｉ
［但し、Ｆは電気化学活性基、Ｌは連結基、そしてＩは２本鎖核酸挿入基であって、Ｉは光照射により２本鎖核酸と光反応する部位を有する］。
Formula (1) F-L-I
[Wherein F is an electrochemically active group, L is a linking group, and I is a double-stranded nucleic acid insertion group, and I has a site that photoreacts with a double-stranded nucleic acid upon irradiation with light].
一般式（１）において、Ｉで示される物質は、２本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射の波長により２本鎖核酸と共有結合、または切断できる物質であり、感光性挿入剤と呼ばれる物質を用いることができる。 In the general formula (1), the substance represented by I is a substance that can be specifically inserted into a double-stranded nucleic acid and covalently bonded to or cleaved from the double-stranded nucleic acid by the wavelength of light irradiation. A substance called can be used.
このような感光性挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特にソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、２本鎖核酸に挿入し非共有的相互作用を起こし、長波長紫外線（３１０〜３９０ｎｍ）を照射すると安定な共有結合を形成する。さらに、短波長紫外線（２１０〜２９０ｎｍ）を照射すると共有結合が切断され、感光性挿入剤は２本鎖核酸から解離する。 Examples of such photosensitive intercalating agents include furocoumarin derivatives, and psoralen derivatives are particularly preferable. A psoralen derivative is inserted into a double-stranded nucleic acid to cause a non-covalent interaction, and forms a stable covalent bond when irradiated with long-wave ultraviolet light (310 to 390 nm). Furthermore, when a short wavelength ultraviolet ray (210 to 290 nm) is irradiated, the covalent bond is cleaved and the photosensitive intercalator is dissociated from the double-stranded nucleic acid.
ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。 Specific examples of psoralen derivatives include psoralen, methoxypsoralen, trimethylpsoralen and the like.
一般式（１）において、Ｆで示される物質は、電気化学活性を有する物質であり、電気化学的に検出可能な物質であれば、限定されるものではない。例えば、酸化還元性を有する化合物を挙げることができ、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで検出が可能である。 In the general formula (1), the substance represented by F is a substance having electrochemical activity, and is not limited as long as it is an electrochemically detectable substance. For example, compounds having redox properties can be mentioned, and detection is possible by measuring a redox current generated during a reversible redox reaction.
このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。 Examples of such redox compounds include ferrocene, catecholamine, metal complexes having a heterocyclic compound as a ligand, rubrene, anthracene, coronene, pyrene, fluoranthene, chrysene, phenanthrene, perylene, binaphthyl, octa Examples include tetraene or viologen.
さらに、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、その発光を測定することで検出を行うこともできる。 In addition, metal complexes having a heterocyclic compound as a ligand, rubrene, anthracene, coronene, pyrene, fluoranthene, chrysene, phenanthrene, perylene, binaphthyl, and octatetraene may generate electrochemiluminescence during the oxidation-reduction reaction. Yes, detection can also be performed by measuring the luminescence.
そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。 In particular, a complex in which the central metal is ruthenium or osmium has good electrochemiluminescence properties, and examples of the material having such good electrochemiluminescence properties include ruthenium bipyridine complexes, ruthenium phenanthroline complexes, and osmium. Bipyridine complex, osnium phenanthroline complex, etc. can be mentioned.
さらに、前記一般式（１）において、連結基Ｌとして用いることができる基としては、前記電気化学活性基Ｆと前記２本鎖核酸挿入基Ｉとを連結するものであれば、そのリンカー配列は特に制限されるものではなく、例えば、アルキル基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基、リン酸基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。 Furthermore, in the general formula (1), as a group that can be used as the linking group L, as long as the electrochemically active group F and the double-stranded nucleic acid insertion group I are linked, the linker sequence is The group is not particularly limited, and examples thereof include an alkyl group, an —O— group, a —CO— group, an —NH— group, a phosphoric acid group, or a group composed of a combination thereof.
以上に説明したような挿入剤を、前記遺伝子サンプルと固定部に固定された前記プローブ核酸をハイブリダイズさせる前もしくは後に添加し、該プローブ核酸と遺伝子サンプルとがハイブリダイズした２本鎖核酸と前記挿入剤とを長波長紫外線照射により共有結合させる。 The intercalating agent as described above is added before or after hybridizing the gene sample and the probe nucleic acid immobilized on the immobilization part, and the double-stranded nucleic acid hybridized with the probe nucleic acid and the gene sample and the The intercalating agent is covalently bonded to the intercalator by long-wave ultraviolet irradiation.
長波長紫外線の照射により２本鎖核酸への挿入したソラレン部が強固に２本鎖核酸と共有結合するようになり、引き続いて、１本鎖の核酸プローブや、固定部の他の表面に、非特異的に吸着した挿入剤を洗浄したとしても、洗浄等の操作によって抜け落ちることがなくなる。 The psoralen part inserted into the double-stranded nucleic acid is strongly covalently bonded to the double-stranded nucleic acid by irradiation with the long-wavelength ultraviolet light, and subsequently, the single-stranded nucleic acid probe and the other surface of the immobilization part Even if the non-specifically adsorbed intercalating agent is washed, it will not come off by an operation such as washing.
長波長紫外線の照射後、未反応の挿入剤を含む溶液を除く。さらに、酸化生成した電気化学活性基と電気化学的反応を示す物質、例えばトリプロピルアミンやトリエチルアミンを含む電解溶液中で短波長紫外線照射工程を行う。短波長紫外線は２本鎖核酸に特異的に結合している挿入剤とのみ解離反応を起こし、２本鎖核酸から挿入剤が分離される。 After irradiation with long-wavelength ultraviolet light, the solution containing unreacted intercalating agent is removed. Further, a short wavelength ultraviolet ray irradiation step is performed in an electrolytic solution containing an electrochemical reaction with the electrochemically active group produced by oxidation, for example, tripropylamine or triethylamine. Short-wave ultraviolet rays cause a dissociation reaction only with the intercalating agent specifically bound to the double-stranded nucleic acid, and the intercalating agent is separated from the double-stranded nucleic acid.
さらにこの電解液中に含まれる挿入剤由来の電気化学的な信号を電極にて測定することにより、２本鎖核酸の存在を高感度に検出することができる。 Furthermore, the presence of the double-stranded nucleic acid can be detected with high sensitivity by measuring an electrochemical signal derived from the intercalating agent contained in the electrolytic solution with an electrode.
前記挿入剤由来の電気化学的な信号は、添加する挿入剤の種類により異なるが、酸化還元電流を生じる挿入剤を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、光電子増倍管等の光検知器を用いて計測が可能である。 The electrochemical signal derived from the intercalating agent varies depending on the type of intercalating agent to be added, but when an intercalating agent that generates an oxidation-reduction current is used, it can be measured by a measurement system including a potentiostat, a function generator, and the like. On the other hand, when an intercalating agent that generates electrochemiluminescence is used, measurement can be performed using a photodetector such as a photomultiplier tube.
図１は、本発明の一実施の形態における遺伝子検出方法の概略を示したものである。固定部１に固定されたプローブ核酸２と検体核酸３をハイブリダイズ反応させ、２本鎖核酸にする（図１（ａ））。２本鎖核酸に挿入剤を添加し（図１（ｂ））、長波長紫外線５を照射することで挿入剤は特異的に２本鎖核酸と結合する。固定部外の表面に挿入剤が非特異吸着しない場合、挿入剤６は２本鎖核酸にのみ結合する（図１（ｃ））。未反応の挿入剤を洗い流した後、電解溶液中で短波長紫外線７を照射し、２本鎖核酸と結合している挿入剤を解離させる（図１（ｄ））。この解離した挿入剤８由来の電気化学的信号を測定することで、２本鎖核酸を検知することが可能となる。
FIG. 1 shows an outline of a gene detection method according to an embodiment of the present invention. The probe nucleic acid 2 and the sample
固定部外の表面に挿入剤が非特異吸着する場合、長波長紫外線１０を照射することにより２本鎖核酸と結合した挿入剤１１と、固定部外の表面に非特異に飽和吸着する挿入剤９が存在する（図１（ｃ´））。未反応の挿入剤を洗い流した後、電解溶液中で短波長紫外線１２を照射し、２本鎖核酸と結合している挿入剤を解離させる（図１（ｄ´））。このとき、基板は挿入剤９が飽和吸着しており、基板解離した挿入剤１３は表面へ再吸着することなく電解溶液に拡散される。この挿入剤１３由来の電気化学的信号を測定することで、２本鎖核酸を検知することが可能となる。
When the intercalating agent is nonspecifically adsorbed on the surface outside the fixing part, the intercalating
いずれの場合においても、２本鎖の核酸プローブを測定電極ではなく固定部に固定化し、長波長紫外線で共有結合させ、後に短波長紫外線で分離した挿入剤を固定部と別に設けた電極で検出することで、従来の電極への非特異吸着した挿入剤をバックグラウンドノイズとして検知することなく、非常に高感度な２本鎖核酸検出が可能となる。 In either case, a double-stranded nucleic acid probe is immobilized on the immobilization part instead of the measurement electrode, covalently bonded with long-wavelength ultraviolet light, and then the intercalating agent separated by the short-wavelength ultraviolet light is detected with an electrode provided separately from the immobilization part By doing so, it becomes possible to detect a double-stranded nucleic acid with very high sensitivity without detecting the non-specifically adsorbed intercalating agent to the conventional electrode as background noise.
本発明による、挿入剤を用いた遺伝子検出方法についてオリゴヌクレオチドを用いて例示する。
（１）プローブ核酸の固定
基板上に、プローブ核酸を固定させるための固定部を設ける。固定部基板上にグラッシーカーボンを配置し、過マンガン酸カリウムで酸化することによって、カーボン表面にカルボン酸基を導入する。
The gene detection method using an intercalating agent according to the present invention will be exemplified using oligonucleotides.
(1) Immobilization of probe nucleic acid An immobilization part for immobilizing probe nucleic acid is provided on a substrate. A glassy carbon is placed on the fixed part substrate and oxidized with potassium permanganate to introduce a carboxylic acid group on the carbon surface.
プローブ核酸には、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の遺伝子配列の５´末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する、５´末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のオリゴヌクレオチド（タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ１の部分に該当）を使用した。なお、オリゴヌクレオチドの配列のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、アデニン、グアニン、チミン、シトシンの各塩基を示す。 The probe nucleic acid has a CCCCCTGGATCCAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCAT sequence located at positions 629-668 from the 5 ′ end of the human Cytochrome P450 gene sequence, a 40-base oligo modified with an aminohexyl group via a phosphate group at the 5 ′ end. Nucleotides (manufactured by Takara Bio Inc., corresponding to the SequenceName1 part in the sequence listing) were used. The oligonucleotide sequences A, G, T, and C represent adenine, guanine, thymine, and cytosine bases.
上記プローブ核酸を、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）に溶解し、１０μＭに調整した。その後、固定部領域内に滴下、室温で一昼夜反応させ、主鎖の５´末端に存在するアミノ基と基板表面に存在するカルボキシル基とを共有結合させた。一昼夜反応後、反応混合液を除去し、２００ｍＭの２−アミノエタノール、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）を５０μｌ滴下し、室温で２時間反応させ、遊離状態のカルボキシル基を遮蔽させた。
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、上記プローブ核酸と相補的な５´末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ２の部分に該当）を使用した。
The probe nucleic acid was dissolved in a reaction mixture (pH 5.5) of 10 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid-sodium hydroxide to 10 μM. It was adjusted. Thereafter, the solution was dropped into the fixed region and reacted at room temperature for a whole day and night to covalently bond the amino group present at the 5 ′ end of the main chain and the carboxyl group present on the substrate surface. After the reaction overnight, the reaction mixture was removed and the reaction of 200 mM 2-aminoethanol, 10 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, and 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid-
(2) Hybridization As a gene sample, an oligodeoxynucleotide having a sequence of ATGATAGTAGGGGAAAATTATTGCATATCTGGATCCAGGGGG from the 5 ′ end complementary to the probe nucleic acid (manufactured by Takara Bio, corresponding to SequenceName2 in the sequence listing) was used.
遺伝子サンプルは、２×ＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。この調整した溶液を、プローブ核酸を固定した固定部上に滴下し、６０℃の恒温槽内で４時間反応させ、２本鎖核酸を形成させた。 The gene sample was dissolved in a hybridization solution mixed with 2 × SSC and adjusted to 20 μM. This adjusted solution was dropped on a fixed part to which the probe nucleic acid was fixed, and reacted for 4 hours in a thermostatic bath at 60 ° C. to form a double-stranded nucleic acid.
また、上記プローブ核酸と非相補的な配列を有する遺伝子サンプルとして、５´末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のＰｏｌｙ−Ａ配列を有する非相補ＤＮＡ（５´末端からＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ３の部分に該当）を用意し比較を行った。
（３）挿入剤の添加
挿入剤には、下記の（化１）に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。
In addition, as a gene sample having a non-complementary sequence with the probe nucleic acid, a non-complementary DNA having a 40-base Poly-A sequence in which an aminohexyl group is modified via a phosphate group at the 5 ′ end (from the 5 ′ end) AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA, manufactured by Takara Bio Inc., which corresponds to the SequenceName3 part in the sequence listing), was compared.
(3) Addition of Insertion Agent A psoralen-modified ruthenium complex represented by the following (Chemical Formula 1) was used as the insertion agent.
ソラレン修飾ルテニウム錯体の合成は、以下手順により得ることができる。 The synthesis of psoralen-modified ruthenium complex can be obtained by the following procedure.
まず、公知の方法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６巻，６号，１０５８頁， １９７７年）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．５ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム溶解 ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で撹拌しながら１，４−ジアミノブタン（０．３２ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）を滴下し１２時間反応させた。溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ａを得た（収率４０％）。 First, 4′-chloromethyl-4,5,8-trimethylpsoralen (0.5 g, 1.81 mmol) synthesized by a known method (Biochemistry, Vol. 16, No. 6, page 1058, 1977) Was dissolved in sodium hydroxide-dissolved dimethylformamide (dry), and 1,4-diaminobutane (0.32 g, 3.63 mmol) was added dropwise with stirring at 160 ° C. for 12 hours. After the solvent was distilled off, the crude product was purified by silica gel chromatography to obtain product A (yield 40%).
次に、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１．３５×１０−２ｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２．７０×１０−２ｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，２−ジブロモエタン７．６１ｇ（４．０５×１０−２ｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。 Next, a solution of 2.50 g (1.35 × 10 −2 mol) of 4,4′-dimethyl-2,2′bipyridine dissolved in 60.0 mL of THF was poured into a container in a nitrogen atmosphere, and then lithium diisopropylamide 2M. 16.9 mL (2.70 × 10 −2 mol) of the solution was added dropwise and stirred for 30 minutes while cooling. On the other hand, 7.61 g (4.05 × 10 −2 mol) of 1,2-dibromoethane and 10 mL of THF were added to a container that was similarly dried in a nitrogen stream, and stirred while cooling.
この１，２−ジブロモエタンとＴＨＦとが挿入された容器に、先程の、ＴＨＦに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン溶液とリチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液とを反応させた反応液をゆっくり滴下させ、２．５時間反応させた。そして、この反応溶液を、２Ｎの塩酸で中和して、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出し、さらに、前記溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｂを得た（収率４７％）。 Reaction in which the vessel in which 1,2-dibromoethane and THF were inserted was reacted with the 4,4′-dimethyl-2,2′bipyridine solution dissolved in THF and the lithium diisopropylamide 2M solution. The solution was slowly added dropwise and allowed to react for 2.5 hours. Then, this reaction solution was neutralized with 2N hydrochloric acid, and THF was distilled off, followed by extraction with chloroform. Further, the crude product obtained by distilling off the solvent was purified with a silica gel column to produce Product B was obtained (yield 47%).
そして、前記生成物Ａ（０．５０ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｂ（０．４９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）とを、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で１８時間撹拌させた。そして、この攪拌した溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ｃを得た（収率３８％）。 The product A (0.50 g, 1.52 mmol) and the product B (0.49 g, 1.68 mmol) are dissolved in sodium hydroxide-dissolved dimethylformamide (dry) and stirred at 160 ° C. for 18 hours. I let you. And after distilling off this stirred solvent, the crude product was purified by silica gel chromatography to obtain product C (yield 38%).
さらに、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え、１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は、吸引ろ過で採取し、生成物Ｄを得た（収率６８．２％）。 Further, ruthenium (III) chloride (2.98 g, 0.01 mol) and 2,2′-bipyridine (3.44 g, 0.022 mol) were refluxed in dimethylformamide (80.0 mL) for 6 hours, Was distilled off. Then, acetone was added and the black precipitate obtained by cooling overnight was extract | collected, 170 mL of ethanol aqueous solution (ethanol: water = 1: 1) was added, and it heated and refluxed for 1 hour. After filtration, 20 g of lithium chloride was added, ethanol was distilled off, and the mixture was further cooled overnight. The deposited black substance was collected by suction filtration to obtain a product D (yield 68.2%).
そして、前記生成物Ｃ（０．３０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｄ（０．３２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）とを、ジメチルホルムアミドに溶かして６時間還流し、反応後、溶媒を留去させて得た黒紫色の物質に蒸留水を加えて溶解させ、未反応錯体をろ過により除去した後、溶媒を留去した。 The product C (0.30 g, 0.56 mmol) and the product D (0.32 g, 0.66 mmol) are dissolved in dimethylformamide and refluxed for 6 hours. After the reaction, the solvent is distilled off. Distilled water was added to the black purple substance obtained and dissolved, the unreacted complex was removed by filtration, and then the solvent was distilled off.
得られた粗生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、ソラレン修飾ルテニウム錯体を得た（収率６８％）。表１は、前述のようにして得たソラレン修飾ルテニウム錯体の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。 The obtained crude product was purified by silica gel chromatography to obtain a psoralen-modified ruthenium complex (yield 68%). Table 1 shows 1 H-NMR results of the psoralen-modified ruthenium complex obtained as described above.
（表１）
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ−６）
σ：
・ ４〜１．８ （６Ｈ，ｍ）
・ ４〜２．６ （１２Ｈ，ｍ）
２．７４ （２Ｈ，ｔ）
・ ８〜３．１ （６Ｈ，ｍ）
・ ３１ （２Ｈ，ｓ）
６．３２ （１Ｈ，ｓ）
７．３８ （２Ｈ，ｄ）
７．５４ （７Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１６ （４Ｈ，ｔ）
８．７０ （２Ｈ，ｄ）
８．８８ （４Ｈ，ｄ）
このようにして得られたソラレン修飾ルテニウム錯体を、１０ｍＭのリン酸バッファで２μＭに調整した。
(Table 1)
1 H-NMR (300MHz, DMSOd -6)
σ:
・ 4-1.8 (6H, m)
・ 4-2.6 (12H, m)
2.74 (2H, t)
・ 8-3.1 (6H, m)
・ 31 (2H, s)
6.32 (1H, s)
7.38 (2H, d)
7.54 (7H, m)
7.77 (4H, m)
8.16 (4H, t)
8.70 (2H, d)
8.88 (4H, d)
The psoralen-modified ruthenium complex thus obtained was adjusted to 2 μM with a 10 mM phosphate buffer.
この調整した溶液を、２本鎖核酸が形成した固定部に添加し、３０分間４℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。３０分後、長波長紫外光源（ＵＶＰ製ＣＬ１０００Ｌ型）を用いて波長３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、ソラレンと２本鎖核酸を共有結合させた。共有結合後、固定部を１０ｍＭのリン酸バッファで１分間洗い流した。
（４）電気化学発光測定
本実施例における遺伝子検出方法について、図２を用いて説明する。上記工程の後、固定部基板２４と作用極、対極、参照極の電極２１を配置した電極基板２２を、０.１Ｍのリン酸バッファおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解溶液２５に満たす。ここで参照極は、基準電位を求めるためのものである。溶液内で固定部２３に対して、短波長紫外光源２６（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、挿入剤を２本鎖核酸から分離させ電解溶液に拡散させた。分離した挿入剤を電解溶液中に均一に拡散させるため、電解溶液を軽く攪拌した。
This prepared solution was added to the fixing part formed with the double-stranded nucleic acid, and a dark reaction was performed in a refrigerator at 4 ° C. for 30 minutes. Thirty minutes later, ultraviolet light with a wavelength of 365 nm and 5 mW / cm 2 was irradiated for 10 minutes using a long wavelength ultraviolet light source (CL1000L type manufactured by UVP) to covalently bond psoralen and double-stranded nucleic acid. After covalent bonding, the immobilization part was washed away with 10 mM phosphate buffer for 1 minute.
(4) Electrochemiluminescence measurement The gene detection method in a present Example is demonstrated using FIG. After the above process, the electrode substrate 22 on which the fixed
その後、電極２１にポテンショスタット２９から電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を光電子増倍管２７（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで５秒間走査し、電圧走査中における最大発光量を測定した。挿入剤由来の発光量はフォトカウンター２８でカウントされ、得られたデータはコントローラＰＣ３０に格納される。また、電圧、電流、発光量等のデータはモニタ３１でモニタリングすることができる。
Thereafter, a voltage was applied to the electrode 21 from the
図３に本実施例で得られた電気化学発光測定による挿入剤の発光量を示したものである。図３において、相補的な、つまり２本鎖核酸由来の発光量は、非相補的な、２本鎖核酸を形成していない１本鎖核酸由来の発光量と比較して著しく高い値となっており、高感度に２本鎖核酸の検出が可能であることがわかる。また、核酸のない場合はほとんど発光が見られないことから、バックグラウンド発光はほとんど生じないことは明らかである。 FIG. 3 shows the amount of luminescence of the intercalating agent obtained by electrochemiluminescence measurement obtained in this example. In FIG. 3, the amount of light emitted from complementary, ie, double-stranded nucleic acids, is significantly higher than the amount of light emitted from non-complementary single-stranded nucleic acids that do not form double-stranded nucleic acids. It can be seen that double-stranded nucleic acid can be detected with high sensitivity. In addition, since there is almost no light emission in the absence of nucleic acid, it is clear that background light emission hardly occurs.
本発明による、挿入剤を用いた遺伝子検出方法についてオリゴヌクレオチドを用いて例示する。
（１）〜（３）は実施例１に同じ。
（４）電気化学発光測定
本実施例における遺伝子検出方法について、図４を用いて説明する。固定部基板４４を、０.１Ｍのリン酸バッファおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解溶液４５に満たす。溶液内で固定部４３に対して、短波長紫外光源４６（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、挿入剤を２本鎖核酸から分離させ電解溶液に拡散させた。挿入剤が拡散した電解溶液を取り出し、作用極、対極、参照極の電極４１を配置した電極基板４２上に滴下する。
The gene detection method using an intercalating agent according to the present invention will be exemplified using oligonucleotides.
(1) to (3) are the same as in the first embodiment.
(4) Electrochemiluminescence measurement The gene detection method in a present Example is demonstrated using FIG. The
その後、電極４１にポテンショスタット４９から電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を光電子増倍管４７（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで５秒間走査し、電圧走査中における最大発光量を測定した。挿入剤由来の発光量はフォトカウンター４８でカウントされ、得られたデータはコントローラＰＣ５０に格納される。また、電圧、電流、発光量等のデータはモニタ５１でモニタリングすることができる。本実施例により、図３と同様な結果が示された。
Thereafter, a voltage was applied to the electrode 41 from a
本発明にかかる遺伝子検出方法は、光照射による簡便な作業性と、測定のバックグラウンドノイズが極力低減可能であるため、非常に高感度に目的遺伝子を検出可能である。このため、高感度測定が必要な１塩基変異多型や細菌検査、ウイルス検査に有用である。 The gene detection method according to the present invention can detect a target gene with very high sensitivity because simple workability by light irradiation and measurement background noise can be reduced as much as possible. For this reason, it is useful for single nucleotide polymorphisms that require high-sensitivity measurement, bacterial testing, and virus testing.
１，２３，４３ 固定部
２ プローブ核酸
３ 検体核酸
４ 挿入剤
５，１０ 長波長紫外線
６，１１ ２本鎖核酸に結合した挿入剤
７，１２ 短波長紫外線
８，１３ ２本鎖核酸から分離した挿入剤
９ 固定部に非特異に飽和吸着した挿入剤
２１，４１ 電極
２２，４２ 電極基板
２４，４４ 固定部用基板
２５，４５ 電解溶液
２６，４６ 紫外光源
２７，４７ 光電子増倍管
２８，４８ フォトカウンター
２９，４９ ポテンショスタット
３０，５０ コントローラＰＣ
３１，５１ モニタ
1,23,43 Fixed part 2 Probe
31,51 monitor
Claims (9)
該プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、
前記ハイブリダイズ反応により形成された２本鎖核酸に対し、前記２本鎖核酸に特異的な光架橋性化合物である２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸挿入部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる挿入剤を添加した後、第１の波長の光照射により前記２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、
前記ステップの後、２本鎖核酸の周囲を電解溶液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離させるステップと、
挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、電解溶液中に分離された前記挿入剤の存在を、前記電極部を介した電気化学的な測定により検出するステップと、
を有することを特徴とする遺伝子検出方法。 Immobilizing a probe nucleic acid having a base sequence complementary to the gene sequence to be detected on a substrate;
Hybridizing the probe nucleic acid and a sample nucleic acid denatured into a single strand; and
For the double-stranded nucleic acid formed by the hybridization reaction, a double-stranded nucleic acid insertion site that is a photocrosslinkable compound specific to the double-stranded nucleic acid, an electrochemically active site having electrochemical activity, After the addition of an intercalating agent comprising a compound having a double-stranded nucleic acid insertion site and a linking site for linking the electrochemically active site, the double-stranded nucleic acid insertion site and the two double-stranded nucleic acid insertion sites are irradiated by light irradiation at the first wavelength Covalently binding the strand nucleic acid;
Filling the periphery of the double-stranded nucleic acid with an electrolytic solution after the step, and separating the covalently bonded double-stranded nucleic acid insertion site from the double-stranded nucleic acid by irradiation with light of a second wavelength;
Disposing an electrode part in the electrolytic solution from which the intercalating agent is separated, and detecting the presence of the intercalating agent separated in the electrolytic solution by electrochemical measurement via the electrode part;
A gene detection method characterized by comprising:
A gene detection method, wherein a central metal of a metal complex having a heterocyclic compound in the ligand according to claim 8 is ruthenium or osnium.
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