JP2007232675A - Gene detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を検出する遺伝子検出方法に関し、特に、標識剤により電気化学的に遺伝子を検出する遺伝子検出方法に関する。 The present invention relates to a gene detection method for detecting a specific gene sequence present in a sample, and particularly to a gene detection method for electrochemically detecting a gene with a labeling agent.
従来、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出する遺伝子検出方法として、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化したＤＮＡチップを用いるものがある。この方法は、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとで形成された二本鎖核酸に特異的に結合し且つ電気化学的に活性な標識剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、ＤＮＡチップの電極を介した電気化学的な測定により、前記二本鎖核酸に結合した標識剤を検出することで、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。 Conventionally, as a gene detection method for electrochemically detecting a specific gene sequence, a DNA chip in which a single-stranded nucleic acid probe having a base sequence complementary to a target gene to be detected is immobilized on an electrode surface is used. There is something. In this method, the nucleic acid probe is hybridized with a target gene sample that has been denatured into a single strand, and then specifically binds to a double-stranded nucleic acid formed with the nucleic acid probe and the target gene sample. A chemically active labeling agent is added to the reaction system of the nucleic acid probe and the gene sample, and the labeling agent bound to the double-stranded nucleic acid is detected by electrochemical measurement through the electrode of the DNA chip. Thus, the nucleic acid probe hybridized with the target gene sample is detected, and the presence of the target gene is confirmed (see, for example, Patent Document 1 and Patent Document 2).
この手法で用いられる前記標識剤は、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記標識剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に挿入することによって、二本鎖核酸と結合する。この標識剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記標識剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。 The labeling agent used in this technique refers to a substance that recognizes the double-stranded nucleic acid and specifically binds to the double-stranded nucleic acid. Each of the labeling agents has a planar insertion group such as a phenyl group in the molecule, and the insertion group is inserted between the base pair of the double-stranded nucleic acid, thereby Join. The binding between the labeling agent and the double-stranded nucleic acid is binding by electrostatic interaction or hydrophobic interaction, and the insertion of the labeling agent between the base pairs of the double-stranded nucleic acid and between the base pairs. This is a binding by an equilibrium reaction in which the release from is repeated at a constant rate.
さらに、前述した標識剤には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質があり、このような電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす挿入剤を用いれば、電気化学的変化の測定によって、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の存在を検出することができる。なお、この電気化学的変化の出力信号としては、酸化還元時に発生する電流や発光が挙げられる。 Furthermore, the above-mentioned labeling agent has a substance that causes an electrically reversible redox reaction. If an intercalating agent that causes such an electrochemically reversible redox reaction is used, the electrochemical change can be measured. Thus, the presence of the labeling agent bound to the double-stranded nucleic acid can be detected. Examples of the output signal of the electrochemical change include current generated during oxidation / reduction and light emission.
従って、このような従来の遺伝子検出方法においては、前記標識剤を二本鎖核酸にのみ特異的に結合させ、該二本鎖核酸に結合した標識剤の量を正確に検出することが重要となる。 Therefore, in such a conventional gene detection method, it is important to specifically bind the labeling agent only to the double-stranded nucleic acid and accurately detect the amount of the labeling agent bound to the double-stranded nucleic acid. Become.
しかし、前記標識剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した標識剤は、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。 However, the labeling agent is non-specifically adsorbed on a single-stranded nucleic acid probe or the electrode surface on which the nucleic acid probe is immobilized. The non-specifically adsorbed labeling agent becomes background noise when detecting the amount of the labeling agent bound to the double-stranded nucleic acid, and causes a decrease in detection sensitivity.
これを解消する手法の１つとして、磁気ビーズを用いた手法がある。この手法は、磁気ビーズに固定した捕捉プローブと、標識剤として電気化学的に活性である物質が結合した標識プローブと、遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、磁気ビーズに遺伝子サンプルを介して標識剤が結合した複合体を形成させる。そして、磁気ビーズを磁力で収集し、洗浄することで、ハイブリダイズしなかった未反応の遺伝子サンプルおよび標識プローブの除去（Ｂ／Ｆ分離）を行う。その後、磁気ビーズと電解液を電極上に展開し、電極に電圧を印加して、遺伝子サンプルに結合した標識プローブからの電気化学的な信号を検出することにより、目的とする遺伝子の存在を検出する手法である（特許文献３及び特許文献４参照）。 One technique for solving this is a technique using magnetic beads. In this method, a capture probe immobilized on a magnetic bead, a labeled probe bound with an electrochemically active substance as a labeling agent, and a gene sample are hybridized, and the labeling agent is attached to the magnetic bead via the gene sample. A bound complex is formed. Then, magnetic beads are collected by magnetic force and washed to remove unreacted gene samples and labeled probes that have not been hybridized (B / F separation). Then, the presence of the target gene is detected by developing magnetic beads and electrolyte on the electrode, applying voltage to the electrode, and detecting the electrochemical signal from the labeled probe bound to the gene sample. (See Patent Document 3 and Patent Document 4).
この手法は、いわゆるサンドイッチハイブリダイゼーションを用いた手法であり、前記捕捉プローブと、前記遺伝子サンプルと、前記標識プローブとが、各成分の特異的相互作用を介して複合体化されているため、特異性が高く、検出感度を向上させることが可能である。 This technique is a technique using so-called sandwich hybridization, and the capture probe, the gene sample, and the labeled probe are complexed through specific interaction of each component. Therefore, it is possible to improve detection sensitivity.
さらに、前記磁気ビーズは、バルク体や膜に比べて比表面積が大きく、反応性を向上させることができ、また、磁力を利用してＢ／Ｆ分離を効率的に行うことで、バックグランドノイズの低減にも有効であるため、検出感度を向上させることが可能である。
前述した特許文献３及び特許文献４の方法では、磁気ビーズ表面に遺伝子サンプルを介して結合した標識剤が、電極との間で電子の授受を行い、酸化または還元されることにより発生する電流や発光を検出するものである。そして、前述の標識剤と電極との電子の授受は、電気二重層と呼ばれる電極表面から数ｎｍの領域といった非常に狭い範囲で行われる。 In the methods of Patent Document 3 and Patent Document 4 described above, the labeling agent bound to the magnetic bead surface via a gene sample exchanges electrons with the electrode, and the current generated by being oxidized or reduced It detects light emission. The above-described electron transfer between the labeling agent and the electrode is performed in a very narrow range such as a region of several nm from the electrode surface called an electric double layer.
しかしながら、前述の手法で用いる磁気ビーズは、ノルウェーのＤｙｎａｌ社から販売されているＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商品名）に代表されるように、電気絶縁材料であるポリスチレンに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものであり、ポリスチレンが主成分であるため、上記磁気ビーズは全体として絶縁体である。 However, the magnetic beads used in the above-mentioned method are obtained by dispersing a magnetizable substance such as iron oxide in polystyrene, which is an electrically insulating material, as represented by DYNABEADS (trade name) sold by Dynal of Norway. Since the main component is polystyrene, the magnetic beads are an insulator as a whole.
そのため、磁気ビーズ表面に遺伝子サンプルを介して結合した標識剤のうち、電極表面に接触する標識剤のみしか電極との電子授受が起こらない、すなわち、磁気ビーズ表面の一部のみしか電気化学反応に関与せず、標識剤の利用効率が悪い、という課題があった。 Therefore, among the labeling agents bound to the magnetic bead surface via the gene sample, only the labeling agent that contacts the electrode surface causes electron transfer with the electrode, that is, only a part of the magnetic bead surface undergoes an electrochemical reaction. There was a problem that the utilization efficiency of the labeling agent was poor without involvement.
本発明は、前記課題を解決するためにされたものであって、磁気ビーズに固定化された標識剤の利用効率を向上させ、検出対象である遺伝子サンプルを高感度に検出できる遺伝子検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and provides a gene detection method that improves the utilization efficiency of a labeling agent immobilized on magnetic beads and can detect a gene sample to be detected with high sensitivity. The purpose is to provide.
前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、電気化学的に活性である物質で標識された、前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製する標識プローブ作製工程と、前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを磁気ビーズに固定化する磁気ビーズ作製工程と、前記磁気ビーズに固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識プローブ、及び検出すべき遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた複合体を形成する複合体形成工程と、前記複合体を磁力により収集し、ハイブリダイズしなかった遺伝子サンプルおよび標識プローブを除去する洗浄工程と、収集した前記磁気ビーズを導電性微粒子が添加された電解液とともに電極上に展開し、前記複合体中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。 In order to solve the above problems, the gene detection method of the present invention is a gene detection method for detecting a gene having a specific sequence, wherein the gene to be detected is denatured into a single strand to produce a gene sample. Sample preparation step, and labeled probe preparation step of preparing a single-stranded labeled probe having a base sequence complementary to a part of the gene sequence of the gene sample, labeled with an electrochemically active substance And a single-stranded capture probe having a base sequence complementary to a part of the gene sequence of the gene sample and having a base sequence different from the labeled probe, and immobilizing the capture probe on a magnetic bead A magnetic bead preparation step, a single-stranded capture probe fixed to the magnetic bead, the labeled probe, and a gene sample to be detected are hybridized. A complex forming step for forming the complex, a washing step for collecting the complex by magnetic force, removing a non-hybridized gene sample and a labeled probe, and adding the collected magnetic beads to the conductive fine particles. And a detection step of developing the electrochemically active substance in the complex with an electrochemical solution and detecting the electrochemically active substance in the complex by electrochemical measurement.
本発明の遺伝子検出方法によれば、電気化学測定の際に、電解液に分散した導電性粒子を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない部分の標識剤でも電気化学反応が起きるため、標識剤の利用効率を高めることができ、高感度な検出が可能となる。 According to the gene detection method of the present invention, during the electrochemical measurement, the electric double layer region extends to a part away from the electrode surface via the conductive particles dispersed in the electrolytic solution, and is in contact with the electrode surface. Since the electrochemical reaction occurs even in a portion of the labeling agent that is not present, the utilization efficiency of the labeling agent can be increased, and highly sensitive detection is possible.
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、***、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。 Hereinafter, the gene detection method of the present invention will be described in detail. In addition, the gene sample in the following embodiments refers to, for example, blood, leukocytes, serum, urine, feces, semen, saliva, cultured cells, tissue cells such as various organ cells, and any sample containing other genes. The cells in the sample are destroyed to release double-stranded nucleic acids, which are dissociated into single-stranded nucleic acids by heat treatment or alkali treatment. In addition, the gene sample in this embodiment may be a nucleic acid fragment that has been cut with a restriction enzyme and purified by electrophoresis separation or the like.
（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
(Embodiment 1)
Hereinafter, the gene detection method in Embodiment 1 is demonstrated. First, a gene sample to be tested is prepared. As described above, this gene sample destroys cells in an arbitrary sample to release double-stranded nucleic acid, and is denatured to single-stranded by heat treatment or alkali treatment.
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。 At this time, the destruction of the cells in the sample can be performed by a conventional method, for example, by applying a physical action such as shaking or ultrasonic waves from the outside. In addition, nucleic acid can be released from cells using a nucleic acid extraction solution (for example, a solution containing a surfactant such as SDS, Triton-X, or Tween-20, or a saponin, EDTA, or protease). .
次に、前記一本鎖の遺伝子サンプルに、後述する標識プローブを含む溶液を接触させる。これにより、前記標識プローブがもつ標識結合用プローブと、該標識結合用プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、標識化遺伝子サンプルが形成される。この標識プローブと遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。 Next, a solution containing a labeled probe described later is brought into contact with the single-stranded gene sample. Thereby, the labeled binding probe of the labeled probe and the gene sample having a sequence complementary to the labeled binding probe are hybridized to form a labeled gene sample. Since the method of hybridizing the labeled probe and the gene sample is well known, the description thereof is omitted here.
以下、本発明に用いられる標識プローブについて説明する。標識プローブは、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質で標識された一本鎖核酸である。 Hereinafter, the labeled probe used in the present invention will be described. The labeled probe is a single-stranded nucleic acid labeled with a substance that has a base sequence complementary to the gene sequence to be detected and is electrochemically active.
前述の電気化学的に活性である物質は、電気化学的に検出可能な物質であれば特に制限無く何を用いてもよく、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物が挙げられる。そしてこのような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。 Any electrochemically active substance may be used as long as it is an electrochemically detectable substance. For example, by measuring an oxidation-reduction current generated during a reversible oxidation-reduction reaction. Examples thereof include compounds having redox properties capable of detecting substances. Examples of such redox compounds include ferrocene, catecholamine, metal complexes having a heterocyclic compound as a ligand, rubrene, anthracene, coronene, pyrene, fluoranthene, chrysene, phenanthrene, perylene, binaphthyl, There are octatetraene and viologen.
なお、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、後述する検出工程にてその発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うこともできる。 In addition, the aforementioned metal complexes having a heterocyclic compound as a ligand, rubrene, anthracene, coronene, pyrene, fluoranthene, chrysene, phenanthrene, perylene, binaphthyl, and octatetraene emit electrochemiluminescence during the oxidation-reduction reaction. Some occur, and the gene sample can be detected by measuring the luminescence in the detection step described later.
また、前述の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等を挙げることができ、特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。 Examples of the metal complex having a heterocyclic compound in the above-mentioned ligand include a heterocyclic compound containing oxygen, nitrogen, etc., for example, a metal complex having a pyridine moiety, a pyran moiety, etc. in the ligand. In particular, a metal complex having a pyridine moiety as a ligand is preferable, and examples of the metal complex having the pyridine moiety as a ligand include metal bipyridine complexes and metal phenanthroline complexes.
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。特に該中心金属が、ルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。 Further, as the central metal of the metal complex having a heterocyclic compound as the ligand, for example, ruthenium, osnium, zinc, cobalt, platinum, chromium, molybdenum, tungsten, technetium, rhenium, rhodium, iridium, palladium, copper , Indium, lanthanum, praseodymium, neodymium, samarium and the like. In particular, a complex in which the central metal is ruthenium or osmium has good electrochemiluminescence properties, and examples of the material having such good electrochemiluminescence properties include ruthenium bipyridine complexes, ruthenium phenanthroline complexes, males. Examples thereof include a nium bipyridine complex and an osnium phenanthroline complex.
そしてこの後、前述したようにして形成された標識化遺伝子サンプルを含む溶液を、磁気ビーズに固定化された捕捉プローブに接触させる。これにより、前記捕捉プローブと、該捕捉プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、前記標識化遺伝子サンプルが磁気ビーズに固定化される。この前記捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。 After that, the solution containing the labeled gene sample formed as described above is brought into contact with the capture probe immobilized on the magnetic beads. Thereby, the capture probe and a gene sample having a sequence complementary to the capture probe are hybridized, and the labeled gene sample is immobilized on the magnetic beads. Since the method of hybridizing the capture probe and the labeled gene sample is well known, description thereof is omitted here.
前記捕捉プローブとしては、化学合成で得た一本鎖の核酸、あるいは生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。なお、生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。 As the capture probe, a single-stranded nucleic acid obtained by chemical synthesis, or a nucleic acid obtained by cleaving a nucleic acid extracted from a biological sample with a restriction enzyme and separating it by electrophoresis or the like can be used. In the case of nucleic acid extracted from a biological sample, it is preferably dissociated into single-stranded nucleic acid by heat treatment or alkali treatment.
また、前記捕捉プローブを固定化する磁気ビーズとしては、特に限定されるものではなく、医用で一般的に用いられている磁気ビーズが使用可能である。前記磁気ビーズは、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁気ビーズの粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、３００ｎｍ〜５μｍが好ましい。 The magnetic beads for immobilizing the capture probe are not particularly limited, and magnetic beads generally used for medical use can be used. The magnetic beads are obtained by dispersing a magnetizable substance such as iron oxide in a polymer such as polystyrene or dextran, which is an electrically insulating material. The particle size of the magnetic beads can be selected from a wide range of 10 nm to 10 μm and is not particularly limited, but is preferably 300 nm to 5 μm from the viewpoint of dispersibility in the solution, separation and recovery.
前記捕捉プローブを前記磁気ビーズに固定化する方法としては、例えば、磁気ビーズにアビジンコーティングを施し、末端をビオチン修飾した核酸プローブと結合させるなどの公知の方法が用いることができる。 As a method for immobilizing the capture probe on the magnetic bead, for example, a known method such as applying avidin coating to the magnetic bead and binding the end to a biotin-modified nucleic acid probe can be used.
なお、前述の説明では、まず遺伝子サンプルと標識プローブとをハイブリダイズさせて標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程の後、該標識化遺伝子サンプルと磁気ビーズに固定化された捕捉プローブとをハイブリダイズさせて、遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する遺伝子サンプル捕捉工程を行なうものとしたが、前記遺伝子サンプル捕捉工程と前記遺伝子サンプル標識化工程とを同時に行うものでもよい。この場合、遺伝子サンプルと、標識プローブと、磁気ビーズに固定化した捕捉プローブとを同時に接触させて、標識された遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する。 In the above description, first, after the gene sample labeling step in which the gene sample and the labeled probe are hybridized to form a labeled gene sample, the labeled gene sample and the capture probe immobilized on the magnetic beads The gene sample capturing step for immobilizing the gene sample and immobilizing the gene sample on the magnetic beads is performed, but the gene sample capturing step and the gene sample labeling step may be performed simultaneously. In this case, the gene sample, the labeled probe, and the capture probe immobilized on the magnetic beads are simultaneously contacted to immobilize the labeled gene sample on the magnetic beads.
前述のようにして前記標識化遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化後、磁気ビーズを磁力で収集し、未反応の遺伝子サンプルと標識プローブを除去することで、Ｂ／Ｆ分離を行う。 After immobilizing the labeled gene sample to the magnetic beads as described above, the magnetic beads are collected by magnetic force, and the unreacted gene sample and the labeled probe are removed to perform B / F separation.
Ｂ／Ｆ分離を行った後、磁気ビーズを電解液とともに電極上に展開し、前記磁気ビーズは磁力により電極表面に捕捉する。そして、電極に電圧を印加することで、該磁気ビーズに固定化された前記標識化遺伝子サンプルの、電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を測定する。 After performing the B / F separation, the magnetic beads are spread on the electrode together with the electrolyte, and the magnetic beads are captured on the electrode surface by magnetic force. Then, by applying a voltage to the electrode, an electrochemical signal derived from an electrochemically active substance of the labeled gene sample immobilized on the magnetic beads is measured.
電気化学的な信号の測定は、標識された電気化学的に活性である物質によって異なり、前記電気化学的に活性である物質として、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、該電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を、前記ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、前記電気化学的に活性である物質として、電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。 The measurement of the electrochemical signal differs depending on the labeled electrochemically active substance, and an electrochemically active substance that generates a redox current is used as the electrochemically active substance. In some cases, an electrochemical signal derived from the electrochemically active substance can be measured by a measurement system including the potentiostat, function generator, and the like. On the other hand, when a substance that generates electrochemiluminescence is used as the electrochemically active substance, measurement can be performed using a photomultiplier or the like.
以下、本発明に用いられる電解液について説明する。本発明の電解液は、導電性微粒子が添加されたものであり、電解液に分散した導電性粒子を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない部分の電気化学的に活性である物質でも電気化学反応が起きるため、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。 Hereinafter, the electrolytic solution used in the present invention will be described. The electrolytic solution of the present invention has conductive fine particles added thereto, and the electric double layer region extends to a part away from the electrode surface through the conductive particles dispersed in the electrolytic solution, and contacts the electrode surface. Since an electrochemical reaction occurs even in an electrochemically active portion of the portion that is not present, the utilization efficiency of the labeling agent can be increased.
前記導電性粒子は、金属電極と前記電気化学的に活性である物質との間で電子の移動が可能であり、前記電気化学的に活性である物質を、酸化還元することができる物質であれば、特に制限無く何を用いてもよい。 The conductive particle may be a substance that can transfer electrons between a metal electrode and the electrochemically active substance, and can oxidize and reduce the electrochemically active substance. Anything can be used without particular limitation.
好適な材料としては、化学的に安定であり、溶解電位が高い金属材料、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン等、また、酸化および還元方向の電位窓の広いカーボン等が挙げられる。 Suitable materials include metal materials that are chemically stable and have a high dissolution potential, such as gold, platinum, silver, palladium, rhodium, iridium, tungsten, and carbon having a wide potential window in the oxidation and reduction directions. Is mentioned.
また、前記導電性粒子の粒径は、特に限定されるものではないが、磁気ビーズの粒径以下であることが好ましい。前記磁力により電極表面に捕捉された磁気ビーズは、凝集、積層した状態で電極表面に存在するため、前述の粒径をもつ導電性粒子を使用することにより、導電性粒子が磁気ビーズの間隙に入り込み、入り込んだ導電性粒子を介して、凝集、積層した磁気ビーズに結合した標識剤を反応させることができ、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。 The particle size of the conductive particles is not particularly limited, but is preferably equal to or smaller than the particle size of the magnetic beads. The magnetic beads trapped on the electrode surface by the magnetic force exist on the electrode surface in an aggregated and laminated state. Therefore, by using the conductive particles having the above-mentioned particle size, the conductive particles are placed in the gap between the magnetic beads. The labeling agent bonded to the aggregated and laminated magnetic beads can be reacted via the entering and entering conductive particles, and the utilization efficiency of the labeling agent can be increased.
さらに、前記導電性粒子の粒径は、１ｎｍ〜５μｍがより好ましく、特に１ｎｍ〜３００ｎｍが好ましい。このような粒径の小さい導電性粒子を用いることにより、凝集、積層した磁気ビーズの間隙に入り込みやすくなる。 Furthermore, the particle diameter of the conductive particles is more preferably 1 nm to 5 μm, and particularly preferably 1 nm to 300 nm. By using such conductive particles having a small particle diameter, it becomes easy to enter the gaps between the aggregated and laminated magnetic beads.
このような導電性微粒子としては、例えば、免疫測定の呈色剤や燃料電池の触媒等で使用されるコロイド粒子等が挙げられる。 Examples of such conductive fine particles include colloidal particles used in immunoassay colorants, fuel cell catalysts, and the like.
また、前記導電性微粒子の電解液への添加量は、前記導電性微粒子を添加した電解液の光学濃度を測定することで決定する。一般に、溶液中の微粒子の濃度は、微粒子を含む溶液の光学濃度で示され、光学濃度の測定は、微粒子を含む溶液の吸収極大波長の光を用いて、吸光光度計により測定される。例えば、導電性微粒子に金コロイドを用いた場合、５２０ｎｍの波長の光を用いて測定されている。 The amount of the conductive fine particles added to the electrolytic solution is determined by measuring the optical density of the electrolytic solution to which the conductive fine particles are added. In general, the concentration of the fine particles in the solution is indicated by the optical density of the solution containing the fine particles, and the optical density is measured with an absorptiometer using the light having the maximum absorption wavelength of the solution containing the fine particles. For example, when gold colloid is used for the conductive fine particles, the measurement is performed using light having a wavelength of 520 nm.
そして、前記導電性微粒子を添加した前記電解液の光学濃度は、０．０００１〜１が好ましく、特に０．０１〜０．３が好ましい。このような光学濃度にすることにより、前記導電性微粒子の良好な分散状態が得られ、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。さらに、前記標識剤に電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、前記電解液の光学濃度が高くなると、前記導電性微粒子が標識剤からの発光を阻害する効果も高くなるため、前述のような光学濃度にすることにより、電界液に添加した前記導電性微粒子が標識剤からの発光を阻害する影響を低く抑えることもできる。 The optical density of the electrolytic solution to which the conductive fine particles are added is preferably 0.0001 to 1, and particularly preferably 0.01 to 0.3. By using such an optical density, a good dispersion state of the conductive fine particles can be obtained, and the utilization efficiency of the labeling agent can be increased. Furthermore, when a substance that generates electrochemiluminescence is used for the labeling agent, if the optical density of the electrolytic solution increases, the conductive fine particles also have an effect of inhibiting light emission from the labeling agent. By setting such an optical density, the influence of the conductive fine particles added to the electrolysis solution inhibiting the light emission from the labeling agent can be suppressed.
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）遺伝子サンプル
遺伝子サンプルには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited thereto.
(1) Gene sample The gene sample contains AATTGAATGA AAACATCAGG ATTGTAAGCA CCCCCTGGAT CCAGATATGTA CCATACTATGA CCATACTGA TGATCATGATCATGATCATCATCAT TAGATATGAT sequence of the human cytochrome P-450 gene sequence from the 5'-end of the gene sequence Deoxynucleotides were used.
（２）磁気ビーズ表面への核酸プローブの固定化
磁気ビーズには、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＣＭ０１Ｎ／５８９６ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた（粒径０．３５μｍ）。捕捉プローブには、５’末端よりＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの遺伝子サンプルと相補的な配列を有し、５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。
(2) Immobilization of nucleic acid probe on magnetic bead surface CM01N / 5896 streptavidin magnetic beads manufactured by Bangs Laboratories were used as magnetic beads (particle size: 0.35 μm). As the capture probe, a probe having a sequence complementary to the gene sample of AATTTGTTAT GGGTTCCCCGG GAAATAATCA from the 5 ′ end and modified with biotin via a phosphate group at the 5 ′ end was used.
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：２Ｍ塩化リチウム：超純水＝２：１０：５：３の体積比になるよう調製）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの核酸プローブを５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。 First, 1 mg of magnetic beads were sampled and washed with TTL buffer (500 mM Tris-HCl (pH 8.0): Tween 20: 2 M lithium chloride: ultrapure water = adjusted to a volume ratio of 2: 10: 5: 3). , 20 μL of TTL buffer. Thereafter, 5 μL of 100 nM nucleic acid probe was added and gently shaken at room temperature for 15 minutes.
この溶液をデカントし、残留した磁気ビーズを０．１５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、ＴＴバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：超純水＝１：２：１の体積比になるよう調製）で洗浄した。 The solution was decanted, and the remaining magnetic beads were washed with a 0.15 M aqueous sodium hydroxide solution, and then the volume ratio of TT buffer (500 mM Tris-HCl (pH 8.0): Tween 20: ultrapure water = 1: 2: 1). Washed to prepare).
洗浄後、ＴＴＥバッファーに溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定な結合を除去した。これにより、捕捉プローブが固定化された磁気ビーズを得た。 After washing, the solution was replaced with TTE buffer, and the unstable binding was removed by incubation at 80 ° C. for 10 minutes. Thereby, a magnetic bead having a capture probe immobilized thereon was obtained.
さらに、本実施例１においては、比較対象として、遺伝子サンプルと非相補的な配列を有する捕捉プローブを使用して、前記捕捉プローブと同様の処理を行った。なお、ここでは、非相補的な捕捉プローブとして、３０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。 Furthermore, in this Example 1, the same process as the said capture probe was performed using the capture probe which has a non-complementary sequence with a gene sample as a comparison object. Here, as a non-complementary capture probe, a probe modified with biotin via a 5'-terminal phosphate group having a 30-mer Poly-A, AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA sequence was used.
（３）標識プローブ
標識プローブには、５’末端からＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有し、５’末端のリン酸基を介して、電気化学的に活性である物質であるルテニウム錯体を修飾し、下記（化１）に示すような３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
(3) Labeled probe The labeled probe has a sequence of TGCTTACAAT CCTGATGTTTTCATTCAATT from the 5 ′ end, and is modified with a ruthenium complex that is an electrochemically active substance via a phosphate group at the 5 ′ end, A 30-base oligodeoxynucleotide as shown below (Chemical Formula 1) was used.
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％）。 To a container in a nitrogen atmosphere, 1.0 g (3.28 mmol) of the product C, 0.67 g (3.61 mmol) of potassium phthalimide, and 30.0 mL of dimethylformamide (dehydrated) were added and refluxed in an oil bath for 18 hours. After the reaction, the mixture was extracted with chloroform and washed with distilled water with 50 mL of 0.2N sodium hydroxide. The solvent was distilled off and recrystallization was performed from ethyl acetate and hexane to obtain the product D (yield 61.5%).
塩化ルテニウム(III)（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た(収率６８．２％)。 Ruthenium (III) chloride (2.98 g, 0.01 mol) and 2,2′-bipyridine (3.44 g, 0.022 mol) were refluxed in dimethylformamide (80.0 mL) for 6 hours, and then the solvent was distilled off. Left. Then, acetone was added and the black precipitate obtained by cooling overnight was extract | collected, 170 mL of ethanol aqueous solution (ethanol: water = 1: 1) was added, and it heated and refluxed for 1 hour. After filtration, 20 g of lithium chloride was added, ethanol was distilled off, and the mixture was further cooled overnight. The deposited black substance was collected by suction filtration to obtain a product E (yield 68.2%).
窒素置換した容器に、前記生成物Ｄ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｅ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１．６％）。 To the container purged with nitrogen, 0.50 g (1.35 mmol) of the product D, 0.78 g (1.61 mmol) of the product E, and 50 mL of ethanol were added. After refluxing in a nitrogen atmosphere for 9 hours, the solvent was distilled off, dissolved in distilled water, and precipitated with a 1.0 M aqueous perchloric acid solution. This precipitate was collected and recrystallized from methanol to obtain a product F (yield 81.6%).
さらに、前記生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。 Further, 1.0 g (1.02 mmol) of the product F and 70.0 mL of methanol were refluxed for 1 hour. After cooling to room temperature, 0.21 mL (4.21 mmol) of hydrazine monohydrate was added and refluxed again for 13 hours. After the reaction, 15 mL of distilled water was added and methanol was distilled off.
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。 Next, 5.0 mL of concentrated hydrochloric acid was added, and the reaction solution obtained by refluxing for 2 hours was refrigerated overnight, and impurities were removed by natural filtration.
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た(収率７１．４％)。 After neutralizing this with sodium hydrogen carbonate, water was distilled off and inorganic substances were removed with acetonitrile. The crude product obtained by distilling off the solvent was purified with a silica gel column to obtain the product G (yield 71.4%).
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。 0.65 g (0.76 mmol) of the product G was added to a container protected from light by aluminum foil, and dissolved in 10 mL of acetonitrile. Next, 0.23 g (2.29 mmol) of triethylamine was added, and then 0.87 g (7.62 mmol) of glutaric anhydride dissolved in 20 mL of acetonitrile was added dropwise.
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記（化２）に示すルテニウム錯体を得た(収率８７．５％)。 After the reaction for 9 hours, the crude product obtained by distilling off acetonitrile with an evaporator was purified by high performance liquid chromatography (HPLC) to obtain a ruthenium complex represented by the following (Chemical Formula 2) (yield: 87.5%). .
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６）
σ：
１．４６ （２Ｈ，ｍ）
１．６９ （４Ｈ，ｍ）
２．１０ （４Ｈ，ｍ）
２．５４ （３Ｈ，ｓ）
２．８１ （２Ｈ，ｔ）
３．０８ （２Ｈ，ｍ）
７．４１ （２Ｈ，ｔ）
７．５７ （６Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１９ （１Ｈ，ｔ）
８．７９ （４Ｈ，ｔ）
８．８８ （６Ｈ，ｍ）
次に、オリゴデオキシヌクレオチド７８６μｇ（８３．４ｐｍｏｌ）を蒸留水０．３ｍＬに溶解させ、該オリゴデオキシヌクレオチドの水溶液に、ルテニウム錯体０．５ｍｇ（０．１２μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．５μｍｏｌ）、ＷＳＣ１．４ｍｇ（７．５μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン２．５μＬ（０．２５μｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して式（１）に示す標識プローブを得た（収率７４．１％）。
1 H-NMR (300 MHz, DMSO d-6)
σ:
1.46 (2H, m)
1.69 (4H, m)
2.10 (4H, m)
2.54 (3H, s)
2.81 (2H, t)
3.08 (2H, m)
7.41 (2H, t)
7.57 (6H, m)
7.77 (4H, m)
8.19 (1H, t)
8.79 (4H, t)
8.88 (6H, m)
Next, 786 μg (83.4 pmol) of oligodeoxynucleotide was dissolved in 0.3 mL of distilled water, and 0.5 mg (0.12 μmol) of a ruthenium complex and 0.3 mg of N-hydroxysuccinimide (2) were added to the aqueous solution of the oligodeoxynucleotide. 0.5 μmol), 1.4 mg (7.5 μmol) of WSC, and 2.5 μL (0.25 μmol) of 0.1M triethylamine were added and reacted at room temperature for 2 days. After purification by HPLC, a fraction of the target product was collected, and the solution was distilled off to obtain a labeled probe represented by the formula (1) (yield 74.1%).
（４）ハイブリダイゼーション
前記捕捉プローブを固定した磁気ビーズに、２ＸＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した遺伝子サンプル及び標識プローブをそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、磁石で磁気ビーズを収集後、溶液をデカントし、４０℃に加温した２ＸＳＳＣで洗浄し、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズαを得た。
(4) Hybridization 14 μL of 2XSSC was added to the magnetic beads on which the capture probe was immobilized, and 4 μL of the gene sample and labeled probe prepared to 5 μM were added thereto, and gently shaken at 70 ° C. After shaking for 1 hour, the magnetic beads were collected with a magnet, and then the solution was decanted and washed with 2XSSC heated to 40 ° C. to obtain magnetic beads α on which double-stranded nucleic acids were formed.
なお、非相補的な捕捉プローブを固定した磁気ビーズについても、上記と同様の処理を行い、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβを得た。 The same processing as described above was performed on the magnetic beads on which the non-complementary capture probe was immobilized, thereby obtaining magnetic beads β on which no double-stranded nucleic acids were formed.
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズα及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβに０．２ＭのＰＢＳを１０μＬと０．２Ｍのトリエチルアミンを１０μＬ混合した溶液を加え、懸濁した後、それぞれ５μＬずつ電極に滴下した。
(5) Electrochemical measurement After the above steps, 10 μL of 0.2 M PBS and 0.2 M triethylamine are added to magnetic beads α in which double-stranded nucleic acids are formed and magnetic beads β in which double-stranded nucleic acids are not formed. 10 μL of a mixed solution was added and suspended, and 5 μL each was added dropwise to the electrode.
前記電極には、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを成膜し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを使用した。また、電極の下には永久磁石のシートを取り付けており、作用極のみに磁気ビーズが集約するようにした。 As the electrode, a glass substrate was used in which a gold film of 200 nm was formed on a glass substrate with a sputtering apparatus (SH-350, ULVAC, Inc.), and an electrode pattern was formed by a photolithography process. In addition, a permanent magnet sheet is attached under the electrode so that the magnetic beads are concentrated only on the working electrode.
５分静置後、前記磁気ビーズα、βが集約した電極ｘα、ｙβそれぞれに、電解液を７５μＬ滴下した。 After standing for 5 minutes, 75 μL of an electrolytic solution was dropped on each of the electrodes xα and yβ where the magnetic beads α and β were aggregated.
ここで、前記電解液には、０．２ＭのＰＢＳを５００μＬ、０．２Ｍのトリエチルアミンを５００μＬ混合した溶液に、さらに導電性微粒子として金コロイド（フナコシ株式会社製ＥＭＧＣ２０、粒径２０ｎｍ、５２０ｎｍの光学濃度１．０）を１００μＬ添加して調整した電解液Ａを使用した。 Here, in the electrolytic solution, a solution prepared by mixing 500 μL of 0.2 M PBS and 500 μL of 0.2 M triethylamine, and further gold colloid (EMGC20 manufactured by Funakoshi Co., Ltd., optical diameter of 20 nm, 520 nm) as conductive fine particles. An electrolytic solution A prepared by adding 100 μL of a concentration 1.0) was used.
また、導電性微粒子の添加効果を明らかにするための比較対象として、０．２ＭのＰＢＳを５００μＬ、０．２Ｍのトリエチルアミンを５００μＬ混合しただけの金コロイドを添加しない電解液Ｂも調整し使用した。 In addition, as a comparative object for clarifying the effect of adding conductive fine particles, an electrolytic solution B in which 500 μL of 0.2 M PBS was mixed and 500 μL of 0.2 M triethylamine was added and no gold colloid was added was also used. .
その後、それぞれの電極ｘα、ｙβに電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。 Thereafter, voltages were applied to the respective electrodes xα and yβ, and the electrochemiluminescence generated at this time was measured. The voltage was applied by scanning from 0 V to 1.3 V and performing electrochemical measurement for 3 seconds. The electrochemiluminescence amount was measured using a photomultiplier tube (H7360-01 manufactured by Hamamatsu Photonics), and the maximum luminescence amount during voltage scanning was measured.
図１は、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズの電極ｘα、及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズの電極ｙβにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。 FIG. 1 shows the maximum amount of electrochemiluminescence detected at an electrode xα of a magnetic bead on which a double-stranded nucleic acid is formed and an electrode yβ of a magnetic bead on which no double-stranded nucleic acid is formed.
図１から、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズ電極ｘαでの発光量は、電解液Ａの方が高くなっており、金コロイドの添加により発光量が増加していることが分かる。また、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズ電極ｙβでの発光量は、電解液Ａおよび電解液Ｂの間に差異はなく、金コロイドの添加によるバックグラウンドノイズの変化はないことも分かる。 FIG. 1 shows that the amount of light emitted from the magnetic bead electrode xα on which the double-stranded nucleic acid is formed is higher in the electrolytic solution A, and the amount of light emitted is increased by the addition of gold colloid. In addition, the amount of light emitted from the magnetic bead electrode yβ in which no double-stranded nucleic acid is formed is not different between the electrolytic solution A and the electrolytic solution B, and it can be seen that there is no change in background noise due to the addition of gold colloid. .
したがって、金コロイドの添加により、バックグラウンドノイズを増加させることなく、発光量のみを増加させることができ、高感度に二本鎖核酸、すなわち目的遺伝子サンプルを検出できることがわかる。 Therefore, it can be seen that the addition of colloidal gold can increase only the amount of luminescence without increasing background noise, and can detect a double-stranded nucleic acid, that is, a target gene sample with high sensitivity.
本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。 The gene detection method according to the present invention can detect a gene having a specific sequence with high sensitivity, and can be applied to uses such as gene diagnosis, infectious disease diagnosis, and genome drug discovery.
Claims (8)
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
電気化学的に活性である物質で標識された、前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製する標識プローブ作製工程と、
前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを磁気ビーズに固定化する磁気ビーズ作製工程と、
前記磁気ビーズに固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識プローブ、及び検出すべき遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた複合体を形成する複合体形成工程と、
前記複合体を磁力により収集し、ハイブリダイズしなかった遺伝子サンプルおよび標識プローブを除去する洗浄工程と、
収集した前記磁気ビーズを導電性微粒子が添加された電解液とともに電極上に展開し、前記複合体中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含む遺伝子検出方法。 A gene detection method for detecting a gene having a specific sequence,
A gene sample preparation step of degenerating the gene to be detected into a single strand to prepare a gene sample;
A labeled probe production step for producing a single-stranded labeled probe labeled with an electrochemically active substance and having a base sequence complementary to a partial gene sequence of the gene sample;
A single-stranded capture probe having a base sequence complementary to a partial gene sequence of the gene sample and having a base sequence different from the labeled probe is prepared, and the capture probe is immobilized on a magnetic bead. A bead manufacturing process;
A complex formation step of forming a complex in which a single-stranded capture probe fixed to the magnetic beads, the labeled probe, and a gene sample to be detected are hybridized;
A washing step of collecting the complex by magnetic force and removing unhybridized gene samples and labeled probes;
Detecting the collected magnetic beads on an electrode together with an electrolytic solution to which conductive fine particles have been added, and detecting the electrochemically active substance in the complex by electrochemical measurement; A gene detection method comprising:
前記導電性微粒子は、前記電気化学的に活性である物質を、酸化還元可能な物質である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 The gene detection method according to claim 1,
The conductive fine particles are substances that can oxidize and reduce the electrochemically active substance.
A gene detection method characterized by the above.
前記導電性微粒子は、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン、カーボンから選ばれる微粒子である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 The gene detection method according to claim 2,
The conductive fine particles are fine particles selected from gold, platinum, silver, palladium, rhodium, iridium, tungsten, and carbon.
A gene detection method characterized by the above.
前記導電性微粒子の粒径が、前記磁気ビーズの粒径以下である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 The gene detection method according to claim 1,
The conductive fine particles have a particle size equal to or smaller than the magnetic beads.
A gene detection method characterized by the above.
前記導電性微粒子の粒径が、１ｎｍ〜５μｍである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 The gene detection method according to claim 4,
The conductive fine particles have a particle size of 1 nm to 5 μm.
A gene detection method characterized by the above.
前記導電性微粒子の粒径が、１ｎｍ〜３００ｎｍである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 In the gene detection method of Claim 5,
The conductive fine particles have a particle size of 1 nm to 300 nm.
A gene detection method characterized by the above.
前記導電性微粒子を添加した前記電解液の吸収極大波長における前記導電性微粒子を添加した前記電解液の光学濃度が、０．０００１〜１である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 The gene detection method according to claim 1,
The optical density of the electrolytic solution to which the conductive fine particles are added at the absorption maximum wavelength of the electrolytic solution to which the conductive fine particles are added is 0.0001 to 1.
A gene detection method characterized by the above.
前記導電性微粒子を添加した前記電解液の吸収極大波長における前記導電性微粒子を添加した前記電解液の光学濃度が、０．０１〜０．３である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 The gene detection method according to claim 7, wherein
The optical density of the electrolytic solution to which the conductive fine particles are added at the absorption maximum wavelength of the electrolytic solution to which the conductive fine particles are added is 0.01 to 0.3.
A gene detection method characterized by the above.
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