JPH06509707A - Polynucleotide confirmation method using selectable cleavage sites - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 選択可、な「裂部位を　いるポリヌクレオチド確認１人立旦 本発明は、オリゴヌクレオチド配列への選択可能開裂部位の組み込み一般に関し 、そしてより詳細には、オリゴヌクレオチド鎖内への過ヨウ素酸で開裂し得る結 合の導入に有用な、新規な試薬類に関する。本発明はまた、この新規な試薬類を 生化学的アッセイに使用する方法に関する。[Detailed description of the invention] Selectable, 1 person standing to confirm polynucleotide containing a cleavage site The present invention relates generally to the incorporation of selectable cleavage sites into oligonucleotide sequences. , and more specifically, the introduction of a periodate-cleavable linkage into the oligonucleotide chain. This invention relates to novel reagents useful for the introduction of chemical reactions. The present invention also utilizes this new class of reagents. Concerning methods for use in biochemical assays.

オリゴヌクレオチド配列を自由に合成し、そして、合成的方法で調製された、ま たは、天然のソースから得られたポリヌクレオチド配列をクローニングし得るこ とで、染色体（単数あるいは複数）、配列の混合物、ｍＲＮＡ等の伸張したオリ ゴヌクレオチド配列中の特定の配列の存在を検出する機会が著しく拡大しつつあ る。以下は僅か数例の代表例に過ぎないが、興味深い特定の配列には、病原体の 存在の診断、対立遺伝子の存在の確認、宿主ゲノム中の損傷の存在、特定の＋ｎ ＲＮＡの検出または細胞宿主の修飾のモニタリング、が含まれ得る。試料中の種 々の抗原の存在を診断するアッセイを行なうための抗体の使用は、ラジオイムノ ア、セイの出現以降、技法およびプロトコールの面で爆発的拡大が見られるが、 つい最近まで、ＤＮＡプローブの領域では同様の拡大はなかった。従って、配列 の検出法の殆どは、ポリヌクレオチド配列を支持体に結合する必要があり、そし て放射標識したプローブを使用する種々のハイブリダイゼーション技術を含んで いる。Oligonucleotide sequences can be freely synthesized and prepared by synthetic methods. Alternatively, polynucleotide sequences obtained from natural sources can be cloned. , and can contain extended ori- gins such as chromosome(s), mixtures of sequences, mRNA, etc. Opportunities to detect the presence of specific sequences in oligonucleotide sequences are expanding significantly. Ru. The following are just a few representative examples, but some interesting specific sequences include diagnosis of the presence, confirmation of the presence of alleles, presence of lesions in the host genome, specific +n Detection of RNA or monitoring of cellular host modifications may be included. species in the sample The use of antibodies to perform diagnostic assays for the presence of various antigens is Since the advent of A.S., there has been an explosive expansion in techniques and protocols. Until recently, there was no similar expansion in the area of DNA probes. Therefore, the array Most of the detection methods require binding the polynucleotide sequence to a support and including various hybridization techniques using radiolabeled probes. There is.

経済的方法で大量のオリゴヌクレオチド配列を製造する能力の同上を背景に、研 究者らの関心は、特定のオリゴヌクレオチド配列の検出のための、単純、正確か つ効果的な技術の提供に向けられている。これら技術は、迅速で、技術者がエラ ーを犯す機会を最小にし、自動化が可能で、そして、単純かつ正確な検出方法を 考慮していることが望ましい。この目的のために、ラジオアイソトープ以外の標 識でオリゴヌクレオチドプローブを標識する手段の提供、および、ゲルから支持 体へのＤＮＡ配列の転写の正確さの向上、および、標識の結合を考慮した誘導体 化オリゴヌクレオチドのための改善された方法を提供するために、すでに努力が なされている。多様なソースに由来し得るＤＮＡを用いる種々の状況でも、対象 のＤＮＡ配列をフレキ／プルに検出し得る新しいプロトコールの提供に対する必 要性は存続している。Given the above-mentioned ability to produce large quantities of oligonucleotide sequences in an economical manner, research Researchers are interested in simple and accurate methods for detecting specific oligonucleotide sequences. The aim is to provide effective technology. These techniques are quick and allow technicians to eliminate errors. Detection method that minimizes the chance of fraud, can be automated, and is simple and accurate. It is desirable to take this into account. For this purpose, markers other than radioisotopes may be used. Providing a means for labeling oligonucleotide probes with a molecular weight and supporting them from gels Derivatives designed to improve the accuracy of transcription of DNA sequences into the body and the binding of labels Efforts have already been made to provide improved methods for conjugated oligonucleotides. being done. Even in a variety of situations using DNA that can come from a variety of sources, There is a need to provide a new protocol that can detect DNA sequences in a flexible/pull manner. The necessity remains.

笈え隨良五旦！ ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８４ ）　１３８：２６７−２８４は、ハイブリダイゼーション技術の優れた総説であ る。Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９ ８３）　８０：４０４５−４０４９は、特定のオリゴヌクレオチド配列の検出の ための、アビジン−酵素複合体と組み合わせたビオチン化ＤＮＡの使用を記載し ている。Let's go! Meinkoth and Wahl, Anal, Biochemistr (1984 ) 138:267-284 is an excellent review of hybridization techniques. Ru. Leary et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA (19 83) 80:4045-4049 for the detection of specific oligonucleotide sequences. describes the use of biotinylated DNA in combination with an avidin-enzyme complex for ing.

Ｒａｎｋｉら、Ｇｅｎｅ日９８３）２１　ニア７−８５は、オリゴヌクレオチド 配列の検出のための、彼等が「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションと呼ぶ技 術を記載している。ＰｆｅｕｆｆｅｒとＩｌｌｅｌｍｒｉｅｈ、　Ｊ。Ranki et al., Gene day 983) 21 Nia 7-85 is an oligonucleotide A technique they call "sandwich" hybridization for sequence detection. The technique is described. Pfeuffer and Illelmrieh, J.

ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９７５）　２５０：８６７−８７６は、セフ ァロース４Ｂへのグアノシン−５’−０−（３−チオトリホスフェート）のカッ プリングを記載している。Ｂａｕｍａｎら、Ｊ、　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｅｈｅｍ、 　ａｎｄ　Ｃｔｏｅ■ｒｎ、（１９８１）　２９：２２７−２３７は、蛍光を用 いるＲＮＡの３°末端の標識化を記載している。ＰＣＴ出願Ｎｏ／８３０２２７ ７号は、標識用の改変りボヌクレオチドのＤＮＡフラグメントへの付加および、 このようなりＮＡフラグメントを分析する方法を記載している。ＲｅｎｚとＫｕ ｒｚＳＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＜１９８４）　１２：３４３５−３４ ４４は、オリゴヌクレオチドに酵素を共有結合させる方法を記載している。Ｗａ ｌｌａｃｅ、　ＤＮＡ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｏ ｏ、　Ｓ、ｉｆ集）ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉ ｄａは、診断のためのプローブの使用に関する一般的背景を提供している。Ｃｈ ｏｕとＭｅｒｉｇａｎ、　Ｌ」工ＬＪ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、（１９８３）　３０８ ：９２１−９２５は、ＣＭＶの検出用の、ラジオアイソトープ標識化プローブの 使用を記載している。Ｉｎｍａｎ。of Biol, Chem, (1975) 250:867-876 Guanosine-5'-0-(3-thiotriphosphate) to allose 4B Pulling is described. Bauman et al., J. of Histohem, and Ctoe rn, (1981) 29:227-237 used fluorescence. Labeling of the 3° end of RNA is described. PCT Application No./830227 No. 7 involves the addition of modified bonucleotides for labeling to DNA fragments, and A method for analyzing such NA fragments is described. Renz and Ku rzSNucl, Ac1ds Res, <1984) 12:3435-34 44 describes a method for covalently linking enzymes to oligonucleotides. Wa llace, DNA Recombinant Technology (Wo o, S, if collection) CRC Press, Boca Raton, Flori da provides general background on the use of probes for diagnosis. Ch ou and Merigan, LJ, of Med, (1983) 308 :921-925 are radioisotope-labeled probes for detection of CMV. Use is described. Inman.

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４Ｂ、２４　（１９７４）　３０ −５９は、ポリアクリルアミドへの結合のための手順を記載し、一方、Ｐａｒｉ ｋｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ−ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４Ｂ、２４　（１９７４ ）　７７−１０２は、アガロースとの力、ブリング反応を記載している。Ａｌｗ ｉｎｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７７）　 ７４：５３５０−５３５４は、／１イブリダイゼーションのための、ゲルから固 相支持体へのオリゴヌクレオチドの転写方法を記載している。Ｃｈｕら、Ｎｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　＜１９８３）　１１：６５１３−６５２９は、末 端のヌクレオチドの誘導体化技術を記載している。ＨＯら、肛匹お１旺ｒｌ（１ ９８１）垣：６４−６７は、リン酸を付してエステルを形成する末端のヌクレオ チドの誘導体化を記載している。Ａｓｈ　ｌｅｙとＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ａｎａ ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅしく１９８４）　１４０：９５−１０３は、表面に結合した テンプレート力）らプローブを調製する方法を報告している。これらの技術を記 載したこれら参考文献を、標識化オリゴヌクレオチドの調製方法を支持する記載 として、本明細書に援用する。Methods in Enzymol, 34B, 24 (1974) 30 -59 describes a procedure for coupling to polyacrylamide, while Pari kh et al., Methods-in Enzymol, 34B, 24 (1974 ) 77-102 describes a force, bling reaction with agarose. Alw ine et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA (1977) 74:5350-5354 from gel to solid for /1 hybridization. A method for transferring oligonucleotides to a phase support is described. Chu et al., Nuc l, Ac1ds Res, <1983) 11:6513-6529. A technique for derivatizing terminal nucleotides is described. HO et al. 981) Kaki: 64-67 are terminal nucleosides that are attached with phosphoric acid to form esters. The derivatization of tide is described. Ash ley and MacDonald, Ana Biochem Biol. 1984) 140:95-103 bound to the surface. have reported a method for preparing probes. Write down these techniques. Use these references as supporting descriptions of the method for preparing labeled oligonucleotides. This is incorporated herein by reference.

免凭旦且丞 固相支持体、少なくとも一種類の標識、および試料と標識化プローブが関与する ハイブリダイゼーションを使用する、特定のヌクレオチド配列を検出するための 方法力（提供される。Sorry to disappoint Involves a solid support, at least one label, and a sample and a labeled probe for detecting specific nucleotide sequences using hybridization Method power (provided.

この方法では、二本鎖形成の存在または不在は、支持体と標識〈単数あるいは複 数の）との間の空間的関係を改変する能力に変換される。この技術の例は、標識 化プローブと試料ＤＮＡとの二本鎖形成を介して、標識と支持体の間（こ開裂部 位を提供することである。この状態では、二本鎖は、支持体（こ結合している。In this method, the presence or absence of duplex formation is determined by the presence or absence of a support and a label. translated into the ability to modify the spatial relationship between (of numbers). An example of this technique is the sign Through the formation of double strands between the conjugated probe and the sample DNA, a link between the label and the support (this cleavage site The purpose is to provide a position. In this state, the duplex is attached to the support.

次に、この開裂部位を切断すると、支持体と標識（単数あるいは複数の）が分離 される。次いで、標識の存在また（ま不在の検出は、通常の技術に従って、行な い得る。This cleavage site is then cut, separating the support and label(s). be done. Detection of the presence or absence of the label is then carried out according to conventional techniques. I can.

従来技術に対する本発明の主要な利点は、本方法カダ、標識が特異的に結合して いるかあるいは非特異的に結合して−Ａるのかの区別を可能にすることである。The major advantages of the present invention over the prior art are that the method The objective is to make it possible to distinguish whether -A is present or non-specifically bound to -A.

即ぢ、従来の技術では、標識は一般に、固相支持体上で検出されていた。即ち、 試料を支持体に付着させ、そして、相補的な標識化プローブと接触させ；次いで 、二本鎖形成を、支持体上でアッセイしていた。この方法の問題点は、被分析物 が存在しない場合にも標識が支持体と結合する可能性があり、実際に結合するこ とである。この標識の支持体への直接の結合を、本明細書中では「非特異結合」 と呼ふ。任意の有意な量の非特異結合が生じた場合、被分析物の存在に拘らず支 持体上で標識が検出され、偽陽性の結果が出る。Thus, in prior art, labels were generally detected on solid supports. That is, attaching the sample to a support and contacting with a complementary labeled probe; then , duplex formation was assayed on the support. The problem with this method is that the analyte Labels can bind to the support even in the absence of That is. This direct binding of the label to the support is herein referred to as "non-specific binding". It's called. If any significant amount of non-specific binding occurs, it will be supported regardless of the presence of analyte. The label is detected on the support, giving a false positive result.

対照的に本発明では、対象被分析物が存在する場合にのみ標識が検出される。即 ち「特異的」結合のみが検出される。In contrast, in the present invention, the label is detected only if the analyte of interest is present. Immediately Thus, only "specific" binding is detected.

好ましい実施態様では、試料と一種またはそれ以上のプローブ間とから形成され た二本鎖を介して支持体と選択された標識との間に開裂部位を導入することが実 施される。この開裂部位は、米国特許第４．７７５．６１９号（上記に引用し参 考文献として援用する）に記載された制限エンドヌクレアーゼ開裂部位であり得 、または、例えば、本願の親出願である米国出願番号０７７２５１、１５２号に 記載された、多くの種類の化学的開裂部位の一つであり得る。In a preferred embodiment, the probe is formed between the sample and one or more probes. It is possible to introduce a cleavage site between the support and the selected label via the stranded duplex. administered. This cleavage site is described in U.S. Pat. No. 4.775.619 (cited above). may be the restriction endonuclease cleavage site described in or, for example, in U.S. Application No. 077251,152, the parent application of this application. It can be one of the many types of chemical cleavage sites described.

本出願は、新しいクラスの化学的開裂部位に関する。これらの開裂部位は、ハイ ブリダイゼーションアッセイに用いられる条件および試薬類に対しては極めて安 定であるが、開裂が要求される場合には、過ヨウ素酸イオンにより容易に開裂で きる。本発明はまた、この開裂部位を含むポリヌクレオチド試薬類、および、ポ リヌクレオチド合成に有用な試薬類、即ち、開裂部位を含み、そして、容易にポ リヌクレオチド鎖に組み込まれ得る単量体の試薬類にも関する。これらの種々の 試薬類は、容易に高い収率で合成され、そして、開裂部位自身と同様に種々の条 件下で非常に安定である。This application relates to a new class of chemical cleavage sites. These cleavage sites are The conditions and reagents used in hybridization assays are extremely safe. However, if cleavage is required, it can be easily cleaved by periodate ion. Wear. The invention also provides polynucleotide reagents and polynucleotides containing this cleavage site. Reagents useful in polynucleotide synthesis, i.e., contain cleavage sites and are easily It also relates to monomeric reagents that can be incorporated into polynucleotide chains. These various The reagents are easily synthesized in high yields and are compatible with various conditions as well as the cleavage site itself. It is very stable under conditions.

乳ｌ然見！呈笠訓 図１は、固相支持体に特異結合および非特異結合した標識の相違を説明している 。I can see the milk! Presentation Kasakun Figure 1 illustrates the differences between specifically and non-specifically bound labels to a solid support. .

図２Ａから２Ｄは、本発明の好ましい方法を模式的に説明している。ここで選択 的な開裂部位は、被分析物／プローブ複合体を介して支持体と標識の間に導入さ れる。Figures 2A to 2D schematically illustrate a preferred method of the invention. select here A cleavage site is introduced between the support and the label via the analyte/probe complex. It will be done.

今日を＝　するための形態 本発明の方法および試薬を詳細に記載する前に、本発明が本明細書に記載の特定 のプロトコールまたは物質は当然に変化し得るので、これらに限定されないこと は、理解されるべきことである。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様 を記述する目的にのみ使用され、そして、限定を意図しないこともまた、理解さ れるべきである。Form for today = Before describing the methods and reagents of the invention in detail, it is important to note that the invention protocols or materials may of course vary and are not limited to should be understood. Terms used herein refer to specific embodiments. It is also understood that the Should be.

本明細書中および添付した請求の範囲中で使用する限り、単数形冠詞であるｒａ Ｊ、ｒａｎＪおよび「ｔｈｅＪを付けられた名詞は、その内容が明らかにそうで ないと示さない限り、複数である対象名詞をも包むことを、特記する。従って、 「３ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ（開裂部位〉」という用語は、２つまたはそれ 以上の開裂部位をも包含する。「ａｌａｂｅｌ（標識）」という用語は、２つま たはそれ以上の標識をも包含する、等である。As used in this specification and the appended claims, the singular article ra J, ranJ, and the nouns suffixed with the J are clearly Note that it also covers plural subject nouns, unless indicated otherwise. Therefore, The term "cleavage site" refers to two or more The above cleavage sites are also included. The term "label" has two meanings: or even more labels.

本発明の記述および権利請求では以下に記述した定義に従って、以下の用語が使 用される。In the description of this invention and claims, the following terms are used in accordance with the definitions set forth below. used.

「アルキル」は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ− ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデ シル、エイコシル、テトラデシル等の、１から２４個の炭素原子を有する、分枝 状または分枝状でない飽和炭化水素基を指す。　「低級アルキル」は、１から８ 個の、より好ましくは１から６個の、炭素原子を有するアルキル基を指し、従っ て例えば、メチル、エチル、プロピル、「アルケニル」は、例えば、エチニル、 １−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−インブテニル、オクテニ ル、デセニル、テトラデセニル、Δ８・目−へブタデカジェニル、ヘキサデセニ ル、エイコセニル、テトラデシル等の様な、２から２４個の炭素原子、および、 １つまたはそれ以上の不飽和の炭素−炭素結合を有する分枝状または分枝状でな い不飽和炭化水素基を指す。　「低級アルケニル」は、２から８個の、より好ま しくは２から６個の、炭素原子のアルケニル基を指し、従って例エバ、エチニル 、１−プロペニル、２−プロペニル、１−フチニル、２−インブテニルおよびオ クテニルを含む。"Alkyl" is, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n- Butyl, isobutyl, t-butyl, octyl, decyl, tetradecyl, hexade Branched, having from 1 to 24 carbon atoms, such as syl, eicosyl, tetradecyl, etc. Refers to a saturated hydrocarbon group that is not shaped or branched. "Lower alkyl" is 1 to 8 refers to an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms; For example, methyl, ethyl, propyl, "alkenyl" means, for example, ethynyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-inbutenyl, octenyl ru, decenyl, tetradecenyl, Δ8-hebutadecagenyl, hexadecenyl from 2 to 24 carbon atoms, such as ole, eicosenyl, tetradecyl, etc., and Branched or unbranched with one or more unsaturated carbon-carbon bonds Refers to unsaturated hydrocarbon groups. "Lower alkenyl" is 2 to 8, more preferably or an alkenyl group of 2 to 6 carbon atoms, thus e.g. , 1-propenyl, 2-propenyl, 1-phthynyl, 2-inbutenyl and Contains ctenyl.

「アルキレン」は、１から６個の炭素原子を含む二官能性の飽和した分枝状また は分枝状でない炭化水素鎖を指し、そして、例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、 エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＴｏ−） 、２−メチルプロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、ヘキシレン （−（ＣＨ２）８−）等を含む。"Alkylene" means a difunctional saturated branched or refers to an unbranched hydrocarbon chain, and includes, for example, methylene (-CH2-), Ethylene (-CH2-CH2-), Propylene (-CH2-CH2-CTo-) , 2-methylpropylene (-CH2-CH(CH3)-CH2-), hexylene (-(CH2)8-) etc.

「アルケニレン」は、例えば、１，３−プロピル−１−エン、１，４−ブト−２ −４ニレン、１．５−ベント−２−エニレン、オヨヒ１，６−ヘキサー３−エニ レンの様な、２から２４個の炭素原子、および１つまたはそれ以上の不飽和の炭 素−炭素結合の二官能性で、分枝状または分枝状でない不飽和炭化水素基を指す 。"Alkenylene" includes, for example, 1,3-propyl-1-ene, 1,4-but-2 -4nylene, 1,5-bent-2-enylene, oyohi 1,6-hexar-3-enylene 2 to 24 carbon atoms and one or more unsaturated carbons, such as A difunctional element-carbon bond that refers to a branched or unbranched unsaturated hydrocarbon group. .

「アリール」は、フェニルまたは１−または２−ナフチル基を指す。これらの基 は、随意に、１から３個の、好ましくは１から２個の、低級アルキル、低級アル コキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、および／またはメルカプト置換基で置換 される。"Aryl" refers to phenyl or 1- or 2-naphthyl groups. These groups optionally 1 to 3, preferably 1 to 2, lower alkyl, lower alkyl Substituted with koxy, hydroxy, amino, nitro, and/or mercapto substituents be done.

「アリールアルキレン」は、本明細書で定義されたアルキレン基の一方の末端に 結合された、本明細書で定義された了り−ル基を指す。"Arylalkylene" means at one end of an alkylene group as defined herein. Refers to an attached aryol group as defined herein.

「シクロアルキル」は、３から８個の炭素原子を有する、飽和炭化水素環基を指 し、そして例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへ ブチル、ンクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、シクロオクチル、等を含む。"Cycloalkyl" refers to a saturated hydrocarbon ring group having from 3 to 8 carbon atoms. and, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclo Includes butyl, cyclohexyl, methylcyclohexyl, cyclooctyl, etc.

「シクロアルキレン」は、本明細書で定義されたアルキレン基の一方の末端に結 合した、本明細書で定義されたシクロアルキル基を含む飽和炭化水素を指す。こ の用語は、例えば、シクロへキンルメチレン、シクロプロピルメチレン、シクロ ブチルエチレン、６−シクロオクチルヘキンレン等を含む。"Cycloalkylene" means attached to one end of an alkylene group as defined herein. refers to a saturated hydrocarbon containing a cycloalkyl group as defined herein. child The terms include, for example, cyclohexyl methylene, cyclopropyl methylene, cyclo Contains butyl ethylene, 6-cyclooctylhekylene, etc.

「シクロオキシアルキレン」は、１つまたはそれ以上のエーテル酸素原子を含む 、本明細書で定義されたシクロアルキレン基を指す。"Cyclooxyalkylene" contains one or more ether oxygen atoms , refers to a cycloalkylene group as defined herein.

本発明は、ハイブリダイゼーションを使用する特異的配列の検出を含み、これに より、試料ＤＮＡとプローブとの二本鎖形成が、標識と支持体との空間的関係を 改変する能力に影響を及ぼす。この様にして、試料中の特定の配列の存在または 不在が、媒質中に遊離した標識の量により、容易に測定し得る。The invention involves the detection of specific sequences using hybridization; Therefore, the double strand formation between the sample DNA and the probe changes the spatial relationship between the label and the support. Affects the ability to modify. In this way, the presence of a particular sequence in a sample or Absence can be easily determined by the amount of label released into the medium.

本発明の方法は、核酸試料が支持体に結合している場合、あるいは溶液中に遊離 して存在している場合も考慮して、プロトコールおよび試薬を変え得る。好まし い実施態様では、酸の二本鎖の形成を含み、その結果、選択的な開裂を与える条 件下で放出された標識の量が、核酸試料中の対象の配列の存在および量の尺度と なる。選択可能な開裂部位は、ホモ二本鎖形成による制限酵素認識部位の形成の 結果として生じ得る、または、一本鎖ボソヌクレオチド鎖中のこの様な選択可能 な開裂部位の存在は、一本鎖中へこの様な部位を予め導入した結果であり得る。The method of the present invention can be used when the nucleic acid sample is bound to a support or free in solution. Protocols and reagents may be modified to take into account the presence of such substances. preferred In a preferred embodiment, the conditions include the formation of an acid duplex and result in selective cleavage. The amount of label released under the conditions is a measure of the presence and amount of the sequence of interest in the nucleic acid sample. Become. Selectable cleavage sites allow for the formation of restriction enzyme recognition sites through homoduplex formation. or such selectable in a single-stranded bosonucleotide chain. The presence of such cleavage sites may be the result of the prior introduction of such sites into the single strand.

対象のオリゴヌクレオチド配列を有し、核酸被分析物にハイブリダイズするポリ ヌクレオチドを含む試薬が使用される。A polynucleotide that has an oligonucleotide sequence of interest and hybridizes to a nucleic acid analyte. Reagents containing nucleotides are used.

この試薬は、本明細書中では、場合により、「捕捉プローブ」と呼ばれ、本方法 では、選択した固相支持体に結合されている。標識化プローブもまた使用され、 これには対象の配列が含まれても含まれなくてもよい。This reagent is sometimes referred to herein as a "capture probe" and is is attached to a solid support of choice. Labeled probes are also used, This may or may not include the target array.

第１の好ましい実施態様では、本発明の方法は、ハイブリグイゼーンフン溶媒中 でのポリヌクレオチド二本鎖の形成を含み、選択可能な開裂部位を介して、標識 が支持体と結合する。試料ＤＮＡが支持体に結合している、または溶液中に分散 している状況の種々のプロトコールが、使用され得る。In a first preferred embodiment, the method of the invention comprises hybridizing labeling via a selectable cleavage site, including the formation of a polynucleotide duplex at is bonded to the support. Sample DNA is bound to a support or dispersed in solution A variety of protocols can be used depending on the situation.

関連する種々のヌクレオチド配列を区別するために、以下の用語を使用する： 核酸試料一対象のオリゴヌクレオチド配列を有する核酸配列の含有が考えられる 試料； 核酸被分析物一対象のオリゴヌクレオチド配列を宵する前記核酸前記試料中のＤ ＮＡまたはＲＮＡ；対象のオリゴヌクレオチド配列−一般には、少なくとも６塩 基、より一般には少なくとも約１０塩基、好ましくは少なくとも約１６塩基、５ 　ｋｂかそれ以上でもあり得るが、通常は０．２ｋｂ以上ではない、ヌクレオチ ド鎖の全部または一部のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列であり、遺伝上の特徴、病原 体、等の診断に役立つ遺伝子または配列の特徴である、検出されるべき診断上の 性質を示す； ポリヌクレオチド配列一対象のオリゴヌクレオチド配列の検出用の試薬として用 いられるＤＮＡまたはＲＮＡ配列であって、このポリヌクレオチド配列は、標識 されていてもされていなくてもよく、支持体に結合していてもしなくてもよく、 そして、対象のオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含んでも含まなくても よい。単独で、または核酸被分析物と結合させると、標識と支持体との間の選択 可能な開裂部位とを宵し、標識と支持体の間の架橋として機能する、１つまたは ２つのポリヌクレオチドの配列も存在する；および選択可能な開裂部位−過ヨウ 素酸で、選択的に開裂し得る単一あるいは複数の官能基。The following terminology is used to distinguish between various related nucleotide sequences: A nucleic acid sample may contain a nucleic acid sequence having an oligonucleotide sequence of interest. sample; a nucleic acid analyte in which said nucleic acid analyte contains an oligonucleotide sequence of interest in said sample; NA or RNA; oligonucleotide sequence of interest - generally at least 6 salts groups, more generally at least about 10 bases, preferably at least about 16 bases, 5 Nucleotides that are usually no larger than 0.2 kb, although they can be kb or larger The DNA or RNA sequence of all or part of the DNA strand, which is associated with genetic characteristics and pathogenesis. A diagnostic feature to be detected, which is a characteristic of a gene or sequence that is useful for diagnosing a body, etc. showing properties; Used as a reagent for the detection of oligonucleotide sequences relative to polynucleotide sequences a DNA or RNA sequence containing a label, the polynucleotide sequence may or may not be bonded to a support, and whether or not it contains a complementary sequence to the target oligonucleotide sequence. good. Choice between labels and supports, alone or in conjunction with nucleic acid analytes one or more possible cleavage sites and act as a bridge between the label and the support. There are also two polynucleotide sequences; and a selectable cleavage site - Single or multiple functional groups that can be selectively cleaved with basic acids.

記載の便宜上、選択可能な開裂部位が創出された本発明の好ましい実施態様は、 ４つの主要な副次的実施態様に分割される。これらの第１番目（図２Ａ参照）で は、使用する試薬は、単一の構成要素で、試薬は、一方の末端近傍で支持体と結 合し、そして反対の末端近傍で１つまたはそれ以上の検出し得る標識と結合する ポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、支持体と標識の中間に開裂 可能な部位を含む。For convenience of description, preferred embodiments of the invention in which selectable cleavage sites are created include: Divided into four main sub-embodiments. In the first of these (see Figure 2A) The reagent used is a single component, and the reagent is bound to the support near one end. and one or more detectable labels near the opposite end. It is a polynucleotide. This polynucleotide is cleaved between the support and the label. Contains possible parts.

第２の場合（図２Ｂ参照）では、使用する試薬は、核酸試料が支持体に結合する か否かで、変更し得る２つの構成要素を有する。核酸試料が支持体に結合する場 合、２つの構成要素は、（１）架橋用ポリヌクレオチド配列、および（２）架橋 用ポリヌクレオチド配列の一部と相補的でハイブリダイズするポリヌクレオチド 配列である。この相補的ポリヌクレオチド配列は、標識されている。この架橋用 ポリヌクレオチド配列は、相補的配列と二本鎖を形成する配列を有すると同時に 、対象のオリゴヌクレオチド配列と二本鎖を形成する領域を有する。In the second case (see Figure 2B), the reagents used are such that the nucleic acid sample binds to the support. It has two components that can be changed depending on whether or not it is. When a nucleic acid sample binds to a support In this case, the two components are (1) a bridging polynucleotide sequence, and (2) a bridging polynucleotide sequence. a polynucleotide that is complementary to and hybridizes with a portion of a polynucleotide sequence for use in It is an array. This complementary polynucleotide sequence is labeled. For this crosslinking A polynucleotide sequence has a sequence that forms a double strand with a complementary sequence and at the same time , has a region that forms a double strand with the oligonucleotide sequence of interest.

試料核酸が溶液中に存在する場合には、この２つの構成要素は、（１）対象のオ リゴヌクレオチド配列を定義し得るかどうかには関係はないが、核酸被分析物中 に存在する配列と相補的な領域を有し、支持体と結合させた箪−のポリヌクレオ チド；および、（２）対象オリゴヌクレオチド配列を定義し得るかどうかに関し ては、第一のポリヌクレオチド配列と同じ定義を有し、核酸被分析物中に存在す る配列と相補的領域である、標識化第二ポリヌクレオチド配列。少な（とも二本 鎖化した領域の少なくとも一つは、対象の配列を明らかに示している。When the sample nucleic acid is in solution, these two components: (1) Regardless of whether the oligonucleotide sequence can be defined, A polynucleosome of a type that has a region complementary to a sequence present in the polynucleotide and is bound to a support. and (2) whether the oligonucleotide sequence of interest can be defined. has the same definition as the first polynucleotide sequence and is present in the nucleic acid analyte. a labeled second polynucleotide sequence that is complementary to the sequence; Few (tomo two) At least one of the stranded regions clearly indicates the sequence of interest.

第一または第二ポリヌクレオチド配列のいずれかは、選択可能な開裂部位を含む 。Either the first or second polynucleotide sequence contains a selectable cleavage site .

第３の場合（図２Ｃ参照）では、被分析物が支持体に結合され、そして使用する 試薬が、対象のオリゴヌレオチド配列と相補的な領域を有し、選択可能な開裂部 位を含む、単独の構成要素である。In the third case (see Figure 2C), the analyte is bound to the support and used The reagent has a complementary region to the oligonucleotide sequence of interest and a selectable cleavage site. It is a single component, including positions.

第４の場合（図２Ｄ参照）では、結合ｒＹＪを介して支持体に結合し、そして、 その反対側の末端が核酸被分析物中に存在する第一の配列と相補的である、ポリ ヌクレオチド鎖の捕捉プローブが提供される。標識した第二ポリヌクレオチド鎖 を含む標識用プローブは、前記第一の配列と異なり、かつに重複しない被分析物 中の第二配列に相補的な領域を有する。図２Ｄで「Ｙ」と略記した結合は、プロ ーブを支持体に結合し得る任意の一般的手段を表わす。結合ｒＸＪは、過ヨウ酸 開裂し得る結合を表わす。In the fourth case (see Figure 2D), binding to the support via the binding rYJ and a polynucleotide whose opposite end is complementary to a first sequence present in the nucleic acid analyte. A nucleotide strand capture probe is provided. Labeled second polynucleotide strand a labeling probe comprising an analyte that is different from and non-overlapping with the first sequence; It has a complementary region to the second sequence within. The bonds abbreviated as “Y” in Figure 2D are Represents any common means by which the tube may be attached to the support. The bond rXJ is periodic acid Represents a bond that can be cleaved.

本発明の焦点である選択可能な開裂部位は、構造式−Ｒ＋−０−Ｘ−０−Ｒ２− を有する全ての過ヨウ素酸開裂結合である。式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、 アルキレン、アルケニレン、／クロアルキレン、／クロアルケニレン、シクロオ キシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、およびこれらの組合せからな る群から選択され、これらの用語は上記で定義された通りである。また、Ｘは、 過ヨウ酸開裂し得る結合回身である。The selectable cleavage site that is the focus of this invention has the structural formula -R+-0-X-0-R2- All periodate cleavage bonds with . In the formula, R1 and R2 are independently Alkylene, alkenylene, /chloroalkylene, /chloroalkenylene, cycloalkylene consisting of xyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof. , as these terms are defined above. Also, X is It is a bond that can be cleaved with periodic acid.

ｒＸＪで表現し得る過ヨウ酸開裂し得る部分の例には、ｒＲＪが水素あるいはア ルキル（一般に低級アルキル）の二本方法を実施するためには、相補的配列間で 二本鎖形成が起こる条件で、核酸を含有する試料と、適切な試薬とを混合する。Examples of periodic acid-cleavable moieties that can be expressed as rXJ include In order to carry out the two-prong method for alkyl (generally lower alkyl), it is necessary to A sample containing nucleic acids and appropriate reagents are mixed under conditions that cause duplex formation.

この混合物を、対象のオリゴヌクレオチド配列上で少なくともへテロ二本鎖形成 またはホモ二本鎖形成が起こる様に考慮された予め定めたストリンジェンンーの 条件下で、ハイブリダイズ゛させる。ハイフ゛リダイゼーションが起こるのに充 分な時間後、支持体を上清から分離し、そして、少なくとも非特異に結合した標 識が実質的に全てなくなる様に洗浄し得る。次に支持体に結合したオリゴヌクレ オチドを、過ヨウ素酸で処理し、その結果、少な（とも１本鎖の開裂が起こり、 そして支持体に結合した標識の放出が起こる。This mixture is applied to form at least a heteroduplex on the oligonucleotide sequence of interest. or at a predetermined stringency to ensure homoduplex formation. hybridize under the following conditions. It takes a while for hyphridization to occur. After a period of time, separate the support from the supernatant and remove at least the non-specifically bound target. It can be washed to eliminate substantially all traces. Next, the oligonucleotide attached to the support Otide is treated with periodic acid, resulting in less (and less) single-strand cleavage. Release of the support-bound label then occurs.

二本鎖形成を起こす特定の配列が試量中に存在するか否かに依存して、支持体に 結合した標識（単数あるいは複数）の放出が観察される。通常は上清の溶媒を標 識の存在に関してアッセイし得る、種々のプロトコールが使用し得るが、場合に よっては支持体を測定しても良い。上清からの支持体の物理的分離が必要か否か に関わらず、種々のプロトコールおよび試薬類が、使用され得る。Depending on whether the specific sequences that cause duplex formation are present in the sample, Release of bound label(s) is observed. Usually the supernatant solvent is Although a variety of protocols can be used to assay for the presence of Therefore, the support may be measured. Whether physical separation of the support from the supernatant is required Regardless, a variety of protocols and reagents can be used.

本発明の方法は、広範な状況で、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれのオリゴヌクレオ チド配列の検出にも使用し得る。重要な対象領域の一つは、特定の宿主に感染し 得る病原体、ウィルス、バクテリア、真菌類、原生動物類等の検出である。例え ば、米国特許第４．３５８．５３５号参照。別の対象領域は、対立遺伝子の検出 、および、例えば羊水穿刺液を用いる宿主のゲノム中に存在する変異あるいは欠 失の検出；遺伝子カウンセリング；宿主の過敏性または感受性試験；および細胞 集囲のモニタリング；である。第３の対象領域は、転写のモニタリング、ＲＮＡ ウィルスの検出、未発現のＲＮＡによる微生物の分類等の様に非常に多様な理由 に基づ＜　ＲＮＡの存在の確認である。例示を目的とするため包括的ではないが 、他の対象領域には、染色体外ＤＮＡまたは組込みＤＮＡの存在；　ＤＮＡ配列 の増幅；このような配列の維持；に関する改変微生物のモニタリングが含まれる 。The methods of the invention apply in a wide variety of situations to oligonucleotides, either DNA or RNA. It can also be used to detect sequence sequences. One important area of interest is the ability to infect specific hosts. This is the detection of pathogens, viruses, bacteria, fungi, protozoa, etc. example See, for example, U.S. Pat. No. 4,358,535. Another area of interest is allele detection and mutations or deletions present in the genome of the host using e.g. amniocentesis. genetic counseling; host hypersensitivity or susceptibility testing; and cell monitoring of the surrounding area; The third region of interest is transcription monitoring, RNA For very diverse reasons such as detection of viruses, classification of microorganisms by unexpressed RNA, etc. This is based on the confirmation of the presence of RNA. For illustrative purposes and not comprehensively , the presence of extrachromosomal or integrated DNA in other regions of interest; the DNA sequence amplification; maintenance of such sequences; monitoring of modified microorganisms for .

本発明の方法を使用し得る種々の目的から明白な様に、生理学的試料は広範囲の ソースから取得し得る。ソースは、例えば便、痰、尿、唾液、その他の排拙物； 血漿、血液、血清、接眼レンズ液、を髄液、リンパ液、等の、種々の生理学的液 体を含み得る。試料は改変せずに使用し得る。あるいは、試料の増幅、クローニ ング、等を行い、単離体とし、そのＤＮＡまたはＲＮＡを全体的に増加し、外来 のＩ）ＮＡまたはＲＮＡは全体的に減少する様に改変し得る。ウィルスを、適合 する細胞のローン上にブレーティングし、ウィルスＤＮＡの量を増大し得る；臨 床的な単離体は、試料を栄養物を加えた寒天培地上に試料をストリークまたはス ポットし、個々のコロニーをアッセイすることで得られ得る１あるいは全試料を 液体の培地と細胞の混合物に入れ、選択的にまたは非選択的に増殖し得る。試料 を処理する特定の方法は、試料の性質、ＤＮＡまたはＲＮＡのソースの性質、存 在する核酸の全量に対する存在すると予想される目的のオリゴヌクレオチド配列 の量、および、採用したプロトコールおよびラベルの感度に依存する。As is clear from the variety of purposes for which the methods of the invention may be used, physiological samples can be used in a wide variety of can be obtained from the source. Sources include feces, sputum, urine, saliva, and other excreta; Various physiological fluids such as plasma, blood, serum, ocular fluid, spinal fluid, lymph fluid, etc. May include the body. Samples may be used without modification. Alternatively, sample amplification, cloning to isolate the DNA or RNA, increase the total amount of foreign I) NA or RNA can be modified to be totally reduced. Adapt the virus can be plated onto a lawn of cells to increase the amount of viral DNA; Bed isolation involves streaking or smearing the sample onto an agar plate containing nutrients. One or all samples can be obtained by potting and assaying individual colonies. The cells can be placed in a mixture of liquid media and grown selectively or non-selectively. sample The particular method of processing depends on the nature of the sample, the nature of the source of the DNA or RNA, the The oligonucleotide sequence of interest expected to be present relative to the total amount of nucleic acid present. and the sensitivity of the protocol and label employed.

試料の核酸または試薬のポリヌクレオチドの一方は、共有結合または非共有結合 の何れかで、拡散しない様に、支持体に結合し得る（図２Ｄで表される実施態様 の場合には、捕捉プローブ単独が固相の支持体に結合している）。試料の核酸を 支持体に結合する場合には、種々の支持体が、特別の使用法を宵し、その応用範 囲も知られているので、その様な支持体力ダ好ましい。これらの支持体には、非 特異結合が低いかあるいは無い、核酸試料を保持する、取り扱いが容易である、 および、増殖あるいは微生物、洗浄、加熱、転写、標識検出の様な種々の処理が 行える様な望ましい特性を与え、ニトロセルロースフィルター、ジアゾ化紙、エ クテオラ（ｅｃｔｅｏｌａ）紙、または他の支持体を含が含まれる。Either the sample nucleic acid or the reagent polynucleotide may be covalently or non-covalently bonded. (the embodiment represented in Figure 2D). (in which case the capture probe alone is bound to a solid support). Sample nucleic acid When bonded to a support, different supports have specific uses and ranges of application. Such a support is preferred since the surroundings are also known. These supports include non- Low or no specific binding, retention of nucleic acid samples, easy handling, and various treatments such as growth or microbial, washing, heating, transfer, and label detection. Nitrocellulose filters, diazotized paper, Includes ecteola paper, or other supports.

ポリヌクレオチド試薬の一成分か支持体に結合と（Ｘう条件で、試料オリゴヌク レオチドと相互作用するタイプの支持体の範囲内で、支持体のタイプは大きく変 動させ得る。支持体は、粒子、紙、プラス千ツク／−ト、コンテナーホルダー壁 、分割器具（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、ミリポアフィルタ−等を含み得る。一方、 支持体の材料は、多糖類、ポリスチレン、ポリアクＩＪ　）し酸およびその誘導 体、例えばポリアクリルアミド、力゛ラス、セラミ、り、金属、炭素、ポリ塩化 ビニル、タン／ザク質、等の様な、天然または合成の有機ポリマーを含み得る。One component of the polynucleotide reagent is bound to the support and the sample oligonucleotide is Within the range of types of supports that interact with leotide, the types of supports vary widely. It can be moved. Supports include particles, paper, plastic sheets, container holder walls. , a separator, a Millipore filter, and the like. on the other hand, The material of the support is polysaccharide, polystyrene, polyacrylic acid and its derivatives. materials such as polyacrylamide, glass, ceramic, resin, metal, carbon, polychloride It may include natural or synthetic organic polymers such as vinyls, proteins, etc.

共有結合または非共有結合のどちらが望まれる力）（こ依存して、種々の材料を 官能基化、または脱官能基化し得る。(depending on whether covalent or non-covalent forces are desired) Can be functionalized or defunctionalized.

核酸試料を支持体に結合する場合、特定の支持体によっては、核酸の満足な結合 に加熱で十分であり得る。他の状況では、核酸に結合させるためにジアゾ基を採 用し得る。し力）し、ポリヌクレオチド試薬の成分を支持体（こ結合する場合、 ポリヌクレオチド試薬の支持体への結合維持を保証するたメ（コ、広範な異なっ た技術を使用し得る。例えば、アルキルアミン類、ヒドラジド類、またはチオセ ミカル１＜ンド類を支持体へ結合させて得られる、結合のための活性アミ７基を 持たせる様に、支持体を官能基化し得る。その後、ターミナルトランスフェラー ゼを用いて、リボヌクレオチドをＤＮＡポリヌクレオチド試薬に付加し得る。例 えば過ヨウ素酸塩、四酸化オスミウム＋過酸化水素、四酢酸鉛等の適切な酸化剤 でグリコール開裂し、ジアルデヒドを形成し、次いでこれを支持体表面のアミ７ 基に結合し、−置換または二置換のアミ７基を生成する。あるいは、チオ燐酸と 共にアルキルチオエステルを形成するマレイミド基も提供し得る。前出のＰａｒ 　ｉｋｈら、および前出のｌｎｍａｎに記述されたアガロースおよびポリアクリ ルアミドについての種々の技術を採用し得、それらの技術は他の物質に対して応 用し得る。When binding a nucleic acid sample to a support, depending on the particular support, satisfactory binding of the nucleic acid heating may be sufficient. In other situations, diazo groups are employed for attachment to nucleic acids. Can be used. When binding the components of the polynucleotide reagent to the support ( A wide variety of methods are available to ensure that polynucleotide reagents remain bound to the support. techniques may be used. For example, alkylamines, hydrazides, or thiose The active amine 7 groups for binding obtained by binding the chemical 1<nds to the support are The support can be functionalized so as to have the following properties. Then the terminal transferer Ribonucleotides can be added to DNA polynucleotide reagents using enzymes. example Suitable oxidizing agents such as periodate, osmium tetroxide + hydrogen peroxide, lead tetraacetate, etc. cleavage of the glycol to form a dialdehyde, which is then transferred to the amide 7 on the support surface. group to form a -substituted or disubstituted amine 7 group. Alternatively, with thiophosphoric acid Maleimide groups which together form an alkylthioester may also be provided. Par mentioned above Agarose and polyacrylic as described in Ikh et al. and lnman supra. A variety of techniques can be employed for amide, and these techniques are responsive to other materials. Can be used.

多くの場合、経験に基づいて決定されるため、アッセイ溶媒中で使用し得る支持 体上のポリヌクレオチド試薬の成分の総数は、変化する。ポリヌクレオチドがハ イブリダイゼーションを妨害する密度にならない限り、支持体上の使用し得る官 能基に対して、ポリヌクレオチドの単位表面積あたりの密度は比較的高くして使 用すべきである。Supports that can be used in assay solvents are often determined empirically. The total number of components of the polynucleotide reagent on the body will vary. polynucleotide is Any available functional compound on the support is not dense enough to interfere with hybridization. Polynucleotides are used at a relatively high density per unit surface area with respect to functional groups. should be used.

ポリヌクレオチドのサイズは大きく変化し得るが、通常約１５塩基以下ではなく 、５０塩基またはそれ以上であり得、通常は約５００塩基を越えず、より一般に は２５０塩基を越えない。ポリヌクレオチド試薬の成分中には通常少なくとも６ 塩基、通常は少なくとも１２塩基の、通常は対象配列である、核酸試料中の配列 に相同の部位を有する。ハイブリダイゼーションのための部位は、１６塩基また はそれ以上であり得、通常約１　ｋｂｐヲ越えない。完全な相同性か要求されな い場合、少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも８０％の相同性があ れば十分である（相同性百分率は、ループアウトし得る非相補的挿入部分、５塩 基長を越える挿入部分を無視した、相補性を意味する）、３ 特に、対立遺伝子群、多数の異なる株、または、関連し合った種を対象とする場 合、メツセン／ヤーＲＮＡあるいはゲノムタノバク質は高度に保存されているに もかかわらず、冬型か起こっているので、任意の特定の配列に対する、この相違 を反映し、かつ全ての対象配列への、相同性を最適化したプローブを調製するこ とが望まれる場合がしばしばある。The size of polynucleotides can vary widely, but is usually no larger than about 15 bases. , 50 bases or more, usually no more than about 500 bases, more commonly does not exceed 250 bases. The components of the polynucleotide reagent usually contain at least 6 A sequence in a nucleic acid sample of bases, usually at least 12 bases, usually the sequence of interest It has a homologous site to . The site for hybridization can be 16 bases or can be larger, but usually does not exceed about 1 kbp. Complete homology not required If not, there is at least about 50% homology, more preferably at least 80% homology. (the percentage of homology is determined by the non-complementary insert that can loop out, (means complementarity, ignoring insertions that exceed the base length), 3 Especially when targeting allelic groups, large numbers of different strains, or related species. In this case, Metsen/Yar RNA or genomic tanobacterium is highly conserved. Even though winter type is occurring, this difference for any particular sequence to prepare probes with optimized homology to all target sequences. is often desired.

標識したポリヌクレオチド試薬の成分の標識は、選択的開裂部位または他の結合 を介して、ポリヌクレオチド配列に結合し、得る標識はアッセイを通して保持さ れる。多くの種類の標識か使用可能である。標識は、検出可能な信号または検出 可能な信号を得る手段を提供し得る。Labeling of the components of the labeled polynucleotide reagents may include selective cleavage sites or other binding sites. The resulting label is retained throughout the assay. It will be done. Many kinds of signs are available. A label is a detectable signal or detection A means for obtaining possible signals may be provided.

それゆえ標識は、直接または間接の何れかで検出可能な信号を提供し得る、リガ ンド、う／オアイントープ、酵素、蛍光物質、化学発光物質、酵素自己不活性化 抑制因子、酵素の補因子、酵素基質、またはその他の置換基の様な多様な置換基 を含んでいる。The label is therefore a trigger that can provide a detectable signal either directly or indirectly. nd, u/ointope, enzyme, fluorescent substance, chemiluminescent substance, enzyme self-inactivation Various substituents such as inhibitors, enzyme cofactors, enzyme substrates, or other substituents Contains.

リガンドが関与する場合、例えば、ビオチンとアビジン、２．４−７ニトロヘン ゼンと抗（２，４−ンニトロベンゼン）ＩｇＧｉの様な、そのリガンドに特異的 に結合するレセプターが一般に使用される。この場合、上述の様に適切な標識で 置換する。When ligands are involved, e.g. biotin and avidin, 2.4-7 nitrohen zene and its ligands, such as anti-(2,4-nitrobenzene) IgGi. Receptors that bind to are commonly used. In this case, with appropriate signage as described above. Replace.

このようにして、検出可能な信号を与えるための、ポリヌクレオチド配列−個当 りの標識の数を検討し得る。In this way, a polynucleotide sequence-individual can be used to provide a detectable signal. The number of additional signs may be considered.

種々のイムノアッセイで使用する標識は殆ど、本発明のアッセイでも利用し得る 。これらの標識は、米国特許第３．８５０゜７５２号（酵素）；第３．８５３． ９１４号（スピンラベル）；第４．１５０．０１５号（蛍光物質）；第４．１７ ４．３８４号（蛍光物質および消光物質曹第４、１６０．６４５号（触媒）：第 ４．２７７、４３７号〈化学発光物質）；第４．３１１１．７０７号（ｌ両光粒 子）；および第４．３１８．８９０号（酵素基質）に説明されている。Most labels used in various immunoassays can also be utilized in the assays of the present invention. . These labels are described in U.S. Pat. No. 3,850.752 (enzymes); No. 914 (spin label); No. 4.150.015 (fluorescent material); No. 4.17 No. 4.384 (Fluorescent and Quenching Substances No. 4, No. 160.645 (Catalyst): No. No. 4.277, 437 (chemiluminescent substances); No. 4.3111.707 (l chemiluminescent substances) and No. 4.318.890 (Enzyme Substrates).

代表的な蛍光性および化学発光性の標識には、フルオレセイン、ローダミン、タ ンンル、ウンベリフェロン、ビリタンパク、ルミノールその他が含まれる。Typical fluorescent and chemiluminescent labels include fluorescein, rhodamine, and tamine. Includes Nunru, Umbelliferone, Biliprotein, Luminol, and others.

代表的な対象とする酵素の例には、西洋ワサビベルオキシダーゼ、グルコース− ６−燐酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクトンダー セ、α−アミラーゼ、ウリカーゼ、リンゴ酸デヒドロヶナーゼ、その他が含まれ る。Examples of typical target enzymes include horseradish peroxidase, glucose- 6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, β-galactander Contains α-amylase, uricase, malate dehydrogenase, and others. Ru.

標識をポリヌクレオチド配列に結合する方法は、標識の性質に依存して大きく変 化する。すでに示したように、リボヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列に加 え、開裂し、得られたジアルデヒドをアミ７Ｋまたはヒドラジン基と結合し得る 。アルキルアミンの生成をもたらす還元条件を用いることで、結合の永続性をさ らに高め得る。あるいは、標識とα−ブロモまたはα−りＣ：ｌニアアセチルの 様な、活性ハロケ７テを換し得る。この活性ハロゲンは、チオ燐酸基またはチオ エステルと結合させることができ、チオエステルが形成される。The methods for attaching labels to polynucleotide sequences vary widely depending on the nature of the label. become As already shown, ribonucleotides can be added to oligonucleotide sequences. can be cleaved and the resulting dialdehyde can be coupled with amide 7K or hydrazine groups. . The persistence of the bond can be promoted by using reducing conditions that result in the formation of alkyl amines. It can be further increased. Alternatively, the label and α-bromo or α-riC:l niacetyl It is possible to change active halo 7 types such as: This active halogen is a thiophosphate group or a thiophosphate group. Can be combined with esters to form thioesters.

あるいは、標識はマレイミド官能基を持ち得、この場合、ポリヌクレオチド上に 存在するメルカプト基がチオエステルを形成する。ポリペプチドの末端の燐酸は 、カルボジイミドで活性化し得、得られるホスホルイミタゾリドはアミノ基ある いはアルコールと反応し、ホスホルアミデートまたは燐酸エステルを与える。ア ミノ修飾したプリンにポリペプチドを形成し得る。従って、標識の選択、結合の 様式、および、結合基の選択には亡範な自由度がある。Alternatively, the label may have a maleimide functionality, in which case it is placed on the polynucleotide. The mercapto group present forms a thioester. The terminal phosphate of a polypeptide is , can be activated with carbodiimide, and the resulting phosphorimitazolide has an amino group. or reacts with alcohol to give phosphoramidates or phosphate esters. a Polypeptides can be formed from amino-modified purines. Therefore, label selection, binding There is tremendous freedom in the choice of format and linking group.

このポリヌクレオチド試薬を試料と結合することで、存在する全ての核酸被分析 分が支持体に結合する。選択可能な開裂部位の開裂で、支持体から放出される標 識の量を被分析物の存在量と関連付け、被分析物の量もまた定量的に測定し得る 。By combining this polynucleotide reagent with the sample, all present nucleic acids can be analyzed. minutes are bound to the support. Upon cleavage at selectable cleavage sites, the target is released from the support. The amount of analyte can also be measured quantitatively by relating the amount of analyte to the amount of analyte present. .

標識と支持体の空間的関係の改変は、数多くの方法で達成し得る。既に示したよ うに、プローブと同じポリヌクレオチドとには、少なくとも一つの共通の認識部 位が存在し得るので、支持体からプローブを放出し得る。Altering the spatial relationship of label and support can be accomplished in a number of ways. I've already shown it In other words, the probe and the same polynucleotide have at least one common recognition site. The probe can be released from the support.

リガンドが検出可能な信号を直接に与えないが、一つ又はそれ以上の標識と結合 している受容体と結合する場合、リガンドで置換したヌクレオチドを使用し得る 。代表的な例には、アビノンと結合するビオチン化されγこヌクレオチド、免疫 グロブリンと結合するハブテン、および、レクチンと糖類、細胞表面膜蛋臼とホ ルモンおよび増殖因子、等の様なタンパク質様のレセプターに結合する種々の天 然化合物が含まれる。The ligand does not directly give a detectable signal, but binds to one or more labels. Ligand-substituted nucleotides can be used when binding to receptors that have . Typical examples include biotinylated gamma nucleotides that bind avinone, Habten binds to globulins, lectins and sugars, and cell surface membrane tassels and proteins. Various proteins that bind to protein-like receptors, such as lumon and growth factors, etc. Contains natural compounds.

図２Ｄで表される実施唸様では、選択可能な開裂部位は、二つの方法の内一つで 導入し得る。In the implementation shown in Figure 2D, the selectable cleavage site can be selected in one of two ways. can be introduced.

先ず、架橋用化合物を、捕捉プローブ１自体に、即ち図中に示したように位置ｒ ＸＪで組み込み得る。この目的には、任意の数の架橋用試薬が使用し得、唯一の 制限は、捕捉プローブに導入する開裂部位は、過ヨウ素酸で開裂できなければな らない点である。過ヨウ素酸開裂可能な結合を導入するための適切な架橋用試薬 の例は、硫黄−硫黄架橋を有するビス（カルボン酸＞（Ｐｊｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｆｃａｌｓから入手可能）、およびジスクシンイミ／ル酒石酸＜ＤＳＴ）である 。First, a crosslinking compound is applied to the capture probe 1 itself, i.e. at position r as shown in the figure. Can be installed in XJ. Any number of cross-linking reagents may be used for this purpose; only one The limitation is that the cleavage site introduced into the capture probe must be cleavable with periodic acid. This is not the case. Suitable crosslinking reagents for introducing periodate-cleavable bonds An example is bis(carboxylic acid>(Pjerce Chem fcals), and disuccinimide/tartaric acid <DST). .

固相の支持体に付着させる前に、捕捉プローブを適切に改変することでも、選択 可能な開裂部位を導入し得る。この方法は、次の構造式を有するポリヌクレオチ ドの調製を含む。Appropriate modification of the capture probe prior to attachment to the solid support can also improve selection. Possible cleavage sites can be introduced. This method uses polynucleotides with the following structural formula: including the preparation of

たたし式中の、Ｘは上述の様に過ヨク素酸開裂可能な部位である、あるいは含む 、ＤＮＡ　ｒはＤＮＡの第１鎖、ＤＮＡ２はＤＮＡの第２鎖、そしてＲ１および Ｒ２は以前に定義した通りである。特に好適な実施態様では、−Ｒ＋−０−Ｘ− ０−Ｒ２−は次にこの化合物を、本技術分野で周知の一般的な方法を使用して固 相の支持体に付着させ、図２Ｄに示した捕捉プローブをとし得る。この様な化合 物は、上の構造式の１．２−ジオール系がＤＮＡ合成中にジベンゾイル混合物と して保護され、さらに次の構造式の置換基Ｙ１に、（ジメトキシトリチル、また は「ＤＭＴＪの様な）酸に感受性で、塩基に安定な保護基、そして置換基Ｙ２に 、水素あるいは、ホスホルアミダイト、燐酸トリエステル、燐酸ジエステル、ホ スファイト、トホスホ不一トまたはホスホチオエートの様なリンの誘導体を含む 次式の試薬を使用し、標準のホスホルアミダイト反応のプロトコールを用いて、 ＤＮＡ断片中に組み込み、調製し得る。代表的な化合物は、ｒ　ＤＭＴＪが、ジ メトキシトリチルでありｒｉＰｒＪはインプロピルである、 て表され得る。In the formula, X is or contains a periodic acid cleavable site as described above. , DNA r is the first strand of DNA, DNA2 is the second strand of DNA, and R1 and R2 is as defined previously. In a particularly preferred embodiment, -R+-0-X- 0-R2- then solidifies this compound using common methods well known in the art. The capture probe shown in FIG. 2D may be attached to a phase support. This kind of combination The 1,2-diol system in the above structural formula is mixed with a dibenzoyl mixture during DNA synthesis. The substituent Y1 in the following structural formula is further protected by (dimethoxytrityl, or is an acid-sensitive, base-stable protecting group (such as DMTJ), and substituent Y2. , hydrogen or phosphoramidites, phosphoric triesters, phosphodiesters, phosphoric acid Contains derivatives of phosphorus such as sphites, tophosphites or phosphothioates Using a standard phosphoramidite reaction protocol using reagents of the following formula: It can be prepared by incorporating it into a DNA fragment. A representative compound is that rDMTJ is methoxytrityl and riPrJ is inpropyl, It can be expressed as

図２Ａから２ｃに示した実施態様と同様に、図２Ｄの実施態様は、溶液中で特異 的に結合した１ｍの検出を（そして、当然被分析物２の正確な測定を）を可能に し、一方、非特異的に結合した襟識６は固相の支持体５に結合したままである。Similar to the embodiments shown in FIGS. 2A through 2c, the embodiment of FIG. 1m detection (and of course accurate measurement of analyte 2) On the other hand, the non-specifically bound collar 6 remains bound to the solid phase support 5.

−広範な種類の支持体、および、オリゴヌクレオチド鎖の非拡散的結合の技術が 、文献中に報告されている。総説は、ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷｈａｔ、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｆｆｉ、（１９８４）　１３８：２６７−２８４を参照。- A wide variety of supports and techniques for non-diffusive attachment of oligonucleotide chains are available. , reported in the literature. Reviews include Meinkoth and What, Anal; See Biocheffi, (1984) 138:267-284.

支持体には、温度ｇ　ｏ　’ｃで２時間で十分なニトロセルロースフィルター、 さらなる活性化なしに結合が起こるジアゾ化紙、エクテオラ紙、その他が含まれ る。アガａ−スビーズは、ＤＮＡと直接反応させるために、臭化シアンで活性化 し得る（Ｂａｕｍａｎ　ラ、Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｔｏｃｈｅｍ、　 （１９８１）　２９＋　２２７−２３７）；あるいは、臭化シアンおよびジアミ ／と反応させ、次ぎに例えば、ブロモアセチルの様な−−ハロアセチルと反応さ せる、あるいは、例えば無水マレイン酸のカルボ牛シル置換活性オレフィンと反 応させ、ポリヌクレオチド路上に存在するチオール官能基と反応し得るビーズを 得る。例えば、ＤＮＡを改変してカップリング用の、−一チオ燐酸を形成し得る 。（ＰｆｅｕｆｆｅｒとＨｔ１ｍｒｅ４ｃｈＳＪ、　Ｂ包り匹■ｒａ、　（１９ ７５）±・８６７−８７６）。化学的手段により、オリゴヌクレオチドを合成し テフロン支持体に結合し、そして次ぎに、オリゴヌクレオチドを取り除くことな くこの材料を完全に脱ブロツク化することも可能である。（Ｌｏｈｒｍａｎｎら い五（１９８４）　３：１２２＞。The support includes a nitrocellulose filter, which is sufficient for 2 hours at temperature g o'c; Includes diazotized papers, Ecteora papers, and others where binding occurs without further activation. Ru. Agar beads are activated with cyanogen bromide for direct reaction with DNA. (Bauman, J., Histochem, Ctochem, (1981) 29+ 227-237); or cyanogen bromide and diamide / and then with a haloacetyl, such as e.g. bromoacetyl. or react with a carboxyl-substituted active olefin, e.g. maleic anhydride. beads that can react with the thiol functional groups present on the polynucleotide. obtain. For example, DNA can be modified to form a -monothiophosphate for coupling. . (Pfeuffer and Ht1mre4chSJ, B wrapping animal ■ra, (19 75)±・867-876). Synthesize oligonucleotides by chemical means bind to a Teflon support and then remove the oligonucleotide. It is also possible to completely deblock this material. (Lohrmann et al. Igo (1984) 3:122>.

襟識と試薬が広範な多様性を有するという観点から、本方法の全般に共通する側 面を記載し、その後いくつかの代表的プロトフルを記載する。本性全般に共通し ているのはハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションは、二本鎖 形成に要求される相同性が大きいか小さいかによって、変化する度合のストリン ジエンシーの程度で実施され得る。殆どの場合で、水性溶媒が使用され、種々の 他の成分の混合物を含み得る。特に、有機極性溶媒は、ストリンジエンシーの増 大のために使用し得る。代表的な溶媒の例には、ジメチルホルムアミド、ジメチ ルアセトアミド、ジメチルスルホキッドが含まれる。即ち、使用する濃度で水混 和する有機溶媒である。高いイオン強度を得るために加える塩濃度を高めても、 ストリンジエンシーを増大し得る。さらに、温度上昇もストリンジエンシーに用 い得る。各場合共に、逆にするとストリンジエンノーは低下する。界面活性材の 様な、他の添加物もまた、ストリンジエンシーの改変に使用し得る。In view of the wide diversity of knowledge and reagents, there are some common aspects of this method. first, and then some representative protofles. Common to all nature What is happening is hybridization. Hybridization is a double stranded varying degrees of string formation, depending on whether greater or lesser homology is required for formation. It can be carried out at a scientific level. In most cases, aqueous solvents are used, and various It may contain mixtures of other ingredients. In particular, organic polar solvents can increase stringency. Can be used for large quantities. Examples of typical solvents include dimethylformamide, dimethyl Contains ruacetamide and dimethyl sulfokide. i.e. mixed with water at the concentration used. It is an organic solvent that dissolves Even if you increase the salt concentration added to obtain high ionic strength, Stringency may be increased. Additionally, temperature increases can also be used for stringency. I can. In each case, the stringency is reduced when reversed. of surfactant Other additives may also be used to modify stringency, such as.

ハイブリダイゼーションだめの時間の長さは、対象配列の濃度、ストリンジエン シー、相補的配列の長さ、等により変化する。一般に、ハイブリダイゼーション は、少なくとも約１５分を要し、そして一般的には、約７２時間を越えず、より 一般には約２４時間を越えない。さらに、あるストリンジエンシーでハイブリダ イゼーションを行い、そして次に、より高いストリンジエンシーで洗浄し、十分 な相同性を欠くヘテロ対合を除去し得る。The length of the hybridization period depends on the concentration of the target sequence, the stringency It varies depending on the sequence, the length of the complementary sequence, etc. Generally, hybridization takes at least about 15 minutes and generally does not exceed about 72 hours, but more Generally it does not exceed about 24 hours. In addition, hybridization with certain stringency and then wash at a higher stringency and thoroughly Heteropairs lacking significant homology can be removed.

核酸試料は、種々の方法で処理し得る。例えば、完全なゲノム、機械的に切断し たまたは制限酵素で消化した、約０．５ｋｂから３０　ｋｂまで変化するゲノム の断片、あるいは、例えば電気泳動で大きさに従って分画された断片を使用し得 る。ある場合に、対象配列は、例えば、例えばＭ２Ｓ、の様な一本鎖のＤＮＡま たはＲＮＡウィルスである適切なベクター中でクローニングされたクローン配列 である。Nucleic acid samples can be processed in a variety of ways. For example, a complete genome, mechanically excised or digested with restriction enzymes, the genome varies from approximately 0.5 kb to 30 kb. Alternatively, fragments that have been fractionated according to size, e.g. by electrophoresis, can be used. Ru. In some cases, the sequence of interest is, for example, a single-stranded DNA, such as, for example, M2S. or an RNA virus, cloned sequences cloned into a suitable vector. It is.

アッセイ溶媒中には、緩衝剤、例えばＳＤＳである界面活性剤、フィコール、ポ リビニルピロリドン、および、非特異的結合を最小化し得る外来のＤＮＡ、を含 め得る。これらの添加物の全ては、参考文献中に説明があるため、詳細な記述を 要さない。Buffers such as surfactants such as SDS, Ficoll, Pork, etc. are included in the assay solvent. Contains ribinylpyrrolidone and foreign DNA that can minimize non-specific binding. I can meet you. All of these additives are described in the references, so a detailed description is not provided. Not needed.

特定のプロトコルに従い、試料核酸をポリヌクレオチド試薬（単数あるいは複数 ）と共に、予め定められたストリンジエンシーのハイブリダイゼーション溶媒中 に入れる。ハイブリダイゼーションに十分な時間の経過後、支持体を、ハイブリ ！　イセ−シ＊ン溶媒よりも高いかまたは低いストリンジエンシーの溶媒で、少 なくとも一回洗浄する。次に、結合したボッヌクレオチドと被分析物を含む支持 体を、−水路または二本鎖開裂を考慮した選択可能な開裂部位の開裂に必要な反 応物（例えば光の様な物理的処理を含む）と接触させる。多くの場合、制限エン ドヌクレアーゼ、ホスホジェステラーゼ、ピロホスファターゼ、ペプチダーゼ、 エステラーゼ、その他の様な加水分解酵素が使用されるが、還元剤、エルマン試 薬の様な他の試薬、または光も用い得る。開裂の後、支持体と上清とは、標識お よび測定の様式、そして、支持体から放出され測定された標識の量に依存して、 分離しても分離しなくてもよい。According to a specific protocol, sample nucleic acids are treated with polynucleotide reagent(s). ) in a hybridization solvent of predetermined stringency. Put it in. After sufficient time for hybridization, remove the support from the ! Solvents with higher or lower stringency than ischemic solvents, with less Wash at least once. Next, the support containing the bound nucleotide and analyte is - the reaction required for cleavage of the water channel or selectable cleavage site considering double-strand cleavage. contact with a chemical agent (including a physical treatment such as light). In many cases, the limit Donuclease, phosphogesterase, pyrophosphatase, peptidase, Hydrolytic enzymes such as esterases and others are used, reducing agents, Ellman's Other reagents such as drugs or light may also be used. After cleavage, the support and supernatant are separated by the label and supernatant. and the mode of measurement and the amount of label released from the support and measured. It may or may not be separated.

本発明をさらに説明するため、幾つかの代表的プロトコルを記載する。第１の代 表的プロトコール中では、蛍光標識されたポリヌクレオチドが各ウェルの底に結 合しているマイクロタイタープレートを使用する。クローン化された病原体のＤ ＮＡを、一つまたはそれ以上の制限酵素で制限酵素消化し、約０．５２ｋｂの断 片を得る。この断片を穏和な塩基性条件下で単離上変性し、そしてハイブリダイ ゼーション溶媒中に分散し、次に、各ウェルが特定の病原体種の異なる株の配列 に特異的に相同な異なる配列を有する複数のウェルに順次添加する。To further explain the invention, some representative protocols are described. first generation In the exemplary protocol, a fluorescently labeled polynucleotide is attached to the bottom of each well. Use a compatible microtiter plate. Cloned pathogen D NA was digested with one or more restriction enzymes to obtain a fragment of approximately 0.52 kb. Get a piece. This fragment is isolated and denatured under mildly basic conditions and hybridized. each well contains an array of different strains of a specific pathogen species. Sequentially add to multiple wells with different sequences specifically homologous to.

ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間の間、これらのウェルを例えば ６０℃の高温度に維持し、その後に、この上清を取り除き、そして、ウェルをハ イブリダイゼーション溶媒より低いストリンジエンシーの緩衝溶媒で繰り返し完 全に洗浄する。二本鎖形成は、全ての株に共通する制限酵素の認識部位を与える 。次に、各ウェルに二本鎖ＤＮＡを消化するための制限酵素溶媒を添加し、二重 鎖ＤＮＡを消化し１、蛍光性の標識の上清中への放出が起こる。各ウェルからこ の上清を吸引分取し、励起光照射をする。次に対照配列の存在の指標として蛍光 の量を測定する。この様にして、液相中の蛍光の存在を観察することで、どの株 が存在するかを迅速にスクリーニングし得る。For a sufficient time for hybridization to occur, store these wells e.g. After maintaining the elevated temperature of 60°C, the supernatant is removed and the wells are Repeat with a buffered solvent of lower stringency than the hybridization solvent. Wash thoroughly. Duplex formation provides recognition sites for restriction enzymes common to all strains . Next, a restriction enzyme solvent for digesting double-stranded DNA is added to each well, and the double-stranded DNA is Digestion of the stranded DNA 1 results in the release of a fluorescent label into the supernatant. From each well Aspirate the supernatant and irradiate it with excitation light. Fluorescence is then used as an indicator of the presence of control sequences. measure the amount of In this way, by observing the presence of fluorescence in the liquid phase, it is possible to determine which strain can be quickly screened for the presence of

第２の代表的なプロトコールでは、未標識のポリヌクレオチドを結合したガラス ピーズを含むカラムを使用する。次にこのカラムに、哺乳類細胞から得たＤＮＡ 断片を含む試料核酸を添加する。この断片は、約０．５から１０　ｋｂの範囲で ある。この試料ＤＮＡを、適切なハイブリダイゼーション溶媒に分散し、モして カラムに添加し、そしてハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間の間カ ラム中に保持する。試料のハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーショ ン溶媒をカラムから放出し、そして、策１の溶媒よりも厳密な条件下の第２のハ イブリダイゼーション溶媒中のジスルフィド結合を介して西洋ワサビペルオキシ ダーゼ（ＨＲＰ）を標識したポリヌクレオチド試薬を加え、そして、第２の溶媒 をハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間でカラムから放出する。標識 したポリヌクレオチドは、対象配列に相補的な配列を有する。ハイブリダイゼー ション溶媒を、カラムから排出する。In a second representative protocol, a glass conjugated with unlabeled polynucleotide was used. Use a column containing peas. Next, add DNA from mammalian cells to this column. Add sample nucleic acid containing the fragment. This fragment ranges from approximately 0.5 to 10 kb. be. Disperse this sample DNA in a suitable hybridization solvent and column and leave it for a sufficient time for hybridization to occur. Retain in ram. After hybridization of the sample, the hybridization The solvent is removed from the column and the second solvent is removed from the column under more stringent conditions than the solvent in Strategy 1. Horseradish peroxy via disulfide bonds in the hybridization solvent A polynucleotide reagent labeled with Dase (HRP) is added, and a second solvent is added. is released from the column in sufficient time for hybridization to occur. sign The obtained polynucleotide has a sequence complementary to the subject sequence. hybridize tion solvent is drained from the column.

次に、カラムを、より高いストリンジエンシーを有する溶媒で１またはそれ以上 の回数洗浄し、標識したポリヌクレオチドに対して不充分な相同性を有する全て のポリヌクレオチド配列を除去する。次に、エルマン試薬をカラムに加え、ジス ルフィド結合の解裂を起こし、モしてＨＲＰを放出させる。ＥＩＲＰを含む溶媒 をカラムから排出し、回収し、そして、引き続く、遊離した酵素がカラム中に残 らない様保証する洗浄の洗浄液をも、補集した。ＨＲＰ標識を含む得られた溶媒 を次に、）ＩＲＰ標識に関してアッセイし得る。ＨＲＰの代わりに、分光学的に または蛍光的に検出し得る生成物を生成する多くの種類の他の酵素を、使用し得 る。The column is then washed with one or more solvents with higher stringency. Washed several times and labeled all with insufficient homology to the polynucleotide. remove the polynucleotide sequence of. Next, add Ellman's reagent to the column and This causes cleavage of the ruphide bond and releases HRP. Solvents containing EIRP is drained from the column, collected, and the subsequent free enzyme remains in the column. We also collected cleaning solutions to ensure that no damage occurs. Resulting solvent containing HRP label ) can then be assayed for the IRP label. Spectroscopically instead of HRP or many types of other enzymes that produce fluorescently detectable products may be used. Ru.

第３のプロトコールでは、試料をフィルターに吸収させ、そして８０℃で２時間 加熱することで、核酸試料を、ニトロセルロースフィルターの一端に非拡散的に 結合する。このフィルターを洗浄し、そしてその後、ノ＼イブリダイゼーンヨン 条件下で、エステル結合を介して、アルキルカルボキシ置換アデニンに結合させ たウンベリフェロンで標識したポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液 に加える。この標識したポリヌクレオチドは、対象配列に相補的な配列を有する 。／・イブリダイゼーションに充分な時間の後、このフィルターをハイブリダイ ゼーション溶媒から取り出し、洗浄し、非特異的に結合たヌクレオチドを除去し 、そして次に、既知濃度のエステラーゼ溶液中に浸す。蛍光の増加の率を、核酸 試料中の被分析物の量の指標としてモニターする。In the third protocol, the sample was absorbed onto the filter and heated to 80°C for 2 hours. By heating, the nucleic acid sample is non-diffusively deposited onto one end of the nitrocellulose filter. Join. Wash this filter, and then conjugated to an alkylcarboxy-substituted adenine via an ester bond under conditions Hybridization solution for polynucleotide labeled with umbelliferone Add to. This labeled polynucleotide has a sequence complementary to the target sequence . /・After sufficient time for hybridization, hybridize this filter. Remove from the oxidation solvent and wash to remove non-specifically bound nucleotides. , and then immersed in an esterase solution of known concentration. The rate of increase in fluorescence of nucleic acids Monitored as an indicator of the amount of analyte in the sample.

他のプロトコールでは、ポリフルオレセイン化した末端を有する被分析物配列に 相補的に配列された１ｍしたポリヌクレオチドを有するストリップを保持する、 ホルダーを有するプラスチックの材質のディノブステイノクを使用し得るｏ核酸 試料を適切なノ・イブリダイゼー／＝Ｉン媒質中で調製し、そして、ディツプス ティ、りを入れ、そしてハイブリダイゼーションを進行させる。ハイブリダイゼ ーションが起こるのに十分な時間の後、このディツプスティックを取り出し、そ して洗浄し、非特異的に結合した全てのポリヌクレオチドを取り除く。対象ポリ ヌクレオチド配列の存在は、制限酵素認識部位の形成をもたらし、そして次に、 ディツプスティックを制限酵素反応混合液に入れ、そして消化を進行させる。消 化が進行するのに十分な時間の後、このディツプスティックを取り出し、徹底的 に洗浄し、そして溶液中の蛍光を読み取る。Other protocols use analyte sequences with polyfluoresceinated ends. retaining a strip having complementary sequenced 1m polynucleotides; Nucleic acids that can be used with a plastic material with a holder Prepare the sample in a suitable hybridization medium and dip Add tea and ri, and proceed with hybridization. hybridize After sufficient time for the dipstick to occur, remove the dipstick and Wash to remove all non-specifically bound polynucleotides. Target policy The presence of the nucleotide sequence results in the formation of a restriction enzyme recognition site and, in turn, Place the dipstick into the restriction enzyme reaction mixture and allow the digestion to proceed. Disappear After sufficient time for the process to proceed, remove the dipstick and thoroughly and read the fluorescence in the solution.

また、ベースラインの値より上の蛍光は、被分析物の存在を示す。Fluorescence above the baseline value also indicates the presence of the analyte.

別のプロトコールでは、ポリヌクレオチド試薬成分は、核酸被分析物の一つの領 域に対し相補的な配列を有し、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合し ている第一のポリヌクレオチド、および核酸被分析物の他の領域に相補的な配列 を有する標識した第２のポリヌクレオチドである。この標識は　Ｎ８−アミノヘ キシルデオキシアデノンントリホスフェートウンベリフェソル力ルボキンアミド で尾部伸張ポリヌクレオチドから得られる。ハイブリダイゼーション条件下で、 過剰の標識したポリヌクレオチドと共に、核酸試料をウェル中に入れる。ハイブ リダイゼーションに十分な時間の後、ハイブリダイゼーション溶液をウェルから 吸引して取り出し、ウェルを洗浄し、そしてウェル中に残留したＤＮＡを、９０ ％のギ酸溶液を加え、そして６０℃で１時間加熱するか、あるいはビペリジンを 加え、９０℃で３０分加熱することで、脱プリン化する。In another protocol, the polynucleotide reagent components are used in one region of the nucleic acid analyte. has a complementary sequence to the region and binds to the walls of the wells of the microtiter plate. a first polynucleotide, and a sequence complementary to other regions of the nucleic acid analyte. A labeled second polynucleotide having the following. This label is N8-amino Xyldeoxyadenone triphosphate umbellifesol luboquinamide obtained from the tail extension polynucleotide. Under hybridization conditions, Nucleic acid samples are placed into wells along with excess labeled polynucleotide. hive After sufficient time for redization, remove the hybridization solution from the wells. Aspirate, wash the wells, and remove any remaining DNA in the wells at 90% % formic acid solution and heat at 60°C for 1 hour, or add biperidine. In addition, depurination is carried out by heating at 90°C for 30 minutes.

あるいは、標識されるべきポリヌクレオチドと、５ｉｌｖｅｒとＦｅ１ｓｈｔ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８２）　２１：６０５６に従いりｏｏアセト アルデヒドで処理して、ポリ−ｄＡを処理して得られるオリゴマーの過剰量とを ライゲーションし、蛍光性Ｎ６−ニタノアデノシンを作成することで、標識が得 られる。標識の放出は、１０００　ｕｇＭの、ＣａＣｌ２溶液中のミクロコツカ スヌクレアーゼで、３７℃で１時間処理して行われる。Alternatively, the polynucleotide to be labeled, 5ilver and Fe1sht, According to Biochemistr (1982) 21:6056 oo acetate Excess amount of oligomer obtained by treating poly-dA by treatment with aldehyde Labeling is obtained by ligation to create fluorescent N6-nitanoadenosine. It will be done. The release of the label was determined by 1000 ugM of microcosms in CaCl2 solution. This is done by treating with snuclease for 1 hour at 37°C.

どちらの場合も、このポリマーの蛍光は自己消光のために顕著に減少する。溶解 すると、蛍光の顕著な増加が観察される。この様にして、脱ポリマー化に抵抗性 を有する、非特異結合した標識ポリヌクレオチドは観察される信号に干渉されな い。さらに、バックグラウンドの蛍光レベルが低いので、蛍光の増加率を核酸被 分析物の定量的な指標として測定し得る。自己消光の代わりに、蛍光物質と消光 物質が入れ替わった／ステム、あるいは、２成分試薬システムで、非消光性蛍光 物質が一つの成分上に存在し、消光物質が他の成分上に存在するシステム、も使 用し得る。In both cases, the fluorescence of this polymer is significantly reduced due to self-quenching. Dissolution A significant increase in fluorescence is then observed. In this way, it is resistant to depolymerization. Non-specifically bound labeled polynucleotides with stomach. Additionally, low background fluorescence levels reduce the rate of increase in fluorescence from nucleic acid It can be measured as a quantitative indicator of the analyte. Fluorescent material and quenching instead of self-quenching Non-quenchable fluorescence in swapped substances/stem or two-component reagent systems Systems in which the substance is present on one component and the quencher is present on the other component may also be used. Can be used.

以下の実施例は説明を目的に提供され、限定は意図しない。The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to be limiting.

夫！ ＰＣＬ（過ヨウ素酸開裂可能リンカ−）の合成：この実験では、略号ｒＸＪは、 Ｄ、Ｌ−１，４−ヒス−（４−（２−１＋−ドロキンエチル）フェノキシ）−２ ，３−ブタンジオールを、略号「ｘ’Ｊ　ハ２．３−イア　７’　ａ　ヒ’Ｊ　 ｙ’　ンヲ、＋　Ｌ　テ略号ｒＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）−ＢＣＥ」は２−（４−［ ４（４−（２−ジメトキシトリチルオキ／）エチル）フェノキシ−２，３−ジ（ ベンゾイルオキシ）−ブタン−オキシ１フエニル）エチル−２−シア／エチル− Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイトを表す。ｒＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）−Ｂ ＣＥ２Ｊ　Ｉｔ次ノｔＲａ　式ヲ有ｔ　ル。husband! Synthesis of PCL (periodic acid cleavable linker): In this experiment, the abbreviation rXJ is D, L-1,4-his-(4-(2-1+-droquinethyl)phenoxy)-2 , 3-butanediol with the abbreviation "x'J ha2.3-ia 7'ahi'J y’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Te abbreviation rDMT-X(Bz2)-BCE' is 2-(4-[ 4(4-(2-dimethoxytrityloxy/)ethyl)phenoxy-2,3-di( benzoyloxy)-butane-oxy1phenyl)ethyl-2-cya/ethyl- Represents N,N-diisopropylphosphoramidite. rDMT-X(Bz2)-B CE2J has the following formula.

４・ヒドロキシフェニルエタノール（２１，４ｇ：１５５　＊墓ａｌｅ）および １．４−ジブロモ−２，３，−ブタンジオール（１９Ｊ　ｇ、７８■■ｏｌｅ） を４００ｍ１の無水エタノールに溶解した混合物に、Ｎａ０Ｈ（２６ｍｌの６Ｍ 水溶液）を加えた。この反応混合物を１８時時間中かに還流した。室温に冷却し た後、溶媒の半分を減圧で除去しく−２００ｍｌ）、そして、激しく攪拌しなが ら１０００　ｍｌの水に滴加した。生成した沈澱物を濾別し、そして真空デシケ ータ−中で、乾燥を補助する固体Ｎａ０Ｈ（１０ｇ）上で完全に乾燥し、１１． ９　ｇ＜３３　ｍｍｏｌｅ）の「Ｘ」（収量４２％）を得た。4.Hydroxyphenylethanol (21.4g: 155 *grave ale) and 1,4-dibromo-2,3,-butanediol (19J g, 78 ole) was dissolved in 400 ml of absolute ethanol, NaOH (26 ml of 6M aqueous solution) was added. The reaction mixture was refluxed for 18 hours. cool to room temperature After that, remove half of the solvent under reduced pressure (-200 ml) and, while stirring vigorously, The mixture was added dropwise to 1000 ml of water. The formed precipitate is filtered and vacuum dessicated. Completely dry over solid Na0H (10 g) to aid drying in a 11. 9 g<33 mmole) of "X" (yield 42%) was obtained.

化合物ｒＸＪ　＜３３　ｍｍｏｌｅ＞をＴＨＦに溶解し、次にこの溶液（３３０ ｍｌ）を濾過し、モしてＮ、ＩＪ−ジメチルアミノピリジン（１００＋ｏｇ）と トリエチルアミン（２７■ｌ；２００　ｍｍｏｌｅ）を加え、そして最後にｔ− ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＤＭＳ−Ｃ１）（１９，８ｇ：１３２ｓ ｖｏｌｅ）を上記混合物に加えた。２０°Ｃ１１８時間の後、全ての出発物質が 消滅しくｔｉｅ分析で確認）、そして、メタノール（５０ｍｌ）を加え過剰なＴ ＢＤＭＳ−ＣＩを消滅した（２５分間）。この反応混合物を少容積に濃縮し、酢 酸エチル（２５０ｍｌ＞で希釈し、そして２５０　ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３で１ 回、２５０　ｍｌのＮａＣ１８０％飽和水溶液で１回洗浄した。有機相を固体Ｎ ａ２ＳＯ４上で乾燥した後、溶媒を減圧下で除去した。粗ＴＢＤＭＳ２−Ｘをピ リジンに溶解し、０℃に冷却し、そして１２５　ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した 塩化ベンゾイル（１３２ｍｍｏｌｅ）を滴加した。反応溶液を加熱し室温とし、 そして１８時間放置した。ピリジン溶媒を減圧下で除去し、モして装置を酢酸エ チルに溶解した。上記と同様に水性溶媒で処理した後、この粗ＴＢＤＭＳ２ＸＢ Ｚ２（３０ｍｍｏｌｅ）を１００　ｍｌの濃酢酸を含むＺｏｏ　ｍｌのＴＨＦに 溶解し、そしてテトラブチルアンモニウムフルオライド（１００ｍｌのＩＭのＴ ｌ（Ｆ溶液）を加え、そして反応混合物を４°Ｃで１８時間放置した。次に溶媒 の大部分を減圧下で除去し、そして酢酸エチル中に入れた装置を固体ＮａＨＣＯ ３で処理し、過剰な酢酸を中和し、上記と同様に洗浄と乾燥を行い、Ｘ（ＢＺ２ ）（３０ｍｍｏｌｅ；１７．０　ｇ＞を得た。この物質を精製せずに使用し、そ してピリジン中で３０　ｍｍｏｌｅのＤＭＴ−Ｃ１で処理した。１８時間後、溶 媒を減圧下で除去し、酢酸エチル中の装置を上記と同様に洗浄および乾燥し、２ ７　ｇの粗ＤＭＴ−Ｘ　（ＢＺ２）を得た。この粗生成物を、ＣＦ１２Ｃ１２／ １％トリエチルアミンを溶媒システムとして用イ、ノリ力の大型カラムで精製し 、純粋なりＭＴ−Ｘ（ＢＺ２）（１３，３ｇ：１５ｍｍｏｌｅ）を得た。この精 製した物質を、以下の様して２−シアノエチルホスホルアミダイト誘導体に変換 した：　ＤＭＴ−Ｘ（ＢＺ２）（１５ｍｍｏｌｅ＞をＮ、Ｎ−ジイソプロピルエ チルアミン（１３，１ｍｌ；７５　ｍｍｏｌｅ）を含む５０ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２ に溶解し、モしてｏ’ｃに冷却した。Compound rXJ <33 mmole> was dissolved in THF, and then this solution (330 mmole) was dissolved in THF. ml) and diluted with N,IJ-dimethylaminopyridine (100+og). Add triethylamine (27 μl; 200 mmole) and finally t- Butyldimethylsilyl chloride (TBDMS-C1) (19.8g: 132s volume) was added to the above mixture. After 118 hours at 20°C, all starting material was (confirmed by tie analysis), and methanol (50 ml) was added to remove excess T. BDMS-CI was extinguished (25 minutes). The reaction mixture was concentrated to a small volume and diluted with vinegar. diluted with ethyl chloride (250 ml) and diluted with 250 ml of 5% NaHCO3. and once with 250 ml of 180% saturated NaC aqueous solution. The organic phase is converted into solid N After drying over a2SO4, the solvent was removed under reduced pressure. Coarse TBDMS2-X Dissolved in lysine, cooled to 0 °C, and dissolved in 125 ml CH2Cl2 Benzoyl chloride (132 mmole) was added dropwise. Heat the reaction solution to room temperature, Then, it was left for 18 hours. The pyridine solvent was removed under reduced pressure and the apparatus was replaced with acetic acid. Dissolved in chill. After treatment with an aqueous solvent as above, this crude TBDMS2XB Z2 (30 mmole) was added to Zoo ml of THF containing 100 ml of concentrated acetic acid. Dissolve and add tetrabutylammonium fluoride (100 ml of IM T 1 (F solution) was added and the reaction mixture was left at 4°C for 18 hours. Then the solvent The majority of the was removed under reduced pressure and the apparatus placed in ethyl acetate was replaced with solid NaHCO. 3 to neutralize excess acetic acid, wash and dry in the same manner as above, and ) (30 mmole; 17.0 g>) was obtained. This material was used without purification and its and treated with 30 mmole of DMT-C1 in pyridine. After 18 hours, the solution The medium was removed under reduced pressure, the equipment in ethyl acetate was washed and dried as above, and the 7 g of crude DMT-X (BZ2) was obtained. This crude product was converted into CF12C12/ Using 1% triethylamine as the solvent system, purification was performed using a large Nori force column. , pure MT-X (BZ2) (13.3 g: 15 mmole) was obtained. This spirit The produced substance was converted into a 2-cyanoethylphosphoramidite derivative as follows. DMT-X (BZ2) (15 mmole) was added to N,N-diisopropyle 50 ml of CH2Cl2 containing thylamine (13.1 ml; 75 mmole) The mixture was dissolved in water, stirred and cooled to o'c.

この溶液に、アルゴン気流下で、２−ンアノエト牛ンーＮ、Ｎ−ジイソプロピル アミノクロロホスフィン（３，３ｍｌ；１５　ｍｍｏｌｅＬヲ注射器を用いて加 えた。〜３０分後、反応は完了し、そして５００　ｍｌの酢酸エチルで希釈した 後、有機相を５００　ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３で２回、そして５００　ｍｌの８ ０％飽和ＮａＣ１で２回洗浄した。固体Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した後、溶液を濾 過し、蒸発乾固し、１６ｇの白色の泡状のＤＭＴ−Ｘ（ＢＺ２）ＢＣＥアミダイ トを得た。この粗アミダイトをシリカゲルカラムで精製しＣＦ１２Ｃ１２／酢酸 エチル／トリエチルアミン（４５：４５：１０　ｖ／ｖ）で溶出し、白色の泡状 の純粋なりＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）ＢＣＥアミダイト（１４，２ｇ；１３　ｍｍｏｌ ｅ）を得た。（ＮＭＲ”Ｐ　δ　１４４　ｐｐｍ：カップリング効率９７％）本 明細書に開示した他の過ヨウ素酸解裂橿への、１．２−ジオール結合の変換は、 宵機合成化学の技術分野で周知の一般的技術を用いて容易に行い得る。Add 2-N,N-diisopropyl to this solution under an argon stream. Aminochlorophosphine (3.3 ml; 15 mmole L) was added using a syringe. I got it. After ~30 minutes, the reaction was complete and diluted with 500 ml of ethyl acetate. Afterwards, the organic phase was washed twice with 500 ml of 5% NaHCO3 and then with 500 ml of 8 Washed twice with 0% saturated NaCl. After drying over solid Na2SO4, the solution was filtered. Filtered and evaporated to dryness to give 16 g of white foamy DMT-X (BZ2) BCE amidite. I got it. This crude amidite was purified with a silica gel column and CF12C12/acetic acid Eluted with ethyl/triethylamine (45:45:10 v/v), white foam Pure MT-X (Bz2) BCE amidite (14.2 g; 13 mmol e) was obtained. (NMR"P δ 144 ppm: coupling efficiency 97%) Book Conversion of the 1,2-diol bond to other periodic acid cleavage groups disclosed in the specification includes: It can be easily carried out using common techniques well known in the art of Yoiki synthetic chemistry.

Ｘｏの合成： 化合物Ｘ（２５ｇ、　６９　ｍｍｏｌｅ）をＣＨ３ＣＮ（２００ｍｌ）に懸濁さ せ、そして５０　ｍｌの２．２−ジメトキシプロパンを加えた。その後の数時間 の間に、無水のｐ−トルエンスルホン酸（０，１Ｍアセトニトリル溶液１０　ｎ ｉｌ＞を加えた。殆ど透明の溶液を得た。１８時間後、溶液を濾過し、そして１ ０ｍ１の８２０を加え、そして１０分間放置し、過剰な試薬および他の副生成物 を破壊した。ビ１７ジン（５０ｍｌ）を加え、そして反応混合物を減圧下で濃縮 し、２５　ｇのＸ°生成物を得た。精製せずに、この物質をＤＭＴに変換し、そ して以前にＸ（Ｂｚ２）の項で記載した様に、さらにＢＣＥホスホルアミダイト に変換した。Synthesis of Xo: Compound X (25 g, 69 mmole) was suspended in CH3CN (200 ml). and 50 ml of 2,2-dimethoxypropane was added. the next few hours During this time, anhydrous p-toluenesulfonic acid (0.1 M acetonitrile solution 10 n il> was added. An almost clear solution was obtained. After 18 hours, the solution was filtered and 1 Add 0ml of 820 and leave for 10 minutes to remove excess reagents and other by-products. destroyed. Bi-17dine (50 ml) was added and the reaction mixture was concentrated under reduced pressure. 25 g of X° product was obtained. Without purification, this substance is converted to DMT and its As previously described in the section for X(Bz2), the BCE phosphoramidite Converted to .

結果： 完全に保護されたＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）ＢＣＥアミダイトを、固相の支持体上の オリゴマー、５°−ｈｌｌ−Ｘ−Ｔｉｓ−３’中に組み込んだ。この断片を、ジ クロロ酢酸と水酸化アンモニウムを用いた脱保護を、先ず、２０°Ｃで１時間、 （コノ−り酸結合を解裂するために）、次に６０°ＣでＸ部分のベンゾイル基を 除去することで行った。オリゴマーの開裂はまったく観察されなかった。水中の テスト第１ノゴマー試料を水中の１００　ｍＭのＮａ１Ｏａで４°Ｃで１時間、 処理した。result: The fully protected DMT-X (Bz2) BCE amidite was transferred onto a solid phase support. The oligomer was incorporated into 5°-hlI-X-Tis-3'. This fragment is Deprotection using chloroacetic acid and ammonium hydroxide was first carried out for 1 hour at 20°C. (to cleave the conolic acid bond), then remove the benzoyl group of the X moiety at 60°C. This was done by removing it. No oligomer cleavage was observed. underwater Test the first nogomer sample in 100 mM Na1Oa in water for 1 hour at 4°C. Processed.

次に過剰の試薬を、リボースで還元した。ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧ Ｅ）で開裂が完了したことが示され、より短０２つの断片、Ｘが０−（ＣＨ２） ２−ＣａＨａ−０−ＣＨ２−ＣＨＯである、５−Ｔｔａｘ−３°および５−Ｘ− Ｔｉｓ−３°を生じた。ＰＡＧＥの結果：３：　５−Ｔｉ１ｌ−Ｘ−Ｔｉ５−３ °、ＮＨａＯＨ２０℃／１時間４：　レーン３と同じ、ただしＮＨ４ＯＨ６０℃ ／１８時間５・　Ｎａ１Ｏａに１時間さらした後はレーン４と同じ６、　レーン ５と同じ 上記の結果から、本方法が、多様なソースに由来する特定のポリヌクレオチド配 列を検出するための、単純、迅速力）つ正確なアプローチを提供することが明か である。本方法（ま、イム／アッセイで使用されてきた検出可能な信号を含む異 なるタイプの標識を考慮した、高い感度と大きな融通性を提供する。従って、本 方法は、放射活性、分光光度計による光吸収、および、蛍光計あるいはンンチレ ーションカウンターによる発光を、検出し得るイムノアッセイ用の従来の装置中 での使用に容易に適応し得る。本方法は、任意のＤＮＡ配列に適用し得、そして 比較的小型のプローブが使用でき偽陽性の減少、および好ましくないヘテロ対合 の最小化をもたらす。測定のために支持体から標識を解裂することで、支持体か ら離れて測定し得るため、バックグラウンド値を大きく減少し得る。Excess reagent was then reduced with ribose. Polyacrylamide electrophoresis (PAG) E) indicates that the cleavage is complete, resulting in a shorter 02 fragment, where X is 0-(CH2) 2-CaHa-0-CH2-CHO, 5-Ttax-3° and 5-X- yielded Tis-3°. PAGE result: 3: 5-Ti1l-X-Ti5-3 °, NHaOH20℃/1 hour 4: Same as lane 3, but NHaOH60℃ /18 hours 5. Same as lane 4 after 1 hour exposure to Na1Oa, lane 6. Same as 5 The above results demonstrate that the present method can be used to target specific polynucleotide sequences derived from diverse sources. It has been shown to provide a simple, fast, and accurate approach for detecting columns. It is. This method (well, im/assay) has been used in It offers high sensitivity and great flexibility considering different types of labels. Therefore, the book Methods include radioactivity, spectrophotometric light absorption, and fluorometric or microscopic measurements. in conventional equipment for immunoassays that can detect luminescence by a cation counter. can be easily adapted for use in The method can be applied to any DNA sequence and Relatively small probes can be used, reducing false positives and undesirable heteropairing resulting in the minimization of By cleaving the label from the support for measurement, Since the background value can be measured far away from the background value, the background value can be greatly reduced.

さらに、ポリヌクレオチド鎖からの標識の分離の必要に基因する、バンクグラウ ンドさらなる変更（ｒｅｄｉｒｅｃｔ　１ｏｎ）がある。Furthermore, due to the need for separation of the label from the polynucleotide strand, There is a further change (redirect 1 on).

従って本方法は、病気の診断、ハイブリッドＤＮＡの操作のモニタリング、遺伝 的特性の確認、等のため、正確で経済的なりＮＡ配列確認の方法を提供し得る。Therefore, this method is useful for disease diagnosis, monitoring of hybrid DNA manipulation, genetic It can provide an accurate and economical method for confirming NA sequences, for example, to confirm biological properties.

以上の様に本発明を、明確な理解を得るために、説明および実施例により、部分 的に詳細に記載したが、何らかの変更および改変は、添付の請求項の範囲内で実 施し得ることは明かである。As described above, the present invention has been partially explained by explanation and examples in order to obtain a clear understanding. Although described in detail herein, certain changes and modifications may be practiced within the scope of the appended claims. It is clear that it can be done.

ＦＩＧ、　２Ｂ　−ＩＡ ＦＩＧ、２Ｂ−ＩＢ ＦＩＧ、２Ｂ−２Ａ ＦＩＧ、　２Ｂ−２Ｂ ＦＩＧ、　２ＣFIG, 2B-IA FIG, 2B-IB FIG, 2B-2A FIG, 2B-2B FIG, 2C

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] １．核酸試料中に存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在 を検出する方法であって：ハイブリダイズ条件下で、該核酸試料とポリヌクレオ チド試薬とを結合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試薬の成分の何れか一つが 支持体と結合され、そして該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダ イゼーションが、Ｒ１およびＲ２が独立して、アルキレン、アルケニレン、シク ロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリ ールアルキレン（ａｒａｌｋｙｌｅｎｅ）、およびこれらの組合せからなる群か ら選択され、そしてｘが過ヨウ素酸で開裂し得る結合である選択可能な開裂部位 −Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−を介して、該支持体と結合した標識を生じさせる； 該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体に結合した標識を該支持体から実質的 に除去する工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該支持体 から遊離した標識を検出する工程；を含む方法。1. the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample; A method for detecting a nucleic acid sample and a polynucleotide under hybridization conditions. a step of combining with a tide reagent; Here, under the hybridization conditions, any one of the components of the sample or the reagent is a support and a hybrid of the analyte and the polynucleotide reagent; ization, R1 and R2 are independently alkylene, alkenylene, cyclo Roalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, ali aralkylene, and combinations thereof. and x is a bond cleavable with periodic acid. causing a label to be bound to the support via -R1-O-X-O-R2-; Substantially removes label bound to the support from the support without via the selectable cleavage site. cleaving the cleavage site with a periodic acid reagent; and removing the cleavage site from the support. A method comprising: detecting a label released from. ２．前記ポリヌクレオチド試薬が、支持体と結合した第一ポリヌクレオチド捕捉 プローブおよび第二ポリヌクレオチド標識プローブを含有する、 ここで、該第一および第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分析 物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列に相補的なオリゴヌクレオ チド配列を有し、該第一および第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一 つが対象配列である、 ここで、前記捕捉プローブが前記選択可能な開裂部位を含む、 請求項１に記載の方法。2. the polynucleotide reagent is a first polynucleotide capture bound to a support; containing a probe and a second polynucleotide labeled probe; Here, the first and second probes are combined with the analyte under the hybridization conditions. An oligonucleotide complementary to a sequence present in a substance so as to form a double strand with the sequence at least one of the first and second oligonucleotide sequences; is the target array, wherein said capture probe comprises said selectable cleavage site; The method according to claim 1. ３．核酸試料中に存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在 を検出する方法であって：水性溶媒中のハイブリダイズ条件下で、該核酸試料と ポリヌクレオチド試薬とを結合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試薬の成分の何れか一つが 支持体と結合され、そして、該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリ ダイゼーションが、Ｒ１およびＲ２が独立して、アルキレン、アルケニレン、シ クロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、ア リールアルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そして、Ｘ が過ヨウ素酸開裂し得る結合である選択可能な開裂部位−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ ２−を介して、該支持体と結合した標識を生じさせる；該液媒から、ポリヌクレ オチド試薬が結合した該支持体および核酸被分析物を分離する工程； 前記液媒と異なるハイブリダイゼーションストリンジェンシーの溶媒で該支持体 を洗浄し、該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体に結合した標識を除去する 工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該支持体から遊離し た標識を検出する工程；を含む方法。3. the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample; A method for detecting a nucleic acid sample under hybridization conditions in an aqueous solvent. binding a polynucleotide reagent; Here, under the hybridization conditions, any one of the components of the sample or the reagent is a support, and a hybrid of the analyte and the polynucleotide reagent. Dization is performed when R1 and R2 are independently alkylene, alkenylene, cylindrical. Chloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, a selected from the group consisting of arylalkylene, and combinations thereof, and selectable cleavage site -R1-O-X-O-R where is a bond capable of periodate cleavage 2- to cause the label to be bound to the support; from the liquid medium, the polynucleotide is separating the support to which the otide reagent is bound and the nucleic acid analyte; said support in a solvent of a different hybridization stringency than said liquid medium. to remove label bound to the support without passing through the selectable cleavage site. step; cleaving the cleavage site with a periodic acid reagent; and releasing it from the support. detecting the labeled label. ４．前記ポリヌクレオチド試薬が、支持体と結合した第一ポリヌクレオチド捕捉 プローブおよび第二ポリヌクレオチド標識プローブを含有する、 ここで、該第一および第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分析 物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列に相補的なオリゴヌクレオ チド配列を有し、該第一および第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一 つが対象配列である、 ここで、前記捕捉プローブが前記選択可能な開裂部位を含む、 請求項３に記載の方法。4. the polynucleotide reagent is a first polynucleotide capture bound to a support; containing a probe and a second polynucleotide labeled probe; Here, the first and second probes are combined with the analyte under the hybridization conditions. An oligonucleotide complementary to a sequence present in a substance so as to form a double strand with the sequence at least one of the first and second oligonucleotide sequences; is the target array, wherein said capture probe comprises said selectable cleavage site; The method according to claim 3. ５．前記Ｘが、Ｒが水素あるいはアルキルである、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります ▼からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。5. The above X is hydrogen or alkyl, ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼、▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼、▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼, ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ and ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of ▼. ６．前記Ｘが、Ｂが水素あるいはアルキルである、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります ▼からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。6. The above X is hydrogen or alkyl, ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼、▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼、▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼, ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ and ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. 4. The method of claim 3, wherein the method is selected from the group consisting of ▼. ７．一方の末端近傍で支持体と結合し、そして反対の末端に対象の配列に相補的 な配列を有するポリヌクレオチド配列を含む、核酸試料中に存在する核酸被分析 物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在の検出に有用なプローブであって、さ らに、Ｒ１およびＲ２が独立して、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレ ン、シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキ レン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そして、Ｘが、過ヨウ素 酸開裂し得る結合である、選択可能な開裂部位−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−を含 む、プローブ。7. bound to the support near one end and complementary to the sequence of interest at the opposite end A nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample containing a polynucleotide sequence having a sequence A probe useful for detecting the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a Furthermore, R1 and R2 independently represent alkylene, alkenylene, cycloalkylene. cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene and combinations thereof, and X is periodine. Contains a selectable cleavage site -R1-O-X-O-R2-, which is an acid cleavable bond. Mmm, probe. ８．次式の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＤＮＡ１はＤＮＡの第一鎖であり、ＤＮＡ２は、ＤＮＡの第二鎖であり 、Ｒ１およびＲ２は独立して、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、 シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン 、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そして、Ｘは過ヨウ素酸開裂 し得る結合である、 を有するポリヌクレオチド試薬。8. Structure of the following formula: ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ Here, DNA1 is the first strand of DNA, and DNA2 is the second strand of DNA. , R1 and R2 are independently alkylene, alkenylene, cycloalkylene, Cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene , and combinations thereof, and X is periodic acid cleavage. is a possible combination, A polynucleotide reagent having the following. ９．前記Ｘが、Ｒが水素あるいはアルキルである、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります ▼からなる群から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド試薬。9. The above X is hydrogen or alkyl, ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼、▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼、▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼, ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ and ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. 9. The polynucleotide reagent according to claim 8, selected from the group consisting of ▼. １０．前記−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−が、▲数式、化学式、表等があります▼ である、請求項８に記載のポリヌクレオチド試薬。10. The above -R1-O-X-O-R2- has ▲a mathematical formula, a chemical formula, a table, etc.▼ The polynucleotide reagent according to claim 8. １１．次式の構造： Ｙ１−Ｏ−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−Ｏ−Ｙ２ここで、Ｒ１およびＲ２は独立し て、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シク ロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、およびこれらの組合せか らなる群から選択され、Ｘは、過ヨウ素酸開裂し得る結合であり、Ｙ１は、酸に 感受性で、塩基に安定な保護基であり、そしてＹ２は、水素、ホスホルアミダイ ト、ホスホトリエステル、ホスホジエステル、ホスファイト、Ｈ−ホスホネート およびホスホロチオエートからなる群から選択される、で表されるポリヌクレオ チド合成に有用なポリヌクレオチド試薬。11. Structure of the following formula: Y1-O-R1-O-X-O-R2-O-Y2 where R1 and R2 are independently , alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyc looxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof X is a bond cleavable with periodic acid, and Y1 is selected from the group consisting of is a sensitive, base-stable protecting group, and Y2 is hydrogen, phosphoramidyl, phosphotriester, phosphodiester, phosphite, H-phosphonate and a phosphorothioate. Polynucleotide reagent useful for tide synthesis. １２．構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＤＭＴは、ジメトキシトリチルを、そして、ｉＰｒは、イソプロピルを 表わす、 を有する請求項１１に記載の試薬。12. Structural formula: ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ Here, DMT is dimethoxytrityl and iPr is isopropyl. represent, The reagent according to claim 11.