JP2003000299A - Method for detecting target nucleic acid fragment, and kit for detecting target nucleic acid fragment - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a target nucleic acid fragment, capable of being readily and rapidly carried out by using a small-size device in high sensitivity, and further to provide a kit for detecting the target nucleic acid fragment by using the detecting method. SOLUTION: The method for detecting the target nucleic acid fragment comprises treating pyrophosphoric acid formed at the time of polymerase elongation reaction based on a specific base sequence of the target nucleic acid fragment, with an enzyme reaction reagent containing an oxidizing enzyme, amplifying the electron transfer caused at the time of the action of the oxidizing enzyme in the presence of an electrochemically active intercalator, and electrochemically detecting the electron transfer as a current. The detecting kit uses the detecting method.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス、細菌等によ
る感染症の臨床検査、及び個人の遺伝的な特徴による遺
伝的疾患の検査等に有効である、特定の塩基配列を有す
るターゲット核酸断片の存在またはターゲット核酸断片
の塩基配列を検出する方法及び当該方法を使用する核酸
断片の検出キットに関し、特に、ターゲット核酸を鋳型
とするポリメラーゼ伸長反応が進行したか否かを、電気
化学活性インターカレータの存在下に、電極を用いて、
電気化学的に電流を測定して検出することにより、ター
ゲット核酸断片の存在またはターゲット核酸断片の塩基
配列を高感度で検出する方法及び当該方法を使用する核
酸断片の検出キットに関する。The present invention relates to a target nucleic acid fragment having a specific nucleotide sequence, which is effective for clinical examination of infectious diseases caused by viruses, bacteria, etc., and examination of genetic diseases caused by genetic characteristics of individuals. The present invention relates to a method for detecting the presence of a target nucleic acid fragment or a base sequence of a target nucleic acid fragment, and a kit for detecting a nucleic acid fragment using the method. In the presence of
The present invention relates to a method for detecting the presence of a target nucleic acid fragment or the base sequence of the target nucleic acid fragment with high sensitivity by electrochemically measuring and detecting an electric current, and a kit for detecting a nucleic acid fragment using the method.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来から、ウイルス、細菌等による感染
症の臨床検査においては、血液等の体液、糞便、喀痰等
を試料とし検体の培養を行い、ウイルス、細菌等の病原
体を同定することが行われている。しかしながらこれら
の方法は、検体を培養するのに非常に長い時間を必要と
したり、ウイルス、細菌の種類によっては培養自体がう
まく行かないという問題もある。また検体を培養するに
は特別の技術を要する点でも、必ずしも迅速、簡便に満
足のいく結果が得られる方法ではない。2. Description of the Related Art Conventionally, in clinical tests for infectious diseases caused by viruses, bacteria, etc., it is possible to identify pathogens such as viruses, bacteria, etc. by culturing samples using body fluids such as blood, feces, sputum, etc. as samples. Has been done. However, these methods also have problems that it takes a very long time to culture the specimen, and that the culture itself may not be successful depending on the type of virus or bacterium. Also, in terms of requiring a special technique for culturing a sample, it is not always a method that can obtain satisfactory results quickly and simply.

【０００３】また、抗原抗体反応を利用してウイルス、
細菌等の病原体を同定する方法も行われている。この方
法は、検査の自動化も可能であり、迅速性、簡便性の点
では良い方法である。しかしながら、病原体を抗原とし
て検出する抗原検出方法においては、試料中に存在する
病原体の量が不足することにより、病原体を検出できな
い場合があり、感度的に問題がある。 また、病原体の
種類に固有な抗原部位を決定することが困難であるとい
う問題もある。一方、病原体の感染により、体内で産生
された抗体を検出する抗体検出法においては、病原体の
感染から抗体が産生されるまでに時間が必要で、その期
間は検出できないという問題がある。In addition, viruses utilizing the antigen-antibody reaction,
Methods for identifying pathogens such as bacteria are also used. This method can automate the inspection, and is a good method in terms of speed and simplicity. However, in an antigen detection method that detects a pathogen as an antigen, the pathogen cannot be detected in some cases due to an insufficient amount of the pathogen present in the sample, and there is a sensitivity problem. There is also a problem that it is difficult to determine the antigenic site unique to the type of pathogen. On the other hand, in the antibody detection method for detecting the antibody produced in the body due to the infection of the pathogen, there is a problem that it takes time from the infection of the pathogen to the production of the antibody, and the period cannot be detected.

【０００４】これらに対して、ウイルス、細菌等の病原
体の種類に固有な塩基配列を持つ核酸断片（ターゲット
核酸断片）を、塩基配列の相補性を利用して検出する方
法は、病原体を直接に同定することを可能にする方法で
あり、ＤＮＡプローブ法または、ＰＣＲ（ポリメラーゼ
チェーンリアクション）法などの遺伝子検査法として普
及している。例えば、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）遺伝
子検査法は、Ｃ型肝炎のインターフェロン（ＩＮＦ）治
療におけるＩＮＦ投与の検討、治癒のモニタリングにお
いて、ＨＣＶ量を直接知ることのできる方法として威力
を発揮している。On the other hand, a method of detecting a nucleic acid fragment (target nucleic acid fragment) having a base sequence unique to the type of pathogen such as virus or bacterium by utilizing the complementarity of the base sequences directly detects the pathogen. It is a method that enables identification, and is widely used as a genetic test method such as a DNA probe method or a PCR (polymerase chain reaction) method. For example, the HCV (hepatitis C virus) gene test method is effective as a method for directly knowing the amount of HCV in the study of INF administration in the treatment of interferon (INF) for hepatitis C and the monitoring of healing. .

【０００５】今後さらに、ウイルス、細菌等の病原体の
遺伝子的特長（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が明らかになり、そ
の遺伝子的特徴を利用した新しい治療薬が開発されるこ
とが期待できる。その場合には、病原体の同定のみなら
ず、その病原体の遺伝子的特徴を知ることが非常に重要
である。まさに遺伝子検査法はその需要を満たすことの
できる検査方法である。It is expected that the genetic characteristics (genotype) of pathogens such as viruses and bacteria will be further clarified in the future, and new therapeutic agents utilizing the genetic characteristics will be developed. In that case, it is very important not only to identify the pathogen but also to know the genetic characteristics of the pathogen. The genetic test method is exactly a test method that can meet the demand.

【０００６】一方、病原体の同定に限らず、遺伝子検査
法では個人の遺伝子的な特徴を直接検出することが可能
であるので、遺伝子疾患の原因である遺伝子の変異の検
出、癌や糖尿病などの生活習慣病などの病気にかかりや
すさを左右している遺伝子的要因の検出にも用いること
ができる。特に、ヒトゲノムの全塩基配列が決定された
後は、ポストゲノム研究として、今まで以上に遺伝子的
特長と疾患の関係が明らかにされていき、さらに遺伝子
的特長を利用した治療薬が開発されていくことが期待で
きる。ポストゲノム研究の進展に伴って、今後ますます
遺伝子検査法の需要が大きくなっていくことが予想され
る。On the other hand, not only the identification of the pathogen but also the genetic test method can directly detect the genetic characteristics of the individual. Therefore, it is possible to detect the mutation of the gene causing the genetic disease, cancer, diabetes, etc. It can also be used to detect genetic factors that influence the susceptibility to diseases such as lifestyle-related diseases. In particular, after the entire nucleotide sequence of the human genome has been determined, as a post-genome study, the relationship between genetic features and diseases will be clarified more than ever, and therapeutic drugs that utilize genetic features will be developed. I can expect to go. With the progress of post-genome research, it is expected that the demand for genetic test methods will increase in the future.

【０００７】しかしながら、現在行われている遺伝子検
査法には特殊な技術、複雑な操作、及び特殊な装置等が
必要であり、遺伝子検査法を実施できる施設は、大規模
な検査センターなどに限られている。ウイルス、細菌等
による感染症の検査においても、また個人の遺伝子的特
長の検査においても、診断、治療の指針の決定がその場
で、できるだけ速く、かつ正確に行えればより効力を発
揮する。そのためには、誰でもが簡単な操作で実施で
き、検査結果を迅速に得ることのできる、高感度の新し
い遺伝子検査法が必要である。However, the current genetic testing methods require special techniques, complicated operations, and special equipment, and the facilities that can carry out genetic testing methods are limited to large-scale testing centers. Has been. In the examination of infectious diseases caused by viruses, bacteria, etc., and also in the examination of individual genetic characteristics, it is more effective if the guideline for diagnosis and treatment can be determined on the spot as quickly and accurately as possible. For that purpose, a highly sensitive new genetic test method that anyone can perform with a simple operation and can obtain a test result quickly is required.

【０００８】これまでも簡便性、迅速性の向上を目指し
て、ターゲット核酸断片を鋳型としたポリメラーゼ伸長
反応の進行の検出を利用した遺伝子検査法が開発されて
いる。ターゲット核酸断片の特定核酸領域をＰＣＲによ
り増幅する際、増幅産物の生成の過程を蛍光強度の変化
としてリアルタイムで検出する方法（Ｒｅａｌ Ｔｉｍ
ｅ ＰＣＲ法）は、ＰＣＲ後に増幅産物を電気泳動し、
結果を解析するという工程を必要としないことから迅速
性の点で良い方法であり、ＴａｑＭａｎプローブ法（Ｐ
Ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、およびＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｅａｃｏｎ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）とし
て商品化されている。しかし、これらの方法は、ＦＲＥ
Ｔ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅ
ｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用した方法で、実施
には蛍光強度の変化を測定することのできる装置と、蛍
光色素とそのクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が組み
合わせて標識された特殊なハイブリダイゼーションプロ
ーブを用意する必要がある点で問題があり、未だ特殊技
術の域を出ていない。[0008] A genetic test method utilizing detection of progress of polymerase extension reaction using a target nucleic acid fragment as a template has been developed so far for the purpose of improving convenience and speed. When amplifying a specific nucleic acid region of a target nucleic acid fragment by PCR, a method of detecting in real time the process of generation of an amplification product as a change in fluorescence intensity (Real Tim)
e PCR method), the amplification product is electrophoresed after PCR,
Since the step of analyzing the result is not required, it is a good method in terms of rapidity, and the TaqMan probe method (P
E Biosystems), and Molecul
It is commercialized as the ar Beacon method (Stratagene). However, these methods
T (fluorescence resonance e)
In this method, it is necessary to prepare a device capable of measuring changes in fluorescence intensity and a special hybridization probe labeled with a combination of a fluorescent dye and its quencher. There is a problem in point, and it is still out of the special technology.

【０００９】また、インターカレータ性蛍光物質の存在
下でターゲット核酸断片の特定核酸領域をＰＣＲで増幅
し、その際の蛍光強度の変化を検出する方法（ＩＭ−Ｐ
ＣＲ：ｉｎｔｅｒｃａｒａｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉ
ｎｇ ＰＣＲ法）が「医学のあゆみ Ｖｏｌ．１７３、Ｎ
ｏ．１２、１９９５」に記載されている。この方法は、
Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法としては、特別なハイブリ
ダイゼーションプローブを必要としない点で良いが、や
はり実施には蛍光強度の変化を測定することのできる装
置が必要である。また、ターゲット核酸断片の特定核酸
領域のＰＣＲ増幅の有無にかかわらず、インターカレー
タ性蛍光物質は系内に存在する核酸断片全てに結合する
ので、特異性の点でも問題がある。A method of amplifying a specific nucleic acid region of a target nucleic acid fragment by PCR in the presence of an intercalating fluorescent substance and detecting a change in fluorescence intensity at that time (IM-P
CR: intercalation monitor
ng PCR method) "Medical History Vol.173, N
o. 12, 1995 ". This method
The Real Time PCR method is good in that it does not require a special hybridization probe, but it also requires an apparatus capable of measuring changes in fluorescence intensity for its implementation. In addition, since the intercalating fluorescent substance binds to all the nucleic acid fragments existing in the system regardless of the presence or absence of PCR amplification of the specific nucleic acid region of the target nucleic acid fragment, there is a problem in specificity.

【００１０】一方、ターゲット核酸断片の特定領域にヌ
クレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー
をハイブリダイズさせ、デオキシヌクレオシド３リン酸
（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼの存
在下で伸長反応、分解反応を繰り返して、生成するピロ
燐酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出する方
法が、特開平７−２３１７９９号公報に開示されてい
る。ポリメラーゼ伸長反応に伴って生成するピロ燐酸を
検出することによるターゲット核酸断片の検出方法は、
ポリメラーゼ伸長反応の副産物である一般化学物質を検
出することで、ターゲット核酸断片の検出を可能にして
いる点で優れている。しかしながら、これまでピロ燐酸
を簡便に、かつ高感度で検出する方法は知られておら
ず、上記公報においても、ピロ燐酸をアデノシン−５’
−ホスホサルフェートおよびアデノシン３燐酸（ＡＴ
Ｐ）スルフリラーゼと反応させて生ずるアデノシン３燐
酸（ＡＴＰ）が、ルシフェラーゼの存在下、ルシフェリ
ンとの反応時に生じる発光を検出する方法しか記載され
ていない。この方法では、発光を測定することのできる
装置が必要である点で簡便性の点で問題が残る。また、
ヌクレアーゼ耐性を有するプライマーを使用し、かつＤ
ＮＡポリメラーゼとヌクレアーゼを併用し、ポリメラー
ゼ反応とヌクレアーゼ反応を繰り返して実施するこで、
実質的に連続して伸長反応が進行しない条件で実施され
る点では本発明とは異なるものである。On the other hand, an oligonucleotide primer having nuclease resistance is hybridized with a specific region of the target nucleic acid fragment, and the extension reaction and the decomposition reaction are repeated in the presence of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase and nuclease, A method for detecting the produced pyrophosphoric acid or deoxynucleoside monophosphoric acid is disclosed in JP-A-7-231799. A method for detecting a target nucleic acid fragment by detecting pyrophosphate generated by the polymerase extension reaction is as follows:
It is excellent in that it enables detection of target nucleic acid fragments by detecting general chemical substances that are by-products of the polymerase extension reaction. However, no method for detecting pyrophosphoric acid easily and with high sensitivity has been known so far, and in the above publication, pyrophosphoric acid is detected as adenosine-5 ′.
-Phosphosulfate and adenosine triphosphate (AT
P) Adenosine triphosphate (ATP) produced by reaction with sulfurylase is only described as a method for detecting luminescence produced upon reaction with luciferin in the presence of luciferase. This method has a problem in terms of simplicity in that a device capable of measuring luminescence is required. Also,
Use a nuclease resistant primer and
By using NA polymerase and nuclease together and repeating the polymerase reaction and nuclease reaction,
This is different from the present invention in that the extension reaction is carried out under conditions where the extension reaction does not proceed substantially continuously.

【００１１】[0011]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な技
術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、誰
でもが簡便かつ迅速に小型の装置を用いて実施すること
のできる、高感度のターゲット核酸断片の検出方法を提
供することを課題とする。また、これらの目的を達成す
るために、省スペースで自動化が可能なターゲット核酸
断片の検出方法の提供も課題とする。更に、これらの検
出方法を用いたターゲット核酸断片の検出キットの提供
も課題とする。The present invention can be implemented simply and quickly by a small device without the need for special techniques, complicated operations, and special devices. An object is to provide a highly sensitive method for detecting a target nucleic acid fragment. In order to achieve these objects, it is also an object to provide a method for detecting a target nucleic acid fragment that can be automated in a space-saving manner. Further, it is an object to provide a kit for detecting a target nucleic acid fragment using these detection methods.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、ターゲット核酸断片の特定の塩基配列
に基づくポリメラーゼ伸長反応の際に生成するピロ燐酸
に対して、酸化酵素を含む酵素反応試薬で処理し、酸化
酵素が作用する際に起こる電子移動を、電気化学的活性
インターカレータの存在下で増幅し、電気化学的に電流
として検出することで、簡便性、迅速性に優れ、かつ高
感度でターゲット核酸断片の検出を行えることを見出
し、本発明を完成するに至った。[Means for Solving the Problems] In order to solve the above problems, the present inventor contains an oxidase for a pyrophosphate generated in a polymerase extension reaction based on a specific base sequence of a target nucleic acid fragment. The electron transfer that occurs when an oxidase acts upon treatment with an enzyme reaction reagent is amplified in the presence of an electrochemically active intercalator and detected electrochemically as an electric current, resulting in excellent simplicity and rapidity. Moreover, they have found that the target nucleic acid fragment can be detected with high sensitivity, and have completed the present invention.

【００１３】即ち、本発明は、少なくとも一部の塩基配
列が既知であるターゲット核酸断片に対し、当該ターゲ
ット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライ
マー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸
（ｄＮＴＰ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼの存
在下に、前記ターゲット核酸断片を鋳型にして前記プラ
イマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応が
連続して進行するか否かにより、前記ターゲット核酸断
片の存在またはターゲット核酸断片の塩基配列を検出す
る方法において、前記ポリメラーゼ伸長反応により生成
するピロ燐酸に対して、少なくとも一種の酸化酵素を含
む酵素反応試薬を作用させ、電気化学活性インターカレ
ータの存在下に、電極を用いて電気化学的に電流を測定
することを特徴とするターゲット核酸断片の検出方法、
及び当該方法を用いた核酸断片の検出キットにある。That is, in the present invention, at least one primer complementary to a part of the target nucleic acid fragment having at least a part of a known base sequence, and at least one deoxynucleoside triphosphate ( dNTP) and the presence of at least one polymerase, the target nucleic acid fragment of the target nucleic acid fragment is determined depending on whether or not the polymerase extension reaction starting from the 3 ′ end of the primer is continuously performed using the target nucleic acid fragment as a template. In the method for detecting the base sequence of the presence or target nucleic acid fragment, an enzyme reaction reagent containing at least one oxidase is allowed to act on pyrophosphate generated by the polymerase extension reaction, and the presence of an electrochemically active intercalator , Characterized by electrochemically measuring current using electrodes A method for detecting a target nucleic acid fragment,
And a kit for detecting a nucleic acid fragment using the method.

【００１４】[0014]

【発明の実施の形態】本発明のターゲット核酸断片検出
方法の好ましい形態は以下の通りである。 (イ) ピロ燐酸に作用する酵素反応試薬が、キサントシ
ンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼを含有
する酵素反応試薬である。 (ロ) 電気化学活性インターカレータが、酸化還元活性
を有する縫い込み型インターカレータである。 (ハ) 電極が、ＤＮＡ断片が表面に固定されているＤＮ
Ａ修飾電極である。 (ニ) 電気化学的な電流の測定が、サイクリックボルタ
ンメトリーまたはディファレンシャルパルスボルタンメ
トリーである。 (ホ) ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランスクリプター
ゼ）からなるグループから選択されるポリメラーゼであ
る。Preferred embodiments of the method for detecting a target nucleic acid fragment of the present invention are as follows. (A) The enzyme reaction reagent that acts on pyrophosphate is an enzyme reaction reagent containing xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, and xanthine oxidase. (B) The electrochemically active intercalator is a sewn-in intercalator having redox activity. (C) The electrode is a DN on which DNA fragments are immobilized on the surface
A modified electrode. (D) The electrochemical current measurement is cyclic voltammetry or differential pulse voltammetry. (E) The polymerase is DNA polymerase I, DNA
It is a polymerase selected from the group consisting of the Klenow fragment of polymerase I, Bst DNA polymerase, and reverse transcriptase.

【００１５】また、本発明の別の形態は、キサントシン
またはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼを含有す
る酵素反応試薬、電気化学活性縫い込み型インターカレ
ータ、及び電極の各要素を含むキットにある。この場
合、電極はＤＮＡ修飾電極であることが好ましい。Another aspect of the present invention is a kit containing each element of xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, enzyme reaction reagent containing xanthine oxidase, electrochemically active threading intercalator, and electrode. It is in. In this case, the electrode is preferably a DNA modified electrode.

【００１６】本発明の更に別の形態は、検出するターゲ
ット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライ
マー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸
（ｄＮＴＰ）、少なくとも一種のポリメラーゼを含有す
るポリメラーゼ伸長反応試薬、キサントシンまたはイノ
シン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ、キサンチンオキシダーゼを含有する酵素反応
試薬、電気化学活性縫い込み型インターカレータ、及び
電極の各要素を含むキットにある。この場合において
も、電極はＤＮＡ修飾電極であることが好ましい。Yet another aspect of the present invention is a polymerase extension containing at least one primer complementary to a part of a target nucleic acid fragment to be detected, at least one deoxynucleoside triphosphate (dNTP), and at least one polymerase. A kit containing each element of a reaction reagent, xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase-containing enzyme reaction reagent, electrochemically active threading intercalator, and electrode. Also in this case, the electrode is preferably a DNA-modified electrode.

【００１７】以下に本発明の実施の形態について詳細に
説明する。Embodiments of the present invention will be described in detail below.

【００１８】(Ａ) ターゲット核酸断片：本発明におい
て検出の対象となるターゲット核酸断片とは、少なくと
も一部の塩基配列が既知であるポリヌクレオチドであ
り、動物、微生物、細菌、植物などすべての生物から単
離されるゲノミックＤＮＡ断片が対象となり得る。また
ウイルスから単離可能なＲＮＡ断片またはＤＮＡ断片、
およびｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡ断片も
対象とすることが可能である。ターゲット核酸断片はで
きる限り精製され、核酸断片以外の余分な成分が取り除
かれていることが望ましい。例えば、動物（例えば人
間）の血液から単離したゲノミックＤＮＡ断片を対象と
する場合または血液中に存在する感染細菌やウイルスの
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を対象とする場合、単
離の過程で破壊された白血球細胞膜、赤血球中から溶出
したヘモグロビン、および血液中存在するその他の一般
化学物質は、十分に取り除いておく必要がある。特にヘ
モグロンビンは、続いておこなうポリメラーゼ伸長反応
を阻害する。また血液中に一般生化学物質として存在す
るピロ燐酸や燐酸は、ポリメラーゼ伸長反応により生成
するピロ燐酸の正確な検出の妨害要因になる。(A) Target nucleic acid fragment: The target nucleic acid fragment to be detected in the present invention is a polynucleotide of which at least a part of the base sequence is known, and all organisms such as animals, microorganisms, bacteria and plants. Genomic DNA fragments isolated from RNA or DNA fragments that can be isolated from viruses,
Also, a cDNA fragment synthesized using mRNA as a template can be used. It is desirable that the target nucleic acid fragment be purified as much as possible and that excess components other than the nucleic acid fragment be removed. For example, when a genomic DNA fragment isolated from the blood of an animal (for example, a human) is targeted or a nucleic acid (DNA or RNA) fragment of an infectious bacterium or virus present in blood is targeted, the isolation process Destroyed white blood cell membranes, hemoglobin eluted from red blood cells, and other common chemicals present in blood must be well removed. In particular, hemoglobin inhibits the subsequent polymerase extension reaction. Pyrophosphate and phosphate present in blood as general biochemical substances interfere with accurate detection of pyrophosphate produced by polymerase extension reaction.

【００１９】(Ｂ) ターゲット核酸断片と相補的なプラ
イマー：本発明において使用するターゲット核酸断片と
相補的なプライマーは、ターゲット核酸断片の塩基配列
が既知である目的の部位に対して相補的な塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである。このターゲット核酸断
片と相補的なプライマーがターゲット核酸断片の目的の
部位にハイブリダイゼーションすることで、プライマー
の３’末端を起点に、ターゲット核酸を鋳型としポリメ
ラーゼ伸長反応が進行する。即ち、本発明においてはプ
ライマーがターゲット核酸断片の目的の部位を認識して
特異的にハイブリダイゼーションするか否かがポイント
となる。本発明で使用するプライマーの好ましい塩基数
は５〜６０塩基である。特に好ましくは１５〜４０塩基
である。プライマーの塩基数は少なすぎると、ターゲッ
ト核酸断片の目的の部位との特異的性が低下するだけで
なく、ターゲット核酸断片とのハイブリッド自体が安定
に形成できない。また、プライマーの塩基数は多すぎる
と、プライマー間またはプライマー内で塩基間の水素結
合により２本鎖を形成してしまい、やはり特異性が低下
する。(B) Primer complementary to target nucleic acid fragment: The primer complementary to the target nucleic acid fragment used in the present invention is a base complementary to a target site whose base sequence of the target nucleic acid fragment is known. An oligonucleotide having a sequence. The primer complementary to the target nucleic acid fragment hybridizes to the target site of the target nucleic acid fragment, and the polymerase extension reaction proceeds from the 3'end of the primer as a starting point using the target nucleic acid as a template. That is, in the present invention, the point is whether or not the primer recognizes the target site of the target nucleic acid fragment and specifically hybridizes. The preferred number of bases of the primer used in the present invention is 5 to 60 bases. Particularly preferred is 15 to 40 bases. If the number of bases in the primer is too small, not only the specificity of the target nucleic acid fragment with the target site is lowered, but also the hybrid itself with the target nucleic acid fragment cannot be stably formed. If the number of bases in the primer is too large, hydrogen bonds between the primers or between the bases form a double strand due to hydrogen bonding between the bases, which also lowers the specificity.

【００２０】本発明の方法を用いてターゲット核酸断片
の存在を検出する場合、ターゲット核酸断片の異なる部
位に対して、それぞれの部位に相補的なプライマーを複
数使用することも可能である。このようにターゲット核
酸断片を複数の部位で認識することで、ターゲット核酸
断片の存在の検出において、特異性が向上する。また、
ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣＲ法）す
る場合には、その増幅法に応じて複数のプライマーを設
計することも可能である。本発明の方法を用いてターゲ
ット核酸断片の塩基配列を検出する場合、特に変異また
は多型の有無を検出する場合は、目的の変異または多型
の部分を含むように、変異または多型に対応する塩基の
種類でプライマーを設計する。そうすることで、ターゲ
ット核酸断片の変異または多型の有無により、ターゲッ
ト核酸断片へのプライマーのハイブリダイゼーションの
有無に差異が生じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差
異として検出することが可能になる。また、変異または
多型に対応する部分をプライマーの３’末端付近に設定
することでポリメーラーゼの反応部位の認識に差異が生
じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差異として検出す
ることも可能である。When detecting the presence of a target nucleic acid fragment using the method of the present invention, it is possible to use a plurality of primers complementary to different sites of the target nucleic acid fragment. By recognizing the target nucleic acid fragment at a plurality of sites in this way, the specificity is improved in detecting the presence of the target nucleic acid fragment. Also,
When a part of the target nucleic acid fragment is amplified (for example, PCR method), it is possible to design a plurality of primers according to the amplification method. When detecting the base sequence of a target nucleic acid fragment using the method of the present invention, particularly when detecting the presence or absence of a mutation or polymorphism, the mutation or polymorphism is dealt with so that the target mutation or polymorphism part is included. Design a primer based on the type of base to be used. By doing so, the presence or absence of the hybridization of the primer to the target nucleic acid fragment is different depending on the presence or absence of the mutation or polymorphism of the target nucleic acid fragment, and as a result, it can be detected as the difference in the polymerase extension reaction. Further, setting a portion corresponding to a mutation or polymorphism near the 3'end of the primer causes a difference in recognition of the reaction site of the polymerase, and as a result, it can be detected as a difference in polymerase extension reaction.

【００２１】(Ｃ) ポリメラーゼ：本発明において使用
するポリメラーゼは、ターゲット核酸がＤＮＡの場合
は、ターゲット核酸断片の一本鎖に変性された部分にプ
ライマーがハイブリダイゼーションすることで形成され
た２本鎖の部分を起点として、５’→３’の方向に、デ
オキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料とし
て、ターゲット核酸断片を鋳型にして相補的な伸長反応
を触媒するＤＮＡポリメーラーゼである。具体的に使用
されるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ等がある。ＤＮＡポリメラーゼは目
的に応じて選択または組み合わせることが可能である。
例えば、ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣ
Ｒ法）する場合には、耐熱性に優れたＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼを用いることが有効である。また、「ＢＩＯ
ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２，２００
１」に記載されている増幅法（ＬＡＭＰ法：Ｌｏｏｐ−
ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）を用いてターゲット核酸
断片の一部を増幅する場合には、５’→３’方向へのヌ
クレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖ＤＮＡを１
本鎖ＤＮＡとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖
置換型のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂｓｔ ＤＮＡポ
リメラーゼを使用することが有効である。その他、目的
に応じて、３’→５’方向へのヘキソキナーゼ活性を持
つ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ、及びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも可
能である。(C) Polymerase: When the target nucleic acid is DNA, the polymerase used in the present invention is a double-stranded chain formed by hybridization of a primer to a portion of the target nucleic acid fragment denatured into a single strand. Is a DNA polymerase that catalyzes a complementary extension reaction using a target nucleic acid fragment as a template, in the 5 ′ → 3 ′ direction starting from the portion of (1) and using deoxynucleoside triphosphate (dNTP) as a material. Specific examples of the DNA polymerase used include DNA polymerase I, Klenow fragment of DNA polymerase I, Bst
There are DNA polymerase and the like. DNA polymerases can be selected or combined depending on the purpose.
For example, a part of the target nucleic acid fragment is amplified (for example, PC
R method), it is effective to use Taq DNA polymerase having excellent heat resistance. In addition, "BIO
INDUSTRY, Vol. 18, No. 2,200
1 ”(LAMP method: Loop-
mediated Isothermal Amplif
When a part of the target nucleic acid fragment is amplified by using cationation of DNA), there is no nuclease activity in the 5 ′ → 3 ′ direction and the double-stranded DNA on the template is
It is effective to use Bst DNA polymerase as a strand displacement type DNA polymerase which catalyzes an elongation reaction while releasing it as a double-stranded DNA. In addition, depending on the purpose, it is also possible to use DNA polymerase α, T4 DNA polymerase, and T7 DNA polymerase that have hexokinase activity in the 3 ′ → 5 ′ direction in combination.

【００２２】また、ＲＮＡウイルスのゲノミック核酸ま
たはｍＲＮＡがターゲット核酸断片である場合には、逆
転写活性を有するリバーストランスクリプターゼを使用
することが可能である。さらにリバーストランスクリプ
ターゼとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも
可能である。When the genomic nucleic acid or mRNA of RNA virus is the target nucleic acid fragment, reverse transcriptase having reverse transcription activity can be used. Further, reverse transcriptase and Taq DNA polymerase can be used in combination.

【００２３】(Ｄ) ポリメラーゼ伸長反応：本発明にお
いて対象となるポリメラーゼ伸長反応には、前記（Ａ）
に記載されているようなターゲット核酸断片の１本鎖に
変性された部分の一部に特異的にハイブリダイゼーショ
ンした、前記（Ｂ）に記載されているようなターゲット
核酸断片と相補的なプライマーの３’末端を起点とし
て、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料
として、前記（Ｃ）に記載されているようなポリメラー
ゼを触媒として、ターゲット核酸断片を鋳型にして進行
する相補的な核酸の伸長反応の全てが含まれる。この相
補的な核酸の伸長反応とは、少なくとも２回（２塩基
分）、連続しての伸長反応が起こることを指している。(D) Polymerase extension reaction: The polymerase extension reaction of interest in the present invention includes the above (A)
Of a primer complementary to the target nucleic acid fragment as described in (B) above, which hybridizes specifically to a part of the single-stranded denatured portion of the target nucleic acid fragment as described in A complementary nucleic acid extension that proceeds from the 3 ′ end as a starting material using deoxynucleoside triphosphate (dNTP) as a material, using the polymerase as described in (C) above as a catalyst and the target nucleic acid fragment as a template All reactions are included. This complementary nucleic acid extension reaction means that continuous extension reactions occur at least twice (for two bases).

【００２４】以下に、例として代表的なポリメラーゼ伸
長反応、およびポリメラーゼ伸長反応を伴うターゲット
核酸断片の目的部位の増幅反応の例を示す。ターゲット
核酸断片を鋳型にして、５’→３’の方向へのポリメラ
ーゼ伸長反応を一度だけ行う場合が最も単純である。こ
のポリメラーゼ伸長反応は等温の条件で実施することが
できる。この場合には、ポリメラーゼ伸長反応の結果と
して生成するピロ燐酸の量は、最初のターゲット核酸断
片の量に比例する。即ち定量的にターゲット核酸断片の
存在を検出するのに適した方法である。The following shows examples of typical polymerase extension reaction and amplification reaction of the target site of the target nucleic acid fragment accompanied by the polymerase extension reaction. The simplest case is to perform the polymerase extension reaction in the 5 ′ → 3 ′ direction only once using the target nucleic acid fragment as a template. This polymerase extension reaction can be carried out under isothermal conditions. In this case, the amount of pyrophosphate produced as a result of the polymerase extension reaction is proportional to the amount of initial target nucleic acid fragment. That is, it is a method suitable for quantitatively detecting the presence of the target nucleic acid fragment.

【００２５】ターゲット核酸の量が少ない場合は、ポリ
メラーゼ伸長反応を利用した何らかの手段でターゲット
核酸の目的部分を増幅することが好ましい。ターゲット
核酸の増幅には、これまで開発、発明されてきた各種の
方法を使用することができる。ターゲット核酸の増幅法
で最も一般的で普及している方法はＰＣＲ（ポリメラー
ゼチェーンリアクション）法である。ＰＣＲ法では、反
応液の温度の上げ下げを周期的にコントロールすること
により、ディネイチャー（核酸断片を２本鎖から１本鎖
に変性する工程）→アニーリング（１本鎖に変性した核
酸断片にプライマーをハイブイリダイズさせる工程）→
ポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）伸長反応
→ディネイチャーの周期的な工程を繰り返すことで、タ
ーゲット核酸断片の目的部分を増幅する方法である。最
終的に、ターゲット核酸断片の目的部位は初期量の１０
０万倍にも増幅し得る。そのためＰＣＲ法の増幅過程で
のポリメラーゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も
多くなり、検出が容易になる。しかしながらＰＣＲ法を
用いた場合には、ターゲット核酸断片の目的部位は指数
的に増幅するために、ターゲット核酸断片の初期量を定
量的に検出することは困難である。When the amount of the target nucleic acid is small, it is preferable to amplify the target portion of the target nucleic acid by some means utilizing the polymerase extension reaction. For the amplification of the target nucleic acid, various methods that have been developed and invented so far can be used. The most popular and popular method for amplifying a target nucleic acid is the PCR (polymerase chain reaction) method. In the PCR method, denaturation (the step of denaturing a nucleic acid fragment from double-stranded to single-stranded) is controlled by periodically controlling the temperature rise and fall of the reaction solution → annealing (primer to the nucleic acid fragment denatured to single-stranded) Hive iridizing process) →
This is a method of amplifying a target portion of a target nucleic acid fragment by repeating a periodic step of polymerase (Taq DNA polymerase) extension reaction → denature. Finally, the target site of the target nucleic acid fragment has an initial amount of 10
It can be amplified up to 100,000 times. Therefore, the amount of accumulated pyrophosphate generated in the polymerase extension reaction in the amplification process of the PCR method increases, and the detection becomes easy. However, when the PCR method is used, the target site of the target nucleic acid fragment is amplified exponentially, so it is difficult to quantitatively detect the initial amount of the target nucleic acid fragment.

【００２６】特開平５−１３０８７０号公報に記載され
ている、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッ
セイ法もポリメラーゼ伸長反応を利用した、ターゲット
核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法は
ターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイ
ゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ
伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作
用させて、プライマーを逆方向から分解する方法であ
る。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーが
ハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長
反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレーアゼ
による分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここ
で、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレーアゼ
による分解反応は等温条件で実施することが可能であ
る。このサイクリングアッセイ法においても繰り返され
るポリメラーゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も
多くなり、検出が容易になる。The cycling assay method using exonuclease described in JP-A-5-130870 is also one of the methods for amplifying a target site of a target nucleic acid fragment using a polymerase extension reaction. This method is a method in which 5 '→ 3' exonuclease is acted together with a polymerase extension reaction starting from a primer specifically hybridized to a target site of a target nucleic acid fragment to decompose the primer from the reverse direction. A new primer hybridizes instead of the decomposed primer, and the extension reaction by the DNA polymerase proceeds again. The extension reaction by the polymerase and the decomposition reaction by the exonuclease which removes the previously extended chain are sequentially and periodically repeated. Here, the elongation reaction by the polymerase and the decomposition reaction by the exonuclease can be carried out under isothermal conditions. Also in this cycling assay method, the accumulated amount of pyrophosphate generated in the repeated polymerase extension reaction increases, and the detection becomes easy.

【００２７】近年開発されたターゲット核酸断片の目的
部位の増幅法として、前記ＬＡＭＰ法がある。この方法
は、ターゲット核酸断片の少なくとも６個所の特定部位
を相補的に認識する少なくとも４種のプライマーと、
５’→３’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型
上の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとして遊離させながら
伸長反応を触媒する鎖置換型のＢｓｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片
の目的部位を、特別な構造とって増幅する方法である。
このＬＡＭＰ法の増幅効率は高く、ポリメラーゼ伸長反
応で生成するピロ燐酸の蓄積量も非常に多くなり、検出
が容易になる。The LAMP method is a recently developed method for amplifying a target site of a target nucleic acid fragment. This method comprises at least four types of primers that complementarily recognize at least six specific sites of a target nucleic acid fragment,
By using a strand displacement type Bst DNA polymerase which has no nuclease activity in the 5 ′ → 3 ′ direction and which catalyzes the elongation reaction while releasing the double-stranded DNA on the template as single-stranded DNA, isothermal conditions can be obtained. Is a method of amplifying a target site of a target nucleic acid fragment with a special structure.
The amplification efficiency of this LAMP method is high, and the accumulated amount of pyrophosphate generated in the polymerase extension reaction is also very large, which facilitates detection.

【００２８】ターゲット核酸断片がＲＮＡ断片の場合
は、逆転写活性を有するリバーストランスクリプターゼ
を使用し、ＲＮＡ鎖を鋳型にして伸長反応を行うことが
可能である。さらにリバーストランスクリプターゼとＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用し、ＲＴ（リバースト
ランスクリプション）反応に引き続いてＰＣＲ反応を行
う、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。このＲＴ反
応またはＲＴ−ＰＣＲ反応で生成するピロ燐酸を検出す
ることで、ターゲット核酸断片のＲＮＡ断片の存在を検
出することができる。この方法は、ＲＮＡウイルスの存
在を検出する場合に有効である。When the target nucleic acid fragment is an RNA fragment, it is possible to use a reverse transcriptase having a reverse transcription activity and carry out an extension reaction using the RNA chain as a template. In addition, reverse transcriptase and T
The RT-PCR method in which an aq DNA polymerase is used in combination and an RT (reverse transcription) reaction is followed by a PCR reaction can be used. The presence of the RNA fragment of the target nucleic acid fragment can be detected by detecting pyrophosphate produced in this RT reaction or RT-PCR reaction. This method is effective in detecting the presence of RNA viruses.

【００２９】(Ｅ) ピロ燐酸に作用する酵素反応試薬：
本発明においては、前記（Ｄ）に示したようなポリメラ
ーゼ伸長反応の際に生成するピロ燐酸に対して作用する
酵素反応試薬を使用する。このような酵素反応試薬は少
なくとも一つの酸化酵素を含んでいる。本発明に適した
ピロ燐酸に作用する酵素反応試薬による酵素反応は、式
（１）または式（２）に示した反応である。(E) Enzyme reaction reagent acting on pyrophosphate:
In the present invention, an enzyme reaction reagent that acts on pyrophosphate produced in the polymerase extension reaction as shown in (D) above is used. Such an enzyme reaction reagent contains at least one oxidase. The enzymatic reaction with the enzymatic reaction reagent that acts on pyrophosphate suitable for the present invention is the reaction shown in Formula (1) or Formula (2).

【００３０】[0030]

【化１】 [Chemical 1]

【００３１】[0031]

【化２】 [Chemical 2]

【００３２】式（１）または式（２）に示した酵素反応
は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで無機燐
酸（Ｐｉ）に変換し、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ（ＰＮＰ）により無機燐酸（Ｐｉ）をキサントシンま
たはイノシンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒポ
キサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により
酸化して尿酸を生成させている。In the enzymatic reaction shown in formula (1) or formula (2), pyrophosphate (PPi) is converted to inorganic phosphate (Pi) by pyrophosphatase, and purine nucleoside phosphorylase (PNP) converts inorganic phosphate (Pi). It is reacted with xanthosine or inosine, and the resulting xanthine or hypoxanthine is oxidized by xanthine oxidase (XOD) to generate uric acid.

【００３３】式（１）または式（２）に示した酵素反応
において、ピロホスファターゼ（ＥＣ３，６，１，１）
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，ＥＣ２．
４．２．１）、及びキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ，
ＥＣ１．２．３．２）は市販のものを使用することがで
きる。In the enzymatic reaction shown in formula (1) or formula (2), pyrophosphatase (EC3,6,1,1)
Purine nucleoside phosphorylase (PNP, EC2.
4.2.1), and xanthine oxidase (XOD,
A commercially available product can be used as EC 1.2.3.2).

【００３４】式（１）または式（２）に示した酵素反応
において、キサンチンまたはヒポキサンチンがキサンチ
ンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化される際に電子移
動が起こる。本発明においては、この電子移動を検出す
る。In the enzymatic reaction shown in formula (1) or formula (2), electron transfer occurs when xanthine or hypoxanthine is oxidized by xanthine oxidase (XOD). In the present invention, this electron transfer is detected.

【００３５】式（１）または式（２）に示した酵素反応
に、さらにウリカーゼを作用させて、式１または式２酵
素反応で生成した尿酸をさらに酸化し、その際の電子移
動を検出することも可能である。Uricase is further acted on the enzyme reaction shown in formula (1) or formula (2) to further oxidize the uric acid produced in the enzyme reaction of formula 1 or formula 2, and the electron transfer at that time is detected. It is also possible.

【００３６】(Ｆ) 電気化学活性インターカレータ：本
発明で使用する電気化学活性インターカレータは、ＤＮ
Ａ断片にインターカレーションし、前記（Ｅ）で示し
た、ピロリン酸に対して作用する酵素反応において、酸
化酵素が作用する際に起こる電子移動を増幅する。この
場合、電気化学活性インターカレータがインターカレー
ションするＤＮＡ断片は、前記（Ｄ）に示したようなポ
リメラーゼ伸長反応により生成する２本鎖ＤＮＡ断片で
あっても、（Ｈ）で後述する、ＤＮＡ修飾電極の表面に
固定された、ポリメラーゼ伸長反応により生成する２本
鎖核酸断片とは無関係の、ＤＮＡ断片であっても良い。(F) Electrochemically active intercalator: The electrochemically active intercalator used in the present invention is DN
It intercalates with the A fragment and amplifies the electron transfer that occurs when the oxidase acts in the enzymatic reaction acting on pyrophosphate shown in (E) above. In this case, even if the DNA fragment intercalated by the electrochemically active intercalator is a double-stranded DNA fragment produced by the polymerase extension reaction as shown in (D) above, it will be described later in (H). It may be a DNA fragment fixed to the surface of the modified electrode and unrelated to the double-stranded nucleic acid fragment generated by the polymerase extension reaction.

【００３７】このような、電気化学活性インターカレー
タとして好ましいインターカレータは、酸化還元活性を
有する縫い込み型インターカレータである。酸化還元活
性を有する縫い込み型インターカレータとしては、特開
平９−２８８０８０号公報および文献（Ｊ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１１１、１９９８）に記載
のインターカレータを用いることが特に好ましい。A preferred intercalator as such an electrochemically active intercalator is a sewn-in intercalator having redox activity. A sewn-in intercalator having redox activity is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-288080 and J. Chem.
Soc. Commun. , 1111, 1998) is particularly preferable.

【００３８】さらに、該インターカレータとしては、下
記式（３）で表されるものも好ましく用いることができ
る。下記の式（３）で表されるインターカレータは、印
加電圧が４００乃至６００ｍＶの範囲にピーク電流値を
有する特徴を持つ。Further, as the intercalator, those represented by the following formula (3) can also be preferably used. The intercalator represented by the following formula (3) has a characteristic that the applied voltage has a peak current value in the range of 400 to 600 mV.

【００３９】[0039]

【化３】 [Chemical 3]

【００４０】上記の式（３）において、Ｎ−置換−イミ
ノ基は、縫い込み型インターカレータに可溶性を付与す
る基であり、ＲおよびＲ¹は、互いに独立に、水素原
子、そして、置換基を有していてもよい炭素原子数が１
乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原
子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もし
くは基を表す。炭素原子数が１乃至３のアルキル基とし
ては、メチル基もしくはエチル基であることが好まし
く、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が
２乃至４のアシル基としては、アセチル基であることが
好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基として
は、フェニル基もしくはナフチル基であることが好まし
く、フェニル基であることが特に好ましい。炭素原子数
が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２
３のアラルキル基としては、ベンジル基であることが好
ましい。ＲおよびＲ¹は、同一の原子もしくは基である
ことが好ましく、メチル基であることが特に好ましい。In the above formula (3), the N-substituted-imino group is a group that imparts solubility to the sewn-in intercalator, and R and R ¹ are each independently a hydrogen atom and a substituent. Has 1 carbon atom which may have
To 3 to 3 alkyl groups, 2 to 4 carbon atoms for acyl groups, 6 to 20 carbon atoms for aryl groups, and 1 to 3 carbon atoms for alkyl groups having 7 to 23 carbon atoms. Represents an atom or group selected from the group consisting of The alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a methyl group or an ethyl group, and particularly preferably a methyl group. The acyl group having 2 to 4 carbon atoms is preferably an acetyl group. The aryl group having 6 to 20 carbon atoms is preferably a phenyl group or a naphthyl group, and particularly preferably a phenyl group. 7 to 2 carbon atoms having an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
The aralkyl group of 3 is preferably a benzyl group. R and R ¹ are preferably the same atom or group, and particularly preferably a methyl group.

【００４１】置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲ
ン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、カルボキシル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６の
アルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化
アルキル基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、お
よび炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。置換
基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃
至６のハロゲン化アルキル基、あるいは炭素原子数が１
乃至６のアルコキシ基については、１乃至１２個である
ことが好ましく、１乃至３個であることさらに好まし
く、１個であることが特に好ましい。炭素原子数が６乃
至１２のアリール基については、その数は１乃至７個で
あることが好ましく、１乃至３個であることがさらに好
ましく、１個であることが特に好ましい。As the substituent, a hydroxyl group, a halogen atom (F, Cl, Br, etc.), a carboxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon atom Examples thereof include an atom or group selected from the group consisting of a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 12 carbon atoms, and an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. The number of substituents is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or 1 carbon atom.
The number of alkoxy groups represented by 1 to 6 is preferably 1 to 12, more preferably 1 to 3, and most preferably 1. Regarding the aryl group having 6 to 12 carbon atoms, the number thereof is preferably 1 to 7, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1.

【００４２】ＹおよびＹ¹は、互いに独立に、−ＮＨ−
ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＨ−基を表し、−ＮＨ−Ｃ
Ｏ−基であることが好ましい。これらの基のカルボニル
基もしくはイミノ基が、それぞれ、ＥおよびＥ¹と結合
する。Y and Y ¹ independently of each other, --NH--
Represents a CO- group or a -CO-NH- group, -NH-C
It is preferably an O-group. The carbonyl group or imino group of these groups binds to E and E ¹ , respectively.

【００４３】ＥおよびＥ¹は、互いに独立に、一つの結
合手を有するフェロセンを表す。当該フェロセンは、置
換基を有していても有していなくてもよい。置換基を有
している場合には、同一であることが好ましい。以下
に、置換基を有するフェロセンの具体例を示す。置換基
の位置は、シクロペンタジエニル基の何れの位置であっ
てもよい。E and E ¹ independently of each other represent ferrocene having one bond. The ferrocene may or may not have a substituent. When they have a substituent, they are preferably the same. Specific examples of ferrocene having a substituent are shown below. The position of the substituent may be any position of the cyclopentadienyl group.

【００４４】[0044]

【化４】 [Chemical 4]

【００４５】ＸおよびＺは、互いに独立に、水素原子、
ハロゲン原子、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル
基を表すが、水素原子であることが好ましい。炭素原子
数１乃至６のアルキル基の好ましい例としては、前記記
載のＲ（もしくはＲ¹）と同様である。X and Z are, independently of each other, a hydrogen atom,
It represents a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably a hydrogen atom. Preferable examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms are the same as R (or R ¹ ) described above.

【００４６】ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、縫い込み型インタ
ーカレータのリンカー部分の長さを決定するものであ
り、各々、１乃至６の整数を表す。但し、ｍとｎとの
和、およびｋとｐとの和は、各々、４乃至８である。ｍ
とｋ、およびｎとｐとは、それぞれ、同一の数であるこ
とが好ましく、ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、何れも３である
ことが特に好ましい。M, n, k and p determine the length of the linker portion of the sewn-in intercalator, and each represents an integer of 1 to 6. However, the sum of m and n and the sum of k and p are 4 to 8, respectively. m
And k and n and p are preferably the same numbers, and it is particularly preferable that m, n, k and p are all 3.

【００４７】上述の導電性基で標識された縫い込み型イ
ンターカレータは、例えば、特開平９−２８８０８０号
に記載の方法によって簡便に収率良く製造することがで
きる。The above-mentioned sewn-in type intercalator labeled with a conductive group can be easily produced in a high yield by the method described in JP-A-9-288080, for example.

【００４８】本発明においては、下記の式（４）で表わ
される酸化還元活性で標識された縫い込み型インターカ
レータを用いることが特に好ましい。下記の式（４）で
表されるインターカレータは、印加電圧１００乃至４０
０ｍＶの範囲にピーク電流値を有する性質を持つ。In the present invention, it is particularly preferable to use a sewn-in intercalator labeled with a redox activity represented by the following formula (4). The intercalator represented by the following formula (4) has an applied voltage of 100 to 40.
It has the property of having a peak current value in the range of 0 mV.

【００４９】 Ｅ_a−Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_b−Ｅ_b …… （４）E _a −L _a −X −L _b −E _b (4)

【００５０】ただし、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、
酸化還元活性を示し、かつ共役系を含む基を表わし、Ｘ
は二価の環状基を表わし、そしてＬ_aおよびＬ_bは、互い
に独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系が延長され
る共役系を形成することのない連結基であって、少なく
とも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する部位
を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換し
得る部位を有する連結基である。However, E _a and E _b are independent of each other,
Represents a group having a redox activity and containing a conjugated system, X
Represents a divalent cyclic group, and L _a and L _b are each independently _a linking group which does not form a conjugated system in which a conjugated system of E _a and E _b is extended, and One of the linking groups is a linking group having a site that imparts water solubility to the present compound or a linking group having a site that can be converted into a site that imparts water solubility.

【００５１】上記式（４）において、Ｅ_aとＥ_b、そして
Ｌ_aとＬ_bとが、それぞれ、互いに同一の基であることが
好ましい。また、Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_bで表わされる連結部の主
鎖の最短の結合路を構成する原子の数が１０乃至１００
の間、なかでも１５乃至７０の間、特に２０乃至５０の
間にあることが好ましい。なお、この連結部の主鎖の最
短の結合路を構成する原子の数の計算を、前記のフェロ
センカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
に適用すると、その原子の数は３２となる。In the above formula (4), it is preferable that E _a and E _b and L _a and L _b are the same groups. Further, L _a -X-L _b The number of atoms constituting the shortest binding line of the main chain of the linking portion represented by 10 to 100
It is preferably between 15 and 70, especially between 20 and 50. When the calculation of the number of atoms constituting the shortest bonding path of the main chain of the connecting portion is applied to the ferrocenecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, the number of atoms becomes 32.

【００５２】また、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、そ
れぞれ置換基を有していてもよい、一もしくは二以上の
結合手を持つメタロセン、２，２’−ビピリジン錯体、
シクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、
１，１０−フェナントロリン錯体、トリフェニルホスフ
ィン錯体、カテコールアミンおよびビオローゲンからな
る群より選ばれる酸化還元活性基であることが好まし
い。E _a and E _b are, independently of each other, a metallocene having one or two or more bonds, which may have a substituent, a 2,2′-bipyridine complex,
Cyclobutadiene complex, cyclopentadienyl complex,
It is preferably a redox active group selected from the group consisting of 1,10-phenanthroline complex, triphenylphosphine complex, catecholamine and viologen.

【００５３】上記式（４）の化合物は、特に下記式
（５）で表わされる化合物であることが好ましい。The compound of the above formula (4) is particularly preferably a compound represented by the following formula (5).

【００５４】 Ｅ_a−Ｌ_1a−Ｌ_2a−Ｘ−Ｌ_2b−Ｌ_1b−Ｅ_b …… （５）E _a −L _1a −L _2a −X −L _2b −L _1b −E _b (5)

【００５５】但し、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、酸
化還元活性を有し、かつ共役系を含む基を表わし、Ｌ_1a
およびＬ_1bは、互いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_b
の共役系が延長される共役系を形成しない基を表わし、
Ｌ_2aおよびＬ_2bは、互いに独立に、水溶性を付与する部
位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換
し得る部位を有する連結基を表わし、そしてＸは二価の
環状基を表わす。However, E _a and E _b each independently represent a group having redox activity and containing a conjugated system, and L _1a
And L _1b are each independently E _a and E _b
Represents a group that does not form a conjugated system in which the conjugated system of is extended,
L _2a and L _2b each independently represent a linking group having a site imparting water solubility or a linking group having a site convertible to a site imparting water solubility, and X represents a divalent cyclic group. .

【００５６】Ｌ_1aおよびＬ_1bは、互いに独立に、置換基
を有していてもよい炭化水素基、特に、置換基を有して
いてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基あるい
は置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のア
ルケニレン基であることが好ましい。L _1a and L _1b are, independently of each other, a hydrocarbon group which may have a substituent, particularly an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent or a substituted group. It is preferably an alkenylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a group.

【００５７】Ｌ_2aおよびＬ_2bは、互いに独立に、炭素元
素以外の元素（例、Ｎ、Ｏ、もしくはＳ）を含む連結基
であることが好ましく、特に、置換基を有していてもよ
い、アミド結合基、エステル結合基、エーテル結合基、
チオエーテル結合基、ジイミド結合基、チオジイミド結
合基、チオアミド結合基、イミノ結合基、カルボニル結
合基、チオカルボニル結合基および１，４−ピペラジニ
ル基からなる群より選ばれる基を含む連結基であること
が好ましい。最も好ましいのは、−ＮＨＣＯ−基、もし
くは−ＣＯＮＨ−基である。なお、Ｅ_aとＥ_b、Ｌ_1aとＬ
_1b、そしてＬ_2aとＬ_2bとが、それぞれ、互いに同一の基
であることが有利である。L _2a and L _2b are preferably, independently of each other, a linking group containing an element other than a carbon element (eg, N, O, or S), and particularly may have a substituent. , Amide bond group, ester bond group, ether bond group,
It may be a linking group containing a group selected from the group consisting of a thioether bond group, a diimide bond group, a thiodiimide bond group, a thioamide bond group, an imino bond group, a carbonyl bond group, a thiocarbonyl bond group and a 1,4-piperazinyl group. preferable. Most preferred is a -NHCO- group or a -CONH- group. Note that E _a and E _b , L _1a and L
Advantageously, _1b , and L _2a and L _2b , are each the same group.

【００５８】上記式（４）および（５）の縫い込み型イ
ンターカレータを用いると、核酸断片の検出操作におい
て電極基板付与する電位として、１００乃至４００ｍＶ
の範囲内の相対的に低い電位が利用できる。When the sewn-in intercalator of the above formulas (4) and (5) is used, the potential applied to the electrode substrate in the operation of detecting nucleic acid fragments is 100 to 400 mV.
A relatively low potential within the range can be utilized.

【００５９】式（４）および式（５）において、Ｘは、
置換基を有していてもよい二価の環状基を表す。二価の
環状基としては、平面性を有する環状基であることが好
ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジ
イミド基、２位と６位、もしくは１位と５位（好ましく
は２位と６位）とに結合手を有するアントラセン基、ア
ントラセン基と同じ位置に結合手を有するアントラキノ
ン基、２位と６位とに結合手を有するフルオレン基、２
位と６位とに結合手を有するビフェニレン基、２位と７
位とに結合手を有するフェナントレン基、および２位と
７位とに結合手を有するピレン基からなる群より選ばれ
る環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合
手を有するナフタレンジイミド基であることが特に好ま
しい。置換基としては、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、
Ｃｌ、Ｂｒ等）、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキ
ル基であることが好ましいが、水素原子であることが好
ましい。炭素原子数１乃至６のアルキル基としては、メ
チル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であること
が好ましい。In the equations (4) and (5), X is
It represents a divalent cyclic group which may have a substituent. The divalent cyclic group is preferably a planar cyclic group, and is a naphthalenediimide group having a bond to two nitrogen atoms, 2-position and 6-position, or 1-position and 5-position (preferably 2-position). And anthracene group having a bond at the 6-position), an anthraquinone group having a bond at the same position as the anthracene group, a fluorene group having a bond at the 2-position and the 6-position, 2
Biphenylene group having a bond at the 6-position and 2-position and 7-position
It is preferably a cyclic group selected from the group consisting of a phenanthrene group having a bond at the 2-position and a pyrene group having a bond at the 2- and 7-positions, and a naphthalenediimide group having a bond at two nitrogen atoms. Is particularly preferable. As the substituent, a hydrogen atom, a halogen atom (F,
Cl, Br, etc.) or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, but preferably a hydrogen atom. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably methyl group, ethyl group or n-propyl group.

【００６０】前記式（４）において、Ｌ_aおよびＬ_bは、
互いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系が延長
される共役系を形成することのない連結基であって、少
なくとも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する
部位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変
換し得る部位を有する連結基である。ここで、「水溶性
を付与する部位に変換し得る部位」とは、たとえば、メ
チル基を置換基として有するイミノ基のように、硫酸な
どの酸と接触した場合に、硫酸塩部位に変換され、水溶
性を示すように変化する部位を有する。勿論、「本化合
物に水溶性を付与する部位」に塩部分のような荷電部分
を持っていてもよい。In the above formula (4), L _a and L _b are
Independently of each other, each is _a linking group that does not form a conjugated system in which the conjugated system of E _a and E _b is extended, and at least one of the linking groups has a site that imparts water solubility to the present compound. It is a linking group having a linking group or a site that can be converted into a site that imparts water solubility. Here, the “site capable of being converted to a site imparting water solubility” is, for example, an imino group having a methyl group as a substituent, is converted to a sulfate site when contacted with an acid such as sulfuric acid. , Has a site that changes to show water solubility. Of course, the “site that imparts water solubility to the present compound” may have a charged moiety such as a salt moiety.

【００６１】Ｌ_aおよびＬ_bは、互いに独立に、Ｅ_aおよ
びＥ_bに隣接する側に、置換基を有していてもよい炭化
水素基（前記式（５）のＬ_1aとＬ_1bに相当する基）を有
し、一方、Ｘに隣接する側に炭素元素以外の元素を含む
連結基（前記式（５）のＬ_2aとＬ_2bに相当する基）とか
らなる連結基であることが好ましい。従って、Ｌ_aおよ
びＬ_bは、それぞれ、前記式（５）の−Ｌ_1a−Ｌ_2a−、
そして−Ｌ_2b−Ｌ_1b−に該当する連結基であることが望
ましい。ここで、Ｌ_1aとＬ_1bは、互いに独立に、置換基
を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン
基あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が２乃
至６のアルケニレン基であることが好ましく、一方、Ｌ
_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを含
む連結基であることが望ましい。L _a and L _b are, independently of each other, _a hydrocarbon group which may have a substituent (on L _1a and L _1b in the above formula (5), on the side adjacent to E _a and E _b. Corresponding group), and on the other hand, a linking group consisting of a linking group containing an element other than a carbon element on the side adjacent to X (group corresponding to L _2a and L _2b in the formula (5)). Is preferred. Thus, L _a and L _b are each, -L _1a -L _2a of the formula (5) -,
And it is desirable that it is a linking group corresponding to -L _2b -L _1b- . Here, L _1a and L _1b are, independently of each other, an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, or an alkylene group having 2 to 6 carbon atoms which may have a substituent. Is preferably an alkenylene group of
It is desirable that _2a and L _2b are, independently of each other, a linking group containing N, O, or S.

【００６２】Ｌ_1aおよびＬ_1bの置換基としては、ヒドロ
キシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、
シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃
至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロ
ゲン化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアル
キルアミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルア
ミノ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至１８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する
炭素原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原
子数が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至
７のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０の
Ｎ−アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカル
ボニル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニ
ル基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原
子を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、
並びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、
炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン
原子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の
数が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原
子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃
至６のアルキレン基では、１乃至１２個であることが好
ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭素原
子数が１乃至６のアルケニレン基については、その数は
１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個である
ことが特に好ましい。The substituents of L _1a and L _1b include a hydroxyl group, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group,
Cyano group, nitro group, formyl group, formylamino group,
An alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a cycloalkylamino group having 5 to 7 carbon atoms, carbon Dialkylamino group having 2 to 12 atoms, aryl group having 6 to 12 carbon atoms, aralkyl group having 7 to 18 carbon atoms and alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, 1 to 6 alkyl Aralkylamino group having 7 to 18 carbon atoms, alkanoyl group having 2 to 7 carbon atoms, alkanoylamino group having 2 to 7 carbon atoms, N-alkanoyl group having 3 to 10 carbon atoms Contains 1 to 4 heteroatoms selected from the group consisting of N-alkylamino groups, aminocarbonyl groups, alkoxycarbonyl groups having 2 to 7 carbon atoms, S, N and O. Heterocyclic group having 2 to 10 carbon atoms,
And an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms as a substituent,
It is an atom or group selected from the group consisting of an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 12 ring-constituting carbon atoms, which may have 1 to 5 halogen atoms. The number of the substituents is preferably 1 to 12, and particularly preferably 1 to 3 in the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms. Regarding the alkenylene group having 1 to 6 carbon atoms, the number thereof is preferably 1 to 10 and particularly preferably 1 to 3.

【００６３】Ｌ_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、それぞ
れ、置換基を有していてもよい、アミド結合基、エステ
ル結合基、エーテル結合基、チオエーテル結合基、ジイ
ミド結合基、チオジイミド結合基、チオアミド結合基、
イミノ結合基、カルボニル結合基、チオカルボニル結合
基および１，４−ピペラジニル基からなる群より選ばれ
る基を一個もしくは複数個含む連結基であることが好ま
しく、特に好ましいのはアミド基（−ＮＨＣＯ−基、も
しくは−ＣＯＮＨ−基）である。L _2a and L _2b , independently of each other, may each have a substituent, such as an amide bond group, an ester bond group, an ether bond group, a thioether bond group, a diimide bond group and a thiodiimide bond group. , A thioamide bond group,
A linking group containing one or more groups selected from the group consisting of an imino bond group, a carbonyl bond group, a thiocarbonyl bond group and a 1,4-piperazinyl group is preferable, and an amide group (-NHCO- is particularly preferable. Group or a —CONH— group).

【００６４】Ｌ_2aとＬ_2bの置換基の例としては、炭素原
子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４の
アシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および
炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数
が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基
で置換されていてもよい。炭素原子数が１乃至３のアル
キル基としては、メチル基もしくはエチル基であること
が好ましく、メチル基であることが特に好ましい。炭素
原子数が２乃至４のアシル基としては、アセチル基であ
ることが好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール
基としては、フェニル基もしくはナフチル基であること
が好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。炭
素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が
７乃至２３のアラルキル基としては、ベンジル基である
ことが好ましい。Examples of the substituent of L _2a and L _2b include an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms and a carbon group. It may be substituted with a group selected from the group consisting of aralkyl groups having 7 to 23 carbon atoms and having an alkyl group having 1 to 3 atoms. The alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a methyl group or an ethyl group, and particularly preferably a methyl group. The acyl group having 2 to 4 carbon atoms is preferably an acetyl group. The aryl group having 6 to 20 carbon atoms is preferably a phenyl group or a naphthyl group, and particularly preferably a phenyl group. The aralkyl group having 7 to 23 carbon atoms and having an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a benzyl group.

【００６５】Ｌ_2aとＬ_2bがイミノ結合基である場合、そ
の置換基としては、メチル基であることが特に好まし
い。従って、Ｌ_2aとＬ_2bは、それぞれ独立に、Ｎ−メチ
ル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ
−プロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに
好ましく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ
基であることが特に好ましい。When L _2a and L _2b are imino-bonding groups, the substituent is particularly preferably a methyl group. Therefore, L _2a and L _2b are each independently an N-methyl-di (n-propylenyl) imino group, 1,4-di (n
A -propylenyl) -piperazinyl group is more preferable, and an N-methyl-di (n-propylenyl) imino group is particularly preferable.

【００６６】Ｅ_aおよびＥ_bは、酸化還元活性を有し、こ
れによって導電性を付与する基であり、互いに独立に、
置換基を有していてもよい、一つ以上の結合手を持つメ
タロセン、２，２’−ビピリジン錯体、シクロブタジエ
ン錯体、シクロペンタジエニル錯体、１，１０−フェナ
ントロリン錯体、トリフェニルホスフィン錯体、カテコ
−ルアミン、あるいはビオロ−ゲンなどであることが好
ましい。置換基を有していてもよい一つの結合手を持つ
フェロセンであることが特に好ましい。Ｅ_aおよびＥ_bは
互いに同一の基であることが好ましい。次に、置換基を
有するフェロセンの具体例を示す。置換基の位置は、シ
クロペンタジエニル基の何れの位置であってもよい。E _a and E _b are groups having redox activity and thereby imparting conductivity, and independently of each other,
A metallocene having one or more bonds, which may have a substituent, a 2,2′-bipyridine complex, a cyclobutadiene complex, a cyclopentadienyl complex, a 1,10-phenanthroline complex, a triphenylphosphine complex, Catecholamine, viologen and the like are preferable. Ferrocene having one bond which may have a substituent is particularly preferable. E _a and E _b are preferably the same groups as each other. Next, specific examples of ferrocene having a substituent are shown. The position of the substituent may be any position of the cyclopentadienyl group.

【００６７】[0067]

【化５】 [Chemical 5]

【００６８】上記の式（４）および（５）の縫い込み型
インターカレータとして有利に用いることのできる化合
物は、例えば、公知のジアミン化合物を原料として、公
知の方法（特開平９−２８８０８０号公報）に準じる製
造方法によって簡便に製造することができる。The compound which can be advantageously used as the sewn-in intercalator of the above formulas (4) and (5) is, for example, a known diamine compound as a raw material and a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 9-288080). It can be easily produced by the production method according to (1).

【００６９】また式（４）および（５）の化合物は、公
知のジアミン化合物を出発物質とする下記の式で代表さ
れる合成ルートによっても安価に、かつ収率良く製造す
ることができる。The compounds of formulas (4) and (5) can also be produced inexpensively and in good yield by a synthetic route represented by the following formula using a known diamine compound as a starting material.

【００７０】[0070]

【化６】 [Chemical 6]

【００７１】(Ｇ) 電極：本発明で使用する電極は通
常、外部に出力する端子を備えているものを用いる。電
極の材料としては、金以外にも、グラファイト、グラシ
ーカーボン等の炭素電極、白金、パラジウム、ロジウム
等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガ
ン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、Ｃｄ
Ｓ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げるこ
とができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いるこ
とが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分
子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆さ
れていてもよい。電極は、例えば、電極がグラシーカー
ボンである場合には、電極を過マンガン酸カリウムで処
理するなどの方法で表面処理しておくことが好ましい。(G) Electrode: The electrode used in the present invention is usually provided with a terminal for outputting to the outside. As the material of the electrode, in addition to gold, carbon electrodes such as graphite and glassy carbon, precious metal electrodes such as platinum, palladium and rhodium, oxide electrodes such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide and lead oxide, Si, Ge, ZnO, Cd
Although semiconductor electrodes such as S and electron conductors such as titanium can be mentioned, it is particularly preferable to use gold or glassy carbon. These electron conductors may be covered with a conductive polymer or a monomolecular film. For example, when the electrode is glassy carbon, the electrode is preferably surface-treated by a method such as treating the electrode with potassium permanganate.

【００７２】本発明で用いられる電極は、導電性を持た
ない基体上に複数の電極が配置されたものであることが
好ましい。その場合、電極は、導電性を持たない基体上
に、互いに接しないように、かつ規則的に配置されてい
ることが好ましい。例えば、板上の基体上に電極が規則
的に配置された電極を好ましく使用できる。また底面に
電極を備えたウエル（穴）が基体に規則的に配置された
電極、および先端に電極を備えている棒状の基体を規則
的に配置したものも好ましく使用できる。The electrode used in the present invention is preferably one in which a plurality of electrodes are arranged on a substrate having no conductivity. In that case, the electrodes are preferably arranged regularly on the non-conductive substrate so as not to contact each other. For example, an electrode in which electrodes are regularly arranged on a substrate on a plate can be preferably used. Further, an electrode in which wells (holes) having electrodes on the bottom surface are regularly arranged on the base body, and a rod-shaped base body having electrodes on the tip end are also preferably used.

【００７３】導電性を持たない基体としては、電気絶縁
性の疎水性担体、あるいは電気絶縁性の低親水性の担体
であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する
平面性の低いものであっても好ましく用いることができ
る。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等
のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチ
レンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノール
Ａのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタ
クリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガ
ラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活
性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィ
ルター等の多孔質物質などを挙げることができるが、各
種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に
好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法
による解析の容易さによるものである。基体の厚さは、
特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至
１００００μｍの範囲にあることが好ましい。The electrically non-conductive substrate is preferably an electrically insulating hydrophobic carrier or an electrically insulating low hydrophilic carrier. Further, it is possible to preferably use even if the surface thereof has irregularities and has low flatness. Materials for the substrate include glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymers such as polymethylmethacrylate, silicon, activated carbon, porous glass, porous ceramics, Porous substances such as porous silicon, porous activated carbon, woven and knitted fabrics, non-woven fabrics, filter papers, short fibers and membrane filters can be mentioned, but various polymers, glass or silicon are particularly preferable. This is because surface treatment is easy and analysis by an electrochemical method is easy. The thickness of the substrate is
Although not particularly limited, in the case of a plate shape, it is preferably in the range of 100 to 10000 μm.

【００７４】導電性を持たない基体上に複数の電極が配
置されたものとしては、導電性を持たない基体の表面を
上記の電子伝導体で処理したものを用いることが好まし
く、金を蒸着したものを用いることが特に好ましい。基
体は、電子伝導体で表面処理をする前に、基体上に電荷
を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からな
る層を設けてもよい。このような層を設けることによっ
て基体の凹凸を軽減することができる。また、基体によ
っては、その基体中に電荷を有する親水性の高分子物質
を含ませることも可能であり、このような処理を施した
基体も好ましく用いることができる。As the one in which a plurality of electrodes are arranged on a non-conductive substrate, it is preferable to use a non-conductive substrate whose surface is treated with the above-mentioned electron conductor, which is vapor-deposited with gold. It is particularly preferable to use one. The substrate may be provided with a layer made of a hydrophilic polymer substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent on the substrate before the surface treatment with an electron conductor. By providing such a layer, unevenness of the substrate can be reduced. In addition, depending on the substrate, it is possible to include a hydrophilic polymer substance having an electric charge in the substrate, and a substrate subjected to such a treatment can also be preferably used.

【００７５】導電性を持たない基体上に複数の電極が配
置されたものとしては、文献（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，
Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１１１９−１１２３，１９
９７）に記載の、シリコンチップも好ましく用いること
ができる。また、プリント配線基板のように、複数の電
極が基体上に印刷されてなるものであってもよい。As a device in which a plurality of electrodes are arranged on a substrate having no conductivity, see the document (Sonowski,
R. G. et al. , Proc. Natl. Aci
d. Sci. USA, 94, 1119-1123, 19
The silicon chip described in 97) can also be preferably used. Further, a plurality of electrodes may be printed on a substrate, such as a printed wiring board.

【００７６】(Ｈ) ＤＮＡ修飾電極：本発明で使用する
ＤＮＡ修飾電極は、前記（Ｇ）に示したような電極の表
面にＤＮＡ断片が固定されている電極である。(H) DNA modified electrode: The DNA modified electrode used in the present invention is an electrode having a DNA fragment immobilized on the surface of the electrode as shown in (G) above.

【００７７】本発明で使用するＤＮＡ断片修飾電極にお
いて、電極の表面に固定されているＤＮＡ断片は、前記
（Ａ）に示したようなターゲットＤＮＡ断片の一部、ま
たは前記（Ｄ）に示したようなポリメラーゼ伸長反応に
より生成したＤＮＡ断片の一部とは、塩基配列において
相補的である必要はない。この点で、本発明に使用する
ＤＮＡ修飾電極は、特許公報第２５７３４４３号または
特開平１２−１４６８９４号公報において使用されてい
る、ターゲット核酸の一部と相補的な塩基配列を有する
ＤＮＡ断片を固定した電極とは、異なるものである。In the DNA fragment-modified electrode used in the present invention, the DNA fragment immobilized on the surface of the electrode is a part of the target DNA fragment as shown in (A) above or is shown in (D) above. A part of the DNA fragment generated by such a polymerase extension reaction need not be complementary in the nucleotide sequence. In this respect, the DNA-modified electrode used in the present invention has a DNA fragment having a base sequence complementary to a part of the target nucleic acid, which is used in Japanese Patent Publication No. 2573443 or Japanese Unexamined Patent Publication No. 12-146894, immobilized. The electrodes are different.

【００７８】ＤＮＡ修飾電極の表面に固定するＤＮＡ断
片の塩基数は５〜８０塩基（または塩基対）であること
が好ましい。特に１５〜４０塩基（または塩基対）であ
ることが好ましい。このようなＤＮＡ断片はオリゴヌク
レオチドとして、容易に合成することができる。The number of bases of the DNA fragment fixed on the surface of the DNA modification electrode is preferably 5 to 80 bases (or base pairs). It is particularly preferably 15 to 40 bases (or base pairs). Such a DNA fragment can be easily synthesized as an oligonucleotide.

【００７９】ＤＮＡ修飾電極の表面に固定するＤＮＡ断
片は、１本鎖ＤＮＡ断片であってもよいが、２本鎖ＤＮ
Ａ断片であることが、特に好ましい。２本鎖ＤＮＡ断片
である方が、前記（Ｆ）で示したような電気化学活性イ
ンターカレータは安定にインターカレーションする。２
本鎖ＤＮＡ断片が固定されているＤＮＡ修飾電極は、電
極表面に固定した１本鎖ＤＮＡ断片に、相補的なＤＮＡ
断片をハイブリダイゼーションさせることで作製するこ
とができる。また、予め２本鎖に調整されたＤＮＡ断片
を固定することでも作製することが可能である。The DNA fragment immobilized on the surface of the DNA-modified electrode may be a single-stranded DNA fragment, but a double-stranded DNA fragment.
Particularly preferred is the A fragment. The double-stranded DNA fragment allows stable intercalation of the electrochemically active intercalator as shown in (F) above. Two
The DNA-modified electrode on which the single-stranded DNA fragment is fixed is a DNA complementary to the single-stranded DNA fragment fixed on the electrode surface.
It can be prepared by hybridizing the fragments. It can also be prepared by immobilizing a DNA fragment prepared in advance into a double strand.

【００８０】このようなＤＮＡ修飾電極は、特開平１２
−１９９７５４号公報に、試料中のアナライトを定量す
る方法に使用するＤＮＡ修飾電極として記載されてい
る。しかしながら、特開平１２−１９９７５４号公報に
記載されている発明は、酸化酵素、ＤＮＡ修飾電極およ
び電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いて、
前記酸化酵素が、その基質であるアナライトを酸化する
際に起こる電子移動を、ＤＮＡ修飾電極および電気化学
活性縫い込み型インターカレータを用いて増感検出する
ことで、前記アナライトを定量する方法であり、本発明
のひとつの形態である、ターゲット核酸断片を鋳型にし
たポリメラーゼ伸長反応により生成するピロ燐酸に対し
て、酸化酵素を含む酵素試薬を作用させて、その際に起
こる電子移動をＤＮＡ修飾電極と電気化学活性縫い込み
型インターカレータを用いて増感検出することで、ター
ゲット核酸断片の存在またはターゲット核酸断片の塩基
配列を検出する方法とは異なるものである。Such a DNA modification electrode is disclosed in Japanese Unexamined Patent Publication No. H12 (1999) -128.
-199754 describes a DNA-modified electrode used in a method for quantifying an analyte in a sample. However, the invention described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 12-199754 uses an oxidase, a DNA modification electrode and an electrochemically active threading intercalator,
A method for quantifying an analyte by sensitizing and detecting an electron transfer that occurs when the oxidase oxidizes an analyte that is its substrate, using a DNA modification electrode and an electrochemically active threading intercalator. In one aspect of the present invention, an enzyme reagent containing an oxidase is allowed to act on pyrophosphate generated by a polymerase extension reaction using a target nucleic acid fragment as a template, and electron transfer occurring at that time is caused by DNA reaction. This is different from the method of detecting the presence of the target nucleic acid fragment or the base sequence of the target nucleic acid fragment by performing the sensitization detection using the modified electrode and the electrochemically activated threading intercalator.

【００８１】ＤＮＡ断片を電極表面に固定する方法は、
表面がカチオニック（陽イオン性）になるように処理さ
れたの電極に、アニオニック（陰イオン性）であるＤＮ
Ａ断片を静電的に固定する方法を用いることができる。
この場合は、ＤＮＡ断片はＤＮＡ断片上の多点で電極表
面に固定される。The method for immobilizing DNA fragments on the electrode surface is as follows:
The surface of the electrode is treated to be cationic (cationic), and the electrode is anionic (anionic) DN
A method of electrostatically fixing the A fragment can be used.
In this case, the DNA fragment is fixed on the electrode surface at multiple points on the DNA fragment.

【００８２】本発明で使用するＤＮＡ修飾電極において
は、電極表面にＤＮＡ断片をその末端で固定する方法が
好ましく用いられる。この場合は、ＤＮＡ断片は末端の
１点で電極表面に固定されていて、ＤＮＡ断片のＤＮＡ
鎖自体は電極表面に束縛されていない。In the DNA-modified electrode used in the present invention, a method of immobilizing a DNA fragment at its end on the electrode surface is preferably used. In this case, the DNA fragment is fixed on the surface of the electrode at one end, and the DNA fragment
The chains themselves are not bound to the electrode surface.

【００８３】電極表面にＤＮＡ断片をその末端で固定す
るには、末端（５’末端）が反応性基で修飾されている
ＤＮＡ断片を用い、その反応性基を介してＤＮＡ断片を
電極表面に固定する。電極表面に２本鎖ＤＮＡ断片をそ
の末端で固定するには、末端（５’末端）が反応性基で
修飾された１本鎖ＤＮＡ断片を用いて、まずその１本鎖
ＤＮＡ断片を電極表面に固定し、続いて電極表面に固定
したＤＮＡ断片に相補的なＤＮＡ断片をハイブリダイゼ
ーションすることで行うことができる。また、２本鎖の
一方の末端（５’末端）のみが反応性基で修飾された、
２本鎖に予め調整されたＤＮＡ断片を用いることも可能
である。To immobilize a DNA fragment at the end on the electrode surface, a DNA fragment whose end (5 'end) is modified with a reactive group is used, and the DNA fragment is attached to the electrode surface via the reactive group. Fix it. To immobilize a double-stranded DNA fragment on the electrode surface at its end, a single-stranded DNA fragment whose end (5 ′ end) is modified with a reactive group is used. First, the single-stranded DNA fragment is attached to the electrode surface. It can be carried out by hybridizing a DNA fragment complementary to the DNA fragment immobilized on the electrode surface and subsequently immobilized on the electrode surface. Further, only one end (5 'end) of the double strand was modified with a reactive group,
It is also possible to use a DNA fragment prepared in advance in a double strand.

【００８４】電極表面にＤＮＡ断片をその末端で固定す
るには、電極が金電極の場合には、末端（５’末端）が
メルカプト基（−ＳＨ）で修飾されているＤＮＡ断片を
用い、その水溶液またはバッファー溶液を金電極表面に
点着し、液が乾燥しないように放置することで、ＤＮＡ
断片を金電極表面に固定することができる。通常、ＤＮ
Ａ断片の末端（５’末端）をメルカプト基で修飾するに
は、アルキル鎖をリンカーにして修飾する。金電極表面
へのＤＮＡ断片の固定方法の最も一般的な方法は、メル
カプトヘキシル基で５’末端が標識されたＤＮＡ断片を
用いる固定方法である。In order to immobilize a DNA fragment on the surface of the electrode at its end, when the electrode is a gold electrode, a DNA fragment whose end (5 'end) is modified with a mercapto group (-SH) is used. By spotting an aqueous solution or a buffer solution on the surface of the gold electrode and leaving it so that the solution does not dry, DNA
The fragments can be fixed to the gold electrode surface. Usually DN
In order to modify the end (5 'end) of the A fragment with a mercapto group, an alkyl chain is used as a linker for modification. The most general method of immobilizing a DNA fragment on the surface of a gold electrode is an immobilization method using a DNA fragment whose 5 ′ end is labeled with a mercaptohexyl group.

【００８５】また、予め電極表面に反応性基を導入して
おき、当該反応性基と反応し得る反応性基で修飾された
ＤＮＡ断片を用い、電極表面に修飾された反応性基とＤ
ＮＡ断片に修飾された反応性基とを反応させ、共有結合
を形成することで、電極表面にＤＮＡ断片をその末端で
固定することができる。Further, by introducing a reactive group into the electrode surface in advance and using a DNA fragment modified with a reactive group capable of reacting with the reactive group, the modified reactive group and D
By reacting the NA fragment with the modified reactive group to form a covalent bond, the DNA fragment can be immobilized at the end of the electrode surface.

【００８６】電極表面にＤＮＡ断片を固定する好ましい
方法は、ジビニルスルホン化合物を介して、ＤＮＡ断片
を電極に共有結合により固定する方法である。この場
合、電極の表面には、ジビニルスルホン化合物と反応す
ることができる反応性基、例、アミノ基（−ＮＨ₂）、
メルカプト基（−ＳＨ）を導入する。A preferred method for immobilizing the DNA fragment on the electrode surface is a method for covalently immobilizing the DNA fragment to the electrode via a divinyl sulfone compound. In this case, on the surface of the electrode, a reactive group capable of reacting with the divinyl sulfone compound, for example, an amino group (—NH ₂ ),
A mercapto group (-SH) is introduced.

【００８７】このような、ジビニルスルホン化合物と反
応することができる反応性基、例、アミノ基（−Ｎ
Ｈ₂）、メルカプト基（−ＳＨ）を電極表面に導入する
には、電極が金から形成されている場合は、炭素数が６
乃至１８のアルキル鎖の、一方の末端がメルカプト基
（−ＳＨ）で修飾されていて、他方の末端がジビニルス
ルホン化合物と反応することができる反応性基、例、ア
ミノ基（−ＮＨ₂）で修飾されている化合物を用いて、
ジビニルスルホン化合物と反応することができる反応性
基を電極表面に導入することができる。Such a reactive group capable of reacting with a divinyl sulfone compound, for example, an amino group (-N
H _2), to introduce a mercapto group (-SH) on the electrode surface, when the electrodes are formed of gold, carbon atoms 6
To 18 alkyl chains, one end of which is modified with a mercapto group (-SH) and the other end of which is a reactive group capable of reacting with a divinylsulfone compound, eg, an amino group (-NH ₂ ). With a modified compound,
A reactive group capable of reacting with the divinyl sulfone compound can be introduced on the electrode surface.

【００８８】アルキル鎖の、一方の末端がメルカプト基
（−ＳＨ）で修飾されていて、他方の末端がジビニルス
ルホン化合物と反応することができない、もしくは反応
性の低い反応性基、例、メチレン基（−ＣＨ₃）、ヒド
ロキシル基（−ＯＨ）で修飾されている化合物と、前記
の、アルキル鎖の、一方の末端がメルカプト基（−Ｓ
Ｈ）で修飾されていて、他方の末端がジビニルスルホン
化合物と反応することができる反応性基、例、アミノ基
（−ＮＨ₂）で修飾されている化合物の両方を、その混
合比を調整して用いることで、電極表面に導入される、
ジビニルスルホン化合物と反応することができる反応性
基の密度をコントロールすることができる。One end of the alkyl chain is modified with a mercapto group (-SH) and the other end is incapable of reacting with the divinylsulfone compound or has a low reactivity, such as a methylene group. (-CH _3), the compound is modified with a hydroxyl (-OH), an said, the alkyl chain, one end mercapto group (-S
Both the compound modified with H) and the other end of which is capable of reacting with the divinyl sulfone compound, eg, a compound modified with an amino group (—NH ₂ ) are adjusted in their mixing ratio. By using it, it is introduced to the electrode surface,
The density of reactive groups that can react with the divinyl sulfone compound can be controlled.

【００８９】こうすることで、ジビニルスルホン基を介
して、共有結合により固定されるＤＮＡ断片の密度をコ
ントロールすることができる。By doing so, it is possible to control the density of the DNA fragments fixed by covalent bonding via the divinyl sulfone group.

【００９０】反応性基が導入された電極は、ジビニルス
ルホン化合物と接触することによって、その反応性基と
ジビニルスルホン化合物とが反応し、共有結合が形成さ
れ、電極の反応性基部分が延長され、その先端もしくは
先端附近にビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆
体基を持つ反応性鎖が形成される。ここで、電極表面に
導入されるビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆
体基と連結基との連結体は、下記の式（６）により表わ
されるものであることが望ましい。When an electrode having a reactive group introduced therein is brought into contact with a divinyl sulfone compound, the reactive group reacts with the divinyl sulfone compound to form a covalent bond, thereby extending the reactive group portion of the electrode. , A reactive chain having a vinylsulfonyl group or its reactive precursor group at or near the tip is formed. Here, it is preferable that the linking body of the vinylsulfonyl group or its reactive precursor group and the linking group introduced on the electrode surface is represented by the following formula (6).

【００９１】 −Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ …… （６）-L-SO ₂ -X (6)

【００９２】上記の式（６）において、Ｘは、−ＣＲ¹
＝ＣＲ²Ｒ³または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙ（反応性前駆
体基）を表わす。Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ互い
に独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリ−ル基、あるいは炭
素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子
が７乃至２６のアラルキル基を表わす。炭素原子数が１
乃至６のアルキル基の例としては、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル
基を挙げることができ、メチル基であることが特に好ま
しい。アリール基としては、フェニル基及びナフチル基
を挙げることができる。Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は共に水素原
子であることが好ましい。In the above formula (6), X is -CR ¹
= Represents a CR ² R ³ or -CHR ¹ -CR ² R ³ Y (reactive precursor group). R ¹ , R ² and R ³ are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or 1 to 6 carbon atoms. Represents an aralkyl group having 7 to 26 total carbon atoms having an alkyl chain. 1 carbon atom
Examples of the alkyl groups of to 6 include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, and an n-hexyl group, and a methyl group is particularly preferable. Examples of the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group. It is preferred that R ¹ , R ² and R ³ are all hydrogen atoms.

【００９３】Ｙは、−ＯＨ、−ＯＲ⁰、−ＳＨ、ＮＨ₃、
ＮＨ₂Ｒ⁰（但し、Ｒ⁰は、水素原子を除く、アルキル基
などの基である）などの求核試薬によって置換される
基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を
表わし、その例としては、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ
¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、あるいは四級ピリジ
ニウム基を表わす（Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のア
ルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、ある
いは炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭
素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表わし；Ｒ
¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基あるいは炭素
原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基を表わし；Ｍ
は、水素原子、アルカリ金属原子あるいはアンモニウム
基を表わす）を挙げることができる。Y is --OH, --OR ⁰ , --SH, NH ₃ ,
NH ₂ R ⁰ (wherein R ⁰ is a group such as an alkyl group excluding a hydrogen atom) is a group substituted by a nucleophile, or a group capable of leaving as “HY” by a base, Examples include halogen atom, -OSO ₂ R
¹¹ , —OCOR ¹² , —OSO ₃ M, or a quaternary pyridinium group (R ¹¹ is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or a carbon atom having 6 to 20 carbon atoms). Represents an aralkyl group having 1 to 6 alkyl chains and having 7 to 26 total carbon atoms; R
¹² represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; M
Represents a hydrogen atom, an alkali metal atom or an ammonium group).

【００９４】Ｌは、電極もしくは電極に結合している連
結基と、上記−ＳＯ₂−Ｘ基とを連結している二価もし
くはそれ以上の連結基を表わす。ただし、Ｌは単結合で
あってもよい。二価の連結基としては、炭素原子数が１
乃至６のアルキレン基、炭素原子数が３乃至１６の脂肪
族環基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン基、Ｎ、
ＳおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至
３個含む炭素原子数が２乃至２０の複素環基、−Ｏ−、
−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＳＯ₃−、−ＮＲ
¹¹−、−ＣＯ−およびこれらの組み合わせから群より選
ばれる基を一つあるいは複数個組み合わせてなる基であ
ることが好ましい。Ｒ¹¹は、水素原子、炭素原子数が１
乃至１５のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリ
ール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基を
有する炭素原子が７乃至２１のアラルキル基であること
が好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至６の
アルキル基であることがさらに好ましく、水素原子、メ
チル基もしくはエチル基であることが特に好ましい。L represents a divalent or higher valent linking group which links the electrode or the linking group bonded to the electrode and the —SO ₂ —X group. However, L may be a single bond. The divalent linking group has 1 carbon atom.
To C6 alkylene groups, C3 to C16 aliphatic ring groups, C6 to C20 arylene groups, N,
A heterocyclic group having 1 to 3 hetero atoms selected from the group consisting of S and P and having 2 to 20 carbon atoms, -O-,
-S -, - SO -, - SO 2 -, - SO 3 -, - NR
¹¹ -, - CO- and is preferably a combination of these is a group formed by combining one or a plurality of groups selected from the group. R ¹¹ is a hydrogen atom and has 1 carbon atom
To an alkyl group having 15 to 15 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 21 carbon atoms having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably a hydrogen atom or a carbon atom. An alkyl group having a number of 1 to 6 is more preferable, and a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group is particularly preferable.

【００９５】Ｌが−ＮＲ¹¹−、−ＳＯＮＲ¹¹−、−ＣＯ
ＮＲ¹¹−、−ＮＲ¹¹ＣＯＯ−、および−ＮＲ¹¹ＣＯＮＲ
¹¹−からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせて
なる基である場合には、それらのＲ¹¹同士が結合して環
を形成していてもよい。[0095] L is ^{-NR 11 -, - SONR 11 -} , - CO
^{NR 11 -, - NR 11 COO-} , and -NR ¹¹ CONR
^In the case of a group formed by combining two or more groups selected from the group consisting of 11-, R ^{11 s} thereof may be bonded to each other to form a ring.

【００９６】Ｒ¹¹のアルキル基、Ｒ¹¹のアリール基、お
よびＲ¹¹のアラルキル基は、置換基を持っていてもよ
い。このような置換基としては、水酸基、炭素原子数が
１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアル
ケニル基、炭素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭
素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が２乃至
７のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール
基、スルファモイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩
等）、スルホ基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カル
ボン酸基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原
子、炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子
数が６乃至２０のアリーレン基、スルホニル基、および
これらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もしく
は基を挙げることができる。[0096] alkyl groups for R ^11, an aralkyl group the aryl group, and R ¹¹ of R ¹¹ may have a substituent. Examples of such a substituent include a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 7 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms. , An aralkyl group having 2 to 7 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, a sulfamoyl group (or its Na salt, K salt, etc.), a sulfo group (or its Na salt, K salt, etc.) ), A carboxylic acid group (or its Na salt, K salt, etc.), a halogen atom, an alkenylene group having 1 to 6 carbon atoms, an arylene group having 6 to 20 carbon atoms, a sulfonyl group, and a combination thereof. An atom or group selected from the group can be mentioned.

【００９７】上記「−Ｘ」基の好ましい具体例を以下に
示す。また、「−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ」として使用できる基
の例についても、その後に示す。Preferred specific examples of the above-mentioned "-X" group are shown below. Moreover, the example of the group which can be used as “—L—SO ₂ —X” is also shown below.

【００９８】[0098]

【化７】 [Chemical 7]

【００９９】[0099]

【化８】 [Chemical 8]

【０１００】「−Ｘ」は、上記具体例中、（Ｘ１）、
（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、（Ｘ７）、（Ｘ８）、
（Ｘ１３）、あるいは（Ｘ１４）であることが好まし
く、（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）であることがさらに好ま
しい。特に好ましいのは（Ｘ１）で表わされるビニル基
である。"-X" means (X1) in the above specific examples,
(X2), (X3), (X4), (X7), (X8),
It is preferably (X13) or (X14), and more preferably (X1) or (X2). Particularly preferred is the vinyl group represented by (X1).

【０１０１】Ｌの好ましい具体例を以下に示す。但し、
ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であること
が好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃
至６の整数であり、２もしくは３であることが好まし
い。Preferred specific examples of L are shown below. However,
a is an integer of 1 to 6, preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. b is an integer of 0 to 6, and is preferably 2 or 3.

【０１０２】[0102]

【化９】 [Chemical 9]

【０１０３】Ｌとしては、上記記載の二価の連結基の他
に、上記式のアルキレン基の水素原子が−ＳＯ₂ＣＨ＝
ＣＨ₂基によって置換されてなる基も好ましい。As L, in addition to the above divalent linking group, a hydrogen atom of the alkylene group of the above formula is --SO ₂ CH═
A group substituted with a CH ₂ group is also preferable.

【０１０４】前記の式（６）で表わされるビニルスルホ
ニル基もしくは反応性前駆体基が共有結合により固定さ
れた電極を得るために利用される二官能反応性化合物と
しては、下記の式（７）で表わされるジスルホン化合物
が有利に利用できる。The difunctional reactive compound used for obtaining the electrode having the vinylsulfonyl group or the reactive precursor group represented by the above formula (6) fixed by a covalent bond is represented by the following formula (7). The disulfone compound represented by: can be advantageously used.

【０１０５】 Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ² …… （７）X ¹ —SO ₂ —L ² —SO ₂ —X ² (7)

【０１０６】上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互いに
独立に、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²
Ｒ³Ｙ（反応性前駆体基）を表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ
³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６
のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、
及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭
素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選
ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、
−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級
ピリジニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基
を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原
子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が
７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を
表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基お
よび炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基から
なる群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アル
カリ金属原子およびアンモニウム基からなる群より選ば
れる原子もしくは基を表わし；そして、Ｌ²は連結基を
表わす。In the above formula, X ¹ and X ² independently of each other are —CR ¹ ═CR ² R ³ or —CHR ¹ —CR ²
R ³ Y (reactive precursor group); R ¹ , R ² and R
³ are, independently of each other, a hydrogen atom and a carbon atom number of 1 to 6
An alkyl group, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms,
And an atom or a group selected from the group consisting of aralkyl groups having a total of 7 to 26 carbon atoms and having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms; Y is a halogen atom,
-OSO ₂ R ¹¹ , -OCOR ¹² , -OSO ₃ M, and an atom or a group selected from the group consisting of quaternary pyridinium groups; R ¹¹ represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or the number of carbon atoms. Represents a group selected from the group consisting of an aryl group having 6 to 20 and an aralkyl group having an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms and having a total number of carbon atoms of 7 to 26; R ¹² has a carbon atom number of Represents a group selected from the group consisting of an alkyl group having 1 to 6 and a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; M is an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkali metal atom and an ammonium group. And L ² represents a linking group.

【０１０７】すなわち、上記の式（２）で表わされるジ
スルホン化合物を、前記の反応性基を備えた電極と、例
えば水性雰囲気にて接触させることによって、本発明の
反応性電極を容易に製造することができる。That is, the reactive electrode of the present invention is easily produced by bringing the disulfone compound represented by the above formula (2) into contact with the above-mentioned electrode having a reactive group, for example, in an aqueous atmosphere. be able to.

【０１０８】好ましく用いるジスルホン化合物の代表例
を下記に示す。なお、ジスルホン化合物は、二種類以上
を混合して用いてもよい。Representative examples of the disulfone compound preferably used are shown below. The disulfone compound may be used as a mixture of two or more kinds.

【０１０９】[0109]

【化１０】 [Chemical 10]

【０１１０】[0110]

【化１１】 [Chemical 11]

【０１１１】上記の式（７）で表わされるジスルホン化
合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスル
ホニルアセトアミド）エタン［上記のＳ１に相当する］
を挙げることができる。A typical example of the disulfone compound represented by the above formula (7) is 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane [corresponding to S1 above].
Can be mentioned.

【０１１２】ジスルホン化合物の合成法については、た
とえば、特公昭４７−２４２９号、同５０−３５８０７
号、特開昭４９−２４４３５号、同５３−４１５５１
号、同５９−１８９４４号等の各種公報に詳細が記載さ
れている。The synthesis method of the disulfone compound is described, for example, in JP-B-47-2429 and 50-35807.
JP-A-49-24435 and JP-A-53-41551.
No. 59-18944 and the like, for details.

【０１１３】上記のようにして得られた、表面にビニル
スルホニル基が導入された電極に対して、末端（５’末
端）がビニルスルホニル基と反応することができる反応
性基、例えばアミノ基（−ＮＨ₂）、メルカプト基（−
ＳＨ）で修飾されているＤＮＡ断片を接触させること
で、ジビニルスルホン化合物を介して、共有結合によ
り、ＤＮＡ断片が表面に固定されている、ＤＮＡ修飾電
極を作製することができる。With respect to the electrode having a vinylsulfonyl group introduced on the surface, which is obtained as described above, a reactive group whose terminal (5 ′ end) can react with the vinylsulfonyl group, for example, an amino group ( -NH _2), a mercapto group (-
By contacting the DNA fragment modified with SH), a DNA modified electrode in which the DNA fragment is immobilized on the surface by a covalent bond via a divinylsulfone compound can be prepared.

【０１１４】このようなＤＮＡ修飾電極は、その表面に
固定されたＤＮＡ断片に、前記（Ｆ）で示したような、
電気化学活性インターカレータがインターカレーション
した状態で、前記（Ｅ）で示したような、ピロリン酸に
対して作用する酵素反応において、酸化酵素が作用する
際に起こる電子移動を増幅する。図１は、電極１１１上
に固定されている２本鎖ＤＮＡ断片１２１にインターカ
レーションした電気化学活性インターカレータ１３１
が、酸化酵素１４１と電極１１１の間の電子移動を仲介
している模式図である。電極１１１上に固定された２本
鎖核酸断片１２１に、電気化学活性インターカレータ１
３１が二つのフェロセン分子を２本鎖の外側に突き出し
た状態で結合（インターカレーション）している。酸化
酵素１４１が作用する際に発生する電子がフェロセン分
子の方向に流れると電流は増幅される。即ち、電気化学
活性インターカレータ１３１は、酸化酵素１４１と電極
１１１の間の電子移動反応を仲介している。Such a DNA-modified electrode has a DNA fragment fixed on its surface, as shown in (F) above,
In the state where the electrochemically active intercalator is intercalated, the electron transfer that occurs when the oxidase acts in the enzymatic reaction that acts on pyrophosphate as shown in (E) above is amplified. FIG. 1 shows an electrochemically active intercalator 131 intercalated into a double-stranded DNA fragment 121 fixed on an electrode 111.
FIG. 3 is a schematic diagram that mediates electron transfer between the oxidase 141 and the electrode 111. The electrochemically active intercalator 1 is attached to the double-stranded nucleic acid fragment 121 fixed on the electrode 111.
31 couples (intercalates) two ferrocene molecules in a state of protruding to the outside of the double chain. When the electrons generated when the oxidase 141 acts flow toward the ferrocene molecule, the current is amplified. That is, the electrochemically active intercalator 131 mediates the electron transfer reaction between the oxidase 141 and the electrode 111.

【０１１５】(Ｉ) キット：本発明のターゲット核酸の
検出は、キサントシンまたはイノシン、ピロホスファタ
ーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン
オキシダーゼを含有する酵素反応試薬、電気化学活性縫
い込み型インターカレータ、及びＤＮＡ修飾電極の各要
素を含む、本発明に係るキットを用いて好ましく実施す
ることができる。(I) Kit: For detection of the target nucleic acid of the present invention, an enzyme reaction reagent containing xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, electrochemically active threading intercalator, and DNA modified electrode It can be preferably carried out using a kit according to the present invention, which comprises each element of

【０１１６】上記のキットは、キサントシンまたはイノ
シン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ、キサンチンオキシダーゼを含有する酵素反応
試薬、電気化学活性縫い込み型インターカレータを保持
し、及びＤＮＡ修飾電極を備えているカートリッジ（容
器）であっても良い。The above kit contains a cartridge containing xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, an enzyme reaction reagent containing xanthine oxidase, an electrochemically active threading intercalator, and a DNA modification electrode ( It may be a container).

【０１１７】このキットを用いてターゲット核酸の検出
を行う場合は、ターゲット核酸断片、ターゲット核酸断
片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少な
くとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼにより、予め
ポリメラーゼ伸長反応を行った反応液を、上記のキット
に供給することで、ターゲット核酸断片の検出を行う。When the target nucleic acid is detected using this kit, the target nucleic acid fragment, at least one primer complementary to a part of the target nucleic acid fragment, and at least one deoxynucleoside triphosphate (dNT).
The target nucleic acid fragment is detected by supplying the reaction solution in which the polymerase extension reaction is performed in advance with P) and at least one polymerase to the above kit.

【０１１８】上記のポリメラーゼ反応を、キサントシン
またはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼを含有す
る酵素反応試薬、および電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータを保持し、ＤＮＡ修飾電極を備えている、前
記カートリッジ（容器）の中で実施することも可能であ
る。The above-mentioned polymerase reaction is carried by holding an enzyme reaction reagent containing xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and an electrochemically active threading intercalator, and equipped with a DNA modification electrode. It is also possible to carry out in the cartridge (container).

【０１１９】また、キットの別の形態として、少なくと
も一部の塩基配列が既知であるターゲット核酸断片を含
む液体を供給することのできる開口部、ターゲット核酸
断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少
なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼを保持するこ
とのできる少なくとも一つの反応セル部、キサントシン
またはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼを含有す
る酵素反応試薬、および電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータを保持し、ＤＮＡ修飾電極を備えている検出
部、及びそれら前記開口部、反応セル部、検出部の間を
連結し、液体を移動させることのできる細管または溝を
備えているカートリジを用いて実施することも可能であ
る。Further, as another form of the kit, an opening capable of supplying a liquid containing a target nucleic acid fragment of which at least a part of the base sequence is known, and at least one kind of complementary to a part of the target nucleic acid fragment Primer, at least one deoxynucleoside triphosphate (dNT)
P), and at least one reaction cell part capable of holding at least one polymerase, xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase-containing enzyme reaction reagent, and electrochemically active threading intercalator And a cartridge having a DNA-modified electrode and a cartridge or a groove capable of moving a liquid by connecting the opening, the reaction cell, and the detector to each other. It is also possible to carry out.

【０１２０】図２には、本発明に係るカートリッジ形態
のキットの一例を示した。キット１０において、開口部
３１からターゲット核酸を含有する試料液を供給するこ
とができる。開口部３１は細管４１によって、反応セル
３２と連結されている。反応セル３２には、予めターゲ
ット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライ
マー８１、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リ
ン酸（ｄＮＴＰ）８２、及び少なくとも一種のポリメラ
ーゼ８３が保持されている。さらに、反応セル３２は細
管４２によって、検出部３３と連結されている。検出部
３３には予めキサントシンまたはイノシン、ピロホスフ
ァターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサン
チンオキシダーゼを含有する酵素反応試薬８４、および
電気化学活性縫い込み型インターカレータ８５が保持さ
れ、ＤＮＡ修飾電極５１が備えられている。反応セル３
２でポリメラーゼ伸長反応が進行した試料液は、細管４
２を移動して、検出部３３に供給される。検出部３３に
供給された試料液中の、ポリメラーゼ伸長反応により生
成したピロ燐酸に対して酵素反応試薬８４が作用し、そ
の際に起こる電子移動を、電気化学活性縫い込み型イン
ターカレータ８５を介して、ＤＮＡ修飾電極５１で電流
として検出する。上記キット１０において、開口部３１
と反応セル３２の間、及び反応セル３２と検出部３３の
間の液体の移動は、遠心力、電気泳動または電気浸透な
どを用いることが可能である。また、反応セル３２、細
管４１及び４２、検出部３３は、基体２１と蓋２２によ
って密封されていることが望ましい。FIG. 2 shows an example of a cartridge type kit according to the present invention. In the kit 10, the sample solution containing the target nucleic acid can be supplied from the opening 31. The opening 31 is connected to the reaction cell 32 by a thin tube 41. In the reaction cell 32, at least one primer 81 complementary to a part of the target nucleic acid fragment, at least one deoxynucleoside triphosphate (dNTP) 82, and at least one polymerase 83 are held in advance. Furthermore, the reaction cell 32 is connected to the detection unit 33 by a thin tube 42. In the detection unit 33, an enzyme reaction reagent 84 containing xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and an electrochemically active threading intercalator 85 are held in advance, and a DNA modification electrode 51 is provided. . Reaction cell 3
The sample solution in which the polymerase extension reaction proceeded in 2 was
2 is moved and supplied to the detection unit 33. The enzyme reaction reagent 84 acts on the pyrophosphoric acid generated by the polymerase extension reaction in the sample solution supplied to the detection unit 33, and the electron transfer occurring at that time is transferred via the electrochemically active threading intercalator 85. Then, it is detected as a current at the DNA modification electrode 51. In the kit 10, the opening 31
The liquid can be moved between the reaction cell 32 and the reaction cell 32, and between the reaction cell 32 and the detection unit 33 by using centrifugal force, electrophoresis, electroosmosis, or the like. Moreover, it is desirable that the reaction cell 32, the thin tubes 41 and 42, and the detection unit 33 are sealed by the base 21 and the lid 22.

【０１２１】図２に示したようなキット１０を使用する
場合、図３に示したように、反応セル３２および検出部
３３の温度をコントロールすることのできる部分６１及
び６２と、ＤＮＡ修飾電極５１上の電子移動を、電気化
学的に電流として検出する部分７１を備えている装置を
合わせて使用することが望ましい。When the kit 10 as shown in FIG. 2 is used, as shown in FIG. 3, the parts 61 and 62 capable of controlling the temperatures of the reaction cell 32 and the detection part 33 and the DNA modification electrode 51 are used. It is desirable to use a device equipped with a portion 71 for detecting the above electron transfer electrochemically as an electric current.

【０１２２】本発明で使用することのできるカートリッ
ジ形態のキットは、図２に示されているものに限られな
い。ポリメラーゼ伸長反応に必要な試薬はそれぞれ別の
スペースに保持されていても良い。その場合は、反応時
にそれぞれの試薬が反応セルに移動してくるようにすれ
ば良い。酵素反応試薬と電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータが別々に、検出部以外のスペースに保持され
ていても良い。その場合も、検出時にそれぞれの試薬が
検出部に移動してくるようにすれば良い。The cartridge type kit that can be used in the present invention is not limited to that shown in FIG. The reagents necessary for the polymerase extension reaction may be held in different spaces. In that case, each reagent may be moved to the reaction cell during the reaction. The enzyme reaction reagent and the electrochemically active threaded intercalator may be separately held in a space other than the detection portion. Also in that case, each reagent may be moved to the detection unit at the time of detection.

【０１２３】また、１つのカートリッジ上に「開口部−
細管−反応セル−細管−検出部」の組を平行に並べて、
または同心円の半径方向に並べて、複数組設置すること
も可能である。この場合、例えば反応セルに保持するタ
ーゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプ
ライマーの塩基配列を、ターゲットとする核酸の種類に
応じて変更することで、同時に複数種のターゲット核酸
を検出することが可能なキットを提供できる。In addition, the "opening-
Tubule-reaction cell-capillary-detection section "are arranged in parallel,
Alternatively, a plurality of sets can be installed by arranging them in the radial direction of the concentric circles. In this case, for example, by changing the base sequence of at least one primer complementary to a part of the target nucleic acid fragment held in the reaction cell according to the type of the target nucleic acid, a plurality of target nucleic acids can be detected simultaneously. It is possible to provide a possible kit.

【０１２４】以下、実施例にて本発明を詳細に説明す
る。しかしながら、本実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。The present invention will be described in detail below with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by this embodiment.

【０１２５】[0125]

【実施例】実施例１ Ｙ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子関
連部位の検出 (１) ターゲット核酸断片試料液の調整 男性、女性、各々１人づつから採取した血液検体に対し
て、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を
用いて、抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの
精製蒸留水中に回収することで、ターゲット核酸断片試
料液を調整した。Example 1 Detection of SRY Gene Related Site on Short Arm of Y Chromosome (1) Preparation of Target Nucleic Acid Fragment Sample Solution Commercially available nucleic acid extraction from blood samples collected from male and female , A purification kit (manufactured by QIAGEN,
A target nucleic acid fragment sample solution was prepared by recovering the extracted and purified genomic nucleic acid fragment in 1 mL of purified distilled water using QIAamp DNA Blood Mini Kit).

【０１２６】(２) プライマーの調整 プライマーは、Ｙ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子を特異的
に認識できるように設計した塩基配列を持つ、オリゴヌ
クレオチドのプライマーのセット（プライマー１、プラ
イマー２）として合成した。(2) Preparation of primer The primer was synthesized as a set of oligonucleotide primers (primer 1, primer 2) having a base sequence designed to specifically recognize the SRY gene on the short arm of the Y chromosome. did.

【０１２７】[0127]

【化１２】 [Chemical 12]

【０１２８】(３) ポリメラーゼ伸長反応によるターゲ
ット核酸断片の増幅 以下に示す反応液の組成で、ＰＣＲによるターゲット核
酸断片の増幅を実施した。ＰＣＲは、[デネイチャー：
９４℃・３０秒、アニーリング：６５℃・３０秒、ポリ
メラーゼ伸長反応：７２℃・１分]を３０サイクル繰り
返することで実施した。(3) Amplification of Target Nucleic Acid Fragment by Polymerase Extension Reaction A target nucleic acid fragment was amplified by PCR with the composition of the reaction solution shown below. PCR is [Denature:
It was carried out by repeating 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, annealing: 65 ° C. for 30 seconds, and polymerase extension reaction: 72 ° C. for 1 minute.

【０１２９】 ＜反応液の組成＞ 精製水 ３６．５μＬ １０×ＰＣＲバッファー ５μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ Ｔａｑ ＦＰ（ニッポンジーン社製） ０．５μＬ ２０μＭ プライマー ２μＬ ３０ｎｇ／μＬ ターゲット核酸断片試料液 ２μＬ[0129] <Composition of reaction liquid>     Purified water 36.5 μL     10 x PCR buffer 5 μL     2.5 mM dNTP 4 μL     Taq FP (Nippon Gene Co., Ltd.) 0.5 μL     20 μM primer 2 μL     30 ng / μL Target nucleic acid fragment sample solution 2 μL

【０１３０】(４) 電気化学的電流測定 前記（３）のポリメラーゼ伸長反応によるターゲット核
酸断片の増幅反応に、ターゲット核酸断片を含まない試
料液を用いた場合（コントロール）、男性から採取した
血液から調整したターゲット核酸試料液を用いた場合
（サンプルＭ）、及び女性から採取した血液から調整し
たターゲット核酸試料液を用いた場合（サンプルＦ）
の、各々の反応後の液を用いて、以下に示す組成の検出
液を調整した。(4) Electrochemical current measurement When a sample solution containing no target nucleic acid fragment was used in the amplification reaction of the target nucleic acid fragment by the polymerase extension reaction of (3) above (control), from blood collected from a man When using the prepared target nucleic acid sample solution (Sample M) and when using the target nucleic acid sample solution prepared from blood collected from a woman (Sample F)
A detection liquid having the composition shown below was prepared using the liquids after the respective reactions.

【０１３１】 ＜検出液の組成＞ ポリメラーゼ伸長反応後の液 １００μＬ キサントシン ０．８２ｇ ピロホスファターゼ ２５０Ｕ プリンヌクレオシドホスホリラーゼ １００Ｕ キサンチンオキシダーゼ ２００Ｕ 電気化学活性縫い込み型インターカレータ(下記式(８)) ０．０２５ｍｇ ０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０） ４００μＬ[0131] <Composition of detection liquid>     Solution after polymerase extension reaction 100 μL     Xanthosine 0.82g     Pyrophosphatase 250U     Purine nucleoside phosphorylase 100U     Xanthine oxidase 200U     Electrochemically active sewn-in intercalator (the following formula (8)) 0.025mg     0.1 M potassium chloride-0.1 M acetate buffer (pH 6.0) 400 μL

【０１３２】[0132]

【化１３】 [Chemical 13]

【０１３３】上記検出液に、ＤＮＡ断片を固定していな
い電極（面積１．０ｍｍ²）を浸漬し、印加電圧１００
乃至７００ｍＶの範囲で、ディファレンシャル・パルス
・ボルタンメトリー（ＤＰＶ）測定を行った。次いで、
印加電圧２６０ｍＶでの応答電流値を求めたところ、コ
ントロール、サンプルＭ、サンプルＦについて、各々−
０．４μＡ、−２．５μＡ、及び−０．４μＡであっ
た。ＤＰＶ測定は、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０
ｍＳおよびスキャン速度１００ｍＶ／秒にて行った。An electrode (area 1.0 mm ² ) on which DNA fragments were not fixed was immersed in the above detection solution, and applied voltage 100
Differential pulse voltammetry (DPV) measurement was performed in the range of 700 mV to 700 mV. Then
When the response current value at an applied voltage of 260 mV was obtained, each of the control, sample M, and sample F was-
The values were 0.4 μA, −2.5 μA, and −0.4 μA. For DPV measurement, pulse amplitude 50 mV, pulse width 50
It was performed at mS and a scan speed of 100 mV / sec.

【０１３４】実施例１は、男性に特有に存在するＹ染色
体短腕上のＳＲＹ遺伝子関連部位を特異的に検出できる
ことを示している。この実施例１の結果より、本発明の
ポリメラーゼ伸長反応の進行により生成するピロ燐酸に
対して、少なくとも一種の酸化酵素を含む酵素反応試薬
を作用させ、電気化学活性インターカレータの存在下
に、電極を用いて電気化学的に電流を測定する方法によ
り、ターゲット核酸断片の存在を検出することが可能で
あることがわかる。Example 1 shows that the SRY gene-related site on the short arm of the Y chromosome, which is unique to males, can be specifically detected. From the results of Example 1, the enzyme reaction reagent containing at least one oxidase is allowed to act on the pyrophosphate produced by the progress of the polymerase extension reaction of the present invention, and the electrode is produced in the presence of the electrochemically active intercalator. It is understood that it is possible to detect the presence of the target nucleic acid fragment by a method of electrochemically measuring an electric current using.

【０１３５】実施例２ ＤＮＡ修飾電極を用いたＹ染色
体短腕上のＳＲＹ遺伝子関連部位の検出 (１) ＤＮＡ修飾電極の作製 面積が１．０ｍｍ²の金電極に、６−アミノ−１ヘキサ
ンチオール（０．０１４ｍＭ）とｎヘキサンチオール
（１ｍＭ）の混合水溶液(２μＬ)を滴下、混合水溶液が
乾燥しないように、４５℃で２時間放置して得られた金
電極に、３％の１，２−ビス（ビニルスルホニルアセト
アミド）エタンのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を滴
下した後、室温で２時間放置して、自由端部にビニルス
ルホニル基を持つ反応性金電極を作製した。次いで、こ
のスペーサ基付き反応性金電極表面に、５’末端にアミ
ノヘキシル基を有するアデニンの２０量体（₂ＨＮ−Ｄ
ＮＡ−Ａ₂₀）と、５’末端が修飾されていないチミンの
２０量体（ＤＮＡ−Ｔ₂₀）を、５×ＳＳＣ溶液中で混合
（１０^-10モル／１μＬ）して、室温で３０分放置した
溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時間放置した後、超
純水で洗浄し、次いで乾燥することにより、ＤＮＡ修飾
電極を作製した。Example 2 Detection of SRY Gene-Related Site on Short Arm of Y Chromosome Using DNA Modified Electrode (1) 6-amino-1hexanethiol was added to a gold electrode having a DNA modified electrode preparation area of 1.0 mm ^2. A mixed aqueous solution (2 μL) of (0.014 mM) and n-hexanethiol (1 mM) was added dropwise, and the mixed aqueous solution was allowed to stand at 45 ° C. for 2 hours so as not to dry. A solution of -bis (vinylsulfonylacetamide) ethane in borate buffer (pH 8.5) was dropped, and the mixture was left at room temperature for 2 hours to prepare a reactive gold electrode having a vinylsulfonyl group at its free end. Then, a 20-mer ( ₂ HN-D) of adenine having an aminohexyl group at the 5'end is formed on the surface of the reactive gold electrode with a spacer group.
NA-A ₂₀ ) and a thymine 20-mer (DNA-T ₂₀ ) not modified at the 5 ′ end were mixed (10 ⁻¹⁰ mol / 1 μL) in 5 × SSC solution and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The left solution (2 μL) was added dropwise, left at room temperature for 1 hour, washed with ultrapure water, and then dried to prepare a DNA-modified electrode.

【０１３６】(２) ＤＮＡ修飾電極を用いた電気化学的
電流測定 実施例１において、ＤＮＡ断片を固定していない電極を
使用する代わりに、上記（１）で作製したＤＮＡ修飾電
極を使用する以外は、実施例１と同様にして、ターゲッ
ト核酸断片試料液の調整、プライマーの調整、ポリメラ
ーゼ伸長反応によるターゲット核酸断片の増幅、及び電
気化学的電流測定を行い、印加電圧２６０ｍＶでの応答
電流値を求めたところ、コントロール、サンプルＭ、サ
ンプルＦについて、各々−０．２μＡ、−４．８μＡ、
及び−０．２μＡであった。(2) Electrochemical current measurement using a DNA-modified electrode In Example 1, the DNA-modified electrode prepared in (1) above was used instead of using the electrode on which the DNA fragment was not immobilized. Was prepared in the same manner as in Example 1 by adjusting the target nucleic acid fragment sample solution, adjusting the primer, amplifying the target nucleic acid fragment by the polymerase extension reaction, and measuring the electrochemical current, and measuring the response current value at an applied voltage of 260 mV. As a result, for the control, the sample M, and the sample F, −0.2 μA, −4.8 μA, and
And -0.2 μA.

【０１３７】実施例２は、ＤＮＡ修飾電極を用いること
で、男性に特有に存在するＹ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝
子関連部位を特異的に検出を、より感度良く行えること
を示している。Example 2 shows that by using a DNA-modified electrode, the SRY gene-related site on the short arm of the Y chromosome, which is unique to males, can be specifically detected with higher sensitivity.

【０１３８】実施例３ ＤＮＡ修飾電極を用いたアルデ
ヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の
１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出 (１) ターゲット核酸断片試料液の調整 予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝
子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬ
ＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型であることが既
知である、各々１人から採取した血液検体をもとに、実
施例１の（２）に記載されている方法と同様にして、タ
ーゲット核酸断片試料液を、各々サンプルＡＬＤＨ２活
性型、及びサンプルルＡＬＤＨ２不活性型として調整し
た。Example 3 Detection of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) of Aldehyde Dehydrogenase Gene (ALDH2 Gene) Related Site Using DNA Modified Electrode (1) Preparation of Target Nucleic Acid Fragment Sample Solution Due to the difference in a specific single nucleotide species in the ALDH2 gene-related site, AL
A target nucleic acid fragment was prepared in the same manner as in the method described in (2) of Example 1 based on a blood sample collected from one person who is known to be DH2 active type or ALDH2 inactive type. The sample solutions were prepared as a sample ALDH2 active type and a sample ALDH2 inactive type, respectively.

【０１３９】(２) プライマーの設計 プライマーは、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連
部位のなかで、ＡＬＤＨ２の活性を決定する特定部分に
ついて、ＡＬＤＨ２活性型の塩基配列に特異的なプライ
マーとして設計した塩基配列を持つ、オリゴヌクレオチ
ドのプライマー（プライマー１）と、前記特定部位の下
流の塩基配列に特異的なプライマーとして設計した塩基
配列を持つ、オリゴヌクレオチドのプライマー（プライ
マー２）のセットとして合成した。(2) Design of primer The primer is a base designed as a primer specific to the ALDH2 active type base sequence for a specific portion of the ALDH2 gene-related site on chromosome 12 that determines the activity of ALDH2. It was synthesized as a set of an oligonucleotide primer (primer 1) having a sequence and an oligonucleotide primer (primer 2) having a base sequence designed as a primer specific to the downstream base sequence of the specific site.

【０１４０】[0140]

【化１４】 [Chemical 14]

【０１４１】(３) ＤＮＡ修飾電極を用いた電気化学的
電流測定 ＤＮＡ修飾電極の作製は実施例２の（１）に、ポリメラ
ーゼ伸長反応によるターゲット核酸断片の増幅（ＰＣ
Ｒ）は実施例１の（３）に、及びポリメラーゼ伸長反応
を行った後の反応液のＤＮＡ修飾電極を用いての電気化
学的電流測定は、ＤＮＡ断片を固定していない電極を使
用する代わりにＤＮＡ修飾電極を使用する以外は、実施
例１の（４）に記載されている方法と同様にして、印加
電圧２６０ｍＶでの応答電流値を求めたところ、コント
ロール、サンプルＡＬＤＨ２活性型、及びサンプルＡＬ
ＤＨ２不活性型について、各々−０．２μＡ、−３．２
μＡ、及び−０．２μＡであった。(3) Electrochemical Current Measurement Using DNA Modified Electrode Preparation of a DNA modified electrode is described in (2) of Example 2 except that amplification of the target nucleic acid fragment by polymerase extension reaction (PC
R) is the same as in (3) of Example 1 and the electrochemical current measurement using the DNA-modified electrode of the reaction solution after carrying out the polymerase extension reaction is the same as that of using the electrode on which the DNA fragment is not immobilized. The response current value at an applied voltage of 260 mV was determined in the same manner as in the method described in (4) of Example 1 except that the DNA-modified electrode was used for the control, the sample ALDH2 active type, and the sample. AL
For the DH2 inactive form, −0.2 μA and −3.2, respectively.
μA and −0.2 μA.

【０１４２】実施例３は、１２番染色体上のＡＬＤＨ２
遺伝子関連部位のなかで、ＡＬＤＨ２の活性を決定する
特定部分の塩基配列違いを特異的に検出できることを示
している。この実施例３の結果より、本発明のポリメラ
ーゼ伸長反応の進行により生成するピロ燐酸に対して、
少なくとも一種の酸化酵素を含む酵素反応試薬を作用さ
せ、電気化学活性インターカレータの存在下に、電極を
用いて電気化学的に電流を測定する方法により、ターゲ
ット核酸断片の塩基配列を検出することが可能であるこ
とがわかる。Example 3 shows that ALDH2 on chromosome 12
It is shown that among the gene-related sites, the difference in the base sequence of the specific portion that determines the activity of ALDH2 can be specifically detected. From the results of Example 3, the pyrophosphate produced by the progress of the polymerase extension reaction of the present invention was
It is possible to detect the base sequence of a target nucleic acid fragment by a method of reacting an enzymatic reaction reagent containing at least one oxidase and measuring an electric current electrochemically using an electrode in the presence of an electrochemically active intercalator. It turns out that it is possible.

【０１４３】[0143]

【発明の効果】本発明によれば、ウイルス、細菌等によ
る感染症の臨床検査、及び個人の遺伝的な特徴による遺
伝的疾患の検査等に有効な、特定の塩基配列を有するタ
ーゲット核酸断片の検出の、簡便かつ迅速な方法および
キットが提供される。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a target nucleic acid fragment having a specific nucleotide sequence, which is effective for clinical examination of infectious diseases caused by viruses, bacteria, etc., and examination of genetic diseases due to individual genetic characteristics, etc. Convenient and rapid methods and kits for detection are provided.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 本発明の一の実施形態を説明する概念図であ
る。FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating an embodiment of the present invention.

【図２】 本発明のカートリッジ形態でのキットの例を
示す斜視図である。FIG. 2 is a perspective view showing an example of a kit in the form of a cartridge of the present invention.

【図３】 本発明のカートリッジ形態でのキットを使用
する場合のシステム構成例を示す斜視図である。FIG. 3 is a perspective view showing an example of a system configuration when a kit in the form of a cartridge of the present invention is used.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１０…キット ２１…基体 ２２…蓋 ３１…開口部 ３２…反応セル ３３…検出部 ４１…細管 ４２…細管 ５１…ＤＮＡ修飾電極 ６１…温度コントロール部 ６２…温度コントロール部 ７１…電気化学的電流検出部 ８１…プライマー ８２…ｄＮＴＰ ８３…ポリメラーゼ ８４…酵素反応試薬 ８５…電気化学活性縫い込み型インターカレータ １１１…電極 １２１…２本鎖ＤＮＡ断片 １３１…電気化学活性インターカレータ １４１…酸化酵素 10 ... Kit 21 ... Base 22 ... Lid 31 ... Opening 32 ... Reaction cell 33 ... Detector 41 ... Capillary 42 ... narrow tube 51 ... DNA modified electrode 61 ... Temperature control section 62 ... Temperature control section 71 ... Electrochemical current detector 81 ... Primer 82 ... dNTP 83 ... Polymerase 84 ... Enzyme reaction reagent 85 ... Electrochemically active threaded intercalator 111 ... Electrode 121 ... Double-stranded DNA fragment 131 ... Electrochemically active intercalator 141 ... Oxidase

フロントページの続き (72)発明者 阿部 義彦 埼玉県朝霞市泉水三丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR62 QS25 QX05 Continued front page    (72) Inventor Yoshihiko Abe             3-11-46 Izumi, Asaka-shi, Saitama Prefecture             Shin Film Co., Ltd. F-term (reference) 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR62                       QS25 QX05

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 少なくとも一部の塩基配列が既知である
ターゲット核酸断片に対し、当該ターゲット核酸断片の
一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくと
も一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、及び少なくと
も一種のポリメラーゼの存在下に、前記ターゲット核酸
断片を鋳型にして前記プライマーの３’末端を起点とす
るポリメラーゼ伸長反応が連続して進行するか否かによ
り、前記ターゲット核酸断片の存在またはターゲット核
酸断片の塩基配列を検出する方法において、前記ポリメ
ラーゼ伸長反応により生成するピロ燐酸に対して、少な
くとも一種の酸化酵素を含む酵素反応試薬を作用させ、
電気化学活性インターカレータの存在下に、電極を用い
て電気化学的に電流を測定することを特徴とするターゲ
ット核酸断片の検出方法1. A target nucleic acid fragment having a known base sequence of at least a part thereof, at least one primer complementary to a part of the target nucleic acid fragment, at least one deoxynucleoside triphosphate, and at least one The presence or absence of the target nucleic acid fragment or the base of the target nucleic acid fragment depends on whether or not the polymerase extension reaction starting from the 3 ′ end of the primer proceeds continuously using the target nucleic acid fragment as a template in the presence of a polymerase. In the method for detecting a sequence, an enzyme reaction reagent containing at least one oxidase is allowed to act on pyrophosphate produced by the polymerase extension reaction,
A method for detecting a target nucleic acid fragment, which comprises electrochemically measuring an electric current using an electrode in the presence of an electrochemically active intercalator 【請求項２】 ピロ燐酸に作用する酵素反応試薬が、キ
サントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼを含有する酵素反応試薬であることを特徴とする請求
項１に記載のターゲット核酸断片の検出方法2. The target nucleic acid fragment according to claim 1, wherein the enzyme reaction reagent that acts on pyrophosphate is an enzyme reaction reagent containing xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, and xanthine oxidase. Detection method 【請求項３】 電気化学活性インターカレータが、酸化
還元活性を有する縫い込み型インターカレータであるこ
とを特徴とする請求項１または請求項２に記載のターゲ
ット核酸断片の検出方法3. The method for detecting a target nucleic acid fragment according to claim 1 or 2, wherein the electrochemically active intercalator is a sewn-in intercalator having redox activity. 【請求項４】 電極が、ＤＮＡ断片が表面に固定されて
いるＤＮＡ修飾電極であることを特徴とする請求項１、
２または請求項３のいずれかに記載のターゲット核酸断
片の検出方法4. The electrode is a DNA-modified electrode having a DNA fragment immobilized on its surface.
The method for detecting a target nucleic acid fragment according to claim 2 or claim 3. 【請求項５】 ＤＮＡ修飾電極に固定されているＤＮＡ
断片が、予め二本鎖に調整されたＤＮＡ断片であること
を特徴とする請求項４に記載の、ターゲット核酸断片の
検出方法5. DNA immobilized on a DNA-modified electrode
The method for detecting a target nucleic acid fragment according to claim 4, wherein the fragment is a DNA fragment prepared in advance into a double-stranded form. 【請求項６】 電気化学的な電流の測定が、サイクリッ
クボルタンメトリーまたはディファレンシャルパルスボ
ルタンメトリーであることを特徴とする請求項１、２、
３、４または請求項５のいずれかに記載のターゲット核
酸断片の検出方法6. The electrochemical current measurement is cyclic voltammetry or differential pulse voltammetry, according to claim 1, 2,
The method for detecting a target nucleic acid fragment according to claim 3, 4 or 5. 【請求項７】 ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランス
クリプターゼ）からなるグループから選択される請求項
１、２、３、４、５または請求項６のいずれかに記載の
ターゲット核酸断片の検出方法7. The polymerase is DNA polymerase I, Klenow fragment of DNA polymerase I, Bst D.
The method for detecting a target nucleic acid fragment according to any one of claims 1, 2, 3, 4, 5 or 6, which is selected from the group consisting of NA polymerase and reverse transcriptase. 【請求項８】 キサントシンまたはイノシン、ピロホス
ファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサ
ンチンオキシダーゼを含有する酵素反応試薬、電気化学
活性縫い込み型インターカレータ、及び電極の各要素を
含むターゲット核酸断片の検出キット8. A kit for detecting a target nucleic acid fragment, which comprises xanthosine or inosine, pyrophosphatase, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase-containing enzyme reaction reagent, electrochemically active threading intercalator, and electrode elements. 【請求項９】 検出するターゲット核酸断片の一部と相
補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種の
デオキシヌクレオシド３リン酸、及び少なくとも一種の
ポリメラーゼを含有するポリメラーゼ伸長反応試薬を更
に含む請求項８に記載のターゲット核酸断片の検出キッ
ト9. The method according to claim 8, further comprising a polymerase extension reaction reagent containing at least one primer complementary to a part of the target nucleic acid fragment to be detected, at least one deoxynucleoside triphosphate, and at least one polymerase. Target nucleic acid fragment detection kit described 【請求項１０】 電極がＤＮＡ修飾電極である請求項８
または請求項９に記載のターゲット核酸断片の検出キッ
ト10. The electrode is a DNA-modified electrode as claimed in claim 8.
Alternatively, the target nucleic acid fragment detection kit according to claim 9.