JP2006003394A - 走査型レーザー顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】第一走査光学系の走査位置と第二走査光学系の走査位置の同期が図られた走査型レーザー顕微鏡を提供する。
【解決手段】走査型レーザー顕微鏡は、標本１１８に光を照射して走査することのできる第一走査光学系Ａと、標本１１８に光を照射して走査することのできる第二走査光学系Ｂと、標本１１８から生じる光を第一走査光学系Ａの一部を介して検出するための検出光学系Ｃと、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂを互いに同期させて走査駆動するコントロールユニット１２０とを備えている。
【選択図】 図１

Description

本発明は走査型レーザー顕微鏡に関する。

走査型レーザー顕微鏡は、レーザー光を走査光学系と対物レンズを介して標本のＸ軸とＹ軸に沿って走査しながら照射し、標本からの蛍光または反射光を再び対物レンズと走査光学系を介して検出器に取り込むことにより標本の二次元の輝度情報を得る。この輝度情報と走査光学系の走査位置情報を対応させることにより、輝点の二次元分布を表示することにより、標本の蛍光像あるいは反射像を観察することも可能である。

走査型レーザー顕微鏡の一種である共焦点走査型レーザー顕微鏡では、検出光学系は、標本と共役な位置にピンホールを有し、標本中の合焦面だけの情報を検出することができる。合焦面だけの情報を検出することが可能であることから、標本中の断面位置における情報を高精度に解析することが可能である。なお、二光子吸収を発生させることが可能なパルスレーザー等を励起光源に用いた場合には、合焦面でだけ標本は蛍光を発するため、ピンホールを設けることなく、標本中の断面情報を取得することが可能である。

特開平１０−２０６７４２号公報は、レーザー走査顕微鏡において、標本の観察のために検出光学系と組み合わされる走査光学系の他に、第二走査光学系を設け、標本の観察位置とは異なる部位にレーザーを照射し、レーザー照射により特異現象を発現させた標本の動的挙動を解析することを提案している。しかし、特異現象を発現させるための走査光学系の駆動と観察のための走査光学系の駆動との間に時間的な相関がないため精密な動的挙動の解析は難しい。

特開２０００−２７５５２９号公報は、走査型レーザー顕微鏡において、観察のための第一走査光学系と特異現象を発現させるための第二走査光学系によるレーザー照射のタイミングを制御することにより、時間精度の高い測定を提案している。これによれば、第二走査光学系を用いて特異現象を発現させた標本を、第一走査光学系を利用して観察することにより、特異発現による標本の動的挙動を時間精度良く観察することができる。
特開平１０−２０６７４２号公報 特開２０００−２７５５２９号公報

しかし、特開２０００−２７５５２９号公報の走査型レーザー顕微鏡は、第一走査光学系の走査位置と第二走査光学系の走査位置の同期が取られていないため、第二走査光学系による励起により生じた蛍光を継続的に第一走査光学系で取り込むようなことはできない。

本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、第一走査光学系の走査位置と第二走査光学系の走査位置の同期が図られた走査型レーザー顕微鏡を提供することである。

本発明による走査型レーザー顕微鏡は、標本に光を照射して走査することのできる第一走査光学系と、標本に光を照射して走査することのできる第二走査光学系と、標本から生じる光を第一走査光学系の一部を介して検出するための検出光学系と、第一走査光学系と第二走査光学系を互いに同期させて走査駆動するコントロールユニットとを備えている。

本発明によれば、第一走査光学系の走査位置と第二走査光学系の走査位置の同期が図られた走査型レーザー顕微鏡が提供される。これにより、第一走査光学系と第二走査光学系を両者の走査位置が常に一致するように駆動することにより、第二走査光学系による励起により生じた蛍光を第一走査光学系を利用して継続的に検出することが可能になる。また、第一走査光学系と第二走査光学系を一定の遅延時間を持たせて駆動することにより、遅延時間を持たせて両走査光学系を駆動することにより、蛍光のライフタイムの測定や、蛍光に遅れて発生するリン光の観察や、蛍光の褪色後回復（ＦＲＡＰ）の測定などが可能になる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

［第一実施形態］
図１は、本発明の第一実施形態による走査型レーザー顕微鏡の光学系ブロック図である。図１に示されるように、観察対象の標本１１８はステージ１１７上に載置される。走査型レーザー顕微鏡は、標本１１８に光を照射して走査することのできる第一走査光学系Ａと、標本１１８に光を照射して走査することのできる第二走査光学系Ｂと、標本１１８から生じる光を第一走査光学系Ａの一部を介して検出するための検出光学系Ｃと、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂを互いに同期させて走査駆動するコントロールユニット１２０とを備えている。

第一走査光学系Ａは、第一レーザー光源１０１と第一レーザー制御素子１０２と第一走査光学ユニット１０４とリレーレンズ１０５とミラー１０６と結像レンズ１１５と対物レンズ１１６とを備えている。第一走査光学系Ａは、第一レーザー光源１０１から射出されるレーザー光を標本１１８に照射して走査することができる。

第二走査光学系Ｂは、第二レーザー光源１１０と第二レーザー制御素子１１１と第二走査光学ユニット１１２とリレーレンズ１１３とダイクロイックミラー１１４と結像レンズ１１５と対物レンズ１１６とを備えている。第二走査光学系Ｂは、第二レーザー光源１１０から射出されるレーザー光を標本１１８に照射して走査することができる。

ダイクロイックミラー１１４は、第一走査光学系Ａの光軸上に位置し、第二走査光学系Ｂの光軸を第一走査光学系Ａの光軸に合成し、第一走査光学系Ａの光軸と第二走査光学系Ｂの光軸はダイクロイックミラー１１４とステージ１１７の間で一致している。第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂは結像レンズ１１５と対物レンズ１１６を共有している。第一走査光学系Ａの焦点面と第二走査光学系Ｂの焦点面とは一致している。

検出光学系Ｃは、ダイクロイックミラー１０３とレンズ１０７とピンホール１０８と光電変換素子１０９とから構成されている。ダイクロイックミラー１０３は、第一走査光学系Ａの光軸上に位置し、第一レーザー光源１０１から発せられたレーザー光と標本１１８から生じた光とを分離する。

第一レーザー制御素子１０２と第二レーザー制御素子１１１と第一走査光学ユニット１０４と第二走査光学ユニット１１２と光電変換素子１０９はコントロールユニット１２０に接続されている。コントロールユニット１２０は表示装置１２１と接続されている。コントロールユニット１２０は、後述するように、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂを制御し、標本１１８へのレーザー光の照射と標本１１８から生じた光の測定とを制御する。

次に、このように構成した走査型レーザー顕微鏡の作用を説明する。

第一レーザー光源１０１からのレーザー光は、コントロールユニット１２０により制御される第一レーザー制御素子１０２によって波長と強度が調整され、ダイクロイックミラー１０３によって反射され、コントロールユニット１２０により制御される第一走査光学ユニット１０４によって走査される。レーザー光はさらに、リレーレンズ１０５とミラー１０６とダイクロイックミラー１１４と結像レンズ１１５と対物レンズ１１６を介して、標本１１８内の断面１１９に照射され、断面１１９上を二次元的に走査される。

一方、第二レーザー光源１１０からのレーザー光は、コントロールユニット１２０により制御される第二レーザー制御素子１１１によって波長と強度が調整され、同じくコントロールユニット１２０により制御される第二走査光学ユニット１１２によって走査される。レーザー光はさらに、リレーレンズ１１３を通過し、ダイクロイックミラー１１４によって反射され、結像レンズ１１５と対物レンズ１１６を透過して、標本１１８内の断面１１９に照射され、断面１１９上を二次元的に走査される。第二走査光学系Ｂのレーザー光の照射位置は、コントロールユニット１２０により第二走査光学ユニット１１２を制御することによって、第一走査光学系Ａのレーザー光の照射位置に対して独立に制御可能である。

レーザー光の照射に応じて断面１１９から生じた光（例えば蛍光または反射光を含む光）の一部は対物レンズ１１６に入射し、結像レンズ１１５を通り、特定の波長域の光だけがダイクロイックミラー１１４を透過する。ダイクロイックミラー１１４を透過した光は、ミラー１０６とリレーレンズ１０５と第一走査光学ユニット１０４を通過し、特定の波長域の光だけがダイクロイックミラー１０３を透過する。ダイクロイックミラー１０３を透過した光はレンズ１０７を通過し、標本１１８内の断面１１９上の光だけがピンホール１０８を通過する。ピンホール１０８を通過した光は光電変換素子１０９に入射する。

光電変換素子１０９は、受光した光の強度を示す信号を出力する。光電変換素子１０９からの出力信号は、コントロールユニット１２０に導かれる。コントロールユニット１２０は、光電変換素子１０９からの出力信号をデジタル信号に変換し、第一走査光学ユニット１０４の走査に同期して処理することにより、標本１１８内の断面１１９上における輝度の二次元分布を示す画像を形成する。形成された輝度画像は、表示装置１２１に表示する。

次に、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂを制御するコントロールユニット１２０の構成について図２を利用して説明する。図２は、コントロールユニット１２０のブロック図である。

前述したように、第一走査光学ユニット１０４は、二つの光学スキャナー１０４ａと１０４ｂを備え、第二走査光学ユニット１１２は、二つの光学スキャナー１１２ａと１１２ｂを備えている。コントロールユニット１２０は、第一走査光学ユニット１０４の光学スキャナー１０４ａと１０４ｂを制御する第一走査光学系駆動ユニット２０５と、第一レーザー制御素子１０２を制御する第一レーザー出力制御ユニット２０３と、第二走査光学ユニット１１２の光学スキャナー１１２ａと１１２ｂを制御する第二走査光学系駆動ユニット２０６と、第二レーザー制御素子１１１を制御する第二レーザー出力制御ユニット２０４と、検出光学系Ｃ内の光電変換素子１０９からの輝度信号をＡ／Ｄ変換して輝度画像して表示装置１２１に出力する画像処理回路２０７と、これらを制御するＣＰＵ２０２と、マンマシンインターフェース２０１とから構成されている。

次に、コントロールユニット１２０の動作について図２と図３を用いて説明する。図３は、本実施形態における第一走査光学系の駆動信号のタイムチャートであり、クロック信号と、ＣＰＵから出力される水平同期信号と垂直同期信号と、第一走査光学系駆動ユニットから出力されるＸ走査波形とＹ走査波形とを示している。

ＣＰＵ２０２内において、一画素に対応する輝度情報を取り込むタイミングを決定するクロック信号が発生される。ＣＰＵ２０２は、クロック信号に基づいて、第一レーザー光源１０１からのレーザー光を標本１１８の断面１１９上の観察範囲で走査するための水平同期信号と垂直同期信号を作り出し、第一走査光学系駆動ユニット２０５に出力する。水平同期信号は主走査方向の走査時間を決定し、垂直同期信号は副走査方向の走査時間を決定する。垂直同期信号の１サイクル分が、二次元走査された画像の一枚分に相当する。ＣＰＵ２０２は、垂直同期信号と共にＹ走査波形を作り出し、光学スキャナー１０４ａに出力するとともに、水平同期信号と共にＸ走査波形を作り出し、光学スキャナー１０４ｂに出力する。ここでは、光学スキャナー１０４ｂが水平方向の主走査を、光学スキャナー１０４ａが垂直方向の副走査を受け持っている。さらにＣＰＵ２０２は、これに同期して、第一レーザー制御素子１０２を駆動するための信号を第一レーザー出力制御ユニット２０３に出力する。光電変換素子１０９からの輝度信号はクロック信号に従ってＣＰＵ２０２に取り込まれて処理される。

第二走査光学ユニット１１２も第一走査光学ユニット１０４と同様に、主走査方向と副走査方向のそれぞれの駆動波形に基づいて光学スキャナー１１２ａと光学スキャナー１１２ｂが駆動される。

次に、本実施形態の走査型レーザー顕微鏡における第一走査光学系と第二走査光学系の同期走査駆動について説明する。

本実施形態では、ＣＰＵ２０２は、第一走査光学系駆動ユニット２０５と第二走査光学系駆動ユニット２０６に対して同一波形で同位相の駆動信号（水平同期信号と垂直同期信号）を与える。これにより第一走査光学系駆動ユニット２０５と第二走査光学系駆動ユニット２０６は、第一走査光学ユニット１０４（光学スキャナー１０４ａと光学スキャナー１０４ｂ）と第二走査光学ユニット１１２（光学スキャナー１１２ａと光学スキャナー１１２ｂ）に同一波形で同位相の駆動信号（Ｙ走査波形とＸ走査波形）を与える。つまり、コントロールユニット１２０は、第一走査光学ユニット１０４と第二走査光学ユニット１１２に同一波形で同位相の駆動信号に基づいて走査駆動する。その結果、標本１１８上における第一レーザー光源１０１からのレーザー光の走査位置と第二レーザー光源１１０からのレーザー光の走査位置とが常に一致する。

また、検出光学系Ｃは、第一走査光学ユニットＡによる走査位置からの光だけを選択的に検出する。

従って、例えば、第二走査光学系Ｂによるレーザー光照射による励起に応じて標本１１８から生じた蛍光も、第一走査光学系Ａによるレーザー光照射による励起に応じて標本１１８から生じた蛍光と一緒に検出光学系Ｃにより検出することができる。

ここでは、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂの両方によりレーザー光照射を行なう例を示したが、第一走査光学系Ａによるレーザー光照射は行なわずに、第二走査光学系Ｂだけによりレーザー光照射を行なってもよい。この場合も、第二走査光学系Ｂによるレーザー光照射による励起に応じて標本１１８から生じた蛍光は、検出光学系Ｃにより検出することができる。

また、第二走査光学系Ｂの第二レーザー光源１１０が、多光子吸収を発生させることが可能な光源、例えばパルスレーザーで構成されてもよい。この場合、標本１１８は合焦面だけから蛍光を発するので、検出光学系Ｃのピンホール１０８は省略されてよい。ピンホールが省略可能であることから、検出光学系に対する第一走査光学系とレーザー光を照射する第二走査光学系の走査位置が厳密に一致しなくても、第二走査光学系による標本照射によって生じる標本からの光を検出器で検出することができる。

さらに、レーザー光照射により標本１１８を励起し、励起により生じた蛍光を検出する例を示したが、レーザー光照射の目的は、これに限定されるものではなく、他の目的、例えば、刺激を与えることであってもよい。これにより刺激に対する標本１１８の反応を測定してもよい。また、検出する光も蛍光に限定されるものではなく、他の光、例えば反射光であってもよい。

本実施形態によれば、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂは、互いの走査位置が常に一致するように、同期させて走査駆動される。このため、第二走査光学系Ｂによるレーザー光照射により生じた蛍光や反射光などの光を、第一走査光学系Ａの一部を介して検出光学系Ｃによって継続的に安定に検出することが可能になる。

これにより、第一走査光学系Ａと検出光学系Ｃを含む既存の一般的な走査型レーザー顕微鏡の装置構成に変更を加えることなく、あとから追加した第二走査光学系による光照射により標本から生じる光を、走査型レーザー顕微鏡に最初から含まれている第一走査光学系Ａと検出光学系Ｃを利用して安定して検出することが可能である。このため、第二走査光学系に構成される光源を観察用の第一走査光学系に置き換えることなく、標本に対して様々な測定を行なうことが可能になる。

［第二実施形態］
本実施形態は、第一走査光学ユニット１０４と第二走査光学ユニット１１２の第一実施形態とは異なる別の駆動に向けられている。

本実施形態の走査型レーザー顕微鏡の構成は第一実施形態と同様である。

本実施形態では、コントロールユニット１２０は、第一走査光学ユニット１０４と第二走査光学ユニット１１２に同一波形で位相が異なる駆動信号に基づいて走査駆動する。より詳しくは、第二走査光学ユニット１１２に与えた駆動信号と同一波形の駆動信号を、第二走査光学ユニット１１２に与えた時刻から一定時間（遅延時間）遅らせて第一走査光学ユニット１０４に与える。これによりコントロールユニット１２０は、第一走査光学系Ａを、第二走査光学系Ｂに対して一定の遅延時間だけ遅らせて走査駆動する。

図４は、本発明の第二実施形態に従って第一走査光学ユニット１０４と第二走査光学ユニット１１２に与えられるＸ走査波形とそれに対応する水平同期信号とを示している。図４から分かるように、第一走査光学ユニット１０４に与えられるＸ走査波形Ａ（これを作り出すための水平同期信号Ａ）は、第二走査光学ユニット１１２に与えられるＸ走査波形Ｂ（これを作り出すための水平同期信号Ｂ）と同一であるが、その位相は一定の遅延時間だけ遅れている。

その結果、図５に示されるように、第一走査光学ユニットＡによる走査位置Ｐ１は、第二走査光学ユニットＢによる走査位置Ｐ２を一定の遅延時間だけ遅れて追いかける。従って、検出光学系Ｃは、第二走査光学ユニットＢによるレーザー光照射から一定の遅延時間経過後に、レーザー光照射により標本１１８から生じた光を検出する。

図６は、図４に示された走査波形を作り出すための信号のタイミングチャートを示している。ＣＰＵ２０２は、クロック信号に基づいて、第一走査光学系駆動ユニット２０５と第二走査光学系駆動ユニット２０６に対して同一波形で同位相の動作開始信号をそれぞれ送出する。第二走査光学系駆動ユニット２０６は、ＣＰＵ２０２からの動作開始信号に位相が一致している第二走査光学系駆動開始信号に従って、駆動信号（Ｘ走査波形とＹ走査波形）を第二走査光学ユニット１１２に送出して走査を開始させる。一方、第一走査光学系駆動ユニット２０５は、動作開始信号に対して位相が一定の遅延時間だけ遅れている第一走査光学系駆動開始信号に従って、駆動信号（Ｘ走査波形とＹ走査波形）を第一走査光学ユニット１０４に送出して走査を開始させる。

ここでは、ＣＰＵ２０２が第一走査光学系駆動ユニット２０５と第二走査光学系駆動ユニット２０６に同一波形で同位相の駆動信号（水平同期信号と垂直同期信号）を与え、第一走査光学系駆動ユニット２０５と第二走査光学系駆動ユニット２０６が駆動信号（Ｘ走査波形とＹ走査波形）を異なるタイミングで出力する例を示したが、制御の手法はこれに限らない。例えば、ＣＰＵ２０２が、第一走査光学系駆動ユニット２０５と第二走査光学系駆動ユニット２０６のそれぞれに対して同一波形だが位相が異なる駆動信号（水平同期信号と垂直同期信号）を与えることによっても同様の制御が可能である。

本実施形態によれば、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂは、第一走査光学系Ａの走査位置が第二走査光学系Ｂの走査位置を一定の遅延時間だけ遅れて追いかけるように、同期させて走査駆動される。このため、例えば、第二走査光学系Ｂによって標本１１８（例えば蛍光標本）を強く励起して標本１１８内の蛍光を褪色させた後に、第一走査光学系Ａによるレーザー光照射による励起に応じて標本１１８から生じた蛍光を、第一走査光学系Ａの一部を介した検出光学系Ｃによって検出することにより、第二走査光学系Ｂに対する第一走査光学系Ａの遅延時間の経過後における蛍光の褪色後回復を測定することができる。

また、第一走査光学系Ａによるレーザー光照射は行なわずに、第二走査光学系Ｂだけによって標本１１８（例えば蛍光標本）にレーザー光を照射して励起することにより、第二走査光学系Ｂによる励起により生じた光を、第二走査光学系Ｂに対する第一走査光学系Ａの遅延時間経過後に検出することができる。この遅延時間経過後の観察から例えば蛍光のライフタイムの測定が可能になる。また、遅延時間をさらに短く設定することにより、蛍光よりも遅れて発生するリン光を測定することも可能になる。

このように本実施形態においても、第一走査光学系Ａと検出光学系Ｃを含む既存の一般的な走査型レーザー顕微鏡の装置構成に変更を加えることなく、あとから追加した第二走査光学系を利用することによって、標本に対して様々な測定を行なうことが可能になる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明の第一実施形態による走査型レーザー顕微鏡の光学系ブロック図である。 図１に示されたコントロールユニットのブロック図である。 本発明の第一実施形態における第一走査光学系の駆動信号のタイムチャートを示している。 本発明の第二実施形態において第一走査光学ユニットと第二走査光学ユニットに与えられるＸ走査波形とそれに対応する水平同期信号とを示している。 本発明の第二実施形態において走査断面上における第一走査光学系による走査位置と第二走査光学系による走査位置の関係を示している。 図４に示された走査波形を作り出すための信号のタイミングチャートを示している。

符号の説明

１０１…第一レーザー光源、１０２…第一レーザー制御素子、１０３…ダイクロイックミラー、１０４…第一走査光学ユニット、１０４ａ…光学スキャナー、１０４ｂ…光学スキャナー、１０５…リレーレンズ、１０６…ミラー、１０７…レンズ、１０８…ピンホール、１０９…光電変換素子、１１０…第二レーザー光源、１１１…第二レーザー制御素子、１１２…第二走査光学ユニット、１１２ａ…光学スキャナー、１１２ｂ…光学スキャナー、１１３…リレーレンズ、１１４…ダイクロイックミラー、１１５…結像レンズ、１１６…対物レンズ、１１７…ステージ、１１８…標本、１１９…断面、１２０…コントロールユニット、１２１…表示装置、２０１…マンマシンインターフェース、２０２…ＣＰＵ、２０３…第一レーザー出力制御ユニット、２０４…第二レーザー出力制御ユニット、２０５…第一走査光学系駆動ユニット、２０６…第二走査光学系駆動ユニット、２０７…画像処理回路。

Claims (12)

1. 標本に光を照射して走査することのできる第一走査光学系と、
   標本に光を照射して走査することのできる第二走査光学系と、
   標本から生じる光を第一走査光学系の一部を介して検出するための検出光学系と、
   第一走査光学系と第二走査光学系を互いに同期させて走査駆動するコントロールユニットとを備えている、走査型レーザー顕微鏡。
2. 請求項１において、コントロールユニットは同一波形の駆動信号に基づいて第一走査光学系と第二走査光学系を走査駆動する、走査型レーザー顕微鏡。
3. 請求項２において、コントロールユニットは同一波形で同位相の駆動信号に基づいて第一走査光学系と第二走査光学系を走査駆動し、第一走査光学系による走査位置と第二走査光学系による走査位置とが常に一致する、走査型レーザー顕微鏡。
4. 請求項２において、コントロールユニットは同一波形で位相が異なる駆動信号に基づいて第一走査光学系と第二走査光学系を走査駆動し、第一走査光学ユニットによる走査位置は第二走査光学ユニットによる走査位置を一定の遅延時間だけ遅れて追いかける、走査型レーザー顕微鏡。
5. 請求項３において、検出光学系が、第一走査光学系と第二走査光学系の焦点面に対して共役な位置関係にあるピンホールを有している、走査型レーザー顕微鏡。
6. 請求項４において、検出光学系が、第一走査光学系と第二走査光学系の焦点面に対して共役な位置関係にあるピンホールを有している、走査型レーザー顕微鏡。
7. 請求項５において、第一走査光学系と第二走査光学系が共に標本に光を照射する、走査型レーザー顕微鏡。
8. 請求項６において、第一走査光学系と第二走査光学系が共に標本に光を照射し、第二走査光学系は標本の蛍光を褪色させ、検出光学系により蛍光の褪色後回復を測定する、走査型レーザー顕微鏡。
9. 請求項３において、第二走査光学系が、多光子吸収を発生させることが可能な光源を有し、第二走査光学系により標本への光照射を行ない、検出光学系により標本からの光を検出する、走査型レーザー顕微鏡。
10. 請求項５において、第二走査光学系により標本へ光を照射し、検出光学系により刺激に対する標本の反応を測定する、走査型レーザー顕微鏡。
11. 請求項６において、第二走査光学系により標本へ光を照射し、検出光学系により蛍光のライフタイムを測定する、走査型レーザー顕微鏡。
12. 請求項６において、第二走査光学系により標本へ光を照射し、検出光学系により蛍光よりも遅れて発生するリン光を測定する、走査型レーザー顕微鏡。

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