JP5771371B2 - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、レーザ光源からの光を所定のＸ方向に走査させるレゾナントガルバノミラーと、前記光源からの光をＺ方向に走査させるピエゾ素子とを備え、レーザ光源からの光を立体試料内にて二次元的に走査させるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。

上記のレーザ走査型顕微鏡は、生体試料等の標本へのダメージ軽減を目的として、速度の小さなピエゾ素子の走査（Ｚ方向の走査）が終了するまで、速度の大きいレゾナントスキャナが走査（Ｘ方向の走査）を繰り返し、その間に得られる信号を積算して、その積算値が所定値を越えるように制御するようになっている。

特開２００１−１０８９０４号公報

しかしながら、上記のレーザ走査型顕微鏡によれば、レーザ光源からの光の強度を低く設定した上で、複数の走査ラインの積算を行って標本画像を生成しているため、標本画像の分解能が低下してしまうという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本へのダメージ軽減を図りつつ、標本画像の分解能を向上することができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、レーザ光を射出するレーザ光源と、少なくとも１つの共振ガルバノミラーを有し、観察画像の生成のために前記レーザ光源からのレーザ光を標本上で走査する第１の走査部と、前記標本の観察深さを変化させるように前記標本に対するレーザ光の光軸方向の焦点位置を変化させる第２の走査部と、前記レーザ光源の射出タイミングと前記第１の走査部および前記第２の走査部の走査タイミングを制御する制御部とを備え、前記制御部が、前記第１の走査部の各ラインの走査毎に有効走査範囲内でオンされる第１の走査部の同期信号により決まる有効タイミングおよび前記第２の走査部により変化させられる観察深さが前記第１の走査部によるレーザ走査を行うべき焦点位置に達する度にオンされる第２の走査部の同期信号により決まる有効タイミングの両方の有効タイミング時に、前記レーザ光源からレーザ光を射出させる制御を繰り返すことで、前記レーザ光の光軸に沿った面内で２次元走査を行うレーザ走査型顕微鏡を採用する。

本発明によれば、レーザ光源からのレーザ光が、少なくとも１つの共振ガルバノミラーを有する第１の走査部により標本上で走査されるとともに、第２の走査部により標本の観察パラメータが変化させられる。この場合において、制御部により、第１の走査部および第２の走査部の両方の有効タイミング時、すなわち画像取得を行うべきタイミング時に、レーザ光源からレーザ光を射出させられる。これにより、各走査部の有効タイミングでない場合に射出されるレーザ光、すなわち標本画像の生成に寄与しないレーザ光を標本に照射することを防止することができ、レーザ光による標本へのダメージを低減することができる。また、従来技術のように複数の走査ラインの積算を行うことなく標本画像を生成でき、標本画像の分解能を向上することができる。ここで、標本の観察パラメータとは、例えば標本の観察位置や観察波長である。第１の走査部は、標本の観察面でレーザ光を走査する共振ガルバノミラーを少なくとも一つ含むが、これと直交する方向に走査するガルバノミラーなどの走査手段を組み合せてＸＹ走査を可能にしたものでもよい。

上記発明において、前記第２の走査部が、前記標本に対するレーザ光の光軸方向の焦点位置を変化させる。
このようにすることで、第１の走査部による走査方向をＸ方向とした場合、第２の走査部により、標本に対するレーザ光の光軸方向（Ｚ方向）の焦点位置を変化させることで、標本の２次元画像（ＸＺ画像）を生成することができる。この場合において、第１の走査部および第２の走査部の両方の有効タイミング時に、レーザ光源からレーザ光を射出させることで、標本画像の生成に寄与しないレーザ光を標本に照射することを防止することができ、レーザ光による標本へのダメージを低減することができる。また、第１の走査部が２次元（ＸＹ）走査可能な構成である場合は、それに合わせて、標本に対する前記レーザ光の光軸方向（Ｚ方向）の焦点位置を変化させることで、標本の３次元画像（ＸＹＺ画像）を生成することができる。この場合において、第１の走査部および第２の走査部の両方の有効タイミング時に、レーザ光源からレーザ光を射出させることで、標本画像の生成に寄与しないレーザ光を標本に照射することを防止することができ、レーザ光による標本へのダメージを低減することができる。

上記発明の参考例において、前記第２の走査部が、レーザ光の光軸に直交する方向に前記標本を相対的に移動させることとしてもよい。
このようにすることで、所望の観察位置が第１の走査部の走査範囲（観察可能範囲）を超えている場合でも、第２の走査部（たとえば標本を載置したＸＹステージ）が標本位置を光軸に対して相対的に移動させることで、所望の観察位置を観察可能になる。

上記発明において、前記レーザ光源が、射出するレーザ光の波長を切り替えることとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光の波長を切り替えて標本に照射し、波長毎の標本画像を生成することができる。この場合において、第１の走査部および第２の走査部の両方の有効タイミング時に、レーザ光源からレーザ光を射出させることができる。これにより、標本画像の生成に寄与しないレーザ光を標本に照射することを防止することができ、レーザ光による標本へのダメージを低減することができる。

上記発明において、前記第２の走査部の有効タイミング中に、少なくとも１つ以上の前記第１の走査部の有効タイミングが含まれることとしてもよい。
このようにすることで、第２の走査部の有効タイミング中に、確実にレーザ光を標本に照射して第１の走査部による走査を行うことができ、標本画像の分解能を向上することができる。

本発明によれば、標本へのダメージ軽減を図りつつ、標本画像の分解能を向上することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。 図１のＺステージを連続的に動作させる場合のタイミングチャートである。 図２の場合において各部により実行される処理を示すフローチャートである。 図１のＺステージを断続的に動作させるとともにレーザ光の波長を切り替える場合のタイミングチャートである。 図４の場合において各部により実行される処理を示すフローチャートである。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光を射出する光源ユニット１０と、試料（標本）Ａを載置するＺステージ２７と、光源ユニット１０からのレーザ光を試料Ａ上で照射するとともに試料Ａからの光を検出する光学ユニット２０と、各部を制御するとともに試料Ａの画像を生成する制御部３０と、試料Ａの画像を表示する表示装置３１と、制御部３０への指示が入力される入力部３２とを備えている。

光源ユニット１０は、レーザ光を射出するレーザ光源１１，１２，１３と、レーザ光源１１，１２，１３からのレーザ光をそれぞれ調光するレーザ調光部１４，１５，１６と、レーザ調光部１４，１５，１６からのレーザ光を合成する光結合器１７とを備えている。

レーザ光源１１，１２，１３は、例えば、試料Ａ中の蛍光物質を励起させて蛍光を発生させる励起光（レーザ光）を射出するようになっており、互いに異なる波長のレーザ光を射出するようになっている。

レーザ調光部１４，１５，１６は、例えば音響光学素子や電気光学素子であり、制御部３０からの信号（レーザ光出射タイミング信号）に基づいて、レーザ光源１１，１２，１３からのレーザ光をそれぞれ変調またはＯＮ／ＯＦＦさせるようになっている。

光結合器１７は、例えばダイクロイックミラーであり、レーザ光源１１からのレーザ光を透過する一方、レーザ光源１２，１３からのレーザ光を反射することで、レーザ光源１１，１２，１３からのレーザ光を同軸に合成するようになっている。

なお、上記のダイクロイックミラーは、レーザ光源１１，１２からのレーザ光を透過する一方、レーザ光源１３からのレーザ光を反射することで、レーザ光源１１，１２，１３からのレーザ光を同軸に合成することとしてもよい。
あるいは、光結合器１７は、２つのダイクロイックミラーを有し、第１のダイクロイックミラーが、レーザ光源１１からのレーザ光を透過する一方、レーザ光源１２からのレーザ光を反射し、第２のダイクロイックミラーが、第１のダイクロイックミラーからのレーザ光を透過する一方、レーザ光源１３からのレーザ光を反射することとしてもよい。

光学ユニット２０は、光結合器１７からのレーザ光を試料Ａ上で走査するＸＹスキャナ（第１の走査部）２２と、ＸＹスキャナ２２により走査されたレーザ光を試料Ａに集光するとともに試料Ａからの光を集める対物レンズ（図示略）と、光結合器１７からのレーザ光と試料Ａからの光とを分光する分光部２１と、分光部２１により分光された試料Ａからの光を検出する検出部２５とを備えている。

ＸＹスキャナ２２は、光結合器１７からのレーザ光を試料Ａ上でＸ方向（試料Ａ上の一方向）に走査するＸガルバノミラー２３と、光結合器１７からのレーザ光を試料Ａ上でＹ方向（試料Ａ上においてＸ方向に直交する方向）に走査するＹガルバノミラー２４とを備えている。

Ｘガルバノミラー２３は、例えばレゾナントガルバノミラー等の共振ガルバノミラーであり、光結合器１７からのレーザ光を、試料Ａ上でＸ方向に高速かつ連続で走査するようになっている。
Ｙガルバノミラー２４は、通常のガルバノミラーであり、光結合器１７からのレーザ光を、試料Ａ上でＹ方向に走査するようになっている。

ＸＹスキャナ２２は、上記のＸガルバノミラー２３およびＹガルバノミラー２４を協調して動作させることにより、光結合器１７により合成されたレーザ光を試料Ａ上で二次元走査するようになっている。
また、Ｘガルバノミラー２３のＸ駆動タイミング信号は制御部３０に出力されるようになっている。

Ｚステージ（第２の走査部）２７は、制御部３０からの信号（Ｚ駆動信号）に基づいて、試料Ａを載置した状態でＺ方向（Ｘ方向およびＹ方向に直交する方向）に移動するようになっている。これにより、Ｚステージ２７をＺ方向に移動させることで、試料Ａ中における対物レンズの焦点位置をＺ方向に変化させるようになっている。

入力部３２は、例えばキーボード、マウス、タッチパネル画面等の入力装置であり、試料Ａの観察位置や使用するレーザ光をユーザが選択することで、その選択情報を制御部３０に入力するようになっている。

制御部３０は、検出部２５により検出された試料Ａからの光と、ＸＹスキャナ２２の試料Ａ上の走査位置と、Ｚステージ２７の位置とに基づいて、試料Ａの３次元画像を生成するようになっている。
また、制御部３０は、レーザ光源１１，１２，１３の射出タイミング、ＸＹスキャナ２２の走査タイミング、およびＺステージ２７の駆動タイミングを制御するようになっている。

具体的には、図２のタイミングチャートに示すように、Ｘガルバノミラー２３の正方向の走査時には、Ｘ駆動タイミング信号がＯＮにされる。また、Ｘガルバノミラー２３の走査範囲（Ｘ走査範囲）において、画像の生成に使用される有効走査範囲内には、水平同期信号がＯＮにされる。Ｚ駆動信号はＺステージ２７の駆動中にはＯＮにされており、観察したい深さに焦点位置が達した場合にＺ同期信号がＯＮにされる。そして、Ｘ駆動タイミング信号、水平同期信号、Ｚ同期信号の全てがＯＮとなっている状態において、レーザ光を射出させるレーザ光出射タイミング信号がＯＮにされる。

上記のような信号処理を行い、各部を制御することで、制御部３０は、ＸＹスキャナ２２およびＺステージ２７の両方の有効タイミング時に、レーザ光源１１，１２，１３からレーザ光を射出させるようになっている。ここで、ＸＹスキャナ２２およびＺステージ２７の両方の有効タイミング時とは、水平同期信号およびＺ同期信号がＯＮとなるタイミング、すなわち画像取得を行うべきタイミングである。

上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡１の作用について説明する。
まず、Ｚステージ２７を連続的に動作（定速移動）させる場合について、図２のタイミングチャートおよび図３のフローチャートに従って以下に説明する。ここでは、試料Ａに単一のレーザ光を照射することとする。この場合、制御部３０からのレーザ光出射タイミング信号に基づいて、レーザ光源１１，１２，１３の全てからレーザ光を射出させて合成光を試料Ａに照射してもよく、レーザ光源１１，１２，１３の少なくとも１つからレーザ光を照射させて試料Ａに照射してもよい。

まず、試料Ａの観察したい深さの間隔（観察深さ間隔）と、Ｘガルバノミラー２３による走査時間（Ｘ走査時間）から、Ｚステージ２７の移動速度（Ｚ速度）を設定する（ステップＳ１）。ここでは、Ｘ走査時間に観察タイミングを合わせるためにＺ速度を決定する。これにより、設定された観察深さで試料Ａを観察することができる。

次に、Ｘガルバノミラー２３からのＸ駆動タイミング信号に合わせて、Ｚ駆動信号を出力し、Ｚステージ２７の駆動を開始する（ステップＳ２）。
次に、設定された観察深さとなったか否かが、設定されたＺ速度と時間（観察深さ時間）により判断される（ステップＳ３）。
なお、この際、観察深さに対応したパルス信号やフィードバッグ信号により、設定された観察深さとなったことを判断することとしてもよい。

ステップＳ３において、観察深さとなった場合には、Ｚ同期信号がＯＮにされる（ステップＳ４）。
次に、Ｘ駆動タイミング信号がＯＮかつＺ同期信号がＯＮの状態で、水平同期信号がＯＮになるタイミングに合わせて、レーザ光出射タイミング信号をＯＮにし、レーザ調光部１４，１５，１６を作動させて、光源ユニット１０からレーザ光を出射させる（ステップＳ５）。

また、水平同期信号がＯＦＦになるタイミングに合わせて、レーザ光出射タイミング信号をＯＦＦにして、光源ユニット１０からのレーザ光の出射を停止させる（ステップＳ６）。

次に、観察深さの範囲を過ぎた場合には、Ｚ同期信号がＯＦＦにされる（ステップＳ７）。
次に、全ての観察深さへの観察が終了したか否かが判断され（ステップＳ８）、終了していない場合にはステップＳ３〜Ｓ８までの処理が繰り返され、終了した場合にはＺステージ２７の駆動が停止される（ステップＳ９）。

以下に、Ｚステージ２７を観察深さ毎に停止（間欠移動）させるとともに、使用するレーザ光を切り替える場合について、図４のタイミングチャートおよび図５のフローチャートに従って説明する。この場合には、制御部３０からのレーザ光出射タイミング信号に基づいて、レーザ光源１１，１２，１３のいずれか１つからレーザ光を射出させて試料Ａに照射する。

まず、試料ＡのＺ方向の観察位置と使用するレーザ光を設定する（ステップＳ１１）。
次に、Ｚステージ２７を駆動させて設定した観察位置に試料Ａを移動する（ステップＳ１２）。

次に、Ｘガルバノミラー２３からのＸ駆動タイミング信号に合わせて、Ｚ同期信号がＯＮにされる（ステップＳ１３）。
次に、水平同期信号がＯＮになるタイミングに合わせて、レーザ光出射タイミング信号がＯＮにされ、レーザ光を試料Ａに照射する（ステップＳ１４）。この際、セレクタ信号を切り替えることで、そのセレクタ信号に対応するレーザ光が試料Ａに照射される。具体的には、図４に示す例において、セレクタ信号１をＯＮにすることで、水平同期信号がＯＮになるタイミングでレーザ光出射タイミング信号１がＯＮにされ、レーザ光源１１からのレーザ光を試料Ａに照射する。また、セレクタ信号１をＯＦＦにしてセレクタ信号２をＯＮにすることで、水平同期信号がＯＮになるタイミングでレーザ光出射タイミング信号２がＯＮにされ、レーザ光源１２からのレーザ光を試料Ａに照射する。

次に、水平同期信号がＯＦＦになるタイミングに合わせて、レーザ光を遮断して試料Ａへの照射を停止する（ステップＳ１５）。
次に、別のレーザ光を使用するか否かの判断が行われ（ステップＳ１６）、別のレーザ光を使用しない場合にはＺ同期信号がＯＦＦにされる（ステップＳ１７）。
一方、別のレーザ光を使用する場合にはレーザ光を切り替えてステップＳ１４〜Ｓ１５の処理が繰り返される。具体的には、図４に示すように、セレクタ信号１，２をＯＮ／ＯＦＦさせることで、水平同期信号がＯＮになるタイミングでレーザ光出射タイミング信号１，２，３が順次ＯＮにされ、各レーザ光源からのレーザ光が順次射出される。

次に、全ての観察位置への観察が終了したか否かが判断され（ステップＳ１８）、終了していない場合にはステップＳ１２〜Ｓ１８までの処理が繰り返され、終了した場合には試料Ａの観察を終了する（ステップＳ１９）。

以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、光源ユニット１０からのレーザ光が、ＸＹスキャナ２２により試料Ａ上で走査されるとともに、Ｚステージ２７により試料Ａの観察パラメータが変化させられる。ここで、観察パラメータは、選択されたレーザ光の波長に応じて設定される観察波長や、Ｚステージ２７の移動により規定される光軸方向の観察位置や、ＸＹスキャナ２２の走査位置によって規定される光軸に直交する方向の観察位置である。

この場合において、制御部３０により、ＸＹスキャナ２２およびＺステージ２７の両方の有効タイミング時に、光源ユニット１０からレーザ光を射出させられる。ここで、ＸＹスキャナ２２およびＺステージ２７の両方の有効タイミング時とは、前述のように、水平同期信号およびＺ同期信号がＯＮとなるタイミング、すなわち画像取得を行うべきタイミングである。これにより、ＸＹスキャナ２２およびＺステージ２７の有効タイミングでない場合に射出されるレーザ光、すなわち試料Ａの画像の生成に寄与しないレーザ光を試料Ａに照射することを防止することができ、レーザ光による試料Ａへのダメージを低減することができる。また、従来技術のように複数の走査ラインの積算を行うことなく試料Ａの画像を生成でき、試料Ａの画像の分解能を向上することができる。

また、Ｚステージ２７が、試料Ａに対するレーザ光の光軸方向の焦点位置を変化させることで、試料Ａの２次元画像（ＸＺ画像）を生成することができる。また、ＸＹスキャナ２２により試料Ａの２次元走査を行うことで、試料Ａの２次元画像（ＸＹ画像）を生成することができる。また、ＸＹスキャナ２２による２次元走査と合わせて、Ｚステージ２７を動作させることで、試料Ａの３次元画像（ＸＹＺ画像）を生成することができる。
また、光源ユニット１０によりレーザ光の波長を切り替えて試料Ａに照射することで、波長毎の試料Ａの画像を生成することができる。

また、第２の走査部として、Ｚステージ２７に代えて、試料Ａをレーザ光の光軸に直交する方向、すなわちＸＹ方向に移動させるＸＹステージを採用することとしてもよい。
この場合には、観察したい場所がＸＹスキャナ２２の走査範囲外にある場合に、観察場所へＸＹステージを移動して、ＸＹステージの停止後にＸ駆動タイミング信号に合わせてＸＹ同期信号をＯＮし、水平同期信号のＯＮに合わせてレーザ光をＯＮする。そして、水平同期信号のＯＦＦに合わせてレーザ光およびＸＹ同期信号をＯＦＦし、次の観察場所へ移動する。上記動作を必要な観察場所分繰り返すことで、試料Ａの２次元画像（ＸＹ画像）を生成することができる。また、上記のＸＹステージに加えて、本実施形態のＺステージ２７を備えることで、試料Ａの３次元画像（ＸＹＺ画像）を生成することができる。

また、Ｚステージ２７の有効タイミング中に、少なくとも１つ以上のＸＹスキャナ２２の有効タイミングが含まれるようにすることで、Ｚステージ２７の有効タイミング中に、確実にレーザ光を試料Ａに照射してＸＹスキャナ２２による走査を行うことができ、試料Ａ画像の分解能を向上することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、３つのレーザ光源を備える例を説明したが、２つまたは４つ以上のレーザ光源を備えることとしてもよい。また、波長可変な１つのレーザ光源を備えることとしてもよい。

また、本実施形態において、レーザ調光部１４，１５，１６に代えて、レーザ光源１１，１２，１３に、それぞれレーザ光のＯＮ／ＯＦＦや波長を切り替える機能を持たせることとしてもよい。

Ａ 試料（標本）
１ レーザ走査型顕微鏡
１０ 光源ユニット
１１，１２，１３ レーザ光源
１４，１５，１６ レーザ調光部
１７ 光結合器
２０ 光学ユニット
２１ 分光部
２２ ＸＹスキャナ（第１の走査部）
２３ Ｘガルバノミラー
２４ Ｙガルバノミラー
２５ 検出部
２７ Ｚステージ（第２の走査部）
３０ 制御部
３１ 表示装置
３２ 入力部

Claims (5)

1. レーザ光を射出するレーザ光源と、
   少なくとも１つの共振ガルバノミラーを有し、観察画像の生成のために前記レーザ光源からのレーザ光を標本上で走査する第１の走査部と、
   前記標本の観察深さを変化させるように前記標本に対するレーザ光の光軸方向の焦点位置を変化させる第２の走査部と、
   前記レーザ光源の射出タイミングと前記第１の走査部および前記第２の走査部の走査タイミングを制御する制御部とを備え、
   前記制御部が、前記第１の走査部の各ラインの走査毎に有効走査範囲内でオンされる第１の走査部の同期信号により決まる有効タイミングおよび前記第２の走査部により変化させられる観察深さが前記第１の走査部によるレーザ走査を行うべき焦点位置に達する度にオンされる第２の走査部の同期信号により決まる有効タイミングの両方の有効タイミング時に、前記レーザ光源からレーザ光を射出させる制御を繰り返すことで、前記レーザ光の光軸に沿った面内で２次元走査を行うレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記レーザ光源が、射出するレーザ光の波長を切り替える請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記第２の走査部の有効タイミング中に、少なくとも１つ以上の前記第１の走査部の有効タイミングが含まれる請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 前記第２の走査部の有効タイミングは、前記レーザ光の光軸方向の焦点位置の移動を開始してからの時間により決定される、請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
5. 前記第２の走査部の有効タイミングは、観察深さに対応したパルス信号やフィードバック信号により決定される、請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。

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