JP4694137B2 - 走査型レーザ顕微鏡、該制御方法、及び該制御プログラム - Google Patents

Description

本発明は、標本面上をレーザ光で走査したときの標本からの透過光や反射光あるいは標本に発生する蛍光を検出する走査型レーザ顕微鏡、顕微鏡制御方法、及び顕微鏡制御プログラムに関する。

走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を走査光学系及び対物レンズを介して標本のＸ軸及びＹ軸方向に走査しながら照射し、標本からの透過光や反射光又は標本に発生する蛍光を再び対物レンズ及び走査光学系を介して検出器で検出して透過光や反射光または蛍光の２次元の輝度情報を得る顕微鏡である。

また、この輝度情報をＸ−Ｙ走査位置に対応させてディスプレイなどに輝度の２次元分布として表示することによって、標本の蛍光像、透過像あるいは反射像を観察することも可能である。
このレーザ走査型顕微鏡のうち共焦点走査型レーザ顕微鏡は、検出光学系の標本と共役な位置に、被測定光の回折限界程度の径を有した絞りを設けることにより、焦点が合っている面の情報のみを検出するものである。

特許文献１では、標本画像を観察・記録しながら標本の所望の位置にレーザ光を照射し、標本の動的特性などを調査するために、第１の走査光学系とは別に、第２のレーザ光源から出力されたコヒーレント光を第２の走査光学系により標本上の任意の位置に照射し、かつ第１のレーザ光源から出力されたコヒーレント光を第１の走査光学系１により標本上で走査させ、その蛍光を光電変換素子によって計測する走査型レーザ顕微鏡が開示されている。

一般に、共焦点走査型レーザ顕微鏡では、合焦面の情報だけを検出できるため、標本を傷付けることなく、光学的な断層像、すなわち３次元情報を得ることができ、しかも、非合焦面の情報を排除することによって、非常にシャープな画像が得られる特徴を有している。

このような共焦点走査型レーザ顕微鏡を用いて、例えば、イオン感受性の蛍光指示薬を標本に導入し、レーザ光で標本を走査して標本から発せられる蛍光の輝度分布から、標本内の特定のイオン濃度分布およびその経時変化を測定する。
この測定では、カルシウムイオンなどのイオン濃度に感受性を有する蛍光指示薬を導入した標本を、その蛍光指示薬を励起する波長のレーザ光で照射することにより、その指示薬特有の波長の蛍光が発せられる。

この蛍光の輝度とイオン濃度との間には一定の相関が成り立つため、蛍光の輝度分布およびその経時変化を測定することにより、標本内のイオン濃度分布とその経時変化を測定できる。
さらに、最近では、標本内の特定部位にイオン物質を出現させることができるケージド試薬が考案されている。このケージド試薬は、殻となるケージド基の中に、カルシウムイオンなどのイオン物質を包含させたものである。ケージド試薬を標本内に抽入したのち、紫外線を照射することによってケージド基が開裂するため、所望の特定部位にイオン物質を出現させることができる。

これらの蛍光指示薬とケージド試薬とを標本内に導入し、特定部位のケージド試薬を開裂させ、以降の蛍光指示薬からの蛍光を観察する装置が特許文献２に開示されている。この装置では、１つの走査手段に蛍光指示薬を励起するための第１のレーザ光源と、ケージド試薬を開裂させるための第２のレーザ光源を設置し、第１のレーザで標本を走査して蛍光指示薬によるイオン濃度分布を観察しながら、所望の位置において、第２のレーザを照射することによってケージド試薬を開裂させることができるものである。

また、各種研究所等では、走査型レーザ顕微鏡を使用したＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）の実験が行われている。走査型レーザ顕微鏡を使用したＦＲＡＰの実験では、まずフォトブリーチ実行前の標本画像を取得し、続いてフォトブリーチを実行し、そしてフォトブリーチ終了後及び蛍光復帰の間の標本画像を取得する等の手順で実験が行われる。

ここで、走査型レーザ顕微鏡を２つの走査光学系を有する構成にした場合、標本画像を取得するための第１のレーザ光源と、フォトブリーチを実行するための第２のレーザ光源を設置し、第２のレーザ光を照射しフォトブリーチしながら第１のレーザ光で標本を走査してフォトブリーチ終了後及び蛍光復帰を観察できる。

このとき、フォトブリーチ実行中に標本へ照射する第２のレーザ光の強度は、フォトブリーチ実行前後の画像取得時に標本へ照射する第１のレーザ光の強度よりも遥かに大きい。
上記のように、標本内の特定のイオン濃度分布およびその経時変化の測定やＦＲＡＰの実験では、第１の走査光学系の走査領域と第２の走査光学系の走査領域を異なるサイズにし、２つの領域が重なり合うようにして、非同期に走査することが可能である。
特開平１０−２０６７４２号公報 特開２０００−２７５５２９号公報

しかしながら、例えばＦＲＡＰの実験で、フォトブリーチ実行中に画像取得を行うために、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を非同期で実施しようとすると、第１の走査光学系からのレーザ光と第２の走査光学系からのレーザ光が走査領域内の一部で重なってしまい、その領域の蛍光物質の褪色が早まったり、または、第２の走査光学系からの光が第１の走査光学系に混入し、混入した領域の輝度値が飽和した走査画像が得られてしまうという問題が発生する可能性がある。

また、標本内の特定のイオン濃度分布およびその経時変化の測定する場合も、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を非同期で実施しようとすると、第１の走査光学系からのレーザ光と第２の走査光学系からのレーザ光が走査領域内の一部で重なってしまい、その領域のケージド試薬を開裂状態が他の領域の開裂状態と異なってしまうという問題が発生する可能性がある。

上記の課題に鑑み、本発明では、複数の走査光学系を使用し、各走査光学系の走査領域が重なり合うような場合でも、各走査光学系からのレーザ光が同時に同じ領域を照射しないようにすることが可能な走査型レーザ光顕微鏡、顕微鏡制御方法、及び顕微鏡制御プログラムを提供する。

本発明に係る走査型レーザ顕微鏡は、複数の走査光学系と、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査と、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査とが重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、該第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段とを備えることを特徴とする。

本発明に係る走査型レーザ顕微鏡は、標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、前記標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、前記第１の走査光学系の走査と前記第２の走査光学系の走査とが重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、前記第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段とを備えることを特徴とする。

本発明に係る、複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡を制御する走査型レーザ顕微鏡制御方法は、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査と、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査とが重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、該第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うことを特徴とする。

本発明に係る、複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡の制御をコンピュータに実行させるための走査型レーザ顕微鏡制御プログラムは、前記複数の走査光学系に走査を行わせる処理と、前記複数の走査光学系を制御して、当該複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査と、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査が重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、該第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する処理を、コンピュータに実行させることを特徴とする。

本発明に係る走査型レーザ顕微鏡は、複数の走査光学系と、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で当該第１走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段と、前記複数の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記第１の走査光学系の走査の帰線区間で、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査と該第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させる制御を行う交差制御手段と、を備え、前記交差制御手段は、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと前記第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを、異ならせることを特徴とする。

本発明に係る走査型レーザ顕微鏡は、標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、前記標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、前記第２の走査光学系の走査の帰線区間で当該第２走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段と、前記第１および第２の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記第２の走査光学系の走査の帰線区間で、該第２の走査光学系の走査と前記第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させる制御を行う交差制御手段と、を備え、前記交差制御手段は、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと前記第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを、異ならせることを特徴とする。

本発明に係る、複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡を制御する走査型レーザ顕微鏡制御方法は、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で当該第１走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御と、前記複数の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査と該第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させるように、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと該第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを異ならせる制御を行うことを特徴とする。

本発明に係る、複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡の制御をコンピュータに実行させるための走査型レーザ顕微鏡制御プログラムは、前記複数の走査光学系に走査を行わせる処理と、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で当該第１走査光学系のレーザ光の照射を停止する処理と、前記複数の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記複数の走査光学系を制御して、当該複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査と該第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させるように、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと該第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを異ならせる処理を、コンピュータに実行させることを特徴とする。

前記走査型レーザ顕微鏡において、前記第１の走査光学系は、レーザ光をＸ方向にライン走査するＸスキャナと該Ｘラインの位置をＹ方向に走査するＹスキャナを備え、前記レーザ光照射制御手段は、前記第１の走査光学系のＸスキャナが前記重なる領域を含むＸラインの走査を行なうときに前記第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うことを特徴とする。

以上発明したように本発明の請求項１〜４によれば、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査が重なる個所で、第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止するのみで、容易に各走査光学系の間のレーザ光の影響を排除できる走査型レーザ光顕微鏡、顕微鏡制御方法、および顕微鏡制御プログラムを提供できる。

また、本発明の請求項１〜４によれば、ハードウェアは従来のものを変更せずに、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査が重なる個所で、第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止するように制御を変更するだけで、容易に本発明を導入することができる。

また、本発明の請求項５〜９によれば、第２の走査光学系の帰線区間で２つの走査光学系の走査を交差するようにするのみで、容易に各走査光学系の間のレーザ光の影響を排除することができる。
また、本発明の請求項５〜９によれば、ハードウェアは従来のものを変更せずに、第２の走査光学系の帰線区間で２つの走査光学系の走査を交差するように制御を変更するだけで、容易に本発明を導入することができる。

＜第１の実施形態＞
本実施形態では、走査型レーザ顕微鏡を用いて、標本内の特定のイオン濃度分布およびその経時変化を測定する例を説明する。
図１は、本実施形態における走査型レーザ顕微鏡のブロック図である。

走査型レーザ顕微鏡は、第１のレーザ光源１からのレーザ光を標本１７の焦点面上を走査する観察用の第１の走査光学系Ａと、第２のレーザ光源１０から出力されるレーザ光を標本の任意の位置に照射してケージド試薬を開裂させるための第２の走査光学系Ｂとを備えている。第２の走査光学系Ｂは標本の特定部位に特異現象を発現させる光学系である。

第１の走査光学系Ａは、第１のレーザ光源１、ダイクロイックミラー２、第１の走査光学ユニット３、リレーレンズ４及びミラー５から構成される。更に第１の走査光学系Ａのダイクロイックミラー２の分岐光路上には、検出光学系Ｃが配置されている。この検出光学系Ｃは、測光フィルタ６、レンズ７、共焦点ピンホール８及び光電変換素子９により構成される。

第２の走査光学系Ｂは、第２のレーザ光源１０、ＣＰＵ２２と接続しているレーザ制御素子２７、第２の走査光学ユニット１１、リレーレンズ１２及びダイクロイックミラー１３から構成される。なお、レーザ制御素子２７としては、ＮＤフィルタ（光量調整フィルタ）、ＡＯＴＦ(音響光学素子)やレーザシャッタ等が使用できる。

第１の走査光学系Ａの光軸と、第２の走査光学系Ｂの光軸とは、ダイクロイックミラー１３により合成され、結像レンズ１４、対物レンズ１５に導かれる。また、リレーレンズ４およびリレーレンズ１２の焦点位置は、結像レンズ１４の焦点位置と一致するように配置されている。標本１７はステージ１８上に載置されている。

ダイクロイックミラー１３は、第１の走査光学系Ａからのレーザ光の波長より長波長の光を透過すると共に、第２の走査光学系Ｂからのレーザ光の波長を反射する特性となっている。
第１の光学走査ユニット３は、第１の走査波形発生回路２０に接続されている。第２の光学走査ユニット１１は、第２の走査波形発生回路２１に接続されている。光電変換素子９は、Ａ／Ｄ変換器１９に接続されている。そして、第１の走査波形発生回路２０、第２の走査波形発生回路２１、及びＡ／Ｄ変換器１９は、ＣＰＵ（中央処理装置）２２と接続している。さらに、ＣＰＵ２２はメモリ２３に接続され、フレームメモリ２５を介してディスプレイ２６とも接続されている。

ＣＰＵ２２は、各所に制御命令を出すもので、例えば、第１及び第２の走査光学ユニット３、１１の光学スキャナ３ａ、３ｂ及び１１ａ、１１ｂを操作制御する第１及び第２の走査波形発生回路２０、２１に対し、第１及び第２のレーザ光源１、１０からのレーザ光が所望の領域を走査するような走査波形を指示して走査を開始させたり、Ａ／Ｄ変換器１９からのデジタルデータを画像化するなどをしている。また、後述する第２の走査光学系Ｂのレーザ制御素子２７の制御もしている。

メモリ２３は、Ａ／Ｄ変換器１９からのデジタルデータや、ＣＰＵ２２で形成される走査画像などを記憶している。ディスプレイ２６は、ＣＰＵ２２で形成されメモリ２３に記憶している走査画像をフレームメモリ２５を介して表示する。
ここで、ＣＰＵ２２、メモリ２３、フレームメモリ２５等は一般的なパーソナルコンピュータ等を利用してもよい。また、後述する制御方法はコンピュータプログラムにより処理可能で、その処理プログラムはＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体やハードディスク等の記憶装置２４に記録されている。また、通信ネットワーク経由で処理プログラムを読み出すようにしてもよい。

必要に応じて前記パーソナルコンピュータのメモリ２３上に前記処理プログラムを読み出し、ＣＰＵ２２により実行しパーソナルコンピュータに接続されている各装置を制御している。
次に、このように構成した走査型レーザ顕微鏡の作用を説明する。第１のレーザ光源１からのレーザ光は、第１の走査波形発生回路２０により走査制御される第１の走査光学ユニット３へ導かれ、任意の方向に偏向走査される。このレーザ光はさらに、リレーレンズ４、ミラー５、ダイクロイックミラー１３、結像レンズ１４、対物レンズ１５を介して、標本１７の断面１６上に集光され、断面１６内を２次元走査する。

標本１７には第１のレーザ光源１の波長によって励起される蛍光指示薬が導入されており、断面１６内をレーザ光が走査することにより、蛍光指示薬が励起されて蛍光を生じる。対物レンズ１５により捕らえられた蛍光は、上記レーザ光と同じ光路を逆向きに進み、対物レンズ１５、結像レンズ１４、ダイクロイックミラー１３を透過し、ミラー５、リレーレンズ４、第１の走査光学ユニット３を介してダイクロイックミラー２へ導かれる。

ダイクロイックミラー２は、第１のレーザ光源１からのレーザ光の波長より長波長側の光を反射する特性となっており、これにより上記蛍光はダイクロイックミラー２により反射され、検出光学系Ｃへ導入される。
検出光学系Ｃにおいて、蛍光は測光フィルタ６により特定の波長の光が選択透過され、さらにレンズ７、共焦点ピンホール８により断面１６からの光のみが選択されて、光電変換素子９へ入射する。
光電変換素子９からの出力信号は、Ａ／Ｄ変換器１９へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、ＣＰＵ２２により、フレームメモリ２５を介して、走査位置に対応してディスプレイ２６上に表示される。表示された画像は、断面１６での蛍光画像（蛍光輝度の２次元分布）、すなわち所望のイオン濃度の断面１６内での分布を示している。

一方、第２のレーザ光源１０からのレーザ光は、ＣＰＵ２２により制御されるレーザ制御素子２７によりレーザ強度等が調整され、第２の走査光学ユニット１１、リレーレンズ１２、ダイクロイックミラー１３を介して第１の走査光学系Ａからの光軸と合成される。そして、結像レンズ１４、対物レンズ１５を透過して、標本１７の断面１６上に照射される。この時の断面１６内での照射位置は、ＣＰＵ２２により第２の走査光学ユニット１１を制御することで第１の走査光学系Ａの走査位置に依存しない任意の位置を選択することができる。

このように第２のレーザ光源１０からのレーザ光が、ケージド試薬を導入した標本１７に照射されると、照射された部位のケージド試薬のケージド基が開裂し、内部に包含されている物質が放出される。この放出による標本１７内の上記イオン濃度分布の変化を、上記第１の走査光学系Ａにより得られる画像により測定できる。

次に、第１の走査光学系Ａの標本１７への走査と、第２の走査光学系Ｂからの標本１７へのレーザ光の照射の制御について説明する。図１にも示すように、第１及び第２の走査光学ユニット３及び１１は、２つの光学スキャナ３ａ、３ｂ及び１１ａ、１１ｂを備えている。

ＣＰＵ２２は、第１の走査光学ユニット３の光学スキャナ３ａ、３ｂを走査制御する第１の走査波形発生回路２０と、第２の走査光学ユニット１１内の光学スキャナ１１ａ，１１ｂを走査制御する第２の走査波形発生回路２１に接続している。
ＣＰＵ２２は蛍光画像を得るため、第１の走査波形発生回路２０に対して目的とする断面１６内の目的とする範囲を第１のレーザ光源１からのレーザ光が走査するような走査波形を指示して走査制御を開始する。また、これと共に、ケージド試薬を開裂させる所望の領域を第２のレーザ光源１０からのレーザ光が走査するように第２の走査波形発生回路２１に対して走査波形を指示する。

図２は、本実施形態における走査波形と走査の関係を示す。同図において、３４は第１の走査光学系の走査領域を示しており、この第１の走査光学系の走査領域３４の水平方向をＸ１、垂直方向をＹ１で表す。また、走査波形３０はＸ１方向の走査波形（１波形の長さをＬｘ１で表す）を示しており、走査波形３１はＹ１方向の走査波形（１波形の長さをＬｙ１で表す）で示している。

また、３５は第２の走査光学系の走査領域を示しており、この第２の走査光学系の走査領域３５の水平方向をＸ２、垂直方向をＹ２で表す。また、走査波形３２はＸ２方向の走査波形（１波形の長さをＬｘ２で表す）を示しており、走査波形３３はＹ２方向の走査波形（１波形の長さをＬｙ２で表す）で示している。

また、第１の走査光学系のピクセルクロックをＣ１、第２の走査光学系のピクセルクロックをＣ２で表す。３６は第２の走査光学系の走査開始位置（ｘｏ２，ｙｏ２）を示している。
さて、ＣＰＵ２２により走査開始が指示された第１の走査波形発生回路２０は、第１の走査光学ユニット３内の２つの光学スキャナ３ａ、３ｂに対し、ＣＰＵ２２により指示された走査波形３０，３１をそれぞれ出力する。なお、ここでは光学スキャナ３ａが水平方向の主走査を、光学スキャナ３ｂが垂直方向の副走査を行うものである。

これによりレーザ光が断面１６内で２次元走査を始める。第１の走査波形発生回路２０は走査波形３０，３１の出力を始めると、Ａ／Ｄ変換器１９に対して、図示しない各種同期信号（クロック信号、垂直同期信号、水平同期信号）を出力する。Ａ／Ｄ変換器１９はこれらの各種同期信号のうち、各画素ごとに発生するクロック信号（図２に示す第１の走査光学系のピクセルクロックＣ１）により光電変換素子９から出力される蛍光輝度信号をＡ／Ｄ変換する。

そして、ＣＰＵ２２において、Ａ／Ｄ変換器１９より得られたデジタルデータと、垂直同期信号と、水平同期信号とからメモリ２３上に画像を形成して、フレームメモリ２５を介してディスプレイ２６上に表示する。この場合、垂直同期信号の１サイクル分が１枚の画像となる。

このようにして得られた画像は、ケージド試薬が開裂する前における標本１７内のイオン濃度分布の初期状態を示す画像となる。かかる画像を１枚ないし複数枚測定した後、ＣＰＵ２２は、第１の走査波形発生回路２０に対して走査開始を指示し、画像の取得を開始する。続いて、ＣＰＵ２２は、所望のタイミングでレーザ制御素子２７にレーザ強度等を指示すると共に、第２の走査波形発生回路２１に走査開始を指示する。

ＣＰＵ２２により走査開始が指示された第２の走査波形発生回路２１は、第２の走査光学ユニット１１内の２つの光学スキャナ１１ａ、１１ｂに対し、ＣＰＵ２２により指示された走査波形３２、３３をそれぞれ出力する。なお、ここでは光学スキャナ１１ａが水平方向の主走査を、光学スキャナ１１ｂが垂直方向の副走査を行うものである。

第２の走査光学系Ｂからのレーザ光を標本１７に照射するとケージド試薬が開裂し、これ以降に第１の走査光学系Ａの走査から得られる走査画像は、ケージド試薬が開裂したことによる標本内の変化を示すものとなる。
このとき、第１の走査光学系Ａの走査と第２の走査光学系Ｂの走査が重なる領域では、レーザ制御素子２７によりレーザ強度等を調整して、レーザ光を同じ領域に同時に照射しないようにする。通常、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を非同期で開始すると、走査領域内のある領域でレーザ光が同時に照射される可能性がある。本発明では、各走査光学系の走査が重なる領域を、第１の走査光学系が走査している間、第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止するようにする。

ここで、図２のような走査波形を用いて走査をする場合を例にして、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査が重なる領域のレーザ光の照射制御について、図３を用いて説明する。図３は、１枚の画像を取得する場合の流れであり、複数枚の画像を取得する場合はこの流れを繰り返す。

まず、走査領域３４に対する第１の走査光学系の走査を開始する（Ｓ３１）。続いて、所望のタイミングで走査領域３５に対する第２の走査光学系の走査を開始する（Ｓ３２）。なお、このとき第２の走査光学系のレーザ光の照射も同時に開始する。
第１の走査光学系の垂直方向の走査位置がｙｏ２に到達したら（Ｓ３３）、第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する（Ｓ３７）。次に第１の走査光学系の垂直方向の走査位置がｙｏ２＋Ｙ２＋１に到達したら（Ｓ３４）、第２の走査光学系のレーザ光の照射を再開する（Ｓ３８）。これらにより、第１の走査光学系の垂直方向の走査位置がｙｏ２からｙｏ２＋Ｙ２の間は第２の走査光学系のレーザ光の照射が停止されるので、同時に同じ領域にレーザ光が照射されることはない。

第１の走査光学系の水平方向の走査は、走査領域３４の全体で繰り返されており（Ｓ３５）、走査領域３４の終了位置まで到達したら（Ｓ３６）、１枚の画像の取得が終了となる。
上記により、複数の走査光学系を用いて、所望の領域で特異現象を発現させる時のイオン濃度分布の経時変化の測定やＦＲＡＰの実験などにおいて、各走査光学系の間のレーザ光の影響を排除することが可能となる。

上記第１の実施形態では、第２の走査光学系のレーザ光の照射を制御しているが、第１の走査光学系のレーザ光の照射を制御してもよい。この場合、レーザ制御素子２７を光源１の光路側に設ける。
上記第１の実施形態では、レーザ制御素子を利用しているが、光源が固体レーザの場合は、レーザ光の射出を制御してもよい。

＜第２の実施形態＞
本実施形態では、第２の走査光学系の走査の帰線区間で第１の走査光学系を走査させることにより、各走査光学系の走査領域が重なり合うような場合でも、第１の走査光学系からのレーザ光と第２の走査光学系からのレーザ光が走査領域内のある１点で重なることを防止する。本実施形態では、走査型レーザ顕微鏡を用いて、標本内の特定のイオン濃度分布およびその経時変化を測定する例を説明する。

図４は、本実施形態における走査型レーザ顕微鏡のブロック図である。走査型レーザ顕微鏡は、第１のレーザ光源１からのレーザ光を標本１７の焦点面上を走査する観察用の第１の走査光学系Ａと、第２のレーザ光源１０から出力されるレーザ光を標本の任意の位置に照射してケージド試薬を開裂させるための第２の走査光学系Ｂとを備えている。第２の走査光学系Ｂは、標本の特定部位に特異現象を発現させる光学系である。

第１の走査光学系Ａは、第１のレーザ光源１、ダイクロイックミラー２、第１の走査光学ユニット３、リレーレンズ４、及びミラー５から構成される。更に、第１の走査光学系Ａのダイクロイックミラー２の分岐光路上には、検出光学系Ｃが配置されている。
この検出光学系Ｃは、測光フィルタ６、レンズ７、共焦点ピンホール８、及び光電変換素子９により構成される。第２の走査光学系Ｂは、第２のレーザ光源１０、第２の走査光学ユニット１１、リレーレンズ１２及びダイクロイックミラー１３から構成される。

第１の走査光学系Ａの光軸と第２の走査光学系Ｂの光軸とは、ダイクロイックミラー１３により合成され、結像レンズ１４及び対物レンズ１５に導かれる。また、リレーレンズ４およびリレーレンズ１２の焦点位置は、結像レンズ１４の焦点位置と一致するように配置されている。標本１７はステージ１８上に載置されている。

ダイクロイックミラー１３は、第１の走査光学系Ａからのレーザ光の波長より長波長の光を透過すると共に、第２の走査光学系Ｂからのレーザ光の波長を反射する特性となっている。
第１の光学走査ユニット３は、第１の走査波形発生回路２０に接続されている。第２の光学走査ユニット１１は、第２の走査波形発生回路２１に接続されている。光電変換素子９は、Ａ／Ｄ変換器１９に接続されている。そして、第１の走査波形発生回路２０、第２の走査波形発生回路２１、及びＡ／Ｄ変換器１９は、ＣＰＵ（中央処理装置）２２と接続している。さらに、ＣＰＵ２２はメモリ２３に接続され、またフレームメモリ２５を介してディスプレイ２６とも接続されている。

ＣＰＵ２２は、各所に制御命令を出すもので、例えば、第１及び第２の走査光学ユニット３，１１の光学スキャナ３ａ，３ｂ及び１１ａ，１１ｂを操作制御する第１及び第２の走査波形発生回路２０，２１に対し、第１及び第２のレーザ光源１，１０からのレーザ光が所望の領域を走査するような走査波形を指示して走査を開始させたり、Ａ／Ｄ変換器１９からのデジタルデータを画像化するなどをしている。また、後述する第１の走査光学系の走査開始と第２の走査光学系の走査開始の間の遅延時間も計算している。

メモリ２３は、Ａ／Ｄ変換器１９からのデジタルデータや、ＣＰＵ２２で形成される走査画像などを記憶している。ディスプレイ２６は、ＣＰＵ２２で形成されメモリ２３に記憶している走査画像を、フレームメモリ２５を介して表示する。
ここで、ＣＰＵ２２、メモリ２３、フレームメモリ２５等は一般的なパーソナルコンピュータ等を利用してもよい。また、後述する制御方法はコンピュータプログラムにより処理可能で、その処理プログラムはＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体やハードディスク等の記憶装置２４に記録されている。また、通信ネットワーク経由で処理プログラムを読み出すようにしてもよい。

必要に応じてこのパーソナルコンピュータのメモリ２３上に前記処理プログラムを読み出し、ＣＰＵ２２により実行しパーソナルコンピュータに接続されている各装置を制御している。
次に、このように構成した走査型レーザ顕微鏡の作用を説明する。第１のレーザ光源１からのレーザ光は、第１の走査波形発生回路２０により走査制御される第１の走査光学ユニット３へ導かれ、任意の方向に偏向走査される。このレーザ光はさらに、リレーレンズ４、ミラー５、ダイクロイックミラー１３、結像レンズ１４、対物レンズ１５を介して、標本１７の断面１６上に集光され、断面１６内を２次元走査する。

標本１７には第１のレーザ光源１の波長によって励起される蛍光指示薬が導入されており、断面１６内をレーザ光が走査することにより、蛍光指示薬が励起されて蛍光を生じる。対物レンズ１５により捕らえられた蛍光は、上記レーザ光と同じ光路を逆向きに進み、対物レンズ１５、結像レンズ１４、ダイクロイックミラー１３を透過し、ミラー５、リレーレンズ４、第１の走査光学ユニット３を介してダイクロイックミラー２へ導かれる。

ダイクロイックミラー２は、第１のレーザ光源１からのレーザ光の波長より長波長側の光を反射する特性となっており、これにより上記蛍光はダイクロイックミラー２により反射され、検出光学系Ｃへ導入される。
検出光学系Ｃにおいて、蛍光は測光フィルタ６により特定の波長の光が選択透過され、さらにレンズ７、共焦点ピンホール８により断面１６からの光のみが選択されて、光電変換素子９へ入射する。

光電変換素子９からの出力信号は、Ａ／Ｄ変換器１９へ導かれ、走査制御に同期してディジタル信号に変換され、ＣＰＵ２２により、フレームメモリ２５を介して、走査位置に対応してディスプレイ２６上に表示される。表示された画像は、断面１６での蛍光画像（蛍光輝度の２次元分布）、すなわち所望のイオン濃度の断面１６内での分布を示している。

一方、第２のレーザ光源１０からのレーザ光は、第２の走査光学ユニット１１、リレーレンズ１２、ダイクロイックミラー１３を介して第１の走査光学系Ａからの光軸と合成される。そして、結像レンズ１４、対物レンズ１５を透過して、標本１７の断面１６上に照射される。この時の断面１６内での照射位置は、ＣＰＵ２２により第２の走査光学ユニット１１を制御することで、第１の走査光学系Ａの走査位置に依存しない任意の位置を選択することができる。

このように第２のレーザ光源１０からのレーザ光が、ケージド試薬を導入した標本１７に照射されると、照射された部位のケージド試薬のケージド基が開裂し、内部に包含されている物質が放出される。この放出による標本１７内の上記イオン濃度分布の変化を、上記第１の走査光学系Ａにより得られる画像により測定できる。

次に、第１の走査光学系Ａの標本１７への走査と、第２の走査光学系Ｂからの標本１７へのレーザ光の照射の制御について説明する。図４にも示すように、第１及び第２の走査光学ユニット３及び１１は、２つの光学スキャナ３ａ，３ｂ及び１１ａ，１１ｂを備えている。

ＣＰＵ２２は、第１の走査光学ユニット３の光学スキャナ３ａ，３ｂを操作制御する第１の走査波形発生回路２０と、第２の走査光学ユニット１１内の光学スキャナ１１ａ，１１ｂを操作制御する第２の走査波形発生回路２１に接続している。
ＣＰＵ２２は、蛍光画像を得るために、目的とする断面１６内の目的とする範囲を第１のレーザ光源１からのレーザ光が走査するような走査波形を、第１の走査波形発生回路２０に対して指示して走査制御を開始する。また、ＣＰＵ２２は、ケージド試薬を開裂させる所望の領域を第２のレーザ光源１０からのレーザ光が走査するように第２の走査波形発生回路２１に対して走査波形を指示する。

図２は、本実施形態における走査波形と走査の関係を示す。同図において、３４は第１の走査光学系の走査領域を示しており、この第１の走査光学系の走査領域３４の水平方向をＸ１、垂直方向をＹ１で表す。また、走査波形３０はＸ１方向の走査波形（１波形の長さをＬｘ１で表す）を示しており、走査波形３１はＹ１方向の走査波形（１波形の長さをＬｙ１で表す）を示している。

また、３５は第２の走査光学系の走査領域を示しており、この第２の走査光学系の走査領域３５の水平方向をＸ２、垂直方向をＹ２で表す。また、走査波形３２はＸ２方向の走査波形（１波形の長さをＬｘ２で表す）を示しており、走査波形３３はＹ２方向の走査波形（１波形の長さをＬｙ２で表す）を示している。

また、第１の走査光学系のピクセルクロックをＣ１、第２の走査光学系のピクセルクロックをＣ２で表す。３６は第２の走査光学系の走査開始位置（ｘｏ２，ｙｏ２）を示している。
さて、ＣＰＵ２２により走査開始が指示された第１の走査波形発生回路２０は、第１の走査光学ユニット３内の２つの光学スキャナ３ａ，３ｂに対し、ＣＰＵ２２により指示された走査波形３０，３１をそれぞれ出力する。なお、ここでは光学スキャナ３ａが水平方向の主走査を、光学スキャナ３ｂが垂直方向の副走査を行うものである。

これによりレーザ光が断面１６内で２次元走査を始める。第１の走査波形発生回路２０は走査波形３０，３１の出力を始めると、Ａ／Ｄ変換器１９に対して、図示しない各種同期信号（クロック信号、垂直同期信号、水平同期信号）を出力する。Ａ／Ｄ変換器１９はこれらの各種同期信号のうち、各画素ごとに発生するクロック信号（図２に示す第１の走査光学系のピクセルクロックＣ１）により光電変換素子９から出力される蛍光輝度信号をＡ／Ｄ変換する。

そして、ＣＰＵ２２において、Ａ／Ｄ変換器１９より得られたデジタルデータと、垂直同期信号と、水平同期信号とからメモリ２３上に画像を形成して、フレームメモリ２５を介してディスプレイ２６上に表示する。この場合、垂直同期信号の１サイクル分が１枚の画像となる。

このようにして得られた画像は、ケージド試薬が開裂する前における標本１７内のイオン濃度分布の初期状態を示す画像となる。かかる画像を１枚ないし複数枚測定した後、ＣＰＵ２２は、第１の走査波形発生回路２０に対して走査開始を指示し、画像の取得を開始する。続いて、後述する方法で計算した遅延時間後に、ＣＰＵ２２は、第２の走査波形発生回路２１に走査開始を指示する。

ＣＰＵ２２により走査開始が指示された第２の走査波形発生回路２１は、第２の走査光学ユニット１１内の２つの光学スキャナ１１ａ，１１ｂに対し、ＣＰＵ２２により指示された走査波形３２，３３をそれぞれ出力する。なお、ここでは光学スキャナ１１ａが水平方向の主走査を、光学スキャナ１１ｂが垂直方向の副走査を行うものである。

第２の走査光学系Ｂからのレーザ光を標本１７に照射するとケージド試薬が開裂し、これ以降に第１の走査光学系Ａの走査から得られる走査画像は、ケージド試薬が開裂したことによる標本内の変化を示すものとなる。
ここで、図２のような走査波形を用いて走査をする場合を例にして、第１の走査光学系の走査開始時間に対する第２の走査光学系の走査開始時間の遅延時間について説明する。通常、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を非同期で開始すると、走査領域内のある１点でレーザ光が重なる可能性がある。本実施形態では、その１点が第２の走査光学系の走査の水平または垂直の帰線区間になるように、第１の走査光学系の走査開始時間または第２の走査光学系の走査開始時間を遅延させる。

これについて具体的に説明する。図２において、例えば走査波形３２について見てみると、走査波形３２の左端は急勾配になって下っており、それから緩やかに右上方へ上がって行き、その後再び急勾配で下っている。このうち、緩やかに右上方へ上がっている波形部分が、レーザ光を照射しながら走査しているところを示している。そして、この両端の急勾配の波形が帰線区間を示し、左から右への走査が再び左へ戻っていることを示す。このときレーザ光の照射は停止状態である。

また、走査波形３３について見てみると、走査波形３３の左端は急勾配になって下っており、それから緩やかに右上方へ上がって行き、その後再び急勾配で下っている。このうち、緩やかに右上方へ上がっている波形部分が、レーザ光を照射しながら走査しているところを示している。そして、この両端の急勾配の波形が帰線区間を示し、上から下へ表示した走査線が再び上へ戻っていることを示す。このときレーザ光の照射は停止状態である。

走査波形３０，３１の見方についてもそれぞれ、走査波形３２，３３と同様である。
このとき、例えば、第２の走査光学系のレーザ光の照射が行われていない時、すなわち、第２の走査光学系の水平走査の帰線区間の時に、第１の走査光学系の走査を行うようにすれば、第１の走査光学系からのレーザ光と第２の走査光学系からのレーザ光が走査領域内のある１点で重なることはない。

図５は、本実施形態における第２の走査光学系の帰線区間で、第１の走査光学系の走査を行うフローを示す。まず、走査領域３５を第２の走査光学系で水平走査を行う（Ｓ１）。それから、その水平走査が終わって次の走査開始まで移動する帰線区間となる（Ｓ２）。この第２の走査光学系の帰線区間で、第１の走査光学系を走査させることにより（Ｓ３）、第１の走査光学系からのレーザ光と第２の走査光学系からのレーザ光が走査領域内のある１点で重なることはない。以下では、これの実現方法を詳述する。

第２の走査光学系の水平走査の帰線区間の終点で、２つの走査光学系の走査を交差する例を説明する。なお、以下の説明中の式で、ＩＮＴ（）は切り捨てを意味する。
まず、第２の走査光学系の走査の先頭位置（垂直位置がｙｏ２）の走査線の先頭に、第１の走査光学系の走査が到達するまでの時間Ｔ１を次式（１）で計算する。

次に、第２の走査光学系の水平走査の１回の走査時間Ｔ２を次式（２）で計算する。

上記Ｔ１とＴ２から、第２の走査光学系の走査の先頭位置に第１の走査光学系の走査が到達するまでに、第２の走査光学系が水平走査する回数ｎａを次式（３）で計算する。

上記より、第２の走査光学系の走査の先頭位置に第１の走査光学系の走査が到達したときに、第２の走査光学系の走査の垂直位置Ｙｓ２が次式（４）で計算できる。

ここで、第２の走査光学系の走査の垂直位置Ｙｓ２における水平走査の帰線区間の終点で、２つの走査光学系の走査を交差するものとする。
続いて、第２の走査光学系の走査の垂直位置Ｙｓ２に第２の走査光学系の走査が到達するまでの時間Ｔａを次式（５）で計算する。

次に、上記Ｔａ時間内に第１の走査光学系の走査が到達する垂直位置Ｙｓ１を次式（６）で計算する。

そして、Ｔａ時間内に各走査光学系の走査が到達した垂直位置の差Ｄｓを次式（７）で計算する。

上記より、この垂直位置の差の時間分、第２の走査光学系の走査開始時間を第１の走査光学系の走査開始時間に対して遅延すればよい。この遅延時間ｔは、次式（８）で計算できる。

以上より、複数の走査光学系を用いて、所望の領域で特異現象を発現させる時のイオン濃度分布の経時変化の測定やＦＲＡＰの実験などにおいて、各走査光学系の間のレーザ光の影響を排除することが可能となる。
＜第３の実施形態＞
第２の実施形態では、水平走査を走査画像の左から右への一方向で走査しているが、走査画像の左から右と右から左の二方向すなわち往復で走査する場合もある。これは走査波形と走査の関係が図６のようになる場合である。この場合は、第２の走査光学系の垂直走査の帰線区間で、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を交差すればよい。

図６は、本実施形態における走査波形と走査の関係を示す。同図において、図２と異なるのは、第１の走査光学系と第２の走査光学系の水平走査を往復にするために、走査波形４０，４２を変化させたことである。
走査波形４０について見てみる。まず左から右への走査時には走査波形４０は緩やかな曲線を描いて飽和に達し、折り返し後（右から左への走査時）にはこの波形を反転した波形となる。走査波形４２についても同様である。

そこで、本実施形態では、第２の走査光学系の垂直走査の帰線区間で、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を交差させる。
以下、第２の走査光学系の垂直走査の帰線区間で、第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を交差する場合の遅延時間の計算を説明する。なお、以下の説明中の式で、ＩＮＴ（）は切り捨てを意味する。

まず、第２の走査光学系の１回のＸＹ走査の終了位置に、第１の走査光学系の走査が到達するまでの時間Ｔｒ１を次式（９）で計算する。

次に、第２の走査光学系の１回のＸＹ走査の走査時間Ｔｒ２を次式（１０）で計算する。

上記Ｔｒ１とＴｒ２から、第２の走査光学系の走査の終了位置に第１の走査光学系の走査が到達するまでに、第２の走査光学系がＸＹ走査する回数ｎｒを次式（１１）で計算する。

上記より、第２の走査光学系の走査の終了位置に（ｎｒ＋１）回目の第２の走査光学系の走査が到達するまでの時間Ｔｒを次式（１２）で計算する。

続いて、上記Ｔｒ時間内に第１の走査光学系の走査が到達する垂直位置Ｙｒ１を次式（１３）で計算する。

そして、Ｔｒ時間内に各走査光学系の走査が到達した垂直位置の差Ｄｒを次式（１４）で計算する。

上記より、この垂直位置の差の時間分、第２の走査光学系の走査開始時間を第１の走査光学系の走査開始時間に対して遅延すればよい。
この遅延時間ｔｒは、次式（１５）で計算できる。

上記により、複数の走査光学系を用いて所望の領域で特異現象を発現させる時のイオン濃度分布の経時変化の測定やＦＲＡＰの実験などにおいて、往復走査する場合でも各走査光学系の間のレーザ光の影響を排除することが可能となる。
なお、第２及び第３の実施形態では、第２の走査光学系の帰線区間の先頭で第１の走査光学系の走査と第２の走査光学系の走査を交差しているが、第２の走査光学系の帰線区間中であればどの位置でもよい。

また、第２及び第３の実施形態では、第１の走査光学系の走査領域より第２の走査光学系の走査領域が小さい場合として記載しているが、第１の走査光学系の走査領域より第２の走査光学系の走査領域が大きい場合は、第１の走査光学系の走査の帰線区間で２つの走査光学系の走査が交差するようにする。

また、第２及び第３の実施形態では、第２の走査光学系の走査開始時間を第１の走査光学系の走査開始時間に対して遅延しているが、第１の走査光学系の走査開始時間を第２の走査光学系の走査開始時間に対して遅延してもよい。
また、第２の実施形態では、第１の走査光学系と第２の走査光学系の水平走査の方向は、それぞれ一方向であり、第３の実施形態では、それぞれ往復したが、これに限らず、一方の走査光学系を一方向、他方を走査光学系を往復で水平走査するようにしてもよい。

また、第２及び第３の実施形態では、第１の走査光学系と走査光学系の走査領域の走査方向は同方向であったが、例えば一方の走査光学系を左から走査させ、他方を右から走査させるというように、逆方向で走査するようにしてもよい。このようにすることで、交差する時間が短くなり、制御に要する負担が軽減される。

また、第１から第３の実施形態では、走査光学系を２つ使用したが、これに限られず、さらに複数使用しても良い。たとえば、５つの走査光学系がある場合、１つを画像取得用走査光学系とし、他の４つをフォトブリーチ用走査光学系とすることで、同時に４つの領域をフォトブリーチすることができる。これにより、様々なパターンの条件下でＦＲＡＰの実験を行うことができる。

なお、本発明は、第１から第３の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々変形実施可能である。

第１の実施形態における走査型レーザ顕微鏡のブロック図である。 第１および第２の実施形態における走査波形と走査の関係を示す図である。 第１の実施形態におけるレーザ光の照射制御の流れを示す図である。 第２の実施形態における走査型レーザ顕微鏡のブロック図である。 第２の実施形態における第２の走査光学系の帰線区間で、第１の走査光学系の走査を行うフローを示す図である。 第３の実施形態における走査波形と走査の関係を示す図である。

符号の説明

１，１０ レーザ光源
２，１３ ダイクロイックミラー
３，１１ 走査光学ユニット
４，１２ リレーレンズ
５ ミラー
６ 測定フィルタ
７ レンズ
８ 共焦点ピンホール
９ 光電変換素子
１４ 結像レンズ
１５ 対物レンズ
１６ 断面位置
１７ 標本
１８ ステージ
１９ Ａ／Ｄ変換器
２０，２１ 走査波形発生回路
２２ ＣＰＵ
２３ メモリ
２４ 記憶装置
２５ フレームメモリ
２６ ディスプレイ
２７ レーザ制御素子

Claims (9)

1. 複数の走査光学系と、
   前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査と、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査とが重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、該第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段と
   を備えることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、
   前記標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、
   前記第１の走査光学系の走査と前記第２の走査光学系の走査とが重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、前記第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段と
   を備えることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
3. 複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡を制御する走査型レーザ顕微鏡制御方法であって、
   前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査と、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査とが重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、該第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行う
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡制御方法。
4. 複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡の制御をコンピュータに実行させるための走査型レーザ顕微鏡制御プログラムであって、
   前記複数の走査光学系に走査を行わせる処理と、
   前記複数の走査光学系を制御して、当該複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査と、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査が重なる領域を前記第１の走査光学系が走査する間、該第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する処理
   を、コンピュータに実行させるための走査型レーザ顕微鏡制御プログラム。
5. 複数の走査光学系と、
   前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で当該第１走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段と、
   前記複数の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記第１の走査光学系の走査の帰線区間で、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査と該第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させる制御を行う交差制御手段と、
   を備え、
   前記交差制御手段は、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと前記第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを、異ならせる
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
6. 標本の走査画像を得るための第１の走査光学系と、
   前記標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第２の走査光学系と、
   前記第２の走査光学系の走査の帰線区間で当該第２走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行うレーザ光照射制御手段と、
   前記第１および第２の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記第２の走査光学系の走査の帰線区間で、該第２の走査光学系の走査と前記第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させる制御を行う交差制御手段と、
   を備え、
   前記交差制御手段は、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと前記第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを、異ならせる
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
7. 複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡を制御する走査型レーザ顕微鏡制御方法であって、
   前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で当該第１走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御と、
   前記複数の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査と該第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させるように、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと該第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを異ならせる制御を行うことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡制御方法。
8. 複数の走査光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡の制御をコンピュータに実行させるための走査型レーザ顕微鏡制御プログラムであって、
   前記複数の走査光学系に走査を行わせる処理と、
   前記複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で当該第１走査光学系のレーザ光の照射を停止する処理と、
   前記複数の走査光学系のそれぞれの走査領域が重なり合う場合に、前記複数の走査光学系を制御して、当該複数の走査光学系のうち第１の走査光学系の走査の帰線区間で、前記複数の走査光学系のうち第２の走査光学系の走査と該第１の走査光学系の走査とを当該両走査光学系の走査動作を停止せずに交差させるように、前記第２の走査光学系の走査の開始タイミングと該第１の走査光学系の走査の開始タイミングとを異ならせる処理
   を、コンピュータに実行させるための走査型レーザ顕微鏡制御プログラム。
9. 前記第１の走査光学系は、レーザ光をＸ方向にライン走査するＸスキャナと該Ｘラインの位置をＹ方向に走査するＹスキャナを備え、
   前記レーザ光照射制御手段は、前記第１の走査光学系のＸスキャナが前記重なる領域を含むＸラインの走査を行なうときに前記第２の走査光学系のレーザ光の照射を停止する制御を行う
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の走査型レーザ顕微鏡。

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