KR20240099301A - 바실러스 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
바실러스 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 특정 구현예는 향상된 단백질 생산성 표현형을 포함하는 재조합 바실러스 균주, 이러한 재조합 바실러스 세포 등을 구성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 재조합 바실러스 균주는 적합한 조건 하에서 성장/배양/발효될 때 관심 단백질 생산 향상에 특히 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 11월 16일에 출원된 미국 가출원 63/279,813호의 이익을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 세균학, 미생물학, 유전학, 분자 생물학, 효소학, 및 산업 단백질 생산 등의 분야에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구현예는 향상된 단백질 생산성 표현형을 포함하는 재조합 바실러스 세포(균주), 이러한 재조합(변형된) 바실러스 세포 등을 구성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
"NB42009-WO-PCT_SequenceListing.xml"이라는 파일명의 서열 목록 텍스트 파일의 전자 제출 내용은 2022년 11월 10일에 생성되었으며 크기는 103 KB이고, 전체가 본원에 참조로 포함된다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 같은 그람 양성 박테리아는 우수한 발효 특성 및 높은 수율(예를 들어, 배양액 1 리터당 최대 25 그램; 문헌[Van Dijl and Hecker, 2013])로 인해 산업 관련 단백질의 생산을 위한 미생물 공장으로 자주 사용된다. 예를 들어, 바실러스 종 숙주 세포는 식품, 직물, 세탁, 의료 기기 세척, 제약 산업 등에 필요한 효소(예를 들어, 아밀라제, 셀룰라제, 만나나제, 펙테이트 리아제, 프로테아제, 풀루라나제 등)를 생성하는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 비병원성 그람 양성 박테리아의 경우 독성 부산물(예를 들어, 내독소로도 알려진 리포다당류; LPS)이 전혀 없는 단백질이 생산되기 때문에 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority, EFSA)의 "공인된 안전성 추정"(QPS) 등급을 획득했으며, 많은 제품이 미국 식품의약국의 "Generally Recognized As Safe(GRAS)" 등급을 받았다(문헌[Olempska-Beer et al., 2006; Earl et al., 2008; Caspers et al., 2010]).
따라서, 미생물 숙주 세포를 통해 단백질(예를 들어, 효소, 항체, 수용체 등)을 생산하는 것은 생명공학 분야에서 특히 관심 대상이다. 마찬가지로, 하나 이상의 관심 단백질의 생산 및 분비에 대한 바실러스 숙주 세포의 최적화는 특히 산업 생명공학 환경에서 관련성이 높으며, 단백질 수율의 작은 개선은 단백질을 대규모의 산업적인 양으로 생산할 때 매우 중요하다. 예를 들어, 수많은 이종성 단백질의 발현은 수율 등의 측면에서 여전히 까다롭고 예측 불가능할 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이, 본 발명은 단백질 생산 능력이 향상된 바실러스 종 세포(예를 들어, 단백질 생산 숙주)를 획득하고 구성하기 위한 매우 바람직한 충족되지 않은 요구에 관한 것이다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 특정 양태는 재조합(변형) 미생물 숙주 세포, 예컨대 본원에 예시된 재조합 바실러스 균주(재조합 균주는 적합한 조건 하에서 배양될 때 관심 단백질의 생산 향상에 특히 유용함)를 설계하고 구성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 특정 구현예는 특히 하나 이상의 정의된 B. 리체니포르미스 유전자좌, prsA 유전자 프로모터 서열, prsA 유전자 암호화 서열(오픈 리딩 프레임), 대조군 세포, 재조합 세포, 관심 단백질, 관심 단백질을 암호화하는 발현 구성체(카세트) 등에서의 도입 및 통합에 적합한 하나 이상의 prsA 유전자 발현 카세트를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 prsA 유전자 발현 카세트를 제공한다. 특정 양태에서, prsA 유전자 카세트는 다운스트림(3') prsA 유전자 암호화 서열(CDS)에 작동가능하게 연결된 업스트림(5') prsA 유전자 프로모터 서열을 포함한다. 관련 양태에서, prsA 유전자 카세트는 제2 카피 prsA 유전자 카세트로 지칭될 수 있다. 다른 관련 양태에서, 본 발명은 목적하는 숙주 세포의 정의된 게놈 유전자좌에서 통합에 적합한 제2 카피 prsA 유전자 카세트를 제공한다. 특정 양태에서, prsA 유전자 프로모터 서열은 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하고/하거나 prsA 유전자 CDS는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함한다.
따라서, 다른 특정 구현예는 관심 단백질을 생산하고 정의된 유전자좌에 통합된 도입된 제2 카피 prsA 유전자 카세트를 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 세포에 관한 것이다. 특정 양태에서, 관심 단백질(POI)을 생산하고, 정의된 게놈 유전자좌(예를 들어, B. 리체니포르미스 amyL 유전자좌)에 통합된 도입된 제2 카피 prsA 유전자 카세트를 갖는 재조합 B. 리체니포르미스 세포는 동일한 POI를 생산하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하며, 여기서 대조군 세포는 catH 유전자좌에 통합된 동일한 prsA 유전자 카세트를 포함하거나 동일한 prsA 유전자 카세트의 비통합 카피를 포함한다. 특정 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 효소이다.
다른 특정 구현예는 B. 리체니포르미스 세포에서 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, 관심 단백질(POI)을 생산하는 B. 리체니포르미스 세포를 구성하는 단계, 정의된 게놈 유전자좌(예를 들어, B. 리체니포르미스 amyL 유전자좌)에 통합된 제2 카피 prsA 유전자 카세트를 상기 세포에 도입하는 단계, 및 POI 생산에 적합한 조건 하에서 상기 재조합 세포를 발효시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태는 동일한 POI를 생산하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는 재조합 B. 리체니포르미스 세포에 관한 것으로, 여기서 대조군 세포는 catH 유전자좌에 통합된 동일한 제2 카피 prsA 유전자 카세트를 포함하거나 동일한 prsA 유전자 카세트의 비통합 카피를 포함한다. 상기 방법의 특정 구현예에서, prsA 유전자 카세트는 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 프로모터 서열을 포함하고/하거나 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 CDS를 포함한다. 상기 방법의 다른 특정 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 효소이다.
생물학적 서열의 간단한 설명
서열번호 1은 합성 올리고뉴클레오티드(DNA) 프라이머 서열 860이다.
서열번호 2는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 861이다.
서열번호 3은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 1636이다.
서열번호 4는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 1637이다.
서열번호 5는 합성 올리고뉴클레오티드 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 6은 합성 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 7은 합성 올리고뉴클레오티드 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 8은 합성 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 9는 합성 올리고뉴클레오티드 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 10은 합성 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 11은 합성 DNA 편집 주형이다.
서열번호 12는 "pRF1005"로 명명된 서열 검증된 플라스미드 단리물이다.
서열번호 13은 B. 리체니포르미스 serA1 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열이다.
서열번호 14는 B. 리체니포르미스 lysA 유전자의 ORF 서열이다.
서열번호 15는 pBl.comK 플라스미드의 DNA 서열이다.
서열번호 16은 ΔrghR2 대립유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 17은 처음 9 bp 및 마지막 9 bp를 제외하고 rghR2 유전자 CDS가 결실된 ΔrghR2 대립유전자의 1523 bp PCR 산물이다.
서열번호 18은 온전한 rghR2 대립유전자의 1922 bp PCR 산물이다.
서열번호 19는 ΔdltA-2 대립유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 20은 dltA-2 유전자 CDS의 700 bp가 결실된 ΔdltA-2 대립유전자의 2067 bp PCR 산물이다.
서열번호 21은 온전한 dltA-2 대립유전자의 2767 bp PCR 산물이다.
서열번호 22는 도입된 (제2) 카피 prsA 카세트의 통합을 위한 amyL 유전자좌를 표적화하는 선형 PCR 산물의 DNA 서열이다.
서열번호 23은 amyL 유전자좌에 대한 업스트림(5') 상동성 아암의 DNA 서열이다.
서열번호 24는 catH 프로모터의 DNA 서열이다.
서열번호 25는 CatH 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 26은 서열번호 28의 spoVG 종결자에 작동가능하게 연결된 서열번호 27의 catH 종결자를 포함하는 이중 종결자 서열을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 27은 catH 종결자를 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 28은 spoVG 종결자를 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 29는 천연 B. 리체니포르미스 prsA 프로모터의 DNA 서열이다.
서열번호 30은 천연 B. 리체니포르미스 PrsA 단백질을 암호화하는 ORF 서열이다.
서열번호 31은 B. 리체니포르미스 amyL 종결자의 DNA 서열이다.
서열번호 32는 amyL 유전자좌에 대한 다운스트림(3') 상동성 아암이다.
서열번호 33은 도입된 (제2) 카피 amyL 통합 카세트 amyL::catH-prsAp-prsA의 DNA 서열이다.
서열번호 34는 2698 bp 서열이다.
서열번호 35는 3562 bp 서열이다.
서열번호 36은 리포터 "아밀라제 1"(Amy1) 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 37은 합성 p3 프로모터의 DNA 서열이다.
서열번호 38은 B. 서브틸리스 변형 aprE 5′-UTR의 DNA 서열이다.
서열번호 39는 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 40은 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자의 DNA 서열이다.
서열번호 41은 합성 p2 프로모터의 DNA 서열이다.
서열번호 42는 리포터 "아밀라제 2"(Amy2) 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 43은 서열번호 30에 의해 암호화된 천연 B. 리체니포르미스 PrsA 단백질의 아미노산 서열이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예는 바실러스(숙주) 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 특정 양태는 재조합 세포가 적합한 조건 하에서 성장/배양/발효될 때 관심 단백질의 생산 향상에 특히 유용한 재조합 바실러스 세포(균주)를 제공한다. 보다 구체적으로, 이후에 제시되고 하기 실시예에서 추가로 기술하는 바와 같이, 출원인은 놀랍게도 정의된 B. 리체니포르미스 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 발현 카세트의 도입된 제2 카피를 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 세포가 B. 리체니포르미스 catH 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트의 동일한 도입된 제2 카피를 갖는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질을 생산할 수 있음을 발견하였다. 따라서 본 발명의 특정 양태는 특히 하나 이상의 사전 정의된 B. 리체니포르미스 유전자좌, prsA 유전자 프로모터 서열, prsA 유전자 암호화 서열(오픈 리딩 프레임), 대조군 세포, 재조합 세포, 관심 단백질, 관심 단백질을 암호화하는 발현 구성체(카세트) 등에서의 도입 및 통합에 적합한 하나 이상의 prsA 유전자 발현 카세트를 제공한다.
I.
정의
본원에 기재된 조성물 및 방법과 관련하여, 다음의 용어 및 어구가 정의된다. 본원에 정의되지 않은 용어는 당업계에서 사용되는 통상적인 의미를 따른다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 적용되는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 대표적인 예시적 방법 및 재료가 이제 기술된다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허는 그 전체가 참조로 포함된다.
또한, 임의의 선택적 요소를 제외하도록 청구범위가 작성될 수 있음에 유의한다. 따라서, 이러한 서술은 청구 요소의 설명과 관련하여 "전적으로", "단지", "~를 제외한", "~를 포함하지 않는" 등과 같은 배타적 용어를 사용하거나, "부정적" 제한이나 그 단서를 사용하기 위한 선행 근거로서의 역할을 하기 위한 것이다. 단서의 예로는, "재조합 세포는 동일한 관심 단백질을 생산하는 대조군 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질을 생산하되, 상기 대조군 세포는 prsA 유전자 카세트의 비통합 제2 카피를 포함한다"와 같은 문구가 포함된다.
본원에 기재되고 예시된 개별 구현예 각각은 본원에 기재된 본 발명의 조성물 및 방법의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 가지며, 이는 본 발명을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 언급된 임의의 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "바실러스 속"은 B. 서브틸리스(subtilis), B. 리체니포르미스(licheniformis), B. 렌투스(lentus), B. 브레비스(brevis), B. 스테아로써모필루스(stearothermophilus), B. 알칼로필루스(alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스(amyloliquefaciens), B. 클라우시(clausii), B. 할로두란스(halodurans), B. 메가테리움(megaterium), B. 코아굴란스(coagulans), B. 서큘란스(circulans), B. 라우투스(lautus), 및 B. 투링기엔시스(thuringiensis)를 비롯해(이에 한정되지 않음), 당업계에 알려진 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 계속해서 분류학적 재편성을 거치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 속은 현재 "지오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 B. 스테아로써모필루스와 같은 유기체를 비롯한(이에 한정되지 않음) 재분류된 종을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합" 또는 "비천연"은 적어도 하나의 조작된 유전적 변경을 갖거나 또는 이종성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물유기체, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 의미하거나, 이종성 또는 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어될 수 있도록 변경된 세포(예를 들어, 미생물 세포)를 의미한다. 재조합은 또한 비천연 세포로부터 유래되거나 또는 하나 이상의 이러한 변형을 갖는 비천연 세포의 자손인 세포를 의미한다. 유전적 변경은, 예를 들어 단백질을 암호화하는 발현가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환, 또는 세포의 유전적 물질의 다른 기능적 변경을 포함한다. 예를 들어, 재조합 세포는 천연(야생형) 세포(예를 들어, 융합 또는 키메라 단백질) 내에서 동일하거나 상동적인 형태로 발견되지 않는 유전자 또는 다른 핵산 분자를 발현시킬 수 있거나, 또는 과발현되거나, 저발현되거나, 최소로 발현되거나, 또는 전혀 발현되지 않을 수 있는 유전자와 같은 내인성 유전자의 변경된 발현 패턴을 제공할 수 있다. "재조합(recombination, recombining)" 또는 "재조합된" 핵산을 생성하는 것은 일반적으로 2개 이상의 핵산 단편을 조립하는 것이며, 조립을 통해 키메라 유전자가 생성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 또는 일부를 지칭할 뿐만 아니라, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 나타내는지와 상관없이, 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA를 지칭한다. 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 암호화할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드(또는 핵산 분자)는 "유전자", "벡터", 및 "플라스미드"를 포함하는 것이 이해된다.
따라서, 용어 "유전자"는 단백질 암호화 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절(비전사) DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사 영역은 인트론, 5'-비번역 영역(UTR), 및 3'-UTR을 포함하는 비번역 영역(UTR)뿐만 아니라 암호화 서열(CDS)도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암호화 서열"("CDS"로 약칭됨)은 (암호화된) 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 특정하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(이하, "ORF")에 의해 결정되며, 이는 대개 ATG 시작 코돈으로 시작된다. 암호화 서열은 일반적으로 DNA, cDNA, 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열(CDS)은 프로모터 서열에 대해 3'(다운스트림)에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자(예를 들어, prsA prsA 유전자 프로모터)로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래되는 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 핵산 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 조건 또는 생리적 조건에 응답하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되도록 하는 프로모터를 일반적으로 "항시성 프로모터"라고 한다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 길이가 다른 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pRF879"로 명명된 플라스미드는 PCT 공개 WO 2021146411호에 기재된 서열번호 78의 pRF879 플라스미드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pZM221"로 명명된 플라스미드는 PCT 공개 WO 2021146411호에 기재된 서열번호 84의 pZM221 플라스미드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pRF1005"(서열번호 12)로 명명된 플라스미드는 catH 유전자좌를 표적화하는 Cas9 플라스미드로서, 서열번호 11의 편집 주형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "야생형(천연) prsA 유전자"는 "야생형(천연) PrsA 단백질"을 암호화한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형(천연) 바실러스 리체니포르미스 "prsA 유전자 프로모터"는 서열번호 29에 제시된 DNA 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 B. 리체니포르미스 " prsA 유전자 암호화 서열(CDS)"은 서열번호 30에 제시된 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하고 천연 PrsA 단백질을 암호화한다. 특정 양태에서, 기능적 PrsA 단백질은 "단백질 샤페론" 기능 또는 활성을 포함한다.
특정 구현예에서, 야생형 prsA 유전자 CDS는 서열번호 30에 대해 약 80% 이상의 (뉴클레오티드) 서열 동일성을 포함한다. 다른 양태에서, 야생형 prsA 유전자 CDS는 서열번호 30에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 다른 구현예에서, 야생형 prsA 유전자 프로모터는 서열번호 29에 대해 약 85%의 서열 동일성을 포함한다. 특정 양태에서, 야생형 prsA 유전자 프로모터는 서열번호 29에 대해 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 숙주 세포가 내인성(천연) "prsA 유전자"(즉, 천연 PrsA 단백질을 암호화)를 포함하고 천연 PrsA 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 통합 발현 카세트)가 동일한 바실러스 숙주 세포에 도입되는 경우, 도입된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 "제2 카피 prsA 유전자"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "제2 카피 prsA 유전자"는 서열번호 30의 ORF에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 prsA 유전자 CDS를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 특정 양태에서, 제2 카피 prsA 유전자 CDS는 서열번호 29의 prsA 프로모터 영역에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는 기능적 prsA 유전자 프로모터 영역으로부터 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 도입된 제2 카피 prsA 유전자는 적어도, 다운스트림(3') prsA 유전자 CDS에 작동가능하게 연결된 업스트림(5') prsA 유전자 프로모터 서열(예를 들어, 5'-[prsA 유전자 프로모터]-[prsA 유전자 CDS]-3')을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF140"으로 명명된 B. 리체니포르미스 균주는, PCT 공개 WO2019/40412호에 일반적으로 기재된 바와 같이, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA 유전자(ΔlysA; 서열번호 14)의 결실 및 도입된 pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 포함한다,
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF412"로 명명된 B. 리체니포르미스 균주는, PCT 공개 WO2021/146411호에 일반적으로 기재된 바와 같이, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA(ΔlysA; 서열번호 14) 의 결실, 도입된 플라스미드 pBl.comK(서열번호 15), 및 결실 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF772"로 명명된 B. 리체니포르미스 균주는, WO2021/146411에 일반적으로 기재된 바와 같이, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA(ΔlysA; 서열번호 14)의 결실, 도입된 플라스미드 pBl.comK(서열번호 15), 결실 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자, 및 결실 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM1319"로 명명된 B. 리체니포르미스 단리물은, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA(ΔlysA; 서열번호 14)의 결실, 도입된 플라스미드 pBl.comK(서열번호 15), 결실 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자, 결실 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자, 및 amyL 유전자좌에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 유전자(예를 들어, 5'-[prsA 프로모터]-prsA 유전자 암호화 서열(ORF)]-3')를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM1322"로 명명된 B. 리체니포르미스 단리물은, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA(ΔlysA; 서열번호 14)의 결실, 도입된 플라스미드 pBl.comK(서열번호 15), 결실 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자, 결실 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자, 및 catH 유전자좌에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 유전자(예를 들어, 5'-[prsA 프로모터]-prsA 유전자 암호화 서열(ORF)]-3')를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM1325"로 명명된 B. 리체니포르미스 단리물은, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA(ΔlysA; 서열번호 14)의 결실, 도입된 플라스미드 pBl.comK(서열번호 15), 결실 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자, 결실 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자, 및 amyL 유전자좌에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 유전자(예를 들어, 5'-[prsA 프로모터]-prsA 유전자 암호화 서열(ORF)]-3')를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF613"으로 명명된 B. 리체니포르미스 단리물은, serA1(ΔserA1; 서열번호 13) 및 lysA(ΔlysA; 서열번호 14)의 결실, 도입된 플라스미드 pBl.comK(서열번호 15), 결실 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자, 결실 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자, 및 catH 유전자좌에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 유전자(예를 들어, 5'-[prsA 프로모터]-prsA 유전자 암호화 서열(ORF)]-3')를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, B. 리체니포르미스 균주 "LDN665"는 Amy1의 2개 카피 및 catH 유전자좌에 통합된 prsA의 제2 카피를 포함하는 아밀라제 1(Amy1) 리포터 균주이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, B. 리체니포르미스 균주 "ZM1351"은 Amy1의 2개 카피 및 amyL 유전자좌에 통합된 prsA의 제2 카피를 포함하는 아밀라제 1(Amy1) 리포터 균주이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, B. 리체니포르미스 균주 "WAAA57"은 Amy2의 2개 카피 및 catH 유전자좌에 통합된 prsA의 제2 카피를 포함하는 아밀라제 2(Amy2) 리포터 균주이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, B. 리체니포르미스 균주 "WAAA197"는 Amy2의 2개 카피 및 amyL 유전자좌에 통합된 prsA의 제2 카피를 포함하는 아밀라제 2(Amy2) 리포터 균주이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아밀라제 1(Amylase 1)" 또는 "아밀라제 1(amylase 1)" 단백질("Amy1"로 약칭)은 아밀라제 리포터 단백질을 지칭하며, 여기서 Amy1 리포터를 암호화하는 DNA는 서열번호 36에 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아밀라제 2(Amylase 2)" 또는 "아밀라제 2(amylase 2)" 단백질("Amy2"로 약칭)은 아밀라제 리포터 단백질을 지칭하며, 여기서 Amy2 리포터를 암호화하는 DNA는 서열번호 42에 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"는 새로 도입된 DNA 서열에 대한 숙주 또는 발현 비히클로서 작용하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 숙주 세포는 그람 양성(예를 들어, 바실러스 종) 세포 또는 그람 음성 E. 콜라이 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된" 세포 또는 "딸" 세포는 변형된 세포가 유래된 모세포에 존재하지 않는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 재조합 세포를 의미한다. 특정 양태에서, "비변형" 세포, "모" 세포, 및/또는 "대조군" 세포와 같은 어구는 본 발명의 변형된 세포와 비교할 때 또는 이에 대해 상대적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대조군 세포에서의 관심 단백질(POI)의 발현이 "변형된" 세포에서의 동일한 POI의 발현과 비교될 때, "대조군" 세포와 "변형된" 세포가 동일한 조건(예를 들어, 배지, 온도, pH 등이 동일한 조건)하에 성장/배양/발효된다는 것이 이해될 것이다. 특정 구현예에서, 증가된 양의 관심 단백질은 본 발명의 재조합 바실러스 세포에서 발현되는 내인성 바실러스 관심 단백질(예를 들어, 천연 프로테아제, 천연 아밀라제 등) 또는 이종성 관심 단백질(예를 들어, 재조합 프로테아제, 재조합 아밀라제 등)일 수 있다. 특정 양태에서, POI는 배양 배지(배양액)로 분비된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 생산의 "증가" 또는 "증가된" 단백질 생산은 증가된 양의 생산된 단백질(예를 들어, 관심 단백질)을 의미한다. 단백질은 숙주 세포 내에서 생산되거나, 배양 배지 내로 분비(또는 수송)될 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 단백질은 배양 배지 내로 생산(분비)된다. 예를 들어, 단백질 생산의 증가는 예를 들어 모체 세포와 비교하여 더 높은 최대 수준의 단백질 또는 효소 활성(예를 들어, 프로테아제 활성, 아밀라제 활성, 풀루라나제 활성, 셀룰라제 활성 등), 또는 생산된 총 세포외 단백질로서 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형" 및 "유전자 변형"은 상호교환적으로 사용되며, 다음을 포함한다: (a) 유전자(또는 이의 ORF)에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, 또는 유전자 또는 이의 ORF의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, (b) 유전자 파괴, (c) 유전자 전환, (d) 유전자 결실, (e) 유전자의 하향조절, (f) 특이적 돌연변이유발, 및/또는 (g) 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 유전자의 무작위 돌연변이유발.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 분자로부터 유래된 센스 RNA(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적 축적을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 나타낼 수 있다. 따라서, 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형, 분비 등을 포함하는(이에 한정되지 않음), 폴리펩티드의 생산에 관여된 임의의 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열들이 결합된 것을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열(예를 들어, ORF)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 암호화 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있는 경우) 해당 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 암호화 서열은 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 분비 리더(즉, 신호 펩티드)를 암호화하는 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우에 해당 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미칠 경우 해당 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이면서 리딩 단계에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 유전자의 단백질 암호화 서열에 연결된 관심 유전자(또는 이의 오픈 리딩 프레임)의 발현을 제어하는 기능적 프로모터 서열"은, 바실러스 종 세포에서 암호화 서열의 전사 및 번역을 제어하는 프로모터 서열을 지칭한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 5' 프로모터(또는 5' 프로모터 영역 또는 탠덤 5' 프로모터 등)를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 프로모터 영역은 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, ORF)에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "적합한 조절 서열"은 암호화 서열의 업스트림(5' 비암호화 서열), 암호화 서열 내, 또는 암호화 서열의 다운스트림(3' 비암호화 서열)에 위치하며 관련 암호화 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(ORF), 또는 이의 유전자, 또는 이의 벡터 등을 "박테리아 세포 내로 도입" 또는 "바실러스 세포 내로 도입"과 같은 어구에서 사용되는 용어 "도입"은 원형질체 융합, 천연 또는 인공 형질전환(예: 염화칼슘, 전기천공), 형질도입, 형질감염, 접합 등을 포함하여(이에 한정되지 않음), 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하기 위한 당업계에 알려진 방법을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 세포가 형질전환되었음을 의미한다. 형질전환은 일반적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, ORF, 또는 유전자)을 세포에 삽입함으로써 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종성 뉴클레오티드 서열(즉, 형질전환될 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 서열)일 수 있다. 따라서, 형질전환은 일반적으로 외인성 DNA를 숙주 세포에 도입하여 DNA가 염색체 통합체 또는 자가 복제성 염색체외 벡터로서 유지되도록 하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환 DNA", "형질전환 서열", 및 "DNA 구성체"는 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 데 사용되는 DNA를 지칭한다. 형질전환 DNA는 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 데 사용되는 DNA이다. 이러한 DNA는 PCR 또는 임의의 다른 적합한 기술에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환 DNA는 유입 서열을 포함하는 반면, 다른 구현예에서는 상동성 박스에 의해 플랭킹된 유입 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형질전환 DNA는 말단에 추가된 다른 비상동성 서열(즉, 스터퍼 서열 또는 플랭크)을 포함한다. 말단은 형질전환 DNA가 예를 들어 벡터 내 삽입과 같이 닫힌 원을 형성하도록 닫힐 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴" 또는 "유전자 파괴"는 상호교환적으로 사용되며, 숙주 세포가 기능적 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 생산하는 것을 실질적으로 방지하는 임의의 유전자 변형을 광범위하게 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 파괴는 프레임시프트 돌연변이, 조기 정지 코돈(즉, 기능적 단백질이 만들어지지 않음), 단백질의 활성을 제거하거나 감소시키는 치환, 내부 결실(즉, 기능적 단백질이 만들어지지 않음), 암호화 서열을 파괴하는 삽입, 전사에 필요한 천연 프로모터와 오픈 리딩 프레임 사이의 작동가능한 연결을 제거하는 돌연변이 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유입 서열"은 바실러스 종 염색체 내로 도입되는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유입 서열은 DNA 구성체의 일부이다. 다른 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 관심 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유입 서열은 형질전환될 세포의 게놈에 이미 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 서열을 포함한다(즉, 상동성 서열이거나 이종성 서열일 수 있음). 일부 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 관심 단백질, 유전자, 및/또는 돌연변이되었거나 변형된 유전자를 암호화한다. 대안적인 구현예에서, 유입 서열은 기능적 야생형 유전자 또는 오페론, 기능적 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비기능적 유전자 또는 오페론을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전자의 기능을 파괴하기 위해 비기능적 서열이 유전자에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 유입 서열은 선택 마커를 포함한다. 추가 구현예에서, 유입 서열은 2개의 상동성 박스를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 박스"는 숙주 세포 염색체 내의 서열에 대해 상동성인 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상동성 박스는 본 발명에 따라 결실, 파괴, 비활성화, 하향조절 등이 될 유전자 또는 유전자의 일부의 인접 플랭킹 암호화 영역과 약 80% 내지 100%의 서열 동일성, 약 90% 내지 100%의 서열 동일성, 또는 약 95% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 업스트림 또는 다운스트림 영역이다. 이러한 서열은 DNA 구성체가 염색체에서 어느 위치에 통합되는지를 지시하고, 염색체의 어느 부분이 유입 서열에 의해 대체되는지를 지시한다. 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니지만, 상동성 박스는 약 1 염기쌍(bp) 내지 200 킬로염기(kb)를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상동성 박스는 약 1 bp 내지 10.0 kb; 1 bp 내지 5.0 kb; 1 bp 내지 2.5 kb; 1 bp 내지 1.0 kb, 및 0.25 kb 내지 2.5 kb를 포함한다. 상동성 박스는 또한 약 10.0 kb, 5.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb, 1.0 kb, 0.5 kb, 0.25 kb, 및 0.1 kb를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커의 5' 및 3' 말단은 상동성 박스에 의해 플랭킹되고, 상동성 박스는 유전자의 암호화 영역을 바로 플랭킹하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선별 마커 암호화 뉴클레오티드 서열"은 숙주 세포에서 발현할 수 있고 선별 마커의 발현이 발현된 유전자를 함유하는 세포에 상응하는 선택 제제의 존재 또는 필수 영양소의 결핍 하에 성장할 수 있는 능력을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선별 마커" 및 "선택 마커"는 숙주 세포에서 발현이 가능한 핵산(예를 들어, 유전자)으로서, 벡터를 함유하는 숙주의 선택을 용이하게 하는 핵산을 지칭한다. 이러한 선별 마커의 예는 항미생물제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "선별 마커"는 숙주 세포가 관심 유입 DNA를 흡수했거나 일부 다른 반응이 일어났다는 표시를 제공하는 유전자를 의미한다. 일반적으로, 선별 마커는 외인성 DNA를 함유하는 세포가 형질전환 동안 외인성 서열을 받지 않은 세포와 구별될 수 있도록 숙주 세포에 항균성 내성 또는 대사 이점을 부여하는 유전자이다.
"상주 선별 마커(residing selectable marker)"는 형질전환될 미생물의 염색체 상에 위치하는 것이다. 상주 선별 마커는 형질전환 DNA 구성체 상의 선별 마커와 상이한 유전자를 암호화한다. 선택 마커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 위에서 나타낸 바와 같이, 마커는 항균성 내성 마커(예를 들어, ampR, phleoR, specR, kanR, eryR, tetR, cmpR, 및 neoR)일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 클로람페니콜 내성 유전자(예를 들어, pC194에 존재하는 유전자, 및 바실러스 리체니포르미스 게놈에 존재하는 내성 유전자)를 제공한다. 이러한 내성 유전자는 본 발명에서, 뿐만 아니라 염색체 통합 카세트 및 통합형 플라스미드의 염색체 증폭과 관련된 구현예에서도 특히 유용하다. 본 발명에 따른 유용한 다른 마커는 세린(예를 들어 serA), 리신(예를 들어 lysA), 트립토판과 같은 영양요구성 마커; 및 검출 마커(예를 들어 β-갈락토시다제)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 숙주 세포 "게놈", 박테리아 (숙주) 세포 "게놈", 또는 바실러스 종 (숙주) 세포 "게놈"은 염색체 유전자 및 염색체외 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드", "벡터", 및 "카세트"는, 일반적으로 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 보통 원형 이중가닥 DNA 분자의 형태인 대개 유전자를 운반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 적절한 3' 비번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구성체로 다수의 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합된, 임의의 공급원 유래의 단일가닥 또는 이중가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형, 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 사용되며 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가 복제성 유전 요소를 형성하는 원형 이중가닥(ds) DNA 구성체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 모세포에 존재하고 딸세포에서 소실된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환 카세트"는 유전자(또는 이의 ORF)를 포함하고 외래 유전자 이외에 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 세포에서 복제(증식)될 수 있고 새로운 유전자 또는 DNA 절편을 세포 내로 운반할 수 있는 임의의 핵산을 지칭한다. 따라서, 이 용어는 상이한 숙주 세포들 간의 전달을 위해 설계된 핵산 구성체를 지칭한다. 벡터는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드, 파지미드(phagemid), 트랜스포존(transposon), 및 인공 염색체, 예컨대 YAC(효모 인공 염색체), BAC(박테리아 인공 염색체), PLAC(식물 인공 염색체) 등을 포함하는데, 이들은 "에피좀"이다(즉, 자율적으로 복제되거나 숙주 생물의 염색체 내에 통합될 수 있음).
"발현 벡터"는 세포에서 이종성 DNA를 통합하고 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 지칭한다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하고 당업자에게 알려져 있다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자가 알고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 카세트" 또는 "발현 벡터"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능케 하는 일련의 명시된 핵산 요소(즉, 전술한 바와 같은 벡터 또는 벡터 요소)를 사용해 재조합적으로 또는 합성에 의해 생성된 핵산 구성체를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편에 통합될 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서도 특히, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 구성체는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소를 또한 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 DNA 구성체는 본원에 정의된 바와 같은 선택 마커 및 비활성화 염색체 또는 유전자 또는 DNA 절편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적화 벡터"는 표적화 벡터가 형질전환되는 숙주 세포의 염색체 내 영역에 대해 상동성이고, 그 영역에서 상동성 재조합을 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 예를 들어, 표적화 벡터는 상동성 재조합을 통해 숙주 세포의 염색체에 돌연변이를 도입하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 추가된 다른 비상동성 서열(즉, 스터퍼 서열 또는 플랭킹 서열)을 포함한다. 말단은 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내 삽입과 같이 닫힌 원을 형성하도록 닫힐 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 모체 B. 리체니포르미스 (숙주) 세포는 하나 이상의 "표적화 벡터"를 도입함으로써 변형(예를 들어, 형질전환)된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관심 단백질" 또는 "POI"는 재조합 숙주 세포에서 발현되는 것이 요망되는 관심 단백질을 의미한다. 특정 양태에서, 변형된 숙주 세포는 동일한 POI를 발현하는 대조군 세포에 비해 증가된 수준으로 POI를 발현한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, POI는 효소, 기질-결합 단백질, 표면-활성 단백질, 구조 단백질, 수용체 단백질 등일 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 대조군 세포에 비해 증가된 양의 이종성 POI를 생산한다. 특정 구현예에서, 변형된 세포에 의해 생산된 POI의 증가된 양은 대조군 세포에 비해 적어도 약 0.5% 내지 1.0% 증가(또는 그 이상)된 것이다.
어구 "관심 유전자"("GOI"로 약칭)는 관심 단백질(POI)을 암호화하는 핵산(유전자, ORF, 폴리뉴클레오티드)을 언급할 때 본원에서 사용될 수 있다. "관심 단백질(POI)"을 암호화하는 "관심 유전자(GOI)"는 자연 발생적 유전자, 돌연변이 유전자, 또는 합성 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 길이의 중합체를 지칭한다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 본원에서 사용된다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산이 개재될 수 있다. 폴리펩티드라는 용어는 자연적으로 변형되었거나, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지 성분과의 접합과 같은 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예컨대, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드도 정의에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자는 상업적으로 관련된 산업적 관심 단백질, 예컨대 효소(예를 들어, 아세틸 에스테라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라비나제, 아라비노푸라노시다제, 탄산무수화효소, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 키모신, 큐티나제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라제, 에스테라제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, α-글루카나제, 글루칸 라이사제, 엔도-β-글루카나제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, α-글루코시다제, β-글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글리코실 하이드롤라제, 헤미셀룰라제, 헥소스 옥시다제, 하이드롤라제, 인버타제, 이소머라제, 라카제, 리파제, 리아제, 만노시다제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 펙틴 데폴리머라제, 펙틴 메틸 에스테라제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라제, 폴리올 옥시다제, 퍼옥시다제, 페놀옥시다제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 펩티다제, 람노-갈락투로나제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나제, 자일라나제, 헥소스 옥시다제, 및 이들의 조합)를 암호화한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리펩티드는, 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환, 추가, 또는 결실에 의해 모체(또는 기준) 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체 폴리펩티드는 적은 수의 아미노산 잔기만큼 모체 폴리펩티드와 상이할 수 있으며, 모체(기준) 폴리펩티드와의 일차 아미노산 서열 상동성/동일성 수준에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 모체(기준) 폴리펩티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리뉴클레오티드는 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, "변이체 폴리뉴클레오티드"는 모체 폴리뉴클레오티드와 명시된 정도의 서열 상동성/동일성을 갖거나, 엄격한 혼성화 조건하에 모체 폴리뉴클레오티드(또는 이의 상보체)와 혼성화된다. 바람직하게는, 변이체 폴리뉴클레오티드는 모체(기준) 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"는 핵산 서열에서의 임의의 변화 또는 변경을 나타낸다. 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 침묵 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이, 스플라이싱 돌연변이 등을 포함하는 여러 가지 유형의 돌연변이가 존재한다. 돌연변이는 특이적으로(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발을 통해) 또는 무작위로(예를 들어, 화학작용제, 복구 결핍된 박테리아 균주를 통한 계대배양을 통해) 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 이의 서열의 맥락에서, 용어 "치환"은 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체(즉, 치환)하는 것을 의미한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 자연적 위치에 있는 유전자를 지칭한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종성" 유전자, "비내인성" 유전자, 또는 "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로는 발견되지 않고 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자(또는 ORF)를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외래" 유전자(들)는 비천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자(또는 ORF) 및/또는 천연 또는 비천연 유기체 내로 삽입된 키메라 유전자를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종성 제어 서열"은 자연에서는 관심 유전자의 발현을 조절하는(제어하는) 기능을 하지 않는 유전자 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)을 나타낸다. 일반적으로, 이종성 핵산 서열은 이들이 존재하는 세포 또는 게놈의 일부에 대해 내인성이 아니며(천연이 아니며), 감염, 전달감염, 형질전환, 미세주입, 전기천공 등에 의해 세포에 부가되었다. "이종성" 핵산 구성체는 천연 숙주 세포에서 발견되는 조절 서열/DNA 암호화 서열의 조합과 동일하거나 이와는 상이한 조절 서열/DNA 암호화(ORF) 서열의 조합을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 성숙한 단백질 또는 전구체 형태의 단백질의 분비 또는 직접 수송에 참여할 수 있는 아미노산 잔기의 서열을 지칭한다. 신호 서열은 일반적으로 전구체 또는 성숙 단백질 서열의 N-말단에 위치한다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 일반적으로 성숙 단백질에 존재하지 않는다. 신호 서열은 일반적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다.
용어 "유래된"은 용어 "기인된", "수득된", "수득 가능한" 및 "생성된"을 포함하며, 일반적으로 하나의 명시된 물질 또는 조성물의 기원이 또 다른 명시된 물질 또는 조성물에서 발견되거나, 또 다른 명시된 물질 또는 조성물을 참조하여 기술될 수 있는 특징을 가진다는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련된다. 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 상동성일 경우, 이는 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 한층 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%의 "동일성 정도"를 갖는 것을 의미한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 본원에서 정의된 바와 같이 상동성이 되기에 충분히 높은 정도의 동일성을 갖는지 여부는 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 GCG 프로그램 패키지로 제공되는 "GAP"(Program Manual for the Wisconsin Package, 버전 8, 1994년 8월, [53711] 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))을 사용하여 두 서열을 정렬함으로써 적절히 조사할 수 있다(문헌[Needleman and Wunsch, 1970]). DNA 서열 비교를 위하여 하기 설정을 갖는 GAP를 사용한다: 5.0의 GAP 생성 페널티 및 0.3의 GAP 연장 페널티.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성 백분율(%)"은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열들 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬할 때, 이들 사이의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동일성 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비생산성(specific productivity)"은 주어진 기간에 걸쳐 시간당 세포당 생산된 단백질의 총량이다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "정제된", "단리된" 또는 "풍부화된"이라는 용어는, 생체분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이들과 결합되어 있는 자연 발생 구성 성분 중 일부 또는 전부로부터 분리됨으로써 이의 자연 상태로부터 변경되는 것을 의미한다. 이러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 바람직하지 않은 전체 세포, 세포 잔여물, 불순물, 외부 단백질, 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에 의한 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기술에 의해 달성될 수 있다. 이후, 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "플랭킹 서열"은 논의 중인 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 임의의 서열을 지칭한다(예를 들어, 유전자 A-B-C의 경우, 유전자 B는 A 및 C 유전자 서열에 의해 플랭킹됨). 특정 구현예에서, 유입 서열은 각 측의 상동성 박스에 의해 플랭킹된다. 다른 구현예에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 각 측의 스터퍼 서열에 의해 플랭킹되는 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 플랭킹 서열은 일 측(3' 또는 5')에만 존재하지만, 바람직한 구현예에서는, 플랭킹되는 서열의 각 측에 존재한다. 각각의 상동성 박스의 서열은 바실러스 염색체 내의 서열에 대해 상동성이다. 이러한 서열은 새로운 구성체가 바실러스 염색체에서 어느 위치에 통합되는지를 지시하고, 바실러스 염색체의 어느 부분이 유입 서열에 의해 대체되는지를 지시한다. 다른 구현예에서, 선택 마커의 5' 및 3' 말단은 비활성화 염색체 절편의 섹션을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 플랭킹 서열은 일 측(3' 또는 5')에만 존재하는 반면, 다른 구현예에서는, 플랭킹되는 서열의 각 측에 존재한다.
II.
AMYL
유전자좌의 제2 카피
PRSA
유전자를 발현하면 단백질 생산이 향상된다.
PrsA 단백질을 암호화하는 바실러스 서브틸리스의 prsA 유전자는 초기에 여러 외단백질의 분비를 감소시키는 비치명적 돌연변이로 정의되었다(Kontinen and Sarvas, 1988). PrsA 단백질은 샤페론 역할을 하는 것으로 기술되었으며 세포질막을 가로질러 전위된다(Kontinen et al., 1993). PCT 공개 WO1994/19471호는 그람 양성 박테리아 발현 시스템을 기술한 것으로, B. 서브틸리스 prsA 유전자 암호화 서열(CDS)의 도입된 카피는 다양한 업스트림 프로모터 및 공급원을 사용하여 과발현(과다생산)되었으며, 구체적으로, prsA 단백질의 과다생산이 야생형보다 더 많은 양을 의미함을 명시하고 있다. 마찬가지로, 미국 특허 공개 2010/0255534호는 강력한 업스트림 프로모터에 작동가능하게 연결되고 abrB, dltA, dltB, dltC, dltD , 및 dltE로부터 선택된 하나 이상의 결실되거나 불활성화된 유전자를 포함하는 B. 서브틸리스 prsA 유전자 CDS의 도입된 카피의 과발현을 기술하고 있다. 이러한 공보물에서 결론지어진 바와 같이, 재조합 B. 서브틸리스 균주에서 prsA(PrsA)의 과발현(과다생산)은 도입된 prsA 유전자 과발현 카세트를 포함하지 않은 대조군 B. 서브틸리스 균주에 비해 단백질 생산이 향상되는 결과를 가져왔다. 보다 최근에, PCT 공개 WO2021/146411호에서 catH 유전자좌에 통합된 prsA 유전자의 도입된 카피(제2 카피)를 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 균주가 기술되었으며, 여기서 도입된 (제2 카피) prsA 유전자는 천연 prsA 유전자 CDS(예를 들어, 5'-[천연 prsA pro]-[천연 prsA ORF]-3')에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 유전자 프로모터 영역을 포함하였다. 이 공보물에 기술된 바와 같이, catH 유전자좌에 통합된 제2 카피 prsA 카세트를 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 균주는 대조군 B. 리체니포르미스 균주에 비해 증가된 양의 리포터 단백질을 생산하였다.
위에서 일반적으로 제시된 바와 같이, 조절되거나 가변적인 prsA 유전자 발현 수준의 이러한 대조적인 결과는 프로모터 및 유전자좌의 선택이 사소하지 않음을 나타낸다. 특히, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 출원인은 아밀라제 리포터 단백질(표 1, 두 번째 열)을 발현하고 도입된 제2 카피 prsA 유전자 카세트(표 1, 첫 번째 열)를 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 균주를 스크리닝하였다.
| 제2 카피 prsA 유전자 카세트 | 상대적 Amy 활성(+/- 표준 편차) |
| 5′-[prsA pro]-[prsA CDS]-3′ | 1.00 ±0.02 |
| 5′-[het pro_1]-[prsA CDS]-3′ | 0.87 ±0.02 |
| 5′-[het pro_2]-[prsA CDS]-3′ | 0.95 ±0.00 |
| 5′-[het pro_3]-[prsA CDS]-3′ | 0.93 ±0.02 |
| 5′-[het pro_4]-[prsA CDS]-3′ | 0.71 ±0.01 |
예를 들어, 상기 표 1에 제시된 바와 같이, 이종성 프로모터(예를 들어, 이종성 프로모터(pro) 1-4; "5'-[het pro_1]"로 약칭 등)의 제어 하에 2차 카피 prsA 유전자 CDS를 발현하는 재조합 B. 리체니포르미스 균주의 단백질 생산성(아밀라제 활성)을 천연 프로모터(즉, 5′-[prsA pro])의 제어 하에 제2 카피 prsA 유전자 CDS를 발현하는 재조합 균주의 단백질 생산성과 비교하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 천연 prsA 프로모터의 제어 하에 제2 카피 prsA 유전자 CDS를 발현하는 균주의 생산성과 비교할 때, 이종성 프로모터의 제어 하에 제2 카피 prsA 유전자 CDS를 발현하는 균주에서 단백질 생산성이 감소되었으며, 이는 prsA 유전자 CDS의 발현을 유도하기 위한 프로모터 영역의 선택/선별이 사소하거나 쉽게 예측가능한 일이 아님을 추가로 입증한다.
보다 구체적으로, 이후에 기술되고 하기 실시예에서 제시되는 바와 같이, 출원인은 놀랍게도, 최적화되고 정의된 B. 리체니포르미스 유전자좌에 통합된 prsA 발현 카세트의 도입된 제2 카피를 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 세포가 B. 리체니포르미스 catH 유전자좌에 통합된 prsA 발현 카세트의 동일한 도입된 제2 카피를 포함하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 리포터 단백질을 생산할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 특정 양태는 본원에서 기술되고 고려되는 하나 이상의 B. 리체니포르미스 게놈 유전자좌를 표적화하고 통합하도록 특이적으로 설계된 prsA 통합(발현) 구성체에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 아래 제시된 실시예 1 및 2는 일반적으로, 정의된 B. 리체니포르미스 게놈 유전자좌에서 표적화 prsA 유전자 통합(제2 카피)에 적합한 플라스미드의 설계 및 구성, 테스트에 적합한 재조합 B. 리체니포르미스 균주의 설계 및 구성, 및 제2 카피 prsA 통합 카세트의 스크리닝 등을 기술한다. 특히, 실시예 1 및 2에 일반적으로 기술된 바와 같이, prsA(통합) 카세트의 도입된 제2 카피를 포함하는 B. 리체니포르미스 세포를 구성하였고, prsA 카세트는 catH 유전자좌 또는 amyL 유전자좌에 통합되었다.
실시예 3에 기술된 바와 같이, 리포터 단백질(Amy1)을 암호화하는 발현 카세트를 B. 리체니포르미스 균주 BF613(catH 유전자좌에 통합된 prsA 카세트 함유) 및 B. 리체니포르미스 균주 ZM1325(amyL 유전자좌에 통합된 prsA 카세트 함유)에 도입하였다. 예를 들어, 표 6(실시예 3)에 나타낸 바와 같이, 2개의 Amy1 생산 균주(LDN665 및 ZM1351)를 표준 소규모 조건을 사용하여 Amy1의 생산에 대해 분석하였고, 이는 catH 유전자좌에 통합된 제2 카피 prsA 카세트를 포함하는 균주(LDN665)에 비해 amyL 유전자좌에 통합된 제2 카피 prsA 카세트를 포함하는 균주(ZM1351)에서 Amy1 생산의 향상을 입증한다.
실시예 4에 추가로 기술된 바와 같이, 제2 아밀라제 리포터 단백질(Amy2)을 암호화하는 발현 카세트를 B. 리체니포르미스 균주 BF613 및 ZM1325에 도입하였다. 예를 들어, 표 7(실시예 4)에 나타낸 바와 같이, 2개의 Amy2 생산 균주(WAAA57 및 WAAA197)를 표준 소규모 조건을 사용하여 Amy2의 생산에 대해 분석하였고, 이는 catH 유전자좌에 통합된 제2 카피 prsA 카세트를 포함하는 균주(WAAA57)에 비해 amyL 유전자좌에 통합된 제2 카피 prsA 카세트를 포함하는 균주(WAAA197)에서 Amy2 생산의 향상을 입증한다.
따라서, 본 발명의 특정 양태는 본원에 기술된 prsA 유전자 CDS에 대한 서열 상동성을 포함하는 prsA 유전자 암호화 서열(CDS), 및/또는 본원에 기술된 prsA 유전자 프로모터 서열에 대한 상동성을 포함하는 prsA 유전자 프로모터 서열에 관한 것이다. 특정 관련 양태에서, prsA 유전자 CDS는 활성(기능적) PrsA 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, prsA 유전자 CDS는 서열번호 43의 성숙 PrsA 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%의 동일성을 갖는 PrsA 단백질을 암호화한다. 특정 양태에서, 서열번호 43의 PrsA 단백질에 대해 적어도 약 50%의 동일성을 포함하는 PrsA 단백질은 기능적 또는 활성 PrsA 단백질로서 추가로 정의된다.
III.
재조합 폴리뉴클레오티드와 분자생물학
상기 및 이하에 일반적으로 기술된 바와 같이, 본 발명의 특정 양태는 관심 단백질을 생산하는 재조합 바실러스 균주에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 하기 실시예에 제시된 바와 같이, 재조합 폴리뉴클레오티드(벡터, 발현 카세트 등), 재조합(변형) 바실러스 균주 등은 당업자에게 알려진 통상적인 분자 생물학 및 미생물학 기술 및 방법을 사용하여 쉽게 구성된다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 재조합 유전학 분야의 통상적인 기술에 의존한다. 본 발명의 일반적인 사용 방법을 개시하고 있는 기본 문서는 문헌[Sambrook et al., (2nd Edition, 1989); Kriegler (1990) 및 Ausubel et al., (1994)]을 포함한다. 마찬가지로, 당업자는 폴리뉴클레오티드 서열을 박테리아 세포(예를 들어, E. 콜라이, 바실리 등)에 도입하기 위한 적합한 방법을 잘 알고 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 특히, 정의된 유전자좌에 통합된 prsA 발현 카세트의 도입된 제2 카피를 포함하는 재조합 바실러스 세포, 관심 단백질을 생산하고 정의된 유전자좌에 통합된 prsA 발현 카세트의 도입된 제2 카피를 포함하는 재조합 바실러스 세포의 설계 및 구성을 위한 조성물 및 방법, 증가된 양의 관심 단백질을 생산하기 위한 조성물 및 방법 등을 제공한다.
특정 구현예에서, prsA 유전자 암호화 서열(CDS)은 서열번호 30의 DNA 서열에 대한 상동성을 포함한다. 예를 들어, 특정 양태에서, prsA 유전자 CDS는 서열번호 30의 prsA 유전자 CDS에 대해 적어도 약 50%의 동일성을 포함한다. 특정 양태에서, prsA 유전자 CDS는 서열번호 30의 prsA 유전자 CDS에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 및 적어도 100%의 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, prsA 유전자 CDS는 서열번호 30의 prsA 유전자에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 포함한다.
다른 특정 양태에서, prsA 유전자 프로모터 서열은 서열번호 29의 DNA 서열에 대한 상동성을 포함한다. 예를 들어, 특정 양태에서, prsA 유전자 프로모터는 서열번호 29의 prsA 유전자 프로모터에 대해 적어도 약 50%의 동일성을 포함한다. 특정 양태에서, prsA 유전자 프로모터는 서열번호 29의 prsA 유전자 프로모터에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 및 최대 100%의 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, prsA 유전자 프로모터는 서열번호 29의 prsA 유전자 프로모터에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 포함한다.
따라서 본 발명의 특정 양태는 재조합 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 플라스미드, 벡터, DNA 구성체 등), 재조합 숙주 세포, prsA 유전자 CDS의 제2 카피를 암호화하는 발현 카세트, 재조합 폴리뉴클레오티드를 구성하기 위한 조성물 및 방법, 재조합 바실러스 숙주 세포 등에 관한 것이다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(유전자, 벡터, 플라스미드, DNA 요소 등)는 유전적으로 변형될 수 있으며, 유전자 변형은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: (a) 유전자(또는 이의 ORF)에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, 또는 유전자 또는 이의 ORF의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, (b) 유전자 파괴, (c) 유전자 전환, (d) 유전자 결실, (e) 유전자의 하향조절(예를 들어, 간섭 RNA), (f) 특이적 돌연변이유발, 및/또는 (g) 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 유전자의 무작위 돌연변이유발. 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, 삽입, 파괴, 대체, 또는 결실)을 사용하여 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 유전자의 발현을 감소(또는 제거)함으로써 구성된다. 변형 또는 비활성화 대상인 유전자 부분은 예를 들어 암호화 영역(CDS, ORF)이거나 암호화 영역의 발현에 필요한 조절(DNA) 요소일 수 있다. 이러한 조절 또는 제어 서열의 예는 프로모터 서열 또는 이의 기능적 부분(즉, 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기에 충분한 부분)일 수 있다. 변형을 위한 다른 제어 서열은 리더 서열, 프로-펩티드 서열, 신호 서열, 전사 종결자 서열, 전사 활성자 서열 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
유전자 결실 기술은 유전자(들)를 부분적으로 또는 완전하게 제거하여, 이들의 발현이 제거되거나 비기능적(또는 활성이 감소된) 단백질 산물이 발현되도록 할 수 있다. 이러한 방법에서, 유전자(들)의 결실은 유전자를 플랭킹하는 5' 및 3' 영역을 인접하여 포함하도록 구성된 플라스미드를 사용하는 상동성 재조합에 의해 달성될 수 있다. 인접한 5' 및 3' 영역은 예를 들어 pE194와 같은 온도 감수성 플라스미드 상에서, 플라스미드가 세포에서 확립될 수 있게 하는 허용 온도에서 제2 선별 마커와 함께 바실러스 세포에 도입될 수 있다. 그런 다음, 플라스미드를 상동성 플랭킹 영역 중 하나에서 염색체에 통합시키는 세포를 선택하기 위해 허용되지 않는 온도로 세포를 이동시킨다. 플라스미드의 통합에 대한 선택은 제2 선별 마커에 대한 선택에 의해 수행된다. 통합 후, 선택 없이 여러 세대 동안 허용 온도로 세포를 이동시킴으로써 제2 상동성 플랭킹 영역에서의 재조합 이벤트가 자극된다. 세포를 플레이팅하여 단일 콜로니를 수득하고, 두 선별 마커의 손실에 대해 콜로니를 검사한다. 따라서, 당업자는 전체 또는 부분 결실에 적합한 유전자의 암호화 서열 및/또는 유전자의 비암호화 서열의 뉴클레오티드 영역을 쉽게 확인할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 유전자 또는 이의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거에 의해 구성된다.
특정 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 CRISPR-Cas9 편집을 통해 구성된다. 예를 들어, 천연 관심 단백질(또는 이의 기능적 변이체 관심 단백질)을 암호화하는 야생형 유전자는, DNA 상의 표적 서열에 엔도뉴클레아제를 보충하는 가이드 RNA(예를 들어, Cas9) 및 Cpf1 또는 가이드 DNA(예를 들어, NgAgo)에 결합함으로써 표적 DNA를 찾아내는 핵산 가이드된 엔도뉴클레아제에 의해 CRISPR-Cas9 편집을 통해 변형될 수 있고, 엔도뉴클레아제는 DNA에서 단일가닥 또는 이중가닥 절단을 생성할 수 있다. 이 표적화된 DNA 절단은 DNA 복구를 위한 기질이 되며 제공된 편집 주형(예를 들어, 천연 유전자 프로모터 서열을 이종성 프로모터로 대체하기 위한 편집 주형)과 재결합할 수 있다. 예를 들어, 핵산 가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자(이 목적의 경우, S. 피오게네스로부터의 Cas9) 또는 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 코돈 최적화된 유전자는 바실러스 세포에서 활성이 있는 프로모터 및 바실러스 세포에서 활성이 있는 종결자에 작동가능하게 연결됨으로써, 바실러스 Cas9 발현 카세트를 생성한다. 마찬가지로, 관심 유전자에 대해 고유한 하나 이상의 표적 부위가 당업자에 의해 쉽게 확인된다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 사용하여 관심 유전자 내의 표적 부위로 지시된 gRNA를 암호화하는 DNA 구성체를 구성하기 위해, 가변 표적화 도메인(VT)은 프로토-스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'인 표적 부위의 뉴클레오티드(NGG)를 포함할 것이며, 이 뉴클레오티드는 S. 피오게네스 Cas9에 대한 Cas9 엔도뉴클레아제 인식 도메인(CER)을 암호화하는 DNA에 융합된다. VT 도메인을 암호화하는 DNA와 CER 도메인을 암호화하는 DNA의 조합은 이에 따라 gRNA를 암호화하는 DNA를 생성한다. 따라서, gRNA를 암호화하는 DNA를 바실러스 세포에서 활성이 있는 프로모터 및 바실러스 세포에서 활성이 있는 종결자에 작동가능하게 연결함으로써 gRNA에 대한 바실러스 발현 카세트가 생성된다.
특정 구현예에서, 엔도뉴클레아제에 의해 유도된 DNA 절단은 유입 서열로 복구/대체된다. 예를 들어, 상기 Cas9 발현 카세트 및 gRNA 발현 카세트에 의해 생성된 DNA 절단을 정확하게 복구하기 위해, 세포의 DNA 복구 기구가 편집 주형을 이용할 수 있도록 뉴클레오티드 편집 주형이 제공된다. 예를 들어, 표적화된 유전자의 5'에 있는 약 500-bp가 표적화된 유전자의 3'에 있는 약 500-bp에 융합되어 편집 주형을 생성할 수 있고, 이 주형은 바실러스 숙주의 기구에 의해 사용되어 RGEN에 의해 생성된 DNA 절단을 복구한다. Cas9 발현 카세트, gRNA 발현 카세트, 및 편집 주형은 다양한 방법을 사용하여 세포에 공동으로 전달될 수 있다. 형질전환된 세포는 정방향 및 역방향 프라이머로 유전자좌를 증폭시켜 표적 유전자좌를 PCR 증폭함으로써 스크리닝된다. 이러한 프라이머는 야생형 유전자좌 또는 RGEN에 의해 편집된 변형된 유전자좌를 증폭시킬 수 있다. 이후 시퀀싱 프라이머를 사용하여 이들 단편을 시퀀싱하여, 편집된 콜로니를 식별한다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 당업계에 잘 알려진 방법(화학적 돌연변이유발 및 전위를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 사용하여 무작위 또는 특이적 돌연변이유발에 의해 구성된다. 유전자의 변형은 모세포에 대한 돌연변이유발 및 유전자의 발현이 변경된 돌연변이 세포에 대한 스크리닝에 의해 수행될 수 있다. 특이적 또는 무작위적일 수 있는 돌연변이유발은 예를 들어 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 사용, 적합한 올리고뉴클레오티드의 사용, 또는 DNA 서열에 대한 PCR 생성 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 또한, 돌연변이유발은 이들 돌연변이유발 방법의 임의의 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 예는 자외선(UV) 조사, 하이드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG), O-메틸 하이드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 설포네이트(EMS), 아황산수소나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 제제가 사용되는 경우, 돌연변이 유발은 일반적으로, 돌연변이 대상 모세포를 적합한 조건에서 선택 돌연변이 유발제의 존재하에 인큐베이션하고, 유전자의 발현이 감소되거나 나타나지 않는 돌연변이 세포를 선택함으로써 수행된다.
국제 PCT 공개 WO2003/083125호는 E. 콜라이를 우회하는 PCR 융합을 사용한 바실러스 결실 균주 및 DNA 구성체의 생성과 같은 바실러스 세포의 변형 방법을 개시한다. PCT 공개 WO2002/14490호는 (1) 통합 플라스미드(pComK)의 구성 및 형질전환, (2) 암호화 서열, 신호 서열, 및 프로펩티드 서열의 무작위 돌연변이유발, (3) 상동성 재조합, (4) 형질전환 DNA에 대한 비상동성 플랭크의 추가에 의한 형질전환 효율 증대, (5) 이중 교차(cross-over) 통합의 최적화, (6) 부위 지정 돌연변이유발, 및 (7) 마커가 없는(marker-less) 결실을 포함하는, 바실러스 세포의 변형 방법을 개시한다. 당업자는 폴리뉴클레오티드 서열을 박테리아 세포(예를 들어, E. 콜라이 및 바실러스)에 도입하기 위한 적합한 방법을 잘 알고 있다. 실제로, 원형질체 형질전환과 응축(congression)을 포함하는 형질전환, 형질도입, 및 원형질체 융합과 같은 방법이 알려져 있으며 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 DNA 구성체를 숙주 세포에 도입하는 데 형질전환 방법이 특히 바람직하다.
일반적으로 사용되는 방법에 추가적으로, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 직접 형질전환된다(즉, 숙주 세포에 도입되기 전에 DNA 구성체의 증폭 또는 다른 처리를 위해 중간 세포가 사용되지 않음). DNA 구성체를 숙주 세포에 도입하는 것은 DNA를 플라스미드 또는 벡터 내 삽입 없이 숙주 세포에 도입하기 위한, 당업계에 알려진 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 이러한 방법은 염화칼슘 침전, 전기천공, 네이키드 DNA, 리포솜 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가 구현예에서, DNA 구성체는 플라스미드 내 삽입 없이 플라스미드와 공동으로 형질전환된다. 추가 구현예에서, 변형된 바실러스 균주로부터 선택 마커가 당업계에 알려진 방법에 의해 결실되거나 실질적으로 절단된다. 일부 구현예에서, 숙주 염색체로부터 벡터를 분해하면 고유 염색체 영역이 제거되면서 염색체에 플랭킹 영역을 남긴다.
바실러스 세포에서 유전자, 이의 오픈 리딩 프레임(ORF), 및/또는 이의 변이체 서열의 발현에 사용하기 위한 프로모터 및 프로모터 서열 영역은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 프로모터 서열은 일반적으로 바실러스 세포에서 기능적이도록 선택되며, 자연 발생 프로모터 서열, 합성 프로모터 서열, 및/또는 이의 프로모터 서열 조합 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다(프로모터(서열)는 바실러스 세포에서 작동가능/기능적이다. 바실러스 세포에서 이종(외부) 단백질을 생산할 수 있는 합성(조작된) 프로모터의 예는 문헌[Zhou et al. (2019), Wang et al. (2019) and Castillo-Hair et al. (2019)]에 기술된 프로모터 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 다른 특정 바실러스 프로모터 서열에는 B. 서브틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE) 프로모터, B. 서브틸리스의 α-아밀라제 프로모터, B. 아밀로리퀘파시엔스의 α-아밀라제 프로모터, B. 서브틸리스로부터의 중성 프로테아제(nprE) 프로모터, 돌연변이체 aprE 프로모터(예를 들어, PCT 공개 WO2001/51643호), B 리체니포르미스 tuf 프로모터, B 리체니포르미스 citZ 프로모터, 또는 바실러스 종 세포로부터의 임의의 다른 기능적 프로모터가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 이종성 프로모터를 사용하여 관심 단백질 또는 prsA 유전자 CDS의 발현을 유도한다. 바실러스 세포에서 다양한 활성(프로모터 강도)을 갖는 프로모터 라이브러리를 스크리닝하고 생성하는 방법은 PCT 공개 WO2003/089604호에 기재되어 있다.
IV.
관심 단백질 생산을 위한
바실러스
세포의 발효
특정 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질을 생산하는 재조합 미생물 세포를 제공한다. 보다 구체적으로, 특정 양태는 관심 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유전적으로 변형된(재조합) 미생물 세포에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예는 관심 단백질의 생산을 위한 미생물 세포의 성장, 배양, 발효 등에 관한 것이다. 일반적으로, 당업계에 잘 알려져 있는 발효 방법이 미생물 세포를 발효시키는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 세포는 회분식 또는 연속식 발효 조건하에 성장시킨다. 전형적인 회분식 발효는 배지의 조성이 발효 시작시 설정되어 발효 중에 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효 시작시, 배지에 목적하는 유기체(들)를 접종한다. 이 방법에서는, 시스템에 어떤 구성요소도 첨가하지 않고 발효가 일어날 수 있다. 일반적으로, 회분식 발효는 탄소원의 추가와 관련하여 "회분식"으로 간주되며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하려는 시도가 종종 이루어진다. 회분식 시스템의 대사산물 및 바이오매스의 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 회분식 배양물 내에서, 세포는 정적 지체기를 거쳐 고성장 대수기로 진행하고, 최종적으로 성장 속도가 감소하거나 성장이 멈추는 정지기로 진행된다. 정지기의 세포는 처치되지 않으면 결국 사멸한다. 일반적으로, 대수기의 세포가 대부분의 제품 생산을 담당한다.
표준 회분식 시스템에 대한 적절한 변형은 "유가식 발효(fed-batch fermentation)" 시스템이다. 일반적인 회분식 시스템의 이러한 변형에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분으로 추가된다. 유가식 시스템은 이화대사물 억제가 세포의 대사를 억제할 가능성이 있는 경우 및 배지에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도는 측정이 어렵기 때문에, pH, 용존 산소량, 및 CO2와 같은 폐가스의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 추정된다. 회분식 및 유가식 발효는 일반적이며 당업계에 잘 알려져 있다.
연속식 발효는 규정 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고 동량의 조정된(conditioned) 배지가 프로세싱을 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로, 세포가 주로 대수기 성장 중인 배양물을 일정한 고밀도로 유지한다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 생성물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절이 가능하다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소가 고정 비율로 유지되고 다른 모든 파라미터는 조절될 수 있다. 다른 시스템에서, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 반면, 성장에 영향을 미치는 여러 인자는 계속 변경될 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도와 균형을 이루어야 한다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
배양/발효는 일반적으로 수성 미네랄 염 배지, 유기 성장 인자, 탄소 및 에너지 공급원 물질, 분자 산소, 그리고 물론, 사용되는 미생물 숙주의 개시 접종원을 포함하는 성장 배지에서 이루어진다.
탄소 및 에너지 공급원, 산소, 동화성 질소, 및 미생물 접종원 이외에도, 적절한 미생물 성장을 확실하게 하기 위하여, 미생물 전환 공정에서 세포에 의한 탄소 및 에너지 공급원의 동화를 최대화하고 발효 배지에서 최대 세포 밀도로 최대 세포 수율을 달성하기 위하여, 적절한 양의 미네랄 영양소를 적당한 비율로 공급하는 것이 필수적이다.
수성 미네랄 배지의 조성은 당업계에 알려진 바와 같이, 부분적으로는 사용되는 미생물 및 기질에 따라, 넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 미네랄 배지는 질소 이외에도, 적절한 양의 인, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 황, 및 나트륨을 적절한 가용성의 동화성 이온 형태 및 조합 형태로 포함해야 하고, 또한, 바람직하게는 일부 미량 원소, 예컨대, 구리, 망간, 몰리브덴, 아연, 철, 붕소, 및 요오드 등이 역시 적절한 가용성의 동화성 형태로 존재해야 하며, 모두 당업계에 알려진 바와 같다.
발효 반응은 미생물 종이 번성하는 식으로 성장하도록 돕는 데 효과적인, 적절한 산소 부분압으로 발효 용기의 내용물을 유지하도록 제공된, 분자 산소를 함유하는 기체, 예컨대, 공기, 산소가 풍부한 공기, 또는 심지어 실질적으로 순수한 분자 산소에 의해 필요한 분자 산소가 공급되는 호기성 과정이다.
발효 온도는 다소 다를 수 있지만 대부분의 미생물 세포의 경우 온도는 일반적으로 약 20℃ 내지 40℃ 범위내일 것이다.
미생물은 또한, 동화성 질소의 공급원을 필요로 한다. 동화성 질소의 공급원은 임의의 질소 함유 화합물 또는 미생물에 의한 대사 이용에 적합한 형태로 질소를 방출할 수 있는 화합물일 수 있다. 단백질 가수분해물과 같은 다양한 유기 질소원 화합물이 이용될 수 있지만, 통상 값싼 질소 함유 화합물, 예컨대 암모니아, 수산화암모늄, 우레아, 및 다양한 암모늄염, 예컨대 인산암모늄, 황산암모늄, 피로인산암모늄, 염화암모늄, 또는 다양한 기타 암모늄 화합물이 이용될 수 있다. 암모니아 가스 자체는 대규모 작업에 편리하며, 적당한 양으로 수성 발효물(발효 배지)을 통한 버블링에 의해 이용될 수 있다. 동시에, 이러한 암모니아는 또한, pH 제어를 돕기 위해 이용될 수 있다.
수성 미생물 발효물(발효 혼합물) 내 pH 범위는 약 2.0 내지 8.0의 예시적 범위 내에 있어야 한다. 미생물의 pH 범위에 대한 선호는 이용되는 배지에 어느 정도 의존적일 뿐만 아니라, 특정 미생물에도 의존적이며, 따라서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 바와 같이, 배지의 변화에 따라 다소 변화한다.
바람직하게는, 발효는 탄소 함유 기질이 제한 인자로서 제어될 수 있는 방식으로 수행되어, 탄소 함유 기질의 세포로의 양호한 전환을 제공하며 상당량의 비전환 기질로 세포가 오염되는 것을 방지한다. 후자의 경우 수용성 기질에 따른 문제는 아니며, 그 이유는 임의의 잔존 미량물이 용이하게 세척되기 때문이다. 그러나 비수용성 기질의 경우 이는 문제가 될 수 있으며, 적합한 세척 단계와 같은 추가적인 생성물 처리 단계를 필요로 한다.
전술한 바와 같이, 이 수준에 도달하는 시간은 중요하지 않으며 특정 미생물 및 수행되는 발효 공정에 따라 다를 수 있다. 그러나 발효 배지 내 탄소원 농도 및 목적하는 수준의 탄소원 달성 여부를 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
필요한 경우, 수성 미네랄 배지를 발효기에 공급하기 전에, 일부 또는 모든 탄소원 및 에너지원 물질 및/또는 일부 동화성 질소원, 예컨대 암모니아가 수성 미네랄 배지에 첨가될 수 있다.
반응기 내로 도입된 각각의 스트림은 바람직하게는 소정의 속도로, 또는 탄소 및 에너지 기질의 농도, pH, 용존 산소, 발효기로부터의 오프가스 내 산소 또는 이산화탄소, 건조 세포 중량으로 측정가능한 세포 밀도, 광 투과율 등과 같은 모니터링을 통해 확인가능한 필요성에 따라, 제어된다. 다양한 물질의 공급 속도는, 탄소원 및 에너지원의 효율적 이용과 일치하여, 가능한 한 빠른 세포 성장 속도가 수득되도록, 기질 충전에 대해 가능한 한 높은 수율의 미생물 세포가 수득되도록, 달라질 수 있다.
회분식, 또는 바람직한 유가식 작업에서, 모든 기기, 반응기, 또는 발효 수단, 관(vessel) 또는 용기, 배관, 부수 순환 또는 냉각 장치 등은, 통상 약 121℃에서와 같은 스팀을 적어도 약 15분 동안 이용하여 초기에 멸균된다. 이어서, 멸균된 반응기에 산소를 포함한 모든 필요한 영양소 및 탄소 함유 기질의 존재 하에 선택된 미생물의 배양물을 접종한다. 이용되는 발효기의 종류는 중요하지 않다.
V.
관심 단백질
관심 단백질(POI)은 임의의 내인성 또는 이종성 단백질일 수 있으며, 이는 이러한 POI의 변이체일 수 있다. 단백질은 하나 이상의 이황화 브리지를 함유할 수 있거나, 기능적 형태가 단량체 또는 다량체인 단백질이다. 즉, 단백질은 4차 구조를 가지며, 복수의 동일한(상동성) 또는 동일하지 않은(이종성) 서브유닛으로 구성된다. 특정 양태에서, 본 발명의 재조합 세포는 하나 이상의 내인성 관심 단백질, 하나 이상의 이종성 관심 단백질, 이의 조합 등을 발현/생산한다.
특정 구현예에서, 변형된 세포는 모체 바실러스(또는 대조군) 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산할 수 있고, POI의 증가된 양은 적어도 약 0.01%의 증가, 적어도 약 0.10%의 증가, 적어도 약 0.50%의 증가, 적어도 약 1.0%의 증가, 적어도 약 2.0%의 증가, 적어도 약 3.0%의 증가, 적어도 약 4.0%의 증가, 적어도 약 5.0%의 증가, 또는 5.0% 초과의 증가이다. 특정 양태에서, POI의 증가된 양은 효소 활성 분석, 단백질 기능 분석, 및/또는 특정 생산성(Qp) 분석/정량화 등에 의해 결정된다. 예를 들어, 당업자는 단백질 발현, 생산, 분비 등의 검출, 분석, 측정 등을 위한 당업계에 알려진 통상적인 방법 및 기술을 이용할 수 있다.
특정 구현예에서, POI 또는 이의 변이체 POI는 효소이다. 특정 양태에서, 효소는 아세틸 에스테라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라비나제, 아라비노푸라노시다제, 아릴에스테라제, 탄산무수화효소, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 키모신, 큐티나제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라제, 에스테라제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, α-글루카나제, 글루칸 라이사제, 엔도-β-글루카나제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, α-글루코시다제, β-글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글리코실 하이드롤라제, 헤미셀룰라제, 헥소스 옥시다제, 하이드롤라제, 인버타제, 이소머라제, 라카제, 리가제, 리파제, 리아제, 리소자임, 만노시다제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 펙틴 해중합효소, 펙틴 메틸 에스테라제, 펙틴분해 효소, 퍼하이드롤라제, 폴리올 옥시다제, 퍼옥시다제, 페놀옥시다제, 포스포디에스테라제, 피타제, 폴리에스테라제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 펩티다제, 람노-갈락투로나제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나제, 자일라나제, 헥소스 옥시다제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 양태에서, POI 또는 이의 변이체 POI는 효소 위원회(EC) 번호 EC 1, EC 2, EC 3, EC 4, EC 5, 또는 EC 6으로부터 선택된 효소이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, POI는 옥시도리덕타제 효소이다. 다른 구현예에서, POI는 트랜스퍼라제 효소이다. 다른 구현예에서, POI는 하이드롤라제 효소이다. 다른 구현예에서, POI는 리아제 효소이다. 다른 특정 구현예에서, POI는 이소머라제 효소이다. 또 다른 구현예에서, POI는 리가제 효소이다.
특정 양태에서, 효소는 프로테아제(예를 들어, 중성 프로테아제, 메탈로프로테아제) 및 알칼리성(또는 "세린") 프로테아제이다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리신 단백질(효소)은 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 세린 프로테아제이다. 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 309와 같은 매우 다양한 바실러스 서브틸리신이 확인되었고 시퀀싱되었다. 본 발명의 일부 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 돌연변이(즉, 변이체) 프로테아제를 생산한다. 따라서, 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 프로테아제를 암호화하는 발현 구성체를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 아밀라제를 암호화하는 발현 구성체를 포함한다. 매우 다양한 아밀라제 효소 및 이의 변이체가 당업자에게 알려져 있다.
다른 구현예에서, 변형된 세포에서 발현되고 생산된 POI 또는 변이체 POI는 펩티드, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 부착 분자, 미생물 항원(예를 들어, HBV 표면 항원, HPV E7 등), 이들의 변이체, 이들의 단편 등이다. 다른 유형의 관심 단백질(또는 이의 변이체)은 식품 또는 작물에 영양가를 제공할 수 있는 것일 수 있다. 비제한적인 예는 항영양 인자의 형성을 억제할 수 있는 식물성 단백질, 및 더 바람직한 아미노산 조성(예를 들어, 비형질전환 식물보다 높은 라이신 함량)을 갖는 식물성 단백질을 포함한다.
위에서 간략히 언급한 바와 같이, 세포내 및 세포외 발현 단백질의 활성을 검출하고 측정하기 위한 다양한 분석법이 당업자에게 알려져 있다. 특히, 프로테아제의 경우, Folin 방법을 사용하여 280 nm에서의 흡광도 또는 비색법으로 측정되는 카제인 또는 헤모글로빈으로부터 산-가용성 펩티드의 방출에 기초한 분석법이 있다. 다른 예시적인 분석법은 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-파라-니트로아닐리드 분석법(SAAPFpNA) 및 2,4,6-트리니트로벤젠 설포네이트 나트륨 염 분석법(TNBS 분석법)을 포함한다. 국제 PCT 공개 WO2014/164777호에는 본원에 기재된 아밀라제 활성에 유용한 Ceralpha α-아밀라제 활성 분석법이 개시되어 있다. 숙주 세포 내 관심 단백질의 분비 수준의 결정 수단 및 발현된 단백질의 검출 수단은 단백질에 특이적인 다클론 또는 단클론 항체를 이용한 면역분석법의 사용을 포함한다. 예는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 형광 면역분석법(FIA), 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 포함한다.
VI.
예시적 구현예
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적인 구현예는 다음과 같다:
1.
바실러스 리체니포르미스 세포의 amyL 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트.
2.
구현예 1에 있어서, 다운스트림(3') prsA 유전자 암호화 서열(CDS)에 작동가능하게 연결된 업스트림(5') prsA 유전자 프로모터 서열을 포함하는 카세트.
3.
구현예 2에 있어서, 상기 prsA 유전자 프로모터 서열은 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는, 카세트.
4.
구현예 2에 있어서, 상기 prsA 유전자 CDS는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는, 카세트.
5.
관심 단백질(POI)을 생산하고, amyL 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트를 포함하는 재조합 바실러스 리체니포르미스 세포.
6.
구현예 5에 있어서, 동일한 POI를 생산하는 대조군 바실러스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 catH 유전자좌에 통합된 동일한 prsA 유전자 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
7.
구현예 5에 있어서, 동일한 POI를 생산하는 대조군 바실러스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 비통합 prsA 유전자 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
8.
구현예 5에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 암호화 서열(CDS)을 포함하는, 재조합 세포.
9.
구현예 5에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는, 재조합 세포.
10.
구현예 5에 있어서, 상기 POI는 효소인, 재조합 세포.
11.
바실러스 리체니포르미스 세포에서 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, POI를 생산하는 바실러스 세포를 획득하거나 구성하는 단계, amyL 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트를 상기 세포에 도입하는 단계, 및 POI 생산에 적합한 조건 하에서 상기 재조합 세포를 발효시키는 단계를 포함하는 방법.
12.
구현예 11에 있어서, 상기 재조합 세포는 동일한 POI를 생산하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 catH 유전자좌에 통합된 동일한 prsA 유전자 카세트를 포함하는, 방법.
13.
구현예 11에 있어서, 상기 재조합 세포는 동일한 POI를 생산하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 비통합 prsA 유전자 카세트를 포함하는, 방법.
14.
구현예 11에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 암호화 서열(CDS)을 포함하는, 방법.
15.
구현예 11에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
16.
구현예 11에 있어서, 상기 POI는 효소인, 방법.
실시예
본 발명의 특정 양태는 하기 실시예를 고려하여 추가로 이해될 수 있으며, 이는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 재료 및 방법의 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Ausubel et al., 1987; Sambrook et al., 1989). 본원에 기술된 바와 같이, PCT 공개 WO2019/040412호(전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 모든 발현 카세트를 숙주 균주로 형질전환시켰다.
실시예 1
플라스미드 pRF1005 표적화
catH
유전자좌의 구성
본 실시예에서는 catH 유전자좌를 표적화하는 Cas9 플라스미드 pRF1005는 구성되고, 편집 주형(서열번호 11)을 포함한다. 플라스미드 백본을 프라이머 860(서열번호 1; 표 2) 및 861(서열번호 2; 표 2)을 사용하여 PCT 공개 WO2021/146411호(전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 pRF946으로부터 PCR로 증폭시키고, 편집 주형 삽입물을 프라이머 1636(서열번호 3; 표 2) 및 1637(서열번호 4; 표 2)을 사용하여 합성 주형으로부터 PCR로 증폭시켰다. 제조사의 지침에 따라 NEBuilder를 사용하여 2개의 부분을 조립하고 E. 콜라이로 형질전환시켰다. 서열 검증된 단리물은 pRF1005(서열번호 12)로 저장되었다. 플라스미드 pRF1005를 사용하여 amyL 유전자좌에서 catH 유전자가 결실되게 하였다. RCA(롤링-서클 증폭)를 사용하여 플라스미드를 증폭시키고, TempliPhi 증폭 키트(GE Healthcare)를 사용하여 형질전환에 적합한 기질로 만들었다.
| 서열번호 | 프라이머 | 서열 |
| 1 | 860 | TGTCAGACCAAGTTTACTCA |
| 2 | 861 | GAATTCCTCCATTTTCTTCTG |
| 3 | 1636 | TGAGTAAACTTGGTCTGACA |
| 4 | 1637 | CAGAAGAAAATGGAGGAATTC |
실시예 2
변형된 숙주 균주의 구성
본원에 기재된 재조합 B 리체니포르미스 균주는 임의의 적합한 B 리체니포르미스 숙주를 사용하여 당업자에 의해 구성될 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO2019/40412호 및 WO2021/146411호 참조; 각각 전문이 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, 특정 양태에서, PCT 공개 WO2019/40412호에 일반적으로 기재된 바와 같이, serA1 및 lysA의 결실을 포함하는 BF140(ΔserA1_ΔlysA)과 같은 B. 리체니포르미스 균주에 숙주 변형이 도입될 수 있다. 다른 양태에서, PCT 공개 WO2021/146411호에 일반적으로 기재된 바와 같이, 변형 dltA 유전자 및/또는 변형된 rghR2 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함하는 B. 리체니포르미스 균주(예를 들어, BF140)에 숙주 변형이 도입될 수 있다.
본 실시예에서, WO2019/40412에 기재된 바와 같이, serA1(서열번호 13) 및 lysA 유전자(서열번호 14)의 결실을 포함하고 pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 함유하는 모체 B. 리체니포르미스 균주 BF140에 일련의 숙주 변형을 도입하였다. 보다 구체적으로, WO2021/146411에 기재된 바와 같이, 결실된 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자는 BF140 균주에서 최초로 구성되었다. 간략하게, pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 함유하는 BF140의 버전을 적격으로 만들었다(WO2021/146411). 100 μl의 적격 세포를 5 μl의 pRF879(서열번호 78; WO2021/146411) RCA와 혼합하고, 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드로 형질전환된 세포를 선택하기 위해 혼합물을 20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 표준 PCR 기술 및 하기 표 3의 프라이머를 사용하여, ΔrghR2 대립유전자(서열번호 16), 처음 9 bp 및 마지막 9 bp를 제외한 rghR2 암호화 서열의 결실에 대해 콜로니를 스크리닝하였다. ΔrghR2 대립유전자(서열번호 16)를 갖는 콜로니는 하기 표 3에 제시된 정방향(서열번호 5) 및 역방향(서열번호 6) 프라이머를 사용하여 1523 bp의 PCR 산물(서열번호 17)을 생성하는 반면, 온전한 rghR2 유전자를 함유하는 모세포는 1922 bp의 PCR 산물(서열번호 18)을 생성한다. ΔrghR2 대립유전자를 함유하는 콜로니는 BF412로 저장되었다.
| 서열번호 | 프라이머 | 서열 |
| 5 | 정방향 | GGATACGCCGATTTCAATGGC |
| 6 | 역방향 | GGCTATGTGCTGGGGGAATT |
pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 함유하는 BF412의 버전을 적격으로 만들었다(WO2021/146411). 100 μl의 적격 세포를 5 μl의 pZM221(서열번호 84; WO 2021146411) RCA와 혼합하고, 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 20 ppm 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 콜로니를 표준 PCR 기술을 사용하여 ΔdltA-2 대립유전자(서열번호 19), dltA 암호화 서열의 700 bp의 결실, 및 하기 표 4에 제시된 정방향(서열번호 7) 및 역방향(서열번호 8) 프라이머에 대해 스크리닝하였다. ΔdltA-2 대립유전자를 갖는 콜로니는 표 4의 프라이머를 사용하여 2067 bp의 PCR 산물(서열번호 20)을 생성하는 반면, 온전한 dltA 유전자를 함유하는 모세포는 2767 bp의 PCR 산물(서열번호 21)을 생성한다. 이는 표준 전기영동 기술을 사용하여 구별할 수 있다. dltA의 700 bp 내부 결실(서열번호 19)을 함유하는 콜로니는 BF772로 저장되었다.
| 서열번호 | 프라이머 | 서열 |
| 7 | 정방향 | GGGTACCTCCATGGTAAAGT |
| 8 | 역방향 | ACGTATTAATGCAGTAGCCG |
pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 함유하는 균주 BF772의 버전을 적격으로 만들고(WO2021/146411), 도입된 (제2 카피) prsA 유전자의 통합을 위해 amyL 유전자좌를 표적화하는 선형 PCR 산물로 형질전환하였다(서열번호 22). 예를 들어, 표적 구성체(카세트)는 B. 서브틸리스의 spoVG 종결자(서열번호 28)에 작동가능하게 연결된 catH 종결자(서열번호 27)로 구성된 이중 종결자(서열번호 26)에 작동가능하게 연결된 CatH 단백질을 암호화하는 DNA(서열번호 25)에 작동가능하게 연결된 catH 프로모터(서열번호 24)에 작동가능하게 연결된 amyL 유전자좌에 대한 업스트림(5′) 상동성 아암(서열번호 23)을 포함한다. 구성체는 amyL 유전자좌에 대한 다운스트림 상동성 아암(서열번호 32)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스의 amyL 유전자의 종결자(서열번호 31)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 prsA CDS(서열번호 30)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 prsA 프로모터(서열번호 29)를 추가로 포함한다.
10 ppm 클로람페니콜을 함유하는 L 한천에서 형성된 콜로니를 콜로니 PCR을 사용해 스크리닝하여 하기 표 5에 제시된 정방향(서열번호 9) 및 역방향(서열번호 10) 프라이머로 표준 PCR 기술을 사용하여 amyL 유전자좌의 변형을 확인하였다. amyL 유전자좌에 통합된 카세트(서열번호 33)를 함유하는 콜로니는 3562 bp의 PCR 산물을 생성하였다. PCR 산물(서열번호 35)은 Sanger의 방법을 사용하여 서열분석하고, 단리물은 ZM1319로 저장되었다.
| 서열번호 | 프라이머 | 서열 |
| 9 | 정방향 | CGCTTCTTGAAAACGAGGTG |
| 10 | 역방향 | GCTCATCCAAATCGATCCCA |
pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 함유하는 ZM1319의 버전을 적격으로 만들었다(WO2021/146411). 100 μl의 적격 세포를 5 μl의 pRF1005 RCA와 혼합하고, 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 20 ppm 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 표준 PCR 기술을 사용하여 amyL::prsAp-prsA 카세트(서열번호 33)를 유지하면서 catH 프로모터의 3' 말단을 암호화하는 DNA(서열번호 24) 및 CatH 단백질을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 25)의 결실, 및 상기 표 5에 제시된 정방향(서열번호 9) 및 역방향(서열번호 10) 프라이머에 대해 콜로니를 스크리닝하였다.
3562 bp 길이의 PCR 산물(서열번호 )을 생성한 catH 유전자좌에 통합된 (제2 카피) prsA 카세트(amyL::catH-prsAp-prsA 카세트; 서열번호 22)를 함유하는 prsA 카세트를 함유하는 모체 콜로니와 대조적으로, amyL 유전자좌에 통합된 (제2 카피) prsA 카세트(amyL::prsAp-prsA 카세트; 서열번호 33)를 함유하는 정확한 콜로니는 2698 bp의 PCR(서열번호 34)을 생성하였다. 표준 겔 전기영동 기술을 사용하고 Sanger 방법으로 PCR 산물을 서열분석하여 차이를 시각적으로 평가하였다. 단리물은 ZM1322로 저장되었다.
pBl.comK 플라스미드(서열번호 15)를 함유하는 ZM1325로 명명된 ZM1322 버전을 다음 실시예에서 아밀라제 리포터 생산을 위한 숙주 균주로 사용하였고, 도입된 (제2 카피) prsA 카세트가 ZM1325 균주의 amyL 유전자좌에 통합된 반면 동일한 도입된 (제2 카피) prsA 카세트가 BF613 균주의 catH 유전자좌에 통합된 것을 제외하고, ZM1325 균주는 전술된 숙주 균주 BF613(WO2021/146411)과 비교하여 동일한 숙주 변형을 함유한다.
실시예 3
amyL
유전자좌에 통합된 제2 카피
prsA
유전자를 포함하는 바실러스 세포에서 아밀라제 1 생산의 향상
본 실시예에서, 변이체 α-아밀라제(본원에서, "아밀라제 1", "Amy1"로 약칭)를 암호화하는 발현 카세트를 B. 리체니포르미스 균주 BF613 및 ZM1325(즉, serA1 및 lysA 유전자의 결실을 포함함)에 도입하였다. 보다 구체적으로, 균주 BF613이 catH 유전자좌에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 발현 카세트를 함유하는 반면, ZM1325는 amyL 유전자좌에 통합된 동일한 도입된 (제2 카피) prsA 발현 카세트를 함유한다는 점을 제외하고, BF613 및 ZM1325는 동질유전자 균주이다.
예를 들어, 아밀라제 1(Amy1; 서열번호 36)의 제1 카세트는 serA1 유전자좌에 통합되었고, serA1 ORF(서열번호 13)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 40)에 작동가능하게 연결된 Amy1을 암호화하는 DNA(서열번호 36)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 펩티드 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 39)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5′-UTR(서열번호 38)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 37)를 함유한다. Amy1의 제2 카세트(서열번호 36)는 lysA 유전자좌에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 40)에 작동가능하게 연결된 Amy1을 암호화하는 DNA(서열번호 36)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 펩티드 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 39)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5′-UTR(서열번호 38)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 p2 프로모터(서열번호 41) 및 lysA ORF(서열번호 14)를 함유한다. 이로 인해 LDN665(즉, lysA 및 serA 유전자좌에 Amy1의 2개 카피가 있는 균주 BF613) 및 ZM1351(즉, lysA 및 serA 유전자좌에 Amy1의 2개 카피가 있는 균주 ZM1325)로 명명된 Amy1 생산 균주가 생성되었다.
두 개의 Amy1 생산 균주(LDN665 및 ZM1351)를 표준 소규모 조건(PCT 공개 WO2018/156705호 및 WO2019/055261호에 기술된 바와 같고, 각각은 본원에 참조로 포함됨)을 사용하여 α-아밀라제의 생산에 대해 분석하였다. 예를 들어, 생산된 아밀라제 리포터 단백질(Amy1)은 Bradford 방법 또는 Ceralpha 분석을 사용하여 정량화되었고(분석 결과는 표 6에 나타나 있음), 이는 catH 유전자좌(LDN665) 대신 amyL 유전자좌(ZM1351)에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 유전자를 포함하는 균주에서 Amy1 생산의 향상을 입증한다.
| 균주 | 종류 | 상대적 Amy1 생산 |
| LDN665 | Amy1의 2개 카피; catH::prsA | 1.00 |
| ZM1351 | Amy1의 2개 카피; amyL::prsA | 1.07 |
실시예 4
amyL
유전자좌에 통합된 제2 카피
prsA
유전자를 포함하는 바실러스 세포에서 아밀라제 2 생산의 향상
본 실시예에서, 다른 아밀라제 리포터 단백질 [Triple-A 21508-1](본원에서, "아밀라제 2", "Amy2"로 약칭)를 암호화하는 발현 카세트를 B. 리체니포르미스 균주 BF613 및 ZM1325(즉, serA1 및 lysA 유전자의 결실을 포함함)에 도입하였다. 상기 제시된 바와 같이, 균주 BF613이 catH 유전자좌에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 발현 카세트를 함유하는 반면, ZM1325는 amyL 유전자좌에 통합된 동일한 도입된 (제2 카피) prsA 발현 카세트를 함유한다는 점을 제외하고, BF613 및 ZM1325는 동질유전자 균주이다. 예를 들어, Amy2의 제1 카세트(서열번호 42)는 serA1 유전자좌에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 40)에 작동가능하게 연결된 Amy2를 암호화하는 DNA(서열번호 42)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 펩티드 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 39)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5′-UTR(서열번호 38)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 37)에 작동가능하게 연결된 serA1 ORF(서열번호 13)를 함유한다. Amy2의 제2 카세트는 lysA 유전자좌에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 40)에 작동가능하게 연결된 Amy2를 암호화하는 DNA(서열번호 42)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 펩티드 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 39)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5′-UTR(서열번호 38)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 p2 프로모터(서열번호 41) 및 lysA ORF(서열번호 14)를 함유한다. 이로 인해 WAAA57(즉, lysA 및 serA 유전자좌에 Amy2의 2개 카피가 있는 균주 BF613) 및 WAAA197(즉, lysA 및 serA 유전자좌에 Amy1의 2개 카피가 있는 균주 ZM1325)로 명명된 Amy2 생산 균주가 생성되었다.
두 개의 Amy2 생산 균주(WAAA57 및 WAAA197)를 아밀라제 생산에 대해 (실시예 3에 기술된 표준 소규모 조건 사용하여) 분석하였고(리포터 분석 결과는 표 7에 나타나 있음), 이는 catH 유전자좌(WAAA57) 대신 amyL 유전자좌(WAAA197)에 통합된 도입된 (제2 카피) prsA 유전자를 포함하는 균주에서 Amy2 생산의 향상을 입증한다.
| 균주 | 종류 | 상대적 Amy2 생산 |
| WAAA57 | Amy2의 2개 카피; catH::prsA | 1.00 |
| WAAA197 | Amy2의 2개 카피; amyL::prsA | 1.04 |
참고문헌
PCT 공개 WO1994/19471호
PCT 공개 WO2002/14490호
PCT 공개 WO2003/083125호
PCT 공개 WO2003/089604호
PCT 공개 WO2019/40412호
PCT 공개 WO2021/146411호
PCT 공개 WO2014/164777호
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서열목록 전자파일 첨부
Claims (16)
- 바실러스 리체니포르미스 세포의 amyL 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트.
- 제1항에 있어서, 다운스트림(3') prsA 유전자 암호화 서열(CDS)에 작동가능하게 연결된 업스트림(5') prsA 유전자 프로모터 서열을 포함하는 카세트.
- 제2항에 있어서, 상기 prsA 유전자 프로모터 서열은 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는, 카세트.
- 제2항에 있어서, 상기 prsA 유전자 CDS는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는, 카세트.
- 관심 단백질(POI)을 생산하고, amyL 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트를 포함하는 재조합 바실러스 리체니포르미스 세포.
- 제5항에 있어서, 동일한 POI를 생산하는 대조군 바실러스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 catH 유전자좌에 통합된 동일한 prsA 유전자 카세트를 포함하는, 재조합 세포.
- 제5항에 있어서, 동일한 POI를 생산하는 대조군 바실러스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 동일한 prsA 유전자 카세트의 도입된 비통합 카피를 포함하는, 재조합 세포.
- 제5항에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 암호화 서열(CDS)을 포함하는, 재조합 세포.
- 제5항에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는, 재조합 세포.
- 제5항에 있어서, 상기 POI는 효소인, 재조합 세포.
- 바실러스 리체니포르미스 세포에서 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, POI를 생산하는 B. 리체니포르미스 세포를 획득하거나 구성하는 단계, amyL 유전자좌에 통합된 prsA 유전자 카세트를 상기 세포에 도입하는 단계, 및 상기 POI 생산에 적합한 조건 하에서 상기 재조합 세포를 발효시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 재조합 세포는 동일한 POI를 생산하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 catH 유전자좌에 통합된 동일한 prsA 유전자 카세트를 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 재조합 세포는 동일한 POI를 생산하는 대조군 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하되, 상기 대조군 세포는 동일한 prsA 유전자 카세트의 도입된 비통합 카피를 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 30에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 암호화 서열(CDS)을 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 29에 대해 적어도 85%의 동일성을 포함하는 prsA 유전자 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 POI는 효소인, 방법.
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