JP2004531604A - 感染性プリオン蛋白を破壊するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
プリオン破壊プロテアーゼを用いた感染性プリオン蛋白の熱/酵素処理による、伝染性海綿状脳症(TSE)および/または他のプリオン蛋白媒介疾患を伴う感染性プリオン蛋白を破壊する方法および組成物。前記方法および組成物は、感染性プリオン蛋白株を含有するか、または感染性プリオン蛋白株によって汚染された組織の処理、あるいは手術器具、台所用品、実験器具などのプリオン汚染物品の消毒または殺菌に適用できる。
Description
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、一般に伝染性海綿状脳症(TSE)、例えば、ウシ海綿状脳症(BSE)およびヒツジスクラピーに関連した感染性プリオン蛋白を破壊するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は動物組織に含有する感染性プリオン蛋白を破壊するための、および/またはこのような感染性プリオン蛋白に汚染された医療器具などの物品を消毒および滅菌するためのプロテアーゼの適用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
プリオン蛋白は、ヒト並びに非ヒト哺乳類種における感染性神経変性疾患に関連する構造異常蛋白である。
【0003】
非ヒト哺乳類種におけるプリオン疾患としては、スクラピー(ヒツジ)、伝染性ミンク脳症(ミンク)、慢性消耗性疾患(ヘラジカ、シカ)、ウシ海綿状脳症(BSE)(ウシ)、ネコ海綿状脳症(ネコ)およびサル海綿状脳症(サル)が挙げられる。
【0004】
ヒトでは、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルトマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、致命的不眠症およびクロイツフェルト−ヤコブ病を含む種々の神経変性疾患が病因学的にプリオン蛋白と関連している。ヒトのプリオン疾患の原因は肉食(新たな変形クロイツフェルト-ヤコブ病の原因となるBSE感染牛肉)、ヒト成長ホルモンの投与(医原性クロイツフェルト−ヤコブ病の原因となる)および儀式的肉食(クールーの原因となる)に関連している。
1992年以来、ヨーロッパではBSEが18万例以上、ヒトクロイツフェルト-ヤコブ病が100例以上報告されており、ヒトの症例数はこれからもかなり上昇すると予測されている。このような疾患は治療法がなく、また病原性プリオン蛋白は処理し難く、非免疫原生であるため、このような疾患の伝播を阻止することは困難である。プリオン蛋白の病原性かつ感染性のイソ体は、非常に安定でβシート構造内に豊富であり、熱や通常の蛋白分解酵素に耐性がある(エス・ビー・プルーシナー(Prusiner、S.B.)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、95卷、p.11363(1998年);エフ・イー・コーエン(Cohen、F.E.)およびエス・ビー・プルーシナー(Prusiner、S.B.)、Ann.Rev.Biochem.、67卷、p.793(1998年);およびケー‐エム・パン(Pan、K−M)、エム・ボールドウィン(Baldwin、M.)、ジェー・ウングエン(Nguyen、J.)、エム・ガセット(Gasset、M.)、エイ・サーバン(Serban、A.)、ディー・グロス(Groth、D.)、アイ・メールホーン(Mehlhorn、I.)、ズィー・フアング(Huang、Z.)、アール・ジェー・フレッタリック(Fletterick、R.J.)、エフ・イー・コーエン(Cohen、F.E.)、およびエス・ビー・プルーシナー(Prusiner、S.B.)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、90巻、p.10962(1993年))。
【0005】
BSEおよびウシ由来のヒト食料品のプリオン蛋白汚染の研究、並びにプリオン蛋白疾患の発生やウシ種における遺伝の研究に大きな努力が集中的に払われてきた。ウシ集団における感染は、感染したウシ、ヒツジおよび他の反芻動物由来の骨粉および提供された器官や組織を含有した飼料を畜牛に与えることに関連していた。
【0006】
現在、多くの国で、別な方法でヒト用食品となる動物製品、および別な方法で動物飼料の原料や栄養サプリメントの実際の源となる動物副産物は、関連動物における感染性プリオン蛋白の存在に由来するプリオン蛋白感染の伝播を防ぐために焼却され、その残留灰は埋められている。
【0007】
ヨーロッパでは、動物副産物からの肉骨粉は飼料としての使用が禁じられている。米国では、BSEの発生は報告されていないが、この疾患の発生と伝播を防ぐために、動物産業およびその関連産業は厳しい規制下に置かれている(ビー・エイ・フランコ(Franco、B.A.)、Feed Stuffs、2001年2月12日)。さらに米国は、肉および肉副製品の輸入を禁じている。
【0008】
動物組織における感染性プリオン蛋白の存在を確認するために、ウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験などの種々の試験が開発された(ジェネティック・エンジニアリング・ニュース(Genetic Engineering News)、21卷、第6号、2001年3月15日)。しかし、感染動物組織から感染性プリオン蛋白を工業応用的に除去するために対応できる状況が、現在のところまだ現れていない。
感染性プリオン蛋白は、正常な蛋白質を変性あるいはその高次構造を分解させる高圧滅菌(200℃の高温でも感染性プリオン蛋白の不活化に効果がない)、煮沸、凍結およびホルムアルデヒド、カルボン酸、クロロホルムなどの試薬への曝露などを含む通常の方法による破壊に対して耐性である。典型的には、プリオン蛋白の病原性イソ体を破壊するためには焼却または漂白剤処理が用いられる。
【0009】
したがって、例えば感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白で汚染された動物組織の処理に適用できる感染性プリオン蛋白破壊のための組成物および方法論を提供することは当業界における著しい進歩となろう。
【0010】
さらに、プリオン感染組織に以前曝露された医療器具の再使用によって生じる交差汚染の危険は増加しつつあり、感染伝播の潜在的原因となっている。
【0011】
衛生管理施設における防腐剤、消毒剤および滅菌法の使用は、衛生管理処置の間に使用された医療器具による交差汚染を防ぐために重要である。医療装置または医療器具の消毒および滅菌は、細菌またはウィルスなどの感染性生物を破壊する種々の物理的および化学的方法を用いて種々の慣例的方法によって達成される。例えば、過酢酸、過酸化水素、水酸化ナトリウム、ギ酸、漂白剤、アルコール類、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、ホルマリンおよびグルタルアルデヒドなどの化学的消毒剤を医療器具の消毒と滅菌に用いることができ、焼却、高圧滅菌、凍結、乾燥加熱、煮沸、UVおよびマイクロ波照射もまた、細菌やウィルスなどの感染性媒介物を破壊するために有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
しかし、上記で検討したとおり、感染性プリオン蛋白は、従来の方法による破壊には耐性があることが知られており、したがって、従来の方法は、プリオンで汚染された医療器具または同類の物品を消毒または滅菌するには無効である。
【0013】
したがって、本発明のもう1つの目的は、プリオンで汚染された手術器具などの医療器具または台所用品および実験器具などの物品を有効に消毒または滅菌する組成物および方法論を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の概要
本発明は、感染性プリオン蛋白を破壊するための方法と組成物を提供する。
【0015】
一の態様において、本発明は、感染性プリオン蛋白で汚染された位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法に関するものであって、
(a)前記位置に感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で前記位置を加熱するステップと、
(b)このような位置における感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱位置を曝露させるステップと、
を含む方法に関する。
【0016】
前記位置は、組織中の感染性プリオン蛋白を含有する、または感染性プリオンによって汚染された組織、あるいは感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品であり得る。
【0017】
ステップ(a)における温度は、約150℃を超えず、約100℃から約150℃の範囲内が好ましく、約125℃から約140℃の範囲内がさらに好ましい。
【0018】
ステップ(b)は、ステップ(a)よりも低い温度、例えば、(1)約35℃から約100℃、(2)約40℃から約75℃、および(3)約50℃から約60℃の範囲内で行われる。ステップ(b)は、好ましくは約40℃を超える温度で、より好ましくは約50℃を超える温度で行われる。
【0019】
ステップ(b)で用いられる蛋白分解酵素は、限定しないが、ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンが挙げられる。ケラチナーゼ酵素類および/またはその活性フラグメントは、本発明の実施に特に好ましい。ケラチナーゼ類は、羽毛、角、ひずめおよび毛髪の主成分であるケラチン蛋白を分解できるものとして一般に知られている蛋白分解酵素の一群である。本出願の発明者は、特に感染性プリオン蛋白が蛋白分解され易くなっている場合は、ケラチナーゼ酵素類もまた、感染性プリオン蛋白類の破壊に有効であるという予想もしない驚くべき結果を発見した。このような蛋白分解酵素はバチルス−リケニフォルミスPWD−1酵素および/またはその活性フラグメントであることがより好ましい。あるいは、このような蛋白分解酵素は、1個以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を含む野生型バチルス−アミロリケファシエンス‐スブチリシン(Bacillus amyloliquefaciens subtilisin)の突然変異体である。
【0020】
さらに、上記明細書中に記載されたような方法は、前記位置中の感染性プリオン蛋白の減少を確認するために前記位置を試験するステップ(C)をさらに含むことができ、ステップ(C)は前記位置をウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験試験からなる群から選択される試験に供することを含む。ウェスタンブロット試験が本発明を実施する上で好ましい。
【0021】
本発明の具体的な一の態様は、上記明細書中に記載されたように感染性プリオン蛋白により汚染されたか、または汚染の疑いのある位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法に関するものであり、このような位置は、組織中に感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織を含む。このような組織は、動物組織、好ましくはウシ組織、ヒツジ組織などの哺乳動物の組織を含むことができ、脳組織、下垂体組織、腸組織、肺組織、心組織、腎組織および脾組織など、動物のいかなる身体部分からのものであってもよい。このような動物組織は、神経系組織を含むことが好ましく、BSE感染組織またはスクラピー感染組織を含むことがより好ましい。前記組織は感染性プリオン蛋白のキャリア動物から得ることができる。
【0022】
本発明の他の具体的態様は、上記明細書中に記載されたように感染性プリオン蛋白により汚染されたか、または汚染の疑いのある位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法に関するものであり、このような位置は、感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品を含む。このような物品は、クランプ類、鉗子類、はさみ類、ナイフ類、ケーブル類、パンチ類、ピンセット類、カニューレ類、キャリパー類、カーバー類、キュレット類、スケーラー類、拡張器類、クリップアプリケータ類、開創器類、コントラクタ類、エキスカベータ類、持針器類、吸引管類、凝固電極類、脳波計深部電極類、肋骨並びに胸骨スプレッダー類、双極性プローブ類、および肋骨用鋏類などの手術器具を含むことができる。あるいは、このような物品は、ナイフ類、フォーク類、はさみ類、ピ−ラー類、皮むき器類、スライサー類、へら類、および包丁類などの食卓用金物類および台所用品、または容器類、ろ過装置類、遠心機類、分光光度計類、および蛍光光度計類などの実験用器具類、またはクランプ類、鉗子類、ナイフ類、のこぎり類、プローブ類および電子スタン器具などの獣医用器具類を含むことができる。
【0023】
処理される位置が物品を含む場合、ステップ(b)に用いられる蛋白分解酵素は、このような物品を洗浄および殺菌する目的で溶液形態において提供されることが好ましい。ケラチナーゼ類は、蛋白分解酵素として用いられるが、このような酵素溶液は、約0.2g/L〜約1.0g/Lの範囲内の低有効濃度により特徴づけられることが好ましい。
【0024】
本発明のさらなる態様は、(a)プリオン蛋白の熱分解温度以下の温度にプリオン蛋白を加熱すること、次いで(b)プリオン蛋白の酵素分解処理、を含む蛋白分解酵素の分解処理による感染性プリオン蛋白の分解性を向上させる方法に関する。
【0025】
本発明のなおさらなる態様は、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染されたウシ組織から感染性プリオン蛋白を除去する方法に関するものであって、(a)約100℃〜約150℃の範囲の温度でウシ組織を加熱処理すること、次いで(b)蛋白分解酵素が熱的に安定であって、ウシ組織に関連する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃〜約100℃の範囲の温度で、ウシ組織を蛋白分解酵素に曝露させることを含む方法に関する。前記加熱処理は約5分〜約5時間の時間で実施することが好ましく、ステップ(b)に用いられる蛋白分解酵素はバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを含むことが好ましい。
【0026】
熱安定性蛋白分解酵素は、本発明の実施に特に有用である。したがって、本発明の具体的な一態様は、組織を加熱することと同時に、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために十分な温度で、かつ十分な時間でこの組織を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることを含むステップにより、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する方法に関する;本発明の他の具体的な態様は、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織を含む組織組成物、および約35℃〜約100℃の温度範囲で熱的安定な蛋白分解酵素に関する。このような熱安定性蛋白分解酵素は、熱安定性プロテアーゼであることが好ましく、動物肉製品または副産物中のBSE媒介感染性プリオン蛋白を分解するため、十分な温度下で、かつ十分な時間で動物肉製品または副産物を処理するために用いることができる。
【0027】
本発明のさらなる他の態様は、組織中の感染性プリオン蛋白を減少させる組織の処理方法に関する。本法は、
(a)前記組織に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で組織を加熱するステップ;および
(b)このような組織に関連する感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱組織を曝露させるステップを含む。
【0028】
本発明のさらなる態様は、感染性蛋白プリオンによる汚染を受け易い物品を消毒する方法であって:
(a)前記物品に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解の感受性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で組織を加熱するステップと、
(b)前記物品に関連する感染性プリオン蛋白の少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱物品を曝露させるステップと、を含む方法に関する。
【0029】
さらなる態様において、本発明は、感染性プリオン蛋白で汚染された手術器具から感染性プリオン蛋白を除去する方法であって、(a)約100℃〜約150℃の範囲の温度で、例えば約5分〜約5時間の時間で手術器具を加熱すること、次いで(b)蛋白分解酵素が熱的に安定であって、前記手術器具を汚染する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃〜約100℃の範囲の温度で、前記加熱手術器具を蛋白分解酵素に曝露させること、を含む方法に関する。
【0030】
本発明のなおさらなる態様は、感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品を消毒する洗浄組成物であって、
(i)ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンからなる群から選択される1種以上の蛋白分解蛋白質と、
(ii)溶媒と、
を含む前記組成物に関する。
【0031】
本発明の洗浄組成物は、約0.2g/L〜1.0g/Lの濃度範囲内にあるケラチナーゼ酵素類を含むことが好ましい。過度の実験なしで通常の当業者により容易に決定できる蒸留水、緩衝液、洗浄液、アルコール、または酵素洗浄剤に通常用いられる任意の他の無機溶媒または有機溶媒などの種々の溶媒が本発明を実施する目的で使用できる。洗浄組成物は、限定しないが、界面活性剤、ビルダー、促進剤、充填剤および他の補助剤などの消毒/滅菌成績を高める1種以上の化学添加物をさらに含むことがより好ましい。
【0032】
本発明の他の態様、特徴および実施形態は、次の開示および添付の請求項からより十分に明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【0033】
発明の好ましい実施形態の詳細な説明
これ以降、より十分に記載される本発明とその特徴、態様および実施形態に関連して、本発明明細書の背景技術の節に引用されている技術文献の開示並びに以下の特許および技術文献は、それぞれ全体を引用文献として明細書中に組み入れてある:
米国特許第4,908,220号明細書;米国特許第4,959,311号明細書;米国特許第5,063,161号明細書;米国特許第5,171,682号明細書;米国特許第5,186,961号明細書;および米国特許第5,712,147号明細書;ジェイ・ピー・デスリーズ(Deslys,J.P.)「BSEに関する屠殺牛のスクリーニング(Screening slaughtered cattle for BSE)」、Nature、409卷、pp.476〜477、2001年1月25日;およびエフ・イー・コーエン(Cohen,F.E.)「Protein Misfolding and Prion Diseases(蛋白襞形成不良およびプリオン疾患)」、J.Mol.Biol.(1999年)、293巻、pp.313〜320。
【0034】
本発明は、組織中の感染性プリオン蛋白を分解するため、あるいは手術器具、食卓用金物類および台所用品、獣医用器具および実験用器具などのプリオン汚染物品の消毒または滅菌するための蛋白分解酵素の使用に基づいている。
【0035】
感染性プリオン蛋白単独の高温曝露(例えば、200℃で)では、それらの病原特性を変えることなく;さらに非感染性PrPcを完全に消化するプロティナーゼKなどの従来の蛋白分解酵素は、対応する感染性イソ体を破壊しないため、感染性プリオン蛋白の分解に関する本発明の方法の有効性はまったく予想外であった。というのは、したがって、従来、感染性PrPScの破壊に必要な焼却温度よりはるかに低い温度が、感染性PrPScを含有する組織または汚染組織から感染性PrPScを完全に除去するために、酵素処理用に使用できることは非常に驚くべきことである。
【0036】
明細書中に用いられるように、用語の高温とは少なくとも35℃の温度を意味する。用語の蛋白分解感受性とは、感染性プリオン蛋白が非感染性生成物に酵素的に分解される能力を意味する。
【0037】
組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白を減少させるための組織または物品などの位置の処理は、以下に記載されるように種々の技術により実施できる。
【0038】
例えば、本発明の一実施形態において、組織または物品(感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白により汚染されたか、または含有または汚染の疑いがある、のいずれかであり得る)を、存在するいずれのプリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するのに有効な蛋白分解酵素に前記組織または物品を曝露させることと共に、存在し得る感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるための十分な温度に、また十分な時間で加熱する。
【0039】
このような処理は、第一のより高い高温に前記組織または物品を加熱する最初のステップ、次に感染性プリオン蛋白の蛋白分解のために第二のより低い高温で酵素剤に前記加熱組織または物品を曝露することを含む、2ステップ連続で行うことができる。
【0040】
このような2ステップ法において、前記組織または物品は、第一のより高い高温で処理し、次いで、第二の酵素処理ステップにおいて蛋白分解酵素を接種させるか、あるいは蛋白分解酵素に曝露させる場合に前記組織または物品が好適な温度になるような第二のより低い高温へと、例えば、前記組織または物品から輻射熱の損失、前記組織または物品の対流冷却、または他の適切な方法により、冷却することができる。
【0041】
このような2ステップ法の第二のステップにおいて、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するのに有効な蛋白分解酵素に、前記組織または物品を曝露する。
【0042】
したがって、前記方法は、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を、前記組織または物品を引き続く蛋白分解酵素処理のため高温に加熱することによって高める種々の実施形態で行うことができる。加熱ステップにおける高温は、任意の好適な温度、例えば、少なくとも35℃、少なくとも40℃、少なくとも60℃、少なくとも75℃、および/または1つの実例となる具体的温度が約100℃〜約150℃、より好ましくは約125℃〜約140℃である、150℃以下(または所望の場合は、他のより低い温度)であってもよい。
【0043】
あるいは、本発明のプリオン蛋白破壊処理は、例えば処理方法に用いられる対応温度で安定かつ有効な(感染性プリオン蛋白を除去するために)単独ステップ法で実施できるので、最初の加熱ステップを必要としない。
【0044】
単独ステップ法において、動物組織または物品を蛋白分解酵素と共に、感染性プリオン蛋白の酵素分解を生じさせるために好適な高温に加熱する。
【0045】
例えば、感染性プリオン蛋白を含有するか、またはそれにより汚染された組織または物品中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する方法は、前記組織または物品の加熱と同時に、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するための十分な温度と十分な時間で前記組織または物品を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることにより実施できる。
【0046】
本発明の実施に使用される方法ステップの具体的な順序にかかりなく、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために有効な蛋白分解酵素(2ステップ法の第二のステップにおいて、または単独ステップ法の酵素分解ステップにおいて)に前記組織または物品を曝露する。
【0047】
使用される蛋白分解酵素の熱安定特性に依存して、酵素分解ステップは本発明の実施における任意の好適な温度、例えば、約35℃を超える温度、約40℃を超える温度、約50℃を超える温度で実施できる。
【0048】
例証として、使用される具体的な蛋白分解酵素の蛋白分解安定性および酵素活性に依存して、酵素分解ステップは、約35℃〜約100℃、約40℃〜約100℃、約50℃〜約100℃、約40℃〜約75℃、約50℃〜約60℃の範囲の温度で実施できる。
【0049】
酵素分解ステップにおいて、蛋白分解酵素は、処理される組織または物品中に存在するか、さもなければ組織または物品中に関連する感染性蛋白プリオンを少なくとも部分的に、好ましくは完全に破壊する。
【0050】
任意の多種多様のプロテアーゼ類が本発明の実施に使用でき、具体的な蛋白分解酵素の選択は、蛋白分解を行うために使用される温度の選択、並びに蛋白分解酵素への曝露前の組織、または物品の任意の高温処理の選択に影響を与えることが認識されるであろう。
【0051】
酵素処理の具体的温度処理条件、並びにこのような酵素処理する前の任意の高温における最初の処理ステップに必要または所望の温度条件は、当業界内で過度の実験なしで経験的に容易に決定できる。
【0052】
本発明の実施に使用される有用な蛋白分解酵素としては、それらの使用条件において酵素的に活性かつ有効な酵素類が挙げられる。高温での酵素処理に関して、蛋白分解酵素は使用条件において熱的に安定で好適である。
【0053】
この点について、熱安定性を広範に変える蛋白分解酵素が知られている。例えば、本発明の具体的実施形態において使用される種々の蛋白分解酵素は、35℃、40℃、50℃、60℃まで、または100℃まででも熱安定であり得る。
【0054】
蛋白分解酵素は、任意の好適な種類であってもよく、単独の酵素種あるいは酵素混合物を含んでもよい。酵素は純粋形態および濃縮形態、あるいは希釈形態で使用できる。酵素は、約0.2g/L〜約1.0g/Lまでの濃度の酵素溶液を形成する溶媒に溶解することが好ましい。
【0055】
本発明の広範な実施における例証的蛋白分解酵素としては、限定しないが、ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンが挙げられる。
【0056】
好ましい酵素種としてケラチナーゼ酵素類が挙げられる。特に好ましいケラチナーゼは、バチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを含む。本発明の実施に有用な蛋白分解酵素種としては、蛋白分解酵素の活性なフラグメント、例えばバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼなどのケラチナーゼ酵素の活性フラグメントが挙げられる。ケラチナーゼ酵素類が本発明に使用される場合、酵素溶液に必要な有効濃度は、従来の酵素洗浄剤または消毒剤の濃度よりも著しく低い。さらに、ケラチナーゼ酵素類は、約6.0から約9.5のpH値で、従来の酵素洗浄剤の大部分の温度よりも著しく高い約50℃から約65℃の最適活性温度範囲により特徴づけられる。したがって、本発明の方法の洗浄温度を著しく上昇させることができ、このことは手術器具に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるためにより有効である。
【0057】
組織を処理する本発明の方法において、処理される組織は、哺乳動物組織並びに非哺乳動物組織、また感染性プリオン蛋白を実際にまたは潜在的に含有する植物組織であってもよい。哺乳動物組織には、ヒト組織並びに非ヒト哺乳動物組織を含むことができる。
【0058】
具体的態様において、本発明の方法において処理できる組織は、限定しないが、ウシ組織、ヒツジ組織、サル組織およびヒト組織が挙げられ、種々の組織タイプ、例えば、脳組織、下垂体組織、腸組織、肺組織、心組織、腎組織および脾組織が挙げられる。一態様において、本発明の方法は、中枢神経系組織および/または末梢神経系組織であってもよい神経系組織を処理するために使用される。
【0059】
本発明の方法に従って、組織から感染性プリオン蛋白を酵素的に除去する方法、または手術器具などの物品の消毒/殺菌方法は、酵素的蛋白分解処理が完結した後、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白の破壊を確認するために前記組織または物品を試験するステップをさらに含むことができる。感染性プリオン蛋白に関する前記組織または物品の試験は、任意の好適な方法、並びに任意の好適な検査法または方法論、例えばウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験、または処理される組織中の感染性プリオン蛋白の有無を確認するために有効である他の好適な試験により実施できる。
【0060】
本発明の酵素処理法は、任意の適切な一連の加工ステップを用いた任意の好適な方法で実施できる。
【0061】
例えば、一実施形態において、処理される組織または物品は、必要または所望の場合、最初に非酵素的熱処理に供され、次いで感染性または汚染性プリオン蛋白破壊のための酵素処理、次に濯ぎおよび非酵素処理、処理される組織または物品の試験、および/または処理後の試験が組織または物品からの感染性プリオン蛋白の除去が不完全であったことを示す場合必要ならば、さらなる熱/酵素処理(例えば、非酵素的熱処理および酵素的高温処理の交互かつ反復サイクルにおいて)に供される。
【0062】
他の実施形態において、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために十分な温度かつ十分な時間で、組織または物品を加熱することと同時に、組織または物品を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることを含むステップにより感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織または物品中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する。次いで処理された組織または物品を、感染性プリオン蛋白の除去を確認する試験に供することができる。
【0063】
さらに、本発明の方法は、任意の熱/酵素処理前に、処理される組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白存在を最初に決定することを含むことができるため、処理が感染性プリオン蛋白を含有すると決定され、確認される組織または物品にのみ適用される。
【0064】
あるいは、感染性プリオン蛋白を潜在的に含有するか、またはそれにより潜在的に汚染されている可能性はあるが、感染性プリオン蛋白の存在を予めはっきりと確認されていない組織または物品に前記熱/酵素処理を行ってから、感染性プリオン蛋白の存在を確認し、次いで前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白の有無を決定するために処理生成物を試験してもよい。
【0065】
本発明の方法は、BSBなどのTSE類を媒介する感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白で汚染され易い肉および肉副産物中の感染性プリオン蛋白を破壊するために有効的に適用される。
【0066】
このように本発明の方法はまた、BSEおよび他の感染性プリオン蛋白疾患の伝染を避けるために焼却するよりも、食品加工および/または関連操作でさらに加工できるウシおよび他の動物製品と副産物の処理に対し信頼できる方法を提供する。
【0067】
このように本発明は、一実施形態においてプリオン蛋白を最初に非酵素的熱処理、例えば感染性プリオン蛋白の熱分解温度(>>200℃)(一般に焼却が実施される)以下の温度に加熱すること、次いで感染性プリオン蛋白を酵素分解する動物製品および副産物の加工法を考慮している。
【0068】
本発明の具体的例証の実施形態において、感染性プリオン蛋白は、約100℃〜約150℃の範囲の温度で、例えば約5分〜約5時間の時間でウシ組織を加熱処理することにより、次いで蛋白分解酵素が熱的に安定であり、ウシ組織中の感染性プリオン蛋白を破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃〜約100℃の範囲の温度で蛋白分解酵素にウシ組織を曝露させることにより、感染性プリオン蛋白を含有するウシ組織から除去される。
【0069】
加熱処理は、場合によっては、加熱処理操作において所望の大気圧、大気圧以下または大気圧以上を与える圧の制御と共に、高温条件が適切に維持される好適なチャンバー内または容器内で実施できる。
【0070】
加熱処理後、ウシ組織は、その中の全ての感染性プリオン蛋白を破壊するためにバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼによる酵素分解処理に供される。熱/酵素処理についで、前記組織は任意の好適な方法で加工できる。
【0071】
例えば、このようなウシ組織は、例えば感染性プリオン蛋白の完全な破壊の確認を試験またはアッセイ後、動物飼料成分(例えば、肉骨粉)または飼料サプリメントを生成するために加工できる。
【0072】
1つの特に好ましい加工実施形態において、加熱処理ステップは、約125℃〜約150℃の最初の高温範囲内で実施され、その後、ウシ組織の酵素処理は、約40℃〜約60℃の第二の高温範囲内においてバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを用いて実施される。
【0073】
本発明の方法は、他の場合では(感染性プリオン蛋白の存在が疑われる、または確認された場合)焼却または廃棄処分を必要とするであろう関連ウシ肉副産物の利用を可能にする。
【0074】
本発明の方法は、処理をしなければ、他の場合ではバイオハザードを構成するであろう物質の栄養学的利用を可能にする技術的に大きな進歩を達成する。本発明の方法は、感染または汚染動物組織の焼却、および廃棄処分に必要なコストおよび施設を同時に避けられる。
【0075】
本発明は、組織から感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に取り除くために十分な温度かつ十分な時間で、熱的安定な蛋白分解酵素に前記組織を曝露することにより、感染性プリオン蛋白、例えば、BSE媒介プリオン蛋白を組織から除去するための簡便な方法論を具現化する。
【0076】
本発明の方法は、伝染性海綿状脳症(TSE)および/または、限定しないが、ウシ海綿状脳症(BSE)およびヒツジスクラピーなどの他のプリオン蛋白媒介疾患に対し感染性であるプリオン蛋白の破壊に広く適用できる。
【0077】
本発明の方法は、ヒト食品用の動物肉の加工および、動物飼料または動物飼料成分用の動物副産物の加工への適用性を有する。
【0078】
1つの組成態様において本発明は、(i)組織、例えば、プリオン蛋白媒介BSEなどの感染性プリオン蛋白を含有するウシ組織、(ii)酵素処理に使用される温度範囲、例えば、約40℃から約60℃で熱的安定である蛋白分解酵素、例えば、バチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼなどの組織組成を含む。
【0079】
このような組織組成は高温にあってもよい。前記組成は、好適な高温で酵素的に反応性であって、蛋白分解酵素および感染性プリオン蛋白の無い処理組織を含む生成組成物を生成する。
【0080】
本発明は、主として引き続く動物飼料成分の生産用に提供された動物部分など、採取状態で感染または汚染されている動物組織の処理への適用において上記に例証として記載したが、本発明はまた、プリオン疾患インビボ処理用の蛋白分解酵素の適用を含む。
【0081】
このような一実施形態において、治療用組成物は、プリオン疾患に対する治療的に有効な蛋白分解酵素を有効成分として含む、インビボプリオン疾患治療用に提供される。
【0082】
他の実施形態としては、インビボで感染性プリオン蛋白の分子認識蛋白として役立つ非感染性プリオン蛋白(例えば、PrPc、同じものを非感染性にするために修飾されたPrPSc、またはPrPScの非感染性フラグメント)と組合せた、ケラチナーゼを含有する治療用組成物を含む。
【0083】
方向づけされた構成物または組合せでケラチナーゼまたは他の蛋白分解酵素を含む、さらに他の治療用組成物が考慮されている。
【0084】
他の例証とする治療用組成物としては、インビボ熱分解誘導時にプリオン疾患に対し、実戦的に有効である蛋白分解酵素と組合せた、非毒性修飾エンドトキシン類縁体などの発熱剤が挙げられる。
【0085】
本発明はまた、蛋白分解酵素またはその活性フラグメントの生産のためにコード化する第一の領域、組み替えポリヌクレオチド発現ベクターの一部として発熱性ペプチドをコードする第二の領域などのポリヌクレオチド配列を含むインビボ治療用組成物を含む。トランスフェクション後、熱安定性蛋白分解酵素またはその活性フラグメントのインビボ発現、および発熱性ペプチドは、感染性プリオン蛋白の除去作用をもたらす。
【0086】
なおさらなる例として、治療用組成物は、伝染性海面状脳症への適用において、血液脳関門を通過できる両親媒性薬物オリゴマー共役物のような血液脳関門通過剤により製剤化できる。このような組成物は、治療用化合物、例えばケラチナーゼ、または他の蛋白分解酵素、またはオリゴマーが親水性部分に結合した親油性部分を含む、オリゴマーに共役したその活性フラグメントを含むことができる。このような治療用組成物を製剤化するのに有用なオリゴマー類は、2000年2月24日に公開された国際公開WO00/09073により完全に記載されている。
【0087】
本発明の方法の他の重要な適用は、手術器具、食卓用金物、台所用品、実験装置、および獣医用器具などの物品の消毒および/または滅菌である。このような方法は、
(a)クランプ類、鉗子類、はさみ類、ナイフ類、ケーブル類、パンチ類、ピンセット類、カニューレ類、キャリパー類、カーバー類、キュレット類、スケーラー類、拡張器類、クリップアプリケータ類、開創器類、コントラクタ類、エキスカベータ類、持針器類、吸引管類、凝固電極類、脳波計深部電極類、肋骨並びに胸骨スプレッダー類、双極性プローブ類、および肋骨用鋏類などの手術器具類;
(b)ナイフ類、フォーク類、はさみ類、ピ−ラー類、皮むき器類、スライサー類、へら類、および包丁類などの食卓用金物類および台所用品;
(c)ろ過装置類、遠心機類、分光光度計類、蛍光光度計類および種々の容器類などの実験用器具類;
(d)クランプ類、鉗子類、ナイフ類、のこぎり類、プローブ類および電子スタン器具などの獣医用器具類、
に関連するプリオン蛋白汚染物の破壊に広く適用できる。
【0088】
上記リストは、本発明の幾つかの適用の例証としてのみ挙げており、本発明の範囲を限定するような仕方で解釈すべきではない。
【0089】
下表は、本発明の一実施形態にしたがった消毒/滅菌サイクルを示している。
【0090】
【表1】
【0091】
他の実施態様において、熱安定性蛋白分解酵素は、このような消毒/滅菌工程に用いられて、加熱と酵素洗浄ステップが、感染性プリオン蛋白の完全破壊および処理物品の消毒に十分な温度かつ十分な時間で同時に実施できる。
【0092】
1つの組成態様における本発明は、(i)酵素処理に使用される温度範囲、例えば、約40℃〜約60℃に熱的安定である蛋白分解酵素、例えば、バチルス−リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼ;(ii)溶媒を含んだ洗浄組成物を含む。
【0093】
酵素洗浄剤の使用に好適な任意の溶媒が本発明の組成物に使用できる。生物学的相溶性並びに低コストを鑑みて、蒸留水が好ましい溶媒である。アルコール、緩衝液、洗浄液などの他の従来の無機および有機溶媒もまた、本発明を実施する目的で使用でき、通常の当業者は、使用される具体的酵素と調和する溶媒を容易に選択できる。従来から使用される化学添加物もまた、本発明の洗浄組成物に導入でき、限定しないが、界面活性剤、ビルダー、促進剤、充填剤および他の補助剤などが挙げられる。
【0094】
本発明の洗浄組成物は、例えば、0.3g/L未満の極低濃度であっても感染性プリオン蛋白を破壊するための有効性を保持する。ケラチナーゼ酵素がこのような洗浄組成物で使用される場合、このような組成物の酵素濃度は、約0.2g/L〜約1.0g/Lの範囲内が好ましい。
【0095】
本発明の洗浄組成物は、高温で酵素的に反応性があり、したがって、手術器具、食卓用金物、台所用品、獣医用器具および実験器具に関連する感染性プリオン蛋白の完全破壊のための高温で使用できる。
【0096】
本発明の特徴および利点は、以下の例証的実施例を参照として、より十分に示されている。
【実施例】
【0097】
実施例1
家禽廃液の好熱嫌気性消化槽から単離された羽毛分解細菌であるバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼ(シー・エム・ウィリアムス(C.M.Williams)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、J.Appl.Bacteriol.、67巻、p.25(1989年);ジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Poultry Sci.72巻、p.1617(1993年)を参照)は、本実施例に使用されたケラチナーゼ酵素源であった(エックス・リン(X.Lin)、シー・ジー・リー(C.G.Lee)、イー・エス・カサーレ(E.S.Casale)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Environ.Microbiol.、58巻、p.3271(1992年)を参照)。
【0098】
このケラチナーゼ酵素をエンコードする遺伝子(エックス・リン(X.Lin)、ディー・ダブリュー・ケレメン(D.W.Kelemen)、イー・エス・ミラー(E.S.Miller)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Env.Microbiol.、61巻、p.1469(1995年)を参照)が単離されて塩基配列決定され、本酵素のスケールアップ醗酵生産も確立されている(ジェー・ジェー・ワング(J.J.Wang)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、J.Ind.Microb.Biotech.22巻、p.608(1999年)を参照)。
【0099】
このケラチナーゼの粗製および精製調製物は、前記のとおり生産され(エックス・リン(X.Lin)、シー・ジー・リー(C.G.Lee)、イー・エス・カサーレ(E.S.Casale)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Environ.Microbiol.、58巻、p.3271(1992年)およびジェー・ジェー・ワング(J.J.Wang)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、J.Ind.Microb.Biotech.22卷、p.608(1999年)を参照)、ノースカロライナ州ラレイ、ノースカロライナ州立大学(NCSU)醗酵施設から入手した。PrPに対するケラチナーゼの有効試験は、オランダ国,レリスタッド動物科学健康研究所(Instirute of Animal Science and Health at Lelystad)(ID−レリスタッド(Lelystad))で実施された。
【0100】
精製ケラチナーゼは、種々の基質との反応においてエラスターゼ、コラゲナーゼ、プロテイナーゼKおよびトリプシン(すべてシグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.)から入手)などの他のプロテアーゼと比較された。ケラチン、エラスチンおよびコラーゲンの加水分解は、増加遊離アミノ基のニンヒドリンカラー反応(A450)により測定された(エックス・リン(X.Lin)、シー・ジー・リー(C.G.Lee)、イー・エス・カサーレ(E.S.Casale)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Environ.Microbiol.、58巻、p.3271(1992年)を参照)。遊離ロイシンは、当量の遊離アミノ基を算出する標準物質として用いられた。カゼイン加水分解は、上澄液中の増加A280により測定した(プライス(Price)およびジョンソン(Johnson)、1989年を参照)。これらの結果を下表1に示す。与えられた各々の基質に関して、全てのプロテアーゼの相対活性を決定した。累積相対活性(CRA)は、ケラチナーゼが広範囲の基質および高活性を有することを示した。
【0101】
【表2】
【0102】
病原性PrPに対するケラチナーゼの有効試験は、ID−レリスタッド(Lelystad)、分子認識ラボラトリーの単離施設(an Isolation Facility in the Laboratory of Molecular Recognition)で実施された。プリオニックスチェックのヨーロッパユニオン検証法(European Union−validated procedure of Prionics Check)(プリオニックス(Prionics)AG、チューリッヒ)が病原性PrPを検出するために用いられた。プリオニックスチェック(Prionics Check)法は、ウェスタンブロット法に基づいており、PrPの具体的形態を視覚化するために6H4モノクローナル抗体を使用する(プリオニックス(Prionics)AG、ウシにおけるBSEプリオンの検出試験、実用製品情報、チューリッヒ(2000年))。
【0103】
肉骨粉工程を模擬するために、原型方法の変更がなされた。第一に、標準法におけるプロテイナーゼKの替わりにケラチナーゼを用いた。ケラチナーゼの粗製調製物を用いた。第二に、BSE組織の前加熱処理効果を試験した。均質化組織を、バルカイン(Vulcain)加圧加熱器により115℃で40分間加熱処理した。第三に、抗酸化剤の亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)も試験した。本法の残りは、製造元の実用製品情報(プリオニックス(Prionics)AG、ウシにおけるBSEプリオンの検出試験、実用製品情報、チューリッヒ(2000年))に記載されたものと同じであった。
【0104】
以下のプロトコルを使用した。1gのBSE陽性脳組織を混合し、9mlのプリオニックス(Prionics)緩衝液で均質化した。半分の分割量である5mlにNa2SO3を加えて、最終濃度0.1%とし、他の半分はNa2SO3なしで行った。分割量4×2.0mlをオートクレーブ用のファルコン(Falcon)管に分配した。さらに1.0mlを陽性対照に使用して標準的プリオニックス法により処理し、他の1.0mlをケラチナーゼなしの対照に使用した。Na2SO3有無の2本の管を40分間加圧加熱処理し、他の2本の管は加熱処理しなかった。PCRプレートのウェルに、サンプル各150μlを50℃で0時間または4時間ケラチナーゼ(150μg、1,000BU/mg)により処理した。ケラチナーゼを、0.05M、pH7.5のリン酸緩衝液に予め溶解した。反応を、セリンプロテアーゼ阻害剤のプリオニックス・ペファブロック(Prionics Pefabloc)の添加により中止した。酵素温置の終末時に、10μlの各サンプル混合液を、SDS−PAGEゲル上に載せ、次いで電気泳動、ウェスタンブロット、および免疫化学発光検出のプリオニックス法を行った。
【0105】
この実験結果を図1に示し(BSEプリオン蛋白に対するケラチナーゼ分解の効果)、図中、1〜17レーンは次の通りである:
レーン1:緩衝液単独。
レーン2:試験したBSE脳組織。
レーン3:Na2SO3有りで前加熱処理し、ケラチナーゼは0時間で中止。
レーン4:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン3と同じ。
レーン5:Na2SO3なしで前加熱処理し、ケラチナーゼは0時間で中止。
レーン6:レーン5と同じでケラチナーゼ消化は4時間。
レーン7:前加熱処理なし、Na2SO3有り、ケラチナーゼは0時間。
レーン8:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン7と同じ。
レーン9:前加熱処理なし、Na2SO3なし、ケラチナーゼは0時間。
レーン10:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン9と同じ。
レーン11:前加熱処理なし、Na2SO3あり、ケラチナーゼなし。
レーン12:4時間の温置以外レーン11と同じ(注:ケラチナーゼを偶然に加えた)。
レーン13:Na2SO3有りで精製スクラピーPrP、ケラチナーゼは0時間で中止。
レーン14:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン13と同じ。
レーン15:Na2SO3有りで精製スクラピーPrP、ケラチナーゼなし。
レーン16:4時間の温置以外レーン15と同じ
レーン17:PrP標品。
【0106】
図1に示されるように、特にサンプルを115℃で40分間前加熱処理する場合、感染性PrPに対するケラチナーゼの消化効果が明白である(レーン3〜6)。前加熱処理なしでは(レーン7〜10)、ケラチナーゼの有効性が少なくなったが、ケラチナーゼは依然として、感染性PrP陽性物質の半分以上を分解した。精製ヒツジスクラピーPrPに対して、ケラチナーゼは、同様に活性であることが判明した(レーン13〜16)。Na2SO3の存在は、単独またはケラチナーゼとの存在のいずれも大きな差があるように見えなかった(レーン15〜16)。
実施例2
本発明の有効性をさらに立証するために、以下の実験手順に従って実験を行った。
【0107】
感染したウシおよびヒツジの脳幹組織におけるPrPScの分解を実施するために、バチルス-リケニフォルミス株PWD−1ケラチナーゼ由来のセリンプロテアーゼであるPWD−1ケラチナーゼが用いられた。サンプル中のPrPScを確認するためにプリオニックスチェック試験(Prionics AG、スイス国チューリッヒ)を用い、続いて組織サンプルの前加熱処理、消化酵素として精製PWD−1ケラチナーゼを用いて組織サンプルの消化を行った。
【0108】
各例とも、1gのBSE陽性の脳幹組織を9mlのプリオニックス(Prionics)均一化緩衝液と混合し、均質化してから、バルカイン(Vulcain)加圧加熱器により115℃で40分間加圧加熱処理した。96ウェルのプレートに各サンプル150μlを加え、0.05M、pH7.5のリン酸緩衝液に予め溶解したPWD−1ケラチナーゼで処理した。250μg/mlの酵素濃度を使用した。酵素消化は50℃で60分間実施した。反応を、セリンプロテアーゼ阻害剤である15μlのペファブロック(Pefabloc(登録商標))の添加により中止した。ゼロ時間サンプルでは、先ずこの阻害剤を添加してからPWD−1ケラチナーゼを添加した。酵素温置の終末時に、10μlの各サンプルを、SDS−PAGEゲル上に載せた。プリオニックスチェックキットに概説されているとおり、電気泳動、ウェスタンブロッティング、および免疫化学発光による検出を行った。
【0109】
BSE陽性(サンプルB1、B2、B3)3個、陰性(ウシサンプルN)1個、スクラピー陽性(サンプルS1とS2)および陰性(ヒツジサンプルN)の脳幹組織サンプルを精製PWD−1ケラチナーゼにより対応する対照に対して試験した。
【0110】
図2はその結果を示しているが、左側部分(「ケラチナーゼ処理」)は、ケラチナーゼ消化の結果であり、右側部分(「対照」)はプリオニックスチェック標品の結果である。ケラチナーゼは、BSE(レーン3〜5)並びにスクラピー(レーン8と9)の全ての被験PrPScを加水分解できた。
【0111】
プリオン蛋白を含有するウシサンプル(サンプルB1、B2、B3)およびプリオン蛋白を含有するヒツジサンプル(サンプルS1とS2)を本発明に従って、熱処理と酵素処理を組合せて処理すると、これらのサンプル中の感染性プリオンサンプル蛋白が完全に破壊されることを、この図は立証している。
【0112】
これらの結果は、全ての種類の被験蛋白質の分解におけるケラチナーゼの多能性を立証している。BSEPrPに対するケラチナーゼの有効性試験において、結果は、特にBSE脳幹組織サンプルが前加熱処理された場合は陽性であった。これは病原性PrPが酵素によって分解されることを立証する初めての実験である。
【0113】
凡そ125℃の温度での加圧過熱処理は、動物副産物の肉骨粉への加工における通常のステップである。感染性PrPの破壊に関して本発明に従ったケラチナーゼによる加熱後処理は、BSEの伝播を抑えるために有効な方法を提供する。ケラチナーゼ処理された肉骨粉はPrPが存在しないことを確認する試験が容易に行われるので、肉骨粉は飼料使用のためにリサイクルできる。
【0114】
このように、本発明の方法は、動物製品および副産物の加工のための簡便で有用な酵素的処理を提供する。
【0115】
本発明は、明細書中に種々の例証的特徴、態様および実施形態を参照させて記載したが、本発明の利用は、それに限定されず、通常の当業者が容易に考え得る他の変更、修飾および他の実施形態に拡大され、また包含することは解されるであろう。
【0116】
したがって、本発明は、以後の請求項にある本発明の精神と範囲内でそのような他の変更、修飾および他の実施形態を包含するものとして広く判断し、解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【0117】
産業的有用性
本発明の方法および組成物は、感染性プリオン蛋白の破壊に有用であり、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白で汚染された生物材料、例えば動物組織の処理に適用できる。他の場合(感染性プリオン蛋白の存在が疑われるか、または確認された)には、本発明は有用で安全な動物飼料または他の栄養最終産物にするために焼却および廃棄処分を要するであろう生物材料の加工を可能にする。本発明の方法および組成物はまた、手術器具、食卓用金物、台所用品、実験器具および獣医用器具などの物品の消毒および/または滅菌に有用であり、このような物品の再使用によって生じる感染性プリオン蛋白の交差汚染および伝播を効果的に防ぐ。
【図面の簡単な説明】
【0118】
【図1】感染性プリオン蛋白の破壊のために本発明の方法の有効性を立証するSDS−PAGEゲル上のゲル電気泳動/ウェスタンブロット結果を示す図である。
【図2】感染性プリオン蛋白の破壊のために本発明の方法の有効性を立証するSDS−PAGEゲル上のゲル電気泳動/ウェスタンブロット結果を示す図である。
【0001】
発明の分野
本発明は、一般に伝染性海綿状脳症(TSE)、例えば、ウシ海綿状脳症(BSE)およびヒツジスクラピーに関連した感染性プリオン蛋白を破壊するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は動物組織に含有する感染性プリオン蛋白を破壊するための、および/またはこのような感染性プリオン蛋白に汚染された医療器具などの物品を消毒および滅菌するためのプロテアーゼの適用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
プリオン蛋白は、ヒト並びに非ヒト哺乳類種における感染性神経変性疾患に関連する構造異常蛋白である。
【0003】
非ヒト哺乳類種におけるプリオン疾患としては、スクラピー(ヒツジ)、伝染性ミンク脳症(ミンク)、慢性消耗性疾患(ヘラジカ、シカ)、ウシ海綿状脳症(BSE)(ウシ)、ネコ海綿状脳症(ネコ)およびサル海綿状脳症(サル)が挙げられる。
【0004】
ヒトでは、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルトマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、致命的不眠症およびクロイツフェルト−ヤコブ病を含む種々の神経変性疾患が病因学的にプリオン蛋白と関連している。ヒトのプリオン疾患の原因は肉食(新たな変形クロイツフェルト-ヤコブ病の原因となるBSE感染牛肉)、ヒト成長ホルモンの投与(医原性クロイツフェルト−ヤコブ病の原因となる)および儀式的肉食(クールーの原因となる)に関連している。
1992年以来、ヨーロッパではBSEが18万例以上、ヒトクロイツフェルト-ヤコブ病が100例以上報告されており、ヒトの症例数はこれからもかなり上昇すると予測されている。このような疾患は治療法がなく、また病原性プリオン蛋白は処理し難く、非免疫原生であるため、このような疾患の伝播を阻止することは困難である。プリオン蛋白の病原性かつ感染性のイソ体は、非常に安定でβシート構造内に豊富であり、熱や通常の蛋白分解酵素に耐性がある(エス・ビー・プルーシナー(Prusiner、S.B.)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、95卷、p.11363(1998年);エフ・イー・コーエン(Cohen、F.E.)およびエス・ビー・プルーシナー(Prusiner、S.B.)、Ann.Rev.Biochem.、67卷、p.793(1998年);およびケー‐エム・パン(Pan、K−M)、エム・ボールドウィン(Baldwin、M.)、ジェー・ウングエン(Nguyen、J.)、エム・ガセット(Gasset、M.)、エイ・サーバン(Serban、A.)、ディー・グロス(Groth、D.)、アイ・メールホーン(Mehlhorn、I.)、ズィー・フアング(Huang、Z.)、アール・ジェー・フレッタリック(Fletterick、R.J.)、エフ・イー・コーエン(Cohen、F.E.)、およびエス・ビー・プルーシナー(Prusiner、S.B.)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、90巻、p.10962(1993年))。
【0005】
BSEおよびウシ由来のヒト食料品のプリオン蛋白汚染の研究、並びにプリオン蛋白疾患の発生やウシ種における遺伝の研究に大きな努力が集中的に払われてきた。ウシ集団における感染は、感染したウシ、ヒツジおよび他の反芻動物由来の骨粉および提供された器官や組織を含有した飼料を畜牛に与えることに関連していた。
【0006】
現在、多くの国で、別な方法でヒト用食品となる動物製品、および別な方法で動物飼料の原料や栄養サプリメントの実際の源となる動物副産物は、関連動物における感染性プリオン蛋白の存在に由来するプリオン蛋白感染の伝播を防ぐために焼却され、その残留灰は埋められている。
【0007】
ヨーロッパでは、動物副産物からの肉骨粉は飼料としての使用が禁じられている。米国では、BSEの発生は報告されていないが、この疾患の発生と伝播を防ぐために、動物産業およびその関連産業は厳しい規制下に置かれている(ビー・エイ・フランコ(Franco、B.A.)、Feed Stuffs、2001年2月12日)。さらに米国は、肉および肉副製品の輸入を禁じている。
【0008】
動物組織における感染性プリオン蛋白の存在を確認するために、ウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験などの種々の試験が開発された(ジェネティック・エンジニアリング・ニュース(Genetic Engineering News)、21卷、第6号、2001年3月15日)。しかし、感染動物組織から感染性プリオン蛋白を工業応用的に除去するために対応できる状況が、現在のところまだ現れていない。
感染性プリオン蛋白は、正常な蛋白質を変性あるいはその高次構造を分解させる高圧滅菌(200℃の高温でも感染性プリオン蛋白の不活化に効果がない)、煮沸、凍結およびホルムアルデヒド、カルボン酸、クロロホルムなどの試薬への曝露などを含む通常の方法による破壊に対して耐性である。典型的には、プリオン蛋白の病原性イソ体を破壊するためには焼却または漂白剤処理が用いられる。
【0009】
したがって、例えば感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白で汚染された動物組織の処理に適用できる感染性プリオン蛋白破壊のための組成物および方法論を提供することは当業界における著しい進歩となろう。
【0010】
さらに、プリオン感染組織に以前曝露された医療器具の再使用によって生じる交差汚染の危険は増加しつつあり、感染伝播の潜在的原因となっている。
【0011】
衛生管理施設における防腐剤、消毒剤および滅菌法の使用は、衛生管理処置の間に使用された医療器具による交差汚染を防ぐために重要である。医療装置または医療器具の消毒および滅菌は、細菌またはウィルスなどの感染性生物を破壊する種々の物理的および化学的方法を用いて種々の慣例的方法によって達成される。例えば、過酢酸、過酸化水素、水酸化ナトリウム、ギ酸、漂白剤、アルコール類、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、ホルマリンおよびグルタルアルデヒドなどの化学的消毒剤を医療器具の消毒と滅菌に用いることができ、焼却、高圧滅菌、凍結、乾燥加熱、煮沸、UVおよびマイクロ波照射もまた、細菌やウィルスなどの感染性媒介物を破壊するために有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
しかし、上記で検討したとおり、感染性プリオン蛋白は、従来の方法による破壊には耐性があることが知られており、したがって、従来の方法は、プリオンで汚染された医療器具または同類の物品を消毒または滅菌するには無効である。
【0013】
したがって、本発明のもう1つの目的は、プリオンで汚染された手術器具などの医療器具または台所用品および実験器具などの物品を有効に消毒または滅菌する組成物および方法論を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の概要
本発明は、感染性プリオン蛋白を破壊するための方法と組成物を提供する。
【0015】
一の態様において、本発明は、感染性プリオン蛋白で汚染された位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法に関するものであって、
(a)前記位置に感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で前記位置を加熱するステップと、
(b)このような位置における感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱位置を曝露させるステップと、
を含む方法に関する。
【0016】
前記位置は、組織中の感染性プリオン蛋白を含有する、または感染性プリオンによって汚染された組織、あるいは感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品であり得る。
【0017】
ステップ(a)における温度は、約150℃を超えず、約100℃から約150℃の範囲内が好ましく、約125℃から約140℃の範囲内がさらに好ましい。
【0018】
ステップ(b)は、ステップ(a)よりも低い温度、例えば、(1)約35℃から約100℃、(2)約40℃から約75℃、および(3)約50℃から約60℃の範囲内で行われる。ステップ(b)は、好ましくは約40℃を超える温度で、より好ましくは約50℃を超える温度で行われる。
【0019】
ステップ(b)で用いられる蛋白分解酵素は、限定しないが、ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンが挙げられる。ケラチナーゼ酵素類および/またはその活性フラグメントは、本発明の実施に特に好ましい。ケラチナーゼ類は、羽毛、角、ひずめおよび毛髪の主成分であるケラチン蛋白を分解できるものとして一般に知られている蛋白分解酵素の一群である。本出願の発明者は、特に感染性プリオン蛋白が蛋白分解され易くなっている場合は、ケラチナーゼ酵素類もまた、感染性プリオン蛋白類の破壊に有効であるという予想もしない驚くべき結果を発見した。このような蛋白分解酵素はバチルス−リケニフォルミスPWD−1酵素および/またはその活性フラグメントであることがより好ましい。あるいは、このような蛋白分解酵素は、1個以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を含む野生型バチルス−アミロリケファシエンス‐スブチリシン(Bacillus amyloliquefaciens subtilisin)の突然変異体である。
【0020】
さらに、上記明細書中に記載されたような方法は、前記位置中の感染性プリオン蛋白の減少を確認するために前記位置を試験するステップ(C)をさらに含むことができ、ステップ(C)は前記位置をウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験試験からなる群から選択される試験に供することを含む。ウェスタンブロット試験が本発明を実施する上で好ましい。
【0021】
本発明の具体的な一の態様は、上記明細書中に記載されたように感染性プリオン蛋白により汚染されたか、または汚染の疑いのある位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法に関するものであり、このような位置は、組織中に感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織を含む。このような組織は、動物組織、好ましくはウシ組織、ヒツジ組織などの哺乳動物の組織を含むことができ、脳組織、下垂体組織、腸組織、肺組織、心組織、腎組織および脾組織など、動物のいかなる身体部分からのものであってもよい。このような動物組織は、神経系組織を含むことが好ましく、BSE感染組織またはスクラピー感染組織を含むことがより好ましい。前記組織は感染性プリオン蛋白のキャリア動物から得ることができる。
【0022】
本発明の他の具体的態様は、上記明細書中に記載されたように感染性プリオン蛋白により汚染されたか、または汚染の疑いのある位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法に関するものであり、このような位置は、感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品を含む。このような物品は、クランプ類、鉗子類、はさみ類、ナイフ類、ケーブル類、パンチ類、ピンセット類、カニューレ類、キャリパー類、カーバー類、キュレット類、スケーラー類、拡張器類、クリップアプリケータ類、開創器類、コントラクタ類、エキスカベータ類、持針器類、吸引管類、凝固電極類、脳波計深部電極類、肋骨並びに胸骨スプレッダー類、双極性プローブ類、および肋骨用鋏類などの手術器具を含むことができる。あるいは、このような物品は、ナイフ類、フォーク類、はさみ類、ピ−ラー類、皮むき器類、スライサー類、へら類、および包丁類などの食卓用金物類および台所用品、または容器類、ろ過装置類、遠心機類、分光光度計類、および蛍光光度計類などの実験用器具類、またはクランプ類、鉗子類、ナイフ類、のこぎり類、プローブ類および電子スタン器具などの獣医用器具類を含むことができる。
【0023】
処理される位置が物品を含む場合、ステップ(b)に用いられる蛋白分解酵素は、このような物品を洗浄および殺菌する目的で溶液形態において提供されることが好ましい。ケラチナーゼ類は、蛋白分解酵素として用いられるが、このような酵素溶液は、約0.2g/L〜約1.0g/Lの範囲内の低有効濃度により特徴づけられることが好ましい。
【0024】
本発明のさらなる態様は、(a)プリオン蛋白の熱分解温度以下の温度にプリオン蛋白を加熱すること、次いで(b)プリオン蛋白の酵素分解処理、を含む蛋白分解酵素の分解処理による感染性プリオン蛋白の分解性を向上させる方法に関する。
【0025】
本発明のなおさらなる態様は、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染されたウシ組織から感染性プリオン蛋白を除去する方法に関するものであって、(a)約100℃〜約150℃の範囲の温度でウシ組織を加熱処理すること、次いで(b)蛋白分解酵素が熱的に安定であって、ウシ組織に関連する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃〜約100℃の範囲の温度で、ウシ組織を蛋白分解酵素に曝露させることを含む方法に関する。前記加熱処理は約5分〜約5時間の時間で実施することが好ましく、ステップ(b)に用いられる蛋白分解酵素はバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを含むことが好ましい。
【0026】
熱安定性蛋白分解酵素は、本発明の実施に特に有用である。したがって、本発明の具体的な一態様は、組織を加熱することと同時に、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために十分な温度で、かつ十分な時間でこの組織を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることを含むステップにより、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する方法に関する;本発明の他の具体的な態様は、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織を含む組織組成物、および約35℃〜約100℃の温度範囲で熱的安定な蛋白分解酵素に関する。このような熱安定性蛋白分解酵素は、熱安定性プロテアーゼであることが好ましく、動物肉製品または副産物中のBSE媒介感染性プリオン蛋白を分解するため、十分な温度下で、かつ十分な時間で動物肉製品または副産物を処理するために用いることができる。
【0027】
本発明のさらなる他の態様は、組織中の感染性プリオン蛋白を減少させる組織の処理方法に関する。本法は、
(a)前記組織に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で組織を加熱するステップ;および
(b)このような組織に関連する感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱組織を曝露させるステップを含む。
【0028】
本発明のさらなる態様は、感染性蛋白プリオンによる汚染を受け易い物品を消毒する方法であって:
(a)前記物品に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解の感受性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で組織を加熱するステップと、
(b)前記物品に関連する感染性プリオン蛋白の少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱物品を曝露させるステップと、を含む方法に関する。
【0029】
さらなる態様において、本発明は、感染性プリオン蛋白で汚染された手術器具から感染性プリオン蛋白を除去する方法であって、(a)約100℃〜約150℃の範囲の温度で、例えば約5分〜約5時間の時間で手術器具を加熱すること、次いで(b)蛋白分解酵素が熱的に安定であって、前記手術器具を汚染する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃〜約100℃の範囲の温度で、前記加熱手術器具を蛋白分解酵素に曝露させること、を含む方法に関する。
【0030】
本発明のなおさらなる態様は、感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品を消毒する洗浄組成物であって、
(i)ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンからなる群から選択される1種以上の蛋白分解蛋白質と、
(ii)溶媒と、
を含む前記組成物に関する。
【0031】
本発明の洗浄組成物は、約0.2g/L〜1.0g/Lの濃度範囲内にあるケラチナーゼ酵素類を含むことが好ましい。過度の実験なしで通常の当業者により容易に決定できる蒸留水、緩衝液、洗浄液、アルコール、または酵素洗浄剤に通常用いられる任意の他の無機溶媒または有機溶媒などの種々の溶媒が本発明を実施する目的で使用できる。洗浄組成物は、限定しないが、界面活性剤、ビルダー、促進剤、充填剤および他の補助剤などの消毒/滅菌成績を高める1種以上の化学添加物をさらに含むことがより好ましい。
【0032】
本発明の他の態様、特徴および実施形態は、次の開示および添付の請求項からより十分に明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【0033】
発明の好ましい実施形態の詳細な説明
これ以降、より十分に記載される本発明とその特徴、態様および実施形態に関連して、本発明明細書の背景技術の節に引用されている技術文献の開示並びに以下の特許および技術文献は、それぞれ全体を引用文献として明細書中に組み入れてある:
米国特許第4,908,220号明細書;米国特許第4,959,311号明細書;米国特許第5,063,161号明細書;米国特許第5,171,682号明細書;米国特許第5,186,961号明細書;および米国特許第5,712,147号明細書;ジェイ・ピー・デスリーズ(Deslys,J.P.)「BSEに関する屠殺牛のスクリーニング(Screening slaughtered cattle for BSE)」、Nature、409卷、pp.476〜477、2001年1月25日;およびエフ・イー・コーエン(Cohen,F.E.)「Protein Misfolding and Prion Diseases(蛋白襞形成不良およびプリオン疾患)」、J.Mol.Biol.(1999年)、293巻、pp.313〜320。
【0034】
本発明は、組織中の感染性プリオン蛋白を分解するため、あるいは手術器具、食卓用金物類および台所用品、獣医用器具および実験用器具などのプリオン汚染物品の消毒または滅菌するための蛋白分解酵素の使用に基づいている。
【0035】
感染性プリオン蛋白単独の高温曝露(例えば、200℃で)では、それらの病原特性を変えることなく;さらに非感染性PrPcを完全に消化するプロティナーゼKなどの従来の蛋白分解酵素は、対応する感染性イソ体を破壊しないため、感染性プリオン蛋白の分解に関する本発明の方法の有効性はまったく予想外であった。というのは、したがって、従来、感染性PrPScの破壊に必要な焼却温度よりはるかに低い温度が、感染性PrPScを含有する組織または汚染組織から感染性PrPScを完全に除去するために、酵素処理用に使用できることは非常に驚くべきことである。
【0036】
明細書中に用いられるように、用語の高温とは少なくとも35℃の温度を意味する。用語の蛋白分解感受性とは、感染性プリオン蛋白が非感染性生成物に酵素的に分解される能力を意味する。
【0037】
組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白を減少させるための組織または物品などの位置の処理は、以下に記載されるように種々の技術により実施できる。
【0038】
例えば、本発明の一実施形態において、組織または物品(感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白により汚染されたか、または含有または汚染の疑いがある、のいずれかであり得る)を、存在するいずれのプリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するのに有効な蛋白分解酵素に前記組織または物品を曝露させることと共に、存在し得る感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるための十分な温度に、また十分な時間で加熱する。
【0039】
このような処理は、第一のより高い高温に前記組織または物品を加熱する最初のステップ、次に感染性プリオン蛋白の蛋白分解のために第二のより低い高温で酵素剤に前記加熱組織または物品を曝露することを含む、2ステップ連続で行うことができる。
【0040】
このような2ステップ法において、前記組織または物品は、第一のより高い高温で処理し、次いで、第二の酵素処理ステップにおいて蛋白分解酵素を接種させるか、あるいは蛋白分解酵素に曝露させる場合に前記組織または物品が好適な温度になるような第二のより低い高温へと、例えば、前記組織または物品から輻射熱の損失、前記組織または物品の対流冷却、または他の適切な方法により、冷却することができる。
【0041】
このような2ステップ法の第二のステップにおいて、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するのに有効な蛋白分解酵素に、前記組織または物品を曝露する。
【0042】
したがって、前記方法は、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を、前記組織または物品を引き続く蛋白分解酵素処理のため高温に加熱することによって高める種々の実施形態で行うことができる。加熱ステップにおける高温は、任意の好適な温度、例えば、少なくとも35℃、少なくとも40℃、少なくとも60℃、少なくとも75℃、および/または1つの実例となる具体的温度が約100℃〜約150℃、より好ましくは約125℃〜約140℃である、150℃以下(または所望の場合は、他のより低い温度)であってもよい。
【0043】
あるいは、本発明のプリオン蛋白破壊処理は、例えば処理方法に用いられる対応温度で安定かつ有効な(感染性プリオン蛋白を除去するために)単独ステップ法で実施できるので、最初の加熱ステップを必要としない。
【0044】
単独ステップ法において、動物組織または物品を蛋白分解酵素と共に、感染性プリオン蛋白の酵素分解を生じさせるために好適な高温に加熱する。
【0045】
例えば、感染性プリオン蛋白を含有するか、またはそれにより汚染された組織または物品中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する方法は、前記組織または物品の加熱と同時に、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するための十分な温度と十分な時間で前記組織または物品を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることにより実施できる。
【0046】
本発明の実施に使用される方法ステップの具体的な順序にかかりなく、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために有効な蛋白分解酵素(2ステップ法の第二のステップにおいて、または単独ステップ法の酵素分解ステップにおいて)に前記組織または物品を曝露する。
【0047】
使用される蛋白分解酵素の熱安定特性に依存して、酵素分解ステップは本発明の実施における任意の好適な温度、例えば、約35℃を超える温度、約40℃を超える温度、約50℃を超える温度で実施できる。
【0048】
例証として、使用される具体的な蛋白分解酵素の蛋白分解安定性および酵素活性に依存して、酵素分解ステップは、約35℃〜約100℃、約40℃〜約100℃、約50℃〜約100℃、約40℃〜約75℃、約50℃〜約60℃の範囲の温度で実施できる。
【0049】
酵素分解ステップにおいて、蛋白分解酵素は、処理される組織または物品中に存在するか、さもなければ組織または物品中に関連する感染性蛋白プリオンを少なくとも部分的に、好ましくは完全に破壊する。
【0050】
任意の多種多様のプロテアーゼ類が本発明の実施に使用でき、具体的な蛋白分解酵素の選択は、蛋白分解を行うために使用される温度の選択、並びに蛋白分解酵素への曝露前の組織、または物品の任意の高温処理の選択に影響を与えることが認識されるであろう。
【0051】
酵素処理の具体的温度処理条件、並びにこのような酵素処理する前の任意の高温における最初の処理ステップに必要または所望の温度条件は、当業界内で過度の実験なしで経験的に容易に決定できる。
【0052】
本発明の実施に使用される有用な蛋白分解酵素としては、それらの使用条件において酵素的に活性かつ有効な酵素類が挙げられる。高温での酵素処理に関して、蛋白分解酵素は使用条件において熱的に安定で好適である。
【0053】
この点について、熱安定性を広範に変える蛋白分解酵素が知られている。例えば、本発明の具体的実施形態において使用される種々の蛋白分解酵素は、35℃、40℃、50℃、60℃まで、または100℃まででも熱安定であり得る。
【0054】
蛋白分解酵素は、任意の好適な種類であってもよく、単独の酵素種あるいは酵素混合物を含んでもよい。酵素は純粋形態および濃縮形態、あるいは希釈形態で使用できる。酵素は、約0.2g/L〜約1.0g/Lまでの濃度の酵素溶液を形成する溶媒に溶解することが好ましい。
【0055】
本発明の広範な実施における例証的蛋白分解酵素としては、限定しないが、ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンが挙げられる。
【0056】
好ましい酵素種としてケラチナーゼ酵素類が挙げられる。特に好ましいケラチナーゼは、バチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを含む。本発明の実施に有用な蛋白分解酵素種としては、蛋白分解酵素の活性なフラグメント、例えばバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼなどのケラチナーゼ酵素の活性フラグメントが挙げられる。ケラチナーゼ酵素類が本発明に使用される場合、酵素溶液に必要な有効濃度は、従来の酵素洗浄剤または消毒剤の濃度よりも著しく低い。さらに、ケラチナーゼ酵素類は、約6.0から約9.5のpH値で、従来の酵素洗浄剤の大部分の温度よりも著しく高い約50℃から約65℃の最適活性温度範囲により特徴づけられる。したがって、本発明の方法の洗浄温度を著しく上昇させることができ、このことは手術器具に関連する感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるためにより有効である。
【0057】
組織を処理する本発明の方法において、処理される組織は、哺乳動物組織並びに非哺乳動物組織、また感染性プリオン蛋白を実際にまたは潜在的に含有する植物組織であってもよい。哺乳動物組織には、ヒト組織並びに非ヒト哺乳動物組織を含むことができる。
【0058】
具体的態様において、本発明の方法において処理できる組織は、限定しないが、ウシ組織、ヒツジ組織、サル組織およびヒト組織が挙げられ、種々の組織タイプ、例えば、脳組織、下垂体組織、腸組織、肺組織、心組織、腎組織および脾組織が挙げられる。一態様において、本発明の方法は、中枢神経系組織および/または末梢神経系組織であってもよい神経系組織を処理するために使用される。
【0059】
本発明の方法に従って、組織から感染性プリオン蛋白を酵素的に除去する方法、または手術器具などの物品の消毒/殺菌方法は、酵素的蛋白分解処理が完結した後、前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白の破壊を確認するために前記組織または物品を試験するステップをさらに含むことができる。感染性プリオン蛋白に関する前記組織または物品の試験は、任意の好適な方法、並びに任意の好適な検査法または方法論、例えばウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験、または処理される組織中の感染性プリオン蛋白の有無を確認するために有効である他の好適な試験により実施できる。
【0060】
本発明の酵素処理法は、任意の適切な一連の加工ステップを用いた任意の好適な方法で実施できる。
【0061】
例えば、一実施形態において、処理される組織または物品は、必要または所望の場合、最初に非酵素的熱処理に供され、次いで感染性または汚染性プリオン蛋白破壊のための酵素処理、次に濯ぎおよび非酵素処理、処理される組織または物品の試験、および/または処理後の試験が組織または物品からの感染性プリオン蛋白の除去が不完全であったことを示す場合必要ならば、さらなる熱/酵素処理(例えば、非酵素的熱処理および酵素的高温処理の交互かつ反復サイクルにおいて)に供される。
【0062】
他の実施形態において、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために十分な温度かつ十分な時間で、組織または物品を加熱することと同時に、組織または物品を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることを含むステップにより感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織または物品中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する。次いで処理された組織または物品を、感染性プリオン蛋白の除去を確認する試験に供することができる。
【0063】
さらに、本発明の方法は、任意の熱/酵素処理前に、処理される組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白存在を最初に決定することを含むことができるため、処理が感染性プリオン蛋白を含有すると決定され、確認される組織または物品にのみ適用される。
【0064】
あるいは、感染性プリオン蛋白を潜在的に含有するか、またはそれにより潜在的に汚染されている可能性はあるが、感染性プリオン蛋白の存在を予めはっきりと確認されていない組織または物品に前記熱/酵素処理を行ってから、感染性プリオン蛋白の存在を確認し、次いで前記組織または物品に関連する感染性プリオン蛋白の有無を決定するために処理生成物を試験してもよい。
【0065】
本発明の方法は、BSBなどのTSE類を媒介する感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白で汚染され易い肉および肉副産物中の感染性プリオン蛋白を破壊するために有効的に適用される。
【0066】
このように本発明の方法はまた、BSEおよび他の感染性プリオン蛋白疾患の伝染を避けるために焼却するよりも、食品加工および/または関連操作でさらに加工できるウシおよび他の動物製品と副産物の処理に対し信頼できる方法を提供する。
【0067】
このように本発明は、一実施形態においてプリオン蛋白を最初に非酵素的熱処理、例えば感染性プリオン蛋白の熱分解温度(>>200℃)(一般に焼却が実施される)以下の温度に加熱すること、次いで感染性プリオン蛋白を酵素分解する動物製品および副産物の加工法を考慮している。
【0068】
本発明の具体的例証の実施形態において、感染性プリオン蛋白は、約100℃〜約150℃の範囲の温度で、例えば約5分〜約5時間の時間でウシ組織を加熱処理することにより、次いで蛋白分解酵素が熱的に安定であり、ウシ組織中の感染性プリオン蛋白を破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃〜約100℃の範囲の温度で蛋白分解酵素にウシ組織を曝露させることにより、感染性プリオン蛋白を含有するウシ組織から除去される。
【0069】
加熱処理は、場合によっては、加熱処理操作において所望の大気圧、大気圧以下または大気圧以上を与える圧の制御と共に、高温条件が適切に維持される好適なチャンバー内または容器内で実施できる。
【0070】
加熱処理後、ウシ組織は、その中の全ての感染性プリオン蛋白を破壊するためにバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼによる酵素分解処理に供される。熱/酵素処理についで、前記組織は任意の好適な方法で加工できる。
【0071】
例えば、このようなウシ組織は、例えば感染性プリオン蛋白の完全な破壊の確認を試験またはアッセイ後、動物飼料成分(例えば、肉骨粉)または飼料サプリメントを生成するために加工できる。
【0072】
1つの特に好ましい加工実施形態において、加熱処理ステップは、約125℃〜約150℃の最初の高温範囲内で実施され、その後、ウシ組織の酵素処理は、約40℃〜約60℃の第二の高温範囲内においてバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを用いて実施される。
【0073】
本発明の方法は、他の場合では(感染性プリオン蛋白の存在が疑われる、または確認された場合)焼却または廃棄処分を必要とするであろう関連ウシ肉副産物の利用を可能にする。
【0074】
本発明の方法は、処理をしなければ、他の場合ではバイオハザードを構成するであろう物質の栄養学的利用を可能にする技術的に大きな進歩を達成する。本発明の方法は、感染または汚染動物組織の焼却、および廃棄処分に必要なコストおよび施設を同時に避けられる。
【0075】
本発明は、組織から感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に取り除くために十分な温度かつ十分な時間で、熱的安定な蛋白分解酵素に前記組織を曝露することにより、感染性プリオン蛋白、例えば、BSE媒介プリオン蛋白を組織から除去するための簡便な方法論を具現化する。
【0076】
本発明の方法は、伝染性海綿状脳症(TSE)および/または、限定しないが、ウシ海綿状脳症(BSE)およびヒツジスクラピーなどの他のプリオン蛋白媒介疾患に対し感染性であるプリオン蛋白の破壊に広く適用できる。
【0077】
本発明の方法は、ヒト食品用の動物肉の加工および、動物飼料または動物飼料成分用の動物副産物の加工への適用性を有する。
【0078】
1つの組成態様において本発明は、(i)組織、例えば、プリオン蛋白媒介BSEなどの感染性プリオン蛋白を含有するウシ組織、(ii)酵素処理に使用される温度範囲、例えば、約40℃から約60℃で熱的安定である蛋白分解酵素、例えば、バチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼなどの組織組成を含む。
【0079】
このような組織組成は高温にあってもよい。前記組成は、好適な高温で酵素的に反応性であって、蛋白分解酵素および感染性プリオン蛋白の無い処理組織を含む生成組成物を生成する。
【0080】
本発明は、主として引き続く動物飼料成分の生産用に提供された動物部分など、採取状態で感染または汚染されている動物組織の処理への適用において上記に例証として記載したが、本発明はまた、プリオン疾患インビボ処理用の蛋白分解酵素の適用を含む。
【0081】
このような一実施形態において、治療用組成物は、プリオン疾患に対する治療的に有効な蛋白分解酵素を有効成分として含む、インビボプリオン疾患治療用に提供される。
【0082】
他の実施形態としては、インビボで感染性プリオン蛋白の分子認識蛋白として役立つ非感染性プリオン蛋白(例えば、PrPc、同じものを非感染性にするために修飾されたPrPSc、またはPrPScの非感染性フラグメント)と組合せた、ケラチナーゼを含有する治療用組成物を含む。
【0083】
方向づけされた構成物または組合せでケラチナーゼまたは他の蛋白分解酵素を含む、さらに他の治療用組成物が考慮されている。
【0084】
他の例証とする治療用組成物としては、インビボ熱分解誘導時にプリオン疾患に対し、実戦的に有効である蛋白分解酵素と組合せた、非毒性修飾エンドトキシン類縁体などの発熱剤が挙げられる。
【0085】
本発明はまた、蛋白分解酵素またはその活性フラグメントの生産のためにコード化する第一の領域、組み替えポリヌクレオチド発現ベクターの一部として発熱性ペプチドをコードする第二の領域などのポリヌクレオチド配列を含むインビボ治療用組成物を含む。トランスフェクション後、熱安定性蛋白分解酵素またはその活性フラグメントのインビボ発現、および発熱性ペプチドは、感染性プリオン蛋白の除去作用をもたらす。
【0086】
なおさらなる例として、治療用組成物は、伝染性海面状脳症への適用において、血液脳関門を通過できる両親媒性薬物オリゴマー共役物のような血液脳関門通過剤により製剤化できる。このような組成物は、治療用化合物、例えばケラチナーゼ、または他の蛋白分解酵素、またはオリゴマーが親水性部分に結合した親油性部分を含む、オリゴマーに共役したその活性フラグメントを含むことができる。このような治療用組成物を製剤化するのに有用なオリゴマー類は、2000年2月24日に公開された国際公開WO00/09073により完全に記載されている。
【0087】
本発明の方法の他の重要な適用は、手術器具、食卓用金物、台所用品、実験装置、および獣医用器具などの物品の消毒および/または滅菌である。このような方法は、
(a)クランプ類、鉗子類、はさみ類、ナイフ類、ケーブル類、パンチ類、ピンセット類、カニューレ類、キャリパー類、カーバー類、キュレット類、スケーラー類、拡張器類、クリップアプリケータ類、開創器類、コントラクタ類、エキスカベータ類、持針器類、吸引管類、凝固電極類、脳波計深部電極類、肋骨並びに胸骨スプレッダー類、双極性プローブ類、および肋骨用鋏類などの手術器具類;
(b)ナイフ類、フォーク類、はさみ類、ピ−ラー類、皮むき器類、スライサー類、へら類、および包丁類などの食卓用金物類および台所用品;
(c)ろ過装置類、遠心機類、分光光度計類、蛍光光度計類および種々の容器類などの実験用器具類;
(d)クランプ類、鉗子類、ナイフ類、のこぎり類、プローブ類および電子スタン器具などの獣医用器具類、
に関連するプリオン蛋白汚染物の破壊に広く適用できる。
【0088】
上記リストは、本発明の幾つかの適用の例証としてのみ挙げており、本発明の範囲を限定するような仕方で解釈すべきではない。
【0089】
下表は、本発明の一実施形態にしたがった消毒/滅菌サイクルを示している。
【0090】
【表1】
【0091】
他の実施態様において、熱安定性蛋白分解酵素は、このような消毒/滅菌工程に用いられて、加熱と酵素洗浄ステップが、感染性プリオン蛋白の完全破壊および処理物品の消毒に十分な温度かつ十分な時間で同時に実施できる。
【0092】
1つの組成態様における本発明は、(i)酵素処理に使用される温度範囲、例えば、約40℃〜約60℃に熱的安定である蛋白分解酵素、例えば、バチルス−リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼ;(ii)溶媒を含んだ洗浄組成物を含む。
【0093】
酵素洗浄剤の使用に好適な任意の溶媒が本発明の組成物に使用できる。生物学的相溶性並びに低コストを鑑みて、蒸留水が好ましい溶媒である。アルコール、緩衝液、洗浄液などの他の従来の無機および有機溶媒もまた、本発明を実施する目的で使用でき、通常の当業者は、使用される具体的酵素と調和する溶媒を容易に選択できる。従来から使用される化学添加物もまた、本発明の洗浄組成物に導入でき、限定しないが、界面活性剤、ビルダー、促進剤、充填剤および他の補助剤などが挙げられる。
【0094】
本発明の洗浄組成物は、例えば、0.3g/L未満の極低濃度であっても感染性プリオン蛋白を破壊するための有効性を保持する。ケラチナーゼ酵素がこのような洗浄組成物で使用される場合、このような組成物の酵素濃度は、約0.2g/L〜約1.0g/Lの範囲内が好ましい。
【0095】
本発明の洗浄組成物は、高温で酵素的に反応性があり、したがって、手術器具、食卓用金物、台所用品、獣医用器具および実験器具に関連する感染性プリオン蛋白の完全破壊のための高温で使用できる。
【0096】
本発明の特徴および利点は、以下の例証的実施例を参照として、より十分に示されている。
【実施例】
【0097】
実施例1
家禽廃液の好熱嫌気性消化槽から単離された羽毛分解細菌であるバチルス-リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼ(シー・エム・ウィリアムス(C.M.Williams)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、J.Appl.Bacteriol.、67巻、p.25(1989年);ジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Poultry Sci.72巻、p.1617(1993年)を参照)は、本実施例に使用されたケラチナーゼ酵素源であった(エックス・リン(X.Lin)、シー・ジー・リー(C.G.Lee)、イー・エス・カサーレ(E.S.Casale)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Environ.Microbiol.、58巻、p.3271(1992年)を参照)。
【0098】
このケラチナーゼ酵素をエンコードする遺伝子(エックス・リン(X.Lin)、ディー・ダブリュー・ケレメン(D.W.Kelemen)、イー・エス・ミラー(E.S.Miller)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Env.Microbiol.、61巻、p.1469(1995年)を参照)が単離されて塩基配列決定され、本酵素のスケールアップ醗酵生産も確立されている(ジェー・ジェー・ワング(J.J.Wang)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、J.Ind.Microb.Biotech.22巻、p.608(1999年)を参照)。
【0099】
このケラチナーゼの粗製および精製調製物は、前記のとおり生産され(エックス・リン(X.Lin)、シー・ジー・リー(C.G.Lee)、イー・エス・カサーレ(E.S.Casale)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Environ.Microbiol.、58巻、p.3271(1992年)およびジェー・ジェー・ワング(J.J.Wang)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、J.Ind.Microb.Biotech.22卷、p.608(1999年)を参照)、ノースカロライナ州ラレイ、ノースカロライナ州立大学(NCSU)醗酵施設から入手した。PrPに対するケラチナーゼの有効試験は、オランダ国,レリスタッド動物科学健康研究所(Instirute of Animal Science and Health at Lelystad)(ID−レリスタッド(Lelystad))で実施された。
【0100】
精製ケラチナーゼは、種々の基質との反応においてエラスターゼ、コラゲナーゼ、プロテイナーゼKおよびトリプシン(すべてシグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.)から入手)などの他のプロテアーゼと比較された。ケラチン、エラスチンおよびコラーゲンの加水分解は、増加遊離アミノ基のニンヒドリンカラー反応(A450)により測定された(エックス・リン(X.Lin)、シー・ジー・リー(C.G.Lee)、イー・エス・カサーレ(E.S.Casale)およびジェー・シー・エッチ・シー(J.C.H.Shih)、Appl.Environ.Microbiol.、58巻、p.3271(1992年)を参照)。遊離ロイシンは、当量の遊離アミノ基を算出する標準物質として用いられた。カゼイン加水分解は、上澄液中の増加A280により測定した(プライス(Price)およびジョンソン(Johnson)、1989年を参照)。これらの結果を下表1に示す。与えられた各々の基質に関して、全てのプロテアーゼの相対活性を決定した。累積相対活性(CRA)は、ケラチナーゼが広範囲の基質および高活性を有することを示した。
【0101】
【表2】
【0102】
病原性PrPに対するケラチナーゼの有効試験は、ID−レリスタッド(Lelystad)、分子認識ラボラトリーの単離施設(an Isolation Facility in the Laboratory of Molecular Recognition)で実施された。プリオニックスチェックのヨーロッパユニオン検証法(European Union−validated procedure of Prionics Check)(プリオニックス(Prionics)AG、チューリッヒ)が病原性PrPを検出するために用いられた。プリオニックスチェック(Prionics Check)法は、ウェスタンブロット法に基づいており、PrPの具体的形態を視覚化するために6H4モノクローナル抗体を使用する(プリオニックス(Prionics)AG、ウシにおけるBSEプリオンの検出試験、実用製品情報、チューリッヒ(2000年))。
【0103】
肉骨粉工程を模擬するために、原型方法の変更がなされた。第一に、標準法におけるプロテイナーゼKの替わりにケラチナーゼを用いた。ケラチナーゼの粗製調製物を用いた。第二に、BSE組織の前加熱処理効果を試験した。均質化組織を、バルカイン(Vulcain)加圧加熱器により115℃で40分間加熱処理した。第三に、抗酸化剤の亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)も試験した。本法の残りは、製造元の実用製品情報(プリオニックス(Prionics)AG、ウシにおけるBSEプリオンの検出試験、実用製品情報、チューリッヒ(2000年))に記載されたものと同じであった。
【0104】
以下のプロトコルを使用した。1gのBSE陽性脳組織を混合し、9mlのプリオニックス(Prionics)緩衝液で均質化した。半分の分割量である5mlにNa2SO3を加えて、最終濃度0.1%とし、他の半分はNa2SO3なしで行った。分割量4×2.0mlをオートクレーブ用のファルコン(Falcon)管に分配した。さらに1.0mlを陽性対照に使用して標準的プリオニックス法により処理し、他の1.0mlをケラチナーゼなしの対照に使用した。Na2SO3有無の2本の管を40分間加圧加熱処理し、他の2本の管は加熱処理しなかった。PCRプレートのウェルに、サンプル各150μlを50℃で0時間または4時間ケラチナーゼ(150μg、1,000BU/mg)により処理した。ケラチナーゼを、0.05M、pH7.5のリン酸緩衝液に予め溶解した。反応を、セリンプロテアーゼ阻害剤のプリオニックス・ペファブロック(Prionics Pefabloc)の添加により中止した。酵素温置の終末時に、10μlの各サンプル混合液を、SDS−PAGEゲル上に載せ、次いで電気泳動、ウェスタンブロット、および免疫化学発光検出のプリオニックス法を行った。
【0105】
この実験結果を図1に示し(BSEプリオン蛋白に対するケラチナーゼ分解の効果)、図中、1〜17レーンは次の通りである:
レーン1:緩衝液単独。
レーン2:試験したBSE脳組織。
レーン3:Na2SO3有りで前加熱処理し、ケラチナーゼは0時間で中止。
レーン4:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン3と同じ。
レーン5:Na2SO3なしで前加熱処理し、ケラチナーゼは0時間で中止。
レーン6:レーン5と同じでケラチナーゼ消化は4時間。
レーン7:前加熱処理なし、Na2SO3有り、ケラチナーゼは0時間。
レーン8:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン7と同じ。
レーン9:前加熱処理なし、Na2SO3なし、ケラチナーゼは0時間。
レーン10:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン9と同じ。
レーン11:前加熱処理なし、Na2SO3あり、ケラチナーゼなし。
レーン12:4時間の温置以外レーン11と同じ(注:ケラチナーゼを偶然に加えた)。
レーン13:Na2SO3有りで精製スクラピーPrP、ケラチナーゼは0時間で中止。
レーン14:4時間のケラチナーゼ消化以外レーン13と同じ。
レーン15:Na2SO3有りで精製スクラピーPrP、ケラチナーゼなし。
レーン16:4時間の温置以外レーン15と同じ
レーン17:PrP標品。
【0106】
図1に示されるように、特にサンプルを115℃で40分間前加熱処理する場合、感染性PrPに対するケラチナーゼの消化効果が明白である(レーン3〜6)。前加熱処理なしでは(レーン7〜10)、ケラチナーゼの有効性が少なくなったが、ケラチナーゼは依然として、感染性PrP陽性物質の半分以上を分解した。精製ヒツジスクラピーPrPに対して、ケラチナーゼは、同様に活性であることが判明した(レーン13〜16)。Na2SO3の存在は、単独またはケラチナーゼとの存在のいずれも大きな差があるように見えなかった(レーン15〜16)。
実施例2
本発明の有効性をさらに立証するために、以下の実験手順に従って実験を行った。
【0107】
感染したウシおよびヒツジの脳幹組織におけるPrPScの分解を実施するために、バチルス-リケニフォルミス株PWD−1ケラチナーゼ由来のセリンプロテアーゼであるPWD−1ケラチナーゼが用いられた。サンプル中のPrPScを確認するためにプリオニックスチェック試験(Prionics AG、スイス国チューリッヒ)を用い、続いて組織サンプルの前加熱処理、消化酵素として精製PWD−1ケラチナーゼを用いて組織サンプルの消化を行った。
【0108】
各例とも、1gのBSE陽性の脳幹組織を9mlのプリオニックス(Prionics)均一化緩衝液と混合し、均質化してから、バルカイン(Vulcain)加圧加熱器により115℃で40分間加圧加熱処理した。96ウェルのプレートに各サンプル150μlを加え、0.05M、pH7.5のリン酸緩衝液に予め溶解したPWD−1ケラチナーゼで処理した。250μg/mlの酵素濃度を使用した。酵素消化は50℃で60分間実施した。反応を、セリンプロテアーゼ阻害剤である15μlのペファブロック(Pefabloc(登録商標))の添加により中止した。ゼロ時間サンプルでは、先ずこの阻害剤を添加してからPWD−1ケラチナーゼを添加した。酵素温置の終末時に、10μlの各サンプルを、SDS−PAGEゲル上に載せた。プリオニックスチェックキットに概説されているとおり、電気泳動、ウェスタンブロッティング、および免疫化学発光による検出を行った。
【0109】
BSE陽性(サンプルB1、B2、B3)3個、陰性(ウシサンプルN)1個、スクラピー陽性(サンプルS1とS2)および陰性(ヒツジサンプルN)の脳幹組織サンプルを精製PWD−1ケラチナーゼにより対応する対照に対して試験した。
【0110】
図2はその結果を示しているが、左側部分(「ケラチナーゼ処理」)は、ケラチナーゼ消化の結果であり、右側部分(「対照」)はプリオニックスチェック標品の結果である。ケラチナーゼは、BSE(レーン3〜5)並びにスクラピー(レーン8と9)の全ての被験PrPScを加水分解できた。
【0111】
プリオン蛋白を含有するウシサンプル(サンプルB1、B2、B3)およびプリオン蛋白を含有するヒツジサンプル(サンプルS1とS2)を本発明に従って、熱処理と酵素処理を組合せて処理すると、これらのサンプル中の感染性プリオンサンプル蛋白が完全に破壊されることを、この図は立証している。
【0112】
これらの結果は、全ての種類の被験蛋白質の分解におけるケラチナーゼの多能性を立証している。BSEPrPに対するケラチナーゼの有効性試験において、結果は、特にBSE脳幹組織サンプルが前加熱処理された場合は陽性であった。これは病原性PrPが酵素によって分解されることを立証する初めての実験である。
【0113】
凡そ125℃の温度での加圧過熱処理は、動物副産物の肉骨粉への加工における通常のステップである。感染性PrPの破壊に関して本発明に従ったケラチナーゼによる加熱後処理は、BSEの伝播を抑えるために有効な方法を提供する。ケラチナーゼ処理された肉骨粉はPrPが存在しないことを確認する試験が容易に行われるので、肉骨粉は飼料使用のためにリサイクルできる。
【0114】
このように、本発明の方法は、動物製品および副産物の加工のための簡便で有用な酵素的処理を提供する。
【0115】
本発明は、明細書中に種々の例証的特徴、態様および実施形態を参照させて記載したが、本発明の利用は、それに限定されず、通常の当業者が容易に考え得る他の変更、修飾および他の実施形態に拡大され、また包含することは解されるであろう。
【0116】
したがって、本発明は、以後の請求項にある本発明の精神と範囲内でそのような他の変更、修飾および他の実施形態を包含するものとして広く判断し、解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【0117】
産業的有用性
本発明の方法および組成物は、感染性プリオン蛋白の破壊に有用であり、感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白で汚染された生物材料、例えば動物組織の処理に適用できる。他の場合(感染性プリオン蛋白の存在が疑われるか、または確認された)には、本発明は有用で安全な動物飼料または他の栄養最終産物にするために焼却および廃棄処分を要するであろう生物材料の加工を可能にする。本発明の方法および組成物はまた、手術器具、食卓用金物、台所用品、実験器具および獣医用器具などの物品の消毒および/または滅菌に有用であり、このような物品の再使用によって生じる感染性プリオン蛋白の交差汚染および伝播を効果的に防ぐ。
【図面の簡単な説明】
【0118】
【図1】感染性プリオン蛋白の破壊のために本発明の方法の有効性を立証するSDS−PAGEゲル上のゲル電気泳動/ウェスタンブロット結果を示す図である。
【図2】感染性プリオン蛋白の破壊のために本発明の方法の有効性を立証するSDS−PAGEゲル上のゲル電気泳動/ウェスタンブロット結果を示す図である。
Claims (61)
- 感染性プリオン蛋白で汚染または汚染の疑いがある位置における感染性プリオン蛋白を減少させるための処理方法であって:
(a)前記位置における感染性プリオン蛋白の蛋白分解の感受性を高める十分な温度で、かつ十分な時間、前記位置を加熱するステップと;
(b)かかる位置における感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に効果的である蛋白分解酵素に前記加熱位置を曝露させるステップと、を含む方法。 - ステップ(a)における温度が、約150℃を超えない温度を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)における温度が、約100℃から約150℃の範囲の温度を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)における温度が、約125℃から約140℃の範囲の温度を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)が、約35℃から約100℃の範囲の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)が、約40℃を超える温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)が、約50℃を超える温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)がス、テップ(a)の温度よりも低い温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)が、約40℃から約75℃の範囲の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)が、約50℃から約60℃の範囲の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記蛋白分解酵素が、ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンからなる群から選択される酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記蛋白分解酵素が、角質分解酵素および/またはその活性フラグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記蛋白分解酵素が、バチルス−リケニフォルミスPWD−1酵素および/またはその活性フラグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- さらに前記位置内の感染性プリオン蛋白の減少を確認するために前記位置を試験するステップ(C)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試験ステップ(C)が、前記位置をウェスタンブロット試験、サンドイッチ免疫学的検定試験、ELISA試験、蛍光免疫学的検定試験、毛管免疫電気泳動試験、およびプラスミノーゲン結合試験からなる群から選択された試験に供することを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記試験ステップ(C)が、前記位置を前記ウェスタンブロット試験に供することを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記位置が感染性プリオン蛋白を含有するか、または前記位置内の感染性プリオンにより汚染された組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組織が哺乳動物の組織を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織が神経系組織を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織がウシ組織を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織がBSE感染組織を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織がヒツジ組織を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織がスクラピー感染組織を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組織が、脳組織、下垂体組織、腸組織、肺組織、心組織、腎組織および脾組織からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記組織が感染性プリオン蛋白のキャリア動物由来である、請求項17に記載の方法。
- 前記位置が、感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記物品が手術器具を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記手術器具が、クランプ類、鉗子類、はさみ類、ナイフ類、ケーブル類、パンチ類、ピンセット類、カニューレ類、キャリパー類、カーバー類、キュレット類、スケーラー類、拡張器類、クリップアプリケータ類、開創器類、コントラクタ類、エキスカベータ類、持針器類、吸引管類、凝固電極類、脳波計深部電極類、肋骨並びに胸骨スプレッダー類、双極性プローブ類、および肋骨用鋏類からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記物品が食卓用金物類および台所用品を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記食卓用金物類および台所用品が、ナイフ類、フォーク類、はさみ類、ピ−ラー類、皮むき器類、スライサー類、へら類、および包丁類からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記物品が実験用器具類である、請求項26に記載の方法。
- 前記実験用器具類が、容器類、ろ過装置類、遠心機類、分光光度計類、および蛍光光度計類からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記物品が獣医用器具類を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記獣医用器具類が、クランプ類、鉗子類、ナイフ類、のこぎり類、プローブ類および電子スタン器具からなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記蛋白分解酵素がプロテアーゼ酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ酵素がカルボニルヒドロラーゼを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記カルボニルヒドロラーゼがスブチリシンを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記スブチリシンが、1個以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を含む野生型バチルス−アミロリケファシエンス−スブチリシン(Bacillus amyloliquefaciens subtilisin)の突然変異体を含む請求項37に記載の方法。
- 蛋白分解酵素の分解処理により、感染性プリオン蛋白の分解性を向上させる方法であって、
(a)プリオン蛋白の熱分解温度以下の温度にプリオン蛋白を加熱すること、次いで、
(b)プリオン蛋白の酵素分解処理すること
を含む方法。 - 感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染されたウシ組織から感染性プリオン蛋白を除去する方法であって、
(a)約100℃から約150℃の範囲の温度でウシ組織を加熱処理すること、
(b)蛋白分解酵素が熱的に安定であって、ウシ組織に関連した感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃から約100℃の範囲の温度で、ウシ組織を蛋白分解酵素に曝露させること、
を含む方法。 - 前記加熱処理が、約5分から約5時間の時間で実施される、請求項40に記載の方法。
- 蛋白分解酵素がバチルス−リケニフォルミスPWD−1ケラチナーゼを含む、請求項40に記載の方法。
- (a)感染性プリオン蛋白を第一の高温範囲の温度に加熱すること、次いで
(b)感染性プリオン蛋白を第二の高温範囲において低い高温に冷却すること、
(c)感染性プリオン蛋白を良性の分解産物に分解するようなより低い高温で効果的な蛋白分解酵素に感染性プリオン蛋白を曝露させること、
を含む感染性プリオン蛋白を分解する方法。 - 感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織または物品を加熱することと同時に、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために十分な温度で、かつ十分な時間で組織または物品を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることを含むステップにより、前記組織または物品中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する方法。
- 動物肉製品または副産物を、それらからBSE媒介感染性プリオン蛋白を除くための加工方法であって、動物肉製品または副産物の中のBSE媒介感染性プリオン蛋白を分解するために十分な温度下で、かつ十分な時間でそれらを熱安定プロテアーゼにより処理することを含む方法。
- 感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織と、約35℃から約100℃の温度範囲で熱的に安定な蛋白分解酵素と、を含む組織組成物。
- 組織中の感染性プリオン蛋白を減少させる組織の処理方法であって、
(a)組織中感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で組織を加熱するステップと、
(b)このような組織における感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱組織を曝露させるステップと、
を含む方法。 - 感染性プリオン蛋白による汚染を受け易い物品を消毒する方法であって、
(a)前記物品に関連した感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるために十分な温度に、かつ十分な時間で前記組織を加熱するステップと、
(b)前記物品に関連した感染性プリオン蛋白の少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱物品を曝露させるステップと、
を含む方法。 - 感染性プリオン蛋白で汚染された手術器具から感染性プリオン蛋白を除去する方法であって、
(a)約100℃から約150℃の範囲の温度で手術器具を加熱すること、次いで、
(b)蛋白分解酵素が熱的に安定であって、前記手術器具を汚染している感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に破壊するために蛋白分解的に有効な約35℃から約100℃の範囲の温度で、前記加熱手術器具を蛋白分解酵素に曝露させること、
を含む方法。 - 感染性プリオン蛋白による汚染を受けやすい物品を消毒する洗浄組成物であって、
(i)ケラチナーゼ酵素類、プロティナーゼK、トリプシン類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、高好熱性プロテアーゼ類、カルボニルヒドロラーゼ、パパイン、パンクレアチン、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、フィシン、カルボキシペプチダーゼ、キモパパインおよびブロメリンからなる群から選択される1種以上の蛋白分解蛋白質と、
(ii)溶媒と、
を含む組成物。 - ケラチナーゼ酵素類を含む、請求項50に記載の洗浄組成物。
- 前記ケラチナーゼ酵素類の濃度が、約0.2g/L〜約1.0g/Lの範囲内にある、請求項51に記載の洗浄組成物。
- 前記溶媒が、蒸留水、アルコール、緩衝液および洗浄剤溶液からなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
- 界面活性剤、ビルダー、促進剤および充填剤からなる群から選択される一つ以上の化学添加物をさらに含む、請求項50に記載の洗浄組成物。
- 組織中の感染性プリオン蛋白を減少させる組織処理方法であって、
(a)組織中感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるために少なくとも40℃の温度に、かつ十分な時間で組織を加熱するステップと、
(b)このような組織における感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に加熱組織を曝露させるステップと、
を含む方法。 - (a)感染性プリオン蛋白を、60℃以上であるが、プリオン蛋白熱分解温度以下である第一高温範囲の温度に加熱すること、次いで(b)感染性プリオン蛋白を第二の高温範囲におけるより低い高温に冷却すること、(c)感染性プリオン蛋白を良性の分解産物に分解するようなより低い高温で有効な蛋白分解酵素に感染性プリオン蛋白を曝露させること、
を含む感染性プリオン蛋白を分解する方法。 - 感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白に汚染された組織を加熱することと同時に、感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解するために40℃以上であるが、プリオン蛋白の熱分解温度以下の温度で、かつ十分な時間で前記組織を熱安定性蛋白分解酵素に曝露させることを含むステップにより、前記組織中の感染性プリオン蛋白を少なくとも部分的に分解する方法。
- 動物肉製品または副産物を、それらからBSE媒介感染性プリオン蛋白を取り除くための加工方法であって、動物肉製品または副産物の中のBSE媒介感染性プリオン蛋白を分解するために60℃以上であるが、プリオン蛋白の熱分解温度以下の温度下で、かつ十分な時間でそれらを熱安定プロテアーゼにより処理することを含む方法。
- 感染性プリオン蛋白を含有するか、または感染性プリオン蛋白によって汚染された組織と、ケラチナーゼ酵素類、キモトリプシン類、ペプシン類、キモシン類、カテプシン類、スブチリシン類、エラスターゼ類、コラゲナーゼ類、エンドペプチダーゼ類、ペプチダーゼ類、オリゴペプチダーゼ類、サーモリシン類、バシロリシン(bacillolysin)、ミシリシン類(mycilysins)、カルボキシペプチダーゼ類、ロイシルアミノペプチダーゼ類、アミノペプチダーゼ類、および高好熱性プロテアーゼ類からなる群から選択される蛋白分解酵素と、を含む組織組成物。
- 動物肉製品または副産物を、40℃以上であるが、プリオン蛋白の熱分解温度以下の温度で、かつ十分な時間で動物肉製品または副産物に関連した感染性プリオン蛋白の分解に有効なプロテアーゼで処理することを含む、動物肉製品または副産物の加工方法。
- 感染性プリオン蛋白で汚染されたか、または汚染の疑いがある位置における感染性プリオン蛋白を減少させる処理方法であって、
(a)前記位置の感染性プリオン蛋白の蛋白分解感受性を高めるために少なくとも40℃の温度に、かつ十分な時間で前記位置を加熱するステップと、
(b)このような位置における感染性蛋白プリオンの少なくとも部分的減少に有効である蛋白分解酵素に前記加熱位置を曝露させるステップと、
を含む方法。
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