JP2006504500A - プリオン汚染除去 - Google Patents
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Abstract
本発明はさらに、洗浄剤及びプロテアーゼを含有するプリオン汚染除去用キット、並びに洗浄剤及びプロテアーゼを含有するプリオン汚染除去用組成物に関する。
Description
Taylor D. M.、Inactivation of prions by physical and chemical means. 1999、J. Hosp. Infect. 43、69-76.
温度/プロテアーゼ濃度の最適条件
当業者には明らかであるが、プロテアーゼ(1種以上)の濃度が高いほど、破壊度と破壊速度は高くなる。プロテアーゼ濃度と時間の組み合わせは必要に応じて選択できる。これらは通常の試行錯誤によって最適化できる。
2種以上のプロテアーゼを使用する場合には、それらのプロテアーゼを単一工程にまとめてもよい。しかし、そのような態様においては、各プロテアーゼが他のプロテアーゼを消化するために、プロテアーゼ活性が低下することがある。従って、最大効果を得るには、本発明の方法における各工程を順次実施すると有利である。また、第二のプロテアーゼ又はそれ以降のプロテアーゼに物品を接触させる前に、第一のプロテアーゼの少なくとも一部は有利に除去される。より好ましくは、第二のプロテアーゼ又はそれ以降のプロテアーゼに物品を接触させる前に、第一のプロテアーゼは実質的にすべて除去される。このことは、複数工程シーケンスにおける各プロテアーゼ処理工程に一様にあてはまる。
上記洗浄剤は、好ましくはイオン性洗浄剤、好ましくはアニオン性洗浄剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物、1−オクタンスルホン酸ナトリウム1水和物、ドデシル硫酸リチウム又はN−ラウロイルサルコシンナトリウム塩のうちの1種又はそれ以上である。好ましくは、上記洗浄剤はSDSである。
オートクレーブ処理は、適切なオートクレーブサイクルであればいかなるサイクルによっても実施できる。代表的なサイクルとしては、121℃で18分間、又は好ましくは134℃で18分間がある。実施者が自らの特別なニーズに合わせて他のサイクルを選択することもできる。オートクレーブサイクルを有利に延長することもできる。
汚染除去すべき物品は、プリオンの不活化又は除去が望ましい物理的アイテムであればどんなものでもよい。この用語には、溶液(1液以上)及び装置又は医療機器(外科用器具を含む)などの物体、特に金属製の物体又はそれらの部品(1つ以上)が包含される。不活化又は除去されるプリオンは、物品中(例えば溶液中又は懸濁物中)に存在していてもよく、或いは物品上に存在(例えば物品表面に結合、付着、又はそれ以外の結びつきを)していてもよい。従って、上記物品は表面を有していてもよい。この表面は、医療機器の表面であってもよい。この表面は、金属を含んでいてもよい。この金属は、外科用鋼鉄などの鋼鉄であってもよい。
汚染除去とは、特定の検体又は環境におけるプリオン価の低減を指す。汚染除去とは、このプリオンが不活化されているかどうかに関わらず表面からのプリオンの除去を指す場合がある。従って、汚染除去には不活化が包含され、また、プリオンが破壊/不活化されるかどうかとは無関係にプリオンを除去することが包含される。汚染除去を行う場合、汚染除去対象表面又は溶液からプリオン感染性が取り除かれることが重要である。このことは、破壊(不活化)又は単純な分離によって行える。重要な点は、汚染除去対象表面又は溶液にプリオン(即ちPrPSc)がもはや結びついていないこと、或いは数及び/又は感染価が低下していることである。明らかに、非感染性のプリオン断片が汚染除去後に依然として表面に付着していたとしても、汚染除去つまりこの表面の汚染除去が成功したという事実には実質的影響はないであろう。
本発明の方法により達成されるプリオン低減は、好適な手段であれば当業者に公知のいかなる手段によってもモニターできる。プリオン低減の評価を示すため、本明細書中に好適なアッセイ手法の具体例を提示する。
本発明はまた、汚染除去に使用するキットに関する。従って、本発明により、洗浄剤並びにプロテイナーゼK、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択されるプロテアーゼを含むキットが提供される。好ましくは、このキットは、2種類以上のプロテアーゼを含む。好ましくは、このキット中の洗浄剤はSDSである。
本発明はまた、汚染除去に使用するための組成物に関する。一態様においては、本発明により、イオン性洗浄剤並びにプロテイナーゼK、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される1種以上のプロテアーゼを含む組成物が提供される。好ましい態様においては、この組成物はこのようなプロテアーゼを2種以上含む。より好ましい態様においては、この組成物の洗浄剤はSDSである。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらには限定されない。実施例においては以下の図を参照する。
プリオン感染価を100万分の1に低減させる洗浄剤及び蛋白分解酵素併用処理について説明する。
この実施例では、洗浄剤の存在下で物品を2種類の蛋白分解酵素(プロテイナーゼK及びプロナーゼ、又はプロナーゼ及びパパイン)に順次曝露することにより感染性物質であるPrPScを水性懸濁物中で不活化できる方法について説明する(この実施例では、この物品とは被感染脳組織である)。
脳組織を18ゲージ、21ゲージ、及び23ゲージの注射針に通すことにより、vCJDに感染したヒト前頭皮質の脳をPBS−ダルベッコ培地(GIBCO-BRL 14190-094)中にホモジナイズして20%(w/v)にした。ホモジネートをPBSで希釈して15%(w/v)にし、少量のアリコートとして−70℃で冷凍保存した。
(a)洗浄剤による処理:ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)。15%ホモジネートのアリコート20μlを、スクリューキャップ付きエッペンドルフ試験管に量り取り、5μlの20% SDSを加えて最終濃度を4% SDSとした。この混合物を15分、99−100℃で加熱した後、室温まで冷却した。40℃までの冷却であれば同様に許容されるであろう。
(b)第一のプロテアーゼによる処理:プロテイナーゼK(PK)。40μg/mlのPK溶液を二回蒸留水で調製した。この酵素溶液のアリコート5μlを、上記手順(a)で作製した洗浄剤処理したホモジネート溶液25μl溶液に加えた。即ち、プロテイナーゼKの最終濃度は6.6ug/mlである。この混合物を40℃で30分間インキュベートした。
(c)第二のプロテアーゼによる処理:プロナーゼ。2mg/mlプロナーゼの0.1M TRIS/HCl pH7.5溶液を調製した。この酵素溶液のアリコート0.5μlを、順次上記手順(a)及び(b)を用いて作製した、SDS処理及びPK処理したホモジネートの30μl溶液に加えた。即ち、プロナーゼの最終濃度は33ug/mlである。この混合物を40℃で30分間インキュベートした。
(a)洗浄剤による処理:ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)。15%ホモジネートのアリコート20μlをスクリューキャップ付きエッペンドルフ試験管に量り取り、5μlの20% SDSを加えて最終濃度を4% SDSにした。この混合物を15分間99−100℃で加熱した。次いで室温と40℃の間の温度まで冷却した後に次の工程に進んだ。
(b)第一のプロテアーゼによる処理:プロナーゼ。0.5mg/mlプロナーゼの0.1M TRIS/HCl pH7.5溶液を調製した。この酵素溶液のアリコート5μlを、上記手順(a)によって作製した洗浄剤処理したホモジネートの溶液25μlに加えた。即ち、プロナーゼの最終濃度は83ug/mlである。この混合物を40℃で30分間インキュベートした。
(c)第二のプロテアーゼによる処理:パパイン。0.4mg/mlパパインの0.1M TRIS/HCl pH6.0溶液を調製した。この酵素溶液のアリコート0.5ulを、順次上記手順(a)及び(b)により調製したSDS処置及びプロナーゼ処理したホモジネートの30μl溶液に加えた。パパインの最終濃度は6.5ug/mlである。この混合物を40℃で30分間インキュベートした。
上記SDS/PK/プロナーゼ(プロトコールA)及びSDS/プロナーゼ/パパイン(プロトコールB)処理から得た材料をウェスタンブロット分析に出した(図2を参照)。検体中の残存PrPScをすべて検出するため、ICSM18抗体及びICSM35抗体を用いてブロットを視覚化した。どちらの抗体を用いてもPrPScは検出できなかった。
この実施例は、表面上におけるプリオン感染性の無効化への本発明の方法の応用(この実施例では、表面とは外科用鋼鉄である)であり、従って外科用器具の汚染除去への適用可能性について示すものである。依然として、本発明の方法は、病院の汚染除去部門で行われる予備洗浄手順において有利に実施可能である。残存感染性のバイオアッセイを行うために、この外科用鋼鉄の小型試料をトランスジェニックマウスに移植する。
材料
プロナーゼ(SIGMA CODE P5147;1.16mg/ml、0.1M TRIS/HCl pH7.5溶液)
パパイン(SIGMA CODE P3375;0.21mg/ml、0.1M TRIS/HCl pH6.0溶液)
G26注射針をガイドとして用いて、Tg20マウスの脳内に未処理のワイヤ小片を1本ずつ手で移植した。
(A群)
ワイヤ小片(5mm)10本をRML感染CD1マウスの脳内(ブレグマの右側)に30分間一時的に挿入した。容量50mlのFALCON試験管を用いて50mlのPBSダルベッコ培地(GIBCO-BRL 14190-094)中で“浸漬”ワイヤ小片を短時間すすぎ、ペトリ皿上で室温で30分間乾燥させた。G26注射針をガイドとして用いて、マウス6匹の各脳に小片を1本ずつ手で移植した。残りのワイヤ小片4本はこの実施例ではそれ以上使用しなかった。
(B群)
PBSダルベッコ培地(GIBCO-BRL 14190-094)中の脳ホモジネート(20%(w/v))を、18ゲージ、21ゲージ及び23ゲージ注射針に通すことにより調製した。浸漬に用いたRML感染CD1マウスの脳(湿重量:400mg)を1mlのPBS中でホモジナイズした。PBSで検体の最終容量を2mlにした。このホモジネート全体を 20%(w/v)(遠心分離工程無し)と呼び、直ちに次の工程に使用した。アリコートを−20℃で冷凍した。
各々20本のワイヤ小片からなる各群を、調製したての20%(w/v)RML脳ホモジネート(0.1ml)に1.5mlセーフロック付きエッペンドルフ試験管中で曝露し、撹拌しながら30分間22℃でインキュベートした。インキュベート後、脳ホモジネートをピペットで採取し、曝露済みワイヤをペトリ皿にそのまま移した。室温で30分間ワイヤを乾燥させた。G26注射針をガイドとして用いることにより、各マウスの脳に小片を1本ずつ手で移植した。
(C群)
LpH、LpHse及びEndozyme Plusによる処理
LPH/LPHse(英国、RG22 4AX、ハンツ、ベージングストーク、バイアブルズ、ジェイズクロース、ステリスハウス、ステリス社製)、Endozyme Plus(米国、NY 11501、ミネオラ:サガモアアベニュー393、ルホフコーポレーション社製)。LPH及びLPHseは、汚染に曝される恐れのある作業台及び同様の表面の消毒用として設計された自社開発化合物である。Endozyme Plusは、医療機器の消毒用として市販されている。
LpHse(E群)。
Endozyme Plus(F群)。
脳ホモジネートに曝露したワイヤ小片20本(3を参照)を、密封したオートクレーブ処理袋に入れて蓋無しオートクレーブトレイ上にて121℃で20分間、及び134℃で30分間それぞれオートクレーブ処理した。オートクレーブ処理済みワイヤ小片をTg20マウスの脳内に移植した(各マウス1本ずつ)。
121℃(G群)。
134℃(H群)。
脳ホモジネートに曝露したワイヤ小片20本(3を参照)を、4%(w/v)SDSを含む二回蒸留水溶液を入れたエッペンドルフ試験管に移し、100℃で15分間煮沸した。エッペンドルフ試験管を4%のSDS存在下で40℃まで冷却し、ピペットで液体を除去した。プロナーゼ溶液(1.16mg/ml)100μlを同じエッペンドルフ試験管に加え、40℃で30分間インキュベートした。溶液を除去し、パパイン溶液(0.21mg/ml)100μlを同じエッペンドルフ試験管に加え、さらに40℃で30分間インキュベートした。50ml及び25mlのPBSでワイヤを短時間すすいだ。1群の処理ワイヤを、Tg20マウスの脳に1片ずつ永久移植して感染性を分析した。
(I群)
酵素処理及び121℃20分(J群)。
酵素処理及び134℃20分(K群)。
この実施例は、表面上におけるプリオン感染性の無効化への本発明の方法の応用である(この実施例では、表面は外科用鋼鉄である)ので、外科用器具の汚染除去への応用性を示すものである。この場合もまた、本発明の方法は病院の汚染除去部門で行われる予備洗浄手順において有利に実施可能である。残存感染性のバイオアッセイを行うために、この外科用鋼鉄の小試料をトランスジェニックマウスに移植する。
材料
プロテイナーゼK(MERCK CODE 390973P; 0.00625mg/ml 0.1M TRIS/HCl pH7.6溶液)。
プロナーゼ(SIGMA CODE P5147; 0.0336mg/ml 0.1M TRIS/HCl pH7.6溶液)
G26注射針をガイドとして用いてTg20マウスの脳に被処理/未処理のワイヤ小片を1本ずつ手で移植した。
脳ホモジネート(10%(w/v))を基本的に上記の通り調製した。即ち、順次孔径の小さい注射針(18ゲージ、21ゲージ、及び23ゲージ注射針)に脳を通すことによりPBS中で調製した。アリコートを−70℃で冷凍した。
Claims (23)
- (i)物品を洗浄剤と接触させること、(ii)該物品をプロテアーゼと接触させること、及び任意に(iii)該物品をオートクレーブ処理することを含む、物品のプリオン汚染除去方法。
- 前記プロテアーゼが、国際生化学・分子生物学連合命名規約委員会が定義するE.C.3.4.分類に属するプロテアーゼ及びペプチダーゼ酵素からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、プロテイナーゼK、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがプロナーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがプロテイナーゼKである、請求項3に記載の方法。
- (i)汚染除去すべき物品を洗浄剤に接触させること、(ii)該物品を第一のプロテアーゼと接触させること、(iii)該物品を第二のプロテアーゼと接触させること、及び任意に(iv)該物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法。
- 前記第一のプロテアーゼ及び第二のプロテアーゼが、プロテイナーゼK、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記第一のプロテアーゼがプロナーゼであり、かつ前記第二のプロテアーゼがパパインである、請求項7に記載の方法。
- 前記第一のプロテアーゼがプロテイナーゼKであり、かつ前記第二のプロテアーゼがプロナーゼである、請求項7に記載の方法。
- 前記第一のプロテアーゼがプロナーゼであり、かつ前記第二のプロテアーゼがプロテイナーゼKである、請求項7に記載の方法。
- 前記洗浄剤がイオン性洗浄剤である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記洗浄剤がアニオン性洗浄剤である、請求項11に記載の方法。
- 前記洗浄剤がSDSである、請求項12に記載の方法。
- 前記物品が表面を有する、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記表面が医療機器の表面である、請求項14に記載の方法。
- 前記表面が金属である、請求項14又は請求項15に記載の方法。
- 前記金属が鋼鉄である、請求項16に記載の方法。
- 洗浄剤並びにプロテイナーゼK、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択されるプロテアーゼを含有するキット。
- 前記プロテアーゼを2種類以上含有する、請求項18に記載のキット。
- 前記洗浄剤がSDSである、請求項18又は19に記載のキット。
- イオン性洗浄剤並びにプロテイナーゼK、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される1種類以上のプロテアーゼを含有する組成物。
- 前記プロテアーゼを2種類以上含有する、請求項21に記載の組成物。
- 前記洗浄剤がSDSである、請求項21又は22に記載の組成物。
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