KR101785613B1 - 고온균 유래 신규한 케라틴 분해 효소 및 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 케라틴 분해능을 지닌 고온균 유래 신규한 케라틴 분해 효소에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 케라틴 분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 케라틴 분해효소의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소를 포함하는 케라틴 분해용 조성물 및 이를 이용하여 케라틴을 분해하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소에 의하여 분해된 케라틴 분해 산물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 케라틴 분해효소는 난분해성 케라틴을 빠르고 효과적으로 분해하는 바, 환경문제를 야기하는 농축산 폐기물의 효율적인 처리 및 고부가가치 자원화 (예를 들어, 효소화장품 신규소재)는 물론 다양한 분해효소군을 활용한 혁신적인 효소생물전환기술로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고온균 유래 신규한 케라틴 분해 효소 및 그의 이용 {Novel Keratinase derived from thermophilic bacteria and Use thereof}
본 발명은 고온균 유래 신규한 케라틴 분해 효소에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 케라틴 분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 케라틴 분해효소의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 효소를 포함하는 케라틴 분해용 조성물 및 이를 이용하여 케라틴을 분해하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 효소에 의하여 분해된 케라틴 분해 산물에 관한 것이다.
케라틴(keratin)은 영양적으로 가치가 있지만 널리 이용되지 않는 동물성 단백질로서, 피부, 뿔 및 헤어의 섬유상 구성성분이며, 도축 및 도계산업에서 대량으로 폐기되고 있다(Kornillowicz-Kowalska와 Bohacz, 2011).
케라틴은 그 구조 속에 이황화결합을 많이 포함하고 있으므로 물에 녹지 않는 특성을 가지고 있으며, 일반적인 단백질 분해효소에 의해 분해되지 않는다(Onifade 등, 1998).
현재, 케라틴 폐기물은 소각처리하거나 화학적 방법에 의하여 케라틴을 분해한 후, 그 분해산물을 가축의 사료첨가물로 재활용하고 있다. 화학적 처리를 통하여 생성된 케라틴 분해산물은 질소, 지방 등의 함량은 높으나 가축이 많이 요구하는 lysine, methionine과 같은 아미노산의 함량은 낮으며, 동시에 소화율이 낮은 단점을 가지고 있다(Papadoulos와 Ketelaars, 1986). 또한 에너지 비용이 많이 소요되고, 악취 등의 환경문제를 초래하기 도 한다(da Rosa Gioppo 등 2009). 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위하여 새로운 처리방법이 필요하게 되었으며, 최근 들어 미생물에 의한 케라틴 분해법이 상기의 문제점들을 해결할 수 있는 환경친화적인 대안으로서 활발히 연구되고 있다.
미생물학적 케라틴 처리법은 케라틴 분해효소(keratinase)를 생성하는 미생물을 분리하는 것부터 시작되는데, Bacillus spp., 방선균, 균류 등 다양한 미생물이 자연환경에서 분리되어 효소생산 특성과 이들 미생물에 의하여 처리된 케라틴 분해산물의 영양적 가치에 대하여 보고된 바 있다(Bertsch와 Coello, 2005; Brandelli 등, 2010). 이 외에도 케라틴 분해효소는 폐수 처리장의 단백질성 유기물 제거, 직물의 품질 개선, 가죽의 제모, 각질 제거용 화장품, 프리온 분해 등에 활용 가능성이 보고(Gupta와 Ramnani, 2006; Langeveld 등, 2003; Onifade 등, 1998)되었으며, 새로운 응용분야를 개척하기 위하여 케라틴 분해효소의 활성과 함께 식물성 장촉진 활성이나 항진균 활성과 같은 독특한 성질을 동시에 보유한 균주를 분리하기 위한 연구도 시작되고 있다(Jeong 등, 2010).
한편, 적은 비용으로 단백질을 분해하기 위해서는 정제효소를 사용하는 것보다 조효소를 사용하는 것이 훨씬 유리하며, 조효소가 정제효소보다 안정성이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 실제 조효소 상태의 제품이 대량의 단백질을 처리하기 위한 효소 제제로 시판되고 있다. 또한 케라틴 분해효소의 특성은 균주 특이적이므로 각 균주가 생성한 효소의 물리화학적 특성을 조사하는 것은 효율적인 효소 적용을 위해서 반드시 선행되어야 할 연구이다.
본 발명자들은 케라틴의 효과적인 분해 및 활용을 위하여 케라틴 분해효소를 찾기 위 하여 예의 노력한 결과, 고온균 유래 케라틴 분해효소가 케라틴을 효과적으로 분해함을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 고온균 유래 신규한 케라틴 분해 효소를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 상기 케라틴 분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 케라틴 분해효소의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 효소를 포함하는 케라틴 분해용 조성물 및 이를 이용하여 케라틴을 분해하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 효소에 의하여 분해된 케라틴 분해 산물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 고온균 유래의
시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된, 케라틴 분해 효소를 제공한다.
상기 시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고;
상기 내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP)는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지며;
상기 티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR)는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고;
상기 아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 CDS, CBP, DSR, 및 SufE은 각각
서열번호 2의 염기서열;
서열번호 4의 염기서열;
서열번호 6의 염기서열; 및
서열번호 8의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1에만 존재하며 페닭털 분해에 관여할 것으로 예상되는 cysteine desulfurase (CDS)를 선별하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 그 아미노산 서열 정보를 서열번호 1로, 그 염기서열 정보를 서열번호 2로 지정하였다.
Thermostable carboxypeptidase 1 (CBP)의 경우, NCBI website 기반 blastp (http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)프로그램을 사용하여 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 단백질 가수분해 효소들과 폐닭털 분해능이 없는 퍼비도박테리움 노도섬 Rt17-B1의 단백질 가수분해 효소들 간의 아미노산 서열 상동성(Identity) 비교 및 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 나타낸 것처럼 퍼비도박테리움 노도섬 Rt17-B1과의 상동성이 낮은 폐닭털 분해에 관여할 것으로 예상되는 단백질 가수분해 효소 thermostable carboxypeptidase 1 (CBP)을 최종 선별하였다.
그 아미노산 서열 정보를 서열번호 3로, 그 염기서열 정보를 서열번호 4로 지정하였다.
Thioredoxin-disulfide reductase (DSR)의 경우, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 이외에 케라틴 분해능이 있는 것으로 알려진 퍼비도박테리움 페니보란스 균주와의 유전체를 RAST server 및 Bioedit 분석 프로그램을 사용하여 비교 및 분석한 결과, 아미노산 상동성이 가장 높으며 폐닭털 분해에 관여할 것으로 예상되는 Thioredoxin-disulfide reductase를 도 4에서 표시한 것처럼 선별하였다.
그 아미노산 서열 정보를 서열번호 5로, 그 염기서열 정보를 서열번호 6로 지정하였다.
Iron-sulfur assembly scaffold protein (SufE)의 경우, CDS와 complex를 형성하여 케라틴 분해능을 증대시킬 것으로 예상되었다. 이에 RAST server를 통하여 Suf operon내에 CDS의 downstream에 존재하는 것으로 확인한 Iron-sulfur assembly scaffold protein을 도5에서 표시한 것처럼 선별하였다.
그 아미노산 서열 정보를 서열번호 7로, 그 염기서열 정보를 서열번호 8로 지정하였다.
또한, 상기 고온균은 써모토겔 (Thermotogales) 목일 수 있다.
써모토겔 목에 포함되는 것은 제한이 없으나, 예를 들어 칼도토가 (Caldotoga), 메소토가 (Mesotoga), 써모팔리움 (Thermopallium), 써모토가 (Thermotoga), 퍼비도박테리움 (Fervidobacterium), 써모시포 (Thermosipho), 코스모토가 (Kosmotoga), 써모코코이데스 (Thermococcoides), 마리니토가 (Marinitoga), 지오토가 (Geotoga) 또는 페트로토가 (Petrotoga) 속일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래의 케라틴 분해효소를 이용하였다.
또한, 본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 아이언-설퍼 어셈블리 스카폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)
로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 케라틴 분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 CDS, CBP, DSR 및 SufE를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각
서열번호 2의 염기서열;
서열번호 4의 염기서열;
서열번호 6의 염기서열; 및
서열번호 8의 염기서열일 수 있다.
상기 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 상동성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%와 80%의 상동성과 유사성(Similarity)을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 벡터는 본 발명의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 뿐만 아니라 이 펩타이드가 융합된 항체의 단편 또는 항체를 발현할 수 있다. 펩타이드가 융합된 항체 또는 항체의 단편의 경우, 벡터는 펩타이드와 항체 또는 이의 단편이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공할 수 있다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, 대장균 JM109, BL21, RR1, LE392, X1776, W3110과 같은 대장균 속 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 케라틴 분해효소의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 고온균 유래의
시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된, 효소를 포함하는 케라틴 분해용 조성물를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양상은 고온균 유래의
시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된, 효소를 케라틴에 처리하는 단계를 포함하는, 케라틴 분해 방법을 제공한다.
상기 시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS); 내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP); 티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 또는 아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)는 케라틴의 분해에서 보조적 또는 필수적일 수 있다.
상기 케라틴의 유래는 제한이 없다. 즉, 모발, 손톱, 동물의 발굽, 피부, 동물의 털 및 깃털 등을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 깃털일 수 있다.
본 발명에 따른 케라틴 분해효소는 난분해성 케라틴을 빠르고 효과적으로 분해하는 바, 환경문제를 야기하는 농축산 폐기물의 효율적인 처리 및 고부가가치 자원화 (예를 들어, 효소화장품 신규소재)는 물론 다양한 분해효소군을 활용한 혁신적인 효소생물전환기술로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 유전체 정보를 RAST server를 사용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 단백질 기능 기반 유전체 비교 분석 결과를 바탕으로 케라틴 분해 효소군으로 선별한 Cysteine desulfurase (CDS)를 나타낸 것이다.
도 3은 아미노산 서열 기반 유전체 비교 분석 결과를 바탕으로 케라틴 분해 효소군으로 선별한 Thermostable carboxypeptidase 1 (CBP)을 나타낸 것이다.
도 4는 아미노산 서열 기반 유전체 비교 분석을 바탕으로 케라틴 분해 효소군으로 선별한 Thioredoxin-disulfide reductase (DSR)을 나타낸 것이다.
도 5는 아미노산 서열 기반 유전체 비교 분석을 바탕으로 케라틴 분해 효소군으로 선별한 Iron-sulfur assembly scaffold protein (SufE)을 나타낸 것이다
도 6은 케라틴 분해 효소군으로 예상되는 핵심 단백질들의 발현 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 케라틴 분해 효소로 예상되는 cysteine desulfurase (CDS) 재조합 단백질의 생물리화학적 특성을 나타낸 것이다.
도 8은 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 케라틴 분해 효소로 예상되는 thermostable carboxypeptidase 1 (CBP) 재조합 단백질의 생물리화학적 특성을 나타낸 것이다.
도 9는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1으로부터 케라틴 분해능을 지닌 효소군을 획득하기 위한 조효소액 추출방법을 나타낸 모식도이다.
도 10은 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 조효소액 및 재조합 단백질을 사용하여 폐닭털 분해를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 도 10의 폐닭털 분해실험을 통해 생산되는 유리 아미노산의 정량분석을 나타낸 것이다.
도 12는 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1을 0.5% (v/v) glucose를 유일탄소원으로 첨가한 배지에서 혐기배양한 균체로부터 조효소액을 추출하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 13는 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 조효소액에 cysteine desulfurase (CDS) 및 Iron-sulfur assembly scaffold protein (SufE) 재조합 단백질을 선택적으로 첨가하여 폐닭털 분해를 위한 병합처리 효과를 나타낸 것이다.
도 14은 도 13에 의한 폐닭털 분해 효과를 아미노산 정량분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW -1의 유전체 분석
케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 배양액으로부터 균체를 수집하여 Genomic DNA extraction kit (Solgent)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 후, SMRT (single molecule real-time) 시퀀싱 플랫폼(PacBio RS II system)을 활용하여 유전체 염기서열을 획득하였다.
유전체 결과는 SMRT 분석 파이프라인 v.2.2.0 내의 RS - HGAP (hierarchical genome-assembly process) 어셈블리 프로토콜 및 RAST 서버 (http://rast.nmpdr.org/)를 사용하여 유전체 정보를 분석하였으며, 그 결과 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 균주의 genome DNA 크기는 2.35 Mb이며 2,259개의 코딩 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
실험예 2: 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW -1의 유전체 정보를 활용한 단백질 기능 기반 및 아미노산 서열 기반 유전체 비교 분석
퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 유전체 정보를 비교 분석하여 케라틴 분해에 관여하는 타겟 효소군을 선정하였다. 이를 위해 케라틴 분해능이 우수한 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 및 같은 속에 해당하는 균주들과의 유전체 정보를 직접 비교 및 분석하여 케라틴 분해 효소군으로 예상되는 단백질 (Cysteine desulfurase (CDS), Thermostable carboxypeptidase 1 (CBP), Thioredoxin-disulfide reductase (DSR))을 선정하였다.
구체적으로, CDS의 경우, 폐닭털 분해 균주인 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1과 폐닭털 분해능이 없는 균주인 퍼비도박테리움 노도섬 Rt17-B1의 유전체를 RAST 서버 (http://rast.nmpdr.org/)를 사용하여 단백질 기능 기반 비교 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 나타낸 것처럼 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1에만 존재하며 페닭털 분해에 관여할 것으로 예상되는 cysteine desulfurase (CDS)를 선별하였다. 그 아미노산 서열 정보를 서열번호 1로, 그 염기서열 정보를 서열번호 2로 지정하였다.
Thermostable carboxypeptidase 1 (CBP)의 경우, NCBI website 기반 blastp (http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)프로그램을 사용하여 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 단백질 가수분해 효소들과 폐닭털 분해능이 없는 퍼비도박테리움 노도섬 Rt17-B1의 단백질 가수분해 효소들 간의 아미노산 서열 상동성 비교 및 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 나타낸 것처럼 퍼비도박테리움 노도섬 Rt17-B1과의 상동성이 낮은 폐닭털 분해에 관여할 것으로 예상되는 단백질 가수분해 효소 thermostable carboxypeptidase 1 (CBP)을 최종 선별하였다.
그 아미노산 서열 정보를 서열번호 3로, 그 염기서열 정보를 서열번호 4로 지정하였다.
Thioredoxin-disulfide reductase (DSR)의 경우, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 이외에 케라틴 분해능이 있는 것으로 알려진 퍼비도박테리움 페니보란스 균주와의 유전체를 RAST server 및 Bioedit 분석 프로그램을 사용하여 비교 및 분석한 결과, 아미노산 상동성이 가장 높으며 폐닭털 분해에 관여할 것으로 예상되는 Thioredoxin-disulfide reductase를 도 4에서 표시한 것처럼 선별하였다.
그 아미노산 서열 정보를 서열번호 5로, 그 염기서열 정보를 서열번호 6로 지정하였다.
Iron-sulfur assembly scaffold protein (SufE)의 경우, CDS와 complex를 형성하여 케라틴 분해능을 증대시킬 것으로 예상되었다. 이에 RAST server를 통하여 Suf operon내에 CDS의 downstream에 존재하는 것으로 확인한 Iron-sulfur assembly scaffold protein을 도 5에서 표시한 것처럼 선별하였다.
그 아미노산 서열 정보를 서열번호 7로, 그 염기서열 정보를 서열번호 8로 지정하였다.
실험예 3: CDS, CBP , DSR 단백질의 발현 벡터 및 대장균 형질전환균체의 제조
퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 단백질 기능 기반 및 아미노산 서열 기반 유전체 비교 분석을 통하여 선별된 케라틴 분해효소군으로 예상되는 단백질들의 발현벡터를 제조하였다.
서열번호 프라이머번호 프라이머 이름 프라이며 염기서열 (5'-3')
9 A F.aw1_cds_NdeI F CATATGCGCTCAACGGTGTTCTC
10 B F.aw1_cds_XhoI R CTCGAGTCATTCGAACCACCTCC
11 C F.aw1_cbp_NdeI F CATATGGAAGAACTAAAAAGCTATTACAAACG
12 D F.aw1_cbp_XhoI R CTCGAGTTAAAGCTCTATCTCATACACTTTG
13 E F.aw1_dsr_NdeI F CATATGAGCGGATTTGAATTCGACA
14 F F.aw1_dsr_XhoI R CTCGAGTTAGAAGTATTTCTTTGCAGCG
15 G F.aw1_sufE_NdeI F GCGCATATGATATACTCTGAATTCATAATGG
16 H F.aw1_sufE_XhoI R CTCGAGTAATTCATTCTTTAAAGCAATCTCC
표 1에서 보듯이 발현벡터 CDS, CBP, DSR, SufE를 제조하기 위하여 먼저 각각의 제한효소 서열(NdeI 또는 XhoI)이 포함된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 발현벡터 제조에 맞게끔 짝으로 PCR에 사용하였다.
PCR 방법을 통한 각각의 유전자 증폭을 위하여 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 균주의 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, Takara사의 Primestar HS DNA polymerase를 사용하여 98℃에서 5분간 반응 후, 98℃에서 30 초, 55℃에서 15초 및 72℃에서 1분으로 30 사이클을 수행 후, 72℃에서 10분간 수행하였다.
증폭된 PCR 산물을 전기영동 후 Gel extraction kit (QIAGEN)를 사용하여 분리 정제하였으며 pTOP Blunt V2 cloning Kit (Enzynomics를 사용하여 클로닝한 후, DNA 시퀀싱(Solgent)을 통하여 각각의 유전자의 변이삽입 유무를 확인하였다.
PCR을 통해 획득한 케라틴 분해효소군으로 예상되는 세 종류의 유전자에 변이가 없는 것을 확인한 후 각각의 유전자 발현 벡터 제조를 위하여 pET-28a(+) (Novagen) 벡터를 제한효소(NdeI, XhoI)로 처리하였으며, pTOP Blunt V2 벡터에 클로닝 되어있는 각각의 유전자의 회수를 위하여 발현용 벡터에 맞는 제한 효소를 처리하여 전기영동 및 Gel extraction kit (QIAGEN)를 사용하여 분리, 정제하였다.
제한효소가 처리된 벡터 및 회수된 유전자들을 DNA ligation kit (Takara)를 사용하여 라이게이션시켜 세 종류의 발현벡터(pET28a-CDS, pET28a-CBP, pET28a-DSR, pET28a-SufE)를 제조하였다. 발현벡터의 개열지도는 도 6에 나타내었다. 케라틴 분해효소군으로 예상되는 단백질 유전자의 발현을 위해 대장균 형질전환체를 아래와 같이 제조하였다. 각각의 발현벡터 플라스미드를 E. coli 균주 BL21(DE3) (Enzynomics)에 도입하였다. 형질전환균을 선택적으로 배양하기 위하여 상기 발현벡터에 포함된 항생제 내성 유전자에 적합한 항생제인 카나마이신 (kanamycin)이 최종농도 100 ㎍/ml이 포함된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 배양하여 싱글 콜로니를 형성시켰다.
실험예 4: CDS, CBP , DSR , SufE 단백질의 대량 발현 및 정제
케라틴 분해효소군으로 예상되는 단백질 유전자의 발현을 위해 각각의 발현벡터가 삽입된 형질전환체를 획득 후 사용하였다. 각각의 형질전환체를 전배양 후 2개의 2리터 플라스크 내에서 카나마이신(100 ㎍/ml)을 첨가한 500 ㎖의 LB에 1% (5 ml)의 전배양균을 접종하고 본배양하여 흡광도(600 nm)가 0.4∼0.6일 때 최종 농도 1mM의 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 각각의 CDS, CBP, DSR, SufE 유전자를 37℃에서 6 시간 동안 발현을 유도하였다.
단백질 발현을 유도시킨 균체를 흡광도(600 nm) 1에 해당하는 배양액을 1.5ml E-tube에 옮긴 후 원심분리 후 배양 균체만을 회수하였으며, 100 ㎕의 1X SDS sample buffer로 균체를 현탁한 후 끊는 물에서 5분간 처리 후 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) gel로 변성 분리한 후 CBB (coomassie brilliant blue) R-250으로 염색을 하여 단백질 발현 양상을 확인하였다. 배양 균체를 원심분리로 회수하고 150 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) 및 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)에 재현탁하였다. 4℃에서 소니케이션(sonication)으로 파쇄한 후, 원심분리(10,000×g, 20 min)를 통하여 상등액을 회수하였다.
회수한 상등액은 열처리 (70℃, 30 분), 원심분리(10,000×g, 20 min) 및 0.45 μm filtering을 통하여 His-tag 정제를 위한 샘플을 획득하였다. 다음 단계로 각각의 발현 단백질의 정제를 위하여 Ni2 +-NTA 아가로스 비드(Novagen)를 사용하여 분리, 정제하였다. N-말단에 6-히스티딘 잔기를 포함하는 발현 단백질을 binding buffer (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 5 mM imidazole)로 평형화된 Ni2+-NTA 아가로스 비드를 통과시켜 결합시킨 후 washing buffer (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 60 mM imidazole)를 사용하여 비특이적인 결합단백질들을 제거한 후 최종적으로 비드에 결합되어 있는 타겟 단백질을 elution buffer (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 250 mM imidazole)를 용출시켜 발현시킨 단백질들을 His-tag 정제하였다.
정제한 단백질들은 모두 N-말단에 His-tagging이 되어 있기에 tag이 제거된 원형의 단백질을 회수하기 위하여 단백질 가수분해 효소인 thrombin (1.6 unit/㎕)을 처리한 후 HiLoad 16/60 superdex 200 prep grade column (GE healthcare)을 사용하여 gel filteration을 수행하여 최종적으로 원형의 단백질들을 회수하여 폐닭털 분해 실험에 사용하였다. CBP의 경우 His-tag 정제 후 단백질 가수분해 효소를 처리과정을 제외하고 바로 gel filteration을 수행하여 최종적으로 폐닭털 분해 실험에 사용하였다.
실험예 5: CDS, CBP 단백질의 생물화학적 특성 분석
도 7과 8에서 나타낸 것처럼 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 균주의 CDS 및 CBP 재조합 단백질의 특성을 분석하였다. CDS의 경우 methylene blue 분석법을 사용하여 최적 효소 첨가량, 기질량 및 최적 반응시간을 설정 후, 도 7에 나타낸 것처럼 90℃와 pH 8.0에서 각각 최대효소활성을 나타내었다. 효소의 kinetics를 확인한 결과, V max는 1135.0 ± 11.0 (Unit/mg)이며 K m은 75.0 ± 1.7 μmol인 것을 확인하였다. CBP의 경우 ninhydrin 분석법을 사용하여 최적 효소 첨가량, 기질량 및 최적 반응시간을 설정 후, 도 8에 나타낸 것처럼 80℃ 및 pH 7.0에서 최대의 효소활성을 나타내었다. 또한 CBP 활성에 영향을 미치는 metal ion들을 확인한 결과, cobalt ion (Co2+)의 존재 하에서 CBP의 활성이 4배 이상 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 6: 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW -1 균주의 단백질 분획화
도 9에서 나타낸 것처럼 폐닭털이 첨가된 배양액(4 liter)으로부터 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 균체를 회수하여 파쇄한 후, 단백질 분획화를 통해 조효소액(표 2)을 획득하여 폐닭털 분해 실험에 사용하였다.

 Protein conc.
(mg/ml)		 Volume
(ml)		 Total amount
(mg)
Whole cell extract 3.96 5 19.81
Pellet 2.39 5 11.95
Cytosol 2.33 4.3 9.997
Membrane protein 5.86 1 5.86
Solubilized membrane 1.91 1.1 2.10
Pellet membrane 3.68 1 3.68
실험예 7: 조효소액 및 재조합 단백질을 이용한 폐닭털 분해 실험
퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1의 조효소액 및 재조합 단백질(CDS, CBP, DSR)들을 사용하여 폐닭털 분해 실험을 다음과 같이 수행하였다, 헝게이트 튜브(hungate tube)에 10 mg의 폐닭털을 넣고 0.05 mg의 resazurin이 포함되어 있는 50 mM HEPES buffer (pH8.0)를 5 ml씩 분주하였다. 10분간 질소 가스치환 후, 고무마개 및 알루미늄씰로 봉하여 121℃에서 20분간 살균하였으며, 냉각 후 각 살균된 튜브에 Na2S를 10 ㎕씩 첨가하였다. 조효소액 및 재조합 단백질인 CDS, CBP, DSR은 모두 50 mM HEPES buffer (pH8.0)로 희석한 후 0.2 mg을 사용하였다. 환원제인 Dithiothreitol (DTT)은 최종 10 mM이 되도록 사용하였다. 각각의 효소반응(표 3참고)은, 2-3회 흔들어 섞어준 후 80℃ 워터 베스(water bath)에서 수행하였다.
반응조건 번호 환원제 조효소액 재조합 단백질
DTT
(10mM)		 supernatant cytosol solublized membrane CDS CBP DSR
1 X X X X X X X
2 X ○ X X X X X
3 ○ ○ X X X X X
4 X X ○ X X X X
5 ○ X ○ X X X X
6 X X X ○ X X X
7 ○ X X ○ X X X
8 X X ○ X X X ○
9 ○ X X X ○ ○ ○
10 X X X X ○ ○ ○
11 ○ X ○ X ○ X X
12 ○ X ○ X X X ○
13 ○ X ○ X X ○ X
14 ○ X 0.05 mg X X X X
15 ○ X 0.1 mg X X X X
(○ : 효소첨가, X : 효소무첨가 )
도 10에서 나타낸 것처럼 폐닭털 분해 양상을 24시간 단위로 확인하였으며 최종적으로 72시간째 배양액을 사용하여 닌하이드린 어쎄이(Ninhydrin assay)를 통한 아미노산 정량을 수행한 결과를 도 11에 나타내었다. 닌하이드린 어쎄이는 각각의 반응조건에서 회수한 배양액 50 ㎕에 동량의 10% TCA (Trichloroacetic acid)용액을 첨가한 후 vortex를 수행하고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 통하여 회수한 상등액에 3% ninhydrin solution 150 ㎕, acetate cyanide buffer 150 ㎕를 첨가한다. Voltex후 15분간 끓이고 pre-chilled isopropanol-water diluent 660 ㎕를 첨가한 후, voltex를 수행하고 Ultraspec 8000 spectrophotometer (GE healthcare)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 실험의 결과 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 균주의 조효소액 모두에서 폐닭털 분해를 확인하였으며, 조효소액과 더불어 재조합 단백질을 첨가한 반응에서도 모두 폐닭털의 분해가 확인되었다. 또한 10 mg의 폐닭털 분해를 위한 조효소액의 최소량을 확인한 결과(No. 14, 15), 최소 0.05 mg의 조효소액이 필요한 것으로 확인되었다.
실험예 8 : 글루코오즈를 첨가하여 배양한 균체의 조효소액 , CDS, SufE 재조합 단백질을 이용한 폐닭털 분해 실험
도 12에서 나타낸 것처럼 폐닭털 대신 0.5 % (v/v) glucose가 첨가된 배양액으로부터 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1균체를 파쇄 후 조효소액(whole cell extract)을 획득하여 폐닭털 분해 실험에 사용하였다. 조효소액 및 SufE 재조합 단백질 추가에 따른 폐닭털 분해 실험을 위하여 헝게이트 튜브(hungate tube)에 10 mg의 폐닭털을 넣고 0.05 mg의 resazurin이 포함되어 있는 50 mM HEPES buffer (pH8.0)를 5 ml씩 분주하였다. 10분간 질소 가스치환 후, 고무마개 및 알루미늄씰로 봉하여 121℃에서 20분간 살균하였으며, 냉각 후 각 살균된 튜브에 Na2S를 10 μl씩 첨가하였다. 조효소액 및 재조합 단백질인 CDS는 0.5 mg, SufE는 2.5 mg을 사용하였다. 환원제인 Dithiothreitol (DTT)은 최종 10 mM이 되도록 사용하였다. 혐기 챔버에서 준비한 각각의 헝게이트 튜브에 각 조건별로 효소를 첨가한 후(표 4참고), 몇 번 흔들어 섞어준 후 80℃ 워터 베스(water bath)에서 반응을 시작하였다.
반응조건 번호 환원제 조효소액 재조합 단백질
DTT
(10mM)		 whole cell extract CDS SufE
1 X X X X
2 O X X X
3 ○ ○ X X
4 O O O X
5 ○ O O O
6 O O X O
(○ : 효소첨가, X : 효소무첨가 )
도 13에서 나타낸 것처럼 폐닭털 분해 양상을 3일 단위로 확인을 하였으며 최종적으로 샘플링한 배양액을 사용하여 닌하이드린 어쎄이(ninhydrinassay)를 통한 아미노산 정량을 수행한 결과를 도 14에 나타내었다. 닌하이드린 어쎄이는 각각의 반응조건에서 회수한 배양액 50 ㎕에 동량의 10% TCA를 첨가하여 voltex를 수행한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 통하여 회수한 상등액 30 ㎕에 3% ninhydrin solution 150 ㎕, acetate cyanide buffer 150 ㎕를 첨가한다. Voltex후 15분간 끓이고 pre-chilled isopropanol-water diluent 660 ㎕를 첨가한 후 voltex를 수행하고 Ultraspec 8000 spectrophotometer (GE healthcare)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 실험의 결과 닭털 대신 글루코오즈가 첨가된 배지에서 배양한 케라틴 분해능을 지닌 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 균주의 조효소액에서도 폐닭털 분해를 확인하였으며, 조효소액과 더불어 재조합 단백질을 첨가한 반응에서도 모두 폐닭털의 분해가 확인되었다. 또한 닭털 배지 유래의 조효소액을 사용하였을 때 보다 글루코스 배지 유래의 조효소액을 사용하였을 때 폐닭털의 분해가 더 느린 것을 확인하였으며 여기에 재조합 단백질 CDS와 SufE를 첨가하면 닭털 분해 속도가 빨라지는 것을 확인하였다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Keratinase derived from Thermophilic bacteria and Use thereof <130> 1-233p-1 <150> 10-2014-0118995 <151> 2014-09-05 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 421 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of Cysteine desulfurase (CDS) <400> 1 Met Arg Ser Thr Val Phe Ser Asp Glu Glu Phe Ser Asn Ile Leu Asn 1 5 10 15 Asp Phe Pro Ala Leu Lys Arg Asn Ile Asn Gly Lys Arg Leu Val Tyr 20 25 30 Leu Asp Asn Ala Ala Ser Thr Leu Lys Cys Lys Ser Val Ile Glu Lys 35 40 45 Met Thr Asp Phe Tyr Leu Tyr His Tyr Ser Asn Ile His Arg Ala Val 50 55 60 His Thr Leu Ala Ser Glu Ala Thr Val Ala Tyr Glu Gln Ala Arg Glu 65 70 75 80 Lys Val Ala Asn Phe Leu Asn Ala Ser Ser Glu Glu Ile Ile Phe Thr 85 90 95 Ser Gly Thr Thr Met Gly Ile Asn Phe Leu Val Asn Ser Leu Ala Lys 100 105 110 Ser Gly Ile Leu Lys Thr Glu Asp Thr Val Leu Ile Ser Gln Val Glu 115 120 125 His His Ala Asn Leu Val Pro Trp Val Arg Leu Ser Lys Phe Tyr Gly 130 135 140 Phe Lys Val Ala Tyr Ile Thr Ala Asp Glu Lys Gly Val Ile Thr Asn 145 150 155 160 Glu Ser Ile Leu Lys Thr Lys Glu Ser Ile Pro Asn Pro Lys Val Val 165 170 175 Ser Ile Thr Gly Gln Ser Asn Val Thr Gly Gln Glu Met Pro Ile Glu 180 185 190 Leu Ile Arg Glu Thr Phe Lys Asn Ala Thr Leu Ile Val Asp Gly Ala 195 200 205 Gln Leu Val Pro His Lys Lys Val Asp Val Lys Lys Leu Asp Val Asp 210 215 220 Phe Leu Val Phe Ser Gly His Lys Ile Leu Gly Pro Thr Gly Ile Gly 225 230 235 240 Val Leu Tyr Gly Lys Lys Ala Leu Leu Glu Gln Leu Glu Pro Phe Leu 245 250 255 Tyr Gly Gly Glu Met Ile Asp Lys Val Thr Phe Glu Asp Val Thr Phe 260 265 270 Asn Val Leu Pro Tyr Arg Phe Glu Ala Gly Thr Gln His Ile Thr Gly 275 280 285 Ala Val Gly Leu Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Leu Glu Ser Ile Gly Phe 290 295 300 Glu Lys Val Glu Lys His Val Glu Glu Leu Ser Asn Tyr Leu Leu Glu 305 310 315 320 Lys Met Met Glu Leu Asp Phe Val Glu Val Tyr Gly Pro Ile Asp Ser 325 330 335 Ser His Lys Ser Leu Val Ser Phe Asn Val Lys Gly Val His Pro His 340 345 350 Asp Val Ser His Ile Leu Asp Glu Asn Phe Gly Val Ala Thr Arg Ser 355 360 365 Gly His His Cys Ala Gln Pro Leu Met Gly Val Leu Ala Lys Gly Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Phe Pro Asn Ser Thr Val Arg Ala Ser Val Tyr Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Thr Lys Glu Asp Ile Asp Val Leu Ile Glu Gly Leu Lys Tyr Ile 405 410 415 Arg Arg Trp Phe Glu 420 <210> 2 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequences of Cysteine desulfurase (CDS) <400> 2 atgcgctcaa cggtgttctc ggatgaggag ttttcaaata tactgaacga ttttcctgca 60 cttaaaagaa atatcaacgg caagaggtta gtttatttag ataatgcagc aagcacgctc 120 aaatgcaaat ccgtcatcga aaagatgacg gatttttacc tttatcatta ttccaacatc 180 cacagagctg ttcacacact cgcaagtgag gcaacagtcg cgtacgaaca agcaagggaa 240 aaagtggcca attttttgaa cgcaagttcc gaagaaatca tcttcacaag tggaacaact 300 atgggaataa atttcttagt gaactcgctc gcgaaaagcg ggattttgaa aacggaagat 360 actgtattaa tttcacaagt agaacaccat gcgaatctcg taccttgggt gagactctca 420 aaattctacg gctttaaagt agcttacata acggcagatg aaaaaggggt tatcacaaat 480 gaatcaattt tgaaaactaa agaatctatt ccaaacccaa aagttgtttc aattacagga 540 cagtcaaatg ttacaggtca agagatgcct atagagttga taagagagac tttcaaaaat 600 gcaaccttga tagttgacgg tgctcagctt gtaccacata aaaaagttga tgtcaaaaag 660 ctcgatgttg attttctcgt gttttcaggc cacaaaatac ttggcccgac gggaataggt 720 gttctgtatg gaaaaaaggc acttcttgaa cagcttgagc cgtttttgta cggcggggag 780 atgatagata aagttacatt cgaagatgtt acattcaatg ttctaccgta cagattcgaa 840 gccggtactc aacacatcac aggtgccgtt gggcttggtt atacgataga ttatctggaa 900 agtatcggat ttgagaaggt agaaaagcac gttgaagagt tatcaaatta cctgttagaa 960 aagatgatgg aacttgattt tgtggaagtc tacggaccaa ttgattcttc tcacaaatct 1020 ttggtatcat ttaatgtgaa aggtgtgcat ccgcatgatg tttcacacat actcgatgag 1080 aattttggtg tagccacaag aagcgggcac cattgtgcac aaccgctaat gggcgtctta 1140 gcgaaaggat caaagataga ttttcctaac tcaacagtta gagcgagcgt ttatctatac 1200 aacacgaaag aagatataga tgtcttaata gaagggttaa aatacatccg gaggtggttc 1260 gaatga 1266 <210> 3 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of Thermostable carboxypeptidase 1 (CBP1) <400> 3 Met Glu Glu Leu Lys Ser Tyr Tyr Lys Arg Val Ala Lys Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Leu Tyr Trp Asp Met Gln Thr Tyr Met Pro Lys Asp 20 25 30 Ala Gly Pro Tyr Arg Ala Glu Val Leu Ser Glu Ile Gly Thr Tyr Ala 35 40 45 Phe Lys Gln Ile Thr Asp Asp Ala Leu Gly Lys Leu Leu Glu Thr Ala 50 55 60 Gln Pro Gln Ser Glu Ile Asp Glu Lys Leu Val Tyr Val Gly Lys Lys 65 70 75 80 Glu Tyr Tyr Lys Tyr Lys Lys Val Pro Pro Glu Leu Phe Gln Glu Ile 85 90 95 Met Ile Thr Ser Thr Met Leu Glu Gln Lys Trp Glu Ile Ala Lys Pro 100 105 110 Arg Gly Asp Phe Glu Glu Val Arg Pro Leu Leu Glu Lys Ile Val Asp 115 120 125 Leu Ser Arg Lys Tyr Ala Asp Ile Leu Gly Tyr Glu Gly Glu Pro Tyr 130 135 140 Asn Ala Leu Leu Asp Leu Tyr Glu Pro Gly Met Lys Ala Glu Glu Val 145 150 155 160 Asp Gln Ile Phe Ser Lys Val Arg Asp Phe Ile Val Glu Val Leu Glu 165 170 175 Lys Ile Glu Arg Leu Pro Lys Ser Glu Asp Pro Phe Asn Arg Glu Ile 180 185 190 Gly Val Asp Lys Gln Lys Glu Phe Ser Asn Trp Leu Leu His Tyr Leu 195 200 205 Lys Tyr Asp Phe Thr Lys Gly Arg Leu Asp Val Ser Ala His Pro Phe 210 215 220 Thr Asn Pro Ile Gly Leu Asn Asp Val Arg Ile Thr Thr Arg Tyr Ile 225 230 235 240 Val Asn Asp Ile Arg Asn Ser Ile Tyr Ser Thr Ile His Glu Phe Gly 245 250 255 His Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ile Pro Thr Glu Phe Tyr Gly Leu Pro 260 265 270 Ile Gly Ser Ser Ala Ser Tyr Gly Phe Asp Glu Ser Gln Ser Arg Phe 275 280 285 Trp Glu Asn Val Val Gly Arg Ser Leu Ala Phe Trp Lys Gly Ile Tyr 290 295 300 Ser Lys Phe Ile Glu Ile Val Pro Glu Met Arg Gly Tyr Ser Val Glu 305 310 315 320 Glu Leu Trp Arg Ala Val Asn Arg Val Gln Arg Ser Phe Ile Arg Thr 325 330 335 Glu Ala Asp Glu Val Thr Tyr Asn Leu His Ile Ile Ile Arg Phe Glu 340 345 350 Ile Glu Arg Glu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Ser Val Lys Asp Val Pro 355 360 365 Asp Lys Trp Asn Glu Leu Tyr Lys Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro 370 375 380 Asn Asn Thr Leu Gly Cys Met Gln Asp Pro His Trp Phe Gly Gly Asn 385 390 395 400 Phe Gly Tyr Phe Pro Thr Tyr Ala Leu Gly Asn Leu Tyr Ala Ala Gln 405 410 415 Ile Phe Glu Lys Leu Lys Glu Glu Ile Asn Phe Glu Glu Val Val Ser 420 425 430 Ala Gly Asn Phe Glu Ile Ile Lys Asn Phe Leu Lys Glu Lys Ile His 435 440 445 Ser Lys Gly Lys Met Tyr Glu Pro Ser Asp Leu Ile Lys Ile Val Thr 450 455 460 Gly Lys Pro Leu Ser Tyr Glu Ser Phe Val Arg Tyr Ile Lys Asp Lys 465 470 475 480 Tyr Ser Lys Val Tyr Glu Ile Glu Leu 485 <210> 4 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequences of Thermostable carboxypeptidase 1 (CBP1) <400> 4 atggaagaac taaaaagcta ttacaaacgt gtcgctaagt actacagcgc agccgcattg 60 ctttactggg atatgcaaac gtatatgcca aaagatgcag gaccgtacag agcggaagtg 120 ctatcggaaa ttggaacgta cgcttttaaa caaataactg acgacgctct cggaaaactg 180 ttggaaacag ctcaaccaca aagtgaaatc gacgagaagc tagtctatgt aggaaagaag 240 gaatactaca agtacaaaaa agttcctcct gaactatttc aagagattat gataacatca 300 acaatgctag agcaaaagtg ggaaattgct aaaccgcgtg gtgatttcga agaagtaaga 360 cctttgcttg aaaaaattgt cgatctcagt agaaaatacg cagacatttt aggttacgaa 420 ggtgaaccgt acaacgcgtt actcgaccta tacgaacccg gaatgaaggc agaagaagtg 480 gatcagatat tcagtaaagt cagagatttt atagtggaag tgctcgaaaa aatcgaaagg 540 ttgccaaaat cagaggatcc gttcaataga gaaatcgggg tagataagca aaaagaattc 600 agcaactggc tgcttcacta tctcaagtac gattttacca agggaaggtt ggatgtatca 660 gcgcatcctt tcaccaatcc aataggtcta aacgatgtac gcataacaac aaggtacata 720 gttaatgaca tcagaaattc catatactct acgatacacg aatttgggca cgcactgtac 780 gcactttcaa ttcctaccga gttctacggt ctaccaattg gtagcagcgc ctcatacggt 840 ttcgacgaga gtcaatcgcg cttttgggaa aatgtagttg gcagaagctt ggcattttgg 900 aaagggattt atagcaaatt catagaaatt gttcccgaga tgcggggata ttcggttgaa 960 gaattatgga gggcggtgaa cagagtccaa aggtcgttca ttagaaccga agcggacgaa 1020 gttacgtaca acctgcacat aatcatccgt tttgagattg aacgcgagct aatcaacggt 1080 gaactgagtg ttaaagacgt cccagacaag tggaacgagc tctacaaaaa atacctgggg 1140 ctggatgtgc caaacaatac gcttggttgt atgcaagatc cacattggtt cggcgggaat 1200 tttggttatt ttccaactta tgcacttggc aacctttatg ctgctcagat atttgaaaaa 1260 ttaaaagaag aaataaactt tgaagaagtt gtttcagctg gtaattttga gatcattaaa 1320 aacttcctga aagagaagat ccattcgaag ggtaaaatgt acgaaccaag cgacttgatt 1380 aaaatcgtga ctggcaaacc gctgtcttac gaatctttcg tgagatacat taaggataag 1440 tactccaaag tgtatgagat agagctttaa 1470 <210> 5 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of Thioredoxin-disulfide reductase (DSR) <400> 5 Met Ser Gly Phe Glu Phe Asp Met Gly Ser Phe Gly Gly Asn Leu Lys 1 5 10 15 Glu Tyr Tyr Asp Ile Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Thr 20 25 30 Ala Ala Ile Tyr Ala Arg Arg Ala Gly Leu Thr Ala Leu Val Ile Glu 35 40 45 Lys Ala Ile Glu Gly Gly Ala Val Thr Gln Thr His Val Val Glu Asn 50 55 60 Trp Pro Gly Glu Ile Ser Ile Glu Gly Gln Ala Leu Gly Gln Lys Phe 65 70 75 80 Ala Asp His Ala Lys His Phe Gly Ala Glu Phe His Tyr Ala Phe Ala 85 90 95 Gln Lys Val Tyr Val Glu Gly Asp Tyr Lys Val Val Glu Leu Asp Asp 100 105 110 Gly Asn Lys Val Lys Ala Lys Val Val Ile Leu Ala Thr Gly Thr Glu 115 120 125 Pro Arg Lys Leu Gly Val Pro Gly Glu Ala Glu Phe Arg Gly Arg Gly 130 135 140 Val Thr Tyr Cys Ala Ala Cys Asp Gly Tyr Leu Phe Lys Asp Lys Asp 145 150 155 160 Val Val Val Val Gly Gly Gly Asp Ser Ala Cys Asp Glu Ser His Phe 165 170 175 Leu Ser Lys Ile Val Lys Ser Ile Thr Met Val Gln Asn Leu Pro Tyr 180 185 190 Leu Thr Ala Ala Lys Val Leu Gln Glu Arg Val Leu Asn Asn Pro Lys 195 200 205 Ile Lys Val Ile Thr Asn His Ile Val Lys Glu Ile Arg Gly Thr Ser 210 215 220 Lys Val Glu Glu Val Val Ile Val Asn Asn Asp Thr Lys Glu Glu Gln 225 230 235 240 Val Ile Lys Ala Glu Gly Val Phe Ile Tyr Val Gly Leu Val Pro Gln 245 250 255 Thr Gln Ile Phe Lys Gly Leu Val Asp Met Asn Asp Tyr Gly Tyr Ile 260 265 270 Ile Thr Asp Glu Asn Met Glu Thr Asn Val Pro Gly Ile Tyr Ala Val 275 280 285 Gly Asp Ile Arg Thr Lys Asn Leu Arg Gln Ile Val Thr Ala Ala Ala 290 295 300 Asp Gly Ala Ile Ala Val Glu His Ala Ala Lys Lys Tyr Phe 305 310 315 <210> 6 <211> 957 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequences of Thioredoxin-disulfide reductase (DSR) <400> 6 atgagcggat ttgaattcga catgggaagc tttggtggaa atctaaagga atattacgac 60 atagctatca tcggtggtgg tccagcagga cttacggctg ctatttacgc aagaagggct 120 ggtttaacag ctctcgttat agaaaaggcc atcgaaggtg gtgcggttac tcaaacacat 180 gttgttgaaa actggcctgg tgagataagt attgaagggc aagctttagg acaaaaattc 240 gccgaccatg caaaacactt tggggctgaa ttccactatg cttttgcaca aaaagtgtat 300 gttgaaggtg attacaaagt tgttgaactt gacgacggaa ataaagtaaa agccaaggtt 360 gtaattcttg ccactggtac agaaccaagg aaacttggcg tacctggcga agcagagttc 420 agaggtagag gagtcaccta ctgcgctgct tgtgatggtt atcttttcaa agataaggat 480 gtagtagttg taggtggcgg agatagcgct tgcgatgaat cgcacttcct ttcaaagatt 540 gttaaaagca tcaccatggt tcagaattta ccgtatttaa cagcggcgaa ggtcttacaa 600 gagagggtgc tcaataatcc aaaaattaag gttatcacaa atcacattgt gaaagagatt 660 agaggaacaa gcaaggttga agaggtcgtt atagtaaaca acgatacgaa agaagaacag 720 gttataaaag cagaaggtgt gttcatatac gttggattag ttccacaaac gcaaatattc 780 aaaggtcttg ttgatatgaa cgactacgga tacataatca ctgatgagaa tatggaaaca 840 aacgtaccag gaatctacgc agttggtgac atcaggacca agaatttgag acaaatagtc 900 accgcagctg cagacggtgc tatagccgtt gaacacgctg caaagaaata cttctaa 957 <210> 7 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of Iron-sulfur assembly scaffold protein (SufE) <400> 7 Met Ile Tyr Ser Glu Phe Ile Met Asp Tyr Ser Lys Leu Lys Lys Phe 1 5 10 15 His Gly Lys Ile Glu Asn Ala His Lys Val Glu Glu Gly Lys Asn Leu 20 25 30 Ser Cys Gly Asp Glu Val Thr Leu Tyr Phe Leu Phe Asp Gly Asp Lys 35 40 45 Ile Val Asp Val Lys Phe Glu Gly His Gly Cys Ala Ile Ser Gln Ala 50 55 60 Ser Thr Asn Val Met Ile Glu Gln Ile Ile Gly Lys Thr Lys Gln Glu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Met Met Lys Asn Ala Glu Asn Met Met Leu Gly Lys Glu 85 90 95 Phe Asp Glu Asn Val Leu Gly Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Val Lys 100 105 110 Asn Tyr Pro Met Arg Val Lys Cys Phe Leu Leu Pro Trp Lys Thr Leu 115 120 125 Glu Ile Ala Leu Lys Asn Glu 130 135 <210> 8 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequences of Iron-sulfur assembly scaffold protei (SufE) <400> 8 atgatatact ctgaattcat aatggactat tcaaaactaa agaaatttca tggaaagata 60 gaaaacgctc acaaggtcga ggaaggtaaa aatctttcct gcggtgatga agtaacgctt 120 tattttcttt ttgatggcga caagatcgtc gatgtgaaat ttgaagggca cggttgtgcg 180 ataagtcagg catcaacaaa cgtgatgata gaacaaatca ttggaaaaac aaaacaagaa 240 gcacttgaaa tgatgaaaaa cgcagagaat atgatgcttg gaaaagaatt tgatgagaat 300 gttcttggac ctatcataaa tttttacgat gtgaagaatt atccaatgag ggttaaatgc 360 tttctacttc catggaaaac cctggagatt gctttaaaga atgaataa 408 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_cds_NdeI F <400> 9 catatgcgct caacggtgtt ctc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_cds_XhoI R <400> 10 ctcgagtcat tcgaaccacc tcc 23 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_cbp_NdeI F <400> 11 catatggaag aactaaaaag ctattacaaa cg 32 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_cbp_XhoI R <400> 12 ctcgagttaa agctctatct catacacttt g 31 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_dsr_NdeI F <400> 13 catatgagcg gatttgaatt cgaca 25 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_dsr_XhoI R <400> 14 ctcgagttag aagtatttct ttgcagcg 28 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_sufE_NdeI F <400> 15 gcgcatatga tatactctga attcataatg g 31 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F.aw1_sufE_XhoI R <400> 16 ctcgagtaat tcattcttta aagcaatctc c 31

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 카르복시펩티다아제 1 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
    서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 효소;를 유효성분으로 포함하는, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래 조효소액에 의한 케라틴 분해 보조용 조성물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 CDS, CBP, DSR, 및 SufE은 각각 서열번호 2의 염기서열; 서열번호 4의 염기서열; 서열번호 6의 염기서열; 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래 조효소액에 의한 케라틴 분해 보조용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, DTT를 더 포함하는 것을 특징으로하는, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래 조효소액에 의한 케라틴 분해 보조용 조성물.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 케라틴은 가금류 깃털인 것을 특징으로 하는, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래 조효소액에 의한 케라틴 분해 보조용 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 카르복시펩티다아제 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
    서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 효소; 및
    b) 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래 조효소액; 을 포함하는 케라틴 분해 촉진용 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 DTT를 추가로 포함하는 것인, 케라틴 분해 촉진용 조성물.
  13. a) 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW-1 유래 조효소액; 및
    b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 시스테인 디설퓨라아제 (Cysteine desulfurase, CDS);
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 카르복시펩티다아제 (Thermostable carboxypeptidase 1, CBP);
    서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 티오레톡신-디설파이드 환원효소 (Thioredoxin-disulfide reductase, DSR); 및
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 아이온-설퍼 어셈블리 스캐폴드 단백질 (Iron-sulfur assembly scaffold protein, SufE)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 효소; 를 케라틴에 처리하는 단계; 를 포함하는, 케라틴 분해 촉진 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 케라틴은 가금류 깃털인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
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