JPH0642831B2 - Ｄｎａの生物学的活性の不活性化法 - Google Patents
Ｄｎａの生物学的活性の不活性化法Info
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- JPH0642831B2 JPH0642831B2 JP63505715A JP50571588A JPH0642831B2 JP H0642831 B2 JPH0642831 B2 JP H0642831B2 JP 63505715 A JP63505715 A JP 63505715A JP 50571588 A JP50571588 A JP 50571588A JP H0642831 B2 JPH0642831 B2 JP H0642831B2
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの生物学的活性の不
活性化法に関する。
活性化法に関する。
学術及び科学技術庁長官（Bundesminister ｆｒFors
chung und Technology）により発布された、試験管中で
新たに組換えられた核酸による危険を保護するための指
導要綱によれば、核酸、すなわちＤＮＡを含有する廃棄
物は滅菌もしくは変性されなければならない。従つて、
組換えＤＮＡ含有微生物での作業の際に、有機体を不活
性化することだけではなく、場合により有機体中の組換
えＤＮＡを破壊することも必要である。微生物の死滅は
一般に比較的簡単に行なうことができる。しかしなが
ら、この適用される処置により微生物中のＤＮＡは一般
に破壊されない。この滅菌もしくは変性は行なわれなけ
ればならないので、活性汚泥法による生物学的浄化装置
が供給される場合（これは有利な方法である）、例えば
活性汚泥の微生物を損なつたり、殺したりするバイオマ
スを有する物質が後続の浄化装置に達しないような処置
も、バイオマスを浄化装置に導入する前に行なわれなけ
ればならない。すなわち、毒性でない物質を使用すると
か、又は浄化装置に達する前に分解して、これが損害を
与えないようにするというような配慮も行なわなければ
ならない。
chung und Technology）により発布された、試験管中で
新たに組換えられた核酸による危険を保護するための指
導要綱によれば、核酸、すなわちＤＮＡを含有する廃棄
物は滅菌もしくは変性されなければならない。従つて、
組換えＤＮＡ含有微生物での作業の際に、有機体を不活
性化することだけではなく、場合により有機体中の組換
えＤＮＡを破壊することも必要である。微生物の死滅は
一般に比較的簡単に行なうことができる。しかしなが
ら、この適用される処置により微生物中のＤＮＡは一般
に破壊されない。この滅菌もしくは変性は行なわれなけ
ればならないので、活性汚泥法による生物学的浄化装置
が供給される場合（これは有利な方法である）、例えば
活性汚泥の微生物を損なつたり、殺したりするバイオマ
スを有する物質が後続の浄化装置に達しないような処置
も、バイオマスを浄化装置に導入する前に行なわれなけ
ればならない。すなわち、毒性でない物質を使用すると
か、又は浄化装置に達する前に分解して、これが損害を
与えないようにするというような配慮も行なわなければ
ならない。
例えば、西ドイツ国の公衆衛生局（ＢＧＡ；Bundesgesu
ndheitamt）により、及び西ドイツ国の生物学的安全に
関する中央委員会（ＺＫＢＳ；Zentralkommission ｆ
Biologische Sicherheit）により承認された、公知の
滅菌及び不活性化法（例えば、１２１℃で２０分を越え
る蒸気滅菌）は非常に費用がかかる。特に工業上通常で
ある１０〜５０m3の発酵処理においては、この方法は装
置においても高いエネルギー消費においても著しく費用
が高い。
ndheitamt）により、及び西ドイツ国の生物学的安全に
関する中央委員会（ＺＫＢＳ；Zentralkommission ｆ
Biologische Sicherheit）により承認された、公知の
滅菌及び不活性化法（例えば、１２１℃で２０分を越え
る蒸気滅菌）は非常に費用がかかる。特に工業上通常で
ある１０〜５０m3の発酵処理においては、この方法は装
置においても高いエネルギー消費においても著しく費用
が高い。
従つて、本発明の課題はＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの生
物学的活性を確実に不活性化することができ、不所望
な、特に毒性の物質が廃水中に達しない方法を提供する
ことである。更に、この方法は安価に実施可能であるべ
きである。
物学的活性を確実に不活性化することができ、不所望
な、特に毒性の物質が廃水中に達しない方法を提供する
ことである。更に、この方法は安価に実施可能であるべ
きである。
この課題はＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの生物学的活性を
不活性化するための方法において、ＤＮＡを含有するバ
イオマスに炭素原子数１〜３のペルカルボン酸、アルカ
リペルオキシド又はアルカリペルオキソモノスルフエー
トを添加し、この混合物を６０〜１００℃に加熱するこ
とを特徴とする方法により解決する。
不活性化するための方法において、ＤＮＡを含有するバ
イオマスに炭素原子数１〜３のペルカルボン酸、アルカ
リペルオキシド又はアルカリペルオキソモノスルフエー
トを添加し、この混合物を６０〜１００℃に加熱するこ
とを特徴とする方法により解決する。
前記化合物を使用し、かつこの配合物を加熱することに
より、なお生きている微生物を殺すことができるだけで
なく、その中に含有されるＤＮＡを、複製可能な断片が
もはや含有されていない程十分に分解するということが
意外にも確認された。
より、なお生きている微生物を殺すことができるだけで
なく、その中に含有されるＤＮＡを、複製可能な断片が
もはや含有されていない程十分に分解するということが
意外にも確認された。
本発明による方法で、５００bpより小さいか／同じ断片
へのＤＮＡの分解が達せられ、このことはＺＫＢＳによ
り承認された安全法（オートクレーブ法）によつても越
えられない。この種の断片はもはや生物学的に活性では
なく、従つて、廃水中に導入しても危険ではない。
へのＤＮＡの分解が達せられ、このことはＺＫＢＳによ
り承認された安全法（オートクレーブ法）によつても越
えられない。この種の断片はもはや生物学的に活性では
なく、従つて、廃水中に導入しても危険ではない。
本発明による方法は動物又は人間の細胞の、並びに微生
物の内側又は外側での組換ＤＮＡの培養及び製造におい
て生じるようなバイオマスに有利に使用することができ
る。従つて、本発明による前処置を本来の浄化装置中へ
の導入の前に、微生物、プラスミド及び同様なＤＮＡ含
有材料を含有する廃水に行なうことができ、このことは
ＤＮＡが複製可能な形でもはや全く存在していることが
できないことを確実にする。
物の内側又は外側での組換ＤＮＡの培養及び製造におい
て生じるようなバイオマスに有利に使用することができ
る。従つて、本発明による前処置を本来の浄化装置中へ
の導入の前に、微生物、プラスミド及び同様なＤＮＡ含
有材料を含有する廃水に行なうことができ、このことは
ＤＮＡが複製可能な形でもはや全く存在していることが
できないことを確実にする。
例えば、微生物を含有する培養溶液のようなバイオマス
を炭素原子数１〜３を有するペルカルボン酸、アルカリ
ペルオキシド又はアルカリペルオキソモノスルフエート
と混合する。この際、過酢酸は１方では比較的安定であ
り、他方では安価であるので、これを使用するのが有利
である。過蟻酸及び過プロピオン酸も同様に好適であ
る。アルカリとしては、本発明においてはＮａ、Ｋ及び
Ｌｉが有利である。アンモニウム塩もここではアルカリ
塩とする。0.05〜５重量％の濃度でペル化合物を使用す
るのが有利である。この際、濃度は使用した化合物並び
に処理すべきバイオマスに依存する。
を炭素原子数１〜３を有するペルカルボン酸、アルカリ
ペルオキシド又はアルカリペルオキソモノスルフエート
と混合する。この際、過酢酸は１方では比較的安定であ
り、他方では安価であるので、これを使用するのが有利
である。過蟻酸及び過プロピオン酸も同様に好適であ
る。アルカリとしては、本発明においてはＮａ、Ｋ及び
Ｌｉが有利である。アンモニウム塩もここではアルカリ
塩とする。0.05〜５重量％の濃度でペル化合物を使用す
るのが有利である。この際、濃度は使用した化合物並び
に処理すべきバイオマスに依存する。
ペル化合物の添加後、この混合物を加熱する。不活性化
は６０〜１００℃の温度に加熱することにより達せられ
る。７０〜９０℃の温度に加熱するのが有利である。特
に過酢酸の使用においては、混合物を少なくとも７０℃
に加熱するのが有利である、それというのもこの温度に
おいて過酢酸は迅速に完全に分解するからである。
は６０〜１００℃の温度に加熱することにより達せられ
る。７０〜９０℃の温度に加熱するのが有利である。特
に過酢酸の使用においては、混合物を少なくとも７０℃
に加熱するのが有利である、それというのもこの温度に
おいて過酢酸は迅速に完全に分解するからである。
混合物の加熱を、塩基対５００を越える鎖長のＤＮＡが
もはやクロマトグラフイーにより検出されなくなるまで
行なう。一般に２０〜６０分後である。すべてのＤＮＡ
が分解されたかどうか検査するために、部分量をこの混
合物から取り出し、こうしてアガロースゲル−電気泳動
にかける。分子量によるクロマトグラフイー分離は溶液
中にどのような断片が存在するかを示す。
もはやクロマトグラフイーにより検出されなくなるまで
行なう。一般に２０〜６０分後である。すべてのＤＮＡ
が分解されたかどうか検査するために、部分量をこの混
合物から取り出し、こうしてアガロースゲル−電気泳動
にかける。分子量によるクロマトグラフイー分離は溶液
中にどのような断片が存在するかを示す。
本発明による方法はpH域６〜１１、特に７〜１０で実施
するのが有利である。
するのが有利である。
本発明による方法の著しい利点は、使用したペル化合物
が完全に分解されるということである。使用した化合物
からは生物学的に無害で毒性を有さない化合物が生じ、
これを直接排水網に導くことができ、かつこの際に活性
汚泥中に含有される微生物が殺されるという危険は全く
ない。
が完全に分解されるということである。使用した化合物
からは生物学的に無害で毒性を有さない化合物が生じ、
これを直接排水網に導くことができ、かつこの際に活性
汚泥中に含有される微生物が殺されるという危険は全く
ない。
次に実施例並びに電気泳動に関する図面につき、本発明
を詳細に説明する。
を詳細に説明する。
第１図は種々のペル化合物を使用した種々の試料の電気
泳動の結果を示す（第１表）。
泳動の結果を示す（第１表）。
第２図は種々のペル化合物を使用した種々の試料の電気
泳動の結果を示す（第２表）。
泳動の結果を示す（第２表）。
第３図は種々のペル化合物をより高い濃度と変化した恒
温保持時間で使用した試料の電気泳動の結果を示す（第
３表）。
温保持時間で使用した試料の電気泳動の結果を示す（第
３表）。
第４図は種々の過酢酸濃度を使用した試料の電気泳動の
結果を示す（第４表）。
結果を示す（第４表）。
第５図は種々の濃度のペルオキソモノスルフエートを使
用した試料の電気泳動の結果を示す（第５表）。
用した試料の電気泳動の結果を示す（第５表）。
第６図は異なる温度で過酢酸を使用した試料の電気泳動
の結果を示す（第６表）。
の結果を示す（第６表）。
第７図は種々の濃度の過酢酸を使用した試料の電気泳動
の結果を示す（第７表）。
の結果を示す（第７表）。
第８図は過酢酸で処理した真核細胞系のＤＮＡの試料の
電気泳動の結果を示す（第８及び９表）。
電気泳動の結果を示す（第８及び９表）。
例１ プラスミドＤＮＡの分解をペル化合物により試験した。
このためにはプラスミドｐＢＲ３２２（ＰＮＡＳ、ＵＳ
Ａ第７５巻、１９７８年、第３７３頁）を使用した。プ
ラスミドＤＮＡ３０μｇ／ｍを含有する溶液をこのプ
ラスミドに関しては使用した。この試料をペル化合物と
の種々の配合において処理した。相応する配合物１００
μを次の表中でそれぞれ挙げた条件下に恒温保持し
た。引き続き配合物の各２０μを取り出し、試料緩衝
液５μと混合し、アガロースゲル電気泳動プレート
（アガロース0.8重量％；ＴＲＩＳ／酢酸塩緩衝液、pH
８ 0.04Mol／；ＥＤＴＡ 0.001Mol／）上に載
せ、Ｔ．マニアテイス（Maniatis）、Ｅ．Ｓ．フリツチ
（Fritsch）及びＪ．サムブルツク（Sambrook）（Molec
ular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、New Yor
k、第１１７２４巻、１９８２年、第４５４頁）による
と同様にして分離する。比較溶液としてはＴＥ−緩衝液
２０μ及び試料緩衝液５μ中のｐＢＲ３２２ 0.6
μｇを使用した。鎖長標準としては、Ｈｉｎｄ IIIで
切断したフアージ・ラムダ（J.Mol.Biol.第１６２巻、
１９８２年、第７２９〜７７３頁）（ＤＮＡ−鎖長標準
II、注文番号２３６２５０としてBoehringer Mannheim
GmbHより入手可能）を使用した。フラグメントの分子量
は15.27,6.21,4.41,2.88,1.53,1.34,0.37メガドルトン
であり、これは塩基対２３１３０，９４１６，６６８
２，４３６１，２３２２，２０２７，５６４に相応す
る。使用したペル化合物、濃度及び恒温保持条件を次の
第１〜５表に挙げる： 結果は第１〜５図から明らかになる。この際、第１図及
び第２図からは、ペル化合物0.1％の濃度において、３
０分の恒温保持時間において、かつ８０℃の温度におい
て、ペル化合物として過酢酸及びナトリウムペルオキシ
ドを使用する場合のみ、塩基対（bp）５００を越える長
さのＤＮＡ−フラグメントを検出しない。第３図は0.5
％の濃度のペルオキソモノスルフエートの使用がプラス
ミド−ＤＮＡの十分なフラグメント化を与えることを示
す。第４図からは８０℃の温度で、恒温保持時間３０分
で、濃度0.1％の過酢酸の使用がプラスミド−ＤＮＡの
十分な分解に導びき、ゲル画像中に塩基対５００を越え
る長さのフラグメントが全く認められないということが
明らかになる。第５図は温度８０℃で、かつ恒温保持時
間３０分で濃度0.5％のペルオキソモノスルフエートを
使用する際、同様に十分なプラスミド−ＤＮＡフラグメ
ント化が達せられるということを示します。
このためにはプラスミドｐＢＲ３２２（ＰＮＡＳ、ＵＳ
Ａ第７５巻、１９７８年、第３７３頁）を使用した。プ
ラスミドＤＮＡ３０μｇ／ｍを含有する溶液をこのプ
ラスミドに関しては使用した。この試料をペル化合物と
の種々の配合において処理した。相応する配合物１００
μを次の表中でそれぞれ挙げた条件下に恒温保持し
た。引き続き配合物の各２０μを取り出し、試料緩衝
液５μと混合し、アガロースゲル電気泳動プレート
（アガロース0.8重量％；ＴＲＩＳ／酢酸塩緩衝液、pH
８ 0.04Mol／；ＥＤＴＡ 0.001Mol／）上に載
せ、Ｔ．マニアテイス（Maniatis）、Ｅ．Ｓ．フリツチ
（Fritsch）及びＪ．サムブルツク（Sambrook）（Molec
ular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、New Yor
k、第１１７２４巻、１９８２年、第４５４頁）による
と同様にして分離する。比較溶液としてはＴＥ−緩衝液
２０μ及び試料緩衝液５μ中のｐＢＲ３２２ 0.6
μｇを使用した。鎖長標準としては、Ｈｉｎｄ IIIで
切断したフアージ・ラムダ（J.Mol.Biol.第１６２巻、
１９８２年、第７２９〜７７３頁）（ＤＮＡ−鎖長標準
II、注文番号２３６２５０としてBoehringer Mannheim
GmbHより入手可能）を使用した。フラグメントの分子量
は15.27,6.21,4.41,2.88,1.53,1.34,0.37メガドルトン
であり、これは塩基対２３１３０，９４１６，６６８
２，４３６１，２３２２，２０２７，５６４に相応す
る。使用したペル化合物、濃度及び恒温保持条件を次の
第１〜５表に挙げる： 結果は第１〜５図から明らかになる。この際、第１図及
び第２図からは、ペル化合物0.1％の濃度において、３
０分の恒温保持時間において、かつ８０℃の温度におい
て、ペル化合物として過酢酸及びナトリウムペルオキシ
ドを使用する場合のみ、塩基対（bp）５００を越える長
さのＤＮＡ−フラグメントを検出しない。第３図は0.5
％の濃度のペルオキソモノスルフエートの使用がプラス
ミド−ＤＮＡの十分なフラグメント化を与えることを示
す。第４図からは８０℃の温度で、恒温保持時間３０分
で、濃度0.1％の過酢酸の使用がプラスミド−ＤＮＡの
十分な分解に導びき、ゲル画像中に塩基対５００を越え
る長さのフラグメントが全く認められないということが
明らかになる。第５図は温度８０℃で、かつ恒温保持時
間３０分で濃度0.5％のペルオキソモノスルフエートを
使用する際、同様に十分なプラスミド−ＤＮＡフラグメ
ント化が達せられるということを示します。
例２ プラスミドｐＢＲ３２２の溶液を、例１に記載されてい
るように0.05％過酢酸で３０分間、異なる温度で恒温保
持した。しかしながら、プラスミド−ＤＮＡ３０μｇ／
ｍのかわりにプラスミドＤＮＡ５０μｇ／ｍを使用
した。それぞれ使用した温度を次の第６表に示す。
るように0.05％過酢酸で３０分間、異なる温度で恒温保
持した。しかしながら、プラスミド−ＤＮＡ３０μｇ／
ｍのかわりにプラスミドＤＮＡ５０μｇ／ｍを使用
した。それぞれ使用した温度を次の第６表に示す。
第６表 痕 跡 温 度 １ ＲＴ，過酢酸なし ２ ８０℃，過酢酸なし ３ ＲＴ ４ ５０℃ ５ ６０℃ ６ ７０℃ ７ ８０℃ ８ λ−鎖長標準 この溶液を例１に記載したように、アガロースゲル−電
気泳動プレート上で分離する。比較溶液としてはＴＥ−
緩衝液２０μ及び試料緩衝液５μ中のｐＢＲ３２２
１μｇを使用した。鎖長標準の濃度は例１と同様であ
つた。結果を第６図に示す。この際、６０℃で３０分間
の恒温保持時間においてプラスミド−ＤＮＡの十分なフ
ラグメント化が達せられ、かつ７０℃においてはゲル画
像中には５００bpより大きいフラグメントは全く検出さ
れなかつた。
気泳動プレート上で分離する。比較溶液としてはＴＥ−
緩衝液２０μ及び試料緩衝液５μ中のｐＢＲ３２２
１μｇを使用した。鎖長標準の濃度は例１と同様であ
つた。結果を第６図に示す。この際、６０℃で３０分間
の恒温保持時間においてプラスミド−ＤＮＡの十分なフ
ラグメント化が達せられ、かつ７０℃においてはゲル画
像中には５００bpより大きいフラグメントは全く検出さ
れなかつた。
例３ 形質転換した微生物大腸菌ＥＤ／ｐＢＴ２ａ−Ｉ（ＤＳ
Ｍ３１４３）をヨーロツパ特許第１８７１３８号明細書
中に記載されているように培養した。培養液0.1ｍを
取り出し、本発明により８０℃で３０分間種種の濃度の
過酢酸と恒温保持し、引き続きプロテイナーゼＫ１０mg
／ｍを含有する溶液１０μと混合し、膜結合ＤＮＡ
を分離させるために３７℃で３０分間恒温保持する。遠
心分離（Eppendorf遠心分離機１４００rpm／５分間）の
後、このように処理した培養液各２０μを電気泳動に
かける。過酢酸の濃度並びにそのつど使用した恒温保持
条件を第７表に示す。
Ｍ３１４３）をヨーロツパ特許第１８７１３８号明細書
中に記載されているように培養した。培養液0.1ｍを
取り出し、本発明により８０℃で３０分間種種の濃度の
過酢酸と恒温保持し、引き続きプロテイナーゼＫ１０mg
／ｍを含有する溶液１０μと混合し、膜結合ＤＮＡ
を分離させるために３７℃で３０分間恒温保持する。遠
心分離（Eppendorf遠心分離機１４００rpm／５分間）の
後、このように処理した培養液各２０μを電気泳動に
かける。過酢酸の濃度並びにそのつど使用した恒温保持
条件を第７表に示す。
結果を第７図中に示した。３０分間の恒温保持時間及び
８０℃の温度で0.2％過酢酸で処理した後、培養液中に
も５００bpをこえるＤＮＡ−フラグメントは検出されな
いということが示された。
８０℃の温度で0.2％過酢酸で処理した後、培養液中に
も５００bpをこえるＤＮＡ−フラグメントは検出されな
いということが示された。
例４ ａ）真核細胞の過酢酸での不活性化 ハイブリドーム細胞ＥＣＡＣＣ８４１２２００３をヨー
ロツパ特許第１５０３０９号明細書中に記載されている
ように培養した。種々の配合において、このハイブリド
ーム細胞を過酢酸と恒温保持した。条件を次の第８表に
記載する： 第８表 痕 跡 過酢酸の濃度 温度／恒温保持時間 １ ０ ％ 室温 ２ ０ ％ ８０℃／３０分 ３ 0.2％ ８０℃／３０分 試料１〜３として細胞１０７／１００μの懸濁液各２
０μをアガロースゲル−電気泳動プレート上に担持さ
せ、かつ分離した。結果を第８図に示す。0.2％の濃度
の過酢酸を用いて恒温保持温度８０℃、恒温保持時間３
０分においてＤＮＡは５００bpを越える長さのＤＮＡ−
フラグメントを検出することができない程度に破壊され
る。
ロツパ特許第１５０３０９号明細書中に記載されている
ように培養した。種々の配合において、このハイブリド
ーム細胞を過酢酸と恒温保持した。条件を次の第８表に
記載する： 第８表 痕 跡 過酢酸の濃度 温度／恒温保持時間 １ ０ ％ 室温 ２ ０ ％ ８０℃／３０分 ３ 0.2％ ８０℃／３０分 試料１〜３として細胞１０７／１００μの懸濁液各２
０μをアガロースゲル−電気泳動プレート上に担持さ
せ、かつ分離した。結果を第８図に示す。0.2％の濃度
の過酢酸を用いて恒温保持温度８０℃、恒温保持時間３
０分においてＤＮＡは５００bpを越える長さのＤＮＡ−
フラグメントを検出することができない程度に破壊され
る。
ｂ）過酢酸での処理後、真核細胞の存在においてｐＢＲ
３２２の形質転換能力の検査 試料溶液としては、付加的にｐＢＲ３２２ ５μｇ／0.
1ｍを含有する、ａ）により得られたハイブリドーム
細胞を0.1ｍあたり１０７含有する懸濁液を使用し
た。この溶液を過酢酸で処理した。恒温保持条件を次の
第９表に記載する： 第９表 痕 跡 過酢酸の濃度 温度／恒温保持時間 ４ ０ ％ 室温 ５ ０ ％ ８０℃／３０分 ６ 0.2％ ″ ７ １ ％ ″ ８ λ−鎖長標準 −−− この混合物各２０μをアガロースゲル電気泳動法によ
り分離した。結果は第８図からわかる。0.2％の濃度の
過酢酸は恒温保持時間３０分間及び恒温保持温度８０℃
でＤＮＡを十分に分解し、５００bpを越えるＤＮＡ−フ
ラグメントはもはや含有されない。
３２２の形質転換能力の検査 試料溶液としては、付加的にｐＢＲ３２２ ５μｇ／0.
1ｍを含有する、ａ）により得られたハイブリドーム
細胞を0.1ｍあたり１０７含有する懸濁液を使用し
た。この溶液を過酢酸で処理した。恒温保持条件を次の
第９表に記載する： 第９表 痕 跡 過酢酸の濃度 温度／恒温保持時間 ４ ０ ％ 室温 ５ ０ ％ ８０℃／３０分 ６ 0.2％ ″ ７ １ ％ ″ ８ λ−鎖長標準 −−− この混合物各２０μをアガロースゲル電気泳動法によ
り分離した。結果は第８図からわかる。0.2％の濃度の
過酢酸は恒温保持時間３０分間及び恒温保持温度８０℃
でＤＮＡを十分に分解し、５００bpを越えるＤＮＡ−フ
ラグメントはもはや含有されない。
ｂ）により製造した試料４〜７を過酢酸で恒温保持した
後、それぞれ１部をＴＥ−緩衝液、pH7.5に対して透析
した。この際得られた溶液から大腸菌ＨＢ１０１（ＤＳ
Ｍ１６０７）の形質転換のために、それぞれ２０μを
マニアテイスによる“Molecular Cloning”第２５０〜
２５１頁に記載されている塩化カルシウム法により形質
転換した。
後、それぞれ１部をＴＥ−緩衝液、pH7.5に対して透析
した。この際得られた溶液から大腸菌ＨＢ１０１（ＤＳ
Ｍ１６０７）の形質転換のために、それぞれ２０μを
マニアテイスによる“Molecular Cloning”第２５０〜
２５１頁に記載されている塩化カルシウム法により形質
転換した。
使用した条件並びに得られた生存菌数（ＬＫＺ）は次の
第１０表からわかる。
第１０表からわかる。
ａ）ＴＥ−緩衝液、pH7.5 ２０μ中の純粋なプラス
ミド溶液１μｇ ｂ）細胞培養液中のプラスミド（ヌクレアーゼによる部
分消化；透析；このうち２０μを大腸菌中に形質転
換） ＬＫＺの測定のために細菌を含有する溶液を１０−１〜
１０−６−倍の希釈で、ＬＢ−培地を有するアンピシリ
ン含有（５０μｇ）又は不含寒天プレート上にひろげ、
３７℃で１夜培養し、生長したコロニーの数を視覚的に
調べる。
ミド溶液１μｇ ｂ）細胞培養液中のプラスミド（ヌクレアーゼによる部
分消化；透析；このうち２０μを大腸菌中に形質転
換） ＬＫＺの測定のために細菌を含有する溶液を１０−１〜
１０−６−倍の希釈で、ＬＢ−培地を有するアンピシリ
ン含有（５０μｇ）又は不含寒天プレート上にひろげ、
３７℃で１夜培養し、生長したコロニーの数を視覚的に
調べる。
８０℃の恒温保持温度及び３０分間の恒温保持時間にお
いて0.2％過酢酸との恒温保持は細胞の完全な死滅に導
びいたということを示す。
いて0.2％過酢酸との恒温保持は細胞の完全な死滅に導
びいたということを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シユーマツハー，ギユンター ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8139 ベルンリー ト カペレンヴエーク 20 (72)発明者 ムンスター，マイクル ジヨン ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8122 ペンツベル ク グルーベ 17 (72)発明者 ザイトラー，ボド ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8120 ヴアイルハ イム ヘルツオークシュタントシュトラー セ 35
Claims (5)
- 【請求項１】ＤＮＡを含有するバイオマスに炭素原子数
１〜３のペルカルボン酸、その塩、アルカリペルオキシ
ド又はアルカリペルオキソモノスルフエートを添加し、
引き続き該混合物を６０〜１００℃に加熱することを特
徴とするＤＮＡの生物学的活性の不活性化法。 - 【請求項２】ペル化合物を0.05〜５％の量で使用する請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】クロマトグラフイーにおいて塩基対５００
を越える鎖長を有するＤＮＡがもはや検出されなくなる
まで加熱を行なう請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】pH値が６〜１１の範囲である請求項１から
３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】pH値が７〜１０の範囲である請求項４記載
の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873733921 DE3733921A1 (de) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | Verfahren zur inaktivierung rekombinanter dna |
| DE3733921.4 | 1987-10-07 | ||
| PCT/EP1988/000592 WO1989003226A1 (en) | 1987-10-07 | 1988-07-04 | Process for inactivating recombinant dna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01503197A JPH01503197A (ja) | 1989-11-02 |
| JPH0642831B2 true JPH0642831B2 (ja) | 1994-06-08 |
Family
ID=6337823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63505715A Expired - Lifetime JPH0642831B2 (ja) | 1987-10-07 | 1988-07-04 | Ｄｎａの生物学的活性の不活性化法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5118603A (ja) |
| EP (1) | EP0334904B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0642831B2 (ja) |
| AT (1) | ATE76585T1 (ja) |
| AU (1) | AU598945B2 (ja) |
| DE (2) | DE3733921A1 (ja) |
| DK (1) | DK167852B1 (ja) |
| FI (1) | FI892769A (ja) |
| WO (1) | WO1989003226A1 (ja) |
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| GB9222561D0 (en) * | 1992-10-27 | 1992-12-09 | Ici Plc | Macromolecular degradation |
| US9804069B2 (en) * | 2012-12-19 | 2017-10-31 | Dnae Group Holdings Limited | Methods for degrading nucleic acid |
| EP2984162B1 (en) | 2013-03-15 | 2019-10-23 | DSM IP Assets B.V. | Use of thermophilic nucleases for degrading nucleic acids |
| JP6057175B2 (ja) * | 2013-04-23 | 2017-01-11 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 非脱気式の高温高圧水蒸気処理装置を用いて汚染を漏らさず高速にｄｎａを分解除去する方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US798013A (en) * | 1904-02-23 | 1905-08-22 | Alphonso M Clover | Antiseptic compound. |
| US2058315A (en) * | 1930-11-14 | 1936-10-20 | Buffalo Electro Chemical Co In | Organic persulphonic compounds and process of preparing same |
| US2536008A (en) * | 1949-02-21 | 1950-12-26 | Shell Dev | Peroxy-substituted persulfonates |
| US2957931A (en) * | 1949-07-28 | 1960-10-25 | Socony Mobil Oil Co Inc | Synthesis of compounds having a carbonphosphorus linkage |
| US2802025A (en) * | 1952-11-12 | 1957-08-06 | Degussa | Process for the production of lower carboxylic peracids |
| GB1568358A (en) * | 1975-11-18 | 1980-05-29 | Interox Chemicals Ltd | Aromatic peroxyacids and their use in bleaching processes |
| JPS61152275A (ja) * | 1984-12-27 | 1986-07-10 | Suntory Ltd | 組換え微生物の殺菌法 |
-
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- 1987-10-07 DE DE19873733921 patent/DE3733921A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-07-04 EP EP88905801A patent/EP0334904B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-04 DE DE8888905801T patent/DE3871519D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-04 WO PCT/EP1988/000592 patent/WO1989003226A1/de active IP Right Grant
- 1988-07-04 AU AU19888/88A patent/AU598945B2/en not_active Ceased
- 1988-07-04 US US07/363,887 patent/US5118603A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-04 AT AT88905801T patent/ATE76585T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-07-04 JP JP63505715A patent/JPH0642831B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-01 DK DK268589A patent/DK167852B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-06-06 FI FI892769A patent/FI892769A/fi not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Publication date |
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| AU598945B2 (en) | 1990-07-05 |
| JPH01503197A (ja) | 1989-11-02 |
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| AU1988888A (en) | 1989-05-02 |
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| WO1989003226A1 (en) | 1989-04-20 |
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| US5118603A (en) | 1992-06-02 |
| DK167852B1 (da) | 1993-12-27 |
| DE3871519D1 (de) | 1992-07-02 |
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| EP0334904B1 (de) | 1992-05-27 |
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