JP2003521448A - 合成ペプチドおよび自己免疫疾患治療のための使用方法 - Google Patents
合成ペプチドおよび自己免疫疾患治療のための使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヘテロポリマー組成物およびペプチド組成物、および自己免疫性または炎症性疾患について個体を治療するためのアミノ酸ヘテロポリマーを含む治療組成物の製造および使用方法を提供する。前記ヘテロポリマー組成物は、固相合成法により製造される。本発明は、水溶性ＭＨＣタンパクへの組成物の結合をアッセイするためのキットをも提供する。
Description
【０００１】
技術分野
本発明は、自己免疫疾患の治療のための、定義された配列を有する種々の態様
のペプチド組成物およびこれらの組成物の製造および使用の方法を提供する。精
製ＭＨＣクラスIIタンパクを用いて、結合、および試験抗原との競合における結
合のためのモチーフを決定し、潜在的治療活性を有するペプチド組成物を同定す
る。
のペプチド組成物およびこれらの組成物の製造および使用の方法を提供する。精
製ＭＨＣクラスIIタンパクを用いて、結合、および試験抗原との競合における結
合のためのモチーフを決定し、潜在的治療活性を有するペプチド組成物を同定す
る。
【０００２】
背景
自己免疫疾患は、自分の抗原（自己抗原）に対して向けられた不適切な免疫応
答によってもたらされるものであり、自己寛容性の正常な状態からの逸脱である
。自己寛容性は、自己抗原に対して反応することができるＴ細胞およびＢ細胞の
産生が、生涯の初期に免疫系の発達において起こる事象によって妨げられた場合
に生じる。プロセッシングされたペプチドを結合し、Ｔ細胞に対して提示する能
力を通じて免疫応答の調節において中心的な役割を果たす細胞表面タンパクは、
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子である（Ｒｏｔｈｂａｒｄ， Ｊ． Ｂ．
ら、１９９１年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：５２７）。
答によってもたらされるものであり、自己寛容性の正常な状態からの逸脱である
。自己寛容性は、自己抗原に対して反応することができるＴ細胞およびＢ細胞の
産生が、生涯の初期に免疫系の発達において起こる事象によって妨げられた場合
に生じる。プロセッシングされたペプチドを結合し、Ｔ細胞に対して提示する能
力を通じて免疫応答の調節において中心的な役割を果たす細胞表面タンパクは、
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子である（Ｒｏｔｈｂａｒｄ， Ｊ． Ｂ．
ら、１９９１年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：５２７）。
【０００３】
多数の治療剤が、自己免系疾患を治療するために開発されてきた。これらには
、「スーパーアスピリン類」、例えば低分子量炎症化合物の形成を、シクロオキ
シゲナーゼを阻害することによって防止し得る一般的抗炎症薬；例えば炎症性タ
ンパク腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を抗ＴＮＦ特異的モノクローナル抗体または抗体
フラグメントでまたはＴＮＦレセプターの可溶性形態で封鎖することにより、タ
ンパク炎症媒介因子を阻害することによって機能し得る薬剤；ＣＤ４レセプター
または細胞接着レセプターＩＣＡＭ−１を阻害することによって抗原提示細胞（
ＡＰＣ）との相互作用を一般に妨害する、Ｔ細胞表面のタンパクを標的とする薬
剤、が挙げられる。しかし、治療剤として天然の折りたたまれたタンパクを含む
組成物は、生産、製剤化、貯蔵およびデリバリーにおいて問題を有し得る。これ
らの問題のいくつかは、病院の設定に患者を送達することを必要とする。
、「スーパーアスピリン類」、例えば低分子量炎症化合物の形成を、シクロオキ
シゲナーゼを阻害することによって防止し得る一般的抗炎症薬；例えば炎症性タ
ンパク腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を抗ＴＮＦ特異的モノクローナル抗体または抗体
フラグメントでまたはＴＮＦレセプターの可溶性形態で封鎖することにより、タ
ンパク炎症媒介因子を阻害することによって機能し得る薬剤；ＣＤ４レセプター
または細胞接着レセプターＩＣＡＭ−１を阻害することによって抗原提示細胞（
ＡＰＣ）との相互作用を一般に妨害する、Ｔ細胞表面のタンパクを標的とする薬
剤、が挙げられる。しかし、治療剤として天然の折りたたまれたタンパクを含む
組成物は、生産、製剤化、貯蔵およびデリバリーにおいて問題を有し得る。これ
らの問題のいくつかは、病院の設定に患者を送達することを必要とする。
【０００４】
自己免疫応答の阻害のさらなる標的は、リンパ球表面タンパクＭＨＣ分子、特
にＭＨＣクラスII遺伝子によってコードされるタンパクのセット、例えばＨＬＡ
−ＤＲ、−ＤＱ、および−ＤＰである。ＭＨＣ遺伝子の各々は、哺乳類集団内で
多数の代替的または対立遺伝子的（ａｌｌｅｌｉｃ）形態で見出される。ある種
の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）およびリューマチ性関節炎（ＲＡ
）に罹患した個体のゲノムは、その疾患がリンクしている１または２以上の特徴
的ＭＨＣクラスII対立遺伝子を担持する可能性が高い。
にＭＨＣクラスII遺伝子によってコードされるタンパクのセット、例えばＨＬＡ
−ＤＲ、−ＤＱ、および−ＤＰである。ＭＨＣ遺伝子の各々は、哺乳類集団内で
多数の代替的または対立遺伝子的（ａｌｌｅｌｉｃ）形態で見出される。ある種
の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）およびリューマチ性関節炎（ＲＡ
）に罹患した個体のゲノムは、その疾患がリンクしている１または２以上の特徴
的ＭＨＣクラスII対立遺伝子を担持する可能性が高い。
【０００５】
ＲＡは、ヒトの一般的な自己免疫疾患で、罹患率はコーカサス人種において約
１％であり（Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｊ．ら、１９９７年、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ
Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ中、８９８−９３２）、現在２５０万人のアメリカ
人が罹患している。ＲＡは、滑液関節の慢性的炎症および活性化Ｔ細胞、マクロ
ファージおよび形質細胞による浸潤を特徴とし、関節の軟骨の進行性の破壊がも
たらされる。これは、関節疾患の最も深刻な形態である。ＲＡに対する遺伝性の
感受性は、ＭＨＣクラスII ＤＲＢ１遺伝子座に対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１
、ＤＲＢ１＊０４０４、またはＤＲＢ１＊０４０５またはＤＲＢ１＊０１０１対
立遺伝子を有する罹患個体と強く関連している。ＲＡにおける自己抗原の性質は
、ほとんどわかっていないが、II型コラーゲン（ＣII）が有力な候補である。残
基２６１〜２７３に相当するII型コラーゲン中の免疫優性Ｔ細胞エピトープが同
定された（Ｆｕｇｇｅｒ， Ｌ．ら、１９９６年、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． ２６：９２８−９３３）。
１％であり（Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｊ．ら、１９９７年、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ
Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ中、８９８−９３２）、現在２５０万人のアメリカ
人が罹患している。ＲＡは、滑液関節の慢性的炎症および活性化Ｔ細胞、マクロ
ファージおよび形質細胞による浸潤を特徴とし、関節の軟骨の進行性の破壊がも
たらされる。これは、関節疾患の最も深刻な形態である。ＲＡに対する遺伝性の
感受性は、ＭＨＣクラスII ＤＲＢ１遺伝子座に対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１
、ＤＲＢ１＊０４０４、またはＤＲＢ１＊０４０５またはＤＲＢ１＊０１０１対
立遺伝子を有する罹患個体と強く関連している。ＲＡにおける自己抗原の性質は
、ほとんどわかっていないが、II型コラーゲン（ＣII）が有力な候補である。残
基２６１〜２７３に相当するII型コラーゲン中の免疫優性Ｔ細胞エピトープが同
定された（Ｆｕｇｇｅｒ， Ｌ．ら、１９９６年、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． ２６：９２８−９３３）。
【０００６】
１または２以上のリンクしたＭＨＣクラスII分子に特異的に結合することがで
き、それによって不適切な免疫応答を阻害し得る因子を同定することが望ましい
であろう。比較的非特異的にいくつかのＭＨＣクラスII分子と相互作用し結合す
るひとつの因子は、コポリマー１（Ｃｏｐ１）であり、これは、マウスにおいて
誘発できＭＳのモデルである実験的アレルギー脳髄膜炎を抑制し得ることが示さ
れた合成アミノ酸ヘテロポリマーである（ＥＡＥ； Ｓｅｌａ， Ｍ．， Ｒ．
Ａｒｎｏｎら、１９９０年、Ｂｕｌｌ． Ｉｎｓｔ． Ｐａｓｔｅｕｒ （Ｐ
ａｒｉｓ））。ポリ（Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｋ）であるＣｏｐ１は、一文字アミノ酸略号
を用いて、ここでは「ＹＥＡＫ」として示され（上記参照；Ｙはチロシンを表し
、Ｅはグルタミン酸、Ａはアラニン、そしてＫはリシンである）、それは、ＭＳ
の再発形態を治療するために用いられてきたが、この疾患を完全に抑制していな
い（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ， Ｍ． Ｂ．ら、１９８７年、Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ．
Ｍｅｄ． ３１７：４０８； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｐ．ら、１９９５年
、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５：１２６８）。ＹＥＡＫがＲＡのような別の自己免
疫疾患の治療に有効であるという示唆は存在しない。
き、それによって不適切な免疫応答を阻害し得る因子を同定することが望ましい
であろう。比較的非特異的にいくつかのＭＨＣクラスII分子と相互作用し結合す
るひとつの因子は、コポリマー１（Ｃｏｐ１）であり、これは、マウスにおいて
誘発できＭＳのモデルである実験的アレルギー脳髄膜炎を抑制し得ることが示さ
れた合成アミノ酸ヘテロポリマーである（ＥＡＥ； Ｓｅｌａ， Ｍ．， Ｒ．
Ａｒｎｏｎら、１９９０年、Ｂｕｌｌ． Ｉｎｓｔ． Ｐａｓｔｅｕｒ （Ｐ
ａｒｉｓ））。ポリ（Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｋ）であるＣｏｐ１は、一文字アミノ酸略号
を用いて、ここでは「ＹＥＡＫ」として示され（上記参照；Ｙはチロシンを表し
、Ｅはグルタミン酸、Ａはアラニン、そしてＫはリシンである）、それは、ＭＳ
の再発形態を治療するために用いられてきたが、この疾患を完全に抑制していな
い（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ， Ｍ． Ｂ．ら、１９８７年、Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ．
Ｍｅｄ． ３１７：４０８； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｐ．ら、１９９５年
、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５：１２６８）。ＹＥＡＫがＲＡのような別の自己免
疫疾患の治療に有効であるという示唆は存在しない。
【０００７】
自己免疫疾患のための改良された治療の需要が存在する。このような治療の潜
在的な供給源は、精製されたＭＨＣクラスII対立遺伝子タンパク分子、特に自己
免疫疾患に関連するＭＨＣクラスII対立遺伝子の生成物であるタンパクに、イン
ビトロで選択的に結合する因子を同定することであろう。そのうえ、その因子は
、インビボで抗原提示細胞の表面に生じるそのタンパクにも結合すべきであり、
それによって自己免疫疾患の原因となるＴ細胞をブロックし、アネルギー化し、
または不活性化し得るべきである。
在的な供給源は、精製されたＭＨＣクラスII対立遺伝子タンパク分子、特に自己
免疫疾患に関連するＭＨＣクラスII対立遺伝子の生成物であるタンパクに、イン
ビトロで選択的に結合する因子を同定することであろう。そのうえ、その因子は
、インビボで抗原提示細胞の表面に生じるそのタンパクにも結合すべきであり、
それによって自己免疫疾患の原因となるＴ細胞をブロックし、アネルギー化し、
または不活性化し得るべきである。
【０００８】
概要
本発明の一つの態様において、芳香族酸、負に荷電したアミノ酸、正に荷電し
たアミノ酸、および脂肪族アミノ酸からなるアミノ酸の群から選択される少なく
とも３個の残基を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、長さが少な
くとも７アミノ酸残基であり、かつ、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタ
ンパクに結合することができる合成ペプチドである、組成物が提供される。した
がって、芳香族アミノ酸は、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルア
ラニン（Ｆ）からなる群から選択され、正に荷電したアミノ酸はリシン（Ｋ）で
あり、その配列はリシン−チロシン（ＫＹ）、リシン−バリン（ＫＶ）、および
リシン−フェニルアラニン（ＫＦ）からなる群から選択される。さらに、本発明
のその態様は、負に荷電したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）であり、その配列が
、グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）、グルタミン酸−リシン−バリン
（ＥＫＶ）およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン（ＥＫＦ）からなる
群から選択される、組成物を提供する。さらに、提供される組成物において、脂
肪族であるアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、その配列は、グルタミン酸−リシ
ン−チロシン−アラニン（ＥＫＹＡ）、グルタミン酸−リシン−バリン−アラニ
ン（ＥＫＶＡ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（
ＥＫＦＡ）から選択される。その組成物は、さらにアミノ末端アラニンを含むこ
とができ、その配列は、アラニン−グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン
（ＡＥＫＹＡ）、アラニン−グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＡＥＫ
ＶＡ）、およびアラニン−グルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン
（ＡＥＫＦＡ）からなるアミノ酸配列の群から選択される。本発明の態様である
合成ペプチドは、例えば関節炎の状態（例えばリューマチ性関節炎）のような自
己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパクに結合することができる。別の態
様においては、本発明の態様である合成ペプチド組成物は、アラニンである脂肪
族アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列は、リシン−グルタミン酸−チロシン−ア
ラニン（ＫＥＹＡ）、リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＫＹＡＥ）
、リシン−グルタミン酸−バリン−アラニン（ＫＥＶＡ）、リシン−バリン−ア
ラニン−グルタミン酸（ＫＶＡＥ）、リシン−グルタミン酸−フェニルアラニン
−アラニン（ＫＥＦＡ）、およびリシン−フェニルアラニン−アラニン−グルタ
ミン酸（ＫＦＡＥ）からなる群から選択される。脂肪族アミノ酸がアラニン（Ａ
）であるさらに別の態様においては、アミノ酸配列は、リシン−チロシン−アラ
ニン−アラニン（ＫＹＡＡ）またはリシン−リシン−チロシン−アラニン（ＫＫ
ＹＡ）、リシン−バリン−アラニン−アラニン（ＫＶＡＡ）またはリシン−リシ
ン−バリン−アラニン（ＫＫＶＡ）、リシン−フェニルアラニン−アラニン−ア
ラニン（ＫＦＡＡ）、およびリシン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（Ｋ
ＫＦＡ）からなるアミノ酸配列の群から選択される。この態様においては、ペプ
チドは、２個のアラニン残基をさらに含むことができ、そのアミノ酸配列は、ア
ラニン−リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＹＡＥ）、グルタミ
ン酸−アラニン−リシン−チロシン−アラニン（ＥＡＫＹＡ）、アラニン−リシ
ン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＶＡＥ）；およびグルタミン酸−ア
ラニン−リシン−バリン−アラニン（ＥＡＫＶＡ）、およびアラニン−リシン−
フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＦＡＥ）；およびグルタミン
酸−アラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＡＫＦＡ））からなる
群から選択されることができる。本発明のこの態様のペプチド組成物は、長さが
７〜１００アミノ酸残基であることができる。
たアミノ酸、および脂肪族アミノ酸からなるアミノ酸の群から選択される少なく
とも３個の残基を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、長さが少な
くとも７アミノ酸残基であり、かつ、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタ
ンパクに結合することができる合成ペプチドである、組成物が提供される。した
がって、芳香族アミノ酸は、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルア
ラニン（Ｆ）からなる群から選択され、正に荷電したアミノ酸はリシン（Ｋ）で
あり、その配列はリシン−チロシン（ＫＹ）、リシン−バリン（ＫＶ）、および
リシン−フェニルアラニン（ＫＦ）からなる群から選択される。さらに、本発明
のその態様は、負に荷電したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）であり、その配列が
、グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）、グルタミン酸−リシン−バリン
（ＥＫＶ）およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン（ＥＫＦ）からなる
群から選択される、組成物を提供する。さらに、提供される組成物において、脂
肪族であるアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、その配列は、グルタミン酸−リシ
ン−チロシン−アラニン（ＥＫＹＡ）、グルタミン酸−リシン−バリン−アラニ
ン（ＥＫＶＡ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（
ＥＫＦＡ）から選択される。その組成物は、さらにアミノ末端アラニンを含むこ
とができ、その配列は、アラニン−グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン
（ＡＥＫＹＡ）、アラニン−グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＡＥＫ
ＶＡ）、およびアラニン−グルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン
（ＡＥＫＦＡ）からなるアミノ酸配列の群から選択される。本発明の態様である
合成ペプチドは、例えば関節炎の状態（例えばリューマチ性関節炎）のような自
己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパクに結合することができる。別の態
様においては、本発明の態様である合成ペプチド組成物は、アラニンである脂肪
族アミノ酸を有し、そのアミノ酸配列は、リシン−グルタミン酸−チロシン−ア
ラニン（ＫＥＹＡ）、リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＫＹＡＥ）
、リシン−グルタミン酸−バリン−アラニン（ＫＥＶＡ）、リシン−バリン−ア
ラニン−グルタミン酸（ＫＶＡＥ）、リシン−グルタミン酸−フェニルアラニン
−アラニン（ＫＥＦＡ）、およびリシン−フェニルアラニン−アラニン−グルタ
ミン酸（ＫＦＡＥ）からなる群から選択される。脂肪族アミノ酸がアラニン（Ａ
）であるさらに別の態様においては、アミノ酸配列は、リシン−チロシン−アラ
ニン−アラニン（ＫＹＡＡ）またはリシン−リシン−チロシン−アラニン（ＫＫ
ＹＡ）、リシン−バリン−アラニン−アラニン（ＫＶＡＡ）またはリシン−リシ
ン−バリン−アラニン（ＫＫＶＡ）、リシン−フェニルアラニン−アラニン−ア
ラニン（ＫＦＡＡ）、およびリシン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（Ｋ
ＫＦＡ）からなるアミノ酸配列の群から選択される。この態様においては、ペプ
チドは、２個のアラニン残基をさらに含むことができ、そのアミノ酸配列は、ア
ラニン−リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＹＡＥ）、グルタミ
ン酸−アラニン−リシン−チロシン−アラニン（ＥＡＫＹＡ）、アラニン−リシ
ン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＶＡＥ）；およびグルタミン酸−ア
ラニン−リシン−バリン−アラニン（ＥＡＫＶＡ）、およびアラニン−リシン−
フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＦＡＥ）；およびグルタミン
酸−アラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＡＫＦＡ））からなる
群から選択されることができる。本発明のこの態様のペプチド組成物は、長さが
７〜１００アミノ酸残基であることができる。
【０００９】
本発明の別の態様は、自己免疫疾患を患う個体において治療活性を有する合成
ペプチドである組成物であって、アミノ酸配列が、グルタミン酸、リシンおよび
アラニン、およびチロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択
されるアミノ酸の、アミノ酸の各々の少なくとも１つを含む組成物を提供する。
この組成物は、長さ７〜１００アミノ酸、例えば長さ７〜５０アミノ酸、長さ７
〜２５アミノ酸、長さ７〜１５アミノ酸のペプチドであることができる。この組
成物は、医薬的に許容可能な担体中の単一用量として、例えば実質的に純粋な合
成ペプチドとして製剤化することができる。本発明の一態様は、II型コラーゲン
２６１−２７３ペプチドよりも、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパ
クの抗原結合グルーブに対してより大きい親和性を有する合成ペプチドである。
これらの態様のさらなる例においては、個体中のペプチドのプロテアーゼ分解の
量で残基位置にアミノ酸アナログを含む組成物が提供される。
ペプチドである組成物であって、アミノ酸配列が、グルタミン酸、リシンおよび
アラニン、およびチロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択
されるアミノ酸の、アミノ酸の各々の少なくとも１つを含む組成物を提供する。
この組成物は、長さ７〜１００アミノ酸、例えば長さ７〜５０アミノ酸、長さ７
〜２５アミノ酸、長さ７〜１５アミノ酸のペプチドであることができる。この組
成物は、医薬的に許容可能な担体中の単一用量として、例えば実質的に純粋な合
成ペプチドとして製剤化することができる。本発明の一態様は、II型コラーゲン
２６１−２７３ペプチドよりも、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパ
クの抗原結合グルーブに対してより大きい親和性を有する合成ペプチドである。
これらの態様のさらなる例においては、個体中のペプチドのプロテアーゼ分解の
量で残基位置にアミノ酸アナログを含む組成物が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様は、以下のものからなる群から選択される配列を有する単離
されたペプチド組成物である：ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）
、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫ
ＡＡＡＡ（配列番号１５）、およびＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号
１８）。本発明のさらなる一態様は、前記の単離されたペプチドのひとつの例で
あって、チロシン（Ｙ）がバリン（Ｆ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換さ
れているものである。さらに、本発明の一態様は、以下のものからなる群から選
択される配列を有する単離されたペプチド組成物であって、そのペプチドはＭＨ
ＣクラスIIタンパクに対する高親和性を有するペプチドである組成物であること
ができる：ＡＥＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号６）、ＡＫＥＹＡＡＡＡ
ＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＫＥＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１
０）、ＡＥＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１１）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡ
ＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１
３）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡ
ＡＫＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＥＡＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１
６）、ＥＫＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＥＡＫＹＡＡＡＡＡ
ＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）、ＡＫＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２
１）、ＡＡＥＹＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２
９）、ＡＥＹＡＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３２）、ＡＥＫＡＹＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ（配列番号３３）、ＡＹＫＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３
５）、およびＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３６）。本発明のさら
に別の態様は、チロシン（Ｙ）がバリン（Ｆ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で
置換されている前記の配列のいずれかに記載の単離されたペプチドである。
されたペプチド組成物である：ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）
、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫ
ＡＡＡＡ（配列番号１５）、およびＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号
１８）。本発明のさらなる一態様は、前記の単離されたペプチドのひとつの例で
あって、チロシン（Ｙ）がバリン（Ｆ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換さ
れているものである。さらに、本発明の一態様は、以下のものからなる群から選
択される配列を有する単離されたペプチド組成物であって、そのペプチドはＭＨ
ＣクラスIIタンパクに対する高親和性を有するペプチドである組成物であること
ができる：ＡＥＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号６）、ＡＫＥＹＡＡＡＡ
ＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＫＥＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１
０）、ＡＥＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１１）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡ
ＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１
３）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡ
ＡＫＡＡＡＡ（配列番号１５）、ＥＡＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１
６）、ＥＫＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＥＡＫＹＡＡＡＡＡ
ＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）、ＡＫＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２
１）、ＡＡＥＹＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２
９）、ＡＥＹＡＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３２）、ＡＥＫＡＹＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ（配列番号３３）、ＡＹＫＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３
５）、およびＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３６）。本発明のさら
に別の態様は、チロシン（Ｙ）がバリン（Ｆ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で
置換されている前記の配列のいずれかに記載の単離されたペプチドである。
【００１１】
本発明の別の態様は、自己抗原に対する個体における免疫応答を阻害すること
ができるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド組成物であって、ＭＨＣクラ
スII ＤＲタンパクのペプチド結合グルーブ中の抗原結合ポケットに相当する前
記ペプチドのアミノ酸配列中の位置が、特定のアミノ酸として同定されるペプチ
ド組成物を提供する。例えば、自己抗原が多発性硬化症および関節炎からなる群
から選択される状態と関連する単離されたペプチド組成物が提供される。ＭＨＣ
クラスIIタンパクは、ＨＬＡ−ＤＲ１タンパク、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパクからな
る群から選択されることができる。別の態様においては、ＭＨＣクラスIIタンパ
クは、ＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲ２である。本発明の一態様は、ＭＨＣクラ
スIIペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列中の位置のアミノ酸
残基が、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される単
離されたペプチドを提供する。この態様は、ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルー
ブ中のＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸位置のアミノ酸残基がアラ
ニンである単離されたペプチド組成物をさらに提供する。この態様は、ＭＨＣク
ラスIIペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸
位置を８残基越えた位置にあるアミノ酸残基がリシン残基およびアラニン残基か
らなる群から選択され、Ｐ１ポケットに相当するアミノ酸残基がチロシン、バリ
ンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される、単離されたペプチド組成
物をさらに提供する。
ができるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド組成物であって、ＭＨＣクラ
スII ＤＲタンパクのペプチド結合グルーブ中の抗原結合ポケットに相当する前
記ペプチドのアミノ酸配列中の位置が、特定のアミノ酸として同定されるペプチ
ド組成物を提供する。例えば、自己抗原が多発性硬化症および関節炎からなる群
から選択される状態と関連する単離されたペプチド組成物が提供される。ＭＨＣ
クラスIIタンパクは、ＨＬＡ−ＤＲ１タンパク、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパクからな
る群から選択されることができる。別の態様においては、ＭＨＣクラスIIタンパ
クは、ＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲ２である。本発明の一態様は、ＭＨＣクラ
スIIペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列中の位置のアミノ酸
残基が、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される単
離されたペプチドを提供する。この態様は、ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルー
ブ中のＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸位置のアミノ酸残基がアラ
ニンである単離されたペプチド組成物をさらに提供する。この態様は、ＭＨＣク
ラスIIペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する配列の最初のアミノ酸
位置を８残基越えた位置にあるアミノ酸残基がリシン残基およびアラニン残基か
らなる群から選択され、Ｐ１ポケットに相当するアミノ酸残基がチロシン、バリ
ンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される、単離されたペプチド組成
物をさらに提供する。
【００１２】
本発明の別の例は、第一のペプチド配列および第二のペプチド配列を含む医薬
調製物であって、調製物が第一のペプチド配列および第二のペプチド配列の混合
物であって、ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する
アミノ酸を８残基越えた相当するアミノ酸位置に、第一の配列がリシン残基を有
し、第二の配列がアラニン残基を有する調製物を提供する。
調製物であって、調製物が第一のペプチド配列および第二のペプチド配列の混合
物であって、ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブ中のＰ１ポケットに相当する
アミノ酸を８残基越えた相当するアミノ酸位置に、第一の配列がリシン残基を有
し、第二の配列がアラニン残基を有する調製物を提供する。
【００１３】
自己免疫疾患は、以下のものからなる群から選択される：多発性硬化症、重症
筋無力症、橋本病、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ギヤン−バレー症候
群、グレーヴズ病、特発性粘液水腫、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫性血小減少性
紫斑病、大腸炎、糖尿病、乾癬、尋常性天疱瘡およびリューマチ性関節炎。
筋無力症、橋本病、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ギヤン−バレー症候
群、グレーヴズ病、特発性粘液水腫、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫性血小減少性
紫斑病、大腸炎、糖尿病、乾癬、尋常性天疱瘡およびリューマチ性関節炎。
【００１４】
特に、本発明の治療組成物の態様は、関節炎の状態の自己免疫疾患を治療する
ために使用することができる。さらに、本発明の治療組成物の態様は、脱髄性疾
患である自己免疫疾患を治療するために使用することができる。さらに別の態様
においては、本発明の治療組成物の態様は、炎症性疾患である自己免疫疾患を治
療するために使用することができる。例えば、本発明の一態様は、自己免疫疾患
リューマチ性関節炎を治療するための治療組成物である。別の例においては、本
発明の態様は、自己免疫疾患多発性硬化症を治療するための治療組成物である。
ために使用することができる。さらに、本発明の治療組成物の態様は、脱髄性疾
患である自己免疫疾患を治療するために使用することができる。さらに別の態様
においては、本発明の治療組成物の態様は、炎症性疾患である自己免疫疾患を治
療するために使用することができる。例えば、本発明の一態様は、自己免疫疾患
リューマチ性関節炎を治療するための治療組成物である。別の例においては、本
発明の態様は、自己免疫疾患多発性硬化症を治療するための治療組成物である。
【００１５】
本発明の別の態様においては、個体において治療活性を有する合成ペプチドヘ
テロポリマーの混合物中のＭＨＣクラスIIアミノ酸結合モチーフ配列を得る方法
であって、以下の工程を含む方法が提供される：（ａ）合成ヘテロポリマーの混
合物をＭＨＣクラスIIタンパク分子に結合させて、ヘテロポリマー−ＭＨＣタン
パク複合体を形成させる工程；（ｂ）前記ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合
体から突出しているヘテロポリマーのアミノ末端アミノ酸残基をペプチダーゼ酵
素消化により除去し、ヘテロポリマーのアミノ末端をＭＨＣタンパク複合体の辺
縁と整列させる工程；および（ｃ）複合体を解離させることにより整列させたヘ
テロポリマーをＭＨＣタンパクから溶出させ、結合モチーフを有するアミノ末端
整列ヘテロポリマーを放出させる工程。この方法には、付加的な工程（ｄ）が含
まれ得る：整列させたヘテロポリマーのアミノ末端配列を決定し、結合モチーフ
を得る工程。さらに、この方法には、付加的な工程（ｅ）が含まれ得る：整列さ
れたヘテロポリマーのアミノ末端配列を合成ヘテロポリマー組成物のアミノ酸配
列と比較する工程。この方法においては、ＭＨＣクラスIIタンパクは、自己免疫
疾患と関連しており、例えば、その自己免疫疾患は、関節炎の状態または脱髄の
状態である。
テロポリマーの混合物中のＭＨＣクラスIIアミノ酸結合モチーフ配列を得る方法
であって、以下の工程を含む方法が提供される：（ａ）合成ヘテロポリマーの混
合物をＭＨＣクラスIIタンパク分子に結合させて、ヘテロポリマー−ＭＨＣタン
パク複合体を形成させる工程；（ｂ）前記ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合
体から突出しているヘテロポリマーのアミノ末端アミノ酸残基をペプチダーゼ酵
素消化により除去し、ヘテロポリマーのアミノ末端をＭＨＣタンパク複合体の辺
縁と整列させる工程；および（ｃ）複合体を解離させることにより整列させたヘ
テロポリマーをＭＨＣタンパクから溶出させ、結合モチーフを有するアミノ末端
整列ヘテロポリマーを放出させる工程。この方法には、付加的な工程（ｄ）が含
まれ得る：整列させたヘテロポリマーのアミノ末端配列を決定し、結合モチーフ
を得る工程。さらに、この方法には、付加的な工程（ｅ）が含まれ得る：整列さ
れたヘテロポリマーのアミノ末端配列を合成ヘテロポリマー組成物のアミノ酸配
列と比較する工程。この方法においては、ＭＨＣクラスIIタンパクは、自己免疫
疾患と関連しており、例えば、その自己免疫疾患は、関節炎の状態または脱髄の
状態である。
【００１６】
この方法の別の態様においては、付加的な工程（ｅ）は以下の工程を含むこと
ができる：複数のペプチド調製物であって、各々のペプチド調製物が結合モチー
フのアミノ酸配列を有するペプチド調製物を合成する工程。この方法のさらなる
側面においては、付加的な工程（ｆ）は、以下の工程を含むことができる：各々
の合成ペプチドのＭＨＣクラスIIタンパクに対する親和性を決定する工程。
ができる：複数のペプチド調製物であって、各々のペプチド調製物が結合モチー
フのアミノ酸配列を有するペプチド調製物を合成する工程。この方法のさらなる
側面においては、付加的な工程（ｆ）は、以下の工程を含むことができる：各々
の合成ペプチドのＭＨＣクラスIIタンパクに対する親和性を決定する工程。
【００１７】
具体的な態様の詳細な説明
文脈が別のことを必要としない限り、本明細書および以下の特許請求の範囲に
おいて使用される場合、以下の用語は以下に規定するとおりの意味を有する： 「自己免疫状態」という用語は、自己抗原として知られる自己がコードするも
のに対して向けられた不適切な免疫応答によって引き起こされる疾患状態を意味
する。
おいて使用される場合、以下の用語は以下に規定するとおりの意味を有する： 「自己免疫状態」という用語は、自己抗原として知られる自己がコードするも
のに対して向けられた不適切な免疫応答によって引き起こされる疾患状態を意味
する。
【００１８】
アミノ酸の「誘導体」という用語は、付加的な置換基、例えば、アミノ酸の原
子に付着した、Ｎ−カルボキシ無水物基、γ−ベンジル基、ε，Ｎ−トリフルオ
ロアセチル基、またはハロゲン化物基を有するそのアミノ酸の化学的に関連した
形態を意味する。
子に付着した、Ｎ−カルボキシ無水物基、γ−ベンジル基、ε，Ｎ−トリフルオ
ロアセチル基、またはハロゲン化物基を有するそのアミノ酸の化学的に関連した
形態を意味する。
【００１９】
「アナログ」という用語は、異なる形状を有するそのアミノ酸の化学的に関連
した形態、例えばアイソマー、またはＬ型でなくＤ型、またはアミノ酸のおよそ
の大きさおよび形を有する有機分子、または、ペプチドまたはポリペプチドに重
合されたときにプロテアーゼ耐性であるようにペプチド結合に関与する原子に改
変を有するアミノ酸、を意味する。
した形態、例えばアイソマー、またはＬ型でなくＤ型、またはアミノ酸のおよそ
の大きさおよび形を有する有機分子、または、ペプチドまたはポリペプチドに重
合されたときにプロテアーゼ耐性であるようにペプチド結合に関与する原子に改
変を有するアミノ酸、を意味する。
【００２０】
「アミノ酸」および「アミノ酸配列」という句は、その配列により示される２
０種の天然アミノ酸のいずれか１または２以上の残基の一部または全体を構成す
るアミノ酸誘導体および／またはアミノ酸アナログである１または２以上の成分
を含むことができる。例えば、１または２以上のチロシン残基を含むアミノ酸配
列においては、これらの残基の１または２以上の一部分はホモチロシンで置換さ
れることができる。さらに、２つの隣接残基の間に１または２以上の非ペプチド
またはペプチドミメティックな結合を有するアミノ酸配列は、この定義内に含ま
れる。
０種の天然アミノ酸のいずれか１または２以上の残基の一部または全体を構成す
るアミノ酸誘導体および／またはアミノ酸アナログである１または２以上の成分
を含むことができる。例えば、１または２以上のチロシン残基を含むアミノ酸配
列においては、これらの残基の１または２以上の一部分はホモチロシンで置換さ
れることができる。さらに、２つの隣接残基の間に１または２以上の非ペプチド
またはペプチドミメティックな結合を有するアミノ酸配列は、この定義内に含ま
れる。
【００２１】
「疎水性」アミノ酸という用語は、脂肪族アミノ酸であるアラニン（Ａまたは
ａｌａ）、グリシン（Ｇまたはｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉまたはｉｌｅ）、ロ
イシン（Ｌまたはｌｅｕ）、プロリン（Ｐまたはｐｒｏ）、およびバリン（Ｖま
たはｖａｌ）（括弧内の用語は、各アミノ酸についての一文字または三文字略号
である）、および芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗまたはｔｒｐ）、フ
ェニルアラニン（Ｆまたはｐｈｅ）、およびチロシン（Ｙまたはｔｙｒ）を意味
する。これらのアミノ酸は、タンパク中の残基として見出される場合、脂肪族側
鎖の長さおよび芳香族側鎖の大きさの関数として疎水性を付与する。
ａｌａ）、グリシン（Ｇまたはｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉまたはｉｌｅ）、ロ
イシン（Ｌまたはｌｅｕ）、プロリン（Ｐまたはｐｒｏ）、およびバリン（Ｖま
たはｖａｌ）（括弧内の用語は、各アミノ酸についての一文字または三文字略号
である）、および芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗまたはｔｒｐ）、フ
ェニルアラニン（Ｆまたはｐｈｅ）、およびチロシン（Ｙまたはｔｙｒ）を意味
する。これらのアミノ酸は、タンパク中の残基として見出される場合、脂肪族側
鎖の長さおよび芳香族側鎖の大きさの関数として疎水性を付与する。
【００２２】
「荷電した」アミノ酸という用語は、アミノ酸アスパラギン酸（Ｄまたはａｓ
ｐ）、グルタミン酸（Ｅまたはｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈまたはｈｉｓ）、アル
ギニン（Ｒまたはａｒｇ）およびリシン（Ｋまたはｌｙｓ）を意味し、これらは
、これらの残基を含むタンパクに水性溶液中で生理学的ｐＨ値で正（ｈｉｓ、ｌ
ｙｓ、およびａｒｇ）または負（ａｓｐ、ｇｌｙ）電荷を与える。
ｐ）、グルタミン酸（Ｅまたはｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈまたはｈｉｓ）、アル
ギニン（Ｒまたはａｒｇ）およびリシン（Ｋまたはｌｙｓ）を意味し、これらは
、これらの残基を含むタンパクに水性溶液中で生理学的ｐＨ値で正（ｈｉｓ、ｌ
ｙｓ、およびａｒｇ）または負（ａｓｐ、ｇｌｙ）電荷を与える。
【００２３】
「アネルギー」という用語は、抗原に対する個体の免疫系の不応答を意味する
。
。
【００２４】
ここで用いる場合、「個体」という用語は、哺乳類を示す。
【００２５】
「関節炎（の）状態」という用語は、その状態を有する個体の少なくとも単一
の関節（例えば肩、膝、腰または個体の指）に見出されるリューマチ性関節炎の
少なくとも１つの症状を意味する。関節炎の状態の例としては、２以上の関節を
侵す関節炎状態である「多発性関節炎」；２１歳未満の個体の関節炎状態である
「若年性関節炎」；およびリューマチ性関節炎（ＲＡ）の症状と共に好中球減少
症、巨脾腫症、体重減少、貧血症、リンパ節症、および皮膚の色素斑の症状もま
た含む「フェルティ症候群」が挙げられる。
の関節（例えば肩、膝、腰または個体の指）に見出されるリューマチ性関節炎の
少なくとも１つの症状を意味する。関節炎の状態の例としては、２以上の関節を
侵す関節炎状態である「多発性関節炎」；２１歳未満の個体の関節炎状態である
「若年性関節炎」；およびリューマチ性関節炎（ＲＡ）の症状と共に好中球減少
症、巨脾腫症、体重減少、貧血症、リンパ節症、および皮膚の色素斑の症状もま
た含む「フェルティ症候群」が挙げられる。
【００２６】
「異種（ヘテロ）細胞」という用語は、個体の細胞に関係しないＭＨＣタンパ
クの産生のための細胞を意味し、すなわち、異種細胞は、哺乳類の細胞ではない
。好ましくは、異種細胞は、温血動物由来ではなく、より好ましくは、異種細胞
は脊椎動物由来ではない。最も好ましい態様においては、異種細胞は、昆虫細胞
、または酵母細胞のような微生物の細胞である。
クの産生のための細胞を意味し、すなわち、異種細胞は、哺乳類の細胞ではない
。好ましくは、異種細胞は、温血動物由来ではなく、より好ましくは、異種細胞
は脊椎動物由来ではない。最も好ましい態様においては、異種細胞は、昆虫細胞
、または酵母細胞のような微生物の細胞である。
【００２７】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、生理学的に適合性の、任意のすべ
ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤のような抗微生物剤
、等張吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋内、経口、腹腔内
、経皮、または皮下投与に適するものであり、活性化合物は、酸の作用または他
の不利な天然状態による不活性化からそれを保護する物質で被膜されていること
ができる。
ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤のような抗微生物剤
、等張吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋内、経口、腹腔内
、経皮、または皮下投与に適するものであり、活性化合物は、酸の作用または他
の不利な天然状態による不活性化からそれを保護する物質で被膜されていること
ができる。
【００２８】
自己免疫疾患の治療剤としてのアミノ酸のヘテロポリマー
本発明は、特異的ＭＨＣクラスIIタンパクに結合することができる薬剤のクラ
スの使用方法に向けられている。このような薬剤は、クラスIIタンパクに結合す
ることができ、したがって、自己免疫疾患に関与する自己抗原の結合を阻害およ
び／または防止することができ、あるいは、結合に際してアネルギーを引き起こ
すことができ、自己抗原に対する免疫系の応答がないようにする。
スの使用方法に向けられている。このような薬剤は、クラスIIタンパクに結合す
ることができ、したがって、自己免疫疾患に関与する自己抗原の結合を阻害およ
び／または防止することができ、あるいは、結合に際してアネルギーを引き起こ
すことができ、自己抗原に対する免疫系の応答がないようにする。
【００２９】
クラスII ＭＨＣタンパクは、２つのほぼ等しい大きさのサブユニットである
αおよびβからなっており、これらは膜貫通タンパクである。ペプチド結合分割
部分（ｃｌｅｆｔ）は、αおよびβ両サブユニットのアミノ末端からのタンパク
の特徴によって形成されており、Ｔ細胞に対する抗原の提示の部位である。クラ
スII ＭＨＣ分子には少なくとも３つのタイプ、すなわちＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ
−ＤＱ、およびＨＬＡ―ＤＰがあり、各タイプの多数の対立遺伝子がある。クラ
スII ＭＨＣ分子は、Ｂリンパ球およびマクロファージのような抗原提示細胞の
表面上に主に発現される（Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｗ， Ｌ．， 「Ｔｈｅ Ｍａｊ
ｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ （ＭＨＣ）」
、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ中、
Ｏｘｆｏｒｄ： Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９
４年、６０２〜６０６頁）。
αおよびβからなっており、これらは膜貫通タンパクである。ペプチド結合分割
部分（ｃｌｅｆｔ）は、αおよびβ両サブユニットのアミノ末端からのタンパク
の特徴によって形成されており、Ｔ細胞に対する抗原の提示の部位である。クラ
スII ＭＨＣ分子には少なくとも３つのタイプ、すなわちＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ
−ＤＱ、およびＨＬＡ―ＤＰがあり、各タイプの多数の対立遺伝子がある。クラ
スII ＭＨＣ分子は、Ｂリンパ球およびマクロファージのような抗原提示細胞の
表面上に主に発現される（Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｗ， Ｌ．， 「Ｔｈｅ Ｍａｊ
ｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ （ＭＨＣ）」
、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ中、
Ｏｘｆｏｒｄ： Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９
４年、６０２〜６０６頁）。
【００３０】
本発明の一態様は、３個以上の異なるアミノ酸を含むヘテロポリマーとして同
定される一つのクラスの化合物を用いてＭＨＣクラスII分子をターゲティングす
ることにより、自己免疫疾患を治療するための新規な方法を含む。さらに、この
３アミノ酸のヘテロポリマーは、荷電した、または疎水性のアミノ酸から優先的
に合成される。好ましい荷電アミノ酸は、リシンおよびグルタミン酸であり；好
ましい疎水性アミノ酸は芳香族、例えばチロシンまたはフェニルアラニンである
ことができ；そして、脂肪族、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソ
ロイシンであることができる。ヘテロポリマーは、好適な分子量の生成物に合成
することができ、そこでは、分子は、ある範囲の平均分子量、例えば２，０００
ダルトン〜４，０００ダルトン；３，０００ダルトン〜６，０００ダルトン；５
，０００ダルトン〜１０，０００ダルトン；８，０００ダルトン〜１２，０００
ダルトンを有することができ、そして２０，０００ダルトンまで広がることがで
きる。
定される一つのクラスの化合物を用いてＭＨＣクラスII分子をターゲティングす
ることにより、自己免疫疾患を治療するための新規な方法を含む。さらに、この
３アミノ酸のヘテロポリマーは、荷電した、または疎水性のアミノ酸から優先的
に合成される。好ましい荷電アミノ酸は、リシンおよびグルタミン酸であり；好
ましい疎水性アミノ酸は芳香族、例えばチロシンまたはフェニルアラニンである
ことができ；そして、脂肪族、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソ
ロイシンであることができる。ヘテロポリマーは、好適な分子量の生成物に合成
することができ、そこでは、分子は、ある範囲の平均分子量、例えば２，０００
ダルトン〜４，０００ダルトン；３，０００ダルトン〜６，０００ダルトン；５
，０００ダルトン〜１０，０００ダルトン；８，０００ダルトン〜１２，０００
ダルトンを有することができ、そして２０，０００ダルトンまで広がることがで
きる。
【００３１】
別の態様においては、本発明のヘテロポリマーは、さらなる重合のために自動
ペプチド合成装置中の樹脂に固定化されたｆ−ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ開始アミ
ノ酸アナログ等を用いて合成することができ（固相合成）、ポリマー生成物集団
内で狭い範囲の分子量を有するヘテロポリマー生成物を生じることができる。こ
の態様においては、生成物ヘテロポリマーの平均分子量は、最短および最長分子
のそれ（分子量）の１００ダルトン以内；最短および最長分子のそれの２００ダ
ルトン以内；最短および最長分子のそれの３００ダルトン以内；最短および最長
分子のそれの４００ダルトン以内；または集団内の最短および最長分子のそれの
８００ダルトン以内であることができる。
ペプチド合成装置中の樹脂に固定化されたｆ−ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ開始アミ
ノ酸アナログ等を用いて合成することができ（固相合成）、ポリマー生成物集団
内で狭い範囲の分子量を有するヘテロポリマー生成物を生じることができる。こ
の態様においては、生成物ヘテロポリマーの平均分子量は、最短および最長分子
のそれ（分子量）の１００ダルトン以内；最短および最長分子のそれの２００ダ
ルトン以内；最短および最長分子のそれの３００ダルトン以内；最短および最長
分子のそれの４００ダルトン以内；または集団内の最短および最長分子のそれの
８００ダルトン以内であることができる。
【００３２】
アミノ酸は、最適の結合特性を有するヘテロポリマーを提供するよう調整する
ことができるモル比で重合され、例えば、ＹＡＫにおいては、最終生成物のチロ
シン１モル当たり少なくとも３モルのリシンおよび最終生成物のチロシン１モル
当たり少なくとも４モルのアラニンの分子比を有する。ＹＡＫについてのモル比
の好ましい態様の一つは、３．７：４．８：１．０の割合のリシン：アラニン：
チロシンである。ＹＡＫについてのモル比の別の好ましい態様は、３．１：４．
３：１．０の割合のリシン：アラニン：チロシンである。ＹＥＫについてのモル
比の好ましい態様の一つは、３．７：１．５：１．０の割合のリシン：グルタミ
ン酸：チロシンである。ＹＥＫについてのモル比の別の好ましい態様は、３．０
：１．０：１．０の割合のリシン：グルタミン酸：チロシンである。３アミノ酸
ヘテロポリマーの他の例としては、グルタミン酸、アラニン、およびリシンのヘ
テロポリマーであるポリ（Ｅ、Ａ、Ｋ）（ここではＥＡＫと示される）、および
上述のＹＥＡが挙げられ、各々についての好ましいモル比の態様は表１に示され
ている。
ことができるモル比で重合され、例えば、ＹＡＫにおいては、最終生成物のチロ
シン１モル当たり少なくとも３モルのリシンおよび最終生成物のチロシン１モル
当たり少なくとも４モルのアラニンの分子比を有する。ＹＡＫについてのモル比
の好ましい態様の一つは、３．７：４．８：１．０の割合のリシン：アラニン：
チロシンである。ＹＡＫについてのモル比の別の好ましい態様は、３．１：４．
３：１．０の割合のリシン：アラニン：チロシンである。ＹＥＫについてのモル
比の好ましい態様の一つは、３．７：１．５：１．０の割合のリシン：グルタミ
ン酸：チロシンである。ＹＥＫについてのモル比の別の好ましい態様は、３．０
：１．０：１．０の割合のリシン：グルタミン酸：チロシンである。３アミノ酸
ヘテロポリマーの他の例としては、グルタミン酸、アラニン、およびリシンのヘ
テロポリマーであるポリ（Ｅ、Ａ、Ｋ）（ここではＥＡＫと示される）、および
上述のＹＥＡが挙げられ、各々についての好ましいモル比の態様は表１に示され
ている。
【００３３】
合成手順は、各々の適切に誘導されたアミノ酸前駆体（Ｌ−リシンのεアミノ
基のような一定の官能基を保護するために誘導されたもの、例えば前駆体ε，Ｎ
−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン）の適切なモル比の、活性化形態の選択さ
れたアミノ酸（例えばＮ−カルボキシ無水物として活性化されたもの）の混合物
である溶液を用意する工程を含むことができる。あるいは、合成手順は、好まし
いモル比の選択されたアミノ酸の誘導された前駆体の合成手順中のオンライン混
合を含むことができる。ヘテロポリマー合成サービスは、例えばＨａｒｖａｒｄ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡで、そしてＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ，
Ｉｎｃ．， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹで、商業的に得ることができる。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ １９９８−１９９９製品カタログを参照
されたい。これは、参照により本明細書に援用される。
基のような一定の官能基を保護するために誘導されたもの、例えば前駆体ε，Ｎ
−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン）の適切なモル比の、活性化形態の選択さ
れたアミノ酸（例えばＮ−カルボキシ無水物として活性化されたもの）の混合物
である溶液を用意する工程を含むことができる。あるいは、合成手順は、好まし
いモル比の選択されたアミノ酸の誘導された前駆体の合成手順中のオンライン混
合を含むことができる。ヘテロポリマー合成サービスは、例えばＨａｒｖａｒｄ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡで、そしてＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ，
Ｉｎｃ．， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹで、商業的に得ることができる。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ １９９８−１９９９製品カタログを参照
されたい。これは、参照により本明細書に援用される。
【００３４】
本発明の一態様は、ヘテロポリマーを、ＭＨＣクラスII分子への抗原性ペプチ
ドの結合を阻害するその能力によって同定する工程を含む、治療性ヘテロポリマ
ーの使用方法である。この態様においては、ＭＨＣクラスII分子は、ヒト集団に
おいて自己免疫疾患、例えばＲＡを有する個体と関連するＨＬＡ−ＤＲ１または
ＨＬＡ−ＤＲ４対立遺伝子によってコードされ、抗原性ペプチドは、例えばコラ
ーゲンII（ＣII）由来エピトープ、例えばＣII ２６１−２７３のような感作性
タンパクのタンパク配列から得られる免疫優性ペプチドである。
ドの結合を阻害するその能力によって同定する工程を含む、治療性ヘテロポリマ
ーの使用方法である。この態様においては、ＭＨＣクラスII分子は、ヒト集団に
おいて自己免疫疾患、例えばＲＡを有する個体と関連するＨＬＡ−ＤＲ１または
ＨＬＡ−ＤＲ４対立遺伝子によってコードされ、抗原性ペプチドは、例えばコラ
ーゲンII（ＣII）由来エピトープ、例えばＣII ２６１−２７３のような感作性
タンパクのタンパク配列から得られる免疫優性ペプチドである。
【００３５】
ヘテロポリマー組成物は、例えば、選択されたアミノ酸の適切な誘導体を用い
る無水物化学を用いて、溶液中で合成することができる。別の好ましい態様にお
いては、本発明のヘテロポリマー組成物は、官能化された樹脂支持体を有するビ
ーズを用いる固相系において合成することができる。ある好ましい態様において
は、ヘテロポリマーは、アミノ酸ヘテロポリマー合成の当業者には公知の技術を
用いて、固相化学により合成される。このような合成は、例えば、モデル９０卓
上合成機（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，
ＫＹ）またはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
， ＣＡ）から入手可能な同等の合成機を用いて、達成することができる。
る無水物化学を用いて、溶液中で合成することができる。別の好ましい態様にお
いては、本発明のヘテロポリマー組成物は、官能化された樹脂支持体を有するビ
ーズを用いる固相系において合成することができる。ある好ましい態様において
は、ヘテロポリマーは、アミノ酸ヘテロポリマー合成の当業者には公知の技術を
用いて、固相化学により合成される。このような合成は、例えば、モデル９０卓
上合成機（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，
ＫＹ）またはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
， ＣＡ）から入手可能な同等の合成機を用いて、達成することができる。
【００３６】
ペプチド合成のためのこのような樹脂支持体の例としては、メリフィールド樹
脂、１％ＤＶＢ架橋を有するクロロメチル化ポリスチレン；ｆ−ｍｏｃアミノ酸
Ｗａｎｇ樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール、が挙げられ、これらの
樹脂にはアミノ酸がプレロードされている（例えばｆ−ｍｏｃ−Ｄ−ｔｒｐ（ｂ
ｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂）。樹脂は、異なるメッシュサイズ、例えば１００〜２０
０メッシュで、そして開始アミノ酸の官能化の高ローディングまたは低ローディ
ング密度で入手可能である。
脂、１％ＤＶＢ架橋を有するクロロメチル化ポリスチレン；ｆ−ｍｏｃアミノ酸
Ｗａｎｇ樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール、が挙げられ、これらの
樹脂にはアミノ酸がプレロードされている（例えばｆ−ｍｏｃ−Ｄ−ｔｒｐ（ｂ
ｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂）。樹脂は、異なるメッシュサイズ、例えば１００〜２０
０メッシュで、そして開始アミノ酸の官能化の高ローディングまたは低ローディ
ング密度で入手可能である。
【００３７】
本発明の組成物に重合されるべき異なる誘導アミノ酸の溶液（好ましくはペプ
チド合成において慣例的なように保護されている）は、ビーズの試料、例えばｆ
−ｍｏｃに添加される。合成、脱保護、および完成したヘテロポリマー分子の樹
脂からの除去のための切断のための試薬は、装置の製造者から入手可能である（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ペプチド合成機、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ，ＣＡまたはＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌ
ｅ，ＫＹ）；例えばＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第二版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
、１９９１年を参照されたい。その内容は、参照により本明細書に援用される。
付加的なアミノ酸またはアミノ酸の誘導体もしくはアナログを、ヘテロポリマー
を構成するよう選択された少なくとも３つのアミノ酸に付加して、それらのアミ
ノ酸の小部分を置換するか、例えば増大したプロテアーゼ耐性を有しそれゆえイ
ンビボでのより長い寿命のような強化された薬理的特性を有するヘテロポリマー
を提供することができる。アナログの例としては、ホモチロシンまたは他の置換
されたチロシン誘導体、およびアミノ酪酸があり、各々、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃ
ｈｅｍＴｅｃｈからｆ−ｍｏｃ誘導体として入手可能である。
チド合成において慣例的なように保護されている）は、ビーズの試料、例えばｆ
−ｍｏｃに添加される。合成、脱保護、および完成したヘテロポリマー分子の樹
脂からの除去のための切断のための試薬は、装置の製造者から入手可能である（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ペプチド合成機、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ，ＣＡまたはＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌ
ｅ，ＫＹ）；例えばＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第二版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
、１９９１年を参照されたい。その内容は、参照により本明細書に援用される。
付加的なアミノ酸またはアミノ酸の誘導体もしくはアナログを、ヘテロポリマー
を構成するよう選択された少なくとも３つのアミノ酸に付加して、それらのアミ
ノ酸の小部分を置換するか、例えば増大したプロテアーゼ耐性を有しそれゆえイ
ンビボでのより長い寿命のような強化された薬理的特性を有するヘテロポリマー
を提供することができる。アナログの例としては、ホモチロシンまたは他の置換
されたチロシン誘導体、およびアミノ酪酸があり、各々、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃ
ｈｅｍＴｅｃｈからｆ−ｍｏｃ誘導体として入手可能である。
【００３８】
本発明の方法における治療組成物
本発明の方法は、個体への投与に適する医薬組成物へのヘテロポリマーの取り
込みを含む。ある好ましい態様において、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担
体中に、アミノ酸ヘテロポリマー、例えばチロシン、アラニンおよびリシンのヘ
テロポリマーであるＹＡＫを含む。別の好ましい態様においては、医薬組成物は
、医薬的に許容可能な担体中に、アミノ酸ヘテロポリマー、例えばチロシン、ア
ラニンおよびリシンのヘテロポリマーであるＹＡＫを、別の治療剤との組み合わ
せで含む。別の好ましい態様においては、医薬組成物は、定義された配列のオリ
ゴペプチド、例えば、アミノ酸配列グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）
を含む長さ９〜２０残基のペプチドを含む。
込みを含む。ある好ましい態様において、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担
体中に、アミノ酸ヘテロポリマー、例えばチロシン、アラニンおよびリシンのヘ
テロポリマーであるＹＡＫを含む。別の好ましい態様においては、医薬組成物は
、医薬的に許容可能な担体中に、アミノ酸ヘテロポリマー、例えばチロシン、ア
ラニンおよびリシンのヘテロポリマーであるＹＡＫを、別の治療剤との組み合わ
せで含む。別の好ましい態様においては、医薬組成物は、定義された配列のオリ
ゴペプチド、例えば、アミノ酸配列グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）
を含む長さ９〜２０残基のペプチドを含む。
【００３９】
本発明の組成物は、当業者にはわかるであろう当業界で公知の種々の他の方法
によって投与することができる。活性化合物は、移植物（インプラント）、経皮
パッチ、微小カプセルデリバリー系を含む制御放出製剤のような、それを急速な
放出から保護するであろう担体を用いて調製することができる。このような製剤
の調製のための多くの方法は特許されており、当業者に一般に公知である。例え
ば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．，ＮＹ、１９７８年を参照された
い。医薬的に許容可能な担体中のデリバリーのための治療組成物は、無菌的であ
り、好ましくは製造および貯蔵の条件下で安定である。組成物は、溶液、微小乳
剤、リポソーム、または高薬剤濃度に適するその他の規則正しい構造として処方
することができる。
によって投与することができる。活性化合物は、移植物（インプラント）、経皮
パッチ、微小カプセルデリバリー系を含む制御放出製剤のような、それを急速な
放出から保護するであろう担体を用いて調製することができる。このような製剤
の調製のための多くの方法は特許されており、当業者に一般に公知である。例え
ば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．，ＮＹ、１９７８年を参照された
い。医薬的に許容可能な担体中のデリバリーのための治療組成物は、無菌的であ
り、好ましくは製造および貯蔵の条件下で安定である。組成物は、溶液、微小乳
剤、リポソーム、または高薬剤濃度に適するその他の規則正しい構造として処方
することができる。
【００４０】
投薬養生法は、最適な望ましい応答（例えば治療応答）を提供するように調整
することができる。例えば、単一の巨丸剤を投与することができ、いくつかに分
割した用量を経時的に投与することができ、あるいは用量を疾患状況の緊急性に
よって示されるように比例して低減または増大させることができる。
することができる。例えば、単一の巨丸剤を投与することができ、いくつかに分
割した用量を経時的に投与することができ、あるいは用量を疾患状況の緊急性に
よって示されるように比例して低減または増大させることができる。
【００４１】
一般に、本発明の好ましい態様は、治療効果（例えば症状の軽減）を生じる最
低有効用量であろう治療性ヘテロポリマー組成物の、好適な一日用量を投与する
ことである。本発明の治療性ヘテロポリマー化合物は、好ましくは、適切な最少
出発用量として１個体当たり１日当たり少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、
少なくとも１０ｍｇ、または少なくとも２０ｍｇの用量で投与される。一般に、
本発明の組成物の有効用量の化合物は、１日当たり個体１ｋｇ当たり５０〜４０
０μｇの化合物の範囲で投与することができる。
低有効用量であろう治療性ヘテロポリマー組成物の、好適な一日用量を投与する
ことである。本発明の治療性ヘテロポリマー化合物は、好ましくは、適切な最少
出発用量として１個体当たり１日当たり少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、
少なくとも１０ｍｇ、または少なくとも２０ｍｇの用量で投与される。一般に、
本発明の組成物の有効用量の化合物は、１日当たり個体１ｋｇ当たり５０〜４０
０μｇの化合物の範囲で投与することができる。
【００４２】
業界の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効用量
を容易に決定し処方することができる。例えば、医師または獣医師は、望ましい
治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物中に使用
される本発明の化合物の用量を開始し、望ましい効果が達成されるまで時間と共
に用量を増大させることができる。
を容易に決定し処方することができる。例えば、医師または獣医師は、望ましい
治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物中に使用
される本発明の化合物の用量を開始し、望ましい効果が達成されるまで時間と共
に用量を増大させることができる。
【００４３】
別の好ましい態様においては、医薬組成物は、付加的な治療剤をも含む。した
がって、本発明の方法において、医薬組成物は、組み合わせ療法の一部として、
すなわち付加的な１または複数の治療剤と組み合わせて、投与することができる
。付加的な治療剤として自己免疫疾患および関節炎の状態の治療のためにヘテロ
ポリマーと共に組み合わせ治療剤として用いることができる物質の例としては、
以下のものが挙げられる：インターロイキン−６、インターロイキン−８、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子−αのような炎症性分
子または望ましくないサイトカインに特異的に結合することができる抗体または
抗体フラグメント；α１−アンチトリプシンまたはアプロチニンのようなタンパ
クであることができる酵素阻害剤；シクロオキシゲナーゼ阻害剤であることがで
きる酵素阻害剤；工学処理（改変）された結合タンパク、例えば工学処理された
カリクレイン阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤である工学処理されたタンパク
；抗菌剤、これはアモキシリン、リファンピシン、エリスロマイシンのような抗
生物質であることができる；抗ウイルス剤、これはアシクロビルのように、低分
子量化学物質であることができる；ステロイド、例えばコルチコステロイド、ま
たはプロゲステロンのような性ステロイド；アスピリン、イブプロフェン、また
はアセトアミノフェンのような非ステロイド性抗炎症剤；メトトレキセートまた
はアドリアマイシンのような抗ガン剤；またはサイトカイン。付加的な治療剤は
、サイトカインであることができ、それは、本明細書で用いる場合、制限なしに
、天然のタンパクまたは変異体であって、成長因子、リンフォカイン、インター
フェロン、腫瘍壊死因子、脈管形成性因子または抗脈管形成性因子、エリスロポ
エチン、トロンボポエチン、インターロイキン、成熟因子、走化性タンパク等と
して機能する薬剤を含む。本発明の組成物とともに使用されるべき好ましい組み
合わせ治療剤であってサイトカインであるものとしては、インターロイキン−４
およびインターロイキン−１０が挙げられる。本発明の組成物とともに使用され
るべき治療剤は、遺伝子融合によってビリオンコートタンパクに共有結合により
付着したタンパクをリモデリングする技術の当業者に公知の、工学処理された結
合タンパクであることができ（Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．ら、米国特許第５，２３３
，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．ら、米国特許第５，４０３，４８４号）、当
業界で公知の方法によって作製することができる。他の種々の標的のいずれかに
結合するタンパクは、工学処理することができ、本発明のヘテロポリマーとの組
み合わせで本発明において治療剤として用いることができる。
がって、本発明の方法において、医薬組成物は、組み合わせ療法の一部として、
すなわち付加的な１または複数の治療剤と組み合わせて、投与することができる
。付加的な治療剤として自己免疫疾患および関節炎の状態の治療のためにヘテロ
ポリマーと共に組み合わせ治療剤として用いることができる物質の例としては、
以下のものが挙げられる：インターロイキン−６、インターロイキン−８、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子−αのような炎症性分
子または望ましくないサイトカインに特異的に結合することができる抗体または
抗体フラグメント；α１−アンチトリプシンまたはアプロチニンのようなタンパ
クであることができる酵素阻害剤；シクロオキシゲナーゼ阻害剤であることがで
きる酵素阻害剤；工学処理（改変）された結合タンパク、例えば工学処理された
カリクレイン阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤である工学処理されたタンパク
；抗菌剤、これはアモキシリン、リファンピシン、エリスロマイシンのような抗
生物質であることができる；抗ウイルス剤、これはアシクロビルのように、低分
子量化学物質であることができる；ステロイド、例えばコルチコステロイド、ま
たはプロゲステロンのような性ステロイド；アスピリン、イブプロフェン、また
はアセトアミノフェンのような非ステロイド性抗炎症剤；メトトレキセートまた
はアドリアマイシンのような抗ガン剤；またはサイトカイン。付加的な治療剤は
、サイトカインであることができ、それは、本明細書で用いる場合、制限なしに
、天然のタンパクまたは変異体であって、成長因子、リンフォカイン、インター
フェロン、腫瘍壊死因子、脈管形成性因子または抗脈管形成性因子、エリスロポ
エチン、トロンボポエチン、インターロイキン、成熟因子、走化性タンパク等と
して機能する薬剤を含む。本発明の組成物とともに使用されるべき好ましい組み
合わせ治療剤であってサイトカインであるものとしては、インターロイキン−４
およびインターロイキン−１０が挙げられる。本発明の組成物とともに使用され
るべき治療剤は、遺伝子融合によってビリオンコートタンパクに共有結合により
付着したタンパクをリモデリングする技術の当業者に公知の、工学処理された結
合タンパクであることができ（Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．ら、米国特許第５，２３３
，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．ら、米国特許第５，４０３，４８４号）、当
業界で公知の方法によって作製することができる。他の種々の標的のいずれかに
結合するタンパクは、工学処理することができ、本発明のヘテロポリマーとの組
み合わせで本発明において治療剤として用いることができる。
【００４４】
このような投与の結果としての症状の改善は、１または複数の関節の浮腫の軽
減によって、１または２以上の関節における炎症の軽減によって、または１また
は２以上の関節の運動性の増大によって、注目される。治療的に有効な用量は、
非処理個体と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０
％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、そしてさらにより好ましくは少
なくとも約８０％、浮腫および関節の炎症を軽減し、運動性を改善することが好
ましい。
減によって、１または２以上の関節における炎症の軽減によって、または１また
は２以上の関節の運動性の増大によって、注目される。治療的に有効な用量は、
非処理個体と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０
％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、そしてさらにより好ましくは少
なくとも約８０％、浮腫および関節の炎症を軽減し、運動性を改善することが好
ましい。
【００４５】
本発明の治療性化合物は、自己免疫疾患の症状、すなわち、橋本甲状腺炎；特
発性粘液水腫、すなわち重篤な甲状腺機能低下の一種；多発性硬化症、すなわち
脳または脊髄の硬化した組織またはパッチを特徴とする脱髄性疾患；神経筋ジャ
ンクションでのアセチルコリンレセプターに対する自己免疫性攻撃により引き起
こされる進行性の筋の弱化を有する疾患である重症筋無力症；ギャン−バレー症
候群、すなわち多発性神経炎の一種；全身性エリテマトーデス；ブドウ膜炎；自
己免疫性卵巣炎；慢性免疫性血小板減少性紫斑病；大腸炎；糖尿病；グレーブズ
病、すなわち甲状腺機能低下の一形態；乾癬；尋常性天疱瘡；およびリューマチ
性関節炎（ＲＡ）を含む不全のクラスを治療するために用いることができる。
発性粘液水腫、すなわち重篤な甲状腺機能低下の一種；多発性硬化症、すなわち
脳または脊髄の硬化した組織またはパッチを特徴とする脱髄性疾患；神経筋ジャ
ンクションでのアセチルコリンレセプターに対する自己免疫性攻撃により引き起
こされる進行性の筋の弱化を有する疾患である重症筋無力症；ギャン−バレー症
候群、すなわち多発性神経炎の一種；全身性エリテマトーデス；ブドウ膜炎；自
己免疫性卵巣炎；慢性免疫性血小板減少性紫斑病；大腸炎；糖尿病；グレーブズ
病、すなわち甲状腺機能低下の一形態；乾癬；尋常性天疱瘡；およびリューマチ
性関節炎（ＲＡ）を含む不全のクラスを治療するために用いることができる。
【００４６】
本発明の別の態様は、ＭＣＨタンパクに対する分析対象物の結合をアッセイす
るためのキットである。この態様は、非哺乳類細胞において組換えにより産生さ
れた水溶性ＭＨＣタンパク；分析対象物およびＭＨＣタンパクを含有するための
反応チャンバー；およびＭＨＣタンパクに対する分析対象物の結合を検出するた
めの手段を提供する。好ましい態様においては、ＭＨＣタンパクは、昆虫細胞ま
たは酵母細胞のような無脊椎動物または微生物細胞において産生され、したがっ
て抗原分割部分に結合したペプチドがない、すなわち、そのＭＨＣタンパクは「
空っぽ（エンプティ）」である。ＭＨＣタンパクに対する分析対象物の結合を検
出するための手段は、当業者に公知の、放射性、蛍光計測性、化学発光性、また
は比色分析性手段であることができる。キットの好ましい態様においては、ＭＨ
Ｃタンパクは、クラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４タンパ
クである。さらに、キットは、ＣIIペプチドのような自己免疫性ペプチド、また
はミエリン塩基性タンパク由来のペプチド、ミエリンオリゴデンドライト（ｏｌ
ｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｅ）タンパク、または自己免疫疾患に関係のある他の何ら
かのタンパク由来のペプチドをも含むことができる。
るためのキットである。この態様は、非哺乳類細胞において組換えにより産生さ
れた水溶性ＭＨＣタンパク；分析対象物およびＭＨＣタンパクを含有するための
反応チャンバー；およびＭＨＣタンパクに対する分析対象物の結合を検出するた
めの手段を提供する。好ましい態様においては、ＭＨＣタンパクは、昆虫細胞ま
たは酵母細胞のような無脊椎動物または微生物細胞において産生され、したがっ
て抗原分割部分に結合したペプチドがない、すなわち、そのＭＨＣタンパクは「
空っぽ（エンプティ）」である。ＭＨＣタンパクに対する分析対象物の結合を検
出するための手段は、当業者に公知の、放射性、蛍光計測性、化学発光性、また
は比色分析性手段であることができる。キットの好ましい態様においては、ＭＨ
Ｃタンパクは、クラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４タンパ
クである。さらに、キットは、ＣIIペプチドのような自己免疫性ペプチド、また
はミエリン塩基性タンパク由来のペプチド、ミエリンオリゴデンドライト（ｏｌ
ｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｅ）タンパク、または自己免疫疾患に関係のある他の何ら
かのタンパク由来のペプチドをも含むことができる。
【００４７】
以下の実施例１は、本発明において用いられる３アミノ酸ヘテロポリマーの各
々の調製方法を提供し、また、ＭＨＣクラスIIタンパクの精製方法をも提供する
。ヘテロポリマーの調製のための重合は、固相法を用いて行うことができ、また
は溶液中で行うことができる。表１は、重合に用いられたアミノ酸誘導体のモル
比（および得られた各アミノ酸置換基のモル％）、および平均分子量を含む３ア
ミノ酸ヘテロポリマーの例の化学特性を示す。
々の調製方法を提供し、また、ＭＨＣクラスIIタンパクの精製方法をも提供する
。ヘテロポリマーの調製のための重合は、固相法を用いて行うことができ、また
は溶液中で行うことができる。表１は、重合に用いられたアミノ酸誘導体のモル
比（および得られた各アミノ酸置換基のモル％）、および平均分子量を含む３ア
ミノ酸ヘテロポリマーの例の化学特性を示す。
【００４８】
実施例２は、ＭＨＣタンパクに対するヘテロポリマーおよびペプチドの結合、
結合の阻害の測定、および細胞−細胞抗原提示アッセイにおけるＴ細胞活性化応
答の阻害についてのアッセイ方法を含む。
結合の阻害の測定、および細胞−細胞抗原提示アッセイにおけるＴ細胞活性化応
答の阻害についてのアッセイ方法を含む。
【００４９】
実施例３は、３アミノ酸ヘテロポリマーとＹＥＡＫとの間と比較しての、ＣII
２６１−２７３エピトープペプチドによる組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−
ＤＲ４分子に対するランダム合成ヘテロポリマーの結合の阻害を示す。インフル
エンザウイルスのヘマグルチニンペプチドＨＡ３０６−３１８の結合についての
データも示されている。ビオチニル化されたヘテロポリマーは、各パネルの左上
の角に太字で示されており、競合物質は、図１Ａおよび１Ｂの各パネルにおける
記号について示されているとおりである。組換えクラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ１タンパクへの結合については、ＹＡＫ（図１Ａ、下パネル）は、ＣIIまたは
ＨＡより大きいビオチニル化ＹＡＫの結合の阻害を提供する。ＹＥＡＫは、ＣII
よりいくらか優れているが、ＨＡペプチドほど効果的ではなく（上パネル）、ビ
オチニル化ＹＥＫ結合の阻害については、ＹＥＫによる阻害は、天然ペプチドの
各々のそれよりも低い。図１Ｂに示されている組換えクラスII ＭＨＣ ＨＬＡ
−ＤＲ４タンパクに対する結合についての匹敵するデータは、ＹＡＫがここでも
天然ペプチドより優れた阻害剤であり；ＹＥＡＫがＣIIまたはＨＡより優れた阻
害剤ではないことを示す。
２６１−２７３エピトープペプチドによる組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−
ＤＲ４分子に対するランダム合成ヘテロポリマーの結合の阻害を示す。インフル
エンザウイルスのヘマグルチニンペプチドＨＡ３０６−３１８の結合についての
データも示されている。ビオチニル化されたヘテロポリマーは、各パネルの左上
の角に太字で示されており、競合物質は、図１Ａおよび１Ｂの各パネルにおける
記号について示されているとおりである。組換えクラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ１タンパクへの結合については、ＹＡＫ（図１Ａ、下パネル）は、ＣIIまたは
ＨＡより大きいビオチニル化ＹＡＫの結合の阻害を提供する。ＹＥＡＫは、ＣII
よりいくらか優れているが、ＨＡペプチドほど効果的ではなく（上パネル）、ビ
オチニル化ＹＥＫ結合の阻害については、ＹＥＫによる阻害は、天然ペプチドの
各々のそれよりも低い。図１Ｂに示されている組換えクラスII ＭＨＣ ＨＬＡ
−ＤＲ４タンパクに対する結合についての匹敵するデータは、ＹＡＫがここでも
天然ペプチドより優れた阻害剤であり；ＹＥＡＫがＣIIまたはＨＡより優れた阻
害剤ではないことを示す。
【００５０】
以前の知見は、ＥＡＥおよびＭＳにおけるＹＥＡＫ（Ｃｏｐ１）の活性がペプ
チド結合グルーブ内のクラスII ＭＨＣ分子への結合に関与し、ＭＳに関連し得
る自己免疫性Ｔ細胞応答の抑制をもたらすことを示唆していた（Ｔｅｉｔｅｌｂ
ａｕｍ， Ｄ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ、８５：９７２４； Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ， Ｄ．ら、１９９２年
、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：１３７；
Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ， Ｍ．ら、１９９８年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ
． １６０：４３８６、これらの内容は、参照により本明細書に援用される）。
本発明においては、精製ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子に対するＹＡＫお
よびＹＥＫの各々の結合は、ＹＥＡＫのそれよりも強いことが示された。さらに
、ＲＡにおける自己抗原の候補であるII型コラーゲンの決定基ＣII２６１−２７
３のＲＡ関連ＭＨＣ−ＤＲ１（ＤＲＢ＊０１０１）およびＤＲ４（ＤＲＢ１＊０
４０１）への結合は、ここではＹＡＫ、ＹＥＫおよびＹＥＡＫの各々によって阻
害された。３アミノ酸ヘテロポリマー、特にリシン、アラニンおよびチロシン（
ＹＡＫ）を有するものおよびリシン、グルタミン酸およびチロシン（ＹＥＫ）を
有するものは、精製ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子に高親和性で結合し、
結合についてＣIIペプチドと効率的に競合した。実施例３は、３アミノ酸ヘテロ
ポリマー、特にＹＡＫおよびＹＥＫが、ＹＥＡＫよりも有意に強力なＭＨＣ分子
の阻害剤であったことを示す。
チド結合グルーブ内のクラスII ＭＨＣ分子への結合に関与し、ＭＳに関連し得
る自己免疫性Ｔ細胞応答の抑制をもたらすことを示唆していた（Ｔｅｉｔｅｌｂ
ａｕｍ， Ｄ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ、８５：９７２４； Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ， Ｄ．ら、１９９２年
、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：１３７；
Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ， Ｍ．ら、１９９８年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ
． １６０：４３８６、これらの内容は、参照により本明細書に援用される）。
本発明においては、精製ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子に対するＹＡＫお
よびＹＥＫの各々の結合は、ＹＥＡＫのそれよりも強いことが示された。さらに
、ＲＡにおける自己抗原の候補であるII型コラーゲンの決定基ＣII２６１−２７
３のＲＡ関連ＭＨＣ−ＤＲ１（ＤＲＢ＊０１０１）およびＤＲ４（ＤＲＢ１＊０
４０１）への結合は、ここではＹＡＫ、ＹＥＫおよびＹＥＡＫの各々によって阻
害された。３アミノ酸ヘテロポリマー、特にリシン、アラニンおよびチロシン（
ＹＡＫ）を有するものおよびリシン、グルタミン酸およびチロシン（ＹＥＫ）を
有するものは、精製ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子に高親和性で結合し、
結合についてＣIIペプチドと効率的に競合した。実施例３は、３アミノ酸ヘテロ
ポリマー、特にＹＡＫおよびＹＥＫが、ＹＥＡＫよりも有意に強力なＭＨＣ分子
の阻害剤であったことを示す。
【００５１】
ここでアッセイにおいて使用された空っぽの組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ
４分子は、先に結合した内在性ペプチドによる干渉を受けない結合についてのデ
ータを生じた。これに対して、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合の
従来の分析については、１０〜２０％のレセプタータンパクのみしか外来性の供
給されたペプチドの結合のために利用可能でなく（例えばＨａｍｍｅｒ， Ｊ．
ら、１９９３年、Ｃｅｌｌ ７４：１９７−２０３を参照されたい）、本発明に
おいてはそれらの報告と異なり、それらと比較してより正確なヘテロポリマーに
対する結合親和性の決定が得られた。
４分子は、先に結合した内在性ペプチドによる干渉を受けない結合についてのデ
ータを生じた。これに対して、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合の
従来の分析については、１０〜２０％のレセプタータンパクのみしか外来性の供
給されたペプチドの結合のために利用可能でなく（例えばＨａｍｍｅｒ， Ｊ．
ら、１９９３年、Ｃｅｌｌ ７４：１９７−２０３を参照されたい）、本発明に
おいてはそれらの報告と異なり、それらと比較してより正確なヘテロポリマーに
対する結合親和性の決定が得られた。
【００５２】
実施例４のデータ（図２および図３Ａ、３Ｂ）は、ＹＥＡＫと比較して、３ア
ミノ酸ランダムヘテロポリマーによる、ＣII抗原の提示に対するＤＲ１およびＤ
Ｒ４制限ＣII特異的Ｔ細胞応答のより大きい阻害を明らかにする。このＩＬ−２
産生を測定するインビボＴ細胞応答においては、ＹＡＫが大きい阻害を提供する
。したがって、３アミノ酸ランダム合成ヘテロポリマーならびに４アミノ酸ラン
ダム合成ヘテロポリマーによるインビボＣII特異的Ｔ細胞応答の阻害の直接の証
拠が、ここで始めて提供される。この直接の証拠は、２つのアッセイ、すなわち
ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合についての他の化合物とのイ
ンビトロ競合、および実施例４に示されているＤＲ１およびＤＲ４制限Ｔ細胞ハ
イブリドーマによるＩＬ−２産生のインビボ阻害におけるヘテロポリマーの存在
の効果からの基準に基づいている。
ミノ酸ランダムヘテロポリマーによる、ＣII抗原の提示に対するＤＲ１およびＤ
Ｒ４制限ＣII特異的Ｔ細胞応答のより大きい阻害を明らかにする。このＩＬ−２
産生を測定するインビボＴ細胞応答においては、ＹＡＫが大きい阻害を提供する
。したがって、３アミノ酸ランダム合成ヘテロポリマーならびに４アミノ酸ラン
ダム合成ヘテロポリマーによるインビボＣII特異的Ｔ細胞応答の阻害の直接の証
拠が、ここで始めて提供される。この直接の証拠は、２つのアッセイ、すなわち
ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合についての他の化合物とのイ
ンビトロ競合、および実施例４に示されているＤＲ１およびＤＲ４制限Ｔ細胞ハ
イブリドーマによるＩＬ−２産生のインビボ阻害におけるヘテロポリマーの存在
の効果からの基準に基づいている。
【００５３】
ＹＥＡＫは、精製ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）およびリュ
ーマチ性関節炎（ＲＡ）関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）またはＨＬ
Ａ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子に、高親和性でペプチド特異的な方式で
結合する。ＹＥＡＫはランダムポリペプチドの混合物であるため、異なるＨＬＡ
タンパクに結合する異なる配列を含み得る；この場合、全体の混合物のうちの一
部分のみが「活性成分」となろう。あるいは、全体の混合物が能力がある、すな
わちすべてのポリペプチドが任意のＨＬＡ−ＤＲ分子に結合する可能性もある。
実施例５は、内在性ヒトペプチドからの干渉を最小限にするように産生された「
空っぽ」の組換えＨＬＡ−ＤＲ１、ＤＲ２およびＤＲ４分子に結合するＹＥＡＫ
の画分を単離・精製する方法を示す。実施例６は、ＨＬＡ−ＤＲタンパク分子に
結合したＹＥＡＫ分子の画分におけるアミノ酸残基の分布を示す。ＭＨＣクラス
IIタンパクグルーブに結合するヘテロポリマーの画分のアミノ酸組成、ＨＰＬＣ
プロフィールおよびプール配列、および免疫学的認識を決定した。
ーマチ性関節炎（ＲＡ）関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）またはＨＬ
Ａ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子に、高親和性でペプチド特異的な方式で
結合する。ＹＥＡＫはランダムポリペプチドの混合物であるため、異なるＨＬＡ
タンパクに結合する異なる配列を含み得る；この場合、全体の混合物のうちの一
部分のみが「活性成分」となろう。あるいは、全体の混合物が能力がある、すな
わちすべてのポリペプチドが任意のＨＬＡ−ＤＲ分子に結合する可能性もある。
実施例５は、内在性ヒトペプチドからの干渉を最小限にするように産生された「
空っぽ」の組換えＨＬＡ−ＤＲ１、ＤＲ２およびＤＲ４分子に結合するＹＥＡＫ
の画分を単離・精製する方法を示す。実施例６は、ＨＬＡ−ＤＲタンパク分子に
結合したＹＥＡＫ分子の画分におけるアミノ酸残基の分布を示す。ＭＨＣクラス
IIタンパクグルーブに結合するヘテロポリマーの画分のアミノ酸組成、ＨＰＬＣ
プロフィールおよびプール配列、および免疫学的認識を決定した。
【００５４】
用いたＹＥＡＫポリペプチドの平均長は７５〜８０アミノ酸であったので、Ｈ
ＬＡ−ＤＲ分子のグルーブ中に横たわる「エピトープ」に匹敵するアミノ酸配列
は、ポリペプチド鎖内に内部的に見出される可能性が高かった。複合体から突出
するポリマーの連続アミノ末端の存在は、結合したＹＥＡＫ画分に直接適用され
る配列分析の微小化学法により得られるべき結合モチーフの配列を曖昧にし得る
。この考慮のため、ＹＥＡＫポリペプチドの突出末端の実施例７におけるアミノ
末端アミノペプチダーゼ処理を用いて、内部領域にアクセスし、結合モチーフ配
列を得た。アミノペプチダーゼは、クラスII ＭＨＣタンパクから突出するペプ
チドのアミノ末端をトリミングするので、このタンパクのグルーブに結合するエ
ピトープは、アミノペプチダーゼタンパク分解から保護されることができる。
ＬＡ−ＤＲ分子のグルーブ中に横たわる「エピトープ」に匹敵するアミノ酸配列
は、ポリペプチド鎖内に内部的に見出される可能性が高かった。複合体から突出
するポリマーの連続アミノ末端の存在は、結合したＹＥＡＫ画分に直接適用され
る配列分析の微小化学法により得られるべき結合モチーフの配列を曖昧にし得る
。この考慮のため、ＹＥＡＫポリペプチドの突出末端の実施例７におけるアミノ
末端アミノペプチダーゼ処理を用いて、内部領域にアクセスし、結合モチーフ配
列を得た。アミノペプチダーゼは、クラスII ＭＨＣタンパクから突出するペプ
チドのアミノ末端をトリミングするので、このタンパクのグルーブに結合するエ
ピトープは、アミノペプチダーゼタンパク分解から保護されることができる。
【００５５】
実施例８においては、実施例７において見出された結合モチーフ配列から得ら
れたＭＨＣクラスII ＤＲ−１およびＤＲ−４結合モチーフの配列に似せるため
に種々の１５マーアミノ酸ペプチドが合成された。これらのペプチドは実施例９
において試験され、それらがＹＥＡＫに対する、およびII型コラーゲン（ＣII）
の免疫優性エピトープ２６１−２７３（リューマチ性関節炎（ＲＡ）の自己抗原
の候補である）に対する、疾患関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）また
はＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）タンパク分子の結合を差別的に阻害す
るかどうかが決定された。実施例１０におけるペプチド配列は、さらに試験され
て、インビボで細胞培養物中でＣIIエピトープ２６１−２７３へのＨＬＡ−ＤＲ
１およびＤＲ４制限Ｔ細胞クローンの応答を有意に阻害する能力を有するものが
得られた。実施例９および１０における、ある種のペプチドは高い特異性および
親和性で結合し、Ｔ細胞活性化を阻害するという知見は、ＲＡおよびＭＳのよう
な自己免疫疾患の治療における治療剤としてのある種の１５マーアミノ酸ペプチ
ド化合物の利用性を示す。
れたＭＨＣクラスII ＤＲ−１およびＤＲ−４結合モチーフの配列に似せるため
に種々の１５マーアミノ酸ペプチドが合成された。これらのペプチドは実施例９
において試験され、それらがＹＥＡＫに対する、およびII型コラーゲン（ＣII）
の免疫優性エピトープ２６１−２７３（リューマチ性関節炎（ＲＡ）の自己抗原
の候補である）に対する、疾患関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）また
はＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）タンパク分子の結合を差別的に阻害す
るかどうかが決定された。実施例１０におけるペプチド配列は、さらに試験され
て、インビボで細胞培養物中でＣIIエピトープ２６１−２７３へのＨＬＡ−ＤＲ
１およびＤＲ４制限Ｔ細胞クローンの応答を有意に阻害する能力を有するものが
得られた。実施例９および１０における、ある種のペプチドは高い特異性および
親和性で結合し、Ｔ細胞活性化を阻害するという知見は、ＲＡおよびＭＳのよう
な自己免疫疾患の治療における治療剤としてのある種の１５マーアミノ酸ペプチ
ド化合物の利用性を示す。
【００５６】
ランダム合成ヘテロポリマーの使用方法は、インビボで自己抗原に対する後続
するＴ細胞応答が阻害されるようにこれらのタンパクレセプター分子への結合に
ついて候補の自己抗原と競合させることにより、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子産物と関連
する他の自己免疫性疾患を治療する基礎となり得る。さらに、重合反応中に種々
の量で添加されるアミノ酸アナログまたは誘導体のような１または２以上の付加
的な成分を有する合成ヘテロポリマーは、種々の自己免疫性Ｔ細胞応答の効果的
な阻害剤となることができる。
するＴ細胞応答が阻害されるようにこれらのタンパクレセプター分子への結合に
ついて候補の自己抗原と競合させることにより、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子産物と関連
する他の自己免疫性疾患を治療する基礎となり得る。さらに、重合反応中に種々
の量で添加されるアミノ酸アナログまたは誘導体のような１または２以上の付加
的な成分を有する合成ヘテロポリマーは、種々の自己免疫性Ｔ細胞応答の効果的
な阻害剤となることができる。
【００５７】
【実施例】実施例１
ヘテロポリマーおよびタンパク試薬を調製する方法
ヘテロポリマーおよびペプチドの合成
ヘテロポリマーＹＥＡＫ（Ｃｏｐ１）を、Ｌ−アラニン、γ−ベンジル−Ｌ−
グルタメート、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンおよびＬ−チロシン
のＮ−カルボキシ無水物の重合により、記載されているように製造した（Ｔｅｉ
ｔｅｌｂａｕｍ，Ｄ．ら、１９７１年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２４
２）。最終生成物は、ランダムポリペプチドの酢酸塩の混合物である。ヘテロポ
リマーＥＡＫ、バッチＳＤ−１６８９、ＭＷ８，８５０；ＹＥＡ、バッチＳＤ−
１６９０、ＭＷ７，６００；ＹＡＫ、バッチＳＤ−１６９１、ＭＷ２０，０００
；およびＹＥＫ、バッチＳＤ−１６９７、ＭＷ１１，０５０もまた、Ｎ−カルボ
キシ無水物基質の重合により合成した（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ、Ｍ．ら
、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６、その内容を参照により
本明細書に援用する）。ヘテロポリマーは、固体状態技術によってもまた合成す
ることができる。配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）を有するイン
フルエンザヘマグルチニンＨＡペプチド３０６−３１８、および配列ＡＧＦＫＧ
ＥＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号２）を有するII型コラーゲン（ＣII）ペプチド２６
１−２７３の天然ペプチド配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にお
いて固相技術（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ら、１９７９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１頁）を使用して合成し、そして逆相ＨＰＬＣにより
精製した。これらの実施例を通して使用されるこれらおよびその他の方法につい
ては、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９５：１２５２８−１２５３１、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈ
ａｒｅｌｉら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４６９７−４７０４
、およびＦｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１１：６３５−６４１をも参照されたい。これらの内容を参照に
より本明細書に援用する。
グルタメート、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンおよびＬ−チロシン
のＮ−カルボキシ無水物の重合により、記載されているように製造した（Ｔｅｉ
ｔｅｌｂａｕｍ，Ｄ．ら、１９７１年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２４
２）。最終生成物は、ランダムポリペプチドの酢酸塩の混合物である。ヘテロポ
リマーＥＡＫ、バッチＳＤ−１６８９、ＭＷ８，８５０；ＹＥＡ、バッチＳＤ−
１６９０、ＭＷ７，６００；ＹＡＫ、バッチＳＤ−１６９１、ＭＷ２０，０００
；およびＹＥＫ、バッチＳＤ−１６９７、ＭＷ１１，０５０もまた、Ｎ−カルボ
キシ無水物基質の重合により合成した（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ、Ｍ．ら
、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６、その内容を参照により
本明細書に援用する）。ヘテロポリマーは、固体状態技術によってもまた合成す
ることができる。配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）を有するイン
フルエンザヘマグルチニンＨＡペプチド３０６−３１８、および配列ＡＧＦＫＧ
ＥＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号２）を有するII型コラーゲン（ＣII）ペプチド２６
１−２７３の天然ペプチド配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にお
いて固相技術（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ら、１９７９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１頁）を使用して合成し、そして逆相ＨＰＬＣにより
精製した。これらの実施例を通して使用されるこれらおよびその他の方法につい
ては、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９５：１２５２８−１２５３１、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈ
ａｒｅｌｉら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４６９７−４７０４
、およびＦｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１１：６３５−６４１をも参照されたい。これらの内容を参照に
より本明細書に援用する。
【００５８】
１文字および３文字のアミノ酸コード（および各々が表すアミノ酸）は、以下
のとおりである：Ａはａｌａ（アラニン）を意味し；Ｃはｃｙｓ（システイン）
を意味し；Ｄはａｓｐ（アスパラギン酸）を意味し；Ｅはｇｌｕ（グルタミン酸
）を意味し；Ｆはｐｈｅ（フェニルアラニン）を意味し；Ｇはｇｌｙ（グリシン
）を意味し；Ｈはｈｉｓ（ヒスチジン）を意味し；Ｉはｉｌｅ（イソロイシン）
を意味し；Ｋはｌｙｓ（リシン）を意味し；Ｌはｌｅｕ（ロイシン）を意味し；
Ｍはｍｅｔ（メチオニン）を意味し；Ｎはａｓｎ（アスパラギン）を意味し；Ｐ
はｐｒｏ（プロリン）を意味し；Ｑはｇｌｎ（グルタミン）を意味し；Ｒはａｒ
ｇ（アルギニン）を意味し；Ｓはｓｅｒ（セリン）を意味し；Ｔはｔｈｒ（トレ
オニン）を意味し；Ｖはｖａｌ（バリン）を意味し；Ｗはｔｒｐ（トリプトファ
ン）を意味し；そしてＹはｔｙｒ（チロシン）を意味する。
のとおりである：Ａはａｌａ（アラニン）を意味し；Ｃはｃｙｓ（システイン）
を意味し；Ｄはａｓｐ（アスパラギン酸）を意味し；Ｅはｇｌｕ（グルタミン酸
）を意味し；Ｆはｐｈｅ（フェニルアラニン）を意味し；Ｇはｇｌｙ（グリシン
）を意味し；Ｈはｈｉｓ（ヒスチジン）を意味し；Ｉはｉｌｅ（イソロイシン）
を意味し；Ｋはｌｙｓ（リシン）を意味し；Ｌはｌｅｕ（ロイシン）を意味し；
Ｍはｍｅｔ（メチオニン）を意味し；Ｎはａｓｎ（アスパラギン）を意味し；Ｐ
はｐｒｏ（プロリン）を意味し；Ｑはｇｌｎ（グルタミン）を意味し；Ｒはａｒ
ｇ（アルギニン）を意味し；Ｓはｓｅｒ（セリン）を意味し；Ｔはｔｈｒ（トレ
オニン）を意味し；Ｖはｖａｌ（バリン）を意味し；Ｗはｔｒｐ（トリプトファ
ン）を意味し；そしてＹはｔｙｒ（チロシン）を意味する。
【００５９】
タンパクの発現および精製
組換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子を、記載されているようにして（Ｓｔ
ｅｒｎ，Ｌ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６８：４６５；Ｄｅｓｓｅｎ，Ａ．ら
、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４７３）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細
胞で発現させた。細胞を、０〜５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＥｘ
ｃｅｌｌ ４０１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、２６℃でロ
ーラービン中で生育させた。細胞を、１ｍＭの最終濃度になるＣｕＳＯ４の添加
により誘導し、そして細胞をさらに４〜５日インキュベートした。組換えＨＬＡ
−ＤＲ１およびＤＲ４の免疫アフィニティー精製を、以前に報告されたように（
Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６８：４６５；Ｄｅｓｓｅｎ，Ａ
．ら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４７３）行った。収穫された細胞に
由来する上清を、プロティンＡ、プロティンＧ、およびプロティンＡ−ＬＢ３．
１カラムに連続的に通過させ、続いて、結合したＨＬＡ−ＤＲを５０ｍＭ ３−
シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、ｐＨ１１．５に
より溶出し、そして２００ｍＭリン酸（ｐＨ６．０）で中和した。溶出物を、Ｃ
ｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０ メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ）上で濃縮した。タンパ
ク濃度を、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）アツセイ
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）により決定した。
ｅｒｎ，Ｌ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６８：４６５；Ｄｅｓｓｅｎ，Ａ．ら
、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４７３）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細
胞で発現させた。細胞を、０〜５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＥｘ
ｃｅｌｌ ４０１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、２６℃でロ
ーラービン中で生育させた。細胞を、１ｍＭの最終濃度になるＣｕＳＯ４の添加
により誘導し、そして細胞をさらに４〜５日インキュベートした。組換えＨＬＡ
−ＤＲ１およびＤＲ４の免疫アフィニティー精製を、以前に報告されたように（
Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６８：４６５；Ｄｅｓｓｅｎ，Ａ
．ら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４７３）行った。収穫された細胞に
由来する上清を、プロティンＡ、プロティンＧ、およびプロティンＡ−ＬＢ３．
１カラムに連続的に通過させ、続いて、結合したＨＬＡ−ＤＲを５０ｍＭ ３−
シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、ｐＨ１１．５に
より溶出し、そして２００ｍＭリン酸（ｐＨ６．０）で中和した。溶出物を、Ｃ
ｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０ メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ）上で濃縮した。タンパ
ク濃度を、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）アツセイ
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）により決定した。
【００６０】
ペプチドの標識
ヘテロポリマーＹＥＡＫ、ＥＡＫ、ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＹＥＫ、およびＨＡ３０
６−３１８ペプチドのビオチニル化を、記載されているように（Ｆｒｉｄｋｉｓ
−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．ら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９１：４８７２）、ジメチルスルホキシド中、過剰のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。未反応のビオチンは透
析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ５
００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌａｇｕｎ
ａ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）。
６−３１８ペプチドのビオチニル化を、記載されているように（Ｆｒｉｄｋｉｓ
−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．ら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９１：４８７２）、ジメチルスルホキシド中、過剰のＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。未反応のビオチンは透
析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ５
００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌａｇｕｎ
ａ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）。
【００６１】実施例２
ＭＨＣクラスIIタンパク分子へのヘテロポリマーによる結合の阻害の
アッセイ法 クラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４タンパクへの結合の競合剤と
しての３アミノ酸ヘテロポリマーを評価するために２つの方法を使用した。第一
のアッセイでは、組換えにより製造された水溶性のタンパクを、ビオチニル化さ
れたヘテロポリマーおよび種々の量の非標識競合剤またはコラーゲンＣIIもしく
はインフルエンザウイルスＨＡペプチドとインキュベートした。第二のアッセイ
では、照射された抗原提示細胞を、ＣIIペプチドおよび阻害ヘテロポリマーとと
もにインキュベートし、そして次にＤＲ限定されたＴ細胞を添加し、そしてＩＬ
−２産生の測定により活性をアッセイした。これらのアッセイは以下のように行
った。
アッセイ法 クラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４タンパクへの結合の競合剤と
しての３アミノ酸ヘテロポリマーを評価するために２つの方法を使用した。第一
のアッセイでは、組換えにより製造された水溶性のタンパクを、ビオチニル化さ
れたヘテロポリマーおよび種々の量の非標識競合剤またはコラーゲンＣIIもしく
はインフルエンザウイルスＨＡペプチドとインキュベートした。第二のアッセイ
では、照射された抗原提示細胞を、ＣIIペプチドおよび阻害ヘテロポリマーとと
もにインキュベートし、そして次にＤＲ限定されたＴ細胞を添加し、そしてＩＬ
−２産生の測定により活性をアッセイした。これらのアッセイは以下のように行
った。
【００６２】
クラスII−ペプチド−結合アッセイ
このアッセイで使用する溶液は、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ、Ｍ．ら、１
９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６に記載されている。アッセイ
は、アフィニティー精製されたＬＢ３．１モノクローナル抗体、ＰＢＳ（１５０
ｍＭ塩化ナトリウム、７．５ｍＭ二塩基リン酸ナトリウム、２．５ｍＭ一塩基リ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中１．０μｇ／ウェル、１００μｌで被覆されて
いる９６ウェル微量滴定イムノアッセイ・プレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）
、Ｆａｌｃｏｎ）において、４℃で１８時間インキュベートすることにより行っ
た。次に、ウェルを３％ＢＳＡ（ウシ胎児血清）を含むＴＢＳ（１３７ｍＭ塩化
ナトリウム、２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ８．０、２．７ｍＭ 塩化カリウム）で
、３７℃で１時間ブロックし、そしてＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を
含むＴＢＳ）で３回洗浄した。サンプルを添加する前に、１％ＢＳＡを含むＴＢ
Ｓ、５０μｌを各ウェルに添加した。
９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６に記載されている。アッセイ
は、アフィニティー精製されたＬＢ３．１モノクローナル抗体、ＰＢＳ（１５０
ｍＭ塩化ナトリウム、７．５ｍＭ二塩基リン酸ナトリウム、２．５ｍＭ一塩基リ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中１．０μｇ／ウェル、１００μｌで被覆されて
いる９６ウェル微量滴定イムノアッセイ・プレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）
、Ｆａｌｃｏｎ）において、４℃で１８時間インキュベートすることにより行っ
た。次に、ウェルを３％ＢＳＡ（ウシ胎児血清）を含むＴＢＳ（１３７ｍＭ塩化
ナトリウム、２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ８．０、２．７ｍＭ 塩化カリウム）で
、３７℃で１時間ブロックし、そしてＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を
含むＴＢＳ）で３回洗浄した。サンプルを添加する前に、１％ＢＳＡを含むＴＢ
Ｓ、５０μｌを各ウェルに添加した。
【００６３】
水溶性ＨＬＡ−ＤＲ１分子を、異種宿主細胞、例えば、組換えバキュロウイル
スで感染された昆虫細胞（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６
８：４６５）、特に、上記Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞において組換えによ
り産生させた。結合分析は、二連で、５０μｌの結合緩衝液中のビオチニル化さ
れたＹＥＡＫ、ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＥＡＫ、またはＹＥＫ（最終濃度１．５μｌ）
を、濃度を変えた非標識阻害剤（ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＥＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡＫ、
ＣII２６１−２７３またはＨＡ３０６−３１８）、および組換え水溶性ＤＲ分子
（０．１５μＭ）と、３７℃で４０時間、ｐＨ５．０で共にインキュベートする
ことにより行った。
スで感染された昆虫細胞（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｃｅｌｌ ６
８：４６５）、特に、上記Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞において組換えによ
り産生させた。結合分析は、二連で、５０μｌの結合緩衝液中のビオチニル化さ
れたＹＥＡＫ、ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＥＡＫ、またはＹＥＫ（最終濃度１．５μｌ）
を、濃度を変えた非標識阻害剤（ＹＥＡ、ＹＡＫ、ＥＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡＫ、
ＣII２６１−２７３またはＨＡ３０６−３１８）、および組換え水溶性ＤＲ分子
（０．１５μＭ）と、３７℃で４０時間、ｐＨ５．０で共にインキュベートする
ことにより行った。
【００６４】
ペプチド−クラスII複合体の検出
結合したペプチド−ビオチンを、ストレプトアビジン抱合アルカリホスファタ
ーゼを使用して以下のように検出した。プレートをＴＴＢＳで三回洗浄し、そし
て、１００μｌのストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼ（１：３００
０、Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）と、３７℃で１時間インキュベー
トし、次に、トリエタノールアミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中のｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を添加した。４１０ｎｍでの吸収を、マイクロプレートリーダー（モ
デルＭＲ４０００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）によりモニ
ターした。
ーゼを使用して以下のように検出した。プレートをＴＴＢＳで三回洗浄し、そし
て、１００μｌのストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼ（１：３００
０、Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）と、３７℃で１時間インキュベー
トし、次に、トリエタノールアミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中のｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を添加した。４１０ｎｍでの吸収を、マイクロプレートリーダー（モ
デルＭＲ４０００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）によりモニ
ターした。
【００６５】
Ｔ細胞ハイブリドーマおよび抗原提示アッセイ
以下のＣII特異的マウスＴ細胞ハイブリドーマを使用した：ＤＲ１制限３．１
９および１９．３クローン（Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ、Ｅ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２）、およびＤＲ４制限３８３８
およびＤ３クローン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｅ．Ｃ．ら、１９９８年、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．ＵＳＡ）。ＡＰＣは、Ｌ５７．２３（ＤＲ１でト
ランスフェクトされたＬ細胞（Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ，Ｅ．Ｆ．ら、１９９７年、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２））、ＤＲ４でトランスフェ
クトされたＬ細胞、およびＰｒｉｅｓｓ細胞（ＤＲＢ１＊０４０１／ＤＲＢ４＊ ０１０１）を、図に示すように使用した。Ｔ細胞刺激実験は、総量０．２ｍｌ中
で９６ウェル微量滴定プレート中で行った。照射された（３０００ｒａｄ）ＡＰ
Ｃ（２．５×１０４／ウェル）を、ＣII２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）およ
び種々の濃度のヘテロポリマーと共に３７℃で２時間インキュベートし、次にＴ
細胞（５×１０４／ウェル）を添加し、そしてインキュベーションを３７℃で２
４時間続けた。上清（３０μｌ）を採取し、そしてＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ（
５×１０４／ウェル）と１２時間インキュベートし、続いて、３Ｈ−チミジン（
１μＣｉ／ウェル）で１２時間標識した。プレートを収穫し、そして１４５０マ
イクロベータＰｌｕｓ液体シンチレーション・カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して放射能をモニターした。
９および１９．３クローン（Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ、Ｅ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２）、およびＤＲ４制限３８３８
およびＤ３クローン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｅ．Ｃ．ら、１９９８年、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．ＵＳＡ）。ＡＰＣは、Ｌ５７．２３（ＤＲ１でト
ランスフェクトされたＬ細胞（Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ，Ｅ．Ｆ．ら、１９９７年、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２））、ＤＲ４でトランスフェ
クトされたＬ細胞、およびＰｒｉｅｓｓ細胞（ＤＲＢ１＊０４０１／ＤＲＢ４＊ ０１０１）を、図に示すように使用した。Ｔ細胞刺激実験は、総量０．２ｍｌ中
で９６ウェル微量滴定プレート中で行った。照射された（３０００ｒａｄ）ＡＰ
Ｃ（２．５×１０４／ウェル）を、ＣII２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）およ
び種々の濃度のヘテロポリマーと共に３７℃で２時間インキュベートし、次にＴ
細胞（５×１０４／ウェル）を添加し、そしてインキュベーションを３７℃で２
４時間続けた。上清（３０μｌ）を採取し、そしてＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ（
５×１０４／ウェル）と１２時間インキュベートし、続いて、３Ｈ−チミジン（
１μＣｉ／ウェル）で１２時間標識した。プレートを収穫し、そして１４５０マ
イクロベータＰｌｕｓ液体シンチレーション・カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して放射能をモニターした。
【００６６】実施例３
ペプチドＣII２６１−２７３によるランダム合成ヘテロポリマーの組
換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合の阻害：３アミノ酸ヘテロポリマ
ーおよびＹＥＡＫの比較は、ＹＡＫが最大の阻害を付与することを示す 自己免疫疾患のための理想的な治療薬は、特定の疾患に関連する対立遺伝子に
よりコードされるＭＨＣクラスIIタンパク分子に高い親和性および特異性を有す
る。この程度の親和性および特異性は、試薬を特にＭＨＣクラスII分子に結合す
る自己抗原のペプチドと成功裡に競合させ得る。
換えＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４分子への結合の阻害：３アミノ酸ヘテロポリマ
ーおよびＹＥＡＫの比較は、ＹＡＫが最大の阻害を付与することを示す 自己免疫疾患のための理想的な治療薬は、特定の疾患に関連する対立遺伝子に
よりコードされるＭＨＣクラスIIタンパク分子に高い親和性および特異性を有す
る。この程度の親和性および特異性は、試薬を特にＭＨＣクラスII分子に結合す
る自己抗原のペプチドと成功裡に競合させ得る。
【００６７】
リューマチ性関節炎に関連するＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４に対する種々のヘ
テロポリマーの結合の親和性および特異性を評価するために、荷電し疎水性であ
る３個のアミノ酸からなるヘテロポリマーをアッセイし、そして、ＭＨＣクラス
IIタンパク結合に関連する種々の速度論特性に関してＹＥＡＫと比較した。これ
らの使用したヘテロポリマーの成分、調製方法、アッセイ法、成分のモル比、お
よび分子量は、実施例１に記載されており、そして、表１に要約されている。こ
れらのランダムヘテロポリマーは、実施例および図に、その成分を示すために１
文字アミノ酸コードを使用してＹＥＡ、ＹＥＫ、ＹＡＫ、およびＥＡＫとして命
名されている。解釈の容易さおよび一貫性のため、アミノ酸成分は、全ての請求
項において完全に記載されている。
テロポリマーの結合の親和性および特異性を評価するために、荷電し疎水性であ
る３個のアミノ酸からなるヘテロポリマーをアッセイし、そして、ＭＨＣクラス
IIタンパク結合に関連する種々の速度論特性に関してＹＥＡＫと比較した。これ
らの使用したヘテロポリマーの成分、調製方法、アッセイ法、成分のモル比、お
よび分子量は、実施例１に記載されており、そして、表１に要約されている。こ
れらのランダムヘテロポリマーは、実施例および図に、その成分を示すために１
文字アミノ酸コードを使用してＹＥＡ、ＹＥＫ、ＹＡＫ、およびＥＡＫとして命
名されている。解釈の容易さおよび一貫性のため、アミノ酸成分は、全ての請求
項において完全に記載されている。
【００６８】
【表１】
【００６９】
ＹＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡまたはＹＥＡＫが、天然配列ＲＡ関連免疫優性抗原Ｃ
II２６１−２７３ペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子との結合におい
て競合するかを決定するために、昆虫細胞内で産生された組換え水溶性ＨＬＡ−
ＤＲ１およびＤＲ４タンパク（各々ＤＲＡ／ＤＲＢ１＊０１０１および＊０４０
１によりコードされている）を使用した。昆虫細胞内で産生された水溶性タンパ
クは、Ｂ細胞から単離された洗浄剤可溶性タンパク（精製された実質的な分子画
分が自己抗原またはペプチドに結合している）と対照的に、自己抗原または他の
ペプチドに大部分が結合しない。したがって、昆虫細胞産生タンパクから得られ
るデータは、ペプチドおよびヘテロポリマーに対する実際の結合親和性のより正
確な表示である（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６０：４３８６、その内容を参照により完全に本明細書に援用する）
。
II２６１−２７３ペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子との結合におい
て競合するかを決定するために、昆虫細胞内で産生された組換え水溶性ＨＬＡ−
ＤＲ１およびＤＲ４タンパク（各々ＤＲＡ／ＤＲＢ１＊０１０１および＊０４０
１によりコードされている）を使用した。昆虫細胞内で産生された水溶性タンパ
クは、Ｂ細胞から単離された洗浄剤可溶性タンパク（精製された実質的な分子画
分が自己抗原またはペプチドに結合している）と対照的に、自己抗原または他の
ペプチドに大部分が結合しない。したがって、昆虫細胞産生タンパクから得られ
るデータは、ペプチドおよびヘテロポリマーに対する実際の結合親和性のより正
確な表示である（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６０：４３８６、その内容を参照により完全に本明細書に援用する）
。
【００７０】
競合結合アッセイは、ビオチニル化されたＹＥＡＫ、ＹＡＫ、ＹＥＡ、および
ＹＥＫを使用し、そして、非標識阻害剤として、ヘテロポリマーＹＥＡＫ、ＹＡ
Ｋ、ＹＥＡ、ＹＥＫ、および天然ペプチドＣII２６１−２７３およびＨＡ３０６
−３１８ペプチド（図１；ＥＡＫは、ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４と低い結合
および競合効率を有することが最初に見出され、さらなる分析から除外された）
を使用して実施した。ＹＥＡＫ、ＹＥＡ、およびＹＡＫ各々のＨＬＡ−ＤＲ１ま
たは−ＤＲ４分子への結合は、５０％阻害に要求されるＣII２６１−２７３ペプ
チドの量により判断し、ＣII２６１−２７３よりも実質的に高く、そして、ＹＥ
Ｋの結合よりも実質的に高かった。インフルエンザウイルスのペプチドＨＡ３０
６−３１８は、各ヘテロポリマーの結合を、ＣII２６１−２７３よりも効率的に
阻害した（図１Ａ、Ｂ）。非標識ペプチドまたは非標識ヘテロポリマーによる、
非標識分子によるビオチニル化されたヘテロポリマーのＤＲ１（図１Ａ）および
ＤＲ４(図１Ｂ）への結合の阻害は、与えられた％阻害に要求される非標識競合
剤の量（横座標上に示す）により決定されるように、ＹＥＡＫまたはＹＥＫに対
するよりもＹＡＫに対するほうがより効率的であった。ＹＡＫは、ペプチドＣII
２６１−２７３よりも優れた阻害物質であることが一貫して見出されたが、これ
は、ＹＥＡＫ、ＹＥＫ、およびＹＥＡには観察されなかった。非標識ＹＡＫによ
る阻害の速度論もまた、インフルエンザペプチドＨＡ３０６−３１８よりも幾分
優れていた。
ＹＥＫを使用し、そして、非標識阻害剤として、ヘテロポリマーＹＥＡＫ、ＹＡ
Ｋ、ＹＥＡ、ＹＥＫ、および天然ペプチドＣII２６１−２７３およびＨＡ３０６
−３１８ペプチド（図１；ＥＡＫは、ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４と低い結合
および競合効率を有することが最初に見出され、さらなる分析から除外された）
を使用して実施した。ＹＥＡＫ、ＹＥＡ、およびＹＡＫ各々のＨＬＡ−ＤＲ１ま
たは−ＤＲ４分子への結合は、５０％阻害に要求されるＣII２６１−２７３ペプ
チドの量により判断し、ＣII２６１−２７３よりも実質的に高く、そして、ＹＥ
Ｋの結合よりも実質的に高かった。インフルエンザウイルスのペプチドＨＡ３０
６−３１８は、各ヘテロポリマーの結合を、ＣII２６１−２７３よりも効率的に
阻害した（図１Ａ、Ｂ）。非標識ペプチドまたは非標識ヘテロポリマーによる、
非標識分子によるビオチニル化されたヘテロポリマーのＤＲ１（図１Ａ）および
ＤＲ４(図１Ｂ）への結合の阻害は、与えられた％阻害に要求される非標識競合
剤の量（横座標上に示す）により決定されるように、ＹＥＡＫまたはＹＥＫに対
するよりもＹＡＫに対するほうがより効率的であった。ＹＡＫは、ペプチドＣII
２６１−２７３よりも優れた阻害物質であることが一貫して見出されたが、これ
は、ＹＥＡＫ、ＹＥＫ、およびＹＥＡには観察されなかった。非標識ＹＡＫによ
る阻害の速度論もまた、インフルエンザペプチドＨＡ３０６−３１８よりも幾分
優れていた。
【００７１】
この実施例および図１Ａおよび１Ｂに示すように、ＹＥＡ、ＹＥＫおよびＹＡ
Ｋヘテロポリマーは、精製ヒトＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４タ
ンパク分子と高親和性で結合することが見出された。驚くべきことに、３つのア
ミノ酸で構成されるヘテロポリマーには、ＹＥＡＫとＭＨＣクラスIIタンパクへ
の結合において成功裡に競合することが見出されたものもある。さらに、これら
の結合のインビトロアッセイにおいて、ランダムな３アミノ酸へテロポリマー、
特にＹＡＫは、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子と結合することが示さ
れており、それは、自己抗原エピトープＣII２６１−２７３の結合よりも優れて
いた。
Ｋヘテロポリマーは、精製ヒトＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４タ
ンパク分子と高親和性で結合することが見出された。驚くべきことに、３つのア
ミノ酸で構成されるヘテロポリマーには、ＹＥＡＫとＭＨＣクラスIIタンパクへ
の結合において成功裡に競合することが見出されたものもある。さらに、これら
の結合のインビトロアッセイにおいて、ランダムな３アミノ酸へテロポリマー、
特にＹＡＫは、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子と結合することが示さ
れており、それは、自己抗原エピトープＣII２６１−２７３の結合よりも優れて
いた。
【００７２】実施例４
ランダムヘテロポリマーによるＣII抗原提示へのＤＲ１−およびＤＲ
４制限ＣII特異的Ｔ細胞応答の阻害 ＹＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡまたはＹＥＡＫのいずれかが自己反応性Ｔ細胞に対す
るリューマチ性関節炎免疫優性エピトープＣII２６１−２７３ペプチドの提示を
阻害し得るかを決定するために、ＨＬＡ−ＤＲ１（３．１９および１９．３）お
よびＤＲ４（３８３８およびＤ３）に制限されているＣII特異的Ｔ細胞ハイブリ
ドーマを使用した。照射されたＡＰＣ（結合しそして抗原を提示するように機能
し得るが、増殖することができない）をＣII２６１−２７３および関連するヘテ
ロポリマーと２時間インキュベートし、次にＴ細胞を加えてさらに２４時間イン
キュベートし、そして各反応においてハイブリドーマにより分泌されたＩＬ−２
の量を測定した。
４制限ＣII特異的Ｔ細胞応答の阻害 ＹＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡまたはＹＥＡＫのいずれかが自己反応性Ｔ細胞に対す
るリューマチ性関節炎免疫優性エピトープＣII２６１−２７３ペプチドの提示を
阻害し得るかを決定するために、ＨＬＡ−ＤＲ１（３．１９および１９．３）お
よびＤＲ４（３８３８およびＤ３）に制限されているＣII特異的Ｔ細胞ハイブリ
ドーマを使用した。照射されたＡＰＣ（結合しそして抗原を提示するように機能
し得るが、増殖することができない）をＣII２６１−２７３および関連するヘテ
ロポリマーと２時間インキュベートし、次にＴ細胞を加えてさらに２４時間イン
キュベートし、そして各反応においてハイブリドーマにより分泌されたＩＬ−２
の量を測定した。
【００７３】
ＹＡＫ、ＹＥＫ、およびＹＥＡＫが、ＣIIペプチドに対するＤＲ１制限Ｔ細胞
応答を阻害することを観察した（図２、上パネル）。ＹＡＫは、最も強力な阻害
剤であって、そしてＹＥＡはあまり効率的には阻害しなかった。ＹＡＫおよびＹ
ＥＫは両方とも、ＹＥＡＫよりも、ＣII抗原のＤＲ１提示のための実質的により
効率的な阻害剤であり（異なる分子量の２つのバッチにおいて）、ＹＡＫは、Ｙ
ＥＡＫよりも２〜３倍低い量で匹敵する阻害を生じ、ＹＡＫは、阻害のより高い
終点に到達した。ＤＲ１ ＡＰＣの他のバッチで矛盾のない結果が得られ（図２
、中および下パネル）、ＹＡＫがこのアッセイにおいてＲＡに関連するペプチド
の免疫認識について、ＹＥＡＫよりも高い阻害特性を示すことが示された。これ
らのヘテロポリマーに関する活性の同様のパターンが、ＡＰＣとしてＰｒｉｅｓ
ｓまたはＤＲ４でトランスフェクトされたＬ繊維芽細胞のいずれかを使用して、
ＤＲ４制限Ｔ細胞で得られた（図３）。
応答を阻害することを観察した（図２、上パネル）。ＹＡＫは、最も強力な阻害
剤であって、そしてＹＥＡはあまり効率的には阻害しなかった。ＹＡＫおよびＹ
ＥＫは両方とも、ＹＥＡＫよりも、ＣII抗原のＤＲ１提示のための実質的により
効率的な阻害剤であり（異なる分子量の２つのバッチにおいて）、ＹＡＫは、Ｙ
ＥＡＫよりも２〜３倍低い量で匹敵する阻害を生じ、ＹＡＫは、阻害のより高い
終点に到達した。ＤＲ１ ＡＰＣの他のバッチで矛盾のない結果が得られ（図２
、中および下パネル）、ＹＡＫがこのアッセイにおいてＲＡに関連するペプチド
の免疫認識について、ＹＥＡＫよりも高い阻害特性を示すことが示された。これ
らのヘテロポリマーに関する活性の同様のパターンが、ＡＰＣとしてＰｒｉｅｓ
ｓまたはＤＲ４でトランスフェクトされたＬ繊維芽細胞のいずれかを使用して、
ＤＲ４制限Ｔ細胞で得られた（図３）。
【００７４】
ＣII２６１−２７３抗原をＴ細胞に提示するＤＲ１またはＤＲ４タンパク分子
の能力は、ＹＥＫよりもＹＡＫの存在により大幅に減少され、ヘテロポリマー分
子は、Ｔ細胞応答の強力な阻害剤であること、およびプロセスの阻害におけるこ
れらのヘテロポリマーの各々の相対的な活性が示された。したがって、Ｔ細胞活
性データに基づき、これらのランダムへテロポリマーの自己抗原性ＣII２６１−
２７３ペプチドとの競合における相対的な能力は、以下の順序で表される： ＹＡＫ＞ＹＥＫ＞ＹＥＡＫ＞＞ＹＥＡ。
の能力は、ＹＥＫよりもＹＡＫの存在により大幅に減少され、ヘテロポリマー分
子は、Ｔ細胞応答の強力な阻害剤であること、およびプロセスの阻害におけるこ
れらのヘテロポリマーの各々の相対的な活性が示された。したがって、Ｔ細胞活
性データに基づき、これらのランダムへテロポリマーの自己抗原性ＣII２６１−
２７３ペプチドとの競合における相対的な能力は、以下の順序で表される： ＹＡＫ＞ＹＥＫ＞ＹＥＡＫ＞＞ＹＥＡ。
【００７５】実施例５
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子に結合するＹＥＡＫ
の調製および定量方法 ＹＥＡＫを水溶性ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、または−ＤＲ４分子と１：１の
モル比で３７℃で４０時間、インキュベートした。これらの組換え「エンプティ
」ＨＬＡ−ＤＲ分子は、外部から添加した抗原の存在下で安定に会合することが
できた、そしてＹＥＡＫは、安定化を促進するように機能することができ、内在
性ペプチドからの干渉をうけない（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．ら、１
９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６）。未結合ＹＥＡＫは、セン
トリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）限外ろ過によって結合ＹＥＡＫから分離した。
次に、結合ＹＥＡＫをＨＬＡ−ＤＲ複合体から酸処理により抽出し（Ｃｈｉｃｚ
，Ｒ．ら、１９９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７）、アミノ酸分析に
供した。
の調製および定量方法 ＹＥＡＫを水溶性ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、または−ＤＲ４分子と１：１の
モル比で３７℃で４０時間、インキュベートした。これらの組換え「エンプティ
」ＨＬＡ−ＤＲ分子は、外部から添加した抗原の存在下で安定に会合することが
できた、そしてＹＥＡＫは、安定化を促進するように機能することができ、内在
性ペプチドからの干渉をうけない（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．ら、１
９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４３８６）。未結合ＹＥＡＫは、セン
トリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）限外ろ過によって結合ＹＥＡＫから分離した。
次に、結合ＹＥＡＫをＨＬＡ−ＤＲ複合体から酸処理により抽出し（Ｃｈｉｃｚ
，Ｒ．ら、１９９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７）、アミノ酸分析に
供した。
【００７６】
ＨＰＬＣ分離および溶出後のマイクロシークエンシングのために、約５〜１０
％のＹＥＡＫ混合物を、ＺｏｒｂａｘＣ１８ １．０ｍｍ逆相カラムを使用し、
１０４０ダイオードアレイ検出器を備え付けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
１０９０ ＨＰＬＣにおいて、マイクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）ＨＰＬＣ
により分画した。流速５４μｌ／分で、ＹＥＡＫをアセトニトリル中（０〜１０
分では０％、７３分では３３％、および１０５分では６０％）０．０５５％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）のグラジエントで溶出した。ピーク決定の戦略、逆相分
離、およびＥｄｍａｎマイクロシークエンシングは、Ｃｈｉｃｚ，Ｒ．ら、１９
９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７およびＬａｎｅ，Ｗ．ら、１９９１
年、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ． １０：１５１で行われているように行った。
％のＹＥＡＫ混合物を、ＺｏｒｂａｘＣ１８ １．０ｍｍ逆相カラムを使用し、
１０４０ダイオードアレイ検出器を備え付けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
１０９０ ＨＰＬＣにおいて、マイクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）ＨＰＬＣ
により分画した。流速５４μｌ／分で、ＹＥＡＫをアセトニトリル中（０〜１０
分では０％、７３分では３３％、および１０５分では６０％）０．０５５％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）のグラジエントで溶出した。ピーク決定の戦略、逆相分
離、およびＥｄｍａｎマイクロシークエンシングは、Ｃｈｉｃｚ，Ｒ．ら、１９
９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７およびＬａｎｅ，Ｗ．ら、１９９１
年、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ． １０：１５１で行われているように行った。
【００７７】
疎水性および大きさによりＹＥＡＫの結合画分をさらに特徴付けるために、サ
ンプルを、アセトニトリルのグラジエントを使用してＲＰ−ＨＰＬＣで分離した
。未処理ＹＥＡＫは、いくつかの小さなピークとともに約４０〜７５分の溶出時
間の間に広がった非常に広いピークを示した。この溶出プロフィールは、ランダ
ムポリペプチドの混合物の特徴であり、そして、ＹＥＡＫの他のバッチのＨＰＬ
Ｃ分離に類似する。同様のプロフィールは、ＹＥＡＫをＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ
２、または−ＤＲ４分子から溶出したときに得られ、これは、化学的特性におい
て、結合画分は、初めのＹＥＡＫ混合物全体と類似していることを示す。
ンプルを、アセトニトリルのグラジエントを使用してＲＰ−ＨＰＬＣで分離した
。未処理ＹＥＡＫは、いくつかの小さなピークとともに約４０〜７５分の溶出時
間の間に広がった非常に広いピークを示した。この溶出プロフィールは、ランダ
ムポリペプチドの混合物の特徴であり、そして、ＹＥＡＫの他のバッチのＨＰＬ
Ｃ分離に類似する。同様のプロフィールは、ＹＥＡＫをＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ
２、または−ＤＲ４分子から溶出したときに得られ、これは、化学的特性におい
て、結合画分は、初めのＹＥＡＫ混合物全体と類似していることを示す。
【００７８】実施例６
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２および−ＤＲ４分子に結合したＹＥＡＫの
分析 添加ＹＥＡＫヘテロポリマー分子の少なくとも９５％が、単離されたＨＬＡ−
ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４に結合した画分において観察され、そして、８０％
はＨＬＡ−ＤＲ２タンパクと結合した。ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−Ｄ
Ｒ４分子との複合体から溶出されたＹＥＡＫは、コントロール（対照）の未処理
ＹＥＡＫと類似の成分アミノ酸Ｙ：Ｅ：Ａ：Ｋの比を示した。これらの結果は、
ＹＥＡＫの結合画分が全混合物のアミノ酸組成を反映し、そして、ＹＥＡＫの集
団が異なるＨＬＡ−ＤＲタンパクへの優先的な結合をほとんどまたはまったく示
さないということを示している。ＹＥＡＫは、ヒトホモ接合性ＥＢＶ形直転換Ｂ
細胞ラインから精製された、各々過剰量のＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−
ＤＲ４分子とインキュベートし、そして、複合体をさらにサイズ除去カラムを通
過させることにより分画すると、溶出された物質の分布は、各々のＨＬＡ−ＤＲ
分子に関し、ほとんど全てのＹＥＡＫが、高分子量複合体に相当する画分で見出
され、１０％未満がコントロールＹＥＡＫのより低い分子量の位置であることを
示した。
分析 添加ＹＥＡＫヘテロポリマー分子の少なくとも９５％が、単離されたＨＬＡ−
ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４に結合した画分において観察され、そして、８０％
はＨＬＡ−ＤＲ２タンパクと結合した。ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−Ｄ
Ｒ４分子との複合体から溶出されたＹＥＡＫは、コントロール（対照）の未処理
ＹＥＡＫと類似の成分アミノ酸Ｙ：Ｅ：Ａ：Ｋの比を示した。これらの結果は、
ＹＥＡＫの結合画分が全混合物のアミノ酸組成を反映し、そして、ＹＥＡＫの集
団が異なるＨＬＡ−ＤＲタンパクへの優先的な結合をほとんどまたはまったく示
さないということを示している。ＹＥＡＫは、ヒトホモ接合性ＥＢＶ形直転換Ｂ
細胞ラインから精製された、各々過剰量のＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−
ＤＲ４分子とインキュベートし、そして、複合体をさらにサイズ除去カラムを通
過させることにより分画すると、溶出された物質の分布は、各々のＨＬＡ−ＤＲ
分子に関し、ほとんど全てのＹＥＡＫが、高分子量複合体に相当する画分で見出
され、１０％未満がコントロールＹＥＡＫのより低い分子量の位置であることを
示した。
【００７９】
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子の各々に結合するＹＥＡＫの
配列を分析するために、実施例５で得られたＨＰＬＣ画分を、溶出面積内でプー
ルし、そしてプールされた画分を、製造者マニュアル３．５を使用し、Ｈｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇ１００５Ａ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）タンパク
シークエンサー上で、自動化されたＥｄｍａｎ分解に付した。
配列を分析するために、実施例５で得られたＨＰＬＣ画分を、溶出面積内でプー
ルし、そしてプールされた画分を、製造者マニュアル３．５を使用し、Ｈｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇ１００５Ａ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）タンパク
シークエンサー上で、自動化されたＥｄｍａｎ分解に付した。
【００８０】
各々のＨＬＡ−ＤＲタンパクについて、結果は、タンパクに結合したＹＥＡＫ
の４つのアミノ酸成分は、ＹＥＡＫの入力したモル比による配列内にランダムに
分布することを示した。アミノ酸アラニン（Ａ）は、ＹＥＡＫ中のＡの当初のよ
り高いモル比から予想されるように、Ｅ、Ｙ、およびＫに比べて有意に高いレベ
ルで見られた。ＹＥＡＫのいずれのアミノ酸の配列特異性または優先的な配置も
存在しないことは、結合した画分もまたランダムで未分画のＹＥＡＫ全体と類似
することを示す。
の４つのアミノ酸成分は、ＹＥＡＫの入力したモル比による配列内にランダムに
分布することを示した。アミノ酸アラニン（Ａ）は、ＹＥＡＫ中のＡの当初のよ
り高いモル比から予想されるように、Ｅ、Ｙ、およびＫに比べて有意に高いレベ
ルで見られた。ＹＥＡＫのいずれのアミノ酸の配列特異性または優先的な配置も
存在しないことは、結合した画分もまたランダムで未分画のＹＥＡＫ全体と類似
することを示す。
【００８１】
抗ＹＥＡＫポリクローナル抗体を用いて、各々のＨＬＡ−ＤＲ分子から溶出さ
れたＹＥＡＫの画分が、コントロールの未処理ＹＥＡＫ中に見られるエピトープ
を含むかどうかを決定した。ＹＥＡＫと種々のＹＥＡＫ画分の間の交互反応性は
、ビオチニル化された抗ＹＥＡＫポリクローナル抗体を使用して直接ＥＬＩＳＡ
アッセイにより検出された。ＹＥＡＫまたは画分を、０．４μｇ／ｍｌおよび２
．０μｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μ／ウェルを二連で９６ウェル微量滴定
免疫アッセイプレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏ
ｌｎ Ｐａｒｋ、ＮＪ）にプレーティングし、３７℃で１時間インキュベートし
、そして０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで３回洗浄した。次に、
ウェルを３％ＢＳＡ含有ＴＢＳでブロックし、次にビオチニル化された抗ＹＥＡ
Ｋ抗体（１：５０００の希釈で、１００μｌ／ウェル）を添加した。抗体−リガ
ンド複合体を、ストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼ（１：３０００
の希釈で、Ｂｉｏｒａｄ）およびｐ−ニトロフェニルリン酸（トリエタノールア
ミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中）を使用して検出した
。４１０ｎｍでの吸収を、マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ
４０００）によりモニターした。
れたＹＥＡＫの画分が、コントロールの未処理ＹＥＡＫ中に見られるエピトープ
を含むかどうかを決定した。ＹＥＡＫと種々のＹＥＡＫ画分の間の交互反応性は
、ビオチニル化された抗ＹＥＡＫポリクローナル抗体を使用して直接ＥＬＩＳＡ
アッセイにより検出された。ＹＥＡＫまたは画分を、０．４μｇ／ｍｌおよび２
．０μｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μ／ウェルを二連で９６ウェル微量滴定
免疫アッセイプレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏ
ｌｎ Ｐａｒｋ、ＮＪ）にプレーティングし、３７℃で１時間インキュベートし
、そして０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで３回洗浄した。次に、
ウェルを３％ＢＳＡ含有ＴＢＳでブロックし、次にビオチニル化された抗ＹＥＡ
Ｋ抗体（１：５０００の希釈で、１００μｌ／ウェル）を添加した。抗体−リガ
ンド複合体を、ストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼ（１：３０００
の希釈で、Ｂｉｏｒａｄ）およびｐ−ニトロフェニルリン酸（トリエタノールア
ミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中）を使用して検出した
。４１０ｎｍでの吸収を、マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ
４０００）によりモニターした。
【００８２】
抗体結合アッセイは、全ての画分が、抗ＹＥＡＫ抗体によって同様に認識され
ていることを示し、これは、これらの結合したヘテロポリマー画分が、互いに、
そしてコントロールＹＥＡＫと、類似または同一のエピトープを共有しているこ
とを示す。
ていることを示し、これは、これらの結合したヘテロポリマー画分が、互いに、
そしてコントロールＹＥＡＫと、類似または同一のエピトープを共有しているこ
とを示す。
【００８３】実施例７
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、または−ＤＲ４分子に結合したＹＥＡＫ
の突出したアミノ末端のアミノペプチダーゼＩでの除去による、ＹＥＡＫの結合
モチーフの特徴付け 実施例６で観察された初めの２０〜２５個のＮ末端アミノ酸の配列は、ＨＬＡ
−ＤＲ分子を超えて突出した配列を表し、機能的エピトープ−特異的グルーブ内
で結合したＹＥＡＫの実際の結合モチーフに関する情報源ではない。ＭＨＣクラ
スIIタンパク内で結合し、このタンパクにより保護されたＹＥＡＫ分子の部分の
アミノ酸配列を得るために、ＹＥＡＫ（１ｍＭ）を、１０ＹＥＡＫ：１ＨＬＡ−
ＤＲのモル比において１０μｌの量で各ＨＬＡ−ＤＲ分子（１００μｍ）と、Ｐ
ＢＳ中、３７℃で４０時間初めにインキュベートした。ＨＬＡ−ＤＲ分子から突
出したＹＥＡＫポリペプチドのアミノ末端を除去し、残りの未結合ＹＥＡＫを消
化するために、アミノペプチダーゼＩ、すなわちＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇ
ｒｉｓｅｕｓから単離されたメタロプロテイン（Ｓｐｕｎｇｉｎ， Ａ．ら、１
９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：４７１；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）を、２単位含む２μｌの量でイン
キュベーションの残り１８時間で反応に添加した（Ｍｏｕｒｉｔｓｅｎ，Ｓ．ら
、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１９８７；Ｌａｒｓｅｎ，Ｓ．Ｌ
．ら、１９９６年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８３）。続いてのヘテロポ
リマーのアミノペプチダーゼでの消化は、２０〜４０の倍率でスケールアップさ
れた容量、例えば、６０μｌのアミノペプチダーゼで消化された３００μｌのヘ
テロポリマーという容量で行った。サンプルは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０限外
ろ過装置を使用して約１００μｌの最終容量にスピン濃縮した。
の突出したアミノ末端のアミノペプチダーゼＩでの除去による、ＹＥＡＫの結合
モチーフの特徴付け 実施例６で観察された初めの２０〜２５個のＮ末端アミノ酸の配列は、ＨＬＡ
−ＤＲ分子を超えて突出した配列を表し、機能的エピトープ−特異的グルーブ内
で結合したＹＥＡＫの実際の結合モチーフに関する情報源ではない。ＭＨＣクラ
スIIタンパク内で結合し、このタンパクにより保護されたＹＥＡＫ分子の部分の
アミノ酸配列を得るために、ＹＥＡＫ（１ｍＭ）を、１０ＹＥＡＫ：１ＨＬＡ−
ＤＲのモル比において１０μｌの量で各ＨＬＡ−ＤＲ分子（１００μｍ）と、Ｐ
ＢＳ中、３７℃で４０時間初めにインキュベートした。ＨＬＡ−ＤＲ分子から突
出したＹＥＡＫポリペプチドのアミノ末端を除去し、残りの未結合ＹＥＡＫを消
化するために、アミノペプチダーゼＩ、すなわちＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇ
ｒｉｓｅｕｓから単離されたメタロプロテイン（Ｓｐｕｎｇｉｎ， Ａ．ら、１
９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：４７１；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）を、２単位含む２μｌの量でイン
キュベーションの残り１８時間で反応に添加した（Ｍｏｕｒｉｔｓｅｎ，Ｓ．ら
、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１９８７；Ｌａｒｓｅｎ，Ｓ．Ｌ
．ら、１９９６年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８３）。続いてのヘテロポ
リマーのアミノペプチダーゼでの消化は、２０〜４０の倍率でスケールアップさ
れた容量、例えば、６０μｌのアミノペプチダーゼで消化された３００μｌのヘ
テロポリマーという容量で行った。サンプルは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０限外
ろ過装置を使用して約１００μｌの最終容量にスピン濃縮した。
【００８４】
ＹＥＡＫ−ＨＬＡ−ＤＲ複合体および未結合ＹＥＡＫを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＯＶＥＸミニセル電気泳動システムで実
施した。分離ゲルは、１０％アクリルアミドであり、スタッキング・ゲルは、５
％であった。ＨＬＡ−ＤＲ１−ＹＥＡＫ複合体を、２００Ｖで１時間非還元条件
下で泳動し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、１０％メタノール／１
０％酢酸で３時間固定し、そして、Ｃｅｌｌｏｐｈａｎｅ ｐａｐｅｒ（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）上で２５℃で乾燥させた。ＹＥＡＫ−ＨＬＡ−ＤＲ複合体は、ＳＤＳに
誘導される解離に耐性を有し、ＨＬＡ−ＤＲ１ αβヘテロ二量体とともにより
高分子量の複合体を形成することが見出され、そして、ポリアクリルアミドゲル
上で５０ｋＤのタンパクの分子量標準よりも高い分子量を有する多数のバンドと
して観察され、これは、ＹＥＡＫ−ＤＲ複合体が保護されていたことを示す。ア
ミノペプチダーゼＩ処理は、未反応ＹＥＡＫが、ゲルの下方部分でスメアとして
表れるという結果となり、これは、酵素により完全に消化されたことを示す。
より分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＯＶＥＸミニセル電気泳動システムで実
施した。分離ゲルは、１０％アクリルアミドであり、スタッキング・ゲルは、５
％であった。ＨＬＡ−ＤＲ１−ＹＥＡＫ複合体を、２００Ｖで１時間非還元条件
下で泳動し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、１０％メタノール／１
０％酢酸で３時間固定し、そして、Ｃｅｌｌｏｐｈａｎｅ ｐａｐｅｒ（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）上で２５℃で乾燥させた。ＹＥＡＫ−ＨＬＡ−ＤＲ複合体は、ＳＤＳに
誘導される解離に耐性を有し、ＨＬＡ−ＤＲ１ αβヘテロ二量体とともにより
高分子量の複合体を形成することが見出され、そして、ポリアクリルアミドゲル
上で５０ｋＤのタンパクの分子量標準よりも高い分子量を有する多数のバンドと
して観察され、これは、ＹＥＡＫ−ＤＲ複合体が保護されていたことを示す。ア
ミノペプチダーゼＩ処理は、未反応ＹＥＡＫが、ゲルの下方部分でスメアとして
表れるという結果となり、これは、酵素により完全に消化されたことを示す。
【００８５】
結合モチーフの配列を得るために、保護されたＹＥＡＫのピークを含む画分を
、ＨＬＡ−ＤＲ複合体の各クラスに対して約４０〜７５分の溶出時間の間の領域
で選択した。突出Ｎ末端のない結合したＹＥＡＫを、酢酸（１０％）の添加およ
び７０℃で１５分のインキュベーションによりＨＬＡ−ＤＲから溶出し、次に限
外ろ過し、ＳｐｅｅｄＶａｃで真空濃縮した（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ；Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．
ら、１９９５年、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２２９）。配列データ（
表２）は、ＨＬＡ−ＤＲ１に結合したペプチドについては、第一および第二のサ
イクルで有意に高いレベルのＥ残基が見出され、第二および第三のサイクルで高
いレベルのＫ残基が見出され、そして、第三〜第五のサイクルで高いレベルのＹ
残基が見出されたことを示す（ＭＨＣクラスIIグルーブ内の結合ペプチド部位の
Ｐ１にほぼ相当する位置と予想される）。Ｅｄｍａｎ分解法による位置３から得
られるアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブのＰ１アンカー位
置に相当するが、これは、ＨＡ３０６−３１８のＨＬＡ−ＤＲ１との複合体の構
造中、Ｐ２アミノ酸残基は、グルーブのフラッシュ末端であり、そしてＰ１の位
置は、深いポケット中の第三のアミノ酸、すなわち、Ｙ３０８であるためである
（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３６８：２１５）。これら
のデータは未処理ＹＥＡＫ中に見られる配列のランダムなパターンと対照的であ
り、こちらはＹＥＡＫを構成する４つのアミノ酸のいずれのＭＨＣクラスIIグル
ーブ内の配列特異性または優先的な配置がないことが示されている。
、ＨＬＡ−ＤＲ複合体の各クラスに対して約４０〜７５分の溶出時間の間の領域
で選択した。突出Ｎ末端のない結合したＹＥＡＫを、酢酸（１０％）の添加およ
び７０℃で１５分のインキュベーションによりＨＬＡ−ＤＲから溶出し、次に限
外ろ過し、ＳｐｅｅｄＶａｃで真空濃縮した（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ；Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ．
ら、１９９５年、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２２９）。配列データ（
表２）は、ＨＬＡ−ＤＲ１に結合したペプチドについては、第一および第二のサ
イクルで有意に高いレベルのＥ残基が見出され、第二および第三のサイクルで高
いレベルのＫ残基が見出され、そして、第三〜第五のサイクルで高いレベルのＹ
残基が見出されたことを示す（ＭＨＣクラスIIグルーブ内の結合ペプチド部位の
Ｐ１にほぼ相当する位置と予想される）。Ｅｄｍａｎ分解法による位置３から得
られるアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブのＰ１アンカー位
置に相当するが、これは、ＨＡ３０６−３１８のＨＬＡ−ＤＲ１との複合体の構
造中、Ｐ２アミノ酸残基は、グルーブのフラッシュ末端であり、そしてＰ１の位
置は、深いポケット中の第三のアミノ酸、すなわち、Ｙ３０８であるためである
（Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３６８：２１５）。これら
のデータは未処理ＹＥＡＫ中に見られる配列のランダムなパターンと対照的であ
り、こちらはＹＥＡＫを構成する４つのアミノ酸のいずれのＭＨＣクラスIIグル
ーブ内の配列特異性または優先的な配置がないことが示されている。
【００８６】
ＨＬＡ−ＤＲ２については、ＹとＡの両方の残基レベルが、サイクル３で高め
られた（表２）。配列特異性または優先的な配置は、Ｐ１に続くアンカー位置に
相当する位置については観察されなかった（ＨＬＡ−ＤＲ１または−ＤＲ４のＰ
４、Ｐ６、またはＰ９に対応する配列中での位置；ＤＲ２ｂ分子のＰ４、Ｐ７）
。全てのサンプルにおいて、ＡのレベルはＥ、Ｙ、およびＫよりも高く、これは
予期されたことであり、そして、ＹＥＡＫ中のＡのより高いモル比に相当するも
のであることが分かった。ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子の各々について、
第一のアンカー位置に相当する位置（配列分析中第三の残基）でＹが、次いで後
続するポケットに相当する位置でＡが見出された。ＨＬＡ−ＤＲ２に結合するＹ
ＥＡＫにおいても又、Ｐ１に相当する位置はＹに富んでいる。Ｐ−２位置に相当
する第一のサイクル位置はＥに富んでおり、そして、Ｐ−１に相当する次に隣接
する位置はＫに富んでいた。これらの残基は、ＹＥＡＫとＨＬＡ−ＤＲ分子との
安定な相互作用に貢献し、そして、この複合体とＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と
の相互作用に貢献し得る。
られた（表２）。配列特異性または優先的な配置は、Ｐ１に続くアンカー位置に
相当する位置については観察されなかった（ＨＬＡ−ＤＲ１または−ＤＲ４のＰ
４、Ｐ６、またはＰ９に対応する配列中での位置；ＤＲ２ｂ分子のＰ４、Ｐ７）
。全てのサンプルにおいて、ＡのレベルはＥ、Ｙ、およびＫよりも高く、これは
予期されたことであり、そして、ＹＥＡＫ中のＡのより高いモル比に相当するも
のであることが分かった。ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子の各々について、
第一のアンカー位置に相当する位置（配列分析中第三の残基）でＹが、次いで後
続するポケットに相当する位置でＡが見出された。ＨＬＡ−ＤＲ２に結合するＹ
ＥＡＫにおいても又、Ｐ１に相当する位置はＹに富んでいる。Ｐ−２位置に相当
する第一のサイクル位置はＥに富んでおり、そして、Ｐ−１に相当する次に隣接
する位置はＫに富んでいた。これらの残基は、ＹＥＡＫとＨＬＡ−ＤＲ分子との
安定な相互作用に貢献し、そして、この複合体とＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と
の相互作用に貢献し得る。
【００８７】
これらの結果は、ＹＥＡＫは、クラスII ＭＨＣ結合モチーフを含むことを示
す。いずれの特定の理論にもとらわれないが、これらのデータによって、ＨＬＡ
−ＤＲ分子の抗原のグルーブに結合するＹＥＡＫは、ブロッキングペプチドもし
くはアンタゴニストまたは部分的アゴニストのいずれかとして作用することがで
き、その結果、自己免疫Ｔ細胞応答またはアネルギー、または両方の抑制をもた
らすことが示される。結合モチーフ配列は、Ｔ細胞エピトープのマッピング、お
よびヒトにおけるＭＳおよびＲＡのような、自己免疫疾患の治療のための新規な
薬剤の設計に有用である。
す。いずれの特定の理論にもとらわれないが、これらのデータによって、ＨＬＡ
−ＤＲ分子の抗原のグルーブに結合するＹＥＡＫは、ブロッキングペプチドもし
くはアンタゴニストまたは部分的アゴニストのいずれかとして作用することがで
き、その結果、自己免疫Ｔ細胞応答またはアネルギー、または両方の抑制をもた
らすことが示される。結合モチーフ配列は、Ｔ細胞エピトープのマッピング、お
よびヒトにおけるＭＳおよびＲＡのような、自己免疫疾患の治療のための新規な
薬剤の設計に有用である。
【００８８】実施例８
ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子のための結合モチーフを有するペ
プチドの合成 上記の実施例は、ＹＥＡＫヘテロポリマーが、ペプチド結合グルーブ内で精製
されたヒトＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、そして、ＨＡ３０６−３１８ペプチド、
すなわちインフルエンザウイルスの高親和性エピトープの、ＨＬＡ−ＤＲ１（Ｄ
ＲＢ１＊０１０１）および−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子の両方に対する
結合を阻害したことを示す。
プチドの合成 上記の実施例は、ＹＥＡＫヘテロポリマーが、ペプチド結合グルーブ内で精製
されたヒトＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、そして、ＨＡ３０６−３１８ペプチド、
すなわちインフルエンザウイルスの高親和性エピトープの、ＨＬＡ−ＤＲ１（Ｄ
ＲＢ１＊０１０１）および−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子の両方に対する
結合を阻害したことを示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
さらに、３つのアミノ酸のみからなるランダムヘテロポリマー（ＥＡＫ、ＹＥ
Ａ、ＹＡＫ、およびＹＥＫ）は、精製されたＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および
−ＤＲ４分子と結合し、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）および
−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）タンパク分子への結合についてＣII２６１−２
７３と競合し、そして、ＣII反応性Ｔ細胞クローンを阻害した。タンパクに結合
するＹＥＡＫの画分を、昆虫細胞中で産生された組換え「エンプティ」ＨＬＡ−
ＤＲ分子との複合体から単離し、そして結合モチーフを、ＨＬＡ−ＤＲ１または
−ＤＲ４分子の大グルーブ中で複合体と結合するＹＥＡＫのアミノペプチダーゼ
Ｉ処理により解析した。続いての溶出されたペプチドのプールシークエンシング
は、使用するＨＬＡ−ＤＲ分子にかかわらず、第一および第二のサイクルでのＥ
レベルの増大、第二および第三サイクルでのＫレベルの増大、第三〜第五サイク
ルでの（結合ペプチドのＰ１における）Ｙレベルの増大を示した。
Ａ、ＹＡＫ、およびＹＥＫ）は、精製されたＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および
−ＤＲ４分子と結合し、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１＊０１０１）および
−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）タンパク分子への結合についてＣII２６１−２
７３と競合し、そして、ＣII反応性Ｔ細胞クローンを阻害した。タンパクに結合
するＹＥＡＫの画分を、昆虫細胞中で産生された組換え「エンプティ」ＨＬＡ−
ＤＲ分子との複合体から単離し、そして結合モチーフを、ＨＬＡ−ＤＲ１または
−ＤＲ４分子の大グルーブ中で複合体と結合するＹＥＡＫのアミノペプチダーゼ
Ｉ処理により解析した。続いての溶出されたペプチドのプールシークエンシング
は、使用するＨＬＡ−ＤＲ分子にかかわらず、第一および第二のサイクルでのＥ
レベルの増大、第二および第三サイクルでのＫレベルの増大、第三〜第五サイク
ルでの（結合ペプチドのＰ１における）Ｙレベルの増大を示した。
【００９１】
この実施例において、定義された配列の１５残基の長さのペプチドを、表２に
要約された結合モチーフの配列を使用して合成した。これらのペプチドを、以下
の実施例において、ＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲタンパク分子への結合の親和
性および特異性、および競合剤分子の結合阻害能力およびＴ細胞応答阻害能力、
自己免疫疾患のための新規な治療化合物として適する機能特性について分析した
。
要約された結合モチーフの配列を使用して合成した。これらのペプチドを、以下
の実施例において、ＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲタンパク分子への結合の親和
性および特異性、および競合剤分子の結合阻害能力およびＴ細胞応答阻害能力、
自己免疫疾患のための新規な治療化合物として適する機能特性について分析した
。
【００９２】
表３に示すペプチドは、固相技術（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ら、１９７９年、Ｔｈ
ｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅ．Ｇｒｏｓｓら編集（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））を使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で合成し、そして、逆相ＨＰＬ
Ｃにより精製した。ペプチド配列は、ＨＡ３０６−３１８、ＰＫＹＶＫＱＧＮＴ
ＬＫＬＡＴ（配列番号１）、ＭＷ１７１８；ＣII２６１−２７３、ＡＧＦＫＧＥ
ＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号２）、ＭＷ１５１６；およびＮ末端およびＣ末端でア
ラニンによりブラケットされたＨＡ３０６−３１８、ＡＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬ
ＡＴＡ（配列番号４）を含む。比較のために、Ｎ末端およびＣ末端をアラニンで
ブラケットされたＣII２６１−２７３ペプチド、ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ（
配列番号３）を合成することができる。ペプチドはまた、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を使用して１μｍスケールで合成する
ことができた。ペプチドは、Ｎ末端に遊離アミノ基、Ｃ末端に遊離カルボキシル
基を有する、そして、スペーサーＳＧＳＧによりＮ末端に結合し、Ｃ末端に遊離
カルボキシル基を有するビオチンを有する、１５マーとして合成した。ペプチド
合成は、コントロールとして２つの標準的なペプチド配列を含むことによりモニ
ターし、それらはＨＰＬＣおよび質量分光分析器に付した。ＨＡ３０６−３１８
ペプチドもまた、結合実験のためのポジティブ・コントロールとして使用した。
ピンペプチドを凍結乾燥し、そしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。これらの条件下で、ペプチドの大部分は完全に溶
解した。ビオチニル化は、記載されたように（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら
、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４
８７２−４８７６）、ＤＭＳＯ中、過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチ
ン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて行った。未反応ビオチンは
、透析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）メンブランＭＷＣＯ５
００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔ
ｏｎ，ＴＸ）。
ｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅ．Ｇｒｏｓｓら編集（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））を使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で合成し、そして、逆相ＨＰＬ
Ｃにより精製した。ペプチド配列は、ＨＡ３０６−３１８、ＰＫＹＶＫＱＧＮＴ
ＬＫＬＡＴ（配列番号１）、ＭＷ１７１８；ＣII２６１−２７３、ＡＧＦＫＧＥ
ＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号２）、ＭＷ１５１６；およびＮ末端およびＣ末端でア
ラニンによりブラケットされたＨＡ３０６−３１８、ＡＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬ
ＡＴＡ（配列番号４）を含む。比較のために、Ｎ末端およびＣ末端をアラニンで
ブラケットされたＣII２６１−２７３ペプチド、ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ（
配列番号３）を合成することができる。ペプチドはまた、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を使用して１μｍスケールで合成する
ことができた。ペプチドは、Ｎ末端に遊離アミノ基、Ｃ末端に遊離カルボキシル
基を有する、そして、スペーサーＳＧＳＧによりＮ末端に結合し、Ｃ末端に遊離
カルボキシル基を有するビオチンを有する、１５マーとして合成した。ペプチド
合成は、コントロールとして２つの標準的なペプチド配列を含むことによりモニ
ターし、それらはＨＰＬＣおよび質量分光分析器に付した。ＨＡ３０６−３１８
ペプチドもまた、結合実験のためのポジティブ・コントロールとして使用した。
ピンペプチドを凍結乾燥し、そしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。これらの条件下で、ペプチドの大部分は完全に溶
解した。ビオチニル化は、記載されたように（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら
、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４
８７２−４８７６）、ＤＭＳＯ中、過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチ
ン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて行った。未反応ビオチンは
、透析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）メンブランＭＷＣＯ５
００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔ
ｏｎ，ＴＸ）。
【００９３】
ＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４分子のグルーブへのＹＥＡＫの結合のためのモ
チーフに基づき合成された１５マーペプチド（配列番号５〜３６、表３参照）は
、ほとんどのペプチドのＮ末端において種々のＥ、Ｋ、およびＡの組み合わせを
有し、続いてＰ１に相当する位置（太字で示す）のＹ、および次に、続く結合ポ
ケット中のＡを含む。配列は、これらのコンセンサス中の位置にしたがって、３
つの異なるグループに分けられる（表３）。グループＩのペプチドは、Ｐ８に相
当する位置にＫを有し、Ｐ１に相当する位置にＹを有する（表３太字）。溶解性
を高めるためにＰ８に相当する位置にリシン（Ｋ）および他の全ての残基にアラ
ニン（Ａ）を有するこのセット中の参照ペプチドは、以前に合成されている（配
列番号５、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ，Ｔ．Ｓ．ら、１９９０年、ＥＭＢＯ Ｊ．９、
１７９７−１８０３）。グループIIのペプチドは、Ｐ１に相当する位置にＹを有
するが、Ｐ８に相当する位置にＡを有していた。グループIIIのペプチドは、Ｈ
Ａ３０６−３１８ペプチドに対して１つまたは２つの残基が移動したアミノ酸チ
ロシン（Ｙ）を有していた。全てのグループのペプチドは、上記の結合モチーフ
において観察されたように、そして溶解性を高めるために１つ以上のグルタミン
酸（Ｅ）および／またはリシン（Ｋ）残基を含む。Ｎ末端がビオチニル化された
非標識のペプチドセットは、これらの研究のために合成された。
チーフに基づき合成された１５マーペプチド（配列番号５〜３６、表３参照）は
、ほとんどのペプチドのＮ末端において種々のＥ、Ｋ、およびＡの組み合わせを
有し、続いてＰ１に相当する位置（太字で示す）のＹ、および次に、続く結合ポ
ケット中のＡを含む。配列は、これらのコンセンサス中の位置にしたがって、３
つの異なるグループに分けられる（表３）。グループＩのペプチドは、Ｐ８に相
当する位置にＫを有し、Ｐ１に相当する位置にＹを有する（表３太字）。溶解性
を高めるためにＰ８に相当する位置にリシン（Ｋ）および他の全ての残基にアラ
ニン（Ａ）を有するこのセット中の参照ペプチドは、以前に合成されている（配
列番号５、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ，Ｔ．Ｓ．ら、１９９０年、ＥＭＢＯ Ｊ．９、
１７９７−１８０３）。グループIIのペプチドは、Ｐ１に相当する位置にＹを有
するが、Ｐ８に相当する位置にＡを有していた。グループIIIのペプチドは、Ｈ
Ａ３０６−３１８ペプチドに対して１つまたは２つの残基が移動したアミノ酸チ
ロシン（Ｙ）を有していた。全てのグループのペプチドは、上記の結合モチーフ
において観察されたように、そして溶解性を高めるために１つ以上のグルタミン
酸（Ｅ）および／またはリシン（Ｋ）残基を含む。Ｎ末端がビオチニル化された
非標識のペプチドセットは、これらの研究のために合成された。
【００９４】
【表３】
【００９５】実施例９
合成１５マーペプチドによるＹＥＡＫおよび抗原のＨＬＡ−ＤＲ分子
への結合の阻害 合成ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４への結合についてＹＥＡＫまた
は高親和性ＨＡ３０６−３１８ペプチドと成功裡に競合し得るかどうかを調べる
ために、ともにビオチニル化されたＹＥＡＫまたはＨＡ３０６−３１８（アラニ
ンでブラケットされた）および非標識阻害剤（ＹＥＡＫおよび合成１５マーペプ
チド）を用いて競合結合アッセイを実施した。速度論研究は、ビオチニル化され
たＹＥＡＫが非標識ＹＥＡＫおよびＨＡ３０６−３１８（ペプチド配列番号４）
の組換えＨＬＡ−ＤＲ１への結合を、グループＩ〜IIIのペプチドよりも良好に
阻害することを示した。しかし、Ｐ８に相当する位置にＫを含むいくつかのペプ
チド（グループＩ）は、Ｐ８に相当する位置にＡを有する類似のペプチド（表３
のグループIIおよびIII）よりも良い阻害剤であった。これに対し、ビオチニル
化されたＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ４分子への結合は、グループＩ〜IIIの多くの
ペプチドにより効率的に阻害されたが、ビオチニル化されたＨＡ３０６−３１８
のＨＬＡ−ＤＲ４への結合は、ＨＡ３０６−３１８または１５マーペプチドより
もＹＥＡＫによってより良好に阻害された。
への結合の阻害 合成ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４への結合についてＹＥＡＫまた
は高親和性ＨＡ３０６−３１８ペプチドと成功裡に競合し得るかどうかを調べる
ために、ともにビオチニル化されたＹＥＡＫまたはＨＡ３０６−３１８（アラニ
ンでブラケットされた）および非標識阻害剤（ＹＥＡＫおよび合成１５マーペプ
チド）を用いて競合結合アッセイを実施した。速度論研究は、ビオチニル化され
たＹＥＡＫが非標識ＹＥＡＫおよびＨＡ３０６−３１８（ペプチド配列番号４）
の組換えＨＬＡ−ＤＲ１への結合を、グループＩ〜IIIのペプチドよりも良好に
阻害することを示した。しかし、Ｐ８に相当する位置にＫを含むいくつかのペプ
チド（グループＩ）は、Ｐ８に相当する位置にＡを有する類似のペプチド（表３
のグループIIおよびIII）よりも良い阻害剤であった。これに対し、ビオチニル
化されたＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ４分子への結合は、グループＩ〜IIIの多くの
ペプチドにより効率的に阻害されたが、ビオチニル化されたＨＡ３０６−３１８
のＨＬＡ−ＤＲ４への結合は、ＨＡ３０６−３１８または１５マーペプチドより
もＹＥＡＫによってより良好に阻害された。
【００９６】
ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、および−ＤＲ４分子への結合に対するＹＥＡＫ、
ＨＡ３０６−３１８またはＣII２６１−２７３の各々との競合における合成１５
マーペプチドの相対的親和性をさらに特徴付けるために、ビオチニル化されたマ
ルチピンペプチドおよび３つの非標識阻害剤を用いて競合結合アッセイを実施し
た。
ＨＡ３０６−３１８またはＣII２６１−２７３の各々との競合における合成１５
マーペプチドの相対的親和性をさらに特徴付けるために、ビオチニル化されたマ
ルチピンペプチドおよび３つの非標識阻害剤を用いて競合結合アッセイを実施し
た。
【００９７】
【表４】
【００９８】
ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４の双方に対するグループＩ〜IIIのペプ
チドの大部分の結合が、非標識ＹＥＡＫ、ＨＡ３０６−３１８（配列番号４）ま
たはＣII２６１−２７３（配列番号２）により阻害されたが、ＨＡ３０６−３１
８（配列番号４）の結合よりも効率的でなかった。しかし、ＹＥＡＫ、ＨＡ３０
６−３１８、またはＣII２６１−２７３よりも、ＨＬＡタンパクへのより高い親
和性を示すペプチドも存在する。
チドの大部分の結合が、非標識ＹＥＡＫ、ＨＡ３０６−３１８（配列番号４）ま
たはＣII２６１−２７３（配列番号２）により阻害されたが、ＨＡ３０６−３１
８（配列番号４）の結合よりも効率的でなかった。しかし、ＹＥＡＫ、ＨＡ３０
６−３１８、またはＣII２６１−２７３よりも、ＨＬＡタンパクへのより高い親
和性を示すペプチドも存在する。
【００９９】
全てのペプチドを、さらに、ＣII特異的Ｔ細胞応答を阻害する能力について試
験した。
験した。
【０１００】実施例１０
１５マー合成ペプチドによるＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４制限Ｃ
II特異的Ｔ細胞応答の阻害 合成ペプチドが自己反応性Ｔ細胞へのＣII２６３−２７３ペプチドの提示の阻
害をもし得るかを決定するために、上記実施例に記載するように、ＡＰＣおよび
ペプチドの複合体を、ＨＬＡ−ＤＲ１（３．１９および１９．３）およびＨＬＡ
−ＤＲ４（３８３８およびＤ３）に制限されたＣII特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ
でテストした。照射されたＡＰＣを、ＣII２６１−２７３および関連したペプチ
ドの各々とともに２時間インキュベートし、Ｔ細胞を添加し、そしてインキュベ
ーションを２４時間続け、そして上清をテストし、Ｔ細胞活性化の目安としてこ
れらのハイブリドーマによるＩＬ−２の分泌量を決定した。
II特異的Ｔ細胞応答の阻害 合成ペプチドが自己反応性Ｔ細胞へのＣII２６３−２７３ペプチドの提示の阻
害をもし得るかを決定するために、上記実施例に記載するように、ＡＰＣおよび
ペプチドの複合体を、ＨＬＡ−ＤＲ１（３．１９および１９．３）およびＨＬＡ
−ＤＲ４（３８３８およびＤ３）に制限されたＣII特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ
でテストした。照射されたＡＰＣを、ＣII２６１−２７３および関連したペプチ
ドの各々とともに２時間インキュベートし、Ｔ細胞を添加し、そしてインキュベ
ーションを２４時間続け、そして上清をテストし、Ｔ細胞活性化の目安としてこ
れらのハイブリドーマによるＩＬ−２の分泌量を決定した。
【０１０１】
ペプチド配列番号１５〜２６は、ＣIIペプチドのためにＡＰＣとしてＨＬＡ−
ＤＲ１でトランスフェクトされたＬ繊維芽細胞を使用し、ＨＬＡ−ＤＲ１制限Ｔ
細胞の最も強力な阻害剤であることが観察された。ペプチド１５、２０、２６、
および２７は、１９．３Ｔ細胞に対する応答を本質的に１００％、ＨＡ３０６−
３１８で観察されるよりも高い阻害レベルまで阻害した。３．１９細胞では、ペ
プチド＃２６による阻害は、ＨＡ３０６−３１８によるものと同程度であった。
ＹＥＡＫは、このＣII特異的Ｔ細胞応答にあまり効果を有さなかった（２０％未
満の阻害）。ＨＡ３０６−３１８（ペプチド配列番号４）は、ＤＲ１ ３．１９
および１９．３Ｔ細胞クローンのいずれをも非常に効率的に阻害した（１９．３
および３．１９細胞について、各々９５％および９８％以上）。これらのデータ
は、配列番号１５、２０、２６、および２７のペプチドは、参照インフルエンザ
ウイルスヘマグルチニンペプチドＨＡ３０６−３１８と同等またはそれよりも良
好なＴ細胞応答の阻害剤であったことを示す。
ＤＲ１でトランスフェクトされたＬ繊維芽細胞を使用し、ＨＬＡ−ＤＲ１制限Ｔ
細胞の最も強力な阻害剤であることが観察された。ペプチド１５、２０、２６、
および２７は、１９．３Ｔ細胞に対する応答を本質的に１００％、ＨＡ３０６−
３１８で観察されるよりも高い阻害レベルまで阻害した。３．１９細胞では、ペ
プチド＃２６による阻害は、ＨＡ３０６−３１８によるものと同程度であった。
ＹＥＡＫは、このＣII特異的Ｔ細胞応答にあまり効果を有さなかった（２０％未
満の阻害）。ＨＡ３０６−３１８（ペプチド配列番号４）は、ＤＲ１ ３．１９
および１９．３Ｔ細胞クローンのいずれをも非常に効率的に阻害した（１９．３
および３．１９細胞について、各々９５％および９８％以上）。これらのデータ
は、配列番号１５、２０、２６、および２７のペプチドは、参照インフルエンザ
ウイルスヘマグルチニンペプチドＨＡ３０６−３１８と同等またはそれよりも良
好なＴ細胞応答の阻害剤であったことを示す。
【０１０２】
ＨＬＡ−ＤＲ４制限Ｔ細胞については、ＨＬＡ−ＤＲ４でトランスフェクトさ
れたＬ繊維芽細胞をＡＰＣとして使用し、以下のパターンの活性を得た：配列番
号６、１１、１６、１７、２２、２３、２７、２８、および３３のペプチドは、
ＤＲ４ ３８３８Ｔ細胞クローンの良好な阻害剤であり、これに対し、Ｄ３クロ
ーンは、配列番号８、１５、１６、１８、および２７のペプチドにより最善に阻
害された。これらのペプチドは、Ｄ３および３８３８細胞において８０％を超え
る阻害のレベルを生じた。ＹＥＡＫは、ＣII特異的Ｔ細胞応答に最小の効果、す
なわち、一貫して２０％未満の阻害しか有さなかった。ＨＡ３０６−３１８（配
列番号４）は、ＤＲ１ ３．１９および１９．３クローンを阻害したよりも、Ｄ
Ｒ４ ３８３８およびＤ３Ｔ細胞クローンの両方をあまり効率的には阻害しなか
った（６０％未満の阻害）。これらのデータは、配列番号８、１５、１６、１８
、および２７のペプチドが、参照インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチ
ドＨＡ３０６−３１８よりも、有意により良好なＴ細胞応答阻害剤であることを
示す。配列番号１５および２７のペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４制限
ＣII特異的Ｔ細胞の両方の高レベルの阻害剤であった。
れたＬ繊維芽細胞をＡＰＣとして使用し、以下のパターンの活性を得た：配列番
号６、１１、１６、１７、２２、２３、２７、２８、および３３のペプチドは、
ＤＲ４ ３８３８Ｔ細胞クローンの良好な阻害剤であり、これに対し、Ｄ３クロ
ーンは、配列番号８、１５、１６、１８、および２７のペプチドにより最善に阻
害された。これらのペプチドは、Ｄ３および３８３８細胞において８０％を超え
る阻害のレベルを生じた。ＹＥＡＫは、ＣII特異的Ｔ細胞応答に最小の効果、す
なわち、一貫して２０％未満の阻害しか有さなかった。ＨＡ３０６−３１８（配
列番号４）は、ＤＲ１ ３．１９および１９．３クローンを阻害したよりも、Ｄ
Ｒ４ ３８３８およびＤ３Ｔ細胞クローンの両方をあまり効率的には阻害しなか
った（６０％未満の阻害）。これらのデータは、配列番号８、１５、１６、１８
、および２７のペプチドが、参照インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチ
ドＨＡ３０６−３１８よりも、有意により良好なＴ細胞応答阻害剤であることを
示す。配列番号１５および２７のペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＤＲ４制限
ＣII特異的Ｔ細胞の両方の高レベルの阻害剤であった。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
各ペプチドについて少なくとも二連で行われたこれらの実施例のデータは、３
２の独特の合成ペプチドのうち、いくつかがＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫ
の組換えＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４への結合を阻害したことを示した。ＨＡ
３０６−３１８またはＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子への結合を阻
害するペプチドは、Ｐ１の位置にＹを含んでいた。Ｐ１のＮ末端側に種々の組み
合わせのＥ、Ａ、およびＫが存在することは、結合の親和性に影響しないようで
あった。後続する残基のうち、Ｐ８におけるＫは、ＨＡ３０６−３１８の阻害に
とって重要であったが、ＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ１への結合には重要ではなかっ
た。ＨＬＡ−ＤＲ１とは対照的に、多くのペプチドが、ＨＡ３０６−３１８およ
びＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ４分子への結合を阻害した。これらのペプチドは、Ｐ
１に相当する位置にＹを含み、そしてＰ８に相当する位置にＫまたはＡのいずれ
かを含んでいたが、他の位置では特異的なアミノ酸の優先性はない。組換えＨＬ
Ａ−ＤＲ４に対するＨＡ３０６−３１８の親和性はＨＬＡ−ＤＲ１分子に対する
ものより低く、ＹＥＡＫの親和性は高く、ヒト血液から精製されたＨＬＡ−ＤＲ
１および−ＤＲ４分子で観察される場合と同様であった。ＨＬＡ−ＤＲ１または
−ＤＲ４のいずれかへのビオチニル化されたペプチドのうちのいくつかの結合は
、ＣII２６１−２７３によっても、ＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫによると
同様に阻害され、これらのペプチドが、全ＹＥＡＫ混合物と同様にＣII反応性Ｔ
細胞への提示について競合し得ることを示す。参照天然ペプチドまたはＹＥＡＫ
混合物と近いかまたはより高い親和性を有するペプチドが、表４および５に、各
々ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４について記載されている。
２の独特の合成ペプチドのうち、いくつかがＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫ
の組換えＨＬＡ−ＤＲ１および−ＤＲ４への結合を阻害したことを示した。ＨＡ
３０６−３１８またはＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ１またはＤＲ４分子への結合を阻
害するペプチドは、Ｐ１の位置にＹを含んでいた。Ｐ１のＮ末端側に種々の組み
合わせのＥ、Ａ、およびＫが存在することは、結合の親和性に影響しないようで
あった。後続する残基のうち、Ｐ８におけるＫは、ＨＡ３０６−３１８の阻害に
とって重要であったが、ＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ１への結合には重要ではなかっ
た。ＨＬＡ−ＤＲ１とは対照的に、多くのペプチドが、ＨＡ３０６−３１８およ
びＹＥＡＫのＨＬＡ−ＤＲ４分子への結合を阻害した。これらのペプチドは、Ｐ
１に相当する位置にＹを含み、そしてＰ８に相当する位置にＫまたはＡのいずれ
かを含んでいたが、他の位置では特異的なアミノ酸の優先性はない。組換えＨＬ
Ａ−ＤＲ４に対するＨＡ３０６−３１８の親和性はＨＬＡ−ＤＲ１分子に対する
ものより低く、ＹＥＡＫの親和性は高く、ヒト血液から精製されたＨＬＡ−ＤＲ
１および−ＤＲ４分子で観察される場合と同様であった。ＨＬＡ−ＤＲ１または
−ＤＲ４のいずれかへのビオチニル化されたペプチドのうちのいくつかの結合は
、ＣII２６１−２７３によっても、ＨＡ３０６−３１８およびＹＥＡＫによると
同様に阻害され、これらのペプチドが、全ＹＥＡＫ混合物と同様にＣII反応性Ｔ
細胞への提示について競合し得ることを示す。参照天然ペプチドまたはＹＥＡＫ
混合物と近いかまたはより高い親和性を有するペプチドが、表４および５に、各
々ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４について記載されている。
【０１０５】
１５マーペプチドの中には、II型コラーゲン特異的Ｔ細胞を阻害するものもあ
った。これらのペプチドは全てＰ１に相当する位置にＹを有し、そしてＰ８に相
当する位置にＫまたはＡのいずれかを有し、他の特異的なパターンは有さなかっ
た。実施例は、Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫからなる群から選択される３つのアミノ酸
からなるいくつかのランダムヘテロポリマーにより強力に阻害されることを示す
。これらのヘテロポリマー、特にＹＡＫは、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１および−Ｄ
Ｒ４分子との結合についてＣII２６１−２７３と競合し、ＣII反応性Ｔ細胞クロ
ーンを阻害した。さらに、ペプチド配列番号８は、直接配列ＹＡＫを含んでおり
、ＹＥＡＫよりも良好にII型コラーゲン反応性Ｔ細胞を阻害し、これは、１つの
配列ＹＡＫを含む、長さ約１５アミノ酸のペプチドが、ヘテロポリマー、ポリ（
Ｙ、Ａ、Ｋ）において見出されるランダムポリペプチドの混合物を置換すること
ができることを示す。
った。これらのペプチドは全てＰ１に相当する位置にＹを有し、そしてＰ８に相
当する位置にＫまたはＡのいずれかを有し、他の特異的なパターンは有さなかっ
た。実施例は、Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫからなる群から選択される３つのアミノ酸
からなるいくつかのランダムヘテロポリマーにより強力に阻害されることを示す
。これらのヘテロポリマー、特にＹＡＫは、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ１および−Ｄ
Ｒ４分子との結合についてＣII２６１−２７３と競合し、ＣII反応性Ｔ細胞クロ
ーンを阻害した。さらに、ペプチド配列番号８は、直接配列ＹＡＫを含んでおり
、ＹＥＡＫよりも良好にII型コラーゲン反応性Ｔ細胞を阻害し、これは、１つの
配列ＹＡＫを含む、長さ約１５アミノ酸のペプチドが、ヘテロポリマー、ポリ（
Ｙ、Ａ、Ｋ）において見出されるランダムポリペプチドの混合物を置換すること
ができることを示す。
【０１０６】
本発明の態様である実施例の結果は、Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫの個々の成分また
は特定のＨＬＡ−ＤＲ分子と適合するアンカー位置の結合モチーフに相当する配
列（Ｐ１に相当する位置におけるＹ）を有するペプチドは、自己免疫性疾患のた
めの効果的な治療薬、ランダムポリペプチドの混合物の代替物として作用し得る
ことを示す。同定された配列の純度の高い、合成された短鎖ポリペプチドを含む
医薬組成物は、個体に投与したときにランダム配列のポリペプチド混合物よりも
少ない副作用を有し得る。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ分子への結合に効果的な特定の
ペプチド配列は、例えば、インビボでの安定性を増加させるためまたは他の所望
の特性を付与するために、ペプチド配列の同方向の繰り返しまたはアミノ酸アナ
ログのような他の分子を含む、より長い配列にすることができる。純度の高い、
合成された、より長い同定された配列を含む医薬組成物は、最良の効力および最
小の毒性を有して、最も効果的であり得る。
は特定のＨＬＡ−ＤＲ分子と適合するアンカー位置の結合モチーフに相当する配
列（Ｐ１に相当する位置におけるＹ）を有するペプチドは、自己免疫性疾患のた
めの効果的な治療薬、ランダムポリペプチドの混合物の代替物として作用し得る
ことを示す。同定された配列の純度の高い、合成された短鎖ポリペプチドを含む
医薬組成物は、個体に投与したときにランダム配列のポリペプチド混合物よりも
少ない副作用を有し得る。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ分子への結合に効果的な特定の
ペプチド配列は、例えば、インビボでの安定性を増加させるためまたは他の所望
の特性を付与するために、ペプチド配列の同方向の繰り返しまたはアミノ酸アナ
ログのような他の分子を含む、より長い配列にすることができる。純度の高い、
合成された、より長い同定された配列を含む医薬組成物は、最良の効力および最
小の毒性を有して、最も効果的であり得る。
【配列表】
【図１】
図１は、異なる競合剤による、空っぽの組換え可溶性ＭＨＣクラスII精製タン
パクに対するビオチン化ヘテロポリマー分子の結合の阻害を示す。図１Ａは、組
換えＨＬＡ−ＤＲ１タンパクに対する結合の阻害を示し、図１Ｂは、組換えＨＬ
Ａ−ＤＲ４タンパクに対する結合の阻害を示す。非標識競合剤（ヘテロポリマー
、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ペプチド３０６−３１８、ま
たはII型コラーゲン（ＣII）ペプチド２６１−２７３）の濃度は、横座標に示さ
れている。各パネルにおいて、ＣII２６１−２７３による阻害は、白丸として示
されており、ＨＡ３０６−３１８による阻害は、黒丸で示されており、示された
３アミノ酸ヘテロポリマーによる阻害は、白または黒三角で示されており、ＹＥ
ＡＫによる阻害は、黒四角で示されている。縦座標に示されている観察された特
異的結合は、以下の式を用いて阻害のパーセンテージとして算出された：阻害の
パーセンテージ＝１００％−［（競合剤ありのシグナル−バックグラウンド）／
（競合剤なしのシグナル−バックグラウンド）×１００］。
パクに対するビオチン化ヘテロポリマー分子の結合の阻害を示す。図１Ａは、組
換えＨＬＡ−ＤＲ１タンパクに対する結合の阻害を示し、図１Ｂは、組換えＨＬ
Ａ−ＤＲ４タンパクに対する結合の阻害を示す。非標識競合剤（ヘテロポリマー
、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ペプチド３０６−３１８、ま
たはII型コラーゲン（ＣII）ペプチド２６１−２７３）の濃度は、横座標に示さ
れている。各パネルにおいて、ＣII２６１−２７３による阻害は、白丸として示
されており、ＨＡ３０６−３１８による阻害は、黒丸で示されており、示された
３アミノ酸ヘテロポリマーによる阻害は、白または黒三角で示されており、ＹＥ
ＡＫによる阻害は、黒四角で示されている。縦座標に示されている観察された特
異的結合は、以下の式を用いて阻害のパーセンテージとして算出された：阻害の
パーセンテージ＝１００％−［（競合剤ありのシグナル−バックグラウンド）／
（競合剤なしのシグナル−バックグラウンド）×１００］。
【図２】
図２は、異なるヘテロポリマーの存在下でのＤＲ−１制限ＣII特異的Ｔ細胞ハ
イブリドーマによるＩＬ−２産生の阻害を示す。照射されたＬ５７．２３細胞（
ＨＬＡ−ＤＲ１をコードする遺伝子でトランスフェクトされた繊維芽細胞）を、
二連でコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）および種々の
濃度（横座標に示されている）のヘテロポリマーと３７℃で２時間共培養し、次
にＴ細胞（示されているとおりのクローン３．１９または１９．３）を添加し、
この混合物をさらに３７℃で２４時間インキュベートした。次に上清（３０μｌ
）を採取し、実施例２に記載したとおりにＩＬ−２依存性細胞毒性Ｔリンパ球（
ＣＴＬ−Ｌ）の増殖によって示されるＩＬ−２産生により測定される活性化につ
いてアッセイした。ＹＡＫによる阻害の度合いは、黒丸として示され、ＹＥＡに
よるものが黒三角、ＹＥＫによるものが白三角、およびＹＥＡＫ（Ｃｏｐ１）に
よるものが黒四角として示されている。縦座標に示されているＣＴＬ−Ｌ増殖の
阻害パーセントは、以下の式を用いて算出された：阻害のパーセンテージ＝１０
０％−［（競合剤ありのシグナル−バックグラウンド）／（競合剤なしのシグナ
ル−バックグラウンド）×１００］。
イブリドーマによるＩＬ−２産生の阻害を示す。照射されたＬ５７．２３細胞（
ＨＬＡ−ＤＲ１をコードする遺伝子でトランスフェクトされた繊維芽細胞）を、
二連でコラーゲンペプチドＣII２６１−２７３（４０μｇ／ｍｌ）および種々の
濃度（横座標に示されている）のヘテロポリマーと３７℃で２時間共培養し、次
にＴ細胞（示されているとおりのクローン３．１９または１９．３）を添加し、
この混合物をさらに３７℃で２４時間インキュベートした。次に上清（３０μｌ
）を採取し、実施例２に記載したとおりにＩＬ−２依存性細胞毒性Ｔリンパ球（
ＣＴＬ−Ｌ）の増殖によって示されるＩＬ−２産生により測定される活性化につ
いてアッセイした。ＹＡＫによる阻害の度合いは、黒丸として示され、ＹＥＡに
よるものが黒三角、ＹＥＫによるものが白三角、およびＹＥＡＫ（Ｃｏｐ１）に
よるものが黒四角として示されている。縦座標に示されているＣＴＬ−Ｌ増殖の
阻害パーセントは、以下の式を用いて算出された：阻害のパーセンテージ＝１０
０％−［（競合剤ありのシグナル−バックグラウンド）／（競合剤なしのシグナ
ル−バックグラウンド）×１００］。
【図３】
図３は、異なるヘテロポリマーの存在下でのＤＲ−４制限ＣII特異的Ｔ細胞ハ
イブリドーマ（３８３８およびＤ３）によるＩＬ−２産生の阻害を示す。図３Ａ
は、照射された３８３８またはＤ３ Ｐｒｉｅｓｓ細胞の共インキュベートの効
果を示し、図３Ｂは、固定濃度４０μｇ／ｍｌでコラーゲンペプチドＣII２６１
−２７３を用いて、種々の濃度の各ヘテロポリマーを用いて、図２と同じ記号を
用いて横座標に示されているように、二連で、３７℃で２時間、ＨＬＡ−ＤＲ４
をコードする遺伝子でトランスフェクトされたＬ細胞をインキュベートすること
の効果を示す。次に、Ｔ細胞を添加し（示されているように、クローン３８３８
またはＤ３）、そして試料を３７℃で２４時間、さらにインキュベートして、図
２に示したようにアッセイした。すべてのアッセイは二連で行った。
イブリドーマ（３８３８およびＤ３）によるＩＬ−２産生の阻害を示す。図３Ａ
は、照射された３８３８またはＤ３ Ｐｒｉｅｓｓ細胞の共インキュベートの効
果を示し、図３Ｂは、固定濃度４０μｇ／ｍｌでコラーゲンペプチドＣII２６１
−２７３を用いて、種々の濃度の各ヘテロポリマーを用いて、図２と同じ記号を
用いて横座標に示されているように、二連で、３７℃で２時間、ＨＬＡ−ＤＲ４
をコードする遺伝子でトランスフェクトされたＬ細胞をインキュベートすること
の効果を示す。次に、Ｔ細胞を添加し（示されているように、クローン３８３８
またはＤ３）、そして試料を３７℃で２４時間、さらにインキュベートして、図
２に示したようにアッセイした。すべてのアッセイは二連で行った。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 19/02
19/02 25/00
25/00 29/00 １０１
29/00 １０１ 37/00
37/00 37/06
37/06 Ｃ０７Ｋ 2/00 ＺＮＡ
Ｃ０７Ｋ 2/00 ＺＮＡ 4/00
4/00 7/08
7/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｉ
Ｌ，ＪＰ
(72)発明者 フリドキス−ハレリ、マーシャ
アメリカ合衆国、マサチューセッツ州
02173、レクシントン、テレサ・アベニュ
ー 10
Ｆターム(参考） 4B064 AG01 CA21 CB05 CD12 DA01
4C084 AA02 BA02 BA08 BA17 BA19
BA20 BA23 CA18 DA58 NA14
ZA021 ZA961 ZB021 ZB082
ZB151 ZC411
4H045 AA10 AA30 BA12 BA13 BA17
EA22 FA34
Claims (40)
- 【請求項１】 芳香族酸、負に荷電したアミノ酸、正に荷電したアミノ酸、
および脂肪族アミノ酸からなるアミノ酸の群から選択される少なくとも３個の残
基を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、長さが少なくとも７アミ
ノ酸残基であり、かつ、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパクに結合
することができる合成ペプチド。 - 【請求項２】 芳香族アミノ酸が、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、および
フェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 正に荷電したアミノ酸がリシン（Ｋ）であり、その配列が、
リシン−チロシン（ＫＹ）、リシン−バリン（ＫＶ）、およびリシン−フェニル
アラニン（ＫＦ）からなる群から選択される、請求項２記載の組成物。 - 【請求項４】 負に荷電したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）であり、その配
列が、グルタミン酸−リシン−チロシン（ＥＫＹ）、グルタミン酸−リシン−バ
リン（ＥＫＶ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニルアラニン（ＥＫＦ）か
らなる群から選択される、請求項３記載の組成物。 - 【請求項５】 脂肪族であるアミノ酸がアラニン（Ａ）であり、その配列が
、グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン（ＥＫＹＡ）、グルタミン酸−リ
シン−バリン−アラニン（ＥＫＶＡ）、およびグルタミン酸−リシン−フェニル
アラニン−アラニン（ＥＫＦＡ）からなる群から選択される、請求項４記載の組
成物。 - 【請求項６】 その配列が、アミノ末端アラニンをさらに含み、その配列が
、アラニン−グルタミン酸−リシン−チロシン−アラニン（ＡＥＫＹＡ）、アラ
ニン−グルタミン酸−リシン−バリン−アラニン（ＡＥＫＶＡ）、およびアラニ
ン−グルタミン酸−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＡＥＫＦＡ）からな
る群から選択される、請求項５記載の組成物。 - 【請求項７】 自己免疫疾患が、関節炎の状態である、請求項６記載の組成
物。 - 【請求項８】 関節炎の状態が、リューマチ性関節炎である、請求項７記載
の組成物。 - 【請求項９】 脂肪族アミノ酸がアラニンであり、アミノ酸配列が、リシン
−グルタミン酸−チロシン−アラニン（ＫＥＹＡ）、リシン−チロシン−アラニ
ン−グルタミン酸（ＫＹＡＥ）、リシン−グルタミン酸−バリン−アラニン（Ｋ
ＥＶＡ）、リシン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＫＶＡＥ）、リシン−グ
ルタミン酸−フェニルアラニン−アラニン（ＫＥＦＡ）、およびリシン−フェニ
ルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＫＦＡＥ）からなる群から選択される、
請求項２記載の組成物。 - 【請求項１０】 脂肪族アミノ酸がアラニン（Ａ）であり、アミノ酸配列が
、リシン−チロシン−アラニン−アラニン（ＫＹＡＡ）またはリシン−リシン−
チロシン−アラニン（ＫＫＹＡ）、リシン−バリン−アラニン−アラニン（ＫＶ
ＡＡ）またはリシン−リシン−バリン−アラニン（ＫＫＶＡ）、リシン−フェニ
ルアラニン−アラニン−アラニン（ＫＦＡＡ）、およびリシン−リシン−フェニ
ルアラニン−アラニン（ＫＫＦＡ）からなる群から選択される、請求項３記載の
組成物。 - 【請求項１１】 ペプチドが、２個のアラニン残基をさらに含み、その配列
が、アラニン−リシン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＹＡＥ）、グ
ルタミン酸−アラニン−リシン−チロシン−アラニン（ＥＡＫＹＡ）、アラニン
−リシン−バリン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＶＡＥ）；およびグルタミン
酸−アラニン−リシン−バリン−アラニン（ＥＡＫＶＡ）、およびアラニン−リ
シン−フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（ＡＫＦＡＥ）；およびグル
タミン酸−アラニン−リシン−フェニルアラニン−アラニン（ＥＡＫＦＡ）から
なる群から選択される、請求項３記載の組成物。 - 【請求項１２】 ペプチドが、７〜１００アミノ酸残基の長さである、請求
項１記載の組成物。 - 【請求項１３】 医薬的に許容可能な担体中で単一用量として製剤化されて
いる、請求項１記載の組成物。 - 【請求項１４】 実質的に純粋である、請求項１記載の組成物。
- 【請求項１５】 II型コラーゲン２６１−２７３ペプチドよりも自己免疫疾
患に関連するＭＨＣクラスIIタンパクの抗原結合グルーブに対してより大きい親
和性を有する、請求項１記載の組成物。 - 【請求項１６】 自己免疫疾患を患う個体において治療活性を有する合成ペ
プチドである組成物であって、ペプチドが、グルタミン酸、リシンおよびアラニ
ン、およびチロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される
アミノ酸、の各アミノ酸の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を有する組成物
。 - 【請求項１７】 ペプチドが、７〜１００アミノ酸の長さである、請求項１
６記載の組成物。 - 【請求項１８】 ペプチドが、７〜５０アミノ酸の長さである、請求項１７
記載の組成物。 - 【請求項１９】 ペプチドが、７〜２５アミノ酸の長さである、請求項１８
記載の組成物。 - 【請求項２０】 ペプチドが、７〜１５アミノ酸の長さである、請求項１９
記載の組成物。 - 【請求項２１】 個体におけるペプチドのプロテアーゼ分解を阻害するのに
充分な量で残基の位置にアミノ酸アナログを含む、請求項１６記載の組成物。 - 【請求項２２】 以下のものからなる群から選択される配列を有する単離さ
れたペプチド組成物：ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号７）、ＡＡＥ
ＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１２）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫＡＡＡＡ
（配列番号１５）、およびＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１８）。 - 【請求項２３】 チロシン（Ｙ）が、バリン（Ｆ）またはフェニルアラニン
（Ｆ）で置換されている、請求項２２記載のペプチドのいずれかの単離されたペ
プチド。 - 【請求項２４】 ペプチドがＭＨＣクラスIIタンパクに対する高親和性を有
し、以下のものからなる群から選択される配列を有する単離されたペプチド組成
物：ＡＥＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号６）、ＡＫＥＹＡＡＡＡＡＡＫ
ＡＡＡＡ（配列番号７）、ＫＥＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１０）、
ＡＥＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１１）、ＡＡＥＹＡＡＡＡＡＡＫＡ
ＡＡＡ（配列番号１２）、ＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１３）、
ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１４）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＫＡ
ＡＡＡ（配列番号１５）、ＥＡＡＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１６）、
ＥＫＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡＡＡＡ（配列番号１７）、ＥＡＫＹＡＡＡＡＡＡＫＡ
ＡＡＡ（配列番号１８）、ＡＫＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２１）、
ＡＡＥＹＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２６）、ＡＡＫＹＥＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡ（配列番号２８）、ＡＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２９）、
ＡＥＹＡＫＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３２）、ＡＥＫＡＹＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡ（配列番号３３）、ＡＹＫＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３５）、
およびＡＫＹＡＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３６）。 - 【請求項２５】 チロシン（Ｙ）が、バリン（Ｆ）またはフェニルアラニン
（Ｆ）で置換されている、請求項２４記載の配列のいずれかの単離されたペプチ
ド。 - 【請求項２６】 個体における自己抗原に対する免疫応答を阻害することが
できるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド組成物であって、ＭＨＣクラス
II ＤＲタンパクのペプチド結合グルーブの抗原結合ポケットに相当するペプチ
ドのアミノ酸配列中の位置が、特定のアミノ酸として同定される、ペプチド組成
物。 - 【請求項２７】 自己抗原が、多発性硬化症および関節炎からなる群から選
択される状態と関連する、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。 - 【請求項２８】 ＭＨＣクラスIIタンパクが、ＭＨＣクラスII ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ１タンパク、およびＭＨＣクラスII ＨＬＡ−ＤＲ４タンパクからなる群から
選択される、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。 - 【請求項２９】 ＭＨＣクラスIIタンパクが、ＭＨＣクラスII ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ２タンパクである、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。 - 【請求項３０】 ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相
当する配列の位置のアミノ酸残基が、チロシン、バリン、およびフェニルアラニ
ンからなる群から選択される、請求項２６記載の単離されたペプチド組成物。 - 【請求項３１】 ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相
当する配列の最初のアミノ酸位置のアミノ酸残基が、アラニンである、請求項２
６記載の単離されたペプチド組成物。 - 【請求項３２】 ＭＨＣクラスIIペプチド結合グルーブのＰ１ポケットに相
当する配列の最初のアミノ酸位置から８残基越えて位置するアミノ酸残基が、リ
シン残基およびアラニン残基からなる群から選択される、請求項２６記載の単離
されたペプチド組成物。 - 【請求項３３】 第一のペプチド配列および第二のペプチド配列を含む医薬
調製物であって、調製物が、ともに請求項２６記載の異なるアミノ酸配列の第一
のペプチドおよび第二のペプチドの医薬的に許容可能な担体中の混合物であり、
第一の配列がさらにリシン残基を有し、第二の配列がＭＨＣクラスIIペプチド結
合グルーブのＰ１ポケットに相当するアミノ酸を越えて８残基に相当するアミノ
酸位置にアラニン残基を有する、調製物。 - 【請求項３４】 以下の工程を含む、個体において治療活性を有する合成ペ
プチドヘテロポリマーの混合物中のＭＨＣクラスII結合モチーフのアミノ酸配列
を得る方法： （ａ）合成ヘテロポリマーの混合物をＭＨＣクラスIIタンパク分子に結合させて
、ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合体を形成させる工程； （ｂ）前記ヘテロポリマー−ＭＨＣタンパク複合体から突出しているヘテロポリ
マーのアミノ末端アミノ酸残基をペプチダーゼ酵素消化により除去して、ヘテロ
ポリマーのアミノ末端をＭＨＣタンパク複合体の辺縁と整列させる工程；および （ｃ）前記複合体を解離させることにより前記整列させたヘテロポリマーをＭＨ
Ｃタンパクから溶出させ、結合モチーフを有するアミノ末端整列ヘテロポリマー
を遊離させる工程。 - 【請求項３５】 付加的な工程（ｄ）が、整列されたヘテロポリマーのアミ
ノ末端配列を決定し、結合モチーフを同定することを含む、請求項３４記載の方
法。 - 【請求項３６】 付加的な工程（ｅ）が、整列されたヘテロポリマーのアミ
ノ末端配列を合成ヘテロポリマー組成物のアミノ酸配列と比較することを含む、
請求項３５記載の方法。 - 【請求項３７】 ＭＨＣクラスIIタンパクが、自己免疫疾患に関連する、請
求項３４記載の方法。 - 【請求項３８】 自己免疫疾患が、関節炎の状態または脱髄状態である、請
求項３７記載の方法。 - 【請求項３９】 付加的な工程（ｅ）が、各ペプチド調製物が結合モチーフ
アミノ酸配列を有する複数のペプチド調製物を合成することを含む、請求項３５
記載の方法。 - 【請求項４０】 付加的な工程（ｆ）が、ＭＨＣクラスIIタンパクに対する
各々の合成ペプチドの親和性を決定することを含む、請求項３９記載の方法。
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