JP6316933B2 - 尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キット - Google Patents
尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キットInfo
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Description
尿試料分析方法を提供する。
本実施形態の尿試料分析方法(以下、単に「方法」ともいう)は、尿中有形成分のうち赤血球、円柱、結晶成分及び粘液糸を分析対象とし、特に円柱及び赤血球の分析に好適である。
本実施形態の尿試料分析用試薬(以下、単に「試薬」ともいう)は、尿試料中の有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための試薬である。本実施形態の試薬は、4mg/L以上50 mg/L以下の濃度で界面活性剤を含む。本実施形態の試薬は、尿試料と当該試薬とを混合して調製された測定試料中の界面活性剤の濃度(終濃度)が2mg/L以上30 mg/L以下、好ましくは4mg/L以上22 mg/L以下となるように、尿試料との混合が行われる試薬である。なお、本実施形態の試薬については、本実施形態の尿試料分析方法に用いた第1試薬について述べたことと同じである。図6に、本実施形態の試薬11の一例を示した。
本実施形態の尿試料分析用試薬キット(以下、単に「試薬キット」ともいう)は、尿試料中の有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための試薬キットである。本実施形態の試薬キットは、4mg/L以上50 mg/L以下の界面活性剤を含む第1試薬と、円柱及び赤血球を染色するための蛍光色素を含む第2試薬とを含む。本実施形態の試薬キットは、尿試料、第1試薬、及び第2試薬を混合して調製された測定試料中の界面活性剤の濃度(終濃度)が2mg/L以上30 mg/L以下、好ましくは4mg/L以上22 mg/L以下となるように、尿試料との混合が行われる試薬キットである。
実施例1では、尿試料から調製した測定試料中の界面活性剤の濃度と、尿中赤血球に及ぼす影響との関係を検討した。
尿試料として、尿沈残渣検査で赤血球を認めた臨床検体を用いた。
・希釈用試薬
希釈用試薬として、下記の組成の希釈液1及び2を調製した。なお、希釈液1及び2には、逆浸透膜で濾過した水を溶媒として用いた。
希釈液1:HEPES-OH(100 mM、pH7)(株式会社同仁化学研究所)、EDTA-2K(25 mM)(中部キレスト株式会社)及びDTAB(50 mg/L)(東京化成工業株式会社)
希釈液2:HEPES-OH(100 mM、pH7)、EDTA-2K(25 mM)及びDTAB(10 mg/L)
シアニン系蛍光色素のDioC3(3)(株式会社林原生物化学研究所)を、1mg/mLの濃度となるようにエチレングリコール(ナカライテスク株式会社)に溶解して、染色用試薬を調製した。
試料の測定はフローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。このフローサイトメータによる測定の具体的な工程は、次のとおりである。まず、尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、染色用試薬(20μL)とを混合し、40℃にて10秒間反応させて測定試料を調製した。測定試料中のDTABの濃度(DTAB終濃度)は、希釈液1を用いた場合は36.25 mg/Lであり、希釈液2を用いた場合は7.25 mg/Lであった。そして、測定試料に光を照射して、前方散乱光強度及び蛍光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。これらの測定値に基づいて、測定試料中の赤血球数をカウントした。結果を、試薬による処理をしていない尿試料に含まれる赤血球数に対する測定試料中の赤血球数の割合(%)として、図1に示す。
実施例2では、フローサイトメータを用いる本実施形態の尿試料分析方法による、円柱に類似する尿中有形成分である粘液糸と、円柱との弁別性能を検討した。
尿試料として、粘液糸を含む尿(尿沈残渣検査で粘液糸を認めた臨床検体。以下、「偽陽性検体」とも呼ぶ)と、円柱及び粘液糸を含む尿(尿沈残渣検査で円柱及び粘液糸を認めた臨床検体。以下、「円柱検体」とも呼ぶ)とを用いた。
・希釈用試薬
希釈用試薬として、下記の組成の希釈液3及び4を調製した。なお、希釈液3及び4には、逆浸透膜で濾過した水を溶媒として用いた。
希釈液3:HEPES-OH(100 mM、pH7)及びEDTA-2K(25 mM)
希釈液4:HEPES-OH(100 mM、pH7)、EDTA-2K(25 mM)及びDTAB(10 mg/L)
・染色用試薬
染色用試薬として、実施例1と同じ染色用試薬を用いた。
尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、染色用試薬(20μL)とを混合し、40℃にて10秒間反応させ測定試料を調製した。そして、得られた測定試料を蛍光顕微鏡BX51(オリンパス株式会社)で目視観察して円柱を計数した。また、同様にして測定試料を調製し、得られた測定試料をフローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)でも測定した。具体的には、測定試料に光を照射して、前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。これらの測定値に基づいて、測定試料中の円柱の数を算出した。結果を表1に示す。なお、蛍光顕微鏡での目視による結果は、希釈液3で処理した試料の円柱の数である。
実施例3では、フローサイトメータを用いる本実施形態の尿試料分析方法の臨床性能を、目視検査の結果と比較して評価した。
尿試料として、顕微鏡観察により円柱が出現していないと判断された陰性尿検体(42検体)を用いた。
希釈用試薬として、実施例2と同じ希釈液3及び4を用いた。染色用試薬として、実施例1と同じ染色用試薬を用いた。
試料の測定は、フローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。このフローサイトメータによる測定の具体的な工程は、次のとおりである。まず、試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、各染色液(20μL)とを混合し、40℃にて10秒間反応させて測定試料を調製した。そして、得られた測定試料に光を照射して、前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。これらの測定値に基づいて測定試料中の円柱の数を算出し、フローサイトメータ(FCM)により陰性と判断された検体数を求めた。また、目視(顕微鏡観察)による陰性検体数をリファレンスとして、FCMによる円柱の分析の特異度を求めた。結果を表2に示す。
実施例4では、尿試料から調製した測定試料中の界面活性剤の濃度と、尿中赤血球に及ぼす影響との関係を検討した。
尿試料として、尿沈残渣検査で赤血球を認めた臨床検体を用いた。
・希釈用試薬
希釈用試薬として、各種の界面活性剤を様々な濃度で含む希釈液のシリーズを調製した。組成は以下のとおりである。なお、各希釈液には、逆浸透膜で濾過した水を溶媒として用いた。
*カチオン性界面活性剤
オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)(東京化成工業)
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)(東京化成工業)
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド(MTAB)(東京化成工業)
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド(DTAC)(東京化成工業)
(ii)下記のノニオン性界面活性剤を1種含む希釈液のシリーズ:HEPES-OH(50 mM、pH7)、EDTA-2K(25 mM)、及びノニオン性界面活性剤(0、5、10、15、20又は30 mg/L)
*ノニオン性界面活性剤
ポリオキシエチレンセチルエーテル(BC-7(日光ケミカルズ))
シアニン系蛍光色素のDiOC3(3)(株式会社林原生物化学研究所)を、1mg/mLの濃度となるようにエチレングリコール(ナカライテスク株式会社)に溶解して、染色用試薬を調製した。
(3-1)カチオン性界面活性剤を1種含む希釈液について
試料の測定はフローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。このフローサイトメータによる測定の具体的な工程は、次のとおりである。まず、尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、染色用試薬(20μL)とを混合し、40℃にて10秒間反応させて測定試料を調製した。測定試料中の界面活性剤の濃度(終濃度)は、0、3.6、7.3、10.9、14.5及び21.8 mg/Lであった。そして、測定試料に光を照射して、前方散乱光強度及び蛍光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。これらの測定値に基づいて、測定試料中の赤血球数をカウントした。結果を図2に示す。
希釈用試薬として、BC-7を含む希釈液のシリーズを用いたこと以外は上記と同様にして、測定試料を調製した。測定試料中の界面活性剤の濃度(終濃度)は、0、3.6、7.3、10.9、14.5及び21.8 mg/Lであった。これらの試料を上記と同様にして測定した。また、比較のため、DTABを含む希釈液のシリーズを用いて、同様に測定試料を測定した。そして、得られた測定値に基づいて、測定試料中の赤血球数をカウントした。結果を図3に示す。
実施例5では、尿試料から調製した測定試料中の界面活性剤の濃度と、円柱に類似した夾雑物を低減する効果との関係を検討した。
尿試料として、円柱を含まないが円柱に類似した夾雑物を含む正常検体を用いた。
・希釈用試薬
希釈用試薬として、各種の界面活性剤を様々な濃度で含む希釈液のシリーズを調製した。組成は以下のとおりである。なお、各希釈液には、逆浸透膜で濾過した水を溶媒として用いた。
*カチオン性界面活性剤
オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)(東京化成工業)
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)(東京化成工業)
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド(MTAB)(東京化成工業)
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド(DTAC)(東京化成工業)
(iv)下記のノニオン性界面活性剤を1種含む希釈液のシリーズ:HEPES-OH(50 mM、pH7)、EDTA-2K(25 mM)、及びノニオン性界面活性剤(0、1、3、5、8、10、20又は50 mg/L)
*ノニオン性界面活性剤
ポリオキシエチレンセチルエーテル(BC-7(日光ケミカルズ))
染色用試薬として、実施例4と同じ染色用試薬を用いた。
(3-1)カチオン性界面活性剤を1種含む希釈液について
試料の測定はフローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。このフローサイトメータによる測定の具体的な工程は、次のとおりである。まず、尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、染色用試薬(20μL)とを混合し、40℃にて10秒間反応させて測定試料を調製した。測定試料中の界面活性剤の濃度(終濃度)は、0、0.7、2.2、3.6、5.8、7.3、14.5及び36.3 mg/Lであった。そして、測定試料に光を照射して、前方散乱光強度及び蛍光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。これらの測定値に基づいて、測定試料中の円柱類似夾雑物の数をカウントした。結果を図4に示す。
希釈用試薬として、BC-7を含む希釈液のシリーズを用いたこと以外は上記と同様にして、測定試料を調製した。測定試料中の界面活性剤の濃度(終濃度)は、0、0.7、2.2、3.6、5.8、7.3、14.5及び36.3 mg/Lであった。これらの試料を上記と同様にして測定した。また、比較のため、DTABを含む希釈液のシリーズを用いて、同様に測定試料を測定した。そして、得られた測定値に基づいて、測定試料中の円柱類似夾雑物の数をカウントした。結果を図5に示す。
22 第1試薬
33 第2試薬
Claims (19)
- 尿試料と、界面活性剤を含む試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、
調製工程で得られた測定試料に含まれる尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する工程と
を含み、調製工程で得られた測定試料中の界面活性剤の濃度が2mg/L以上30 mg/L以下であり、前記界面活性剤が、4級アンモニウム塩型界面活性剤及びピリジニウム塩型界面活性剤であるカチオン性界面活性剤、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルから選択される少なくとも1つである、
尿試料分析方法。 - 調製工程で得られた測定試料中の界面活性剤の濃度が4mg/L以上22 mg/L以下である、請求項1に記載の尿試料分析方法。
- カチオン性界面活性剤が、4級アンモニウム塩型界面活性剤である請求項1又は2に記載の尿試料分析方法。
- 4級アンモニウム塩型界面活性剤が、以下の式(I):
で表される、全炭素数が4〜38の界面活性剤である請求項3に記載の尿試料分析方法。 - 前記式(I)において、R2、R3及びR4のそれぞれがメチル基である請求項4に記載の尿試料分析方法。
- 前記式(I)において、X-がハロゲンイオンであり、臭化物イオン、塩化物イオン及びヨウ化物イオンから選択される少なくとも1つである請求項4又は5に記載の尿試料分析方法。
- 4級アンモニウム塩型界面活性剤が、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、オクチルトリメチルアンモニウムクロライド、及びテトラデシルトリメチルアンモニウムクロライドから選択される少なくとも1つである請求項3〜6のいずれか1項に記載の尿試料分析方法。
- 調製工程において、円柱及び赤血球を染色するための蛍光色素を含む試薬をさらに混合する請求項1〜7のいずれか1項に記載の尿試料分析方法。
- 円柱及び赤血球を染色するための蛍光色素が、シアニン系蛍光色素である請求項8に記載の尿試料分析方法。
- 調製工程で得られた測定試料に含まれる尿中有形成分に光を照射して光学的情報を取得する工程をさらに含み、
検出工程が、取得した光学的情報に基づいて、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する工程である請求項1〜9のいずれか1項に記載の尿試料分析方法。 - 前記光学的情報が、少なくとも散乱光情報を含む請求項10に記載の尿試料分析方法。
- 界面活性剤を含む試薬が、キレート剤をさらに含む請求項1〜11のいずれか1項に記載の尿試料分析方法。
- キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸塩(EDTA塩)である請求項12に記載の尿試料分析方法。
- 4mg/L以上50 mg/L以下の界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、4級アンモニウム塩型界面活性剤及びピリジニウム塩型界面活性剤であるカチオン性界面活性剤、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルから選択される少なくとも1つである、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析用試薬。
- 4mg/L以上50 mg/L以下の界面活性剤を含む第1試薬と、
円柱及び赤血球を染色するための蛍光色素を含む第2試薬と、
を含み、前記界面活性剤が、4級アンモニウム塩型界面活性剤及びピリジニウム塩型界面活性剤であるカチオン性界面活性剤、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルから選択される少なくとも1つである、
尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析用試薬キット。 - 請求項8又は9に記載の尿試料分析方法に用いられ、円柱及び赤血球を染色するための蛍光色素、及び前記蛍光色素を溶解させるための溶媒を含む、試薬。
- 前記溶媒が、水、水溶性有機溶媒及びそれらの混合物から選択される請求項16に記載の試薬。
- 前記水溶性有機溶媒が、炭素数1〜3の低級アルコール、エチレングリコール及びジメチルスルホキシドから選択される請求項17に記載の試薬。
- 前記溶媒が、エチレングリコールである請求項16に記載の試薬。
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