JP2002148261A - 異常細胞分類計数方法 - Google Patents
異常細胞分類計数方法Info
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- JP2002148261A JP2002148261A JP2000341309A JP2000341309A JP2002148261A JP 2002148261 A JP2002148261 A JP 2002148261A JP 2000341309 A JP2000341309 A JP 2000341309A JP 2000341309 A JP2000341309 A JP 2000341309A JP 2002148261 A JP2002148261 A JP 2002148261A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 白血球を測定すると同時に、赤芽球、大型血
小板、溶血抵抗性赤血球、ダメージ白血球、血小板凝集
などの異常細胞を、同時に分類計数する方法を提供す
る。 【解決手段】 （１）血液試料を、赤血球を測定の障害
とならない程度に処理し、白血球と異常細胞を染色に好
適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤からなる水溶
液と混合し、（２）染色することによって少なくとも白
血球と異常細胞の間に蛍光強度の差異を生じる少なくと
も１つの蛍光色素を含む染色液と混合し、染色し、
（２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測
定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍
光を測定し、（４）（３）で測定した散乱光と蛍光の強
度差を用いて白血球の分布領域を設定し、白血球を分類
計数し、（５）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差
を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異常細胞を分類
計数する。
小板、溶血抵抗性赤血球、ダメージ白血球、血小板凝集
などの異常細胞を、同時に分類計数する方法を提供す
る。 【解決手段】 （１）血液試料を、赤血球を測定の障害
とならない程度に処理し、白血球と異常細胞を染色に好
適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤からなる水溶
液と混合し、（２）染色することによって少なくとも白
血球と異常細胞の間に蛍光強度の差異を生じる少なくと
も１つの蛍光色素を含む染色液と混合し、染色し、
（２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測
定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍
光を測定し、（４）（３）で測定した散乱光と蛍光の強
度差を用いて白血球の分布領域を設定し、白血球を分類
計数し、（５）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差
を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異常細胞を分類
計数する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はフローサイトメトリ
による異常細胞の分類計数に関する。
による異常細胞の分類計数に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床検査の分野において、赤芽球、大型
血小板などを測定することは、疾患の診断、予後診断を
行う上で極めて有用な情報を得ることができる。通常、
赤芽球は骨髄中に存在し、末梢血中には存在しない。そ
のため末梢血への赤芽球の出現は、急性骨髄性白血病、
溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、サラセミアなど
の疾患が存在する可能性を示している。大型血小板の出
現については、ITPなどの疾患が存在する可能性を示し
ている。溶血抵抗性赤血球、血小板凝集についても、造
血器疾患が存在する可能性を示している。また、ダメー
ジ白血球は、採血後時間が経過した、保存状態が悪い、
薬物投与などの影響がある可能性を示している。
血小板などを測定することは、疾患の診断、予後診断を
行う上で極めて有用な情報を得ることができる。通常、
赤芽球は骨髄中に存在し、末梢血中には存在しない。そ
のため末梢血への赤芽球の出現は、急性骨髄性白血病、
溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、サラセミアなど
の疾患が存在する可能性を示している。大型血小板の出
現については、ITPなどの疾患が存在する可能性を示し
ている。溶血抵抗性赤血球、血小板凝集についても、造
血器疾患が存在する可能性を示している。また、ダメー
ジ白血球は、採血後時間が経過した、保存状態が悪い、
薬物投与などの影響がある可能性を示している。
【０００３】近年、フローサイトメータの原理を応用し
た種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。
しかしながら、これらの装置は、赤芽球、大型血小板、
溶血抵抗性赤血球、ダメージ白血球、血小板凝集などを
同時に１つの測定チャンネルで測定することはできず、
複数の測定チャンネルを用いて検出していた。また複数
の試薬を使用する必要があり、この場合ランニングコス
トが高くなるという問題がある。
た種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。
しかしながら、これらの装置は、赤芽球、大型血小板、
溶血抵抗性赤血球、ダメージ白血球、血小板凝集などを
同時に１つの測定チャンネルで測定することはできず、
複数の測定チャンネルを用いて検出していた。また複数
の試薬を使用する必要があり、この場合ランニングコス
トが高くなるという問題がある。
【０００４】さらに、全てのチャンネルが、検体測定時
にすべて使用されるわけではなく、ディスクリートされ
て行われることが多い。このような場合、一つの測定法
では、異常細胞に対する十分な検知力を得ることができ
ず、異常細胞を見落とすことがある。
にすべて使用されるわけではなく、ディスクリートされ
て行われることが多い。このような場合、一つの測定法
では、異常細胞に対する十分な検知力を得ることができ
ず、異常細胞を見落とすことがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、白血球を測
定すると同時に、赤芽球、大型血小板、溶血抵抗性赤血
球、ダメージ白血球、血小板凝集などの異常細胞を、同
時に分類計数する方法を提供することを目的とする。
定すると同時に、赤芽球、大型血小板、溶血抵抗性赤血
球、ダメージ白血球、血小板凝集などの異常細胞を、同
時に分類計数する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の工程： （１）赤血球を測定の障害とならない程度に処理し、白
血球と異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤
と界面活性剤からなる水溶液と混合する工程、（２）染
色することによって少なくとも白血球と異常細胞の間に
蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの蛍光色素を含
む染色液と混合し、染色する工程、（３）（２）で調製
した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なく
とも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する
工程、（４）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて白血球の分布領域を設定し、白血球を分類計数す
る工程、（５）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差
を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異常細胞を分類
計数する工程、からなる異常細胞分類計数方法を提供す
る。
血球と異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤
と界面活性剤からなる水溶液と混合する工程、（２）染
色することによって少なくとも白血球と異常細胞の間に
蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの蛍光色素を含
む染色液と混合し、染色する工程、（３）（２）で調製
した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なく
とも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する
工程、（４）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて白血球の分布領域を設定し、白血球を分類計数す
る工程、（５）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差
を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異常細胞を分類
計数する工程、からなる異常細胞分類計数方法を提供す
る。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明でいう血液試料は、末梢血
液、臍帯血、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血
液試料などの体液試料をいう。
液、臍帯血、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血
液試料などの体液試料をいう。
【０００８】溶血抵抗性赤血球とは、一般的に知られる
溶血法などでは、溶解されない赤血球のことをいう。
溶血法などでは、溶解されない赤血球のことをいう。
【０００９】ダメージ白血球とは、採血後時間が経過し
た、または保存状態が悪く、細胞膜に損傷を受けた白血
球のことをいう。
た、または保存状態が悪く、細胞膜に損傷を受けた白血
球のことをいう。
【００１０】本発明ではまず、血液試料を、白血球並び
に異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界
面活性剤からなる溶血剤と混合し、血液試料中の赤血球
を測定の障害とならない程度に溶解する。このために好
適な溶解剤とは、赤血球を溶解するが、白血球細胞への
ダメージの少ない溶解剤であり、例えば、浸透圧１００
ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、ｐＨ２．０〜５．０の水溶液であ
る。
に異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界
面活性剤からなる溶血剤と混合し、血液試料中の赤血球
を測定の障害とならない程度に溶解する。このために好
適な溶解剤とは、赤血球を溶解するが、白血球細胞への
ダメージの少ない溶解剤であり、例えば、浸透圧１００
ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、ｐＨ２．０〜５．０の水溶液であ
る。
【００１１】本工程の目的は、異常細胞と白血球を測定
する上で障害となる赤血球を溶血すること、異常細胞と
白血球の間に蛍光強度の差異を生じさせることである。
する上で障害となる赤血球を溶血すること、異常細胞と
白血球の間に蛍光強度の差異を生じさせることである。
【００１２】赤血球は、若干の個体差があるが、通常１
５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生
じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明と
なる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、測
定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低
いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。本発明で使
用する溶血剤では、個体差考慮して１００ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ以下の浸透圧を使用する。この浸透圧を達成するため
には、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類又
は後述の緩衝剤濃度などにより浸透圧を調整することが
できる。
５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生
じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明と
なる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、測
定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低
いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。本発明で使
用する溶血剤では、個体差考慮して１００ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ以下の浸透圧を使用する。この浸透圧を達成するため
には、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類又
は後述の緩衝剤濃度などにより浸透圧を調整することが
できる。
【００１３】ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、
白血球、赤芽球などの異常細胞にも過度の障害を与える
ため、後述する蛍光強度の差異が得にくくなる。
白血球、赤芽球などの異常細胞にも過度の障害を与える
ため、後述する蛍光強度の差異が得にくくなる。
【００１４】溶血のｐＨは、赤血球の溶血が効率よく行
われるために、酸性側にすることが好適である。特に好
適には、２．０〜５．０のｐＨが使用される。さらに好
適には２．５〜４．５のｐＨが選ばれる。
われるために、酸性側にすることが好適である。特に好
適には、２．０〜５．０のｐＨが使用される。さらに好
適には２．５〜４．５のｐＨが選ばれる。
【００１５】また、ｐＨを一定に保つためには、緩衝剤
を使用することが好適であり、設定するｐＨ±２．０の
付近にｐＫａを有する緩衝剤が使用できる。例えば、ク
エン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロ
ン酸などの緩衝剤を含むことができる。
を使用することが好適であり、設定するｐＨ±２．０の
付近にｐＫａを有する緩衝剤が使用できる。例えば、ク
エン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロ
ン酸などの緩衝剤を含むことができる。
【００１６】さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分
子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくは
その塩を使用することにより、より効果的に（短時間
に）赤血球を溶血することができる。好ましい有機酸も
しくはその塩としては、例えばサリチル酸、サリチル酸
ナトリウム、フタル酸などが挙げられる。これらは、緩
衝剤としても作用する。
子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくは
その塩を使用することにより、より効果的に（短時間
に）赤血球を溶血することができる。好ましい有機酸も
しくはその塩としては、例えばサリチル酸、サリチル酸
ナトリウム、フタル酸などが挙げられる。これらは、緩
衝剤としても作用する。
【００１７】本条件下では、赤芽球の細胞膜も赤血球と
同様に細孔を生じ溶血するが、赤芽球の細胞核の性状
は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。
同様に細孔を生じ溶血するが、赤芽球の細胞核の性状
は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。
【００１８】一方、白血球の細胞膜への傷害は明確では
ないが、光学的顕微鏡による観察では、生細胞と顕著な
差は認められない。
ないが、光学的顕微鏡による観察では、生細胞と顕著な
差は認められない。
【００１９】本発明では、界面活性剤を含むが、界面活
性剤は、難溶性の色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集
防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進の目的で使
用される。
性剤は、難溶性の色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集
防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進の目的で使
用される。
【００２０】しかし、界面活性剤の濃度が高すぎる場
合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球などにも過度の
傷害を与え、特に赤芽球の形状を変化させ、後述する赤
芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくする問題があ
る。
合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球などにも過度の
傷害を与え、特に赤芽球の形状を変化させ、後述する赤
芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくする問題があ
る。
【００２１】従って、本発明に使用する界面活性剤は、
赤芽球を含む異常細胞と白血球の蛍光強度の差異を小さ
くしないように濃度の調整を行った。
赤芽球を含む異常細胞と白血球の蛍光強度の差異を小さ
くしないように濃度の調整を行った。
【００２２】界面活性剤濃度は、１０〜１００００ｍｇ
／ｌにすることが好適である。さらに好適には、１００
〜５０００ｍｇ／ｌの濃度が選ばれる。
／ｌにすることが好適である。さらに好適には、１００
〜５０００ｍｇ／ｌの濃度が選ばれる。
【００２３】この結果、予期せぬことに、従来不可能で
あると考えられてきた、異常細胞と白血球の間の明瞭な
蛍光強度の差異を生じさせ、さらに赤芽球を成熟度ごと
に分類計数することが可能になった。
あると考えられてきた、異常細胞と白血球の間の明瞭な
蛍光強度の差異を生じさせ、さらに赤芽球を成熟度ごと
に分類計数することが可能になった。
【００２４】少なくとも白血球と異常細胞の間に蛍光強
度の差異を生じる蛍光色素とは、以下の群からなる色素
のうち少なくとも１種類が使用される。
度の差異を生じる蛍光色素とは、以下の群からなる色素
のうち少なくとも１種類が使用される。
【００２５】
【化３５】
【００２６】（式中、Ｒ1、Ｒ2、は水素原子又はアルキ
ル基又はアルキニル基又は水酸基で置換されたアルキル
基；Ｙ、Ｚは硫黄又は酸素又は窒素又は低級アルキル基
を有する炭素；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンであ
る。）
ル基又はアルキニル基又は水酸基で置換されたアルキル
基；Ｙ、Ｚは硫黄又は酸素又は窒素又は低級アルキル基
を有する炭素；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンであ
る。）
【００２７】
【化３６】
【００２８】（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；
Ｒ2およびＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アル
コキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又はアルキル基；
Ｚは硫黄、酸素、あるいは低級アルキル基を有する炭
素；ｎは０，１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
Ｒ2およびＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アル
コキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又はアルキル基；
Ｚは硫黄、酸素、あるいは低級アルキル基を有する炭
素；ｎは０，１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【００２９】
【化３７】
【００３０】（式中、Ｒ1は水素原子又はジメチルアミ
ノ基；Ｒ2はアルキル基、Ｒ3は水素原子又はジメチルア
ミノ基；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
ノ基；Ｒ2はアルキル基、Ｒ3は水素原子又はジメチルア
ミノ基；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【００３１】
【化３８】
【００３２】（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；
Ｒ2はジメチルアミノ基；Ｒ3は水素原子又はアミノ基；
Ｒ4は水素原子又はアルキル基又はアミノ基；Ｒ5は水素
原子又はジメチルアミノ基；Ｘ−はアニオン；Ｙは硫黄
又は酸素である。）
Ｒ2はジメチルアミノ基；Ｒ3は水素原子又はアミノ基；
Ｒ4は水素原子又はアルキル基又はアミノ基；Ｒ5は水素
原子又はジメチルアミノ基；Ｘ−はアニオン；Ｙは硫黄
又は酸素である。）
【００３３】
【化３９】
【００３４】（式中、Ｒ1は水素原子又は水酸基；Ｒ2は
水素原子又はスルホン酸基；Ｒ3は水素原子又はスルホ
ン酸基；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。）
水素原子又はスルホン酸基；Ｒ3は水素原子又はスルホ
ン酸基；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。）
【００３５】
【化４０】 NK-2825
【００３６】
【化４１】 NK-1836
【００３７】
【化４２】 NK-1954
【００３８】
【化４３】 Oxazine750
【００３９】
【化４４】 Cryptocyanine
【００４０】
【化４５】 NK-376
【００４１】
【化４６】 NK-382
【００４２】
【化４７】 NK-2711
【００４３】
【化４８】 NK-138
【００４４】
【化４９】 Oxazine720
【００４５】
【化５０】 LDS730
【００４６】
【化５１】 LD700
【００４７】
【化５２】 Nile Blue A
【００４８】
【化５３】 Brilliant Green
【００４９】
【化５４】 Iodide green
【００５０】
【化５５】 Malachite green
【００５１】式中、ヘテロ環の窒素原子又は炭素原子に
結合するアルキル基は、炭素数１−２０、好ましくは、
１−１０、より好ましくは炭素数１−６のアルキル基で
あり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペ
ンチル、ヘキシルなどを挙げることができる。
結合するアルキル基は、炭素数１−２０、好ましくは、
１−１０、より好ましくは炭素数１−６のアルキル基で
あり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペ
ンチル、ヘキシルなどを挙げることができる。
【００５２】低級アルキル基又は低級アルコキシル基と
は炭素数１−８の直鎖又は分岐アルキル基又はアルコキ
シル基であり、好ましくはメチル、エチル、メトキシ、
エトキシである。アシル基としては炭素数１−３のも
の、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニルが好ま
しい。好ましいアニオンには、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ
−などのハロゲンイオン、及びＣＦ3ＳＯ3 -、ＢＦ4 -、
ＣｌＯ4 -などを含む。
は炭素数１−８の直鎖又は分岐アルキル基又はアルコキ
シル基であり、好ましくはメチル、エチル、メトキシ、
エトキシである。アシル基としては炭素数１−３のも
の、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニルが好ま
しい。好ましいアニオンには、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ
−などのハロゲンイオン、及びＣＦ3ＳＯ3 -、ＢＦ4 -、
ＣｌＯ4 -などを含む。
【００５３】上記に記載した色素のうちＮＫシリーズ
は、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ７３０、Ｌ
Ｄ７００はＥｘｃｉｔｏｎ社より、その他のものは市販
品を購入することができる。
は、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ７３０、Ｌ
Ｄ７００はＥｘｃｉｔｏｎ社より、その他のものは市販
品を購入することができる。
【００５４】蛍光色素は、溶血剤に溶解させ、溶血剤と
同時に血液に作用させても（混合させても）良いし、溶
解処理（工程の）後、適当な溶媒（水、低級アルコー
ル、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、等）に溶解したも
のを添加しても良い。色素の濃度は使用する色素により
異なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましく
は０．１〜１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．３〜３．
０ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は溶血剤と色素溶液
を混合した状態での濃度である。
同時に血液に作用させても（混合させても）良いし、溶
解処理（工程の）後、適当な溶媒（水、低級アルコー
ル、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、等）に溶解したも
のを添加しても良い。色素の濃度は使用する色素により
異なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましく
は０．１〜１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．３〜３．
０ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は溶血剤と色素溶液
を混合した状態での濃度である。
【００５５】前述の溶血剤で処理した血球を上述の色素
で染色した場合、白血球は強く染色され、フローサイト
メータで測定した場合強い蛍光を発する。一方、赤芽球
は弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球と赤芽球の
蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、お
そらく赤芽球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色
素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられ
る。
で染色した場合、白血球は強く染色され、フローサイト
メータで測定した場合強い蛍光を発する。一方、赤芽球
は弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球と赤芽球の
蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、お
そらく赤芽球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色
素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられ
る。
【００５６】本発明で使用される界面活性剤としては、
以下の群から少なくとも１種類が好適に使用される。
以下の群から少なくとも１種類が好適に使用される。
【００５７】
【化５６】
【００５８】（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異な
って、Ｈ原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ 6-8のアラルキル
基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基
又はＣ6- 18のアラルキル基；Ｘ-はアニオンである。）
って、Ｈ原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ 6-8のアラルキル
基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基
又はＣ6- 18のアラルキル基；Ｘ-はアニオンである。）
【００５９】
【化５７】
【００６０】（式中、Ｒ1はＣ8-18のアルキル基；Ｘ-は
アニオンである。）
アニオンである。）
【００６１】
【化５８】
【００６２】（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一又は異なって、Ｈ
原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ
3はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ
6-18のアラルキル基；ｎは１又は２である。）
原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ
3はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ
6-18のアラルキル基；ｎは１又は２である。）
【００６３】
【化５９】
【００６４】
【化６０】 MEGA-8
【００６５】
【化６１】 シュクロースモノカプレート
【００６６】
【化６２】 Deoxy-BIGCHAP
【００６７】
【化６３】 ｎ−オクチル−β−D−チオグルコシド
【００６８】
【化６４】 ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド
【００６９】
【化６５】 ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド
【００７０】
【化６６】 ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド
【００７１】
【化６７】 CHAPS
【００７２】
【化６８】 CHAPSO
【００７３】上記の式中、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8
のアラルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ベ
ンジルなどを挙げることができる。好ましくは、メチ
ル、エチルなどのＣ1-3のアルキル基である。
のアラルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ベ
ンジルなどを挙げることができる。好ましくは、メチ
ル、エチルなどのＣ1-3のアルキル基である。
【００７４】Ｃ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル
基又はＣ6-18のアラルキル基としては、オクチル、デシ
ル、ドデシル、テトラデシル、オレイルなどを挙げるこ
とができる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシ
ルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基である。
基又はＣ6-18のアラルキル基としては、オクチル、デシ
ル、ドデシル、テトラデシル、オレイルなどを挙げるこ
とができる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシ
ルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基である。
【００７５】Ｃ8-18のアルキル基としては、デシル、ド
デシル、テトラデシルなどのＣ10-1 8の直鎖のアルキル
基を挙げることができる。
デシル、テトラデシルなどのＣ10-1 8の直鎖のアルキル
基を挙げることができる。
【００７６】また、Ｃ９−２５のアルキル基、アルケニ
ル基又はアルキニル基の例としては、ノニル、ドデシ
ル、ヘキサデシル、オレイル等が挙げられる。
ル基又はアルキニル基の例としては、ノニル、ドデシ
ル、ヘキサデシル、オレイル等が挙げられる。
【００７７】上記に記載した界面活性剤のうち、ＭＥＧ
Ａ−８からＣＨＡＰＳＯまでは株式会社 同仁化学研究
所より購入することができる。
Ａ−８からＣＨＡＰＳＯまでは株式会社 同仁化学研究
所より購入することができる。
【００７８】界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類に
より好適な濃度が異なるが、１０〜１００００ｍｇ／
ｌ、好ましくは１００〜５０００ｍｇ／ｌ、さらには好
ましくは１０００〜３０００ｍｇ／ｌである。なお、こ
の濃度は溶血剤に含まれる界面活性剤の濃度である。
より好適な濃度が異なるが、１０〜１００００ｍｇ／
ｌ、好ましくは１００〜５０００ｍｇ／ｌ、さらには好
ましくは１０００〜３０００ｍｇ／ｌである。なお、こ
の濃度は溶血剤に含まれる界面活性剤の濃度である。
【００７９】本発明の好ましい態様では、サリチル酸な
どの有機酸、色素、及び界面活性剤を精製水に溶解し、
ＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整して得られる
簡単な組成の試薬を用いることができる。試薬と試料を
混合し、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３
〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間反応させる。
どの有機酸、色素、及び界面活性剤を精製水に溶解し、
ＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整して得られる
簡単な組成の試薬を用いることができる。試薬と試料を
混合し、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３
〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間反応させる。
【００８０】このようにして調製した測定用試料をフロ
ーサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、
少なくとも１つの蛍光を測定する。
ーサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、
少なくとも１つの蛍光を測定する。
【００８１】本発明でいう散乱光は、一般に市販される
フローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低
角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方
高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、
側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好まし
くは、前方低角散乱光が選ばれ、この散乱光は白血球の
大きさ情報を反映する。
フローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低
角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方
高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、
側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好まし
くは、前方低角散乱光が選ばれ、この散乱光は白血球の
大きさ情報を反映する。
【００８２】蛍光とは、前述の細胞成分と色素から発せ
られるもので、使用する色素によって好適な受光波長が
選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するも
のである。
られるもので、使用する色素によって好適な受光波長が
選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するも
のである。
【００８３】フローサイトメータの光源は、特に限定さ
れず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例え
ば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半
導体レーザ、青色半導体レーザなどが使用される。特に
半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装
置コストを大幅に下げることができる。
れず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例え
ば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半
導体レーザ、青色半導体レーザなどが使用される。特に
半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装
置コストを大幅に下げることができる。
【００８４】次いで、測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて赤芽球系細胞を分類計数し、赤芽球系細胞を成熟
度ごとに分類計数する。「測定した散乱光と蛍光の強度
差を用いて、赤芽球系細胞を分類計数する工程」とは、
例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってス
キャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すよう
に、赤芽球（NRBC）、白血球（WBC）及びゴースト化し
た細胞（Ghost）の各細胞は、集団（クラスター）を形
成して分布する。そしてこの集団を、適当な解析ソフト
を用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる
細胞数を解析することにより、赤芽球の数と割合を計算
する工程をいう。「赤芽球を成熟度に分類計数する工
程」とは、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光
をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に
示すように、赤芽球は成熟度によって集団（クラスタ
ー）を形成して分布する。Stage I領域は、最も幼若な
赤芽球である前赤芽球と好塩基性赤芽球が分布し、Stag
e II領域は、多染性赤芽球、StageIII領域は、最も成熟
した正染性赤芽球が分布している。また、Stage IV領域
は、脱核直線の赤芽球が分布している。そしてこの集団
を適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、そ
の領域内に含まれる細胞数を解析することにより、赤芽
球の各成熟度での数と割合を算出する工程をいう。
用いて赤芽球系細胞を分類計数し、赤芽球系細胞を成熟
度ごとに分類計数する。「測定した散乱光と蛍光の強度
差を用いて、赤芽球系細胞を分類計数する工程」とは、
例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってス
キャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すよう
に、赤芽球（NRBC）、白血球（WBC）及びゴースト化し
た細胞（Ghost）の各細胞は、集団（クラスター）を形
成して分布する。そしてこの集団を、適当な解析ソフト
を用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる
細胞数を解析することにより、赤芽球の数と割合を計算
する工程をいう。「赤芽球を成熟度に分類計数する工
程」とは、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光
をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に
示すように、赤芽球は成熟度によって集団（クラスタ
ー）を形成して分布する。Stage I領域は、最も幼若な
赤芽球である前赤芽球と好塩基性赤芽球が分布し、Stag
e II領域は、多染性赤芽球、StageIII領域は、最も成熟
した正染性赤芽球が分布している。また、Stage IV領域
は、脱核直線の赤芽球が分布している。そしてこの集団
を適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、そ
の領域内に含まれる細胞数を解析することにより、赤芽
球の各成熟度での数と割合を算出する工程をいう。
【００８５】また、「測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて、血小板凝集を分類計数する工程」とは、例え
ば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってスキャ
ッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、血
小板凝集は、集団（クラスター）を形成して分布する。
そしてこの集団を、適当な解析ソフトを用いて領域を設
定し、その領域内に含まれる細胞数を計数することによ
り、血小板凝集の数と割合を算出する工程をいう。
用いて、血小板凝集を分類計数する工程」とは、例え
ば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってスキャ
ッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、血
小板凝集は、集団（クラスター）を形成して分布する。
そしてこの集団を、適当な解析ソフトを用いて領域を設
定し、その領域内に含まれる細胞数を計数することによ
り、血小板凝集の数と割合を算出する工程をいう。
【００８６】本発明を以下の実施例によってさらに詳し
く説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であ
り、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定
されるものではない。
く説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であ
り、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定
されるものではない。
【００８７】
【実施例】実施例１ 赤芽球出現例 以下の組成の試薬を調製した。 サリチル酸（市販品） １０ｍＭ ＮＫ−２８２５（日本感光色素研究所（株）） ０．３ｍｇ／ｌ ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（市販品） ０．３ｇ／ｌ 精製水 １ｌ ＮａＯＨでｐＨを３．０に調製（浸透圧 ４０ｍＯｓｍ／ｋｇ） 上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した赤芽球が末梢血
に出現した患者の血液を３０μｌを加え、４０℃で５秒
間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱
光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レ
ーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を
測定した。
に出現した患者の血液を３０μｌを加え、４０℃で５秒
間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱
光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レ
ーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を
測定した。
【００８８】図２にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、赤芽球StageI、赤芽球StageII、赤芽球StageIIIの
４つの集団を形成する。
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、赤芽球StageI、赤芽球StageII、赤芽球StageIIIの
４つの集団を形成する。
【００８９】上記の血液にメイグリュンワルド染色を施
した後、顕微鏡により目視を行った。赤芽球を前赤芽
球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分
類し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較し
た。
した後、顕微鏡により目視を行った。赤芽球を前赤芽
球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分
類し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較し
た。
【００９０】図３にフローサイトメータと目視の結果を
示す。図３より、本発明と目視の結果がよく一致してい
ることが判明した。
示す。図３より、本発明と目視の結果がよく一致してい
ることが判明した。
【００９１】実施例２ 赤芽球及び溶血抵抗性赤血球出
現例 メイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視
を行った結果、脱核直前の赤芽球が認められ、市販の血
球計数器で溶血抵抗性と判定された抗凝固剤処理した患
者の血液３０μｌに実施例１の試薬１．０ｍｌを加え、
４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、
前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの
赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の
波長の蛍光を測定した。
現例 メイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視
を行った結果、脱核直前の赤芽球が認められ、市販の血
球計数器で溶血抵抗性と判定された抗凝固剤処理した患
者の血液３０μｌに実施例１の試薬１．０ｍｌを加え、
４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、
前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの
赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の
波長の蛍光を測定した。
【００９２】図４にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、脱核直前の赤芽球、溶血抵抗性赤血球の３つの集団
を形成する。図４より、本発明により脱核直前の赤芽
球、溶血抵抗性赤血球が測定できることが判明した。
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、脱核直前の赤芽球、溶血抵抗性赤血球の３つの集団
を形成する。図４より、本発明により脱核直前の赤芽
球、溶血抵抗性赤血球が測定できることが判明した。
【００９３】実施例３ 血小板凝集出現例 メイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視
を行った結果、血小板凝集が認められた抗凝固剤処理し
た患者の血液３０μｌに 実施例１の試薬１．０ｍｌを
加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメー
タで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３
ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ
以上の波長の蛍光を測定した。
を行った結果、血小板凝集が認められた抗凝固剤処理し
た患者の血液３０μｌに 実施例１の試薬１．０ｍｌを
加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメー
タで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３
ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ
以上の波長の蛍光を測定した。
【００９４】図５にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、血小板凝集の２つの集団を形成する。図５より、本
発明により血小板凝集が測定できることが判明した。
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、血小板凝集の２つの集団を形成する。図５より、本
発明により血小板凝集が測定できることが判明した。
【００９５】実施例４ 大型血小板出現例 メイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視
を行った結果、大型血小板が認められた抗凝固剤処理し
た患者の血液３０μｌに 実施例１の試薬１．０ｍｌを
加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメー
タで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３
ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ
以上の波長の蛍光を測定した。
を行った結果、大型血小板が認められた抗凝固剤処理し
た患者の血液３０μｌに 実施例１の試薬１．０ｍｌを
加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメー
タで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３
ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ
以上の波長の蛍光を測定した。
【００９６】図６にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、大型血小板の２つの集団を形成する。図６より、本
発明により大型血小板が測定できることが判明した。
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、白血
球、大型血小板の２つの集団を形成する。図６より、本
発明により大型血小板が測定できることが判明した。
【００９７】実施例５ 好塩基球出現例 実施例１の試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した好塩基球
が末梢血に出現した患者の血液を３０μｌを加え、４０
℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、前方
低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色
半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長
の蛍光を測定した。
が末梢血に出現した患者の血液を３０μｌを加え、４０
℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、前方
低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色
半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長
の蛍光を測定した。
【００９８】図７にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、好塩
基球、好塩基球以外の白血球の２つの集団を形成する。
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、好塩
基球、好塩基球以外の白血球の２つの集団を形成する。
【００９９】上記の血液にメイグリュンワルド染色を施
した後、顕微鏡により目視を行った。白血球を好塩基
球、好塩基球以外の白血球に分類し、上記フローサイト
メータで得られた結果と比較した。図８にフローサイト
メータと目視の結果を示す。図８より、本発明と目視の
結果がよく一致していることが判明した。
した後、顕微鏡により目視を行った。白血球を好塩基
球、好塩基球以外の白血球に分類し、上記フローサイト
メータで得られた結果と比較した。図８にフローサイト
メータと目視の結果を示す。図８より、本発明と目視の
結果がよく一致していることが判明した。
【０１００】実施例６ ダメージ白血球出現例 実施例１の試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理し、採血後４
８時間経過した末梢血を３０μｌを加え、４０℃で５秒
間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱
光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レ
ーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を
測定した。
８時間経過した末梢血を３０μｌを加え、４０℃で５秒
間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱
光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レ
ーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を
測定した。
【０１０１】図９にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、ダメ
ージ白血球、それ以外の白血球の２つの集団を形成す
る。
散乱光をとったスキャッタグラムを示す。血球は、ダメ
ージ白血球、それ以外の白血球の２つの集団を形成す
る。
【０１０２】
【発明の効果】本発明によれば、白血球を測定すると同
時に、赤芽球、大型血小板、溶血抵抗性赤血球、ダメー
ジ白血球、血小板凝集などの異常細胞を、同時に分類計
数することができる。
時に、赤芽球、大型血小板、溶血抵抗性赤血球、ダメー
ジ白血球、血小板凝集などの異常細胞を、同時に分類計
数することができる。
【図１】本発明の方法によって得られるスキャッタグラ
ムの模式図である。
ムの模式図である。
【図２】本発明の実施例１によって得られるスキャッタ
グラムである。
グラムである。
【図３】本発明の実施例１において本発明と目視の結果
を比較した図である。
を比較した図である。
【図４】本発明の実施例２によって得られるスキャッタ
グラムである。
グラムである。
【図５】本発明の実施例３によって得られるスキャッタ
グラムである。
グラムである。
【図６】本発明の実施例４によって得られるスキャッタ
グラムである。
グラムである。
【図７】本発明の実施例５によって得られるスキャッタ
グラムである。
グラムである。
【図８】本発明の実施例５において本発明と目視の結果
を比較した図である。
を比較した図である。
【図９】本発明の実施例６によって得られるスキャッタ
グラムである。
グラムである。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１１月９日（２０００．１１．
９）
９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の工程： （１）血液試料を、赤血球を測定の障害とならない程度
に処理し、白血球と異常細胞を染色に好適な状態にする
赤血球溶解剤と界面活性剤からなる水溶液と混合する工
程、（２）染色することによって少なくとも白血球と異
常細胞の間に蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの
蛍光色素を含む染色液と混合し、染色する工程、（３）
（２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測
定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍
光を測定する工程、（４）（３）で測定した散乱光と蛍
光の強度差を用いて白血球の分布領域を設定し、白血球
を分類計数する工程、（５）（３）で測定した散乱光と
蛍光の強度差を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異
常細胞を分類計数する工程、からなる異常細胞分類計数
方法を提供する。
に処理し、白血球と異常細胞を染色に好適な状態にする
赤血球溶解剤と界面活性剤からなる水溶液と混合する工
程、（２）染色することによって少なくとも白血球と異
常細胞の間に蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの
蛍光色素を含む染色液と混合し、染色する工程、（３）
（２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測
定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍
光を測定する工程、（４）（３）で測定した散乱光と蛍
光の強度差を用いて白血球の分布領域を設定し、白血球
を分類計数する工程、（５）（３）で測定した散乱光と
蛍光の強度差を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異
常細胞を分類計数する工程、からなる異常細胞分類計数
方法を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｐ // Ｇ０１Ｎ 33/50 33/50 Ｌ (72)発明者 坂田 孝 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 (72)発明者 浜口 行雄 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 EA14 KA02 KA09 LA01 2G045 AA03 AA04 AA07 BA13 BB25 BB29 BB40 CA02 CA03 CA11 CA16 CA22 CA23 CA24 CA25 CB01 FA14 FA37 FB12 GA01 GA02 GA03 GA04 GA10 GC11 GC15 2G054 AA07 AB02 BB08 CA30 CE02 EA03 FA08 GA04 GB02
Claims (9)
- 【請求項１】 以下の工程からなる白血球と少なくとも
１つの異常細胞を分類計数する方法； （１）赤血球を測定の障害とならない程度に処理し、白
血球と異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤
と界面活性剤からなる水溶液と混合する工程、（２）染
色することによって少なくとも白血球と異常細胞の間に
蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの蛍光色素を含
む染色液と混合し、染色する工程、（３）（２）で調製
した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なく
とも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する
工程、（４）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて白血球の分布領域を設定し、白血球を分類計数す
る工程、（５）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差
を用いて異常細胞の分布領域を設定し、異常細胞を分類
計数する工程、 - 【請求項２】 異常細胞が以下の少なくとも１つから選
ばれる請求項１記載の白血球と少なくとも１つの異常細
胞を分類計数する方法； （１）血小板凝集 （２）大型血小板 （３）溶血抵抗性赤血球 （４）ダメージ白血球 （５）赤芽球 - 【請求項３】 白血球が以下の少なくとも１つから選ば
れる請求項１記載の白血球と少なくとも１つの異常細胞
を分類計数する方法； （１）好塩基球 （２）好塩基球を除く白血球 - 【請求項４】 蛍光色素が、以下の群から選ばれる請求
項１記載の白血球と少なくとも１つの異常細胞を分類計
数する方法； 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、は水素原子又はアルキル基又はアル
キニル基又は水酸基で置換されたアルキル基；Ｙ、Ｚは
硫黄又は酸素又は窒素又は低級アルキル基を有する炭
素；ｎは０，１又は２；Ｘ-はアニオンである。） 【化２】 （式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2およびＲ3
は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ
4は水素原子、アシル基又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸
素、あるいは低級アルキル基を有する炭素；ｎは０，１
又は２；Ｘ-はアニオンである。） 【化３】 （式中、Ｒ1は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ2はア
ルキル基、Ｒ3は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは
１又は２；Ｘ-はアニオンである。） 【化４】 （式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2はジメチル
アミノ基；Ｒ3は水素原子又はアミノ基；Ｒ4は水素原子
又はアルキル基又はアミノ基；Ｒ5は水素原子又はジメ
チルアミノ基；Ｘ−はアニオン；Ｙは硫黄又は酸素であ
る。） 【化５】 （式中、Ｒ1は水素原子又は水酸基；Ｒ2は水素原子又は
スルホン酸基；Ｒ3は水素原子又はスルホン酸基；Ｙ+は
アルカリ金属イオンである。） 【化６】 NK-2825 【化７】 NK-1836 【化８】 NK-1954 【化９】 Oxazine750 【化１０】 Cryptocyanine 【化１１】 NK-376 【化１２】 NK-382 【化１３】 NK-2711 【化１４】 NK-138 【化１５】 Oxazine720 【化１６】 LDS730 【化１７】 LD700 【化１８】 Nile Blue A 【化１９】 Brilliant Green 【化２０】 Iodide green 【化２１】 Malachite green - 【請求項５】 赤血球溶解剤が浸透圧１００ｍＯｓｍ／
ｋｇ以下のｐＨ２．０〜５．０の水溶液である請求項１
記載の白血球と少なくとも１つの異常細胞を分類計数す
る方法。 - 【請求項６】 界面活性剤が、以下の群から選ばれる請
求項１記載の白血球と少なくとも１つの異常細胞を分類
計数する方法。 【化２２】 （式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、Ｈ原
子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ 6-8のアラルキル基；Ｒ4は
Ｃ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6- 18
のアラルキル基；Ｘ-はアニオンである。） 【化２３】 （式中、Ｒ1はＣ8-18のアルキル基；Ｘ-はアニオンであ
る。） 【化２４】 （式中、Ｒ1、Ｒ2は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1-8
のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ3はＣ8-18の
アルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラル
キル基；ｎは１又は２である。） 【化２５】 【化２６】 MEGA-8 【化２７】 シュクロースモノカプレート 【化２８】 Deoxy-BIGCHAP 【化２９】 ｎ−オクチル−β−D−チオグルコシド 【化３０】 ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド 【化３１】 ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド 【化３２】 ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド 【化３３】 CHAPS 【化３４】 CHAPSO - 【請求項７】 界面活性剤濃度が１０〜１００００ｍｇ
／ｌである請求項１記載の白血球と少なくとも１つの異
常細胞を分類計数する方法。 - 【請求項８】 以下の工程からなる白血球と少なくとも
１つの異常細胞を分類計数する方法； （１）赤血球を測定の障害とならない程度に処理し、白
血球と異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤
と界面活性剤からなる水溶液と混合する工程、（２）染
色することによって少なくとも白血球と異常細胞の間に
蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの蛍光色素を含
む染色液と混合し、染色する工程、（３）（２）で調製
した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なく
とも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する
工程、（４）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて好塩基球を除く白血球の分布領域を設定し、好塩
基球を除く白血球を分類計数する工程、（５）（３）で
測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて血小板凝集の分
布領域を設定し、血小板凝集を分類計数する工程、
（６）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて
大型血小板の分布領域を設定し、大型血小板を分類計数
する工程、（７）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度
差を用いて溶血抵抗性赤血球の分布領域を設定し、溶血
抵抗性赤血球を分類計数する工程、（８）（３）で測定
した散乱光と蛍光の強度差を用いてダメージ白血球の分
布領域を設定し、ダメージ白血球を分類計数する工程、
（９）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて
赤芽球の分布領域を設定し、赤芽球を分類計数する工
程、（１０）（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を
用いて赤芽球を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数
する工程、（１１）（４）で分類計数した白血球と、
（９）で分類計数した赤芽球より、白血球に対する赤芽
球の割合を算出する工程、（１２）（９）で分類計数し
た赤芽球数と、（１０）で成熟度ごとに少なくとも２つ
に分類計数した赤芽球数から全赤芽球に対する成熟度ご
との赤芽球に対する割合を算出する工程、（１３）
（３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて好塩基
球の分布領域を設定し、好塩基球を分類計数する工程。 - 【請求項９】 測定する散乱光が、前方低角散乱光、前
方高角散乱光及び側方散乱光から選ばれる少なくとも１
つである請求項１〜８記載の異常細胞分類計数方法。
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