JP4797349B2 - ビタミンb6酵素を用いた試薬の安定化法およびその試薬 - Google Patents
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1.ビタミンB6酵素と該ビタミンB6酵素の補酵素を含む少なくとも2つのパーツを有する試薬であって、ビタミンB6酵素と、ビタミンB6酵素の補酵素を別々のパーツに処方してなる試薬。
2. ビタミンB6酵素がチロシンデカルボキシラーゼである、項1に記載の試薬。
3. 補酵素がピリドキサール5リン酸である、項1に記載の試薬。
4. ビタミンB6酵素を用いた試薬がチロシン測定試薬である、請求項1〜3のいずれかに記載の試薬。
5. ビタミンB6酵素と該酵素の補酵素を含む試薬においてビタミンB6酵素の補酵素を安定化する方法及び試薬であって、貯蔵中の構成として、ビタミンB6酵素とビタミンB6酵素の補酵素を別々に処方することを特徴とする、方法及び試薬。
6. ビタミンB6酵素がチロシンデカルボキシラーゼである、項5に記載の方法及び試薬。
7. 補酵素がピリドキサール5リン酸である、項5に記載の方法及び試薬。
8. ビタミンB6酵素を用いた試薬がチロシン測定試薬である、項5〜7のいずれかに記載の方法及び試薬。
補酵素の結合していないビタミンB6酵素(アポ型酵素)とその補酵素を1つのパーツに共存させると、保存中にビタミンB6酵素(アポ型酵素)とその補酵素が結合してホロ型酵素になる。
ビタミンB6酵素(アポ型酵素)とその補酵素を使用直前に混合した場合、ビタミンB6酵素の活性発現は低下は見られず、該酵素の活性発現は安定化される。この現象の1つの解釈として、本発明者はビタミンB6酵素(アポ型酵素)は劣化した補酵素よりも劣化していない補酵素と選択的に結合するため、保存中に補酵素の一部が劣化したとしても、ビタミンB6酵素(ホロ型酵素)の活性低下は起こらないと考えている。
具体的には、検体中のチロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させるとチラミンとCO2に変換され、次いでチラミンオキシダーゼを作用させると、4−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとNH3とH2O2に分解される。生成したH2O2をペルオキシダーゼの作用下に4-アミノアンチピリンとEHSPTを酸化縮合させ、得られたキノン色素を吸光度測定し、チロシン量を測定することができる。
・ ビタミンB6酵素(第一試薬にペルオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、第二試薬はチラミンデカルボキシラーゼ);
・ 補酵素(ビタミンB6)
・ ペルオキシダーゼの存在下で発生した過酸化水素と反応して可視化される色素系(例えば第一試薬にN-エチル(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジン、第二試薬に4-アミノアンチピリン);及び
・ 緩衝剤。
本発明で用いられるビタミンB6酵素の起原は特に限定されず、活性発現や構造の維持などに可逆的に補酵素を必要とするものであれば、微生物、植物または動物のいずれの起原のものも用いることが可能である。これらは種々の市販のものを使用することができる。或いは公知の方法によって該酵素を生産する細胞(微生物など)を培養し得られた培養物を精製することによっても入手できる。さらに、小麦胚芽抽出物などを用いた無細胞蛋白合成系を用いて製造することもできる。また、公知の方法によって、上記により得られた酵素のアミノ酸配列を改変したり、化学修飾を行ったものも、活性発現や構造の維持などに可逆的に電解質を必要とするものであれば、何ら問題なく使用できる。或いは、天然の状態ではもともと活性発現や構造の維持などに電解質を必要としなかった酵素に公知の方法によって改変を加えて電解質を必要としたものも本発明に用いることができる。
ヘキサ(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−4,4,4−トリアミノトリフェニルメタン、
ヘキサ(3−スルホプロピル)−4,4,4−トリアミノトリフェニルメタン、
ビス(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)トルイジン等が挙げられる。
(実施例1)
下記のチロシン測定試薬を10℃、7日間保存し、チロシンデカルボキシラーゼ(アポ化型酵素)の残存活性(調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。比較例では、下記組成より第一試薬のピリドキサール5-リン酸エステルを添加せず、第二試薬にピリドキサール5-リン酸エステル 40μmol/L添加した試薬を同様に検討した。
(試薬の調製)
下記組成からなるチロシン測定試薬を調製した。
第一試薬
マックィルバイン緩衝液 50mM pH6.0
トリトンX−100 1g/L
TOOS 1g/L
フラビンアデニンジヌクレオチド2Na塩 8μmol/L
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 3U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製ASO−311) 1U/mL
チラミンオキシダーゼ(東洋紡社製TYO−301) 0.3U/mL
ピリドキサール5-リン酸エステル 10μmol/L
第ニ試薬
マックィルバイン緩衝液 50mM pH6.0
トリトンX−100 1g/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
チロシンデカルボキシラーゼ 1.2U/mL
(実施例2)
実施例1のチロシン測定試薬を10℃、11日間保存し、下記の測定法にて試料として精製水、200μmol/Lチロシン水溶液を測定し200μmol/Lチロシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度(感度)を算出し調製直後のその吸光度と比較し相対パーセントを求めた。比較例では、下記組成より第一試薬のピリドキサール5-リン酸エステルを添加せず、第二試薬にピリドキサール5-リン酸エステル 40μmol/L添加した試薬を同様に検討した。
(測定法)
日立7170形自動分析機を用いた。試料2.5μLに第一試薬 200μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を50μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で570nmにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および200μmol/LL-チロシン水溶液の測定吸光度より算出しチロシン濃度として求めた。
(実施例3)
実施例1のチロシン測定試薬の調製直後および10℃、7日間保存した試薬、各々について、実施例2に記載の測定法にて同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清QAPトロールIIX(シスメックス社)にL-チロシンを終濃度100μmol/Lになるように添加したものを試料とし繰返しn=20で測定し変動係数CV(%)を算出した。比較例では、下記組成より第一試薬のピリドキサール5-リン酸エステルを添加せず、第二試薬にピリドキサール5-リン酸エステル 40μmol/L添加した試薬を同様に検討した。
Claims (4)
- チロシンデカルボキシラーゼとピリドキサール5リン酸を含む少なくとも2つのパーツを有する試薬であって、チロシンデカルボキシラーゼと、ピリドキサール5リン酸を別々のパーツに処方してなる試薬。
- チロシンデカルボキシラーゼを用いた試薬がチロシン測定試薬である、請求項1に記載の試薬。
- チロシンデカルボキシラーゼとピリドキサール5リン酸を含む試薬においてピリドキサール5リン酸を安定化する方法であって、貯蔵中の構成として、チロシンデカルボキシラーゼとピリドキサール5リン酸を別々に処方することを特徴とする、方法。
- チロシンデカルボキシラーゼを用いた試薬がチロシン測定試薬である、請求項3に記載の方法。
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