JP2001349894A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カラム耐久性が良く、しかも、安定型ＨｂＡ
１ｃを、精度良く短時間で分離可能なヘモグロビン類の
測定方法を提供する。 【解決手段】 カチオン交換液体クロマトグラフィー
によるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピ
ックイオンを含有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能
を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含有す
る溶離液を用い、カラム圧力を９．８×１０⁴Ｐａ〜
３．９×１０⁶Ｐａに設定して測定を行うことを特徴と
するヘモグロビン類の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カチオン交換液体
クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃ
という）は、血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグ
ロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去
１〜２カ月間の血液中の平均的な血糖値（血液中のグル
コース濃度）を反映する。このため、ＨｂＡ１ｃは、糖
尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態
を把握する等の糖尿病診断の指標として広く利用されて
いる。

【０００３】ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモ
グロビンＡ（以下、ＨｂＡという）とが、反応して生成
された糖化ヘモグロビン（以下、ＧＨｂという）であ
り、これが可逆的に反応したものを不安定型ヘモグロビ
ンＡ１ｃ（unstable HbA1c：以下、不安定型ＨｂＡ１ｃ
という）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に
反応したものを安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（stable HbA
1c：以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）と呼んでいる。そ
して、上記糖尿病診断の指標としては、安定型ＨｂＡ１
ｃを用いることが好ましく、臨床検査分野では、高精度
で、しかも、短時間に安定型ＨｂＡ１ｃの比率を測定し
うる方法の開発が望まれていた。

【０００４】従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一
般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられてお
り、液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定
は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により
行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血
液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分
離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１
ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂ
という）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不
安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビ
ンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）の順に溶出される。

【０００５】このうち、糖尿病の診断の指標として使用
されるのは、最近では、上記したとおり安定型ＨｂＡ１
ｃであり、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピー
クの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率
（％）として求められている。

【０００６】従って、安定型ＨｂＡ１ｃ値を正確に測定
するためには、安定型ＨｂＡ１ｃのピークのみを高精度
に分離する技術が必要であるが、従来においては、安定
型ＨｂＡ１ｃのピークの近傍に出現する不安定型ＨｂＡ
１ｃのピークやアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂ
という）、カルバミル化ヘモグロビン（以下ＣＨｂとい
う）などの修飾ヘモグロビンのピークと、安定型ＨｂＡ
１ｃのピークとを高精度かつ短時間に分離するのは極め
て困難とされていた。

【０００７】そこで、特開昭６３−２９８０６３号公報
に記載があるように、赤血球および／または、ヘモグロ
ビンを含む試料を、リン酸縮合体および／またはリン酸
縮合体の塩を含む解離溶媒質と接触させて、不安定型ヘ
モグロビンをヘモグロビンとグルコースに解離して測定
する方法が従来より知られている。しかしながら、この
方法では、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分となり、測
定精度が悪いという欠点があった。

【０００８】一方、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグ
ロビンと、安定型ＨｂＡ１ｃとを測定時間２．２分とい
う短時間で分離できる方法も開発されている（全自動グ
リコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ型の基
礎的検討：日本臨床自動化学会会誌 ２１ （１９９
６） ８４０−８４３）。

【０００９】この方法は、上述の従来法における解離剤
を用いずに、非多孔性充填剤を用い、しかも、充填剤の
粒径を２．５μｍと非常に小さくして測定サンプルのカ
ラム内での拡散を小さくすることにより、安定型ＨｂＡ
１ｃの分離を可能にしている。しかし、このような、粒
径の非常に小さい充填剤を充填したカラムをヘモグロビ
ン類の測定に用いると、測定初期のカラム圧力が非常に
高い（例えば、約９．８×１０⁶Ｐａ）ため測定装置に
耐圧性が必要になりコストアップになるという欠点が存
在した。

【００１０】また、連続測定したとき、目詰まりが大き
いためカラム圧力上昇が高く、カラム耐久性が悪いとい
う欠点があった。さらに、この方法においては、充填剤
の粒径を大きくすることによりカラム圧力を低くする
と、測定サンプルがカラム内で拡散し分離が不十分にな
ってしまう問題点があった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来におけるヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑
み、カラム耐久性が良く、しかも、安定型ＨｂＡ１ｃ
を、精度良く短時間で分離可能なヘモグロビン類の測定
方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロ
ビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含
有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶離液を用
い、カラム圧力を９．８×１０⁴Ｐａ〜３．９×１０⁶Ｐ
ａに設定して測定を行うことを特徴とするヘモグロビン
類の測定方法である。

【００１３】請求項２記載の発明は、請求項１記載のヘ
モグロビン類の測定方法であって、グラディエント溶出
法を用いて上記溶離液の送液を行なうことを特徴とする
ヘモグロビン類の測定方法である。

【００１４】以下、本発明について詳説する。

【００１５】本発明においては、カオトロピックイオ
ン、及び、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶離液を用い
る。この溶離液は、単一種の溶離液であってもよいが、
好ましくは、溶出力が異なる、例えばカオトロピックイ
オンの濃度やｐＨが異なる、２種以上の溶離液を用い
る。

【００１６】上記カオトロピックイオンとは、水溶液に
解離して生じたイオンにより水の構造が破壊され、疎水
性物質と水が接触したときに起こる、水のエントロピー
減少を抑制するものである。

【００１７】具体的には、陰イオンのカオトロピックイ
オンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸
イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素
酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イ
オン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、またそ
の他に尿素等が挙げられる。

【００１８】また、陽イオンのカオトロピックイオンと
しては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシ
ウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウ
ムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。

【００１９】上記カオトロピックイオンの中でも、安定
型ＨｂＡ１ｃの測定精度をより向上させるために、好ま
しくは、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、ト
リクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イ
オン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオ
ン、臭化物イオン等が挙げられ、陽イオンとしては、バ
リウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオ
ン等が用いられる。より好ましくは、トリブロモ酢酸イ
オン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、過
塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用い
られる。

【００２０】また、これらカオトロピックイオンは、単
一種で用いても、また複数種混合して用いてもよい。

【００２１】上記カオトロピックイオンの溶離液中の濃
度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、より好ま
しくは１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭ
〜５００ｍＭである。これは、濃度が０．１ｍＭ未満で
あると、ヘモグロビン類の測定において、分離効果が低
下し測定精度が悪くなるためであり、また、濃度が３０
００ｍＭを超えてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以
上向上しないためである。

【００２２】また、カオトロピックイオンを溶離液以外
の測定試料と接触する液、例えば、試料希釈液、溶血液
等に添加して用いてもよい。

【００２３】本発明における上記ｐＨ４．０〜６．８で
緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩と
しては、以下のものが挙げられる。

【００２４】上記無機酸としては、例えば、リン酸、炭
酸等が挙げられる。また、上記有機酸としては、例え
ば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒ
ドロキシカルボン酸、カコジル酸、アミノ酸、ピロリン
酸等が挙げられる。

【００２５】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸として
は、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−
ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が
挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミ
ノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン
等が挙げられる。

【００２６】上記無機酸または有機酸の塩としては、公
知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が
挙げられる。

【００２７】上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩は、単独種でもまた、複数種混合して用いても良い。

【００２８】上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩の溶離液中の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液
のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用がある範囲であ
ればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、よ
り好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭである。

【００２９】本発明における溶離液のｐＨは、４．０〜
６．８であり、より好ましくは４．５〜５．８である。
ｐＨが４．０未満では、ヘモグロビンが変性する可能性
があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプ
ラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持されにくくな
り、分離能が悪くなるためである。

【００３０】上記溶離液には、以下に示す（１）無機塩
類、（２）ｐＨ調節剤、（３）有機溶媒、（４）安定
剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤、（７）防腐剤
等を添加してもよい。

【００３１】（１）無機塩類としては、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウ
ム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類
の溶離液中の濃度は、特に限定されないが、好ましくは
１〜１５００ｍＭである。

【００３２】（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基
を添加してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン
酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水
酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム
等が挙げられる。これらの酸、塩基の溶離液中の濃度
は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５
００ｍＭである。

【００３３】（３）メタノール、エタノール、アセトニ
トリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよ
い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、
好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオ
ン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度
で用いるのが好ましい。

【００３４】（４）ヘモグロビンの安定剤として、公知
の安定剤を添加してもよい。該安定剤としては、例え
ば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート
剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化
防止剤等が挙げられる。

【００３５】（５）ヘモグロビンの非特異的吸着を少な
くするために、アミン類を添加してもよい。該アミン類
としては、公知のものが用いられ、好ましくは、分子量
２０〜５００の第１級アミン、第２級アミン及び第３級
アミンが挙げられる。

【００３６】（６）界面活性剤として、ノニオン性界面
活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤
等を添加してもよい。界面活性剤を用いることにより、
溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試
薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。上記界面活
性剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、
例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチ
レンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で
表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）
ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテ
ル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ
（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテ
ル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セ
チルステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニ
ルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モ
ノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタ
ン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソル
ビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯ
Ｅ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モ
ノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン
酸ソルビタン等が挙げられる。これらの界面活性剤は、
単独種でもまた複数種混合して用いてもよい。これらの
界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重量
％である。

【００３７】（７）防腐剤として、アジ化ナトリウム、
チモールなどを添加しても良い。

【００３８】本発明では、溶出力が異なる２種以上の溶
離液を用いる場合、これらの溶離液をグラディエント溶
出法により送液を行うのがより好ましい。グラディエン
ト溶出法としては、例えば、段階溶出法（ステップアッ
プグラディエント溶出）、リニアグラディエント溶出
法、または、それらを組み合わす方法があり、いずれの
方法にも限定されるものではない。

【００３９】上記段階溶出法によって測定を行う場合の
クロマトグラフィー装置の構成例を図１に示した。溶離
液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる溶離液であ
り、電磁弁１によって設定時間ごとに各溶離液に切り替
えられるように、構成されている。溶離液は、送液ポン
プ２により、試料注入部３から導入された試料とともに
カラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出され
る。各ピーク面積、高さ等はインテグレータ６により算
出される。

【００４０】本発明の測定方法により分離されるヘモグ
ロビン類のうち、ＨｂＡ等からなるＨｂＡ０は、ＨｂＡ
１ｃより後に溶出し、強く充填剤に保持されるため、測
定時間を長くさせる傾向にある。このため、ＨｂＡ０の
溶出には、上述の溶離液よりも溶出力の強い溶離液、す
なわちｐＨがヘモグロビン等電点（ヘモグロビンの等電
点については、理化学事典（第４版、１９８７年９月、
岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載あるよ
うに、ｐＨ６．８〜７である）よりアルカリ側にある溶
離液を用いるのが好ましい。

【００４１】すなわち、溶離液のｐＨが、ヘモグロビン
の等電点より酸性側からアルカリ性側に変わることによ
って、ヘモグロビンの表面の総電荷がプラスからマイナ
スに変わり、これによって充填剤表面のカチオン交換基
との電気的反発がおこり、ＨｂＡ０成分を迅速に溶出す
ることができるのである。

【００４２】上記の如くＨｂＡ０成分を溶出するための
溶離液としては、カラム耐久性の向上と測定時間短縮の
ため、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電
点よりアルカリ側になるように、ｐＨを６．８以上に設
定した少なくとも１種以上の緩衝液を用いるのが好まし
い。

【００４３】上記溶離液のｐＨは、好ましくは７〜１２
であり、さらに好ましくは、７．５〜１１、またさらに
好ましくは８〜９．５である。これは、溶離液のｐＨが
６．８以下になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となり
易く、ｐＨが１２より高いと充填剤の分解が考えられる
ためである。また、充填剤の分解が測定に影響ない場合
は、溶離液のｐＨを１２以上にするのが好ましく、より
好ましくは、１０〜１３．５である。但し、溶離液のｐ
Ｈを１２以上にした時、充填剤の分解が測定に影響する
場合であっても、溶離液を流す時間を短くすることによ
り、充填剤の分解を最小限に抑えることができる。

【００４４】ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、
ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例え
ば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；
クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチル
グルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカ
ルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩から
なる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリ
ノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−
（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒ
ｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａ
ｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリ
シルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド
（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。ま
た、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴ
Ａ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダ
ゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルア
ミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等
の有機物も使用できる。

【００４５】上記の無機酸・有機酸、あるいはその塩ま
たは有機物等の濃度は、水に溶解された状態で溶離液の
ｐＨを６．８以上にする緩衝作用がある範囲であればよ
く、好ましくは、１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好
ましくは１０〜５００ｍＭである。

【００４６】また、より効果的にＨｂＡ０成分を、溶出
するためには、上記ＨｂＡ０の溶出に好適に用いられる
溶離液に、カオトロピックイオンを添加することが好ま
しい。上記カオトロピックイオンは、前述したのと同様
のものを用いることができる。カオトロピックイオンの
溶離液中の濃度は、１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、
より好ましくは１０ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましく
は、５０ｍＭ〜５００ｍＭである。

【００４７】上記溶離液には、前述した溶離液に添加さ
れるのと同様の各種添加剤、例えば、（１）無機塩類、
（２）ｐＨ調節剤、（３）有機溶媒、（４）安定剤、
（５）アミン類、（６）界面活性剤、（７）防腐剤等を
添加してもよい。

【００４８】本発明においては、カラム圧力を９．８×
１０⁴Ｐａ〜３．９×１０⁶Ｐａ（１ｋｇｆ／ｃｍ²〜４
０ｋｇｆ／ｃｍ²）に設定して測定を行う。カラム圧力
のより好ましい範囲は、２．０×１０⁵Ｐａ〜３．４×
１０⁶Ｐａ（２ｋｇｆ／ｃｍ²〜３５ｋｇｆ／ｃｍ²）で
あり、更に好ましい範囲は、４．９×１０⁵Ｐａ〜２．
９×１０⁶Ｐａ（５ｋｇｆ／ｃｍ²〜３０ｋｇｆ／ｃ
ｍ²）である。これは、カラム圧力が９．８×１０⁴Ｐａ
より小さいと圧力変動が大きいため、安定型ＨｂＡ１ｃ
を精度良く測定できなくなるためである。また、カラム
圧力が３．９×１０⁶Ｐａより高くなると短時間測定で
連続測定したとき、カラム圧力上昇が大きくなり、カラ
ム耐久性が悪化してしまうためである。

【００４９】本発明でいうカラム圧力とは、分離用カラ
ムに流入する溶離液の液圧を意味するものであり、液体
クロマトグラフィー装置において、分離用カラムに流入
する溶離液の流路上に設けられた圧力計により計測され
るものである。このカラム圧力を計測する圧力計は、液
体クロマトグラフィー装置において一般的に用いられて
いるものであれば、特に限定されるものではないが、例
えばＪＩＳ Ｂ ７５０５−１９８０に規格が定められて
いるプルドン管圧力計が好適に用いられる。

【００５０】上記カラム圧力の設定は、カラム圧力の大
きさに影響を与える諸条件を調節することにより行な
う。具体的には、溶離液の流速、カラムに充填される充
填剤の粒径の大きさ、カラム内径及びカラム長などを適
宜調節することにより、上記範囲内となるように設定す
る。また、粒径の小さい充填剤（例えば、粒径３μｍ以
下の充填剤：多孔性充填剤及び非多孔性充填剤を含む）
を用いる場合、上記カラム圧力範囲内になるように、溶
離液の流速を調節しても良いし、また、粒径の小さい充
填剤を充填するカラムサイズを適宜小さくしても良い
（例えば、カラム内径０．１ｍｍ〜４ｍｍ、カラム長さ
５ｍｍ〜２００ｍｍ程度）。

【００５１】例えば、他の条件を同一にして溶離液の流
速のみを変化させる場合、カラム圧力を高めるために
は、溶離液の流速を上げればよいし、カラム圧力を低め
るためには、溶離液の流速を下げればよい。また、充填
剤の粒径の大きさのみを変化させる場合は、カラム圧力
を高めるためには、充填剤の粒径を小さくすればよい
し、カラム圧力を低めるためには、充填剤の粒径を大き
くすればよい。

【００５２】本発明における、他の測定条件としては、
公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０
０１〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．０１〜４ｍｌ／
分、特に好ましくは０．１〜３ｍｌ／分である。

【００５３】本発明のヘモグロビン類の測定方法におい
て用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン
交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、
高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる
ものである。

【００５４】上記カチオン交換基は、公知のものでよく
特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。

【００５５】上記充填剤粒子の直径は、好ましくは０．
５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。ま
た、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏
差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは４０
％以下、より好ましくは３０％以下である。

【００５６】充填剤粒子は、必要に応じて、上記に示し
た範囲の充填剤を複数種混合して用いても良い。

【００５７】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。

【００５８】上記高分子粒子は、導入されるイオン交換
基以外の構成成分は、より親水性であることが好まし
い。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが
好ましい。

【００５９】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができ、例えば、高分子
粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ
基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応で
カチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこと
ができる。

【００６０】また、カチオン交換基を有する単量体を重
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。

【００６１】また、（メタ）アクリル酸メチル、（メ
タ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有
エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在
下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エス
テルをカチオン交換基に変換させてもよい。

【００６２】更に、特公平８−７１９７号公報に記載の
ように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基
を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、
該単量体を重合させても良い。

【００６３】上記充填剤のカラムへの充填方法は、公知
の任意の方法が使用できるが、スラリー充填法を用いる
のがより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を
溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプ
などによりカラムに圧入することにより行う。

【００６４】本発明の測定方法を実施するのに用いられ
る液体クロマトグラフィー装置は、公知のものでよく、
例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラ
ム、検出器などから構成される。また、他の付属装置
（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属さ
れてもよい。

【００６５】また、セミミクロタイプの装置を用いても
良い。その１例としては、資生堂社製のＮＡＮＯＳＰＡ
ＣＥシリーズがあり、送液ポンプ：イナートポンプ２０
０１ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ ＳＩ-１、オートサンプラー
２００３、検出器ＵＶ-ＶＩＳ検出器２００２などで構
成される。

【００６６】上記カラムの材質は、公知のもので良く、
例えば、ガラス、ステンレス、ＰＥＥＫ（ポリエーテル
エーテルケトン）等の樹脂が挙げられる。

【００６７】また、カラムに装着されるフィルターの素
材も公知のもので良い。カラムの両端に設けられるフィ
ルターは、ヘモグロビン類の吸着を少なくするために、
不活性（イナート）な素材のものが好ましい。例えば、
ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレン、テフロン
（登録商標）、チタンなどがある。また、ステンレス製
のフィルターのように、ヘモグロビン類の吸着が大きい
ものは、表面をシリコーン処理、または、公知のブロッ
キング試薬（アルブミン、牛血清アルブミン、カゼイ
ン、ゼラチンなど）でブロッキングしても良い。上記の
フィルターは、プレフィルターとして用いても良い。

【００６８】また、カラムの充填剤とカラムが接する部
位を、不活性な素材で被覆してもよく、その素材として
は、例えばＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン
化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。

【００６９】上記測定方法における他の測定条件として
は公知の条件でよく、特に限定されないが、好ましくは
以下の条件を用いる。ヘモグロビン類の検出について
は、４１５ｎｍの可視光を用いるのが好ましい。測定試
料は、通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含
む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる
のが好ましい。液体クロマトグラフィー装置への試料注
入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜
１００μＬ程度である。

【００７０】本発明におけるヘモグロビン類の測定方法
の１実施態様を以下に示す。溶血液試料をカチオン交換
液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、Ｈｂ
Ａ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、
安定型ＨｂＡ１ｃ並びにＨｂＡ０などのピークが出現す
る。

【００７１】ここでは、溶出力の異なる３種の溶離液Ａ
〜Ｃ（溶離液Ａ＜溶離液Ｂ＜溶離液Ｃの順に溶出力が高
くなるよう設定したもの）を用い、まず、溶離液Ａで、
ＨｂＡ１ａ〜ＨｂＦまで溶出させ、不安定型ＨｂＡ１ｃ
と安定型ＨｂＡ１ｃをカラムに強く保持させて分離す
る。次に、より溶出力の強い溶離液Ｂをステップグラデ
ィエント溶出法で流し、カラムに強く保持させて分離し
た不安定型ＨｂＡ１ｃピークと安定型ＨｂＡ１ｃピーク
をシャープに溶出させる。最後に、カラムに最も強く保
持しているＨｂＡ０を、最も溶出力の強い溶離液Ｃをス
テップグラディエント溶出法で流して溶出させ、その
後、次の測定に備えて溶離液Ａをカラムへ流し、測定系
に悪影響が無い程度に溶離液Ａでカラム内を平衡化させ
る。

【００７２】［作用］従来、粒径の大きな充填剤を充填
したカラムでは、カラム内での測定サンプルの拡散が大
きいために、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃを
分離できなかったが、本発明では、溶離液にカオトロピ
ックイオンを添加することにより、分離溶出挙動が非常
に近い不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃのカラム
との相互作用の差を拡大させ、従来法で安定型ＨｂＡ１
ｃを分離測定できなかった粒径の大きな充填剤でも、安
定型ＨｂＡ１ｃを分離測定することができる。また、粒
径の大きな充填剤を充填したカラムは、カラム圧力が非
常に低いので、測定試料がカラムに目詰まりしづらく、
そのため、連続測定してもカラム圧力上昇が小さく、カ
ラム耐久性に優れている。さらに、グラディェント溶出
法を組み合わすことにより、より高精度に安定型ＨｂＡ
１ｃを分離測定できる。

【００７３】

【実施例】次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳し
く説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定され
るものではない。

【００７４】［実施例１］（１）充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタ
クリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に
過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。
これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社
製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素
雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次
いで、反応系を３５℃に冷却させた後、２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）
の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加
し、１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温して１．３時
間重合した。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒
径９μｍの粒子を得た。

【００７５】（２）カラムへの充填 （１）で得られた充填剤をカラムに以下のようにして充
填した。充填剤粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理し
た後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム
（内径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続したパッカー
（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ
（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ²
で定圧充填した。

【００７６】（３）ヘモグロビン類の測定 （２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘ
モグロビン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 圧力計：ストレンゲージ式圧力変換器 溶離液：溶離液Ａ：５６ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０） 送液パターン：測定開始より０〜１．２分の間は溶離液Ａを送液し、１．２〜 １．３分の間は溶離液Ｂを送液し、１．３〜１．９分の間は溶離 液Ａを送液した。 流速：２．２ｍＬ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μＬ カラム圧力：２．９×１０⁶Ｐａ（３０ｋｇｆ／ｃｍ²）

【００７７】（測定試料）健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．０）を用いた。

【００７８】（４）測定結果 上記測定条件により、得られたクロマトグラムを図２に
示した。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２は
ＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４
は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０を示す。図
２より、測定時間１．９分で安定型Ａ１ｃを分離測定で
きたことが分かる。

【００７９】［実施例２］（１）充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタ
クリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に
過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。
これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社
製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素
雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次
いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の
５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し
１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合
した。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径１１
μｍの粒子を得た。

【００８０】（２）カラムへの充填 上記実施例１と同様に行った。

【００８１】（３）ヘモグロビン類の測定 以下に示した項目以外は、実施例１と同様に行った。 溶離液：溶離液Ａ：５６ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：７０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｃ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０） 送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜 １．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離 液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送液した。 カラム圧力：７．８×１０⁵Ｐａ（８ｋｇｆ／ｃｍ²）

【００８２】（４）測定結果 上記測定条件により、得られたクロマトグラムを図３に
示した。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２は
ＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４
は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０を示す。図
３より、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測定で
きた。

【００８３】［比較例１］（１）充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタ
クリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に
過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。
これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社
製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素
雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次
いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の
５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し
１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し、１．３時間重
合させた。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径
３μｍの粒子を得た。

【００８４】（２）カラムへの充填 上記実施例１と同様に行った。

【００８５】（３）ヘモグロビン類の測定 以下に示した項目以外は、上記実施例１と同様に行っ
た。カラム圧力：７．８×１０⁶Ｐａ（８０ｋｇｆ／ｃ
ｍ²）

【００８６】（４）測定結果 比較例１により得られたクロマトグラムは図２と同様で
あった。

【００８７】［比較例２］（１）充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタ
クリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に
過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。
これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社
製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素
雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次
いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の
５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し
１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合
させた。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径３
０μｍの粒子を得た。

【００８８】（２）カラムへの充填 上記実施例１と同様に行った。

【００８９】（３）ヘモグロビン類の測定 以下に示した項目以外は、実施例１と同様に行った。カ
ラム圧力：４．９×１０⁴Ｐａ（０．５ｋｇｆ／ｃｍ²）

【００９０】（４）測定結果 上記測定条件によりヘモグロビン類の測定を試みたが、
測定出来なかった。

【００９１】［実施例３］（１）充填剤の調製 上記比較例１と同様に行った。

【００９２】（２）カラムへの充填 上記比較例１と同様に行った。

【００９３】（３）ヘモグロビン類の測定 （２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘ
モグロビン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 圧力計：ストレンゲージ式圧力変換器 溶離液：溶離液Ａ：６２ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０） 溶離液Ｂ：７０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０） 溶離液Ｃ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０） 送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６ 〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間 は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送 液した。 流速：１．０ｍｌ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μｌ カラム圧力：３．８×１０⁶Ｐａ（３９ｋｇｆ／ｃｍ²）

【００９４】（４）測定結果 上記測定条件により得られたクロマトグラムは、図３と
同様であり、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測
定できた。

【００９５】［実施例４］（１）充填剤の調製 上記比較例１と同様に行った。

【００９６】（２）カラムへの充填 （１）で得られた充填剤をカラムに以下のようにして充
填した。充填剤粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散させ、５分間超音波処理
した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム
（内径４０ｍｍ×長さ３０ｍｍ）を接続したパッカー
（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ
（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ²
で定圧充填した。（３）ヘモグロビン類の測定 （２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘ
モグロビン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 圧力計：ストレンゲージ式圧力変換器 溶離液：溶離液Ａ：５８ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０） 溶離液Ｂ：６８ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０） 溶離液Ｃ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０） 送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６ 〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間 は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送 液した 流速：１．１ｍｌ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μｌ カラム圧力：３．５×１０⁶Ｐａ（３６ｋｇｆ／ｃｍ²）

【００９７】（４）測定結果 上記測定条件により得られたクロマトグラムは、図３と
同様であり、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測
定できた。

【００９８】［実施例５］（１）充填剤の調製 上記比較例１と同様に行った。

【００９９】（２）カラムへの充填 （１）で得られた充填剤をステンレス製の空カラム（内
径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ）に充填した以外は、実施
例４と同様に行った。（３）ヘモグロビン類の測定 （２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘ
モグロビン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：イナートポンプ２００１：NANOSPACE SI-1（資生 堂社製） オートサンプラ：オートサンプラー２００３（資生堂社製） 検出器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００２（資生堂社製） 溶離液：溶離液Ａ：４９ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ５．３０） 溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ５．３０） 溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０） 送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６ 〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間 は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送 液した。 流速：０．１８ｍｌ/分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：２μｌ カラム圧力：２．２×１０⁶Ｐａ（２２ｋｇｆ／ｃｍ²）（４）測定結果 上記測定条件により得られたクロマトグラムは図３と同
様であり、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測定
できた。

【０１００】［カラム耐久性の評価］実施例１〜４と比
較例１〜２のカラムについて、上記に示したそれぞれの
測定条件で５００検体連続測定してカラム耐久性を評価
した。測定試料としては、健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．０）を用いた。

【０１０１】［カラム耐久性評価の結果］安定型ＨｂＡ
１ｃの測定値の変動を指標として、カラム耐久性を評価
し、図４に示した。その結果、実施例１〜４では、５０
０検体連続測定しても、安定型ＨｂＡ１ｃ値の変動は、
ほとんど無かった。しかし、比較例１では、１００検体
連続測定した後から、安定型ＨｂＡ１ｃ値が次第に高く
なった。これは、カラム圧力を高く設定すると、カラム
内に測定試料の一部が詰まり、カラム洗浄が不十分にな
る結果カラムが劣化し、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型Ｈ
ｂＡ１ｃの分離が不十分になったのが原因であると考え
られた。尚、比較例２では、カラム圧力が低すぎて安定
型ＨｂＡ１ｃ値を測定出来なかった。

【０１０２】

【発明の効果】本発明のヘモグロビン類の測定方法は上
述の構成からなるので、カラム耐久性に優れ、しかも、
安定型ＨｂＡ１ｃを、精度良く短時間で分離、測定する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 液体クロマトグラフィー装置の１例を示した
図

【図２】 実施例１での測定結果を示した図

【図３】 実施例２での測定結果を示した図

【図４】 カラム耐久性評価の結果を示した図

【符号の説明】

Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ ： 溶離液Ａ〜Ｄ １ ： 電磁弁 ２ ： 送液ポンプ ３ ： 試料注入部 ４ ： カラム ５ ： 検出器 ６ ： インテグレータ １１ ： ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ １２ ： ＨｂＦ １３ ： 不安定型ＨｂＡ１ｃ １４ ： 安定型ＨｂＡ１ｃ １５ ： ＨｂＡ０

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カチオン交換液体クロマトグラフィーによ
   るヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピック
   イオンを含有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持
   つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶
   離液を用い、カラム圧力を９．８×１０⁴Ｐａ〜３．９
   ×１０⁶Ｐａに設定して測定を行うことを特徴とするヘ
   モグロビン類の測定方法。
2. 【請求項２】請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法
   であって、グラディエント溶出法を用いて上記溶離液の
   送液を行なうことを特徴とするヘモグロビン類の測定方
   法。